JP2014520881A - 結合組織疾患の治療のためのブロメライン由来タンパク質分解抽出物 - Google Patents

Abstract

本発明は、結合組織疾患の治療のための、ブロメラインから得られるタンパク質分解抽出物に関する。詳細には本発明は、デュピュイトラン病およびペイロニー病などの疾患の治療のための、ブロメラインから得られるタンパク質分解抽出物を含む医薬組成物に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、結合組織疾患の治療のための、ブロメラインから得られるタンパク質分解抽出物に関する。詳細には、本発明は、デュピュイトラン病およびペイロニー病などの疾患の治療のための、ブロメラインから得られるタンパク質分解抽出物を含む医薬組成物に関する。

コラーゲンは結合組織の主要な構成成分であり、腱、靭帯および皮膚などの線維組織において主に見られる。多くの疾患や病気が、過剰なコラーゲンの沈着に関連し、その中で最も一般的なものが、デュピュイトラン病およびペイロニー病である。

デュピュイトラン病（ＤＤ）は、手に異常なコラーゲンの産生および沈着が生じる結合組織疾患であり、一般に薬指および小指の中手指節関節（ＭＣＰＪ）、ならびに近位指節間関節（ＰＩＰＪ）の拘縮を特徴とする。手掌筋膜レベルでの過剰なコラーゲンの沈着を伴う線維芽細胞の増殖および筋線維芽細胞への分化により、手掌および／あるいは指において小結節および線維性索の形成が生じる。線維性索あるいは小結節は、線維性索で直径１ミリメートルから、線維性小結節で直径１０ミリメートル近くにまで及ぶ、様々な太さとなり得る。疾患が進行するにつれて、索は収縮し始め、手の機能を妨げ低下させる指の屈曲奇形（屈曲拘縮）が生じる。

ＤＤの罹患率は年齢に伴って上昇し、男性の方がより罹患しやすい。遺伝的感受性、喫煙、アルコール、糖尿病、てんかん、および反復的な手作業が、ＤＤの一般的なリスク因子と考えられている。ＤＤの重症度および進行は、指の屈曲拘縮の度合によって分類できる。

手術による筋膜切除は、現在最も広く利用可能なＤＤの治療であり、ほとんどの患者にとって一時的にせよ良好な結果をもたらす。しかし、手術による筋膜切除は通常、指の神経損傷、指の欠損、皮弁の欠損、創傷治癒の問題および術後硬直などの特有の合併症のみならず、一般的な手術合併症（例えば感染症、血腫、組織欠損）を伴う。さらに筋膜切除は、回復に時間を要し、またＤＤの再発率が極端に高いため決定的な治癒をもたらさない。針や薄い刃を用いた低侵襲的手法が試みられている。このような手法では、合併症は少ないものの、再発率が上昇する。また、非手術的処置も開発されており、これらは放射線療法、超音波、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ステロイド剤およびインターフェロン−γの注入を含む。

インビトロでの研究により、コラゲナーゼにデュピュイトラン索組織の断裂に必要な張力係数および力を低減させる能力があることが証明され、コラゲナーゼが酵素による筋膜切開に有効である可能性が示されている。近年の臨床試験により、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍのコラゲナーゼを用いた治療でＤＤ拘縮が解放され、罹患した関節の可動範囲が改善することが示されている。ＤＤの患者へのコラゲナーゼの注入を８年間経過観察した結果、コラゲナーゼによる治療を施す前の初期の拘縮と比べた場合、疾患の再発に次いでＭＣＰＪ拘縮が緩和することが示された。また、ＤＤの患者の組織には、正常な大人の手掌筋膜には通常存在しないＩＩＩ型コラーゲンが豊富に存在することも示されている。

ペイロニー病は、男性の１０％までが罹患する、陰茎の軟組織におけるコラーゲンに富んだ線維性斑の成長を伴う結合組織疾患である。具体的には、線維性斑は白膜（陰核海綿体を取り囲む組織の厚い外筒）において形成され、しばしば痛みを伴う異常な湾曲を生じさせる。

手術は、予想通りに何度も効力を示すことが可能なように思われる唯一のペイロニー病の治療方法である。手術は通常、疾患が安定化し、奇形が***を妨げ、および／あるいは極度の痛みを生じさせる長期的な症例にのみ必要とされる。しかし、陰茎の永久的な短縮など、手術により合併症が発生し得る。

また、ペイロニー病の非手術的治療方法も利用可能であるが、全くほとんど効果はない。病巣内への直接的な注入により斑を溶解させる試みが行われている。注入法の中でも、クロストリジウムのコラゲナーゼを伴うものが、やはり効果および持続期間がかなり限定されるものの、最も一貫した効力を示すように思われる。さらに、放射線療法およびレーザー技術が試みられている。

米国特許第５，５８９，１７１号、同第６，０８６，８７２号、および米国再発行特許第ＲＥ３９，９４１号には、線維性の罹患した手掌筋膜へのコラゲナーゼの投与を含む、デュピュイトラン病に罹患した人を治療する方法が開示されている。

米国特許第６，０２２，５３９号には、陰茎にある線維性のペイロニー斑へのコラゲナーゼの注入を含む、ペイロニー病に罹患した人を治療する方法が開示されている。

米国特許第６，３５３，０２８号には、ペイロニー病、デュピュイトラン病およびレダーホース線維症といった結合組織疾患の治療のための、カルシウムチャネル遮断剤およびカルシウムチャネル遮断剤の経皮送達を亢進する運搬剤を含む外用薬が開示されている。

米国特許出願公開第２００８／０２０６２２８号には、肥厚性瘢痕およびケロイド瘢痕の治療のためのみならず、様々な種類の創傷、火傷、褥瘡、血管の潰瘍および糖尿病性下肢潰瘍の治療のための、コラゲナーゼと共にヒアルロン酸あるいはその誘導体を含む薬剤が開示されている。デュピュイトラン病の治療については明確に開示されている。

国際公開第２００４／０３７１８３号には、線維症を伴う病気の治療のための方法および組成物が開示されており、その中で、ペイロニー病およびデュピュイトラン病について開示されている。組成物は、いくつか列挙すると、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）−４阻害剤、ＰＤＥ−５阻害剤、あるいはｃＧＭＰを増加させる化合物を含む。

国際公開第２００５／０７４９１３号には、デュピュイトラン拘縮あるいはペイロニー拘縮などの拘縮の治療のための、微小管阻害剤、抗代謝剤、アルキル化剤、ビンカアルカロイド、ＰＤＥ阻害剤、コラゲナーゼを含むマトリックスメタロプロテアーゼを含む、細胞周期阻害剤の使用が開示されている。

背景技術のいずれにも、植物由来のタンパク質分解酵素が、過剰なコラーゲンの沈着を伴う結合組織疾患の治療に有用であることは、開示も示唆もされていない。

植物であるパイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）の茎由来の抽出物が、失活した組織を選択的に除去することが見出されている。ブロメラインとも呼称されるこのような抽出物は、様々なタンパク質分解酵素および加水分解酵素を含有する。

本発明の出願人による国際公開第２００６／０５４３０９号には、ブロメラインに存在する平均分子量２３ｋＤａのタンパク質分解酵素の大部分を含む、ブロメラインから得られた創傷清拭組成物が開示されている。さらに国際公開第２００６／０５４３０９号には、生存不能組織の創傷清拭のための前記創傷清拭組成物の使用が開示されている。

過剰なコラーゲンの沈着を伴う結合組織疾患の治療のための、改良された非侵襲的手法に対する需要が、未だ満たされずに残っている。

本発明は、結合組織疾患の治療のための、ブロメラインから得られるタンパク質分解抽出物を提供する。詳細には、本発明は、デュピュイトラン病およびペイロニー病を含む、過剰なコラーゲンの沈着に関連する結合組織疾患の治療のための、ブロメラインから得られるタンパク質分解抽出物を提供する。

ステムブロメラインあるいはアナナインなどのブロメラインに存在する１種類以上のシステインプロテアーゼを含む、ブロメラインから得られたタンパク質分解抽出物が、未変性の非変性コラーゲンを分解できることが本願において初めて開示される。予想外にも、デュピュイトラン索へのタンパク質分解抽出物の注入により、正常で健常な結合組織を損なうことなく、索が断裂する結果となった。

さらに本発明において、デュピュイトラン索を断裂する、あるいは溶解するというタンパク質分解抽出物の効力が、コラゲナーゼの効力と同様であるか、あるいはより高いことが開示される。しかし、コラゲナーゼが様々な型のコラーゲンに親和性があるため非疾患の靭帯あるいは腱に損傷を与える可能性があるのに対し、本発明のタンパク質分解抽出物は、疾患状態の索に対して特異性を示す。従って、本発明のタンパク質分解抽出物は、過剰なコラーゲン沈着を伴う結合組織疾患、特にデュピュイトラン病およびペイロニー病の治療のための改良された、および安全な薬物を提供する。

高濃度のタンパク質分解抽出物を少量で調製できるという事実のために、疾患状態の線維性の索あるいは斑へのこのような少量の注入が可能であり、従って、血管外漏出および周囲の組織への損傷を回避し、臨床的手順が簡素化し、故に患者の服薬率が増加する。

１つの態様によれば本発明は、そのような治療を必要とする対象への、治療上有効な量の、ブロメラインから得られたタンパク質分解抽出物および医薬的に許容される運搬体を含む医薬組成物の投与を含む結合組織疾患の治療方法であって、前記タンパク質分解抽出物が、ステムブロメラインおよびアナナインからなる群から選択される少なくとも１種類のシステインプロテアーゼを含み、前記結合組織疾患が過剰なコラーゲンの沈着に関連する治療方法を提供する。

さらなる実施形態によれば、結合組織疾患はデュピュイトラン病、ペイロニー病、肩関節周囲炎およびレダーホース病からなる群から選択される。特定の実施形態によれば、結合組織疾患はデュピュイトラン病である。別の実施形態によれば、結合組織疾患はペイロニー病である。

一実施形態によれば、タンパク質分解抽出物はステムブロメラインおよびアナナインを含む。別の実施形態によれば、タンパク質分解抽出物はシステインプロテアーゼ前駆体をさらに含む。さらなる実施形態によれば、タンパク質分解抽出物はシステインプロテアーゼの断片をさらに含む。好例な実施形態によれば、タンパク質分解抽出物はステムブロメライン、アナナイン、およびシステインプロテアーゼ前駆体を含む。

さらなる実施形態によれば、医薬組成物は麻酔薬、抗菌薬および抗炎症薬からなる群から選択される薬剤をさらに含む。

さらに別の実施形態によれば、麻酔薬はアメソカイン（テトラカイン）、リグノカイン（リドカイン）、キシロカイン、ブピバカイン、プリロカイン、ロピバカイン、ベンゾカイン、メピバカイン、コカインおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。各々の可能性が本発明の個別の実施形態である。

さらなる実施形態によれば、抗菌薬は、アマンタジン塩酸塩、アマンタジン硫酸塩、アミカシン、アミカシン硫酸塩、アミノグリコシド類、アモキシシリン、アンピシリン、アンサマイシン類、バシトラシン、ベータラクタム類、カンジシジン、カプレオマイシン、カルベニシリン、セファレキシン、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セファピリン、セフラジン、セファログリシン、クロラムフェニコール類、クロルヘキシジン、クロルヘキシジングルコン酸塩、クロルヘキシジン塩酸塩、クロロキシン、クロルキナルドール、クロルテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン塩酸塩、シプロフロキサシン、サーキュリン、クリンダマイシン、クリンダマイシン塩酸塩、クロトリマゾール、クロキサシリン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジヨードヒドロキシキン、ドキシサイクリン、エタンブトール、エタンブトール塩酸塩、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、エリスロマイシンステアリン酸塩、ファルネソール、フロキサシリン、ゲンタマイシン、ゲンタマイシン硫酸塩、グラミシジン、グリセオフルビン、ハロプロジン、ハルキノール、ヘキサクロロフェン、イミノサイクリン、ヨードクロルヒドロキシキン、カナマイシン、カナマイシン硫酸塩、リンコマイシン、リネオマイシン、リネオマイシン塩酸塩、マクロライド類、メクロサイクリン、メタサイクリン、メタサイクリン塩酸塩、メテナミン、馬尿酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、メシチリン、メトロニダゾール、ミコナゾール、ミコナゾール塩酸塩、ミノサイクリン、ミノサイクリン塩酸塩、ムピロシン、ナフシリン、ネオマイシン、ネオマイシン硫酸塩、ネチルマイシン、ネチルマイシン硫酸塩、ニトロフラゾン、ノルフロキサシン、ナイスタチン、オクトピロックス、オレアンドマイシン、セファロスポリン類、オキサシリン、オキシテアクリン、オキシテトラサイクリン塩酸塩、パラクロロメタキシレノール、パロモマイシン、パロモマイシン硫酸塩、ペニシリン類、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ペンタミジン、ペンタミジン塩酸塩、フェネチシリン、ポリミキシン類、キノロン類、ストレプトマイシン硫酸塩、テトラサイクリン、トブラマイシン、トルナフテート、トリクロサン、リファンピン、リファマイシン、ロリテトラサイクリン、銀塩類、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン類、テトラサイクリン、トブラマイシン、トブラマイシン硫酸塩、トリクロカルバン、トリクロサン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、タイロシン、バンコマイシン、およびタイロスリシンからなる群から選択される。各々の可能性が本発明の個別の実施形態である。

さらなる実施形態によれば、抗炎症薬は、非ステロイド系抗炎症薬およびステロイド系抗炎症薬からなる群から選択される。

さらに別の実施形態によれば、医薬組成物は、安定化剤、抗酸化剤、保存剤、緩衝剤、キレート剤、および等張化剤からなる群から選択される構成成分をさらに含む。

さらに別の実施形態によれば、医薬組成物は、固形製剤、半固形製剤、液体製剤、および泡製剤からなる群から選択される形態で製剤化される。特定の実施形態によれば、固形製剤は粉末である。別の実施形態によれば、液体製剤はｐＨが約６〜７の注入可能な溶液である。

好例な実施形態によれば、医薬組成物は、疾患線維組織への注入により投与される。医薬組成物を、単一用量で、あるいは疾患線維組織の２ヵ所以上に分割して注入することが可能である。

別の態様によれば、本発明は、結合組織疾患の治療に使用するためのタンパク質分解抽出物を含む医薬組成物であって、前記タンパク質分解抽出物はステムブロメラインおよびアナナインからなる群から選択される少なくとも１種類のシステインプロテアーゼを含み、前記結合組織疾患は過剰なコラーゲンの沈着に関連する、医薬組成物を提供する。

本発明のこれらの実施形態およびその他の実施形態は、以下の図面、説明、実施例、および特許請求の範囲に関連してより深く理解されるであろう。

タンパク質分解抽出物の２つのバッチのコラーゲン分解活性を示すグラフである。タンパク質分解抽出物（ＭＤ２ Ｈ−０５−２７およびＭＤ５ Ｈ−１０−４６と命名）の濃度をサンプルごとに増加させて、蛍光標識したＩＶ型コラーゲンの存在下で２０分インキュベートした。インキュベーション終了時に蛍光を測定した。結果を相対蛍光ユニット（ＲＦＵ）で示す。 Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンに対するタンパク質分解抽出物のコラーゲン分解活性を示すグラフである。蛍光標識したＩ型コラーゲンあるいはＩＶ型コラーゲンの存在下でタンパク質分解抽出物を様々な時間インキュベートした。インキュベーション終了時に蛍光を測定した。結果を相対蛍光ユニット（ＲＦＵ）で示す。 コラゲナーゼのコラーゲン分解活性と比較した場合のタンパク質分解抽出物のコラーゲン分解活性を示すグラフである。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｉｔｉｃｕｍのコラゲナーゼを、蛍光標識したＩＶ型コラーゲンあるいは蛍光標識したゼラチンのいずれかとインキュベートし、２０分のインキュベーション終了時に蛍光を測定した。タンパク質分解抽出物を、蛍光標識したＩＶ型コラーゲンと２０分インキュベートし、その後、蛍光を測定した。 タンパク質分解抽出物のゼラチナーゼ活性を示すグラフである。タンパク質分解抽出物の２つのバッチ（Ｊ−０１−１９およびＪ−１４−４５と命名）の濃度をサンプルごとに増加させて、蛍光標識したゼラチンの存在下で２０分インキュベートし、その後、蛍光を測定した。 患者からの手術によるデュピュイトラン索の切除を示す写真である。デュピュイトラン病患者の薬指の異常拘縮を示す写真である。 患者からの手術によるデュピュイトラン索の切除を示す写真である。手術による異常索の除去を示す写真である。 患者からの手術によるデュピュイトラン索の切除を示す写真である。手掌の土台から除去された後の索を示す写真である。 デュピュイトラン索を２つに切開する様子を示す写真である。 索の固定を示す写真である。 デュピュイトラン索への溶液の注入手段を示す写真である。 引張延伸用の機械を示す写真である。 張力適用前および張力適用後の索を示す写真である。張力適用前の索を示す写真である。 張力適用前および張力適用後の索を示す写真である。張力適用後および索が断裂する前の索を示す写真である。 デュピュイトラン索の伸長に対する生理食塩水の効果を引張強度の適用の関数として示す。デュピュイトラン索に生理食塩水を注入し、生理食塩水中で２４時間インキュベートした。その後、索を引張応力に晒し、索の伸長および断裂を調べた。 デュピュイトラン索の伸長に対するタンパク質分解抽出物の効果を引張強度の適用の関数として示す。デュピュイトラン索にタンパク質分解抽出物を注入し、タンパク質分解抽出物の存在下で２４時間インキュベートした。その後、索を引張応力に晒し、索の伸長および断裂を調べた。 デュピュイトラン索の伸長に対するタンパク質分解抽出物の注入一回分の効果を引張強度の適用の関数として示す。デュピュイトラン索にタンパク質分解抽出物を注入し、生理食塩水中で２４時間インキュベートした。その後、索を引張応力に晒し、索の伸長および断裂を調べた。

本発明は、ブロメラインから得られたタンパク質分解抽出物を、そのような治療を必要とする対象へ投与することを含む、異常なコラーゲンの沈着を伴う結合組織疾患の治療方法を提供する。

ブロメライン（Ｄｅｂｒａｓｅ（登録商標）とも呼ばれる）から得られた創傷清拭組成物は、本発明の出願人による国際公開第２００６／０５４３０９号において初めて開示されており、その内容は本明細書に完全に記載されているかの如く、参照により組み込まれる。国際公開第２００６／０５４３０９号において開示される創傷清拭組成物は、ステムブロメラインおよびアナナインなどのシステインプロテアーゼを含む。さらに国際公開第２００６／０５４３０９号は、創傷清拭組成物が、火傷した皮膚、すなわち失活した組織をブロメラインよりも効率よく創傷清拭したことを開示する。しかし、創傷清拭組成物は健康な、または生きた皮膚あるいは真皮の創傷清拭においては不活性であることが見出された（例えばＳｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｊ． Ｂｕｒｎ Ｃａｒｅ Ｒｅｓ． ３１： ３０４−３０９を参照）。従って、創傷清拭組成物は、生組織ではなく、失活した組織に対して有効であることが示された。

本発明は、ブロメラインから得られたタンパク質分解抽出物が、予想外にも、インビトロにおいてコラーゲン分解活性を示し、デュピュイトラン病に罹患した対象から得られた手掌の線維性索を溶解できることを開示する。本発明のタンパク質分解抽出物は健康な結合組織を分解しないため、従って本発明は、コラーゲンの豊富な線維組織の溶解、具体的にはデュピュイトラン病またはペイロニー病に罹患した対象における溶解のための、安全かつ効率的な酵素の薬剤を提供する。

「ブロメラインから得られたタンパク質分解抽出物」および「タンパク質分解抽出物」なる用語は、本明細書および特許請求の範囲の全体に渡って互換的に使用され、ブロメラインから粗精製された酵素調製物を指す。

「ブロメライン」なる用語は、複数の現在市販されているブロメライン粉末調製物のいずれをも指す。ブロメラインの製造業者の例としては、限定されるものではないが、ＳｉｇｍａおよびＣｈａｌｌｅｎｇｅ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ． Ｌｔｄ．（台湾）が含まれる。ブロメラインは植物パイナップルの茎から調製される。ブロメラインを得る典型的な手順は以下の通りである。まず植物パイナップル茎由来の汁のｐＨをリン酸で約３または４に調整し、スルフヒドリル酸化から保護するために水素化ナトリウムまたは硫化水素ナトリウムを加える。不活性物質を約３０％のアセトンで沈殿させ、ろ過の後、きれいになった液体を７０％のアセトンで沈殿させる。この沈殿物を遠心分離により回収し、リン酸で酸性化した水素化ナトリウムまたは硫化水素ナトリウムを含む水に再溶解させてから再沈殿させるか、あるいはそのまま真空乾燥器中で乾燥させる。物質を再沈殿させる場合には７０％のアセトンを使用する。いずれの手順で得た乾燥物質も、本発明の創傷清拭組成物を得るための出発物質として適当である。

本発明のタンパク質分解抽出物はブロメラインに存在する１種類以上のシステインプロテアーゼを含み得る。好例な実施形態によれば、タンパク質分解抽出物（別名Ｄｅｂｒａｓｅ（登録商標）またはＮｅｘｏｂｒｉｄ（登録商標））はシステインプロテアーゼであるステムブロメライン（ＥＣ ３．４．２２．３２）およびアナナイン（ＥＣ ３．４．２２．３１）を含む。タンパク質分解抽出物は、例えばアナナイン（ＥＣ ３．４．２２．３１）前駆体、フルートブロメライン（ＥＣ ３．４．２２．３３）前駆体、およびステムブロメライン（ＥＣ ３．４．２２．３２）前駆体などの、ブロメラインのシステインプロテアーゼ前駆体を１種類以上さらに含み得る。タンパク質分解抽出物は、システインプロテアーゼの断片（例えば国際公開第２００６／０５４３０９号を参照）、ジャカリン様レクチン（例えばＲａｖａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，１４（１２）：１２４７−１２６３を参照）、および／またはブロメライン阻害剤をさらに含み得る。

タンパク質分解抽出物は、以下の手順を含む方法によって調製できる。
（ａ）任意選択で抗酸化剤を含む、ｐＨが約２．４〜約４の酸性溶液中にブロメラインを懸濁する。
（ｂ）（ａ）の懸濁液のｐＨを約２．４〜約４に調整する。
（ｃ）（ｂ）の懸濁液にろ過助剤を加える。
（ｄ）（ｃ）の懸濁液をろ過し、不溶性の構成成分を除去する。
（ｅ）（ｄ）のろ過後の溶液に硫酸アンモニウム塩を加え、約４０％〜約５０％の範囲で硫酸アンモニウムを飽和させる。
（ｆ）（ｅ）の懸濁液のｐＨを約２．５〜約４に調整する。
（ｇ）（ｆ）の懸濁液を３℃〜１０℃にてインキュベートする。
（ｈ）（ｇ）の懸濁液を遠心分離し、硫酸アンモニウム沈殿を得る。
（ｉ）硫酸アンモニウム沈殿を、任意選択で抗酸化剤を含む、ｐＨが約２．４〜約４の酸性溶液中に溶解する。
（ｊ）（ｉ）の溶液を１０ｋＤａの限外ろ過膜でろ過する。
（ｋ）（ｊ）の保持溶液を凍結乾燥する。

一部の実施形態によれば、ブロメラインの懸濁は、ｐＨが約２．４〜４のいかなる酸性溶液中でも可能である。本発明によれば、使用可能な酸性溶液または緩衝液の例としては、限定されるものではないが、ｐＨが２．４〜４の、酢酸水溶液、酢酸塩緩衝液、およびチオグリコール酸を１％含む酢酸塩緩衝液が含まれる。特定の好例な実施形態によれば、酸性溶液は、米国特許第５，８３０，７３９号および同第４，１９７，２９１号において開示される緩衝液および溶液から選択され、その内容は本明細書に完全に記載されているかの如く、参照により組み込まれる。

酸性溶液は、任意選択で抗酸化剤を含んでよい。抗酸化剤の例としては、限定されるものではないが、アスコルビン酸、ジヒドロキノン、ブチルヒドロキシトルエンおよびジチオスレイトールが含まれる。抗酸化剤は約０．５％〜約２％、好ましくは１％の濃度で加えられてよい。

酸性溶液は、湿潤剤をさらに含んでよい。湿潤剤の例としては、限定されるものではないが、ｎ−オクタノールが含まれる。

任意選択で抗酸化剤を含む酸性溶液のｐＨは約２．４〜約４であってよい。特定の好ましい実施形態によれば、任意選択で抗酸化剤を含む酸性溶液のｐＨは約２．４〜約２．６である。

さらなる実施形態によれば、ろ過助剤が（ａ）の懸濁液に加えられる。一実施形態によれば、ろ過助剤はシリカを含む。好ましくは、ろ過助剤は、より速い流速を達成するために焼成された天然の珪藻土である。

所望のタンパク質の沈殿は、手順（ｄ）のろ過後の溶液に硫酸アンモニウム塩を加えることにより行われる。硫酸アンモニウム塩は、約４０％〜約５０％の範囲で硫酸アンモニウムを飽和させるために加えられてよい。好ましくは、硫酸アンモニウム塩は、硫酸アンモニウムを４０％で飽和させるために加えられてよい。

手順（ｆ）の懸濁液は次に３℃〜１０℃にてインキュベートされる。好ましくは、手順（ｆ）の懸濁液は３℃〜１０℃にて少なくとも１０時間インキュベートされる。より好ましくは、手順（ｆ）の懸濁液は４℃にて１２〜２４時間インキュベートされる。

インキュベーション終了時に、手順（ｇ）の懸濁液は遠心分離され、所望のタンパク質、すなわちタンパク質分解酵素が沈殿する。沈殿は次に、任意選択で抗酸化剤を含む酸性溶液に溶解される。好例な実施形態によれば、懸濁液は４℃にて少なくとも１０時間インキュベートされる。

手順（ｉ）の溶液は、分子量が約１０ｋＤａを超えるタンパク質分解酵素を保持するために、ろ過工程に供される。好ましい実施形態によれば、手順（ｉ）の溶液は、分画分子量が約１０ｋＤａのろ過膜によりろ過される。

タンパク質分解抽出物は、ろ過後に凍結乾燥されてよく、蒸留水で洗浄後、凍結乾燥されてよく、あるいは、ろ過の後、凍結乾燥されてよい。一般に好ましい実施形態によれば、タンパク質分解抽出物は、無菌液を得るために、孔サイズが少なくとも約０．５μｍのろ過膜によりろ過され、その後、凍結乾燥され、保存される。好ましくは、タンパク質分解抽出物は、水分が無いと安定性が増すため、凍結乾燥粉末として保存される。タンパク質分解抽出物は使用前に、ｐＨが約６〜約７の溶液を得るために溶液に溶解される。

好例な実施形態によれば、タンパク質分解抽出物は、以下の手順を含む方法により調製できる。
（ａ）１％のアスコルビン酸およびｎ−オクタノールを含む、ｐＨが約２．４〜約２．６の０．３Ｍ酢酸にブロメラインを懸濁する。
（ｂ）（ａ）の懸濁液のｐＨを約２．５〜約３．５に調整する。
（ｃ）（ｂ）の懸濁液にシリカを含むろ過助剤を加える。
（ｄ）（ｃ）の懸濁液をフィルタープレスによりろ過し、不溶性の構成成分を除去する。
（ｅ）（ｄ）のろ過後の溶液に硫酸アンモニウム塩（２８５ｇ／Ｌ）を加え、硫酸アンモニウムを４０％で飽和させる。
（ｆ）（ｅ）の懸濁液のｐＨを約２．５〜約３．５に調整する。
（ｇ）（ｆ）の懸濁液を４℃にて約１２〜２４時間インキュベートする。
（ｈ）（ｇ）の懸濁液を遠心分離し、硫酸アンモニウム沈殿を得る。
（ｉ）硫酸アンモニウム沈殿を、アスコルビン酸を１％含む、ｐＨが約２．４〜約２．６の０．３Ｍ酢酸中に溶解する。
（ｊ）（ｉ）の溶液を１０ｋＤａの限外ろ過膜でろ過する。
（ｋ）（ｊ）の保持溶液をろ過し、無菌液を得る。
（ｌ）（ｋ）のろ過後の溶液を凍結乾燥する。

「デュピュイトラン病」および「ＤＤ」なる用語は、本明細書において互換的に使用され、指が完全には広がらず、通常の状態で手の手掌側に屈曲している疾患を指す。具体的には、デュピュイトラン病は、通常は尺骨側の、手掌筋膜における線維腫性小結節の形成から始まる。小結節が進行すると、手掌から指にかけて線維帯あるいは線維性索が形成される。最終的にこれが、恒常的な指の屈曲拘縮の原因となる。最も一般的に罹患するのが薬指であり、小指がこれに続く。

「デュピュイトラン索」および「疾患状態の索」なる用語は、本明細書において互換的に使用され、手掌の皮膚下を縦方向に延びる筋膜線維の帯を指す。これらの帯は、帯に連なる表面を覆う皮膚および末端の指の拘縮の原因となり、最終的には、罹患した指の恒常的な屈曲拘縮にまで発展する。一般的にデュピュイトラン索は、数多くの線維芽細胞、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質、特にコラーゲンの沈着の増加、および筋線維芽細胞を含む。

本発明のタンパク質分解抽出物は、過剰なコラーゲンの沈着に関連する他の疾患に罹患した人の治療に有用であることが理解されるべきである。コラーゲンの沈着を伴う他の線維組織の奇形および異常には、ペイロニー病、レダーホース線維症、および関節包、腱鞘並びに靭帯鞘の線維症が含まれる。従って、タンパク質分解抽出物はまた、肩関節周囲炎（癒着性関節包炎）の治療にも有用である可能性がある。過剰なコラーゲンの沈着または線維組織の奇形を伴うこれらの結合組織疾患は、創傷あるいは火傷とは関連がない。

本明細書において使用される場合、「治療すること」あるいは「治療」なる用語は、少なくとも１以上の結合組織疾患に関連する症状の改善または排除を指す。例えば、デュピュイトラン病に関連する症状には、いくつか列挙すると、関節拘縮、関節の可動範囲の減少が含まれる。ペイロニー病の症状には、例えば、痛み、異常な湾曲、および***不全が含まれる。

タンパク質分解抽出物の「治療上有効な量」なる用語は、組成物を投与された対象に対して薬効を与えるのに十分な、タンパク質分解抽出物の量のことである。

溶液または懸濁液に言及する場合、「約」なる用語は、表示されたｐＨの上下０．５ｐＨ単位が本発明の範囲内であると示すことを意味する。

本発明の医薬組成物はタンパク質分解抽出物および医薬的に許容される運搬体を含む。

「医薬的に許容される」なる用語は、動物における使用、より具体的にはヒトにおける使用について、合衆国または州政府の監督機関に認可されている、あるいは、合衆国薬局方またはその他の一般的に認められた薬局方に記載されていることを意味する。

「運搬体」なる用語は、タンパク質分解抽出物と共に投与される希釈剤、賦形剤、または溶媒を指す。このような医薬運搬体は、水および、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、胡麻油等などの、石油、動物油、植物油、または合成油を含む油類、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、あるいはその他の合成溶媒などの無菌の液体であってよい。生理食塩水、ＮａＣｌ／ＣａＣｌ_２水溶液、水性デキストロース、グリセロール溶液、およびアルブミン溶液が、液体運搬体として、具体的には注入可能な溶液として、用いられてよい。また、医薬組成物が静脈内投与される場合、水も運搬体として用いられ得る。

医薬組成物は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、トラガント、ケイ酸カルシウム、ポリビニルピロリドン、およびセルロースなどの安定化剤をさらに含んでよい。組成物は、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油などの潤滑剤、湿潤剤、乳化剤ならびに懸濁剤、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン、メチルヒドロキシ安息香酸、またはプロピルヒドロキシ安息香酸などの保存剤、アスコルビン酸、ジヒドロキノン、ブチルヒドロキシトルエン、およびジチオスレイトールなどの抗酸化剤、ならびに、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および酒石酸ナトリウムなどの緩衝剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調節剤をさらに含んでよい。

医薬組成物は、麻酔薬をさらに含んでよい。

麻酔薬は、限定されるものではないが、アメソカイン（テトラカイン）、リグノカイン（リドカイン）、キシロカイン、ブピバカイン、プリロカイン、ロピバカイン、ベンゾカイン、メピバカイン、コカイン、およびそれらの組み合わせを含む。

医薬組成物は、抗菌薬をさらに含んでよい。

抗菌薬は、限定されるものではないが、アマンタジン塩酸塩、アマンタジン硫酸塩、アミカシン、アミカシン硫酸塩、アミノグリコシド類、アモキシシリン、アンピシリン、アンサマイシン類、バシトラシン、ベータラクタム類、カンジシジン、カプレオマイシン、カルベニシリン、セファレキシン、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セファピリン、セフラジン、セファログリシン、クロラムフェニコール類、クロルヘキシジン、クロルヘキシジングルコン酸塩、クロルヘキシジン塩酸塩、クロロキシン、クロルキナルドール、クロルテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン塩酸塩、シプロフロキサシン、サーキュリン、クリンダマイシン、クリンダマイシン塩酸塩、クロトリマゾール、クロキサシリン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジヨードヒドロキシキン、ドキシサイクリン、エタンブトール、エタンブトール塩酸塩、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、エリスロマイシンステアリン酸塩、ファルネソール、フロキサシリン、ゲンタマイシン、ゲンタマイシン硫酸塩、グラミシジン、グリセオフルビン、ハロプロジン、ハルキノール、ヘキサクロロフェン、イミノサイクリン、ヨードクロルヒドロキシキン、カナマイシン、カナマイシン硫酸塩、リンコマイシン、リネオマイシン、リネオマイシン塩酸塩、マクロライド類、メクロサイクリン、メタサイクリン、メタサイクリン塩酸塩、メテナミン、馬尿酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、メシチリン、メトロニダゾール、ミコナゾール、ミコナゾール塩酸塩、ミノサイクリン、ミノサイクリン塩酸塩、ムピロシン、ナフシリン、ネオマイシン、ネオマイシン硫酸塩、ネチルマイシン、ネチルマイシン硫酸塩、ニトロフラゾン、ノルフロキサシン、ナイスタチン、オクトピロックス、オレアンドマイシン、セファロスポリン類、オキサシリン、オキシテアクリン、オキシテトラサイクリン塩酸塩、パラクロロメタキシレノール、パロモマイシン、パロモマイシン硫酸塩、ペニシリン類、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ペンタミジン、ペンタミジン塩酸塩、フェネチシリン、ポリミキシン類、キノロン類、ストレプトマイシン硫酸塩、テトラサイクリン、トブラマイシン、トルナフテート、トリクロサン、リファンピン、リファマイシン、ロリテトラサイクリン、銀塩類、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン類、テトラサイクリン、トブラマイシン、トブラマイシン硫酸塩、トリクロカルバン、トリクロサン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、タイロシン、バンコマイシン、およびタイロスリシンを含む。

さらに別の実施形態によれば、医薬組成物は抗炎症薬をさらに含んでよい。

抗炎症薬は、非ステロイド系、ステロイド系、あるいはそれらの組み合わせであってよい。非ステロイド系抗炎症薬の非限定的な例としては、ピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカムなどのオキシカム類、アスピリン、サルサラート、ベノリラート、コリンマグネシウムトリサリチル酸、サファプリン、ソルプリン、ジフルニサル、およびフェンドサルなどのサリチル酸類、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパック、フロフェナク、チオピナク、ジドメタシン、アセメタシン、フェンチアザク、ゾメピラク、クリダナク、オクセピナク、フェルビナク、およびケトロラクなどの酢酸誘導体、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルム酸、およびトルフェナム酸などのフェナム酸類、イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、およびチアプロフェン酸などのプロピオン酸誘導体、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾン、およびトリメタゾンなどのピラゾール類が含まれる。また、これらの非ステロイド系抗炎症薬の抽出物が用いられてもよい。

ステロイド系抗炎症薬の非限定的な例としては、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシトリアムシノロン、α−メチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、酢酸デゾキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（酢酸フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロゾン、フルランドレノロン、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルロゾン、フルランドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン並びにそのエステル類の残りのもの、クロロプレドニゾン、酢酸クロロプレドニゾン、クロコルトロン、クレスシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニソロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンシクロペンチルプロピオネート、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロン、およびそれらの抽出物などの副腎皮質ホルモン剤が含まれる。

医薬組成物は、乾燥製剤または凍結乾燥製剤、半固形製剤、液体製剤、あるいは泡製剤として製剤されてよい。従って、医薬組成物は、粉末、溶液、懸濁液、乳濁液、ゲル、スプレー、あるいはパッチの形態で製剤されてよい。

医薬組成物は、罹患部位に局所投与、皮下投与、皮内投与、あるいは筋肉内投与されてよい。

特定の実施形態によれば、医薬組成物は、注入により投与される。好例な実施形態によれば、医薬組成物は、疾患状態の線維性小結節または線維性索に、あるいは線維性斑に直接注入される。あるいは、医薬組成物は、手術による切開部に移植される。無菌の注入可能な調製物が、当技術分野において周知のように、水溶液あるいは油性の懸濁液として製剤されてよい。

皮膚上での局所的な使用のために、医薬組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、スプレー、あるいはエアロゾルの形態で製剤されてよい。適切な溶媒の例としては、限定されるものではないが、ワセリン、アクアフォー、ネオベース、プロピレングリコール、グリセリン等が含まれる。また、これらの溶媒の２つ以上の組み合わせも使用され得る。

医薬組成物は、所定の期間にわたる有効成分の放出の延長を可能とする、放出制御製剤または持続放出製剤として製剤されてよい。特定の実施形態において医薬組成物は、選択部位において、調節された期間にわたってタンパク質分解抽出物を放出する、生分解性の、生体適合性高分子インプラントと組み合わせて投与される。高分子素材の例としては、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレン−酢酸ビニル、共重合体、およびそれらの混合物が含まれる（Ｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ， Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ （ｅｄｓ．）， １９７４， ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ．を参照）。あるいは、医薬組成物は、ゲルとして局所投与される。使用可能な高分子素材の例としては、多糖類、具体的には、例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、キチン、キトサン、およびアルギン酸がある。ゲル製剤は、所定の期間にわたる有効成分の放出の延長を可能とする。

医薬組成物は、発泡体として製剤されてよい。発泡性組成物を発泡体として生じさせて投与するために高圧ガスが使用される。適切な高圧ガスの例としては、ブタン、プロパン、イソブタンあるいはそれらの混合物などの揮発性炭化水素、およびフッ化炭素ガスが含まれる。組成物は、水溶性、水中油型乳剤、または油中水型乳剤であってよく、安定化剤をさらに含む。安定化剤は組成物の粘度を増加させ、組成物の安定性に寄与でき、および／あるいは発泡体の崩壊速度を低下させる。安定化剤の例としては、限定されるものではないが、天然起源の高分子素材（例えば、アルギン酸、アルブミン、カラゲナン、キサンタンガム、デンプン）、セルロースエーテル（例えば、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）などの半合成高分子素材、および合成高分子素材（例えば、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、およびポリビニルピロリドン）が含まれる。

薬剤の製剤および投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

医薬組成物を、単一用量で、あるいは疾患線維組織の２ヵ所以上に分割して投与することが可能である。投与されるタンパク質分解抽出物の量は、斑を軟化させる、および／あるいは断裂させるのに有効な量である。タンパク質分解抽出物の有効量は、約０．２ｍｇ／日から約４０ｍｇ／日に及んでよい。特定の実施形態において医薬組成物は、２回以上に分けて投与され、それぞれが医薬組成物を約０．５〜１．５ｍｇ含み、任意選択で０．２〜０．５ｍｌの溶液あるいは懸濁液である。

特定の実施形態において、タンパク質分解抽出物を含む医薬組成物が投与される臓器は、数時間、例えば２〜１２時間、固定化される。

本明細書を通じて開示された各々の可能性は、本発明の個別の実施形態である。

以下の実施例は、本発明のより完全なる理解を提供するために提示される。本発明の原理を説明するために記載された具体的な技術、条件、素材、配合、および報告データは例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１：タンパク質分解抽出物のコラーゲン分解活性
タンパク質分解抽出物は、国際公開第２００６／０５４３０９号に記載の通りにブロメラインより得た。

デブラーゼ（Ｄｅｂｒａｓｅ）の２つのバッチのＩＶ型コラーゲン分解活性を最初に測定した。アッセイは、フルオレセインで標識されたＤＱ−ＩＶ型コラーゲン（商標）を基質として含むＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）ゼラチナーゼ／コラゲナーゼアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づいた。この基質はコラゲナーゼにより効率よく消化され、強い蛍光のペプチドを生じることが知られている。蛍光の増大はタンパク質分解活性に比例する。

各ウェルにデブラーゼ反応バッファ（０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）を加え、最終的な体積を１００μｌとした。次に０．５μｇ／μｌのＤＱ−ＩＶ型コラーゲン（商標）溶液をウェルに１０μｌ加えた。その後、デブラーゼバッファ中で０．２２５〜１ｎｇ／μｌの濃度の新しく調製したデブラーゼを異なる量（１０〜８０μｌ）でウェルに加え、１．５〜２０ｎｇ／ウェルの濃度とした。デブラーゼバッファをネガティブコントロールとして使用した。反応プレートを室温で２０分インキュベートした。反応を停止させるために、２０μｌの反応停止溶液（０．３２４ｍＭでヨード酢酸を含むデブラーゼバッファ）を加えた。蛍光強度を、標準的なフルオレセインフィルターを備えた蛍光マイクロプレートリーダー（分析者ＡＤ、ＬＪＬ）により測定した。酵素非存在下でインキュベートしたウェルからのバックグラウンドの蛍光を差し引いた。

図１はデブラーゼの２つのバッチのコラーゲン分解活性を示す。図に示される様に、デブラーゼの２つのバッチは同様のコラーゲン分解活性を発現し、本発明のタンパク質分解抽出物を得るための実験手順により一貫した酵素調製物が産生されることが示された。

次に、タンパク質分解抽出物のＩ型およびＩＶ型コラーゲン分解活性を測定した。そのために、フルオレセインで標識されたＤＱ−ＩＶ型コラーゲン（商標）およびＤＱ−Ｉ型コラーゲン（商標）を基質として用いた。アッセイは上記の通りに行い、図２に示される時間継続した。２０μｌの反応停止溶液（０．３２４ｍＭでヨード酢酸を含むデブラーゼバッファ）の添加により反応を停止し、蛍光強度を上記の通りに測定した。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍから精製されたコラゲナーゼを、予め定義された活性を有するポジティブコントロールとした（１ユニットを、３７℃、ｐＨ７．５において５時間でコラーゲンから１μｍｏｌのＥ−ロイシン当量を遊離させるのに必要な酵素の量として定義した）。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍのコラゲナーゼを用いたアッセイのために、コラゲナーゼ用反応バッファ（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．２ｍＭ アジ化ナトリウム、ｐＨ７．６）を各ウェル当り最終的な体積が１００μｌとなるように加えた。次に、クロストリジウムコラゲナーゼバッファ中で０．４〜１ｍＵ／μｌとしたクロストリジウムコラゲナーゼを異なる量（１０〜８０μｌ）で参照ウェルに加え、５〜８０ｍＵ／ウェルの範囲の濃度にした。クロストリジウムコラゲナーゼの反応を停止するために、２ｍｇ／ｍｌで１，１０−フェナントロリンを含むコラゲナーゼバッファを２０μｌ加えた。

クロストリジウムコラゲナーゼのデータをｍＵ当りの参照値として用いた。タンパク質分解抽出物（別名デブラーゼ）サンプルのデータを参照値で割り、ｍＵ／ｎｇデブラーゼを決定した。

図２は、タンパク質分解抽出物がＩ型およびＩＶ型コラーゲンをそれぞれ１．５８および１．２７ｍＵ／ｎｇの特異的活性で分解したことを示す。

次に、タンパク質分解抽出物の活性を、コラーゲンに対するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍのコラゲナーゼ活性と比較した。また、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）ゼラチナーゼ／コラゲナーゼアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および基質としてＤＱゼラチン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、コラゲナーゼのゼラチンに対するタンパク質分解活性も測定した。

図３はタンパク質分解抽出物がＩＶ型コラーゲンに対するコラーゲン分解活性を発現したことを示し、その活性はコラーゲンに対して市販のコラゲナーゼにより得られる活性よりも高かった。

図４はタンパク質分解抽出物がゼラチナーゼ活性を発現したことを示す。図に示される様に、タンパク質分解抽出物のゼラチナーゼ活性は２〜８ｎｇ／ウェルの範囲の濃度において直線的であった。

実施例２：タンパク質分解抽出物はデュピュイトラン索の断裂を促進する。
デュピュイトラン索は筋膜切除を受けている患者より得た（図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ）。手術前に全ての対象が同意書に署名し、研究はヘルシンキの委員会によって承認された。実験によりタンパク質分解抽出物の索の筋膜を切除する能力が調査された。

組織の調製
患者より得られた索を、その長さに応じて２つまたは３つの断片に分けた（図６）。Ｋｒａｃｋｏｖの手法により索をプロレン１の縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）で機械試験装置に連結した（図７）。２つの索のうちの１つにタンパク質分解抽出物（索のサイズに応じて０．３ｍｌ〜０．５ｍｌのタンパク質分解抽出物）を注入し、２つ目の対照の索には生理食塩水を注入した（図８）。タンパク質分解抽出物の群の索をタンパク質分解抽出物の溶液に浸し、対照群の索は生理食塩水に浸した。両群を３７℃にて２４時間インキュベートした。

機械試験
２４時間のインキュベーションの後、全ての索を機械式引張応力試験装置（Ｚｗｉｃｋ １４４５試験システム、Ｚｗｉｃｋ Ｃｏ．、ドイツ）に連結した。各々の索を、索または連結している縫合糸が断裂するまで、増加する荷重に晒した。断裂するまで適用した張力を装置により測定した。

組織学的解析
組織学的解析および疾患の段階の判定のために、各検体のサンプルを得た。

統計的解析
調査群と比較した対照群の効率をフィッシャー直接確率法により検定した。

結果
タンパク質分解抽出物で処理した索（ｎ＝１０）は全て、伸張の後、断裂した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。タンパク質分解抽出物で処理した索の一部は、ほぼ完全に断裂し、機械試験の前に事実上溶解した。対照の索（ｎ＝９）は全て、張力適用後に断裂しなかった。図１１に示されるように、対照の索は全て、非常に高い荷重を適用した場合に断裂するまで、索への応力が増加するにつれて有限の伸長に象徴される同様の応力伸長パターンを示した。対照的に、タンパク質分解抽出物で処理した索は全て、索の引張強度の消失を示し、結果的に非常に低い応力で索が断裂した（図１２）。これらの結果により、低用量、すなわち０．８ｍｇ／ｍｌのタンパク質分解抽出物にデュピュイトラン病の索を断裂させる能力があること、および、さらにこの効果は、より高用量、すなわち１５０ｍｇ／ｍｌまでのタンパク質分解抽出物でも示されることが証明された。

デュピュイトラン索の伸張に対するタンパク質分解抽出物の注入１回分の効果を評価するために、索の、索に沿った３ヵ所の異なる部位にタンパク質分解抽出物を注入し、その後、タンパク質分解抽出物非存在下で生理食塩水中において３７℃にて２４時間インキュベートした。

図１３は、デュピュイトラン索の３ヵ所におこなったタンパク質分解抽出物の注入により索の引張強度を４分の１から５分の１に減少させることができたことを示す（図１３参照、テスト１ａおよび２はそれぞれ１８Ｎおよび１５Ｎの応力での索の断裂を示している）。１つの索（図１３、テスト１ｂ）は０．４Ｎの応力で断裂を起こした。これらの結果は、タンパク質分解抽出物のデュピュイトラン索を溶解させる効率性を証明し、本発明のタンパク質分解抽出物が、デュピュイトラン病、およびその他の過剰なコラーゲンの沈着を伴う結合組織疾患のための、非常に有効な酵素薬であることを明確に意味する。

本発明は、本明細書において具体的に示された、および上述された事項により限定されるものではないことが当業者によって認識されるであろう。むしろ本発明の範囲は以下の特許請求の範囲により定義される。

Claims (18)

1. 治療上有効な量の、ブロメラインから得られたタンパク質分解抽出物、および医薬的に許容される運搬体を含む医薬組成物をその治療を必要とする対象に投与することを含む、結合組織疾患を治療する方法であって、前記タンパク質分解抽出物は、ステムブロメラインおよびアナナインからなる群から選択される少なくとも１種類のシステインプロテアーゼを含み、前記結合組織疾患は過剰なコラーゲンの沈着に関連する、方法。
2. 前記結合組織疾患が、デュピュイトラン病、ペイロニー病、肩関節周囲炎、およびレダーホース病からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記結合組織疾患がデュピュイトラン病である、請求項１に記載の方法。
4. 前記結合組織疾患がペイロニー病である、請求項１に記載の方法。
5. 前記タンパク質分解抽出物がステムブロメラインおよびアナナインを含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記タンパク質分解抽出物が、少なくとも１種類のシステインプロテアーゼ前駆体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記医薬組成物が、麻酔薬、抗菌薬および抗炎症薬からなる群から選択される薬剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記麻酔薬が、アメソカイン（テトラカイン）、リグノカイン（リドカイン）、キシロカイン、ブピバカイン、プリロカイン、ロピバカイン、ベンゾカイン、メピバカイン、コカインおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記抗菌薬が、アマンタジン塩酸塩、アマンタジン硫酸塩、アミカシン、アミカシン硫酸塩、アミノグリコシド類、アモキシシリン、アンピシリン、アンサマイシン類、バシトラシン、ベータラクタム類、カンジシジン、カプレオマイシン、カルベニシリン、セファレキシン、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セファピリン、セフラジン、セファログリシン、クロラムフェニコール類、クロルヘキシジン、クロルヘキシジングルコン酸塩、クロルヘキシジン塩酸塩、クロロキシン、クロルキナルドール、クロルテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン塩酸塩、シプロフロキサシン、サーキュリン、クリンダマイシン、クリンダマイシン塩酸塩、クロトリマゾール、クロキサシリン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジヨードヒドロキシキン、ドキシサイクリン、エタンブトール、エタンブトール塩酸塩、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、エリスロマイシンステアリン酸塩、ファルネソール、フロキサシリン、ゲンタマイシン、ゲンタマイシン硫酸塩、グラミシジン、グリセオフルビン、ハロプロジン、ハルキノール、ヘキサクロロフェン、イミノサイクリン、ヨードクロルヒドロキシキン、カナマイシン、カナマイシン硫酸塩、リンコマイシン、リネオマイシン、リネオマイシン塩酸塩、マクロライド類、メクロサイクリン、メタサイクリン、メタサイクリン塩酸塩、メテナミン、馬尿酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、メシチリン、メトロニダゾール、ミコナゾール、ミコナゾール塩酸塩、ミノサイクリン、ミノサイクリン塩酸塩、ムピロシン、ナフシリン、ネオマイシン、ネオマイシン硫酸塩、ネチルマイシン、ネチルマイシン硫酸塩、ニトロフラゾン、ノルフロキサシン、ナイスタチン、オクトピロックス、オレアンドマイシン、セファロスポリン類、オキサシリン、オキシテアクリン、オキシテトラサイクリン塩酸塩、パラクロロメタキシレノール、パロモマイシン、パロモマイシン硫酸塩、ペニシリン類、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ペンタミジン、ペンタミジン塩酸塩、フェネチシリン、ポリミキシン類、キノロン類、ストレプトマイシン硫酸塩、テトラサイクリン、トブラマイシン、トルナフテート、トリクロサン、リファンピン、リファマイシン、ロリテトラサイクリン、銀塩類、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン類、テトラサイクリン、トブラマイシン、トブラマイシン硫酸塩、トリクロカルバン、トリクロサン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、タイロシン、バンコマイシン、およびタイロスリシンからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
10. 前記抗炎症薬が、非ステロイド系抗炎症薬およびステロイド系抗炎症薬からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
11. 前記医薬組成物が、安定化剤、抗酸化剤、保存剤、緩衝剤、キレート剤、および等張化剤からなる群から選択される構成成分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記医薬組成物が、固形製剤、半固形製剤、液体製剤、および泡製剤からなる群から選択される形態で製剤化される、請求項１に記載の方法。
13. 前記固形製剤が粉末である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記液体製剤が、ｐＨが約６〜約７の注入可能な溶液である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記医薬組成物が、疾患線維組織への注入により投与される、請求項１に記載の方法。
16. 前記医薬組成物が、単一用量で注入される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記医薬組成物が、疾患線維組織の２ヵ所以上に分割して注入される、請求項１５に記載の方法。
18. 結合組織疾患の治療に使用するための、タンパク質分解抽出物を含む医薬組成物であって、前記タンパク質分解抽出物は、ステムブロメラインおよびアナナインからなる群から選択される少なくとも１種類のシステインプロテアーゼを含み、前記結合組織疾患は過剰なコラーゲンの沈着に関連する、医薬組成物。

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