JP2014507645A - 無レンズ断層撮影装置及び方法 - Google Patents
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Abstract
サンプル中に含まれる対象の三次元撮像システムであって、画像センサと、サンプルを保持するように構成され画像センサの近傍に配置されているサンプルホルダと、部分コヒーレント光を具える照明源と、を具えるシステム。照明源は、照明源とサンプルホルダとの間に介在させた、開口、光ファイバケーブル、又は光導波路のうちの少なくとも1つを通してサンプルを照明するように構成されており、照明源は、複数の異なる角度を通じてサンプルを照明する。
【選択図】図1A
【選択図】図1A
Description
関連出願
本出願は、2011年1月6日に出願された米国暫定特許出願第61/430,465号と、2011年5月16日に出願された米国暫定特許出願第61/486,685号の優先権を主張する。優先権は、35U.S.C.§119に基づいて主張されている。上述の特許出願は、ここに完全に記載されているように、引用によって組み込まれている。
本出願は、2011年1月6日に出願された米国暫定特許出願第61/430,465号と、2011年5月16日に出願された米国暫定特許出願第61/486,685号の優先権を主張する。優先権は、35U.S.C.§119に基づいて主張されている。上述の特許出願は、ここに完全に記載されているように、引用によって組み込まれている。
技術分野
本発明の属する技術分野は、一般的に細胞などの微細構造の撮影方法及び装置に関する。特に、本発明の属する技術分野は、静止サンプル又はマイクロ流体環境内のフロー中の、細胞、細胞小器官、細胞粒子などの断層撮影システム及び方法に関する。
本発明の属する技術分野は、一般的に細胞などの微細構造の撮影方法及び装置に関する。特に、本発明の属する技術分野は、静止サンプル又はマイクロ流体環境内のフロー中の、細胞、細胞小器官、細胞粒子などの断層撮影システム及び方法に関する。
光学顕微鏡検査は、数世紀にわたって生命工学における欠くことができないツールであった。それにもかかわらず、そのデザインは基本的に初めから変わっていない。すなわち、視覚化のために目又はデジタルセンサアレイによって検出する前に、レンズ及びその他の光学部品のシステムを介して検体の画像を拡大するというものである。より小さな特徴をより良好な解像度で解像するという追及が、サイズが大きくなり複雑さが増すという代償を払って光学顕微鏡の性能を改良してきた。一方で、非常に小型化されたアーキテクチュア内で生物サンプルを迅速かつ効率良く操作し処理するマイクロ流体システム及びラボオンチップシステムなどの新しい技術が頭角を現してきた。しかしながら、検体の光学的検査は、未だに従来の光学顕微鏡によって行われており、これはマイクロ流体システムのスケールに比べて、通常桁違いのサイズ不整合がある。この結果、小型のラボオンチッププラットフォームと一体化することができる代替の小型の顕微鏡モダリティが明らかに必要とされている。
新しい光学顕微鏡モダリティの要求は、小型化と微小流体の一体化の必要性によってのみ拍車がかけられたのではない。大きな視野(FOV)の低減という代償を払って高解像度が達成されるという事実は、レンズベースでの撮像のもう1つの基本的な制限である。希少細胞の撮像又はモデル器官の光学的表現型検査といった、スループットが高い顕微鏡が非常に望まれるいくつかの重要な問題について、従来の光学顕微鏡の比較的小さな視野がそのアプリケーションに更なる課題をもたらしている。
上述したこれらの要求を補完する解決策を提供するために、代替的に無レンズ顕微鏡プラットフォームが開発されている。これは、小型のオンチップ撮像アーキテクチュアにおいて高い解像度と大きな視野を組み合わせたものである。このモダリティでは、微小な対象物のデジタルインラインホログラムが、単位フリンジ倍率の部分コヒーレント照明を用いてセンサアレイ上に記録され、センサの活性領域全体が撮像FOVとして作用する。センサのピクセルサイズによる解像度の制限を克服するためには、サンプルの複数サブピクセルをシフトさせたホログラムが必要であり、ピクセル超解像技術を適用して、大きなFOVと矛盾することなくサブミクロンの方位分解能を達成する。この結果、開口数(NA)が〜0.5の顕微鏡対物レンズと比較できる横方向の撮像性能が、24mm2のFOVについて達成された。これは同じ解像度の対物レンズより2桁以上大きい倍率である。Bishara W.et al.,Lensfree on−chip microscopy over a wide field−of−view using pixel super−resolution.Optics Express 18:11181:−11191(2010) 参照。
部分コヒーレント無レンズインラインホログラフィにおけるピクセル超解像技術が、大きな視野に亘るサブミクロン方位分解能での撮像を可能にする一方で、デジタルインラインホログラフィの焦点深度が本質的に長いため、残念ながら距離分解能は有意に低い(例えば、>40乃至50μm)。したがって、ホログラフィな再構築が計算上異なる深度で合焦するにもかかわらず、〜50μmより近い平面をセクションにわけることは、開口数の検出に関係なく、無レンズ広視野ホログラフィック顕微鏡では実現できなかった。この基本的な制限に取り組む必要がある。
同じように、この数年間、断撮像可能な光学顕微鏡モダリティに興味が広がってきた。一例として、光投射型断層撮影(OPT)が提案され、ここでは、屈折率マッチングゲル中に沈めた光学的に透明にした検体を、従来のレンズベースの顕微鏡の固定光路に対して回転させ、最大〜1cm3の撮像ボリューム内で3つの寸法すべてにおいて〜10μmの等方性分解能を提供している。Sharpe J et al.,Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies,Science 296:541−545(2002) 参照。
近年、開口数が大きい対物レンズを用いたOPTの変形バージョンも実装されて、例えば、<0.0005mm3といった有意に低減されたボリュームにわたるサブミクロン細胞撮像が実現されている。Fauver M et al.,Three−dimensional imaging of single isolated cell nuclei using optical projection tomography,Optics Express 13:4210−4223(2005)参照。
光学回析トモグラフィ(ODT)はもう1つのパワフルな技術であり、ここでは、デジタルホログラフィを用いて、照明方向を変え、対象を回転させ、あるいは、異なる波長で複数の画像を捕捉することによって、検体の3D屈折率分布を再構築している。これらの断層撮影システムでは、定期的に細胞を撮像することができ、三次元すべてにおけるサブミクロン解像度を潜在的に実現している。しかしながら、従来の顕微鏡と同様に、これらのシステムには解像度と撮影ボリュームのトレードオフが生じ、使用する対物レンズによって、例えば、0.04乃至0.2mm2より小さい非常に低減された撮像FOVと、10乃至20μmより小さい被写界深度(DOF)という犠牲を払って、高解像度を達成している。
同じ目的で、もう1つの撮像モダリティ、すなわち、選択的平面照明顕微鏡法(SPIM)も導入されている。これは、筒状レンズによって発生する光シートを用いて蛍光サンプル内の選択的平面を連続的に照明し、方位分解能を強化した3D画像を生成する。Huisken J et al.,Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy,Science 305:1007−1009(2004)参照。SPIMは、蛍光撮像法のみに限定されており、最大数ミリメートルの厚いサンプルで、使用する対物レンズの開口数あるいは光−電子センサアレイの活性領域のいずれかによって決まる、0.04乃至2mm2の範囲のFOV上での〜6μmの方位分解能を達成する。一般的に、これらの既存の光学断層撮像プラットフォームは、上述したように、すべて小型化してマイクロ流体システムと一体化するよう取り組んでいる、比較的複雑で嵩の大きい光学組織に依存している。したがって、コンパクトな具体例における分解能が高く、撮像ボリュームが大きい代替の断層撮影顕微鏡プラットフォームは、細胞及び発生生物学、神経科学、及び創薬を含む様々な分野において、重要な撮像ツールセットを提供できる。
本発明の一態様において、無レンズ光学断層撮影システム及び方法が提供されており、これは、〜14mm2のFOV上で〜2.5乃至3μmの距離分解能と、1μmより小さい方位分解能、並びに〜4mmの拡張DOFを達成して、〜15mm3のオンチップ撮影ボリュームを達成する。この無レンズ光学断層撮影プラットフォームは、非常に大きい撮影ボリュームを持つ三次元(3D)の高い分解能と、既存の光学コンピュータ断層撮影モダリティには適合しない3D空間−バンド帯域積を提供する。
1つのアプローチでは、〜10nmのスペクトルバンド幅を有する部分コヒーレント光源を回転させて、複数角度(空気中で±50°にわたる)から検体ボリュームを照明することによって無レンズ断層撮影が達成され、ここでは、各照明角度において、レンズや、レーザ、あるいはその他の嵩のある光学部品を使用することなくいくつかの物体のサブピクセルシフト投影ホログラムが記録される。次いで、このサブピクセル画像は、デジタル処理が行われ、各角度投影について、単一の高い分解能(例えば、ピクセル超解像度)のホログラムを生成する。次いで、この高分解能ホログラムをデジタル的に再構築して、位相及び振幅情報を取得し、次いで逆投影して、サンプルのX線断層写真を計算する。
このホログラム記録ジオメトリの制限付空間的時間的コヒーレンスは、スペックル及び複数の反射干渉ノイズタームの低減といった、重要な利点を再構築画像にもたらす。更に、このジオメトリにおける単位フリンジ倍率によって、例えば>40°の斜照明角度でも対象物のインラインホログラムを記録することができる。これは、フリンジ倍率を用いた従来のコヒーレントインラインホログラム撮影スキームでは、通常、実現不可能である。
斜照明の制限された角度レンジによる欠陥を最小限に抑えるため、二軸断層撮影スキームを適用することができる。ここでは、二本のほぼ直交する軸に沿って光源が回転する。断層撮像性能は、様々な寸法のマイクロビーズを用いて、また野生型C.Elegansによって定量化される。良好な3D空間分解能を用いて大容量をプローブして、この無レンズ光学断層撮影プラットフォームは、例えば、細胞及び発生生物学において、高スループットの撮像アプリケーション用のパワフルなツールを提供する。
一の実施例では、サンプル中に含まれている対象物の三次元撮像システムが、画像センサと;サンプルを保持するように構成されたサンプルホルダであって、画像センサに隣接して配置されたサンプルホルダと;部分コヒーレント光又はコヒーレント光を具える照明源であって、照明源とサンプルホルダの間に介在させた開口、光ファイバケーブル、あるいは光導波路のうちの少なくとも1つを通ってサンプルを照明するように構成された照明源と;を具え、この照明源が複数の異なる角度からサンプルを照明するように構成されている。
別の実施例では、サンプル中に含まれている対象物の三次元画像を取得する方法が開示されており、これは、第1の角度で部分コヒーレント光又はコヒーレント光であって、サンプルを照明する前に開口か、光ファイバケーブルを通過する光を発する照明源を用いてサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを照明するステップと;サンプルホルダを異なる角度で照明源を用いて照明するステップであって、サンプルを照明する前に開口又は光ファイバケーブルのうちの少なくとも1つを光が通過するステップと;各角度で、サンプルホルダの反対側に配置した画像センサから複数のサブピクセル画像フレームを取得するステップと;この各角度におけるサブピクセル画像フレームを、各角度について単一のより分解能が高いホログラムにデジタル的に変換するステップと;このより分解能が高いホログラムから各角度について投影画像をデジタル的に再構築するステップと;サンプル中の対象物の三次元断層画像をデジタル的に逆投影するステップと;を具える。
さらに別の実施例では、サンプル中に含まれている対象物の三次元撮像を実行する方法が開示されており、これは、画像センサに隣接して配置したフローセルを通してサンプルを流すステップと;第1の角度で部分コヒーレント光又はコヒーレント光であって、サンプルを照明する前に開口、光ファイバケーブル、又は光導波路のうちの少なくとも1つを通過する光を発する照明源を用いて、サンプルを照明するステップと;画像センサを用いて第1の角度で移動するサンプル中の対象物の複数の画像フレームを取得するステップと;この照明源を用いて少なくとも一又はそれ以上の異なる角度でサンプルを照明するステップであって、サンプルを照明する前に開口か、光ファイバケーブルか、光導波路のうちの少なくとも1つを光が通過するステップと;画像センサを用いて一又はそれ以上の異なる角度で移動するサンプル中の対象物の複数の画像フレームを取得するステップと;第1の角度及び一又はそれ以上の異なる角度で取得した複数の画像フレームから対象物の超解像投影ホログラムをデジタル的に再構築するステップと;第1の角度及び一又はそれ以上の異なる角度で取得した超解像投影ホログラムに基づいてサンプル中の対象物の複合投影画像をデジタル的に再構築するステップと;この複雑な投影画像のフィルタをかけた逆投影を行ってサンプル中の対象物の三次元X線断層写真をデジタル的に再構築するステップと;を具える。
さらに別の実施例では、携帯型断層撮像装置が開示されており、これは、内部にサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを収容するハウジングと;サンプルの第1の側に対して変化する角度でハウジング内に配置した複数の部分コヒーレント又はコヒーレント光源であって、複数の光源の各々がそれぞれ導波路に接続されている光源と;複数の光源に動作可能に接続されたマイクロコントローラであって、各々の光源を選択的に作動させるように構成されたマイクロコントローラと;ほぼ直交する方向に導波路を移動させるように構成された電磁アクチュエータと;サンプルの第2の対向する側にあるハウジング中に配置した画像センサと;を具える。
別の実施例では携帯型断層撮像装置が開示されており、これは、内部にサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを収容するハウジングと;サンプルの第1の側に対して変化する角度でハウジング内に配置した複数の部分コヒーレント又はコヒーレント光源であって、複数の光源の各々がそれぞれの空間開口に接続されている光源と;複数の光源に動作可能に接続されたマイクロコントローラであって、各々の光源を選択的に作動させるように構成されたマイクロコントローラと;ほぼ直交する方向に空間開口を移動させるように構成された電磁アクチュエータと;サンプルの第2の対向する側にあるハウジング中に配置した画像センサと;を具える。
図1Aは、サンプル14中の対象12(図1Bに最もよく見られる)の断層撮像を行うシステム10を示す。対象12は、細胞又は生物学的要素又は構造(例えば、細胞器官又は細胞構造)を含むものでもよい。対象12は、むしろ、多細胞生物又は同様のものを含んでいてもよい。代替的に、対象12は、粒子物体又はその他の物体であってもよい。図1Aは、画像センサ16の上方に若干の距離を置いて配置された撮像対象12を示す。いくつかの実施例では、一又はそれ以上の対象12を含むサンプル14が、光学的に透明なカバーの上にあるいは画像センサ16の表面上(例えば、ガラスカバー)に直接配置されている。代替的に、一又はそれ以上の対象12を含むサンプル14は、ガラス又はプラスチックのスライド、カバースリップ、又は図1Bに見らえるような同様のものといった、光学的に透明なサンプルホルダ18上に配置されている。
とにかく、画像センサ16の表面はサンプル14に接していてもよく、近接していてもよい。一般的に、サンプル14中の対象12は、画像センサ16の活性表面内数ミリメートルにある。画像センサ16は、例えば、電荷接合素子(CCD)あるいは相補型MOS(CMOS)素子を具えていてもよい。画像センサ16は、モノクロセンサであっても、カラーセンサであってもよい。画像センサ16は、一般的に、9.0μmより小さい、具体的には5.0μmより小さい(例えば、2.2μm又はそれより小さい)小ピクセルサイズである。一般的に、ピクセルサイズが小さい画像センサ16は、高分解能である。本明細書に記載した撮像方法の1つの利点は、ピクセルサイズより良好な空間解像度が得られることである。
図1Aをさらに参照すると、システム10は、サンプルホルダ18の第1の側部(図1Aで見られる上側)を照明するように構成した照明源20を具える。照明源20は、好ましくは空間コヒーレント光源あるいは部分コヒーレント光源である。発光ダイオード(LED)が、照明源20の一例である。LEDは比較的安価であり、耐久性があり、一般的に所要電力が少ない。もちろん、フィルタ付キセノンランプなどのその他の光源を使用してもよい。電球も光源20の1つの選択である。レーザ光などのコヒーレント光線(例えば、レーザダイオード)も使用することができる。光源20は、好ましくは、約0.1乃至約100nmの間のスペクトル帯域を有しているが、このスペクトル帯域はより小さくても大きくてもよい。更に、照明源20は、約0.1乃至10,000μmの空間コヒーレント径を有する部分コヒーレント光を具えていてもよい。
図1Cを参照すると、選択的に空間フィルタ22を、照明源20と、対象12を含むサンプル14の間に配置している。空間フィルタ22はフィルタに含まれる照明経路(空間開口又はピンホール)を形成する開口24を有する不透明面を具える。開口24は、通常50μm乃至約100μmの範囲にある径(D)を有する。代替的に、空間フィルタ22は、図1Aに示すように照明源20の遠位端に一体的に形成することもできる。例えば、照明源20は、図1Aに示すような光ファイバ、あるいはその他の光導波路に連結することができる。光ファイバに関しては、ファイバは、外側表面より屈折率が高い内側コアを具えており、光が内側コア内部に案内される。この実施例では、開口24を有する別の不透明面は不要である。代わりに、光ファイバ自体が空間フィルタ22として作用する。この実施例では、光学ファイバのコアは、本明細書に記載した開口24と同じ範囲の径を有している。図1Aに見られるように、光ファイバケーブル照明源20の遠位端(空間フィルタ22)は、サンプルホルダ18(又はサンプル14)から距離z1のところに配置されている。画像センサ16の結像面は、サンプルホルダ18(又はサンプル14)から距離z2のところに配置されている。本明細書に記載したシステム10では、z2<<z1である。例えば、距離z1は、約1cm乃至約10cmのあたりにある。別の実施例では、この範囲がより小さく、例えば、約5cm乃至約10cmのあたりにある。距離z2は、約0.05mm乃至2cmのあたりにあるが、別の実施例では、この距離z2が約1mm乃至2mmのあたりである。システム10では、伝達距離z1によって、空間を対象12の平面で展開させ、対象12によって散乱した光がバックグラウンド光と干渉して、画像センサ16の上に無レンズインラインホログラムを形成する。
図1Aを更に参照すると、システム10は、ラップトップ、デスクトップ、又はシステム10に操作可能に接続された同様のものといったコンピュータ30を具えており、解像度の低い画像(例えば、解像度の低いあるいは生の画像フレーム)を画像センサ16からコンピュータ30に転送してデータを取得し、画像を処理する。コンピュータ30は、以下により詳細に説明するように、一又はそれ以上のプロセッサ32を具えており、ある角度で撮影した複数のサブピクセル(低解像度)画像をとって対象12の単一で解像度が高い投影ホログラム画像を生成するソフトウエアを稼働又は実行する。このソフトウエアは、振幅及び位相情報の両方を含む対象12の複合投影画像をデジタル的に再構築することもできる。同じ画像のホログラム振幅と回復した位相を有しており、ソフトウエアは、複雑な投影画像のフィルタにかけた誤差逆伝搬を通して、デジタル的に対象12の三次元断層画像を再構築する。再構築した断層画像は、例えば、ディスプレイ34等の上でユーザに表示することができる。ユーザは、例えば、キーボードやマウスといった入力デバイス36を介してコンピュータ30とインターフェースを取って、様々な断層画像面を選択することができる。
図1Aは、互いにほぼ直交している第1及び第2のアーク40、42を示す。第1及び第2のアーク40、42は、照明源20がサンプル14中に含まれる対象12を照明する異なる角度を表している。異なる撮像位置(破線で示す)が第1及び第2のアーク40、42に沿って示されている。一般的に、照明源20は、0°位置を表す画像センサ16上方に上死点(図1Aに示す)を有する−89°乃至+89°の範囲の角度で、移動する。一実施例では、照明源20はアーク40、42の一方に沿って、静止撮像センサ16に対して移動する。代替的に、照明源20を静止させて、撮像センサ16が移動して、同じ角度の照明を行うようにしてもよい。さらに別の代替例では、照明源20と画像センサ16の両方が互いに移動してもよい。一般的に、サンプル14内に含まれる対象12を画像センサが妨害する傾向にあるので、照明源20をその中にサンプル14を有する画像センサ16と逆に移動させることが好ましい。照明源20及び/又は画像センサ16は、照明源20を画像センサ16に対して様々な角度で動かす機械的ステージ、アーム、スライド、等の機械的アクチュエータによって移動する。このアクチュエータの数はいくつでもよい。
図1Aを更に参照すると、照明源20は、結像面とほぼ平行の面内でアーク40、42に沿った各角度で移動する能力も有する。図1Aの挿入図は、蛇行ラインパターンにおける照明源20の二次元(例えば、x及びy変位)の移動を示す。このようにして、照明源20は比較的小さい変位湾曲部(例えば70μmより小さい)を作ることができる。以下に説明するように、画像センサ16に平行な小さい個別シフトを用いて、単一の高解像度(例えば、ピクセル超解像度)画像を作る。例えば、3×3グリッドを用いて、x−y面において、アーク40、42の各角度位置に、9つの異なる低分解能(LR)画像を得ることができる。図1Cを参照すると、照明源20を移動させる代わりに、固定照明源20に対して開口24を移動させるようにしてもよい。例えば、ステップモータ、移動可能ステージ、圧電素子、あるいはソレノイドを含めて、任意数の機械的アクチュエータを使用することができる。
図1Aは、互いにほぼ直交するように配置したアーク40、42を示す。別の実施例では、照明源20を球形又は楕円形などの三次元表面上の異なる角度に配置することができる。対象12は、一般的に、その形状で規定される三次元表面の中心(例えば、重心)近くに配置される。この実施例では、照明源20は、2つの直交するアークに対向する三次元表面部分をトレースすることができる。
図2は、システム10がサンプル14中の対象12の三次元断層画像をどのようにして取得するかについてのトップレベルフローチャートを示す。サンプル14をサンプルホルダ18に装填した後、照明源20が操作1000に見られるように第1の角度に移動する。照明源10は、サンプル14を照明し、操作1100に見られるように複数のサブピクセル(LR)ホログラム画像を取得する。このステップにおいて、一の実施例によれば、複数のサブピクセル画像は、照明源10を、画像センサ16にほぼ平行な面(例えばx及びy面)において移動させることによって取得する。この移動は、照明源10が第1の角度位置にいる間に生じる。例えば、3×3アレイで取られた9つの画像を第1の角度位置で得ることができる。次いで、操作1200に見られるように、照明源10を別の角度位置に移動させる。この異なる角度位置では、照明源10がサンプル14を照明し、操作1300に見られるように、複数のサブピクセルホログラム画像を取得する。このステップでも複数のサブピクセル画像は、同様に、画像センサ16にほぼ平行な面(例えばx及びy面)において照明源10を移動させることによって得られる。照明源20は、次いで、操作1250に見られるように別の角度位置に移動して複数のサブピクセルホログラムを取得する。このプロセスを任意の回数繰り返して、複数の異なる角度で画像を得る。複数のサブピクセルホログラム画像は、例えばアーク40、42に沿って撮像される。
操作1400では、各角度における複数のサブピクセル画像を、ピクセル超解像技術を用いて、単一の高解像度ホログラム(SRホログラム)にデジタル的に変換する。その詳細は引用によって組み込まれている、Bishara et al.Lensfree on−chip microscopy over a wide field−of−view using pixel super−resolution,Optics Express 18:11181−11191(2010)に開示されている。最初に、これらのホログラム間のシフトを、局所勾配反復アルゴリズムを用いて推定する。このシフトを推定すると、測定したシフトホログラムと相補的な、高分解能グリッドが反復計算される。これらの反復において、最小限に抑える費用関数が、高解像ホログラムのダウンサンプルバージョンと、対応するサブピクセルシフト生ホログラムとの間の平均平方誤差として選択される。
次いで、操作1500で、各角度において、複合投影画像をデジタル的に再構築する。デジタル的に合成された超解像ホログラフィック画像を再構築して、様々な照明角度における対象の無レンズ投影画像を取得する。斜めの照明角度で記録されたホログラムが、散乱した物体波の同軸伝搬と、センサアレイに対する非摂動基準波によって、インラインホログラムである旨は、強調すべきである。結果的に、デジタル的に再構築した画像は、検出面における複合視野の位相が記録プロセスにおいて失われるという兆候である、二重像アーティファクトによって品質が落ちる。忠実な投影画像を得るために、サイズを制限した反復位相回復アルゴリズムが用いられ、センサによって検出された複合視野の位相を回復することができる。位相回復アルゴリズムに関する詳細は、完全にここに記載されているかのように引用によって組み込まれている、Mudanyali et al.,Compact,Light−weight and Cost−effective Microscope based on Lensless Incoherent Holography for Telemedicine Application,Lab Chip 10:1417−1428(2010)に見ることができる。
従来の縦型照明ケースと同様に、斜めの照明角度で記録されたホログラムは、ホログラムを記録するのに使用した基準波のデジタル的なレプリカである基準波と重なって、センサに対して垂直に傾いた平面基準波を使用することになる。サンプルホルダ中の光の屈折により、この再構築波の傾斜角度は、照明ビームの傾斜と同じではない。実際、投影ホログラム用のデジタル再構築角度は、Δd/z2の比率の逆タンジェントを計算することによって決まる。ここで、Δdは縦方向の投影画像における位置に対する対象のホログラムの横方向のシフトを意味し、z2は、実験的にわかるか、あるいは縦方向のホログラムのデジタル再構築距離によって反復決定される。
反復位相復元のために、平行な画像検出面と対象面との間で複合視野をデジタル的に前後に伝達する。照明に垂直な面における投影画像を得るために、回復した視野をグリッド上に挿入する。傾斜方向に沿ったこのグリッドの寸法は、cos(θ)で再計測する。ここで、θはデジタル的な再構築角度である。加えて、断層写真をコンピュータ計算する前に、投影画像を共通の回転中心に対して整列させる必要がある。これを行うために、画像登録アルゴリズムに基づいて、自動化した2段階相互相関を実装した。連続的な照明角度(例えば50°及び48°)で得た投影画像は、互いに非常に似ており、隣接する角度において取得した投影画像を相互相関させることによって、画像登録の第1ステップが行われる。ほとんどの場合、特に、C.Elegansなど、対象が大きな連結された構造である場合、このステップで、連続的に登録された投影セットが生じる。しかし、FOVがビーズなど分散型の小さな対象を含む場合、隣接する角度についても各々の変化に起因する投影画像における若干の相違が登録精度を悪化させることがある。この場合、投影画像の中央にあるビーズは、回転中心にあると仮定され、投影画像の中心を離れて、質の悪い画像登録を表す。したがって、第1のステップに続いて、登録の第2ステップが用いられ、縦型投影画像の中心にあるビーズを全体的基準として使用し、その他のすべての投影画像が、特定のビーズに対して自動的に整列する。基準ビーズは第1ステップにおいて、すでに大まかに整列しているので、第2の相関ステップは、クロップした投影画像をクロップした全体、すなわち縦型の、投影画像と相関させることによって、基準ビーズの上でのみ実行される。
この無レンズ記録スキームにおける大きなz1/z2比によって、媒体の屈折率に近い検出NAが得られる。このシステムの特徴は、傾斜照明ビームを用いてホログラムを記録するのに最も重要であるが、光電子センサアレイの設計によって、使用できる最大角度が制限される。一般的に、光電子センサアレイはレンズベースの撮像システムとして設計されており、入射光の角度は通常20°乃至30°を超えない。この結果、±50°より大きい照明角度で記録されたホログラムはアーティファクトを示し始める。このため、2つの異なる回転軸に沿って、−50°乃至+50°の制限された角度範囲内で実験的な投影ホログラムを取得した。しかしながら、角度範囲は、例えば、−89°と+89°の間に跨る角度より大きい、あるいは、いくつかの場合−89°と+89°の間に跨る角度であると理解すべきである。
無レンズ投影画像(位相と振幅の両方)は、操作1600に見られるように、フィルタ逆投影アルゴリズムにかけて、三次元画像を生成する。フーリエ射影定理によって、異なる方向に沿った対象の2D投影画像から、対象の3D伝達機能を再構築することができる。逆投影法に関する詳細は、引用によりここに組み込まれている、M.,Weighted back−projection methods,Electron Tomography:Methods for three dimensional visualization of structures in the cell,(Springer,New York,2nd ed.)pp.245−273(2006)に見ることができる。もちろん、当業者に公知であるその他の断層画像再構築方法も同様に使用することができる。
したがって、各照明角度についての1つのピクセル超解像(SR)ホログラムが、複数のサブピクセル(LR)シフトホログラムを用いてデジタル的に合成され、次いで、すべての高解像ホログラムのホログラフィック再構築により無レンズ投影画像が生成される。次いで、操作1600において、これらの再構築した無レンズ投影画像(位相と振幅)を用いて、フィルタ逆投影アルゴリズムを用いてマイクロ対象の3D断層画像をコンピュータで計算する。この技術の基本的要件は、一般的な投影仮定(projection assumption)と呼ばれており、投影画像が対象の所定の特徴の線形和を表すものであり、このための断層画像をコンピュータで計算することができる。X線コンピュータ断層画像においてこの条件に満足することは、電磁スペクトルのその部分におけるわずかな回析によってより容易であるが、光学レジメにおけるコンピュータ断層画像は弱い分散対象を必要とする。同様に、この無レンズ光学断層モダリティも、大多数の光子が、最大でも断層写真の各スタック量を超える単一の分散事象を経験する必要がある。弱い分散対象については、システムの長い焦点深度とともに、複雑な分散電位が照明方向に沿って付加的になる。この結果、フィルタ逆投影アルゴリズムを適用することによって、対象の複雑な分散電位の断層写真を計算することができる。この入力は、各照明角度におけるピクセル超解像無レンズホログラムのホログラフィック再構築によって計算した合成投影画像である。
ホログラムは、±50°といった制限された角度範囲で記録されるため、対象のフーリエ空間に、欠損ウエッジとして知られている欠けた領域がある。この欠損ウエッジの主な意味合いは、低い距離分解能であり、ラテラルより大きな値に距離分解能を制限する。更に、ラテラル平面では、リンギングアーティファクトが観察されるとともに、照明の回転方向に沿って点広がり関数(PSF)を狭くして、x−y面におけるPSFが楕円形になる。
これらの撮像アーティファクトを最小限にするために、二軸断層撮像スキームを使用する。各傾斜方向に沿って得られた投影画像は、別々に逆投影されて、2セットの合成X線断層写真を計算する。これらのX線断層写真をフーリエ空間で合わせて、Mastronarde D.N.,Dual−Axis Tmography:An approach with Alignment Methods That Preserve Resolution,Journal of Strucural Biology 120:343−352(1977) にあるシーケンスを行う。この文献は、ここに完全に記載されているように引例として組み込まれている。したがって、両方のX線断層写真セットがデータを有する領域が平均され、一方、フーリエ空間において一セットのみが有益なデータを有する領域は、対応するX線断層写真のデータで満たされる。この結果、欠損ウエッジが欠損ピラミッドまで最小になり、上述した制限された角度のX線写真アーティファクトが有意に低減する。更に、対象の支持部外のアーティファクトを低減するために、縦型投影ホログラムのデジタル再構築に用いられるマスクをすべてのX線断層写真にあてる。欠損ウエッジを繰り返しデータで満たして、解像度を良くするとともに、対象の3Dサポート又は伝達関数の推測的情報に基づいて、反復制限アルゴリズムを装填することによるアーティファクトを低減することができる。
図3は、サンプル14中の対象12の断層写真撮像用システム50の別の実施例を示す図である。この実施例では、対象が、例えばC.Elegansなどの蠕虫のように見えるが、サンプル14は、流れるサンプルボリュームである。システム50は、フローセル52を具えており、このセルはキャリア流体の流れの中を移動する対象12を搬送するように構成されている。一の態様では、移動する対象12は、細胞又はその他の生物学的要素を含む。移動する対象12は、また、非生物学的粒子又はそのようなものを含むものでもよい。キャリア流体は、通常、移動する対象がその中に存在する流体である。キャリア流体は、また、ある状況では気体であってもよい。移動する対象12が細胞である場合、キャリア流体は通常、生理学的に適用可能な緩衝溶液又はそのようなものである(例えば、リン酸緩衝生理食塩水)。フローセル42は、ほぼまっすぐであり、光学的にほぼ透明(少なくとも、ここにより詳細に述べた照明源に対して)な三次元導管である。フローセル52は、ガラス、プラスチック、あるいはマイクロ流体デバイスに通常使用されるその他の材料でできている。フローセル52の導管は、正方形あるいは長方形といった形状の規則的な断面積を有する。移動する対象12を含むフローセル52の内部寸法はさまざまである。例えば、フローセル52は、ミリメートルスケールの高さ/幅を有していてもよい。代替的に、フローセル52は、マイクロメートルスケールの高さ/幅を有していてもよい。この点に関して、フローセル52は、マイクロチャネル又はそのようなものを具えていてもよい。
移動する対象12は、一又はそれ以上のポンピング技術を用いて、フローセル52を移動する又は流れる。例えば、圧力勾配が生じて、フローセル52内に対象12を含む流体を送り込む。代替的に、移動対象12は、使用しているセル52の対向する端部の電極による導電運動を用いて、フローセル52を通って移動する。この点に関しては、何らかの特別なポンプモダリティを用いて、フローセル52中で対象12を移動させることができる。例としては、シリンジポンプ、誘電得移動現象ベースの電極、電磁流体力学電極、などのポンプの使用が含まれる。
図3を更に参照すると、システム50は照明源54を具えており、この照明源はフローセル52の第1の側部(図3に見る上側)を照明するように構成されている。照明源54は、好ましくは、空間的にコヒーレントな、あるいは部分的にコヒーレントな光源である。発光ダイオード(LED)は、照明源54の一例である。LEDは、比較的安価であり、耐久性があり、一般的に所要電力が少ない。もちろん、フィルタ付キセノンランプなどのその他の光源を使用することもできる。レーザや電球も照明源54の選択肢である。照明源54は、好ましくは、約0.1乃至約100nmの間のスペクトル帯域を有するが、このスペクトル帯域はこれより小さくても、大きくてもよい。更に、照明源54は、約0.1乃至10000μmの空間コヒーレント径を有する少なくとも部分的なコヒーレント光を含むものであってもよい。
空間フィルタ56は、図3に示すように照明源54の遠位端に一体化することができる。例えば、照明源54は図3に見られる光ファイバあるいは別の光導波路に接続することができる。光ファイバに関しては、ファイバは外側面より屈折率の高い内側コアを具えているため、光が内部に案内される。代替的に、空間フィルタ56は、図1Cに示すような開口24を有する不透明面を具えていてもよい。空間フィルタ56は、光をよりコヒーレントにするように作用する。
図3に示すように、画像センサ58は、フローセル52と反対の第2の側に配置されており、フローセル52が照明源54と画像センサ58との間に挿入される。画像センサ58は、フローセル52の後側近傍に配置されている。画像センサ58の表面は、フローセル52の近位側あるいは後側に接触しているか、これに近接していてもよい。例えば、フローセル52は、画像センサ58を通常覆っているガラス又はその他の光学的に透明な層の上に直接配置してもよい。画像センサ58は、例えば、電荷結合素子(CCD)又は相補型金属−酸化物半導体(CMOS)素子を具えている。画像センサ58は、モノクロでもよく、カラーでもよい。画像センサ58は、一般的に、サイズが9.0μmより小さい、特に、サイズが5,0μmより小さい(例えば、2.2μm又はそれより小さい)小サイズピクセルを有している。一般的に、より小さいピクセルサイズの画像センサ58は、解像度が高い。
図3をさらに参照すると、照明源54は、フローセル52から距離z1に配置されている。画像センサ58の撮像面は、フローセル52から距離z2に配置されている。ここに記載したシステム50では、z2<<z1である。例えば、距離z1は約1cm乃至約10cmのオーダである。別の実施例では、この範囲はより小さくてもよく、例えば、約5cm乃至約10cmである。距離z2は、約0.05mm乃至2cmのオーダであるが、別の実施例では、この距離z2は約1mm乃至2mmである。システム50では、伝搬距離z1は、移動する対象12の面において空間コヒーレンスが発達する距離であり、移動する対象12によって散乱する光が、バックグラウンド光と干渉して画像センサ58上に無レンズインラインホログラムを形成する。
図3に見られるように、移動する対象12は、矢印Aで示す方向にフローセル52内を流れる。矢印Aは、フローセル52の縦軸とほぼ平行である。矢印Aの方向(したがって、フローセル52の方向)は、画像センサ58に対して若干角度がついている。この角度の正確な値は、臨界的なものではなく、事前に知られている必要はない。これは、単純に、フローセル52に沿って移動する対象12の流れが、画像センサ22の両方の軸方向であるx及びy方向においてシフト要素を確実に作るようにする。この角度は、通常、非ゼロ角度45°より小さい角度の間にある。図1Aに示す従来技術の実施例のように、照明源54は異なる角度でフローセル52を照明するために移動可能である。
図3をさらに参照すると、システム50は、システム50に動作可能に接続されたラップトップ、デスクトップなどのコンピュータ30あるいは同様のものを具えており、低解像度画像(例えば、低解像度フレーム又は生画像フレーム)を画像センサ58からコンピュータ30に送ってデータ取得と画像処理を行うようにしている。コンピュータ30は、ここにより詳細に説明する一又はそれ以上のプロセッサ32を具えており、このプロセッサは、ホログラフィックな振幅又は強度を具える移動対象物12の画像を取得するソフトウエアを稼働あるいは実行する。コンピュータ30においてこのソフトウエアが、画像の失われた位相を回復する。同じ画像に関するホログラフィックな振幅と回復した位相の両方で、このソフトウエアは移動する対象物12のより解像度が高い画像を再構築する。再構築された画像は、例えば、ディスプレイ34あるいは同様のものの上でユーザに表示することができる。ソフトウエアは、ホログラフィック署名に基づいて対象となる特定の細胞を同定し表示することもできる。
フローセル52を通って流れる移動対象物12は、画像センサ58を用いて撮像される。特に、角度的にオフセットした画像センサ58を用いて複数の解像度の低いホログラフィック画像フレームを取得する。システム撮像ジオメトリの単位フリンジ倍率のため、画像センサ58のピクセルサイズによって、取得したホログラムがアンダーサンプリングとなることがある。一方、この流れの間に、各無レンズ対象ホログラムが、時間を関数にして様々なサブピクセルシフトでサンプリングされるため、ピクセル超解像アルゴリズムを用いて、例えば、≦0.5μmの有効ピクセルサイズを有する高解像ホログラムをデジタル的に合成する。このサイズは、センサの物理的ピクセルサイズより有意に小さい(例えば>2μm)。したがって、システム50は、フローセル52内の移動対象12の流れを用いて、ホログラムサンプリング用のより小さいピクセルを作る。このような超解像デジタルインラインホログラムは、ツイン画像アーティファクトを削除した後、移動対象12の高解像無レンズ撮像を可能にする。
図3は、アーク59を示しており、これに沿って照明源54が移動して、フローセル52を異なる角度から撮像する。様々な撮像位置(破線で示す)が、アーク59に沿って示されている。一般的に、照明源54は、−89°乃至+89°の範囲の角度で移動し、画像センサ58の上方には0°位置を表す上死点がある(図3に見られる)。システム50は、更に、従来の実施例にあるような画像の処理と分析を行うソフトウエアを実行する、少なくとも1つのプロセッサ32を有するコンピュータ30を具えている。モニタ34と入力デバイス36は、コンピュータ30に接続して結果を表示し、コンピュータ30とインターフェースをとる。
図3に示す実施例は、図2に示すものと同様に作用する。操作1100における差異は、画像センサ58に平行な面のx−y方向において照明源54を移動させる必要がないことである。この動作は、移動対象12が対象12のホログラムにシフトを提供するため不要である。
図4は、サンプル14内の対象12の断層画像を撮像するシステム60の別の実施例を示す図である。この実施例では、システム60がハウジング64を具える、携帯型あるいは持ち運び可能な撮像器62を具える。ハウジング64は、粗プラスチックあるいは金属材料から作ることができ、持ち運び可能な撮像器62の様々な部品を含むあるいは収納している。ハウジング64は、その中に照明源66を具えており、この照明源は複数のLEDを具える。24個のLEDが図4に見られるが、これより多くても少なくてもよい。図4に見られるように、LED照明源66の各々は、ハウジング64のアーチ型内面に沿って配置されている。各LEDは、光ファイバ68に突合せ結合されている。
各光ファイバ68は、導波路として作用し、光ファイバ68のアレイは、図4に示すようにアークに沿って設けられている。このスキームにおいて、各光ファイバコアの径が〜0.1mmであるため、焦点レンズあるいは、各LEDの対応する光ファイバ端部への突合せ結合を単純かつ機械的に強固なものとするその他の光結合ツールが不要である。照明源66の一時的なコヒーレンスを上げるために、光緩衝ベースのカラーフィルタ70を用いてLEDのスペクトルを〜10nm(〜640nmに中心がある)まで狭くすることができる。各光ファイバ68の対応する端部(LEDに突合せ結合されていない端部)が、共通のアーク型ブリッジ72に装着されている。したがって、各光ファイバ68は、アーク型ブリッジ72に沿って異なる角度からサンプルを照明することができる。従来の実施例と異なり、照明源を異なる角度に移動させる必要がない。ここでは、以下に説明するように、個々のLEDがオンになり、サンプルを異なる角度から照明する。プラスチックで作ることができるアーク形状ブリッジは、両端にマグネット74を装着している。マグネット74は、ネオジム磁石などの希土類磁石を具えていてもよい。撮像器62は、各マグネット近傍に装着したコイル76を具えている。コイル76は、DC電流源に接続され、起動すると、ブリッジ72を移動させ、ファイバ68の全端部を同時に移動させる電磁力を生成する。この点に関して、磁石74と関連するコイル76が付いたアーク型ブリッジ72は、電磁アクチュエータとして作用する。コイル76及び/又は磁石74は、対応するコイル76が起動すると、直交する変位が生じるように配置されている。したがって、ファイバ68の端部の変位は、x及びy方向の両方において生じる。コイル76は、筒状軸が磁石の磁化ベクトルに整列するように配置されている。
バッテリ(図示せず)は、撮像器62への電力供給に使用できる。例えば、標準的なアルカリバッテリ(容量が、例えば3000mAhのもの)を用いて、断層写真顕微鏡を少なくとも数日間連続使用するための配置を必要とすることなく、ファイバを起動することができる。代替的に、撮像器62は、外部電源から電力供給してもよい。
撮像器62は更に、ハウジング64内にマイクロコントローラ78を具えている。マイクロコントローラ78を用いて、照明源66を構成しているLEDの点火を制御する。例えば、マイクロコントローラ78は、個々のLEDを適時に起動あるいはトリガする。一例として、LEDは、ブリッジ72に沿って順番に起動させてもよい。マイクロコントローラ78は、コイル76の起動を制御するのに使用することもできる。
図4を参照すると、撮像器62は、ハウジング64内及び外に移動可能な、サンプル充填機80を具えている。一又はそれ以上の対象12を含むサンプル14(図1B参照)が、サンプルホルダ18に装填され、サンプル充填機80内に配置される。サンプル充填器80は、次いで、デバイスを押し入れ、照明器66の光路にサンプル14が配置される。撮像器62も、画像センサ82を具えている。画像センサ82は、従来の実施例のコンテキストで述べたように、CMOS又はCCDを具えている。
システム60は、更に、少なくとも一のプロセッサ32を有するコンピュータ30を具えており、従来の実施例にあるように画像の処理及び分析を行うソフトウエアを実行する。モニタ34と入力デバイス36がコンピュータ30に接続されており、結果を表示するとともに、コンピュータ30とインターフェースを取る。コンピュータ30、モニタ34、入力デバイス36は、従来の実施例と同じ又は同様の態様で動作する。
実験1−第1実施例
図1Aに示す実施例を無レンズ断層写真撮影に使用して、〜14mm2の大FOVと、〜4mmの拡大されたDOFを超える、<1μmの方位分解能と、〜2.5乃至3μmの軸上分解能を達成し、〜15mm3のオンチップ撮像ボリュームを可能にした。この無レンズ光断層写真プラットフォームは、有意に大きい撮像ボリュームを有する3D高解像度と合体させ、既存の光コンピュータ断層画像モダリティによってはマッチングしない、3D空間帯域積を提供している。
図1Aに示す実施例を無レンズ断層写真撮影に使用して、〜14mm2の大FOVと、〜4mmの拡大されたDOFを超える、<1μmの方位分解能と、〜2.5乃至3μmの軸上分解能を達成し、〜15mm3のオンチップ撮像ボリュームを可能にした。この無レンズ光断層写真プラットフォームは、有意に大きい撮像ボリュームを有する3D高解像度と合体させ、既存の光コンピュータ断層画像モダリティによってはマッチングしない、3D空間帯域積を提供している。
無レンズ断層写真撮像は、〜10nmのスペクトル帯域を有する部分コヒーレント光源を回転させて、複数角度(空気中の±50°に亘る)からサンプルボリュームを照明することで実行される。ここでは、各照明角度において、チップ上の対象の複数サブピクセルシフトインライン投影ホログラムが、レンズ、レーザ、あるいはその他の嵩のある光学部品を用いることなく記録される。ホログラム記録ジオメトリの制限付き空間及び時間的コヒーレンスによって、スペックルと、複数の反射干渉ノイズタームの低減といった再構築画像への重要な利点がもたらされる。更に、このジオメトリにおける単位フリンジ倍率によって、フリンジ倍率を用いる従来のコヒーレントインラインホログラム撮像スキームでは通常実現できない、例えば>40°といった斜めの照明角度においても、対象のインラインホログラムを記録することができる。
断層写真の制限された角度アーティファクトに対向するために、二軸断層写真スキームを使用して、図1Aに示すように、2つの直交する方向に照明源を連続的に回転させる。ピクセル超解像を実行し、したがって、各投影画像についてサブミクロンの方位分解能を達成するには、互いに対してサブピクセルシフト(x−y面において)複数の無レンズインラインホログラムを、各照明角度で取得する(図1Aの挿入図参照)。一旦、高解像度(SR)投影ホログラム(各照明角度につき1つ)セットが、ピクセル超解像アル
ゴリズムを用いてデジタル的に合成されると、ハイブリッドフィルタ逆投影法を用いて、対象の最終断層写真を作る。したがって、超解像投影がまずデジタル的に再構築され、次いで、逆投影を行って、サンプルの散乱ポテンシャルの体積画像を得る。
ゴリズムを用いてデジタル的に合成されると、ハイブリッドフィルタ逆投影法を用いて、対象の最終断層写真を作る。したがって、超解像投影がまずデジタル的に再構築され、次いで、逆投影を行って、サンプルの散乱ポテンシャルの体積画像を得る。
これらの結果は、(1)光学断層写真撮像が無レンズオンチップ撮像に拡大され;(2)2軸断層写真を電磁スペクトルの光学部分に適用し;(3)ピクセル超解像技術を光学断層写真撮像に適用した、最初のものである。レンズあるいはレーザなどのコヒーレント光源を用いることなく、ここに提供されている無レンズ断層写真撮像スキームは、二軸断層写真スキームを用いて〜15mm3の大きな撮像体積を超える、<1μm×<1μm×〜2.5乃至3μmの空間解像度を実現する。短軸投影データを用いたならば、方位分解能で〜15%の低減という代償を払って、撮像体積は、〜30mm3に増える。大きな撮像体積を超えて良好な空間解像度を提供し、無レンズ光学断層写真は、一般的に、例えば、細胞及び発生生物学における高スループットの撮像アプリケーション用に非常に便利である。
この実験で使用した無レンズ断層写真撮像構成においては、センサから約z1=70mm離れたところに位置する光源(Aptina MT9P031STC,5 Megapixels,2.2μm pixel size)が、部分コヒーレント照明を提供し、チャンバの高さによってセンサまでの距離が例えば、z2=0.5乃至4mmの間で、対象のインラインホログラムを記録する。実験のフレキシビリティのために、単色光分光器を用いて、約500nmを中心に〜10nm帯域を有する調整可能な広域帯照明を提供する。径0.05乃至0.1mmの開口を通してフィルタをかけ、z1=70mmの距離を伝達した後、<0.5乃至1mmの空間コヒーレンス径の照明ビームを取得する。このビームによって、個々の対象のインラインホログラムを記録することができる。モータ駆動ステージを用いて光源を回転させ、原点がセンサアレイの中心であるアークに沿って多角照明を行うことができる。z1/z2比が大きいため、このアラインメントは精度が高くなく、構成のロバスト性が維持される。
各照明角度において、一連のサブピクセルシフトホログラムが記録されて、ピクセル超解像を実装する(図2の操作1400)。これは、モータ駆動リニアステージを使用して光源を直線的に移動させ、〜70μmのステップサイズを用いて、センサ表面に平行な面における3×3グリッド内の位置に分散させる(トータル9個の画像)。z1/z2比が大きいため、光源面における大きなシフトがホログラム面におけるサブピクセルシフトに対応する。この正確なサブピクセルシフト量は重要ではなく、実際この値は、照明角度に応じて生ホログラムが経験する横方向のシフト量からデジタル的に推察される。
ほとんどのデジタルセンサアレイは、センサ面の法線から測定した入射光線の角度が20乃至30°を超えないレンズベースの撮像システムで動作するように設計されているので、k−ベクトルが大きい入射波はアーティファクトが増えて、SNRが低減した状態でサンプリングされる。したがって、システムのNA検出がz2が短いことによって媒体の屈折率に届く場合でも、±50°を超える角度についての再構築した投影画像はアーティファクトを示し、断層写真の再構築用の投影像を含むことで、最終画像品質を改善するのではなく悪化させ得ることが観察された。この結果、投影画像は、±50°の傾斜範囲のみにおいて、2°の角度インクリメントで取得される。
角度を制限した断層写真のアーティファクトを低減するために、2軸断層写真スキームを用いた。したがって、1軸に沿った投影画像の記録が完了した後、コンピュータで制御した回転ステージを用いてサンプルを装着したセンサを90°回転させて、直交する方向に沿って第2の投影画像セットを記録する。カスタムメイドの発達したLabViewインターフェースを用いて、データ取得プロセスを自動化するとともに、トータルで918の広いFOV無レンズホログラムを記録する。1軸に沿った459の投影画像セットの取得には、〜4fpsのフレームレートで〜5分かかるが、より早いフレームレートセンサを用いることにより、有意に改善することができる。
図5Aは、+50°、0°、及び−50°の3つのそれぞれの角度についての、ホログラフィック記録状態を示す図である。光源、投影画像面、及びホログラム面が、各状態について示されている。図5Bは、+50°、0°、及び−50°の3つの角度に対応する角度で測定した、5μmのビーズの対応する超解像(分解能がより高い)ホログラムからクロップした画像(b1、b2、b3)を示す。検出面がビームの伝達に対して法線方向ではないため、個々のビーズのホログラムは、予想通り楕円形をしている。図5Cは、図5Bの対応するホログラム(画像b1乃至b3)を用いてデジタル的に再構築した無レンズ投影画像を示す。遠近補正を行った後、再構築した円形ビーズに見られるように楕円性を除去する。再構築された投影画像は、回転中心であると仮定される画像中心のビーズに対して登録される。
無レンズ断層写真システムを特徴づけるべく、寸法の異なるマイクロビーズを用いて一連の実験を行った。図6Aは、光学接着剤(屈折率〜1.52、Norland NOA65)を満たした厚さ〜50μmのチャンバ内にランダムに分配した5μmメラミンビーズ(屈折率〜1.68、Corpuscular Inc.)についての2軸断層写真再構築の結果を示す。コンピュータ断層写真は、−14μmから25μmの範囲の様々な面で計算する。顕微鏡比較画像(図6B)を得るために使用した対物レンズ(40×、0.65−NA)のFOVに合致させるために、〜14mm2の画像のより大きなFOVからクロップした対象の小領域についてのみ、<3min内に、グラフィックス処理単位(NVidia,Geforce GTX480)を用いて断層写真を計算した。図6A及び6Bの矢印は、ビーズを指しており、このビーズは所定の層において、合焦している。図6A(画像a1乃至a5)は、図6B(画像b1乃至b5)に提供されている対応する顕微鏡比較写真とともに、合焦していないビーズが断層写真において順次はじかれており、合焦しているビーズのみが再構築画像に現れていることを示している。断層写真の画像性能を更に示すために、図6C(画像a6乃至a8)は、対象となるズーム領域を示しており、図6A(画像a3乃至a5)において破線の円で強調されている。ここでは、2つのランダムビーズが、z方向における〜20μmの中心間距離をもって軸方向に重なっている。これらの画像は、対応する顕微鏡画像(画像b6乃至b8)に沿って表示されている。これらの再構築結果から、重なり合ったビーズが、相当の深度で、互いから最小焦点外コンタミネーションで順次解像されることが明らかであり、図6C(画像a7)に示す中間スライスは無視できる誤った詳細を有しており、この軸方向に重なっている領域の順次の切断面を表示している。図6B(画像b1乃至b5)と図6C(画像b6乃至b8)に示す対応する顕微鏡画像によって認証されるので、照明源の開口数又はコヒーレント特性に関係なく、これらの結果は、定期的なインラインホログラフスキームへの到達を超える、断面画像能力を示す。
図6A乃至6Cの結果が比較的小さいFOVの上で示されているが、全体の撮像体積の断層写真は、同じ生ホログラフィックデータセットから計算できるFOV内の異なる領域についてのいくつかの断層写真をデジタル的に組み合わせることによって取得することができる。なお、センサエッジに近い対象のホログラムは、大きな照明角度において活性領域外に来るので、有効FOVは〜24mm2から14mm2に(CMOSセンサチップの活性領域にある)下がる。
断層写真顕微鏡の撮像特性をさらに調べるために、光学接着剤に分散させた直径2μmのビーズを撮像した。図7A乃至7Cは、x−y、y−z、及びx−z面における再構築断面をそれぞれ示す図であり、各々、ビーズの中心を通って切断されている。図7Aに示す再構築したビーズの円形によって明らかな通り、2軸断層写真スキームが、x−y面における延長アーティファクトをなくしている。これは、通常、角度を制限した1軸断層写真に見られる。一方で、同じビーズの再構築版は、センサ面の法線に対して±50°を超える角度での投影がないため、軸上の伸長が見られる。図8A乃至8Cは、異なる深度に位置する3つの個別のビーズについて、x、y、及びz軸に沿った断面ラインプロファイルを示す。z=−3μmにあるビーズにおいては、中心を通るラインプロファイルのFWHM値が、x、y、及びz寸法に沿って、それぞれ、2.3μm、2.2μm、及び5.5μmである。深度z=−9μmとz=4μmにあるその他のビーズでも同様の結果が得られた。このことは、深度が異なる視覚化ボリュームで同じ撮像パフォーマンスが維持されることを示す。
広角FOV上で対象の3D撮像を可能にするのに加えて、無レンズ単位拡大ジオメトリによって、このプラットフォームにも、従来の顕微鏡対物レンズを用いた撮像システムに比べて優位に延長したDOFがある。この大きなDOFを示すために、〜1mm幅(例えば、トータルで厚さ3.3mm)で重ねた4つの層を有する10μmのビーズでできた多層チャンバを撮像した。次いで、このチャンバをセンサの活性領域の上に持ち上げて、最も遠い層を、センサチップから〜4mm離れたところに位置させた。空中で±50°に亘る照明角度で、14mm2×3.3mmの体積に対応する全体の断層写真データを、2軸スキャニングを用いて〜10分以上かけて取得した。一旦、この生データを取得すると(各照明角度における9つのサブピクセルシフトホログラムを具える)、各深度の層について個別に断層写真がコンピュータ処理される。次いで、これらの断層写真を、ここでは、DOF〜4mmの単一ボリューム画像にデジタル的に組み合わせる。ホログラフィックに記録した投影画像セットは、これらの1つを図9Aに示すが、厚いサンプルの全3Dボリューム情報を具えており、図9Aに示すサイズが異なる矢印は、多層チャンバ内の異なる層に配置したビーズを示している。図9B乃至9Eは、チャンバ内の様々な深度についての断層写真を示す(図9B:z=3.97mm;図9C:z=1.740mm;図9D:z=730μm;図9E:z=742μm)。
このような大きなDOFの断層撮影再構築についての1つの重要な試みは、各照明角度におけるピクセル超解像の実装である。比較的離れた深度に位置する粒子/対象の生ホログラムは、異なるシフトを作るため、そのホログラムが検出面で重なり合う場合に、ピクセル超解像のブラインドリアライゼーションによって、重なり合う粒子ホログラムの少なくともいくつかについてエラーが生じるであろう。この試みを軽減するべく、異なる層の生ホログラムを互いにフィルタにかけて、ピクセル超解像を、異なる深度の層の無レンズホログラムに個別に適用した。厚いサンプル中の軸方向に重なり合う対象についての超解像ホログラフィック投影を計算するには、>200乃至300μm、軸上で離れている対象のホログラムがセンサチップの上を、有意に様々な量シフトするため、追加のデジタル処理が必要である。この結果、光源をシフトさせることによって得られた生ホログラムは、同じ2D生ホログラムの変位バーションというよりはむしろ、実質的に異なる二次元関数であり、第4ピクセルの超解像技術に合致することが求められる。結果的に、所定の照明角度における単一超解像投影ホログラムは、サンプル深度全体について計算することができない。代わりに、個別超解像ホログラムを各深度の層について計算する。これを行うために、例えば、図10Aの測定したホログラムなどの測定したホログラフィック投影画像は、削除されるべき各深度についてデジタル的に再構築され、再構築した対象を、対象のサポートの内側が0で外側が1のバイナリマスクと重畳させることによってホログラムフィールドから除去する。大ボリューム中の削除すべきすべての層についてこの操作を連続して行い、図10Bに示すように、対象となる層のみのデジタルホログラムを取得する。不要な層にのみマスク操作を行っているので、図10Cに示すように、対象になる層の元々のホログラムとデジタル的に取り出したホログラムとの間の差異を示す対象となる層のホログラムにアーティファクトが導入されない。深度の短い範囲(<200乃至300μm)のシフトしたホログラムをデジタル的に取得すると、前述したように対象となる層の深度について、超解像ホログラムを特に計算することができる。
生命科学の応用に関する無レンズ断層写真顕微鏡の性能を示すために、野生種C.Elegansの蠕虫を、脱イオン水中のL4ステージ(長さ〜650μm)で撮像した。この蠕虫は、4mMのレバミソール(Sigma Aldrich L9756)溶液で一時的に固定して、撮像処理中の好ましくない動きを防止した。蠕虫は、データ取得中にy−軸に平行に整列するので、x−軸に沿った傾斜によって得られる投影のみを用いて、蠕虫の断層写真をコンピュータ計算した。この計算は、単一GPUを用いて〜4分間かかった。図11Aは、z=3μm面に対応する蠕虫全体のスライスを示す。蠕虫は、センサ面に対して若干傾斜した面外に観察され、前方が〜8μmほど上がっていた。この結果、蠕虫全体の単一スライスは、同等の鮮明度でこの動物に亘る詳細を明らかにしていない。図11B(画像b1乃至b3)は、z=2μm、z=8μm、z=13μm、のそれぞれにおける蠕虫の前方領域を通る再構築した深度断面を示している。図11Cの画像b4は、比較のための顕微鏡画像(×40、0.65NA)を示す。これらの図に示すように、外径<5μmの長い筒状構造をしている蠕虫の咽頭管を、z=8μmの面ではっきりと見ることができる(画像b2)が、これは、咽頭の中心から離れた深度で急速に消失している。図11D(画像c1乃至c3)も、同じ蠕虫の中心及び前側領域を通る異なる深度における断層写真を示す。図11E(画像c4)は、比較のための顕微鏡画像を示す。これらのすべての結果において、異なる部位におけるはっきり区別できる詳細の状況を明確に観察することができる。これは、検出開口数あるいはコヒーレント特性にかかわらず、規則的なインラインホログラフィック再構築ではなしえない、有意に改善された切断能力を示している。大撮像量とともに、これらの結果は、高スループット撮像が最も大事なC.Elegansやzebrafish等の光学的にアクセス可能なモデル生命体のオンチップ撮像とスクリーニング用の無レンズ断層写真プラットフォームの可能性を顕在化するものである。
無レンズ断層撮像システムは、<1μmの方位分解能と〜2.5乃至3μmの軸分解能で、〜14mm2の広いFOVと〜4mmの長いDOFを照明できる独自の顕微鏡モダリティを提供している。これらの結果は、標準的な20倍の対物レンズ(NA〜0.4、FOV<1mm2)と比較して、>104倍を超える大撮像量の分解能を提示している。このことは、特に、3Dのモデルアニマル撮像といった、高スループットの撮像及びスクリーニングアプリケーションに適したプラットフォームを作りうる。また、撮像量は、短軸データセットで必要な投影を用いることで、〜3乃至3.5μmの低軸上解像度という代償を払って、〜30mm3まで増やすことができる。
このような広いFOVと拡大したDOFで、オンチップ断層撮像を行うことができる、無レンズインコヒーレントホログラフィスキームには、いくつもの独自の態様がある。例えば、〜20乃至100という大きなz1/z2比を選択することで、画像モダリティに大FOVをもたらす単位倍率でのホログラフィック撮像ができる。センサーチップにおけるこの単位倍率とピクセルサイズによって決まる制限されたホログラム解像度は、撮像FOVのトレードオフがない状態で、ピクセル超解像アプローチによってバランスされ、方位開口数を0.4乃至0.5上げる。同じく大きいz1/z2比は、非常に大きい照明開口(例えば、>50μm)を使用することもでき、光結合部品、感度の高いアラインメント、あるいは達成可能な解像度においてトレードオフを必要とすることなく、照明端を非常に簡易なものにする。この結果、構成を不必要に複雑にし、サンプルを摂動させるであろう対象物を回転させるのではなく、光源を傾けることによって投影画像を容易に取得できる。更に、光学部品の簡素化と無レンズ構成のアラインメントが不要な構造によって、二軸断層写真の簡単な実装が可能となる。なぜなら、光源又はセンサ(その上にサンプルを装着した)の傾斜軸が90°回転して、二本の直交する方向に沿って投影画像を取得できるからである。
無レンズ断層写真スキームのもう1つの独自の態様は、部分コヒーレント光の一時的かつ空間的な使用である。照明のスペクトル幅は〜10nmであり、中心波長が〜500nmであり、コヒーレント長を<10μmに制限する。この比較的短いコヒーレント長は、この技術に関していかなる制限もなさず、実際のところ、2つの主たるノイズ源、すなわち、スペックル及び複数反射干渉ノイズ項を低減する。複数反射干渉ノイズ項は、斜角でのレーザ照明では、特に邪魔である。更に、制限されたコヒーレンス長も、互いに対する異なる深度のクロストークを部分的になくす。このようなクロス干渉項は望ましくなく、実際、ホログラフィック再構築スキームにおいては完全に無視される。同じクロス干渉が所定の深度層内でも生じる。換言すると、サンプルボリューム中の分散中心が、実際、検出面において互いに干渉する。これは、ホログラフィック再構築(例えば、対の画像の削除)に関する限り、アーティファクト源でもある。この制限された空間コヒーレンスも、対象物の個々のホログラムを記録するのに十分大きいが、FOVを全体的に撮像するより有意に小さい空間コヒーレンス径(例えば、<0.5乃至1mm)を選択することによって、この問題を低減するのに役立つ。この空間コヒーレンス径は、照明の開口(例えば、0.05乃至0.1mm)を変えること、及び、ソース開口とサンプルボリューム間の幅を変えることによって、このジオメトリのエンジニアにはむしろ簡単である。
実験2−第2実施例
この実験では、図3に示す実施例を光流体断層写真顕微鏡として試験した。この顕微鏡は、マイクロ流体チャネル内を流れる検体の3D撮像を行うことができる。この光流体無レンズ撮像モダリティでは、センサから〜50mm離して配置した空間的非干渉性光源(〜10nmの特定帯域で中心周波数600nm、直径〜0.05乃至0.1mmの開口でフィルタにかけた)を用いて、サンプルのデジタルインラインホログラムを、光電センサアレイ(Aptina MT9P031STC,5 Megapixels,2.2μmピクセルサイズ)で記録した。ホログラムが取得されている一方で、図3に見られるように、x−y面において少し傾いたセンサ上に直接配置したマイクロチャネルに沿って対象を電気運動流で駆動する。この傾斜角度の正確な値は重要ではなく、事前に知る必要はない。これは、単に、マイクロチャネルに沿った対象の流れが、x及びyの両方においてシフト成分を生じることを確認して、ピクセル超解像を通じてより高い解像度のホログラムのデジタル合成を可能にしている。単位フリンジ倍率を有する独自のホログラム記録ジオメトリによって、ホログラフィック光流体顕微鏡プラットフォームで、図3に示すように、光学的計算断層写真を実行するカギである複数の照明角度を用いて流れる対象を撮像することができる。
この実験では、図3に示す実施例を光流体断層写真顕微鏡として試験した。この顕微鏡は、マイクロ流体チャネル内を流れる検体の3D撮像を行うことができる。この光流体無レンズ撮像モダリティでは、センサから〜50mm離して配置した空間的非干渉性光源(〜10nmの特定帯域で中心周波数600nm、直径〜0.05乃至0.1mmの開口でフィルタにかけた)を用いて、サンプルのデジタルインラインホログラムを、光電センサアレイ(Aptina MT9P031STC,5 Megapixels,2.2μmピクセルサイズ)で記録した。ホログラムが取得されている一方で、図3に見られるように、x−y面において少し傾いたセンサ上に直接配置したマイクロチャネルに沿って対象を電気運動流で駆動する。この傾斜角度の正確な値は重要ではなく、事前に知る必要はない。これは、単に、マイクロチャネルに沿った対象の流れが、x及びyの両方においてシフト成分を生じることを確認して、ピクセル超解像を通じてより高い解像度のホログラムのデジタル合成を可能にしている。単位フリンジ倍率を有する独自のホログラム記録ジオメトリによって、ホログラフィック光流体顕微鏡プラットフォームで、図3に示すように、光学的計算断層写真を実行するカギである複数の照明角度を用いて流れる対象を撮像することができる。
断層写真撮像用の多角照明は、従来の光流体顕微鏡のアーキテクチュアで実行できない。なぜなら、対象と開口/センサ面との間の距離と屈折率が増えることによって、より大きい照明角度で、同じ対象の異なる断面の投影画像が失われ始めるからである。この光流体断層写真プラットフォームでは、各照明角度(例えば、θ=−50°:+50°に亘る)で、サンプルがセンサアレイ上をしっかり流れる間にいくつかの投影ホログラム(例えば、15フレーム)が記録される。これらの低解像度(LR)無レンズホログラムは、次いで、ピクセル超解像技術を用いて、単一の超解像(SR)ホログラムにデジタル的に合成され、所定の照明方向に対応する各投影ホログラムについて<1μmの方位分解能を達成する。これらのSR投影ホログラムがデジタル的に再構築され、同じ対象の複合投影画像を得る。これは、フィルタ逆投影アルゴリズムを用いて逆投影で対象の断層写真を計算できる。
野生種のC.Elegansの蠕虫を、マイクロ流体チャネル内を流れる間に、θ=−50°:+50°にわたって、2°の分散インクリメントの様々な照明角度で、順次撮像する実験を行った。これらの実験で、実験に使用したCMOSセンサチップの設計が、有効最大照明角度を最終的に制限している。ほとんどのデジタルセンサが、レンズベースの撮像システムで作動するように設計されており、したがって、±50°より大きい照明角度で記録したホログラムはアーティファクトを示している。このため、角度レンジを±50°に制限した。各照明角度について、〜15のホログラフィックフレームが流れる対象(<3秒で)について捕捉され、その結果電気運動流体条件の下、トータルで〜2.5分の撮像時間となった。これらの撮像角度は、光源を保持しているコンピュータ制御された回転ステージによって自動的に作られ、x−y面に配置されている検出器アレイに対してx−z面内で光源の回転を規定している。この設定で記録したいくつかの例示的LRホログラムを図11Fに示す。予想通りに、傾斜した照明(θ=±34°)について、xに沿ったホログラムの延長部分が、θ=0°の場合に比べて広い。マイクロチャネル内を流れる間の蠕虫のサブピクセルシフトを用いることによって、図11Gに示すように、各照明角度におけるサンプルの超解像ホログラムが合成される。すなわち、複数のサブピクセル画像を用いて、図2の操作1400に見られるように、単一のより高度な解像画像が作られる。これらのSRホログラムは、生ホログラムでサンプリングしたより詳細なフリンジを示す。
デジタルホログラフィック再構築を介してサンプルの複雑な投影画像を得るには、合成したSRホログラムを傾斜した基準波とデジタル的に重ね合わせる。マイクロ流体チャンバ内で光が反射するので、この再構築波の傾斜角度は、光源の傾斜と同じではない。代わりに、投影ホログラム用のデジタル再構築角度(θ)は、比Δd/z2の逆タンジェントを計算することによって決まる。ここで、Δdは対象のホログラム縦型投影画像における位置に対する横方向のシフトを表し、z2は、実験的に得ることもできるし、縦型投影ホログラムのデジタル再構築距離によってもわかる。なお、傾斜照明角度を使用する場合と異なり、基準波と対象波が同軸で伝わるため、記録したホログラムはインラインホログラムである。結果的に、対象−サポート制約に基づく反復位相回復アルゴリズムを用いて、対象を透過した複合フィールドを再構築する。これらの反復を通じて、光場が、平行なホログラムと対象面との間で前後して伝搬する。この反復が収束すると、傾斜方向に沿った寸法をcos(θ)でスケーリングし直した寸法のグリッド上に回復した場を挿入することによって、照明角度の垂直な面に複合場の投影が得られる。θ±34°及び0°に関して、例示的な再構築が図12A乃至12Dに示されている。これは、ホログラフィック光流体顕微鏡プラットフォームの多重角度超解像撮像パフォーマンスを示す。SRホログラムを計算して、〜15反復における画像の繰り返して行われる再構築の全プロセスは、Graphics Processing Unit(GPU−NVidia Geforce GTX480)平行CUDAベースの実装を用いて、0.25秒以下で行われる。
弱い分散対象については、デジタルホログラフィック再構築を介して得た複合場(図12A乃至12Dに示す)が、照明方向に沿った対象の複合伝達関数(位相、吸収、又は分散している電位)の投影を表す。したがって、対象の3D伝達関数は、逆フィルタ投影アルゴリズムを用いて断層写真の形で計算することができる。ここで、すべての複合投影画像(すなわち、θ=−50°:2°:50°についての51の超解像画像)が入力として使用されている。図13A乃至13Eは、C.Elegansサンプルの無レンズ光流体断層写真を示す図であり、ここでは、いくつかの深度における蠕虫の断面が提供されている。図13Fは、10倍の顕微鏡画像を示す。このような断層写真撮像スキームは、特に、ホログラフィック再構築モダリティに内在する良く知られた焦点深度の問題を軽減し、有意に改良した軸方向解像度で光流体断層撮像を可能にする。この断層写真再構築プロセスは(SRホログラムと逆フィルタ投影とを合成するステップを含む)、単一のGPUを用いて3.5分以上はかからない。これは、いくつかのGPUを並行して使用することによって、有意に改良できる。これらの断層写真再構築の結果に基づいて、蠕虫の移動の振幅についての軸方向ラインプロファイルの半値全幅(FWHM)は、〜30μmと測定された。これは、C.Elegansサンプルの典型的な厚さに匹敵する。断層写真を計算することなく、単一の超解像縦方向無レンズホログラム(θ=0°)を用いた同じ軸方向FWHMは〜1mmであり、これは、複数投影を用いて焦点深度が改良されることを明らかにしている。無レンズホログラムに固有の長い焦点深度は、実際、延長された被写界深度として近い投影を満足するよう補助しており、C.Elegansなどの弱く散乱したサンプルの断層写真撮像ができる。
記録しうるホログラムの制限された角度範囲によって、対象のフーリエ空間に、一般に「欠落ウエッジ」と呼ばれる欠落した領域がある。欠落ウエッジの最も重要な効果は、軸方向におけるPSFの延長である。これが、軸方向の解像度を、この場合〜3μmと考えられるラテラルより大きな値に制限する。このようなアーティファクトの減少は、対象の3Dサポートに基づく、あるいは対象の伝達機能に関する事前情報を用いた、反復制限アルゴリズムを実装することによって達成される。これによって、対象関数の3Dフーリエ空間における欠落領域を繰り返し埋めることができる。
実験3−第3実施例
実施例3は、チップ上に対象の深度断面を切り取ることができる携帯型無レンズ断層写真顕微鏡に関する。この小型無レンズ光学断層写真顕微鏡は、重さ〜110gであり、部分コヒーレントデジタルインラインホログラフィに基づいており、〜20mm2の大きなFOVにわたる<7μmの軸上解像度と、〜1mmの焦点深度(DOF)を達成することができ、チップ上の〜20mm3の大きなサンプルボリュームを調べることができる。DOFを〜4mmに延長することによって、空間解像度の低減を犠牲にして、撮像ボリュームも〜80mm3に増える。
実施例3は、チップ上に対象の深度断面を切り取ることができる携帯型無レンズ断層写真顕微鏡に関する。この小型無レンズ光学断層写真顕微鏡は、重さ〜110gであり、部分コヒーレントデジタルインラインホログラフィに基づいており、〜20mm2の大きなFOVにわたる<7μmの軸上解像度と、〜1mmの焦点深度(DOF)を達成することができ、チップ上の〜20mm3の大きなサンプルボリュームを調べることができる。DOFを〜4mmに延長することによって、空間解像度の低減を犠牲にして、撮像ボリュームも〜80mm3に増える。
この携帯型無レンズ断層写真プラットフォームでは、3D空間解像度を有意に強くできる主な要因は:(i)対象の複数デジタルインラインホログラムを断層写真撮像用の変化する照明角度で記録することと;(ii)ピクセル超解像度を実装して、各視野角度における無レンズホログラムの方位分解能を有意にあげること;である。このオンチップ顕微鏡断層写真の実装に、24個の発光ダイオード(LED−各々のコストは<0.3USD)が使用される。このLEDは、個別であるが、図4に示すように、アークに沿って傾斜した光ファイバ導波路にバット・カップリングされている。各ファイバは、コア径が〜0.1mm、長さが〜14mmである。このファイバは、アークに沿って装着されており、〜4.1°のインクリメントで±50°の範囲内で様々な角度からサンプルを照明している。このスキームでは、各ファイバコアの径が〜0.1mmなので、焦点レンズあるいは、各LEDの対応するファイバ端へのバット・カップリングをむしろシンプルにし、機械的ロバストにするその他の光結合ツールは不要である。照明源の一時的コヒーレンスを増やすために、LEDのスペクトルは、区分アーク上に装着した光ファイバアレイのジオメトリ(〜10mm×5mm)に合致する6ピースの干渉ベースのカラーフィルタ(総額<50USD、Edmund Optics)を用いて、〜10nm(中心〜640nm)まで狭める。このことによって、これらのカラーフィルタ上にほぼ垂直な入射光が入る。このスペクトルフィルタリングを行った後、照明ビームのコヒーレンス長は〜30μmまで増え、これによって、〜0.3乃至0.4の開口数(NA)、センサチップ表面からの最大対象高さ〜1mmのホログラムを得ることができる。
複数角度から無レンズ投影ホログラムを記録するためには、低価格マイクロコントローラ(Atmel ATmega8515、単価〜3USD)で順次、LEDを自動的にオン・オフ切り替えをする。デジタルセンサアレイ(Aptina MT9P031STC,5 Megapixels,2.2μm ピクセルサイズ)が、ファイバ端からz1=〜60mm離れて配置されており、無レンズ顕微鏡の一方の側から挿入されたサンプルトレイを介して装填された(センサチップの活性領域への距離、z2<5mm)対象の無レンズ投影ホログラムを記録する(図4参照)。各照明角度において、デジタルピクセル超解像を実装するためにサブピクセルシフトした一連のホログラムが記録される。この目的で、両端にネオジム磁石を有する共通のアーク形状部理事にすべてのファイバが装着されている。これらの磁石に装着されているコイルを直流電流で駆動することによって、電磁力が生じ、プラスチックのブリッジを始動させて、すべてのファイバ端を同時に移動させる。これらのファイバは、〜500μm×〜500μmのグリッド内で10乃至15の異なる位置にシフトして、各位置について、新しい〜20乃至24個のホログラフィック投影セットが得られる。すなわち、ソース面におけるここのような大きなシフトは、z1/z2比が大きいので、ホログラム面におけるより小さなシフトに対応している。より重要なことは、すべてのランダムシフトは、ピクセル超解像度を達成するのに同様の価値があるため、これらのシフトは正確である必要がなく、繰り返し可能なことである。更に、この情報は、取得した無レンズホログラムのシーケンスを処理することによって正確に得られるので、これらのシフトを事前に知る必要がない。LabView(National Instruments)をベースにした自動露出ソフトウエアを用いて、24画像セットを、4フレーム/秒で、〜6秒で取得することができる。これは、例えば、>15乃至20fpsの高いフレームレートのセンサを使用して、非常にスピードアップすることができる。
ホログラム記録ジオメトリにおける大きなz1/z2比が、±90°に近い角度でホログラムを記録できるにもかかわらず、デジタルセンサアレイの設計自体は、断層写真顕微鏡で使用できる照明角度の実際の範囲を制限している。ほとんどのデジタルセンサアレイは、撮像エレメントとしてレンズを使用する撮像システム用に設計されており、その結果、センサ表面法線から測定した入射光線の角度は、通常20°乃至30°より小さい。したがって、これらの光電センサの感度は、設計によっては、50°より大きい入射角と、収差が有意になるために急速に落ちる。したがって、ホログラム記録ジオメトリは、より大きな角度(例えば、70°乃至80°)の使用が可能であっても、この特別な断層写真顕微鏡構成のために、照明の角度範囲を±50°に制限している。
上述した通り、多角照明に使用する光ファイバは、電磁力で始動されるとすべてのファイバーと共に動く共通のアーク形軽量ブリッジ(〜1.7グラム)に接続されている。これらの光ファイバケーブルの他端は、機械的に固定されており、ここにアドレスされたLEDにバット・カップリングされている。したがって、全体の構造は、ばね質量系として成形することができ、すべてのファイバが集合的にばねとして作動し、ブリッジ片は質量負荷となる。
この構造の設計に考慮する必要があるいくつかの重要なスペックがある。すなわち、(1)機器の形状要因を小さく保つために、アクチュエータの全体アーキテクチュアを可能な限りコンパクトにするべきである;(2)この構造は、自体で硬いままに保つのに十分な剛性があって、小さな外部の動きが画像取得の間、ファイバーチップをランダムに動かさないようにしなければならない、さもなければ、記録したホログラムがぼやけてしまう;(3)この構造の最小振動モードの自然な機械共振周波数はできる限り高く、外部の振動とカップリングしたことによって構造が動かないようにしなければならない、これは、長期にわたってファイバ端を搖動することなく迅速に安定した状態で変位させるのに役立つ;及び(4)現場で使用するには、標準的な電池で供給できる適宜の電流と電圧値で十分な始動が行われなくてはならない。(1)、(2)、及び(3)は、ファイバーを短く保つことによって、構造をコンパクトかつ剛性にして(共鳴周波数も上げて)達成することができるが、これは残念なことに、必要な電磁力を大幅に上げることになり、多くの電力を消費する結果になるであろう。
ここで、Eはシリカファイバのヤング係数であり(E=72GPa)、rはファイバの半径であり(r=〜62.5μm)、Lはファイバ長である。この無レンズ断層写真顕微鏡の設計では、ファイバ長L=14mmが選択されており、これはプラスチックブリッジとファイバの固定端との間の距離である。これらのファイバが、N=24ファイバの集中型システムを形成する平行ばねとして作用すると仮定すると、構造の機械的周波数を以下の式で計算できる。
式(2)は、測定した質量m=1.7gがプラスチックブリッジと2つの磁石に使用される場合、f0〜24Hzの期待値となる。この計算式によれば、力が加わってファイバが安定−安定した変位に達するまでの時間は、例えば、〜45の線質係数として、〜300msと推測することができる。これらの計算を考慮すると実際のファイバの安定する時間は短い。更に、実験の間、外部の動揺に起因するファイバアレイの望ましくない搖動は観察されなかったし、構造全体は極めてロバスト性があり、頑丈で、現場使用に適している。
照明ファイバの電磁始動を達成するために、2つのネオジム磁石をプラスチックブリッジの各端部に装着した。これらの磁石の一方は、その上に〜1乃至2mmの距離で装着されているコイルに直流電流が流れると電磁力がアークの方向に沿ってファイバを移動させるように整列している。もう一方の磁石は、対応するコイルが作動すると直交する方向に変位するように配置されている。したがって、ファイバ端のx及びy方向における変位がなされて、サンプルの超解像投影ホログラムが生成される。これらのコイルは、そのシリンダ軸が磁石の磁化ベクトルに整列するように配置されている。この構成では、磁石に発生する力(Fmag)は、以下の式で計算できる。
ここで、Sは磁石の円筒断面積(単位m2)であり、Mは磁化(テスラ)であり、Hz1及びHz2(A/m)は磁石の上下それぞれにおける磁場強度の軸方向成分である。式(3)は、発生した力が磁石の2つの端部に生じる磁場の差ΔH2に正比例しており、これを用いて流れた電流の極性に応じて円筒軸に沿って磁石を押したり引いたりすることを提示している。
図4に示すように、撮像するサンプルは、携帯用断層写真顕微鏡の一方の側部から挿入したサンプルトレイを用いてセンサアレイの上に配置した標準的なカバーグラスの上に置くことができる。サンプルは、光源までの距離(〜60mm)に比べてセンサアレイの活性領域へより近い(<4乃至5mm)ので、対象の無レンズホログラムは、例えば〜24mm2といった広いFOVに記録できる。これは、例えば、典型的な10倍の対物レンズのFOVより、>20倍大きい。次いで、低価格マイクロコントローラを用いて、LEDを自動的に、(1つずつ)順次オンにして、±50°の角度範囲内でサンプルの無レンズ投影ホログラムを記録する。
各照明角度において空間解像度を上げるピクセル超解像(SR)を行うために、光ファイバ導波路端部を、電磁作動を介して少量(<500μm)ずつ機械的に変位させる。このスキームにおいては、ファイバを、両端に取り付けた低価格ネオジム磁石を用いて、共通ブリッジ(半径3.1mm、長さ6.2mm)に連結する。電磁的に磁石を作動させるのに使用する小型の円形電気コイル(半径5mm、高さ5mm)をプラスチックハウジング内部に装着し、x及びy両方向に沿ってすべてのファイバを同時にシフトさせる。
これらのファイバ端部の正確な変位量は事前に知る必要はなく、繰り返しあるいは正確に制御する必要もない。実際、各ファイバ端の個々の変位は、取得した無レンズホログラムシーケンスを用いてデジタル的に計算することができる。直流電流でコイルを駆動することでファイバが新しい位置にシフトされると、新しい無レンズ投影ホログラムセットが記録され、各ホログラムがセンサアレイに対して二次元的に若干シフトされる。電気コイル(50Ω)に〜4Vの電圧をかけて、ファイバ変位を最大(すなわち、<500μm)にするためには、80mAの最大電流が必要である。標準的なアルカリ電池(例えば、3000mAhの容量)を使用してファイバを作動させ、電池を交換する必要なく、少なくとも数日間、断層写真顕微鏡を連続的に使用することができる。
上述の設定で、10乃至15の投影ホログラムを各照明角度で記録して、所定の照明角度について一のSRホログラムをデジタル的に合成する。図14Aは、3つの異なる角度(−44°、0°、及び+44°)についてのホログラム記録ジオメトリを示す。図14Bは、図14Aの各対応する角度で取得した、対応するピクセル超解像(SR)投影ホログラムを示す。これらの無レンズSRホログラムは、デジタル的に再構築して、図14Cに見られるサンプルの投影画像を取得し、次いで、逆フィルタ投影アルゴリズムを用いて合成し、センサチップ上に配置した対象の断層写真を計算する。
各照明角度で記録したシフトしたホログラムをデジタル的に処理して、より空間解像度の高い投影ホログラムを合成する。これは、図2の操作1400に記載されている。これらのデジタル的に合成した超解像ホログラムは、次いで、迅速に再構築されて、対象の無レンズ投影画像を取得する。斜めの照明角度を使用したにもかかわらず、物体波と非摂動基準が同軸で伝達し、各無レンズホログラムはインラインホログラムとなる。二重像アーティファクトをなくし、記録した光場強度の位相を回復するには、ホログラム場が、対象サポートをこれらの反復機関における制約として用いて検出器と対象面との間で前後に伝わる反復位相回復アルゴリズムを用いる。従来のホログラム再構築と同様に、記録したホログラムは、ホログラムを記録するのに使用した基準波のデジタル的レプリカである再構築波とデジタル的に乗算される。したがって、反復位相回復ステップの前に、まず、ホログラムを角度θrec傾いている平面波と乗算する。サンプルチャンバ内の光の屈折によって、この再構築波の傾斜角度、θrecが、照明ファイバの物理的な傾きと同じではないことも重要である。実際、θrecは、Δd/z2の逆タンジェントを計算することで決まる。ここで、Δdは、縦型投影ホログラムにおける生ホログラムの位置に対する横方向のシフトであり、z2は実験的に得るか、あるいは縦型ホログラム画像のデジタル再構築距離によって決まる。集束は、通常10乃至20回の反復で達成され、その後、検出器に平行な物体面の光場が得られる。それにもかかわらず、照明方向に垂直である投影画像を得るには、この光場を回転させる必要がある。これを達成するには、回復した場を、照明の傾斜方向に沿ってcos(θrec)分、リスケールした新しいグリッドに挿間する。これは、回復した場を効果的に絞り込み、対応する角度についての投影画像を提供する。
各照明角度における投影画像を計算すると、この画像を断層写真を計算する前に共通の回転中心に対して記録する必要がある(例えば、3つの投影画像が中心のビーズに対して整列している、図14C(画像c1乃至c3)参照)。これは、自動化した2段階相互相関アルゴリズムを実装することによって達成される。第1の段階では、隣接する角度についての投影画像を、これらの隣接する投影の対象となる領域全体を相互相関させることによって、互いに整列させる(例えば、42°と46°;46°と50°)。連続する角度についての投影画像は互いによく似ているので、この操作は近似初期アラインメントを提供する。しかしながら、視野角に応じたシーンの若干の変化により、記録は完全ではない。第2の微調整段階では、投影画像の1つをグローバル基準画像として選択して、すべての投影画像をこの基準画像に対して記録するが、今回は投影画像中の対象となる小さな領域を利用する。この第2段階は、マイクロビーズなどの分散した小さな対象の画像を整列させる場合に、特に必要である。
逆フィルタ投影アルゴリズム(ここに参照により組み込まれているRadermacher M.公報により詳細に記載されている)を用いて、無レンズ投影画像から対象の断層写真を計算する。このアプローチの妥当性についての基本的条件は、断層写真を計算する投影画像が対象の特性の線的総和を表すことである(例えば、位相、吸収、分散強度、他)。これは、一般的に、入射光子の大部分が対象の容量を超えて最大で単会分散事象を経験する場合である弱い分散対象によって満たされる。
弱い分散対象が、|s(xθ、yθ、zθ)|≪1を満足する複雑な分散関数s(xθ、yθ、zθ)によって表されると仮定する。ここで、(xθ、yθ、zθ)は、z軸が特定の投影角度における照明角度に整列してる座標軸を規定する。この場合、相互干渉期間のホログラムに対する寄与は、実際のホログラフィック周波数変換機関に比較して、無視することができるであろう。この過程はさらに、システムの低空間コヒーレンス(横方向分離がコヒーレンス径より大きい対象間のクロストークを最小限に抑える)と一時的低コヒーレンス(分離がコヒーレンス長より長い異なる層間のクロストークを最小限に抑える)によって確認され、3Dコヒーレンスフィルタとして作用する。この結果、単一の断層写真容量(例えば、Δz〜±25μmに亘る)内の各投影画像について、ホログラフィックに再構築した画像コントラストが、∫|s(xθ、yθ、zθ)|・dzθで表される分散強度関数の線的和を生む。この結果は更に、検出開口数にかかわらず、デジタルインラインホログラフィスキームが一般的に、非常に長い焦点深度を有しており、その結果、所定のzθ方向に沿った分散係数を概算して、適宜の二重画像削除ステップの後に線的に加算することによって証明される。その結果、対象の分散強度の断層画像を、入力が、様々な照明角度において取得したピクセル超解像無レンズホログラムのホログラフィック再構築によって計算した投影画像である、フィルタをかけた逆投影アルゴリズムを適用することによって計算することができる。
携帯型無レンズ断層写真顕微鏡の性能を評価するために、寸法の異なるマイクロビーズを、伝染性の寄生性扁形動物であるHymenolepis Nanaの卵と共に撮像した。レンズ、レーザ、又はその他のコストのかかる光学機械部品を用いることなく、ここに述べた無レンズ断層写真顕微鏡が<7μmの軸方向解像度の断層像を提供し、一方で、〜20mm3の大撮像容量に各投影画像のNAを最大〜0.3乃至0.4上げ得るピクセル超解像を実装した。更に、この容量は、空間解像度を低減して、最大〜80mm3(〜4mmのDOFに対応する)まで拡大することができる。このように大きな撮像容量を超える良好な空間解像度を提供しつつ、この小型で、軽量(〜110g)で、対費用効果の高い無レンズ断層写真顕微鏡は、遠隔治療及び遠隔位置における高スループット撮像アプリケーション用の有益なツールを提供することができる。
図15Bは、直径2μmのマイクロ粒子のデジタル的に合成したピクセル超解像(SR)ホログラムを示す。ここで、空間周波数がより高いホログラフィックフリンジを、図15Aに示す生の低解像度(LR)ホログラムと比較して観察することができる。この開口数(NA)が大きくなった結果、SRホログラムを用いた再構築画像が、図15Cと15Dの視覚的な比較でわかるように、より高い方位解像度を示している。ここでは(SRで)、2μmのビーズを実際のサイズより近くで撮像している。
次いで、図15A及び15Bにそれぞれ示すLR及びSRホログラムに対応して、再構築した深度プロファイルを考察した。図15AのLR無レンズホログラムをいくつかの異なる深度(z)でデジタル的に再構築することによって、同じ2μmの粒子に対応する図15Eに示すy−z及びx−zプロファイル(画像a1及びa2)を得ることができる。この結果、z方向に沿った拡大は深度断面に向けての単一LRホログラムの制限を示している。この制限は、図15F(画像b1及びb2)に示すようにSR無レンズホログラムを用いて部分的に改善される。一方、SRでの開口数の改良にもかかわらず、例えば、〜45μmあるいはより良好な軸上解像度で対象の断面撮像をすることができない。
この基本的な軸上解像度の制限を軽減するために、±50°の範囲にわたる〜20の照明角度について合成した無レンズSRホログラムを用いて、図16A乃至16Cに示す同じマイクロ粒子の断層写真を作成した。図16A乃至16Cに示すこの結果は、ビーズ画像の短い焦点深度で観察される携帯型無レンズ断層写真顕微鏡が軸上解像度を有意に改善することを表している。携帯型断層写真顕微鏡は、単一LRホログラムと単一SRホログラムでそれぞれ達成できる要因に比較して、>13×及び〜6乃至7×の要因で軸上解像度を改善する。
携帯型無レンズ断層写真顕微鏡の深度セクショニング能力を更に示すために、光学接着剤(屈折率〜1.52、Norland NOA65)を満たした厚さ〜50μmのチャンバ内にランダムに分散させた直径5μmの球形マイクロビーズ(屈折率〜1.68、Corpuscular Inc.)を撮像した。図17A乃至17Eは、比較目的で使用した40倍の対物レンズ(NA:0.65)のFOVに合致させるためにより大きい画像領域からデジタル的にクロップした対象小領域についての断層写真再構築結果を示す(図17F乃至17J)。チャンバの全深度についての無レンズ断層写真を、Graphics Processing Unit (NVidia,Geforce GTX 480)を用いて<1分以内に計算した。図17A乃至17Eの矢印は、画像の対応する層深度でフォーカスしているマイクロビーズを示しており、これは、図17F乃至17Jに示す、同じ深度で得られた標準的な顕微鏡の画像を用いて交差評価することができる。断層写真撮像性能を更に数量化するために、図18Aでは同じFOV内に位置する任意のマイクロビーズのx及びyラインプロファイルを示す。ここでは、粒子の半値全幅(FWHM)をx及びy方向に沿ってそれぞれ、〜5μm及び〜5.5μmとして計算することができ、これはその径(5μm)に良く合致している。同じビーズの断層写真(z方向に沿った)の軸上ラインプロファイルは、図18Bに見られるように、〜12.9μmのFWHMを有する。多角照明と断層写真デジタル再構築を使用せずに、単一のSRホログラムのみを使用すると、同じマイクロ粒子のコンピュータ画像は>75μmの軸上FWHMを有するであろう。これは、その焦点深度が長いため、インラインホログラフィック撮像プラットフォームでは予期されることである。図18Bに示す軸上ラインプロファイルの一次元空間導関数(すなわち、そのラインプロファイル)を取ることによって、z方向に沿った断層写真顕微鏡の点広がり関数のFWHMは〜6μmになると予測できる(図18Bの導関数曲線参照)。
図4に示す無レンズホログラム記録ジオメトリは、特に、高スループットの撮像が必要な場合にいくつかの利点があり、長い焦点深度(例えば〜1.4mm)や、広い視野(例えば〜20mm2)の両方を達成する。特に、無レンズホログラフィック投影は、対象となるどの深度でも再構築することができ、したがって、断層写真は特別な収差を導入することなくその深度領域付近で計算できる。このアプローチにより、長い被写界深度内の対象となる任意の領域の3D撮像が可能となり、したがって、撮像容量が大きくなる。
この能力を特に示すために、多層チャンバ(間に〜1mmの距離を置いて互いに重ねた、トータル厚さ〜3.5mmの4層)を撮像した。この層は、光学接着剤に埋め込んだ10μmのビーズでできている。この厚い対象は、センサチップの活性領域から〜0.7mm離して配置されており、最も遠い層は、センサ面からz〜4.2mmの位置にある。図19Aは、角度0°における多層チャンバの記録されたホログラムを示す図である。図19B乃至19Fは、この厚い対象の中の異なる層のコンピュータ断層写真を示す図であり、長いDOF内での無レンズ断層写真アプローチの光学的セクショニング能力を示している。異なる層において計算したこのような分離した断層写真をデジタル的に合成することによって、全DOFの断層写真と対象の体積を得ることができる。最も遠い層(センサから〜4.2mm離れている)における対象の無レンズホログラムは、センサの活性領域から上は40°及び下は−40°の照明角度に対してシフトしており、その結果、角度範囲は最上層に対してのみ±40°に制限されている。厚い又は多層のチャンバの断層写真撮像用のピクセル超解像スキームのデジタル的実装には、追加の信号処理が必要である。なぜなら、有意に異なる深度に位置する対象は、センサ面における対応するホログラムの横方向のシフトに大きな変化があるためである。この問題に対処するために、反復アルゴリズムを用いて超解像ホログラムを所定の深度の層(すなわち、その他の層から独立して)について特別に計算できるようにした。図19G乃至19Iは、様々な深度についてのSRホログラムを示す(図19G:z=〜0.75mm;図19H:z=〜1.8mm;図19I:z=〜4.2mm)。
上述した通り、例えば<200乃至300μmの高さに対象が分散されているチャンバについて、すべての対象のホログラムは所定のソースシフトとほぼ同じようにシフトする。したがって、すべてのサブピクセルシフトホログラムで測定したデータを満足する単一のSRホログラムを合成することができる。しかしながら、厚い又は多層のチャンバについては、>200乃至300μm軸方向に離れている対象の無レンズホログラムは、有意に異なる量シフトし、異なるソースシフトについて記録したホログラムは異なって見える。この結果、シフトしたすべてのホログラムを満足する単一のSRホログラムを計算することはできない。この問題を解決するために、ホログラム強度から望ましくない層をデジタル的に消去することによって、所望の層についてのみの情報を持つ新しいホログラムを取得することができる。これを行うために、図19Aに示すような厚い(あるいは多層の)チャンバについての無レンズホログラムを、望ましくない層で再構築して、これらの層でフォーカスされた対象を、二値マスク操作を用いてホログラム場から除去するようにする。所望の層以外のすべての層を続けて消去することで、新しいデジタル的にクリーンなホログラムができる。このホログラムは、特に、対象の層深度について測定したデータに忠実である。センサにより近い層を消去することで、クリーンになったホログラムの残り部分を残すが、これらの残り部分は非常に弱いのでこのことは問題にならない。また、所望の層のホログラムは、もともと測定した生のホログラムデータに合致して完全な状態で残る。最終的に、様々なサブピクセルシフトがあるこれらの新しいホログラムが対象となる所定の層について得られると、その層深度のSRホログラムを順次計算することができる。図19G乃至19Iは、異なる深度におけるデジタル的にクリーンなSRホログラムを示している。
バイオ医薬における潜在的なアプリケーションについての携帯型無レンズ断層写真顕微鏡の性能を評価するために、Hymenolepis Nana(H.Nana)の卵を撮像した。H.Nanaの卵は、直径〜40μmのほぼ球形構造を持つヒトの伝染性寄生型扁虫である。無レンズインラインホログラフィの長い被写界深度によって、この卵の光学的切断は、所定の照明角度で記録したホログラムを再構築するだけではできない。しかしながら、図20Aに示すように、この寄生型卵の個別の深度セクション(画像a1、a2、a3)を、携帯型断層写真顕微鏡(図4に示す)を用いて作ることができ、各深度層における個々の詳細/特徴を示すことができる。比較の目的で、図20Aに見られるものと同じ深度位置での40倍の顕微鏡画像を図20Bに示す。
実施例を示して説明したが、ここに開示した本発明の概念範囲から外れることなく様々な変形を行うことができる。したがって、本発明は特許請求の範囲とその均等物以外によっては制限を受けるべきでない。
Claims (35)
- サンプル内に含まれる対象の三次元撮像システムにおいて:
画像センサと;
前記サンプルを保持するように構成され、前記画像センサ近傍に配置されたサンプルホルダと;
部分コヒーレント光又はコヒーレント光を具える照明源であって、前記光源と前記サンプルホルダの間に配置された、開口、光ファイバケーブル、あるいは光導波路の少なくとも1つを通して前記サンプルを照明するように構成された照明源と、を具え、
前記照明源が複数の異なる角度で前記サンプルを照明するように構成されていることを特徴とするシステム。 - 請求項1に記載のシステムにおいて、前記照明源が静止しているサンプルホルダに対して移動可能であることを特徴とするシステム。
- 請求項1に記載のシステムにおいて、前記サンプルホルダが静止している照明源に対して移動可能であることを特徴とするシステム。
- 請求項1に記載のシステムにおいて、前記サンプルホルダがマイクロ流体フローセルを具えることを特徴とするシステム。
- 請求項4に記載のシステムにおいて、前記サンプルホルダが前記画像センサに対して角度を成していることを特徴とするシステム。
- 請求項1に記載のシステムにおいて、前記複数の異なる角度が、約−89°乃至+89°の範囲に亘ることを特徴とするシステム。
- 請求項1に記載のシステムにおいて、前記複数の異なる角度が、ほぼ直交する軸に沿った角度を含むことを特徴とするシステム。
- 請求項1に記載のシステムが更に、前記サンプルの三次元画像を、前記複数の異なる角度における照明から取得した画像に基づいて再構築するように構成された少なくとも一のデジタルプロセッサを具えることを特徴とするシステム。
- 請求項1に記載のシステムが更に、前記開口、光ファイバケーブル又は光導波路のうちの少なくとも1つを、前記撮像面とほぼ平行な平面において移動させる手段を具えることを特徴とするシステム。
- 請求項1に記載のシステムにおいて、前記移動させる手段が、ステップモータ、移動可能なステージ、圧電素子、及びソレノイドのうちの少なくとも1つを具えることを特徴とするシステム。
- 請求項1に記載のシステムにおいて、前記複数の角度が、三次元形状の表面に沿った異なる角度を含むことを特徴とするシステム。
- 請求項11に記載のシステムにおいて、前記形状が球形又は楕円形であることを特徴とするシステム。
- サンプルに含まれる対象の三次元画像を取得する方法において:
第1の角度で部分コヒーレント光又はコヒーレント光を出射する光源と共にサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを照明するステップであって、前記サンプルを照明する前に開口又は光ファイバケーブルのうちの少なくとも1つを光が通過するステップと;
前記サンプルホルダを異なる角度で前記照明源を用いて照明するステップであって、前記サンプルを照明する前に開口又は光ファイバケーブルを光が通過するステップと;
各角度において、前記サンプルホルダの反対側に配置した画像センサから複数のサブピクセル画像フレームを取得するステップと;
各角度における前記サブピクセル画像フレームを、各角度について単一のより解像度が高いホログラムにデジタル的に変換するステップと;
前記より高い解像度のホログラムから各角度についての投影画像をデジタル的に再構築するステップと;
前記サンプル中の対象の三次元断層写真画像をデジタル的に逆投影するステップと;
を具えることを特徴とする方法。 - 請求項13に記載の方法において、各角度において画像センサからの複数のサブピクセル画像フレームを取得するステップが更に、前記照明源、開口、又は光ファイバケーブルの少なくとも1つを、前記画像センサにほぼ平行な平面において横方向に移動させるステップを具えることを特徴とする方法。
- 請求項13に記載の方法において、前記複数の角度が単一平面における複数の角度を含むことを特徴とする方法。
- 請求項13に記載の方法において、前記複数の角度が互いにほぼ直交する2つの平面における複数の角度を含むことを特徴とする方法。
- 請求項13に記載の方法において、前記複数の角度が三次元形状の表面に沿った異なる角度を含むことを特徴とする方法。
- 請求項17に記載の方法において、前記形状が球形又は楕円形を含むことを特徴とする方法。
- 請求項13に記載の方法において、前記各角度においてサブピクセル画像フレームを各角度についての単一の解像度が高いホログラムにデジタル的に変換するステップ;各角度についてより解像度が高いホログラムから投影画像をデジタル的に再構築するステップ;及び前記サンプル中の対象の三次元断層写真画像をデジタル的に逆投影するステップ;が、少なくとも一のプロセッサで実行されることを特徴とする方法。
- サンプル中に含まれる対象の三次元撮像を行う方法において:
画像センサ近傍に配置したフローセルを通してサンプルを流すステップと;
第1の角度で部分コヒーレント光又はコヒーレント光を出射する照明源で前記サンプルを照明するステップであって、前記光が、前記サンプルを照明する前に、開口、光ファイバケーブル、又は光導波路のうちの少なくとも1つを通過するステップと;
前記画像センサを用いて前記第1の角度で、移動するサンプル中にある前記対象の複数の画像フレームを取得するステップと;
前記照明源で前記サンプルを一又はそれ以上の異なる角度で照明するステップであって、前記光が、前記サンプルを照明する前に、開口、光ファイバケーブル、又は光導波路のうちの少なくとも1つを通過するステップと;
前記画像センサを用いて前記一又はそれ以上の異なる角度で、移動するサンプル中にある前記対象の複数の画像フレームを取得するステップと;
前記第1の角度及び一又はそれ以上の異なる角度で取得した前記複数の画像フレームから前記対象の超解像投影ホログラムをデジタル的に再構築するステップと;
前記第1の角度及び一又はそれ以上の異なる角度で取得した前記超解像投影ホログラムに基づいて、前記サンプル内の対象の複合投影画像をデジタル的に再構築するステップと;
前記複合投影画像を前記サンプル中の対象の三次元断層写真にデジタル的に再構築するステップと;
を具えることを特徴とする方法。 - 請求項20に記載の方法において、前記複合投影画像が、前記複合投影画像のフィルタ逆投影を介して三次元断層写真にデジタル的に再構築されることを特徴とする方法。
- 請求項20に記載の方法において、前記フローセルが前記撮像センサアレイに対して角度を成していることを特徴とする方法。
- 請求項20に記載の方法において、前記第1の角度及び一又はそれ以上の異なる角度が、約−89°乃至+89°の間の範囲内にあることを特徴とする方法。
- 請求項20に記載の方法において、前記第1の角度及び一又はそれ以上の異なる角度が前記フローの方向に対して若干角度を成しているアークに沿って成されており、約−89°乃至+89°の間の範囲内にあることを特徴とする方法。
- 請求項20に記載の方法において、前記第1の角度及び一又はそれ以上の異なる角度が前記フローの方向に対して垂直なアークに沿って成されており、約−89°乃至+89°の間の範囲内にことを特徴とする方法。
- 請求項20に記載の方法において、前記一又はそれ以上の異なる角度が、三次元形状の表面に沿った異なる角度を含むことを特徴とする方法。
- 請求項26に記載の方法において、前記形状が球形又は楕円形を含むことを特徴とする方法。
- 携帯型断層写真撮像装置において:
中にサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを具えるハウジングと;
前記サンプルの第1側部に対して変化する角度で前記ハウジング内に配置された複数の部分コヒーレント光源又はコヒーレント光源であって、当該複数の光源の各々が、それぞれ導波路に接続されている光源と;
前記複数の光源に動作可能に接続されたマイクロコントローラであって、個々の光源を個別に作動させるように構成されているマイクロコントローラと;
ほぼ直交する方向に前記導波路を移動させるように構成された電磁アクチュエータと;
前記サンプルの第2の側部の前記ハウジング内に配置した画像センサと;
を具えることを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。 - 請求項28に記載の携帯型断層写真撮像装置が更に、前記導波路と前記サンプルとの間にカラーフィルタを介在させたことを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
- 請求項28に記載の携帯型断層写真撮像装置が更に、前記ハウジング内に一又はそれ以上のバッテリを配置したことを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
- 請求項28に記載の携帯型断層写真撮像装置において、前記複数の部分コヒーレント光源がLED又はレーザダイオードを具えることを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
- 携帯型断層写真撮像装置において:
中にサンプルを保持するように構成されたサンプルホルダを具えるハウジングと;
前記サンプルの第1側部に対して変化する角度で前記ハウジング内に配置された複数の部分コヒーレント光源又はコヒーレント光源であって、当該複数の光源の各々が、それぞれ空間開口に接続されている光源と;
前記複数の光源に動作可能に接続されたマイクロコントローラであって、個々の光源を選択的に個別に作動させるように構成されているマイクロコントローラと;
ほぼ直交する方向に前記空間開口を移動させるように構成された電磁アクチュエータと;
前記サンプルの第2の側部の前記ハウジング内に配置した画像センサと;
を具えることを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。 - 請求項32に記載の携帯型断層写真撮像装置が更に、前記空間開口と前記サンプルとの間にカラーフィルタを介在させたことを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
- 請求項32に記載の携帯型断層写真撮像装置が更に、前記ハウジング内に一又はそれ以上のバッテリを配置したことを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
- 請求項32に記載の携帯型断層写真撮像装置において、前記複数の部分コヒーレント光源がLED又はレーザダイオードを具えることを特徴とする携帯型断層写真撮像装置。
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