JP2014501521A - Ahp6遺伝子の破壊は種子収量が向上した植物をもたらす - Google Patents
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Abstract
Description
-ヒスチジンリン酸基転移キナーゼ/トランスフェラーゼタンパク質の構造ファミリーのメンバーである;および/または
-配列番号1の位置Asn83に対応する位置にヒスチジンを欠く;および/または
-配列番号1または12を有するAHP6タンパク質と本質的に同じ機能を示す;および/または
-配列番号1または12のアミノ酸配列全体と比較した場合、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
タンパク質を指してもよい。
(a)配列番号1もしくは12のアミノ酸配列を含むAHP6タンパク質もしくはこのオルソログをコードする核酸、
(b)配列番号1もしくは12のアミノ酸配列全体と比較した場合、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むAHP6タンパク質をコードする核酸、
(c)配列番号2、3、4、13もしくは14の核酸配列を含む核酸、
(d)配列番号2、3、4、13もしくは14の核酸配列全体を通じて、少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸、または
(e)(a)、(b)、(c)および/もしくは(d)下に定義された核酸配列の1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
を含んでもよく、またはからなってもよい。
-配列番号1または12を有するシロイヌナズナのAHP6タンパク質、
-配列番号5を有するシロイヌナズナのCKX1タンパク質、
-配列番号6を有するシロイヌナズナのCKX2タンパク質、
-配列番号7を有するシロイヌナズナのCKX3タンパク質、
-配列番号8を有するシロイヌナズナのCKX4タンパク質、
-配列番号9を有するシロイヌナズナのCKX5タンパク質、
-配列番号10を有するシロイヌナズナのCKX6タンパク質、および/または
-配列番号11を有するシロイヌナズナのCKX7タンパク質
と本質的に同じ機能を有するタンパク質をコードし、配列の長さ全体にわたって、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、シロイヌナズナとは異なる種に由来する内因性遺伝子を意味してもよい。
(a)別のアミノ酸に代わるアミノ酸の置換をもたらす核酸配列における変化である「ミスセンス変異」、
(b)未成熟ストップコドンの導入をもたらし、故に、翻訳の停止をもたらす(切断されたタンパク質をもたらす)核酸配列における変化である「ナンセンス変異」または「ストップコドン変異」(植物遺伝子は、翻訳ストップコドン「TGA」(RNAではUGA)、「TAA」(RNAではUAA)および「TAG」(RNAではUAG)を含有し、故に、(リーディングフレームで)翻訳される成熟mRNAにあるべきこれらのコドンの1つをもたらすいずれのヌクレオチド置換、挿入、欠失も、翻訳を停止させる)、
(c)核酸のコード配列において付加された1つまたは複数のコドンに起因する、1つまたは複数のアミノ酸の「挿入変異」、
(d)核酸のコード配列において欠失された1つまたは複数のコドンに起因する、1つまたは複数のアミノ酸の「欠失変異」、
(e)変異の下流の異なるフレームで翻訳される核酸配列をもたらす「フレームシフト変異」(フレームシフト変異は、1つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または重複など、さまざまな原因を有し得る)
などの1つまたは複数の変異を含む場合、内因性遺伝子は本発明の意味において破壊され得る。
N6-ジメチルアリルアデニン+アクセプター+H2O⇔アデニン+3-メチル-ブタ-2-エナール+還元アクセプター
を触媒する酵素である。
-配列番号5と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX1遺伝子、
-配列番号6と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX2遺伝子、
-配列番号7と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX3遺伝子、
-配列番号8と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX4遺伝子、
-配列番号9と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX5遺伝子、
-配列番号10と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX6遺伝子、または
-配列番号11と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX7遺伝子
であってもよい。
(a)配列番号1、12のアミノ酸配列を含むAHP6タンパク質もしくはこのオルソログをコードする核酸、
(b)配列番号1もしくは12のアミノ酸配列全体と比較した場合、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むAHP6タンパク質をコードする核酸、
(c)配列番号2、3、4、13もしくは14の核酸配列を含む核酸、
(d)配列番号2、3、4、13もしくは14の核酸配列全体を通じて、少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸、または
(e)(a)、(b)、(c)および/もしくは(d)下に定義された核酸配列の1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
を含む、またはからなる。
-配列番号5と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX1遺伝子、
-配列番号6と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX2遺伝子、
-配列番号7と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX3遺伝子、
-配列番号8と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX4遺伝子、
-配列番号9と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX5遺伝子、
-配列番号10と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX6遺伝子、または
-配列番号11と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX7遺伝子
であってもよい。
植物材料および生長条件
シロイヌナズナのコロンビア(Col-0)生態型を野生型として使用した。T-DNA挿入変異体ckx2-S1 (SALK_068485)、ckx3-S1 (SALK_050938)、ckx4-S1 (SALK_055204)、ckx5-S1 (SALK_064309)、およびckx6-S1 (SALK_070071)は、Salk Institute Genomic Analysis Laboratory (Alonsoら、(2003) Science 301、653〜657頁)から、トランスポゾン挿入変異体ckx4-ZはZIGIAトランスポゾンコレクション(Baumann E、Lewald J、Saedler H、Schulz B、Wisman E (1998) Successful PCR-based reverse genetic screens using an En-7-mutagenised Arabidopsis thaliana population generated via single-seed descent. Theoretical and Applied Genetics 97: 729〜734頁)から、ckx5-G2 (系統ID 332B10)およびckx7-G1 (系統ID 363C02)はGABI-KATコレクション(Rosso、M.G.、Li、Y.、Strizhov、N.、Reiss、B.、Dekker、K.、and Weisshaar、B. (2003) Plant Mol. Biol. 53、247〜259頁)から、およびckx7-T1 (SAIL_515_A07)はTorrey Mesa Research Institute (現Syngenta)からであった。ahp6-1アレルを、サイトカイニン受容体CRE1/AHK4のwol変異に関連した限定根生長の抑制スクリーニングにおいて同定し、単離した(Mahonen, A. P.、Bonke, M.、Kauppinen, L、Riikonen, M.、Benfey, P.N.、およびHelariutta, Y. (2000). A novel two-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root. Genes Dev. 14、2938〜2943頁;ならびにMahonen, A. P.、Bishopp, A.、Higuchi, M.、Nieminen, K.M.、Kinoshita, K.、Tormakangas, K.、Ikeda, Y.、Oka, A.、Kakimoto, T.、およびHelariutta, Y. (2006)、Cytokinin signaling and its inhibitor AHP6 regulate cell fate during vascular development. Science 311、94〜98頁)。ahp6-3アレルは、ヌルアレルの可能性があることを表す、およびahp6-1と同様の方法(Mahonenら、2006)でwol表現型を抑制するT-DNA挿入である。複数の変異体は遺伝的交配により得た。植物は、温室で長日条件下(16時間明期/8時間暗期)、22℃、土壌で生育させた。種子収量測定について植物は、グロースチャンバー(Percival AR-66L)で長日条件下、約100μΕ、65%湿度、24℃、土壌で生育させた。
主茎における長角果の数は、開花の終了後に決定した。主茎における長角果の数は、種子収量に関する周知の指標である。主茎における長角果の数の増加は、通常、植物あたりの総種子収量の増加を示す(図2Aおよび2Cから理解され得る通り)。種子収量の直接分析のため、植物を開花の終了後に紙袋に入れ、総種子重量を決定する前にさらに3週間乾燥状態に保った。
本発明者らは、ahp6変異体植物の生殖発育を野生型対照植物と比較した。シロイヌナズナ属の花は、無限花序***組織により絶えず形成される。ahp6変異体は両方とも、野生型より大幅に多い花からなるより大きな花序を形成した。ahp6花序***組織により形成されたより多くの花は、野生型に比べて長角果の数の増加をもたらした(図2A)。最後の花の形成後の主茎における長角果の数を比較した。ahp6-1およびahp6-3変異体は、それぞれ野生型植物より11および21%多い長角果を産生した(図2A)。さらに、ahp花序茎における長角果の密度が増加した。花序茎の長さ単位あたりの長角果の数は、野生型植物に比べて、ahp6-1およびahp6-3変異体でそれぞれ22および20%増加した(図2B)。花および長角果形成の増加が、変異体植物の種子収量に影響を与えるかどうかを試験するため、本発明者らは、開花の終了後に個々の植物から全ての種子を回収し、種子重量を決定した。ahp6-1およびahp6-3変異体の総種子収量は、それぞれ野生型に比べて19.5および16.7%増加した(図2C)。
Claims (15)
- 植物における種子収量を増加させるための方法であって、植物の細胞における内因性AHP6遺伝子の破壊を含み、前記破壊が、このような破壊を欠く対応する対照植物に比べて、前記内因性AHP6遺伝子の産物の発現および/または活性を阻害する方法。
- 内因性AHP6遺伝子の破壊を植物ゲノムに導入する工程と、
このような変更されたゲノムを有する植物を再生する工程と
を含む、請求項1に記載の方法。 - 破壊が植物ゲノムに安定に導入される、請求項2に記載の方法。
- 内因性AHP6遺伝子が、ヒスチジンリン酸基転移キナーゼ/トランスフェラーゼタンパク質の構造ファミリーのメンバーである、配列番号1の位置Asn83に対応する位置にヒスチジンを欠く、および配列番号1または12を有するAHP6タンパク質と本質的に同じ機能を示すAHP6タンパク質をコードする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 内因性AHP6遺伝子が、
(a)配列番号1もしくは12のアミノ酸配列を含むAHP6タンパク質もしくはこのオルソログをコードする核酸、
(b)配列番号1もしくは12のアミノ酸配列全体を通じて、少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むAHP6タンパク質をコードする核酸、
(c)配列番号2、3、4、13もしくは14の核酸配列を含む核酸、
(d)配列番号2、3、4、13もしくは14の核酸配列全体を通じて、少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸、または
(e)(a)、(b)、(c)および/もしくは(d)下に定義された核酸配列の1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
を含む、またはからなる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - 少なくとも1つの内因性CKX遺伝子の破壊を植物ゲノムに導入する工程をさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのCKX遺伝子が、
-配列番号5と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX1遺伝子、
-配列番号6と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX2遺伝子、
-配列番号7と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX3遺伝子、
-配列番号8と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX4遺伝子、
-配列番号9と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX5遺伝子、
-配列番号10と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX6遺伝子、または
-配列番号11と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX7遺伝子
である、請求項6に記載の方法。 - 配列番号7と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質をコードする内因性CKX3遺伝子、またはこのオルソログ、および配列番号9と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質をコードする内因性CKX5遺伝子、またはこのオルソログが破壊されている、請求項6または7に記載の方法。
- 1つ、1つを超えるまたは全ての破壊が、構造的破壊、アンチセンスポリヌクレオチド遺伝子抑制、二本鎖RNA誘導遺伝子サイレンシング、リボザイム法、ゲノム破壊、TILLINGおよび/または相同的組換えにより導入される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ、1つを超えるまたは全ての破壊がホモ接合破壊である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 植物およびこれに由来する子孫における種子収量を増加させるための、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法の使用。
- 種子収量が増加した非自然発生植物の作製のための、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法の使用。
- 内因性AHP6遺伝子および少なくとも1つの内因性CKX遺伝子における破壊を含む非自然発生植物。
- 内因性AHP6遺伝子が、
(a)配列番号1、12のアミノ酸配列を含むAHP6タンパク質もしくはこのオルソログをコードする核酸、
(b)配列番号1もしくは12のアミノ酸配列全体を通じて、少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むAHP6タンパク質をコードする核酸、
(c)配列番号2、3、4、13もしくは14の核酸配列を含む核酸、
(d)配列番号2、3、4、13もしくは14の核酸配列全体を通じて、少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸、または
(e)(a)、(b)、(c)および/もしくは(d)下に定義された核酸配列の1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
を含む、またはからなる、請求項13に記載の非自然発生植物。 - 少なくとも1つのCKX遺伝子が、
-配列番号5と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX1遺伝子、
-配列番号6と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX2遺伝子、
-配列番号7と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX3遺伝子、
-配列番号8と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX4遺伝子、
-配列番号9と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX5遺伝子、
-配列番号10と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX6遺伝子、または
-配列番号11と同一であるもしくは少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むCKXタンパク質またはこのオルソログをコードする内因性CKX7遺伝子
である、請求項13または14に記載の非自然発生植物。
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