JP2014526884A - 抗体重鎖のc末端の修飾による補体依存性細胞傷害の調節 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、補体依存性細胞傷害(CDC)を誘導するための抗体およびその能力に関する。重鎖のC末端の修飾によってCDC媒介能が変化した抗体バリアントを提供する。さらに、本発明は、そのような抗体を作出する方法、ならびに該抗体の産生に適したヌクレオチド構築物および宿主細胞を提供する。
モノクローナル抗体は近年、特にがんおよび自己免疫疾患の治療に対して成果を挙げた治療用分子になっている。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞傷害(CDC)のような、抗体のFc領域によって媒介されるエフェクタ機能は、モノクローナル抗体の臨床的有効性にとって重要な機構であることが多い。
(a) 該重鎖をコードするヌクレオチド構築物を提供する段階であって、該構築物が該重鎖のC末端においてリジン残基をコードしない、段階、
(b) 該ヌクレオチド構築物を宿主細胞において発現させる段階であって、ただし該宿主細胞はCHO細胞または蘚類細胞ではない、段階、
および
(c) 該宿主細胞の細胞培養物から該抗体を回収する段階
を含む該方法を提供する。
定義
「免疫グロブリン」という用語は、2対のポリペプチド鎖、すなわち1対の低分子量軽(L)鎖および1対の重(H)鎖からなる構造的に関連した糖タンパク質のクラスをいい、これら4つは全てジスルフィド結合によって相互に結合している。免疫グロブリンの構造は十分に特徴付けられている。例えば、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))を参照されたい。簡潔に説明すると、各重鎖は典型的に、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略す)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は典型的に、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3から構成される。重鎖はいわゆる「ヒンジ領域」におけるジスルフィド結合によって相互に結合している。各軽鎖は典型的に、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略す)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は典型的に、1つのドメイン、CLから構成される。典型的に、定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)に記述されているようにEUインデックスにしたがって行われる。VH領域およびVL領域はさらに、相補性決定領域(CDR)とも称される超可変性の領域(または配列および/もしくは構造的に規定されたループの形態において超可変性でありうる超可変領域)と、そこに介在するフレームワーク領域(FR)と称されるより保存された領域に細分化されうる。各VHおよびVLは典型的に、アミノ末端からカルボキシ末端へとFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序で配置された、3つのCDRおよび4つのFRから構成される(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)も参照されたい)。
上記のように、第1の局面において、本発明は、重鎖のC末端領域中の荷電アミノ酸残基の数を減らすことによって抗体のCDC媒介能を増強するための方法に関する。CDC媒介能が増強されている抗体産物は、重鎖からの荷電残基の翻訳後タンパク質分解による除去により、またはC末端をコードする領域中の、リジンなどの荷電アミノ酸のコドンを欠くヌクレオチド構築物からの抗体の組み換え産生により入手可能である。
(a) 該重鎖をコードするヌクレオチド構築物であって、該重鎖のC末端のリジン残基をコードしない該構築物を提供する段階、
(b) 該ヌクレオチド構築物を宿主細胞において発現させる段階であって、ただし該宿主細胞はCHO細胞または蘚類細胞ではない、段階
および
(c) 該宿主細胞の細胞培養物から該抗体を回収する段階
を含む該方法を提供する。
(i) 酵母細胞、例えばピキア・パストリスまたはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)およびオガタエ・ミニュータ(Ogataea minuta)、ならびに
(ii) 糸状菌細胞、例えばアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzea)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesi)、ならびに
(iii) 植物細胞、例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis)細胞、コウキクサ、ニコチアナ・ベンサミアナ(Nicotiana benthamiana) (タバコ)、油料種子作物(ブラシカ・ナプス(Brassica napus))、大豆、米、トウモロコシ(ズィー・メイス(Zea mays))またはニンジン細胞、ならびに
(iv) NS0細胞、Sp2/0細胞またはPER.C6細胞。
SEQ ID NO:1 : IgG1定常領域のアミノ酸配列(アクセッション番号P01857; IgGm (za)アロタイプ) (CH3配列に下線が引かれている)
SEQ ID NO:2 : IgG2定常領域のアミノ酸配列(アクセッション番号P01859) (CH3配列に下線が引かれている)
SEQ ID NO:3 : IgG3定常領域のアミノ酸配列(アクセッション番号P1860) (CH3配列に下線が引かれている)
SEQ ID NO:4 : IgG4定常領域のアミノ酸配列(CH3配列に下線が引かれている)
SEQ ID NO:5 : IgG1m(f)アロタイプ定常領域のアミノ酸配列(CH3配列に下線が引かれている)
C末端リジンまたは他の荷電アミノ酸残基のない、本発明の抗体は、CDCを介した細胞致死の増強が望まれる目的のような、多くの異なる目的に用いられうる。適当な疾患の例としては、非限定的に、さまざまな形態のがんが挙げられる。そのような抗体に適した抗原標的の例としては、非限定的に、腫瘍erbB1 (EGFR)、erbB2 (HER2)、erbB3、erbB4、MUC-1、CD4、CD19、CD20、CD25、CD32、CD37、CD38、CD74、CD138、CXCR5、c-Met、HERV-外被タンパク質、ペリオスチン、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、EGFrvIII、IGFr、L1-CAM、AXL、組織因子(TF)、EpCAMおよびMRP3が挙げられる。好ましい抗原には、CD20、HER2、EGFR、CD38、IGFR、CD25およびCD32が含まれる。例示的な抗体には、HuMAb 7D8、HuMAb 2F2 (WO2004035607に記述されている)およびHuMAb 005 (WO 2006099875に記述されている)が含まれる。
さらなる主な局面において、本発明は、本明細書において記述の本発明による抗体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。
抗CD20抗体(2F2, WO 2004035607 (Genmab)に記述されている)および抗CD38抗体(005, WO 2006099875 (Genmab)に記述されている)をハイブリドーマ上清から単離し、分取陽イオン交換クロマトグラフィー(CIEX)に供した。CIEXは、ProPac (登録商標) WCX 10 (9 mm×250 mm)分取カラムを用いAKTA Purifierシステムにて行った。移動相AおよびBは、10 mMリン酸ナトリウム(pH 7.2)および10 mMリン酸ナトリウム(pH 7.0)中25 mM塩化ナトリウムであった。注入の前に抗体を終夜透析した。60分で0%から12% Bへの直線勾配(抗CD20)および25分で8%から13% Bへの直線勾配(抗CD38)を用いた。どちらの抗体分離の場合にも流速を4 mL/分とし、280 nmでの吸光度によって濃度を決定した。各抗体ごとに、6回の連続注入を行い、個別にK0、K1およびK2アイソフォーム(1抗体あたり0個、1個または2個の重鎖C末端リジンを含む)をプールし、濃縮し(Sartorius, Vivaspin, 10,000 Da MWCO)、分離用緩衝液をPBS緩衝液に交換した。プールした画分を、処理なしでまたはカルボキシペプチダーゼB (CPB)処理(20 mMリン酸ナトリウム[pH 7.2]中の抗体500 μL [450 μg/mL]を0.05 IU/μL CPB [Calbiochem] 10 μLとともに混合し、4時間37℃でインキュベートした)後にcIEFおよびSDS PAGEによって生化学的に分析した。さらに使用するまで-80℃でサンプルを貯蔵した。cIEF分析の場合、抗体サンプルを5 μg/mLに希釈し、20 μLを高pI KitならびにpH 7.65および10.0マーカー(Amersham, Piscataway, USA)とともにプレキャストcIEF FocusGel 6-11 24S (ETC, Kirchentellinsfurt, Germany)に負荷した。ゲルを500 V、30 mAおよび10 Wで30分間プレフォーカスし、引き続き1500 V、18 mAおよび20 Wで90分間、ならびに2000 V、15 mAおよび25 Wで30分間フォーカスした。ゲルを20% (w/v)トリフルオロ酢酸中にて30℃で45分間固定した。バンドの検出は、FocusGel供給業者によって推奨されるアンモニア銀染色手順を用いて行った。cIEFゲルは、GeneGenius Imaging System (Synoptics, Cambridge, UK)を用いてデジタル画像化した。cIEFに用いたその他全ての試薬および装置は、GE Healthcare (Uppsala, Sweden)から入手した。非還元SDS-PAGEは、4〜12%のNuPAGE Bis-Tris SDS-PAGEゲル(Invitrogen, Breda, The Netherlands)にて行った。SDS-PAGEゲルは、GeneGenius Imaging System (Synoptics, Cambridge, UK)を用いてデジタル画像化した。
カルボキシペプチダーゼB (CPB)処理の有無にかかわらず、抗体調製物および回収されたアイソフォームは、前記のように分取CIEXによって得た。CD20およびCD38の両方を発現するDaudi細胞への抗体サンプルの結合は、FACS分析によって分析した。ポリスチレン96ウェル丸底プレート(Greiner bio-one 650101)中50 μLの細胞105個を、RPMI1640/0.2% BSA中、0.04 μg/mLから10 μg/mLに及ぶ抗体調製物の連続希釈液とともに、4℃で30分間インキュベートした。RPMI/0.2% BSA中で2回洗浄した後に、細胞をフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合ウサギ抗ヒトIgG (F0056, Dako, Glostrup, Denmark)とともに4℃で30分間インキュベートした。細胞をRPMI/0.2% BSA中で2回洗浄し、RPMI/0.2% BSA中で再懸濁し、FACS Calibur (BD Biosciences)にて分析した。GraphPad Prism V5.01ソフトウェア(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)を用いて非直線回帰(傾きを可変量としたS字型用量応答曲線)により結合曲線を分析した。CDCの誘導を調べるため、Daudi細胞(細胞2×106個/mL)を抗体調製物の連続希釈液とともにRTで15分間インキュベートした。補体源として正常ヒト血清(NHS; M0008, Sanquin, Amsterdam, The Netherlands)を加えた(終濃度20% [v/v])。丸底96ウェルプレート(Nunc, Rochester, NY)中にて37℃で45分間インキュベートした後、サンプルを氷上に置くことによって反応を停止させた。ヨウ化プロピジウム(PI, Sigma Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands)染色法を用いてFACS分析により、細胞溶解を決定した。溶解の百分率を次のように決定した: 溶解の百分率= (PI陽性細胞の数/細胞の総数)×100%。
示したデータは、抗CD20抗体および抗CD38抗体の、カルボキシペプチダーゼB (CPB)処理有りおよび無しでの、未分画および回収K2アイソフォームによるDaudi細胞のCDCの誘導に対するEC50値[μg/mL]である。
カルボキシペプチダーゼB (CPB)処理の有無にかかわらず、抗体調製物および回収されたK2アイソフォームは、前記のように得た。C1q利用の効力を調べるため、Daudi細胞(細胞2×106個/mL)を、固定濃度(10 μg/mL)の抗体調製物とともに、10%ウシ胎仔血清を補充したRPMI1640培地中で室温で15分間インキュベートした。1 mM MgCl2および1 mM CaCl2を補充したC1q枯渇血清(Quidel, San Diego, CA)ならびに低濃度のC1q (Complement Technologies, Tyler, TX)を補体源として加えた(終濃度50% [v/v])。前記のようにCDCアッセイ法を行った。
示したデータは、抗CD38抗体の、CPB処理有りおよび無しでの、未分画および回収K2アイソフォームによるDaudi細胞のCDCの誘導に対するC1q必要量のEC50値[μg/mL]である。
回収されたK2アイソフォームによるCDC誘導の効力が未分画の抗体調製物と比べて低下していたことについて、C末端リジンの存在が実際に関与していたことをさらに検証するため、各重鎖の中に0個、1個、2個または3個のC末端リジンを含む変異体を構築した。さらに、C末端の位置に負電荷(グルタミン酸; E)を有する変異体を構築した。変異体を下記表に記述する。EUナンバリングでのアミノ酸P445はSEQ ID NO:1および5 (それぞれ、IgG1m (za)およびIgG1m(f)アロタイプFc配列)において328位のプロリンに相当する。
表4 - 抗CD38抗体および変異体によるCDC誘導。
示したデータは、EC50値(μg/mL)および最大濃度(4 μg/mL)の試験抗体で誘導された溶解の百分率である。
IgG分子間の電荷斥力が、C末端の位置にリジンまたはグルタミン酸を保有する抗CD38変異体のCDC活性の低減に関わるかどうかを調べるため、C末端の位置に異なる電荷を有する変異体を混合した。CDCアッセイ法を前記のように行った。
CH3ドメインのC末端の位置に焦点を合わせた変異を含めて、変異のライブラリを作出した。Quikchange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene, US)を用いて抗CD38抗体005のIgG1 Fc領域の中に変異を導入した。手短に言えば、所望の変異位置ごとに、所望の位置で縮重コドンをコードするフォワードおよびリバースプライマーを用いて、全長プラスミドDNA鋳型を複製した。得られたDNA混合物をDpnIにより消化してソースプラスミドDNAを除去し、これを用いて大腸菌(E. coli)を形質転換した。得られたコロニーをプールし、培養し、プラスミドDNAをこれらのプールから単離し、大腸菌へ再び形質転換して、クローン性コロニーを得た。得られたコロニーから単離された変異体プラスミドDNAを、DNA配列決定(LGC genomics, Berlin, Germany)によって調べた。発現カセットをPCRによってプラスミドDNAから増幅し、抗CD38抗体005の変異体重鎖および野生型軽鎖の両方を含むDNA混合物を、本質的には製造元によって記述されているように293fectin (Invitrogen, US)を用いてFreestyle HEK293F細胞(Invitrogen, US)に一過的に遺伝子導入した。抗体変異体を含む遺伝子導入細胞の上清を集めた。
1.0 ug/mlの抗CD38抗体の点突然変異体の存在下でのDaudi細胞の溶解の百分率。野生型抗体はこれらの条件の下で66%の細胞を溶解させた。
Claims (60)
- 以下の段階を含む、少なくとも重鎖を含む抗体を宿主細胞において産生する方法:
(a) 該重鎖をコードするヌクレオチド構築物を提供する段階であって、該構築物が該重鎖のC末端においてリジン残基をコードしない、段階、
(b) 宿主細胞において該ヌクレオチド構築物を発現させる段階であって、ただし該宿主細胞がCHO細胞または蘚類細胞ではない、段階、および
(c) 該宿主細胞の細胞培養物から該抗体を回収する段階。 - 前記宿主細胞が、軽鎖をコードする構築物をさらに発現する、請求項1記載の方法。
- 前記宿主細胞が、タンパク質のAsn結合型グリコシル化の能力を有する、請求項1または2記載の方法。
- 前記宿主細胞が、ヒト様グリコシル化またはヒトグリコシル化されている糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている非ヒト細胞である、前記請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記宿主細胞が、抗体重鎖からC末端リジン残基を効率的に除去できない宿主細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記宿主細胞が、C末端リジンを含む構築物を発現する場合に抗体分子の10%超、例えば30%超がK2アイソフォームである抗体調製物を産生する、宿主細胞である、請求項5記載の方法。
- 前記宿主細胞が以下からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法:
(a) 酵母細胞、例えばピキア・パストリス(Pichia pastoris)またはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)およびオガタエ・ミニュータ(Ogataea minuta)、
(b) 糸状菌細胞、例えばアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzea)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesi)、
(c) 植物細胞、例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis)細胞、コウキクサ(Lemna minor)、ニコチアナ・ベンサミアナ(Nicotiana benthamiana) (タバコ)、油料種子作物(ブラシカ・ナプス(Brassica napus))、大豆、米、トウモロコシ(ズィー・メイス(Zea mays))またはニンジン細胞、
(d) NS0細胞、Sp2/0細胞、およびPER.C6細胞。 - 前記段階(a)において提供される前記ヌクレオチド構築物が、C末端リジン残基に対するコドンを有する本来の重鎖配列に由来するか、またはそれに基づいてデザインされ、例えば、該ヌクレオチド構築物が、該本来の重鎖配列と比べてC末端リジン残基に対するコドンの欠失または置換を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記重鎖をコードする構築物が該重鎖のC末端においてリジンまたはアルギニンをコードせず、好ましくは、該重鎖をコードする構築物が該重鎖のC末端において荷電アミノ酸残基をコードしない、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記ヌクレオチド構築物が、C末端修飾以外は、IgG1またはIgG2アイソタイプの重鎖をコードする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記ヌクレオチド構築物のC末端コドンが、ProまたはGly残基をコードする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記請求項のいずれか一項記載の方法によって入手されるまたは入手可能な単離された抗体。
- 抗体重鎖からC末端リジン残基を効率的に除去できない宿主細胞であって、C末端リジンを欠く重鎖をコードするヌクレオチド構築物を含む、前記宿主細胞。
- 請求項7で指定されたタイプのうちの1つである、請求項13記載の宿主細胞。
- 補体依存性細胞傷害を媒介する抗体の能力を増強する方法であって、抗体の重鎖からC末端リジン残基を除去する段階を含む、前記方法。
- 前記リジン残基が酵素的切断によって、例えばカルボキシペプチダーゼを用いて切断される、請求項15記載の方法。
- 前記抗体がC末端リジン残基の除去の前に精製される、請求項15または16記載の方法。
- 前記抗体がIgG1またはIgG2アイソタイプである、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
- 複数の抗体産生細胞培養物、例えばハイブリドーマ細胞培養物を、所望の特性について試験する方法であって、該ハイブリドーマの培養物のサンプルを請求項15〜18のいずれか一項記載の方法で処理する段階、および処理したサンプルを所望の特性について試験する段階を含む、前記方法。
- 前記所望の特性が細胞溶解または細胞致死である、請求項19記載の方法。
- タンパク質分解による除去を受けにくい少なくとも1つの荷電アミノ酸残基をC末端領域に有する重鎖を含む、単離された抗体バリアント。
- 軽鎖をさらに含む、請求項21記載の抗体バリアント。
- 前記荷電アミノ酸残基のない抗体と比べて補体依存性細胞傷害を媒介する能力が低下している、前記請求項21〜22のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記荷電アミノ酸残基が、哺乳動物由来のプロテアーゼによる除去を受けにくく、好ましくはCHO、HEK-293、PER.C6、NS0またはSp2/0由来のプロテアーゼによる除去を受けにくく、より好ましくはCHO、HEK-293、PER.C6、NS0またはSp2/0細胞の分泌経路において活性なプロテアーゼによる除去を受けにくい、前記請求項21〜23のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記荷電アミノ酸残基が、ヒトプロテアーゼによる除去を受けにくく、好ましくは循環中のタンパク質に作用しうるヒトプロテアーゼによる除去を受けにくい、前記請求項21〜24のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記荷電アミノ酸が、最もC末端側の6つのアミノ酸残基の中にあり、例えば前記重鎖の最もC末端側の5つのアミノ酸残基の中にあり、例えば前記重鎖の最もC末端側の4つのアミノ酸残基の中にあり、例えば前記重鎖の最もC末端側の3つのアミノ酸残基の中にあり、例えば前記重鎖の最もC末端側の2つのアミノ酸残基の中にあり、例えば前記荷電アミノ酸が前記重鎖の最もC末端側のアミノ酸残基である、前記請求項21〜25のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記重鎖が、SEQ ID NO:1、2、3または5に記載されたCH3配列を含み、かつ前記荷電アミノ酸が、それぞれ325位〜330位、321位〜326位、372位〜377位および325位〜330位の間に位置する、前記請求項21〜26のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記重鎖が、SEQ ID NO:1、2、3または5に記載された定常領域配列全体を含み、かつ前記荷電アミノ酸が、それぞれ325位〜330位、321位〜326位、372位〜377位および325位〜330位の間に位置する、前記請求項21〜27のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記荷電アミノ酸が、正荷電アミノ酸残基、好ましくはリジン残基である、前記請求項21〜28のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記荷電アミノ酸が、負荷電アミノ酸残基、好ましくはグルタミン酸残基である、前記請求項21〜28のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記荷電アミノ酸残基が、該荷電アミノ酸残基のC末端側にある位置でのアミノ酸修飾によってタンパク質分解による除去を受けにくい、前記請求項21〜30のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記荷電アミノ酸残基が、該荷電アミノ酸残基のC末端側にあるプロリン残基の存在によってタンパク質分解による除去を受けにくく、好ましくは、該プロリン残基が該荷電アミノ酸残基のすぐC末端側に位置し、より好ましくは、該荷電アミノ酸残基および該プロリン残基が前記重鎖の最もC末端側の2つのアミノ酸残基である、前記請求項21〜31のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記重鎖が、2つまたはそれより多い荷電アミノ酸残基、例えば2つ、3つ、4つまたは5つの荷電アミノ酸残基をC末端領域に含み、該荷電アミノ酸残基が、好ましくは全て正電荷または全て負電荷のいずれかを有する、前記請求項21〜32のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 指定されたアミノ酸修飾が、アミノ酸置換の結果である、前記請求項21〜33のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 指定されたアミノ酸修飾が、C末端アミノ酸付加の結果である、前記請求項21〜34のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記抗体が、ヒト抗体、好ましくはヒトIgG1抗体またはヒトIgG3抗体である、前記請求項21〜35のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記抗体重鎖が、C末端にプロリン残基が付加されている、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4重鎖である、前記請求項21〜36のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 前記抗体がC末端で結合されていない、前記請求項21〜37のいずれか一項記載の抗体バリアント。
- 医薬として用いるための、請求項21〜38のいずれか一項記載の抗体。
- タンパク質分解による除去を受けにくい荷電アミノ酸残基をC末端領域に有する重鎖をコードする、ヌクレオチド構築物。
- 請求項22〜38のいずれか一項記載のさらなる特徴を有する、請求項40記載のヌクレオチド構築物。
- 請求項21〜38のいずれか一項記載の抗体バリアントを産生できる、宿主細胞。
- 重鎖からC末端リジンを除去できるカルボキシペプチダーゼの活性を取り除くように遺伝子組み換えされた、宿主細胞。
- CHO、HEK-293、PER.C6、NS0またはSp2/0細胞である、請求項43記載の宿主細胞。
- 請求項21〜38のいずれか一項記載の抗体バリアントを産生する方法であって、請求項42〜44のいずれか一項記載の宿主細胞を培養する段階、および該細胞の培養物から該抗体を回収する段階を含む、前記方法。
- 前記宿主細胞が、C末端に負荷電アミノ酸残基を有するかまたはC末端において正荷電アミノ酸残基の後にプロリン残基を有する重鎖をコードするヌクレオチド構築物を含むCHOまたはHEK細胞である、請求項45記載の方法。
- 少なくとも1つの正荷電アミノ酸残基をC末端領域に有する重鎖を含む抗体バリアント分子の亜集団と、少なくとも1つの負荷電アミノ酸残基をC末端領域に有する重鎖を含む抗体バリアント分子の亜集団とを含む抗体混合物であって、該正荷電アミノ酸残基および該負荷電アミノ酸残基がタンパク質分解による除去を受けにくい、前記抗体混合物。
- 前記亜集団の各々が前記混合物の少なくとも10%、例えば少なくとも20%、例えば前記混合物の少なくとも30%を構成する、請求項47記載の抗体混合物。
- 前記抗体分子が請求項22〜38のいずれか一項または複数項において指定された特性を有する、請求項47または48記載の抗体混合物。
- 2つの亜集団の各々における抗体分子が、2本の同一の重鎖を含む、前記請求項47〜49のいずれか一項記載の抗体混合物。
- 医薬として用いるための、好ましくはがんの治療において用いるための前記請求項47〜50のいずれか一項記載の抗体混合物。
- 抗体分子の間での分子間C末端相互作用に有利に働く1つまたは複数のアミノ酸修飾を含む変異C末端領域を有する重鎖を含む、単離された抗体。
- 前記アミノ酸修飾のない抗体と比べて補体依存性細胞傷害を媒介する能力が増強されている、請求項52記載の抗体。
- 2本の同一ではない重鎖を含む、請求項52記載の抗体。
- 一方の重鎖がC末端領域に負荷電アミノ酸残基を含み、かつ他方の重鎖がC末端領域に正荷電アミノ酸残基を含み、該荷電アミノ酸残基がタンパク質分解による除去を受けにくい、請求項52記載の抗体。
- 単一特異性抗体である、前記請求項52〜55のいずれか一項記載の抗体。
- 二重特異性抗体である、前記請求項52〜55のいずれか一項記載の抗体。
- 医薬として用いるための前記請求項52〜57のいずれか一項記載の抗体。
- 請求項52〜57のいずれか一項記載の抗体を産生する方法であって、前記重鎖をコードするヌクレオチド構築物を含む宿主細胞を培養する段階、および該宿主細胞の細胞培養物から該抗体を回収する段階を含む、前記方法。
- 前記宿主細胞がCHOまたはHEK細胞である、請求項59記載の方法。
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