DK177324B1 - Præparat og anvendelse deraf ved fremstilling af et lægemiddel til lindring af Dupuytren's syndrom - Google Patents

Abstract

Ved Dupuytren s sygdom injiceres kollagenase ind i de af sygdommen for årsagede strenge, hånden immobiliseres med det samme og holdes immobili seret i flere timer. Strengen afspændes eller sprænges, hvilket lindrer den af sygdommen forårsagede håndkontraktur.

Description

DK 177324 B1

Dupuytren's sygdom (Dupuytren's kontraktur) af hånden optræder hovedsagelig, men ikke udelukkende, hos mænd. Den findes hyppigere hos midaldrende og ældre personer, personer af nordeuropæisk afstamning og personer med visse kroniske sygdomme, fx diabetes, alkoholisme og rygning. År-5 sagen kendes ikke.

Sygdommen er karakteriseret ved en fortykkelse og kontraktur af håndfladens fascie (bindevæv) og udvikler sig sædvanligvis til bøjningsdeformiteter, der involverer én eller flere fingre. Dette skyldes dannelse af langsgående 10 strenge af forhærdet bindevæv i håndfladen, der strækker sig ind i fingrene.

En lignende læsion optræder af og til i foden. Der er ikke blevet fundet nogen effektiv palliativ behandling; alvorlige tilfælde behandles kirurgisk (fasciotomi eller fasciektomi).

15 For tiden er den hyppigst anvendte terapi for involutions- og residualfaserne af Dupuytren's sygdom kirurgisk fasciektomi (dvs. fjernelse). Adskillige forfattere har foreslået alternative, ikke-kirurgiske terapiformer, herunder kemisk eller enzymatisk fasciotomi. Forskere har anvendt vitamin E, dimethylsulfoxid (DMSO), tocopherol, røntgenstråler og fysioterapi, uden at dette resulterede i 20 terapeutiske forbedringer. Desuden er der beskrevet tilfælde, hvor anvendelse af allopurinol og methyl hydrazin og steroider bevirkede en umiddelbar forbedring, der dog ikke holdt over længere tid. Hueston berettede om anvendelsen af en blanding af trypsin, hyaluronidase og lidocain, der blev injiceret i Dupuytren-knuder og -strenge hos 12 patienter, med efterfølgende spræng-25 ning af den syge fascie ved tvunget fingerstrækning, men uden længerevarende forbedringer.

E. Ippolito et al. (Experimental Study on the Use of Collagenase in Localized Connective Tissue Fibrosis, Ital. J. Orthop., Traumatol., bind 1/2, 279-290 30 (1975)) anvendte kaninsener som en model for Dupuytren- strenge. I in vivo tests blev akillessenen hos kaniner infiltreret med 1 cm3 af en opløsning af 2 DK 177324 B1

Whartington's kollagenase. Opløsningerne indeholdt hhv. 40, 80 og 160 enheder af enzymet pr. cm3. (1 Whartington-enhed er omtrent lig med 2 ABC-enheder.) Efter aflivning 24 timer senere viste den med 40 enheder infiltrerede sene ikke tegn på nedbrydning, mens den med 160 enheder infiltrerede 5 sene viste massiv nedbrydning.

Thomas L. Wegman, US-patent 5.589.171, 12/31/96, anviser behandling af Dupuytren's sygdom ved injektion af kollagenase i fiberstrengene. Der forelægges data, hvor udskårne strenge behandles in vitro. I ét forsøg injiceredes 10 3600 ABC-enheder kollagenase i 0,5 ml diluent i hver af ti strenge, der deref ter inkuberedes i 24 timer. Middeltrækmodulet blev reduceret, og der iagttages sprængning af kollagenbundter. I et andet in vitro forsøg blev udskårne strenge klippet i stykker og inkuberet i 48 timer med kollagenase i forskellige koncentrationer fra 225 til 900 ABC-enheder pr. ml i diluent. En undersøgelse 15 af sektioner af de behandlede strenge afslørede en tiltagende sprængning af kollagen. Det konkluderedes, at 450 ABC-enheder pr. ml var en passende koncentration.

Håndkontraktur som følge af Dupuytren's sygdom kan ifølge opfindelsen af-20 hjælpes ved at injicere kollagenase i en effektiv mængde og koncentration i den fibrøse Dupuytren-streng, idet hånden immobiliseres umiddelbart efter injektionen og holdes ubevægelig i flere timer. De bedste resultater opnås, når patienten befinder sig i sygdommens residualfase.

25 Opfindelsen angår nærmere bestemt anvendelse af kollagenase til fremstilling af en farmaceutisk sammensætning til behandling af Dupuytren’s sygdom, hvor sammensætningen omfatter kollagenase i en farmaceutisk acceptabel bærer med en koncentration på ca. 15.000 til ca. 75.000 ABC-enheder kollagenase pr. ml. bærer, og hvor sammensætningen omfatter en kollage-30 nasedosis på mindst 8.000 ABC-enheder.

3 DK 177324 B1

Kollagenase er et enzym, som har den specielle evne, at det nedbryder kollagen. Det fremstilles kommercielt ved fermentering af Clostridium histolyti-cum og oprenses ved hjælp af en kromatografisk teknik.

5 Styrkebestemmelsen af kollagenase er baseret på nedbrydningen af ikke-denatureret kollagen (fra kvægsener) ved pH 7,2 og 37°C i 20-24 timer. Antallet af spaltede peptidbindinger måles ved reaktion med ninhydrin. Ami-nogrupper, der frigives ved en trypsinnedbrydningskontroltest, trækkes fra.

Én netto ABC-enhed kollagenase solubiliserer ninhydrinreaktivt materiale 10 ækvivalent med 1,09 nanomol leucin pr. minut.

Steriliseret lyofiliseret kollagenasepulver kan fås med en minimumstyrke på 50 ABC-enheder pr. mg. Styrken kan være betydeligt højere fra portion til portion, men tages med i beregningen, når vægten af pulveret, der skal an-15 vendes sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer, fx. almindeligt saltvand, bestemmes ved fremstilling af en ønsket koncentration til behandling.

Kollagenasen anvendes i en farmaceutisk acceptabel flydende bærer, som også er inert over for kollagenase. Eksempler er almindeligt saltvand, vandig 20 NaCI/CaCI2-puffer, vandig dextranopløsning, vandig hetastivelseopløsning.

I en udførelsesform er anvendelsen ifølge opfindelsen egnet til fremstilling af en farmaceutisk sammensætning til behandling ved injektion i en fibrøs streng i hånden hos en person, der lider af Dupuytren’s sygdom, og hvor 25 hånden immobiliseres umiddelbart efter injektionen. Immobiliseringen kan gøres ved at hånden omvikles med en tilstrækkelig gazebandage og således, at der dannes en omfangsrig forbinding, og derefter holdes ubevægelig i flere timer.

30 Hånden, og især den angrebne finger, hindres således i at bevæge sig i væsentlig grad. Immobiliseringen fortsættes i flere timer, fx 4 til 10 timer. Det 4 DK 177324 B1 antages, at dette kan minimere udtrykningen af kollagenaseopløsning fra strengen og giver tilstrækkelig, men ikke overdreven lang tid til, at kollagena-sen kan indvirke på strengen, hvilket fører til gode kliniske resultater. Hvis injektionen gives tidligt på eftermiddagen, vil forbindingen typisk blive fjernet 5 ved sengetid.

Mængden og koncentrationen af den anvendte kollagenase bevirker en blødgøring og afspænding eller sprængning af strengen. Når den af strengen udøvede spænding, der har holdt fingeren bøjet, lettes således, vil fingeren 10 snart rette sig ud, sædvanligvis fuldstændigt.

Ifølge opfindelsen injiceres tilstrækkelig kollagenaseopløsning i Dupuytren-strengen til at tilvejebringe en samlet kollagenasedosis på mindst 8.000 ABC-enheder, og fortrinsvis en mængde i intervallet fra 8.000 til ca. 15.000 ABC-15 enheder. Kollagenasekoncentrationen i bæreren er i intervallet fra ca. 15.000 til ca. 75.000 ABC-enheder pr. ml bærer. Egnede kombinationer er fx mindst 8.000 ABC-enheder i en koncentration på mindst 30.000 enheder/ml; mindst 10.000 enheder i en koncentration på mindst 40.000 enheder/ml. Generelt gælder det, at jo mindre mængden af kollagenase er, desto større bør kon- 20 centrationen være. Hvis der således i en speciel situation ønskes anvendt 5.000 ABC-enheder, vil en koncentration på fra 20.000 til 50.000 enheder/ml være ønskelig.

Det samlede volumen af injiceret væske overstiger fortrinsvis ikke ca. 0,5 ml.

25 Et mindre volumen ned til fra ca. 0,25 ml til ca. 0,1 ml er sædvanligvis mere foretrukket.

Vigtige aspekter af opfindelsen er, at den samlede dosis pr. streng injiceres i multiple portioner, fortrinsvis mindst tre, på forskellige steder i strengen, men 30 i umiddelbar nærhed af hinanden. Det er ønskværdigt, at disse steder har en indbyrdes afstand på ca. 2 mm, og at de sædvanligvis befinder sig ved eller 5 DK 177324 B1 tæt ved mellemhåndsfingerleddet og/eller grundstykkefingerleddet. Nålen af injektionssprøjten bør ikke indføres i ret vinkel i forhold til strengen, men i en spids vinkel. Formålet med disse procedurer er at sikre en god fordeling af kollagenasen inden for et lille volumen af strengen.

5 I tilfælde, hvor resultaterne af en enkelt behandling anses for at være utilstrækkelige, kan de samme procedurer med den samme samlede kollagena-semængde og -koncentration gentages fra én til højst fem gange med ugentlige intervaller.

10

Dupuytren's sygdom skrider langsomt frem over en lang årrække og forårsager fikserede bøjningsdeformiteter i fingrenes mellemhåndsled (MP) og grundstykkeled (PIP). Lillefingeren og ringfingeren er de hyppigst påvirkede fingre. Sygdommen skrider frem gennem tre faser som beskrevet af J.V.

15 Luck, J. Bone Joint Surg. 41A:635-664, 1959. Den indledende proliferation-fase er karakteriseret ved knudedannelse i håndfladens fascie, hvor der dukker en celletype op, der er kendt under betegnelsen myofibroblast (G. Gab-biani, G. Majno, Am. J. Pathol. 66:131-138, 1972), og begynder at proliferere. Involutions- eller midterfasen er fokus for ekstrem myofibroblastproliferation 20 og disse cellers dannelse af aktivt type III kollagen. I den sidste fase eller residualfasen forsvinder modulet sammen med myofibroblasten, og der forbliver kun en tæt fibrøs type I kollagenstreng, der histologisk set minder om en sene.

25 Den bedste anvendelse af opfindelsen finder sted ved behandling af residual-fasen/endefasen af Dupuytren's sygdom. Den saglige begrundelse for at injicere i strenge i stedet for i Dupuytren-knuder eller under involutionsfa-sen/midterfasen er, at strenge indeholder et ringe antal fibroblaster, er relativt ikke-vaskulære og består overvejende af type I kollagen, men ikke indeholder 30 myofibroblaster, som det er tilfældet med knuderne og under midterfasen.

Der findes ingen indikation for, at kollagenase er cytotoxisk overfor myo- 6 DK 177324 B1 fibroblaster. Derfor ville en injektion af kollagenase i knuderne eller under midterfasen, hvor der forekommer myofibroblaster, højst sandsynligt resultere i et snarligt tilbagefald til, eller en forværring af, håndens kontraktur. Dette kan være grunden til, at tidligere ikke-operative behandlinger har svigtet.

5 Denne mangel på succes kan ifølge opfindelsen afhjælpes ved at injicere i strenge i residualfasen.

Forsøg 10 Ved alle forsøg anvendtes NucleolysinR fra Advance Biofactures Corporation i Lynbrook, New York. NucleolysinR er en kollagenase opnået ved fermentering af Clostridium histolyticum, kromatografisk oprensning og lyofilisering.

Den fortyndedes til den ønskede koncentration med en vandig puffer af 0,2 mM calciumchlorid og 0,9% natriumchlorid.

15

Undersøgelse A

I et kontrolpilotforsøg injiceredes 3600 ABC-enheder kollagenase i 0,5 ml puffer i 10 Dupuytren-strenge opnået fra patienter, der undergik fasciektomi.

20 Som kontrol injiceredes der kun 0,5 ml puffer i 10 andre strenge, der blev behandlet på samme tidspunkt og på samme måde. Alle strenge inkuberedes derefter ved 37°C i 24 timer. Ved at strække de behandlede stenge i en Chatillon-maskine og måle spænding og forlængelse, blev det fundet, at de kollagenase-injicerede strenge undergik en 93% formindskelse af trækmodu-25 let i sammenligning med kontrolprøverne.

Forskerne konkluderede, at "en dosis på 3600 enheder oversteg langt den dosis, der var nødvendig til at sprænge strengene ved Dupuytren's sygdom." 30 Dernæst udførtes en kontrolundersøgelse med multiple doser in vitro. 20 strenge opnåedes fra patienter, der undergik kirurgi, og disse prøver fordel- 7 DK 177324 B1 tes tilfældigt på én ud af fire grupper: 150 ABC-enheder, 300 ABC-enheder og 600 ABC-enheder kollagenase og en puffergruppe som kontrol. Hver gruppe omfattede fem strenge. Alle patienter var mænd. Den gennemsnitlige patientalder i gruppen med 600 enheder var 62 år, i gruppen med 300 enhe-5 der var den 58 år, i gruppen med 150 enheder 67 år og i kontrolgruppen 58 år.

Strengenes midtersubstans injiceredes med enten puffer eller 150, 300 eller 600 ABC-enheder kollagenase, idet hver injektion havde et volumen på 0,2 10 ml. Strengene blev derefter inkuberet ved 37°C i 24 timer. Herefter blev hver streng strakt i en Chatillon-maskine, indtil strengen bristede.

Det blev fundet, at en dosis på 300 ABC-enheder kollagenase var tilstrækkelig til at få strengen til at briste inden for de gennemsnitlige begrænsninger af 15 den maksimale kraft af fingerstrækmusklerne i lillefingeren, ringfingeren, langfingeren og pegefingeren. Histologisk set befandt samtlige udtagne prøver sig i sygdommens residualfase og indeholdt kun type I kollagen i henhold til Sirrius-rødfarvning.

20 Undersøgelsen A er blevet beskrevet i The Journal of Hand Surgery, bind 21 A, nr. 3, maj 1996, 490-495.

Undersøgelse B

25 Efter undersøgelse A udførte de samme forskere en række in vivo tests på patienter, der befandt sig i residualfasen af Dupuytren's sygdom. Når 300 ABC-enheder kollagenase i 0,1 ml pufferdiluent ikke havde nogen effekt, udførtes tests med fordoblede doser, dvs. 600, 1200, 2400, 4800 og 9600 ABC-enheder, hver dosis med 0,1 ml diluent, og med én dosis pr. patient. En en-30 kelt injektion i Dupuytren-strengen i en vinkel på 90° blev givet tæt ved håndens mellemhåndsfingerled (MP). Efter at have ventet i to timer blev patien- DK 177324 B1 8 terne opfordret til aktivt at strække fingeren i et forsøg på at sprænge strengen.

Der iagttoges ingen effekt hos nogen af disse patienter.

5

Undersøgelse C

Derefter gik man frem på en anden måde. Injektionen blev givet tæt ved MP-leddet på tre forskellige steder med ca. 2 mm afstand, idet nålen blev holdt i 10 en skrå vinkel i forhold til strengens akse og indført i forskellige vinkler, idet den ønskede samlede dosis således blev tilført i multiple trin.

Før injektionen måltes Dupuytren-strengens dybde i hånden ved ultralydvisualisering under anvendelse af en Alkoa Model 210 fremstillet af Corome-15 trios. Dette giver lægen mulighed for at undgå injektion i den underliggende bøjemuskelsene.

Udstrækningen af fingerens bøjning ved MP-leddet måltes i grader ved hjælp af et digitalt goniometer.

20

Den samlede dosis var 10.000 ABC-cenhder i 0,5 eller 0,25 ml diluent.

Umiddelbart efter injektionen vikledes hånden ind i en omfangsrig gazeforbinding og holdtes ubevægeligt i flere timer. Injektionen blev typisk givet ved 25 middagstid eller kort derefter, og bandagen fjernedes ved sengetid. Patienterne opmuntredes til ikke at forsøge at strække eller bøje fingrene.

Ved anvendelse af disse procedurer opnåedes fremragende kliniske resulta ter.

30 9 DK 177324 B1 1. En 75 år gammel kvinde havde en bøjningsvinkel på 40° i venstre ringfinger. Dupuytren-strengen injiceredes som beskrevet ovenfor med 10.000 ABC-enheder kollagenase i 0,5 ml pufferopløsning. Dette resulterede i en betydelig opsvulmen, som dog aftog næste dag. Efter 1 uge var bøjnings- 5 vinklen blevet formindsket til 25°. Efter 2 uger var den nul, dvs. normal, og sådan forblev den. Efter 7 måneder var strengen stadig synlig under huden, men den var fladere og blødere end før injektionen, og den tidligere deformerede finger var stadig lige.

10 De følgende tre patienter blev injiceret med 10.000 ABC-enheder kollagenase i 0,25 ml pufferdiluent.

2. Højre lillefinger hos en 64 år gammel mand var bøjet med 60°, dvs. dens bøjningsvinkel målte 60°. Ved opfølgningen den første dag efter injekti- 15 onen var den 45°, og efter 1 uge var den nul.

3. En 64 år gammel mand havde en meget tyk Dupuytren-streng, der strakte sig fra håndfladen ind i venstre ringfinger, som havde en bøjningsvinkel på 45°. Én dag efter injektionen var den 30°, og den var blevet formind- 20 sket til nul (normal) på femtedagen.

4. En 64 år gammel mand havde en Dupuytren's kontraktur, der trak hans højre lillefinger til en bøjning på 60°. Én dag efter injektionen var den 45°, efter to dage 25°, og efter fem dage var den normal, dvs. 0°.

25

Claims (13)

1. Anvendelse af kollagenase til fremstilling af en farmaceutisk sammen- 5 sætning til behandling af Dupuytren’s sygdom, hvor sammensætnin gen omfatter kollagenase i en farmaceutisk acceptabel bærer med en koncentration på ca. 15.000 til ca. 75.000 ABC-enheder kollagenase pr. ml. bærer, og hvor sammensætningen omfatter en kollagenasedo-sis på mindst 8.000 ABC-enheder.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor sammensætningen omfatter en kolla-genasedosis inden for området 10.000 til 15.000 ABC-enheder.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor sammensætningen omfatter kol- 15 lagenase i en koncentration på mindst 20.000 til 50.000 ABC-enheder pr. ml.

4. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor sammensætningen omfatter en effektiv samlet kollagenasemængde på mindst 8.000 ABC-enheder pr. 20 dosisenhed i en farmaceutisk acceptabel bærer med en koncentration på mindst 30.000 ABC-enheder pr. ml. bærer.

5. Anvendelse ifølge krav 1 til 4, hvor koncentrationen er på mindst 40.000 ABC-enheder kollagenase pr. ml. bærer, og hvor sammensæt- 25 ningen omfatter en effektiv samlet kollagenasedosis på mindst 10.000 ABC-enheder.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor kol-lagenasen er indeholdt i en farmaceutisk acceptabel vandig bærer. 30

7. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor den farmaceutiske sammensætning er egnet til behandling af personer, der befinder sig i residualfasen af Dupuytren’s sygdom. DK 177324 B1

8. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav til fremstilling af en farmaceutisk sammensætning til behandling ved injektion i en fibrøs streng i hånden hos en person, der lider af Dupuytren’s 5 sygdom, og hvor hånden immobiliseres umiddelbart efter injektionen og derefter holdes ubevægelig i flere timer.

9. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav til fremstilling af en farmaceutisk sammensætning til behandling ved injektion 10. en fibrøs streng i en spids vinkel i forhold til strengen i hånden hos en person, der lider af Dupuytren’s sygdom.

10. Anvendelse ifølge krav 8 eller 9 til fremstilling af en farmaceutisk sammensætning til behandling ved injektion flere steder i strengen. 15

11. Anvendelse ifølge krav 10 til fremstilling af en farmaceutisk sammensætning til behandling ved injektion mindst tre steder i umiddelbar nærhed af hinanden.

12. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor det samlede væskevolumen ikke overstiger ca. 0,5 ml.

13. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor det samlede væskevolumen ligger fra ca. 0,1 til ca. 0,25 ml. 25