CN103348010A - 中断ahp6基因导致植物种子产量提高 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种增加植物种子产量的方法，这种方法包括中断植物细胞中的内源AHP6基因，相较于相应的缺少上述中断的对照植物，所述的中断抑制了所述内源AHP6基因产物的表达和/或活性。

Description

中断AHP6基因导致植物种子产量提高

背景技术

为了能为不断增长的人口提供食物和其他植物源产品，人们一直对提高农业生产率感兴趣。

植物的产量可通过各种不同的方式受到影响，例如，通过改善植物生长特性或延缓叶片衰老。已知许多机制和通路与植物生长和发育有关。

细胞***素是一种植物激素，在植物生长和发育的许多方面起着正调节和负调节的作用。细胞***素促进茎尖分生组织的形成及其活力，能建立库组织，延缓叶片衰老，抑制根的生长和分支，并且在种子萌发和应激反应中起到作用(Mok,D.W.S.&Mok,M.C.(2001)Ann.Rev.Plant Physiol.Mol.Bio.52,89-118)。对缺少细胞***素的植物进行分析表明，细胞***素在茎尖分生组织和根部分生组织中起着相反的作用，从而暗示该激酶在器官生长的定量控制中具有很重要的功能(Werner T,Motyka V,Laucou V,Smets R,VanOnckelen H,Schmülling T,Plant Cell2003,15(11):2532-50;Werner T,Motyka V,Strnad M,Schmülling T,Proc Natl Acad Sci U S A2001,98(18):10487-92)。

已经显示细胞***素氧化/脱氢酶(CKX)是调节植物激素细胞***素维持体内平衡的重要因素。拟南芥属基因组编码7个CKX基因，这7个CKX基因具有不同的表达域(Werner et al.,2001;Werner et al.,2003)。各CKX蛋白质具有不同的亚细胞定位和生化特性(Werner et al.,2003)。通过各单独CKX基因的过表达，建立了细胞***素缺陷植物，结果表明细胞***素是茎尖分生组织活性的正调节因子，且是根部分生组织活性的负调节因子。

最近证实，在水稻作物中，抑制特定CKX基因功能，该基因是拟南芥CKX3的水稻同源基因，会导致所述水稻作物的载粒数增加（见US2006/0123507A1)。

虽然这些结果是很有希望的，但仍然需要进一步提高植物的产量。

发明内容

本发明的目的在于提供合适的手段和方法，以提高植物的产量。

本发明将按照下文详细描述来实现上述目的。

本发明提供一种提高植物种子产量的方法，这种方法包括将植物细胞中内源AHP6基因中断，相较于相应的缺少所述中断的对照植物，所述的中断抑制了所述内源AHP6基因产物的表达和/或活性。

令人惊讶的是，已经发现植物AHP6基因中断导致植物种子产量高于缺少这种中断的植物。而单一的AHP6中断已经导致种子产量显著的增长，相较于野生型和单一的CKX基因中断，至少一种CKX基因与AHP6基因同时产生中断，能够导致可观的进一步增长。AHP6,CKX3和CKX5的中断同时发生导致种子产量的最显著增加。更令人惊讶的是，已经发现至少一种CKX基因与AHP6基因的同时稳定中断导致植物增产更多。看来，植物内源AHP6基因中断而增加细胞***素是非常有效的。当植物表现出通常与出现细胞***素含量增加相关的表型时，可观察到细胞***素水平增加。植物的至少一种内源CKX基因与AHP6同时中断可以造成细胞***素水平增加，例如，至少两种不同的内源CKX基因与AHP6同时产生中断。然而，其他改变或操作也能造成细胞***素水平增加，例如，参与细胞激肽类合成的基因突变或细胞***素受体的突变。另一种选择是通过施用化合物影响植物细胞***素水平。已知部分化合物导致细胞***素水平增加。

第一方面，本发明提供一种提高植物种子产量的方法，这种方法包括植物细胞中内源AHP6基因的中断，相较于相应的缺少上述中断的对照植物，所述的中断抑制了所述内源AHP6基因产物的表达和/或活性。

第二方面，本发明提供上述方法的用途，所述方法用于提高植物及其繁衍的子代的种子产量，和/或用于制备具有增加的种子产量的非天然的植物。

第三方面，本发明提供一种非天然的植物，所述植物在内源AHP6基因和至少一个内源CKX基因中包含中断。

本发明还涉及一种分离的植物细胞或非天然植物，所述植物细胞或植物可通过或通过本发明所述的方法之一获得。

除非另有规定，本发明的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本发明的说明书及权利要求书中，以下技术术语将根据下列定义使用。

如说明书和附加的权利要求书中所用，单数形式(“a”,“an”和“the”)包括单数和复数形式，除非上下文另有清晰指示。因此，例如，提及的“细胞(a cell)”包括一种细胞和两种或多种细胞的结合，等等。

在本发明的方法中，植物的种子产量得到提高。

术语“植物”一般属于以下任意一种：整株植物、植物的组成部分或器官（例如，叶，茎，根等），茎部营养器官/结构（例如，叶，茎和块茎），根，花和花器/结构（例如苞片，萼片，花瓣，雄蕊，心皮、花药和胚珠），种子（包括胚，胚乳和种皮），果实（成熟的子房），植物组织（例如维管组织，基本组织等），组织培养的愈伤组织和植物细胞（例如保卫细胞，***、毛状体等），及同一植物的子代。术语“植物”一般指所有能够进行光合作用的生物体。本发明范围内的植物，包括植物界的高等植物和低等植物中的所有属和种。成熟植物是指在幼苗之后任何发育阶段的植物。幼苗是指在早期发育阶段的幼小不成熟的植物。本发明的植物可能是一年生的，多年生的，单子叶植物和/或双子叶植物。特别的，本发明的植物可以是下述植物家族的植物：十字花科，尤其是芸苔属和拟南芥属的植物。

本发明所用的植物细胞还包括，但不限于，得自或发现于植物或其组成部分中的细胞，如得自或发现于：种子，培养物，悬浮培养物，胚，分生组织区域，愈伤组织，叶，根，茎，配子体，孢子体，花粉，及小孢子。植物细胞也可以理解为包括从上述组织中获得的经改变的细胞，如原生质体。

如本发明所用，当术语“非天然的”用于植物时，是指具有被人类修饰的基因组的植物。例如，转基因植物是一种非天然的植物。转基因植物可能包括如外源核酸分子，如包括转录区的嵌合基因，所述转录区当转录时产生具有生物活性的RNA分子，该分子可降低内源基因，如本发明所述的AHP6基因的表达，因此，是被人类修饰过的。另外，包括内源基因突变的植物也被认为是非天然植物，例如，暴露在诱变剂中产生的内源AHP6基因突变（如在调节元件或在编码序列中），因为这也是被人类进行了基因修饰。此外，还有特定物种的植物，如甘蓝型油菜（Brassica napus），或者十字花科的其他家族成员，这些物种中发生如内源AHP6基因中的突变，但其在自然情况下不发生该突变，其通过例如定向育种过程实现，如利用同一种植物或另一种类型植物进行的标记-辅助育种并选择或基因渗透，也被认为是非天然植物。相反，仅包括自发的或自然发生的突变的植物，例如未被人类进行遗传修饰的植物，不是本发明定义的“非天然植物”，因此，不包括在本发明之内。本领域技术人员了解到，相较于天然植物，非天然植物典型的具有改变的核苷酸序列。非天然植物也可以是被人类遗传修饰但未改变其核苷酸序列的植物，例如通过改变其甲基化模式。

术语“转基因”是指导入了核苷酸序列和/或变化（如突变，点突变等）的植物，所述核苷酸序列包括但不局限于基因，多核苷酸，脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）等，其中，与未导入的植物不同，所述植物是通过对于植物生产而言非必须的生物学过程导入所述核苷酸序列和/或变化。因此，术语“转基因植物”不仅包括含有非内源核酸的植物，还明确包括内源基因发生突变，如点突变的植物。其中，与非导入植物相比，所述转基因植物是通过对于植物生产而言非必须的生物学过程导入所述突变。

在本发明所述的方法中，通过中断内源AHP6基因提高植物的种子产量。

术语“基因”或“基因序列”广泛地指与生物学功能相关的任何核酸。基因通常包括编码序列，和／或该编码序列表达所需的调控序列。术语“基因”适用于特定的基因组序列，同时还适用于该基因组序列编码的cDNA或mRNA。基因还包括不表达的核酸片段，来自例如其他蛋白质的识别序列。不表达的调控序列包括结合转录因子等调控蛋白的启动子和增强子，以在相邻或附近序列起始转录。

术语“内源的”涉及已经存在于特定野生型细胞或像例如植物一样的有机体中。术语“外源的”涉及不是内源的任何基因或核酸序列。

编码AHP6蛋白质的AHP6基因是在拟南芥中首次描述，也称为拟南芥组氨酸磷酸转移酶蛋白质6。AHP6蛋白质是组氨酸磷酸转移激酶／转移酶蛋白结构家族的成员。但是，AHP6蛋白缺少组氨酸残基，所述组氨酸残基在其它的AHPs里用于磷酸转移，且在组氨酸磷酸转移酶/转移酶的家族里是保守的。代替所述的组氨酸残基，在具有SEQ ID No.1序列的AHP6a的Asn83的位置，AHP6显示具有天冬酰胺酸残基。对于本发明的目的，术语“AHP6蛋白”指一类蛋白，该蛋白，例如，

是组氨酸磷酸转移激酶／转移酶蛋白结构家族的成员；和/或

在对应于SEQ ID No.1序列的Asn83的位置缺少组氨酸；和/或

显示与具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.12的AHP6蛋白具有基本相同的功能；和/或

包括氨基酸序列，该序列与SEQ ID No.1或SEQ ID No.12所示的整个氨基酸序列相比，有至少70%，至少80%，至少90%或至少95%的一致性。

在AHP6蛋白功能的体外生化测试中，AHP6蛋白显示了与具有SEQ IDNo.1或SEQ ID No.12序列的AHP6蛋白的基本相同的功能，这时所述蛋白显示拟南芥AHP6蛋白的至少50%，至少70%或至少90%的活性，前述拟南芥AHP6蛋白具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.12序列。

等，在“Cytokinin signaling and its inhibitor AHP6regulate cell fate during vasculardevelopment”，科学2006,311,94-98内描述了合适的AHP6蛋白功能的体外生化测试。如

等（2006）描述的，AHP6蛋白不显示具有磷酸转移活性，而通过与磷酸转移机制相互影响而作为细胞***素信号的抑制剂起作用。

拟南芥的AHP6蛋白以两种可选的拼接形式存在，称为AHP6a和AHP6b，而所述两种拼接形式在第一外显子的长度上不同。在此使用的，在没有指出其它定义的情况下，术语“AHP6蛋白”指AHP6a和AHP6b两种拼接形式。拟南芥的AHP6蛋白包括对应于AHP6a的SEQ ID No.1的氨基酸序列，或对应于AHP6b的SEQ ID No.12序列，拟南芥的AHP6基因的基因组序列包括SEQ ID No.2的核酸序列，拟南芥的AHP6基因的编码序列包括对应于AHP6a蛋白的SEQ ID No.3的核酸序列和对应于AHP6b的SEQ ID No.13序列，拟南芥的AHP6基因的cDNA包括对应于AHP6a的SEQ ID No.4核酸序列和对应于AHP6b的SEQ ID NO.14序列。

内源AHP6基因可以包括下述基因或由下述基因组成：

（a）一种编码AHP6蛋白的核酸，所述AHP6蛋白包括SEQ ID No.1，SEQ ID No.12或其直系同源序列；

（b）一种编码AHP6蛋白的核酸，所述AHP6蛋白包括的氨基酸序列，与SEQ ID No.1或SEQ ID No.12所示的整个氨基酸序列有至少70%，至少80%，至少90%或至少95%的一致性；

（c）一种包括SEQ ID No.2,3,4,13或14所示的核酸序列的核酸；

（d）一种包括与SEQ ID No.2,3,4,13或14所示的整个核酸序列有至少90%一致性的核酸序列的核酸；

（e）一种在严格条件下与（a），（b），（c）和/或（d）即定的核酸序列之一杂交的核酸。

术语“核酸”或“多核苷酸”一般是使用其在本领域的公知的含意，指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物，或其类似物，例如，包括核苷酸，肽核酸等的修饰的核苷酸聚合物。在某些应用中，核酸是包括多种单体类型的聚合物，例如同时包括RNA和DAN亚单位。核酸可以是，例如，染色体或染色体片段、载体（如表达载体）、表达盒，裸DNA或RNA聚合物、聚合酶链反应（PCR）的产物、寡核苷酸、探针等。核酸可以是，例如，单链和/或双链的。除非另有说明，本发明的特定的核酸序列除了明确定义的任何序列之外，可选的包括或编码互补序列。

术语“多核苷酸序列”，“核酸序列”，“核酸”或“核苷酸序列”是指在单个核酸中的核苷酸连续序列，或一种代表，例如，其一种字符串。也就是说，“多核苷酸序列”是核苷酸的聚合物（寡核苷酸、DNA、核酸等），或代表核苷酸聚合物的字符串，取决于上下文。经由任何具体的多核苷酸序列，可确定特定的核酸或互补（例如互补的核酸）的多核苷酸序列。

术语“子序列”或“片段”是整个序列的任何部分。

本发明所用的术语“直系同源”是指源自，例如，不同于拟南芥的同一物种的基因，所述基因显示出与拟南芥的特定基因具有最高的相似性，即，最高的序列一致性，和/或所述基因编码蛋白显示与拟南芥的特定基因基本相同的功能，因为这两个基因均来自于共同祖先。术语“直系同源”可以指内源基因，该内源基因编码具有基本相同的功能的蛋白质，该蛋白质包含与给定的各自的直系同源序列有至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少99%的一致性的序列（多肽或核酸），例如，在整个序列长度上具有上述的序列一致性。特别地，术语“直系同源”可以指源自与拟南芥不同的物种，且编码蛋白质的内源基因，该蛋白质具有基本相同的功能并包括与各自直系同源所指的拟南芥给定序列有至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少99%的一致性的序列，例如，在整个序列长度上。

本发明所用的术语“直系同源基因”可以指源自与拟南芥不同的物种，且编码蛋白质的内源基因，该蛋白质分别具有与下述蛋白基本相同的功能，并在整个序列长度上包含与下述蛋白有至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少99%的一致性的氨基酸序列：

具有SEQ ID No.1或12序列的拟南芥的AHP6蛋白；

具有SEQ ID No.5序列的拟南芥的CKX1蛋白；

具有SEQ ID No.6序列的拟南芥的CKX2蛋白；

具有SEQ ID No.7序列的拟南芥的CKX3蛋白；

具有SEQ ID No.8序列的拟南芥的CKX4蛋白；

具有SEQ ID No.9序列的拟南芥的CKX5蛋白；

具有SEQ ID No.10序列的拟南芥的CKX6蛋白；和/或

具有SEQ ID No.11序列的拟南芥的CKX7蛋白。

AHP6蛋白的直系同源蛋白显示与拟南芥的包含SEQ ID No.1或12氨基酸序列的AHP6蛋白基本相同的功能。

等人在"Cytokinin signalingand its inhibitor AHP6regulate cell fate during vascular development",科学2006,311,94-98内公开了AHP6蛋白功能的体外生化测试方法。在上述体外生化测试中，AHP6蛋白的一种直系同源蛋白显示了拟南芥的具有SEQ ID No.1或12序列的AHP6蛋白的至少50%，优选至少70%，更优选至少90%的活性。

给定的拟南芥CKX蛋白的直系同源蛋白显示了与拟南芥自己的CKX蛋白基本相同的功能。本领域技术人员知道确定一种给定蛋白是否含有细胞***素氧化/脱氢酶活性并确定特定的蛋白或探针的细胞***素氧化/脱氢酶活性的绝对值、和/或与另一种蛋白或探针相比的相对值的手段和方法。在现有的文献中，对如何测试给定的蛋白的活性有充分的指导，参考，例如，EC1.5.99.12。

在上述体外生化测试方法的测量中，CKX1蛋白的直系同源蛋白可以显示具有SEQ ID No.5序列的拟南芥CKX1蛋白的至少50%，优选至少70%，更优选至少90%的活性。

在上述体外生化测试方法的测量中，CKX2蛋白的直系同源蛋白可以显示具有SEQ ID No.6序列的拟南芥CKX2蛋白的至少50%，优选至少70%，更优选至少90%的活性。

在上述体外生化测试方法的测量中，CKX3蛋白的直系同源蛋白可以显示具有SEQ ID No.7序列的拟南芥CKX3蛋白的至少50%，优选至少70%，更优选至少90%的活性。

在上述体外生化测试方法的测量中，CKX4蛋白的直系同源蛋白可以显示具有SEQ ID No.8序列的拟南芥CKX4蛋白的至少50%，优选至少70%，更优选至少90%的活性。

在上述体外生化测试方法的测量中，CKX5蛋白的直系同源蛋白可以显示具有SEQ ID No.9序列的拟南芥CKX5蛋白的至少50%，优选至少70%，更优选至少90%的活性。

在上述体外生化测试方法的测量中，CKX6蛋白的直系同源蛋白可以显示具有SEQ ID No.10序列的拟南芥CKX6蛋白的至少50%，优选至少70%，更优选至少90%的活性。

在上述体外生化测试方法的测量中，CKX7蛋白的直系同源蛋白可以显示具有SEQ ID No.11序列的拟南芥CKX7蛋白的至少50%，优选至少70%，更优选至少90%的活性。

基于本发明的目的，序列“一致性”是由几种任意方法客观确定的。本领域技术人员熟知这些方法，可以在没有负担的情况下选择合适的方法。可有多种确定两条或两条以上序列之间关系（如一致性、相似性和/或同源性）的方法，并且这些方法在本领域是公知的。这些方法包括，例如人工比对，计算机辅助比对和其组合。许多执行序列比对的算法（一般是由计算机实施的）被广泛应用，或本领域技术人员可以制作序列比对的算法。一个氨基酸序列或核苷酸序列与另一个氨基酸或核苷酸序列的一致性程度，可以通过下述Karlin and Altschul公开的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877,1993)确定。可以使用例如基于这种算法的改进的BLASTN和BLASTX程序(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。为了根据基于BLAST的BLASTN分析核苷酸序列，其参数可以设置为，例如，得分为100（score=100），且字串长度为12。在另一方面，通过基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列的参数包括，例如，得分为50（score=50）和字串长度为3。当使用BLAST和间隙BLAST（Gapped BLAST）程序时，使用每个程序的默认参数。现有技术中公知用于这种分析的特别技术（参见：//www.ncbi.nim.nih.gov）。

本发明所述的严格的杂交条件包括下述条件，例如：6M脲，0.4%SDS，和0.5×SSC；和那些产生相似的严格性的条件。当杂交在更严格的条件，例如6M脲，0.4%SDS，和0.1×SSC下进行，可预期得到具有更高同源性的核酸序列。在此条件下分离的那些核酸序列可预期编码具有与AHP6蛋白（SEQID NO:1）有高的氨基酸同源水平的蛋白。在此，高同源性指与整个氨基酸序列有至少50%或更多，70%或更多，或90%或更多（例如95%或更多）的一致性。

已知已经有三个等位的隐性突变，代表了本发明范围内的内源AHP6基因的中断的例子。

等人，在“Cytokinin signaling and its inhibitor AHP6regulate cell fate during vascular development”，科学2006,311,94-98中描述了突变aph6-1，aph6-2和aph6-3。在aph6-1中，该突变导致了第一外显子中的终止密码子提前，但是，在aph6-2中，该突变位于基因第一内含子中，AHP6b拼接变体5’边缘开始5个碱基对处（5base pairs from the5'-border of the AHP6bsplice variant），而aph6-3是T-DNA***的等位基因。aph6-1和aph6-3都显示代表无效等位基因，但是在aph6-2等位基因中，仅存在拼接变体APH6a。

本发明所用的术语“中断”或“中断的”是指基因可以被结构性中断，以使该基因包括至少一个突变或结构改变，从而使中断的基因无法引导全长且全功能基因产物的有效表达。当内源基因包含一个或两个以上突变时，本发明范围内的内源基因可以被中断，例如：

（a）“错义突变”，该突变是核酸序列中的改变，导致了一个氨基酸被另一个氨基酸取代；

（b）“无义突变”或“终止密码子突变”，该突变是核酸序列中的改变，导致了引入提前的终止密码子，并且因此，翻译终止（导致蛋白质缩短）；植物基因包含翻译终止密码子“TGA”（RNA中的UGA），“TAA”（RNA中的UAA）和“TAG”（RNA中的UAG）；因此，在成熟的正在翻译的mRNA（在读框中）中的导致出现这些密码子之一的任何核苷酸的取代，***，缺失，将终止翻译。

（c）一个或多个氨基酸的“***突变”，由于一个或多个密码子已经***到核酸的编码序列中；

（d）一个或多个氨基酸的“缺失突变”，由于一个或多个密码子已经从核酸的编码序列中被删除；

（e）“移码突变”，导致了突变点之后的核酸序列在不同的阅读框中被翻译。移码突变可以有多种起因，例如一个或多个核苷酸发生***，缺失或复制。

如已经提到的，要求内源基因中的突变更好的产生一种突变体蛋白，该蛋白包括在体内活性显著降低或没有生物活性，或无蛋白产生。基本上，任何导致一种蛋白，相对于野生型蛋白，包括至少一个氨基酸的***，缺失和/或取代的突变，可以导致活性显著降低或不具有生物活性。无论怎样，可以理解，蛋白质的某些部分的突变更易于导致突变的APH6蛋白的功能降低，例如突变导致了缩短的蛋白，从而使功能区域的重要部分缺失。

本发明所用的术语“中断”或“中断的”还包括中断的基因或它的一种产物被功能性抑制或去活性化，从而使基因不表达、或者不能有效表达具有全长和/或全功能的基因产物。可通过结构中断，和/或在转录或翻译水平干扰表达，来获得功能抑制或去活性化。功能抑制或去活性化也可以经由以下方法来实现，例如：反义多核苷酸基因抑制、双链RNA诱导的基因沉默、核酶技术等。表达和/或活性的抑制可为以下处理结果，例如，反义构建体，正义构建体，RNA沉默构建体，RNA干扰，基因组中断（例如，转座子，定向诱导基因组局部突变技术，同源重组等）等。可以通过下述方法测量表达和/或活性的抑制情况：测定转录物的存在和/或含量（例如，通过Northern杂交或逆转录聚合酶链反应（RT-PRC）技术），和/或测定所述基因编码的全长或截短的多肽的存在和/或含量（例如，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫印迹（Western blotting）），和/或测定中断的基因的产物蛋白的活性的存在和/或含量。

本发明所述用的术语“中断”或“中断的”可以理解为，所述中断还包括只在植物的一个组成部分，在特定的细胞类型或组织，例如生殖分生组织或茎尖中的有效地中断。可以通过与编码区，非编码区和/或调控区，例如，特定基因的启动子区域的相互作用或影响上述区域，来实现中断。本发明范围内的中断优选导致中断的基因和/或其产物的全部或部分的功能丢失。

通过向植物细胞的基因组中导入至少一种多核苷酸序列，以在本发明所述方法中或本发明所述非天然植物中产生至少一个中断，所述导入的多核苷酸序列包含与SEQ ID No.2,3,4,13,14序列或其子序列，或其互补序列有至少大约90%，至少大约95%，至少大约99%，大约99.5%或更高的序列一致性的核酸序列，且使所述至少一种多核苷酸序列与启动子正义或反义连接。在另一个实施例中，通过导入至少一种用于RNA沉默或RNA干扰的多核苷酸序列，在植物细胞的基因组中导入中断。

至少一种内源基因中的一个，至少两个或全部中断包括一个或多个转座子的***。“转座因子”（TE）或“转座性遗传因子”是可以在细胞内从一个位置移动到另一个位置的DNA序列。转座因子的移动可以从游离基因到游离基因，从游离基因到染色体，从染色体到染色体，或从染色体到游离基因。转座因子的特征是在其末端有反向重复序列。该转移是通过“转座酶”酶介导的。在结构上，基于存在或不存在除了因子转移所必需的那些基因序列之外的基因序列，而将转座因子分别归类为“转座子”（TN）或“***序列因子”（IS因子）。微型转座子或微型-IS因子通常缺少编码转座酶的序列。

在另一个实施例中，在至少一种内源基因中的一个，至少两个或所有中断可以包含一个或多个点突变。

在至少一种内源基因中的一个，至少两个或所有中断可以是纯合中断。可选择地，在至少一种内源基因中的一个，至少两个或所有中断可以是杂合中断。在一些实施例中，在至少一种内源基因中的中断可以包含纯合中断，杂合中断，或纯合中断与杂合中断的结合。

所述中断可以通过向植物的基因组中导入表达盒来引入。“表达盒”是核酸构建体，例如载体，如质粒，病毒载体等，能够产生转录本，且能够潜在地产生多核苷酸序列所编码的多肽。表达载体能够在外源性细胞，例如细菌细胞或植物细胞中，在体内或体外，例如培养的植物原生质体中产生转录本。根据例如选定的启动子，产物的表达可以是组成性表达或诱导性表达。本定义明确包括没有被翻译或不能被翻译的反义结构、正义结构、或RNA干扰或沉默结构。在表达载体的情况中，如果启动子能够调节相关联的多核苷酸序列的表达，则称启动子被“可操作连接”或“功能性连接”至多核苷酸序列。该术语也适用于可替代的外源性基因构建体，如表达或整合的转基因。同样的，术语“可操作性连接”或“功能性连接”同样适用于替代或补充的与多核苷酸相关联的转录调控序列，如增强子。

术语“载体”是指使核酸在有机体，细胞，或细胞组分之间繁殖和/或转移的工具。载体包括可自主复制或整合到宿主细胞染色体上的质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、及人工染色体等。载体也可以是不能自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一链中由DNA和RNA共同组成的多核苷酸、多聚赖氨酸结合的DNA或RNA、肽结合的DNA或RNA、脂质体结合的DNA等。

如果核苷酸序列可以被转录（以剪接或者非剪接形式）和/或翻译成RNA或多肽、或其子序列，则称多核苷酸序列、核酸序列或基因“编码”正义或反义RNA分子，或RNA沉默或干扰分子，或多肽。本领域技术人员公知地，由于遗传密码的简并性，使得许多不同的核酸序列编码相同的氨基酸序列或多肽，且可无困难地确定给定的核酸序列是否编码给定的氨基酸序列或多肽。

“基因表达”或“核酸表达”是指DNA转录成RNA（可选择地，包括RNA的修饰，如剪接），RNA翻译成多肽（可能包括多肽后续的修饰，例如翻译后修饰），或转录和翻译都发生，根据上下文决定。

本发明所述方法进一步包括向植物基因组中引入内源AHP6基因中断，并再生具有这种改变的基因组的植物的步骤。所述中断可以被稳定地导入到植物的基因组中，以生成非天然植物。如果所述中断在细胞***过程中被复制或分离并且被传递到所述植物或植物细胞的子代，该中断被认为是稳定地导入到植物的基因组中。

本发明所述方法可进一步包括下述步骤：向植物基因组中引入至少一种内源CKX基因的中断，例如，至少两种不同的内源CKX基因的中断。

本发明中所用的术语“CKX基因”或“细胞***素氧化/脱氢酶基因”是指编码具有细胞***素氧化/脱氢酶活性的CKX蛋白的基因。CKX蛋白，也称为细胞***素氧化/脱氢酶，是一种催化下述化学反应的酶：

N6-二甲基烯丙基腺嘌呤+受体+H₂O

腺嘌呤+3-甲基-2-丁烯醛+还原受体

该酶的三个底物是N6-二甲基烯丙基腺嘌呤、受体和H₂O，而它的三个产物是腺嘌呤、3-甲基-2-丁烯醛和还原受体。术语“细胞***素氧化/脱氢酶活性”包括如下的活性：给定多肽利用至少一种细胞***素作为底物，以催化氧化还原反应。本领域技术人员具有公知的手段和方法，以确定给定的多肽是否具有细胞***素氧化/脱氢酶的活性，或确定特定的多肽或探针的细胞***素氧化/脱氢酶活性水平的绝对值、和/或与另一种多肽或探针相比的相对值。在文献中有充分的如何测试给定多肽的这种活性的指导，例如，参见EC1.5.99.12。术语“细胞***素氧化/脱氢酶活性”包括如下的活性：给定多肽利用至少一种细胞***素作为底物，以催化氧化还原反应；该活性不低于AtCKX3(CKX3为SEQ ID No.7)活性的30%，或不低于AtCKX3活性的50%。

所述至少一种CKX基因可以是：

一种编码CKX蛋白的内源CKX1基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.5序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；

一种编码CKX蛋白的内源CKX2基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.6序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；

一种编码CKX蛋白的内源CKX3基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.7序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；

一种编码CKX蛋白的内源CKX4基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.8序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；

一种编码CKX蛋白的内源CKX5基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.9序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；

一种编码CKX蛋白的内源CKX6基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.10序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；或

一种编码CKX蛋白的内源CKX7基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.11序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列。

在本发明所述的方法中，除内源AHP6基因的中断外，可以有至少两个内源CKX基因被中断。特别地，两个被中断的内源CKX基因是一个编码CKX蛋白的内源CKX3基因或其直系同源基因，该CKX蛋白包含与SEQ ID No.7序列相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；和一个编码CKX蛋白的内源CKX5基因或其直系同源基因，该CKX蛋白包含与SEQ ID No.9序列相同或有至少90%一致性的氨基酸序列。

本发明显示，AHP6基因的中断与CKX基因的中断的结合导致了种子产量甚至更显著的提高。

本发明所述方法可以用于获得单株植物的角果数量增加，从而，获得植物和由其繁衍的子代的种子产量增加。

本发明所述方法也可以用于生产非天然植物，该植物的单株植物的角果数量增加，从而，获得了种子产量增加的植物和由其繁衍的子代。

本发明也涉及一种非天然植物，该植物包含在内源AHP6基因和至少一种内源CKX基因中的中断。例如，所述内源AHP6基因包含下述基因或由下述基因组成：

（a）编码AHP6蛋白的核酸或其直系同源序列，所述AHP6蛋白包括SEQID No.1，SEQ ID No.12的氨基酸序列；

（b）编码AHP6蛋白的核酸，所述AHP6蛋白包括与SEQ ID No.1或SEQ ID No.12所示的整个氨基酸序列有至少70%，至少80%，至少90%或至少95%的一致性的氨基酸序列；

（c）包括SEQ ID No.2,3,4,13或14所示的核酸序列的核酸；

（d）包括与SEQ ID No.2,3,4,13或14所示的整个核酸序列有至少90%一致性的核酸序列的核酸；

（e）在严格条件下与（a），（b），（c）和/或（d）限定的核酸序列之一杂交的核酸。

在本发明提供的非天然植物中，所述至少一种中断的内源CKX基因可以是：

一种编码CKX蛋白的内源CKX1基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.5序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；

一种编码CKX蛋白的内源CKX2基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.6序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；

一种编码CKX蛋白的内源CKX3基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.7序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；

一种编码CKX蛋白的内源CKX4基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.8序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；

一种编码CKX蛋白的内源CKX5基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.9序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；

一种编码CKX蛋白的内源CKX6基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.10序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；或

一种编码CKX蛋白的内源CKX7基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.11序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列。

在本发明提供的非天然植物中被中断的内源CKX基因可以是：

一种编码CKX蛋白的内源CKX3基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.7序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列；和

一种编码CKX蛋白的内源CKX5基因或其直系同源基因，所述CKX蛋白包含与SEQ ID No.9序列相同或有至少90%的一致性的氨基酸序列。

本发明提供的非天然植物可以通过如转化等常规手段生产。植物细胞和原生质体的转化可以采用植物分子生物学领域的技术人员公知的各种方式进行，包括但不限于本发明描述的方法。一般参见《酶学方法》，第153卷，重组DNA部分D，Wu和Grossman编著，1987，科学出版社（Methods inEnzymology,Vol.153(Recombinant DNA Part D)Wu and Grossman(eds.)1987,Academic Press）。本发明所用的术语“转化”是指通过导入例如一种“异源的”、“外源的”或“外来的”核酸序列来改变宿主植物或植物细胞的基因型。异源的核酸序列不一定需要源自不同的来源，但是对于要导入的细胞来说，在某种程序上是外来的。

在本发明提供的方法中及在本发明提供的非天然植物中，可以通过许多不同的已知技术来获得内源基因的中断。

通过将，例如，处于反义或正义形式、或RNA沉默或干扰结构等中的转基因多核苷酸序列导入植物细胞或植物的基因组中，并在植物细胞或植物中进行表达，从而促使在至少一个内源基因中发生一个、至少两个或所有中断；其中，转基因多核苷酸序列包括将被中断的内源基因之一的核酸序列或其互补序列。另外，所述多核苷酸序列可以包括启动子，从而，与相应的缺少这种中断的对照植物细胞或植物（如非转基因亲本或同一种的非转基因植物）相比，所述转基因多核苷酸序列至少能够抑制中断的内源基因的表达和/或活性。转基因的多核苷酸序列可以采用多种技术导入，该技术包括但不限于，例如，电穿孔，微弹轰击、土壤杆菌介导的转化、或其它可用的方法。在本发明的某些方面，多核苷酸正向或反向地连接在启动子上，或设置为RNA沉默或干扰。

一个或多个内源基因的中断可以通过同源依赖性基因沉默的应用来生成，该技术在文献中有充分的描述。

可替代的，另一种基因沉默的方法，可以利用反义技术。反义核酸的使用在本领域是公知的。反义核酸具有与目标核酸，如特定基因组序列、mRNA、或cDNA互补的区域。反义核酸可以是RNA、DNA或其它任何合适的分子。反义序列与其互补的正义序列形成双链体，从而导致该基因失活。反义核酸通过与基因转录的RNA形成双链体、与双链DNA形成三链体等来抑制该基因的表达。反义核酸可以通过多种已得到确认的技术来制备和检测。

催化性RNA分子或核酶也可以用来抑制特定基因的表达。可以设计核酶，以使该核酶在实际操作中与任何期望的目标RNA进行配对，并在特异位置剪切磷酸双酯骨架，从而使目标RNA功能性失活。在进行这种剪切时，核酶本身并未改变，因此能够回收并剪切其它分子。如果反义RNA内包含核酶序列，则可给予该反义RNA的RNA-切割活性，从而增加了该反义RNA构建体的活性。已经确定了许多核酶种类。例如，一类核酶衍生自许多小的环状RNA，该环状RNA在植物中能够自剪切和复制。该RNA可以独自复制（类病毒RNA），或使用辅助病毒（卫星RNA）进行复制。该RNA的例子包括：源自鳄梨日斑类病毒（avocado sunblotch viroid）的RNA，以及，源自烟草环斑病毒（tobacco ringspot virus）、紫花苜蓿短暂条纹病毒（lucerne transient streakvirus）、绒毛烟草斑驳病毒（velvet tobacco mottle virus）、茄属植物斑驳病毒（solanum nodiflorum mottle virus）和地三叶草斑驳病毒（subterranean clovermottle virus）的卫星RNA。对目标RNA-特异性核酶的设计和使用已有描述。参见例如，Haseloff等（1988）Nature,334:585-591。

通过抑制表达使特定选择的基因失活的另一种方法是正义抑制。已证实，其中核酸相对于启动子是正向配置的表达盒的导入，是阻断期望目标基因转录的有效手段。参见，例如美国专利号5,034,323，5,231,020和5,283,184。

也可以使用RNA沉默或RNA干扰（RNAi）技术来制造本发明的中断。RNA沉默或RNA干扰也可以称为转录后基因沉默（PTGS）或共抑制。在本发明的上下文中，“RNA沉默”（也称为RNAi或RNA介导的干扰）是指如下机制：通过该机制，存在于细胞中的单链RNA或典型的双链RNA抑制目标基因的表达；该目标基因包含与该RNA相同的或几乎相同的序列。该机制包括，但不限于：RNA干扰；抑制目标基因转录的目标mRNA的翻译，且不会改变该mRNA的稳定性；以及转录沉默（例如，组蛋白乙酰化和异染色质的形成导致目标mRNA转录被抑制）。在“RNA干扰”中，存在于细胞中的单链RNA或双链RNA导致核苷酸链内切，随后使目标mRNA发生降解。

在一个实施例中，将转基因（例如，序列和/或感兴趣的基因或编码序列或子序列）导入植物细胞，通过RNA沉默或RNA干扰（RNAi）来中断一个或多个基因。例如，序列或子序列（转基因）包括：小的子序列，例如长度约21-25个碱基；较大的子序列，例如长度约25-100或100-2000（或约200-1500，约250-1000等）个碱基；和/或，全长编码序列或基因或选自中断的内源基因的基因或其互补序列。这些转基因在序列或子序列中包含一个区域，该区域长度约21-25个碱基，与核酸序列SEQ ID No.2、3、4、13或14之一的子序列有至少80%，至少90%，或至少99%的一致性。

例如通过发夹（茎环）RNA的表达或干扰RNA双链的表达，利用RNAi在许多细胞类型（包括，如植物细胞）和有机体中抑制基因表达，这在文献中有清楚的描述。另外，确定靶向期望基因的适当干扰RNA(s)的方法、及产生该干扰RNA的方法，同样在文献中有详细的描述。例如，以下文献描述了RNA干扰方法，例如，美国专利申请公开号20020173478，20020162126，和20020182223。

可以在例如组成型启动子、诱导型启动子、或组织特异型启动子的控制下表达用来诱导RNAi的多核苷酸序列或子序列。在某些实施例中，在组织特异型启动子的控制下进行表达是有利的。本发明使用的“启动子”，包括DNA上游的转录起始区域，且参与RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合，以起始转录。“植物启动子”是指能够在植物细胞中起始转录的启动子。植物启动子的例子包括，但不限于：从植物、植物病毒、及包含在植物细胞中表达的基因的细菌，如农杆菌（Agrobacterium）或根瘤菌（Rhizobium）中获得的启动子。在发育控制下的启动子的例子包括：在特定组织，如叶、根、或种子，或在如胚乳、胚或分生区域的空间优先起始转录的启动子。这些启动子被称为“组织优选”的或“组织特异型”的。时间调节性的启动子在特定时间启动表达，如授粉后0-25天之间。“细胞类型优选”启动子，主要在一种或多种器官中特定类型的细胞中启动表达，例如，在根或叶的维管细胞中。“可诱导的”启动子是在环境控制下可诱导或可去抑制的启动子。通过可诱导的启动子影响转录的环境条件的例子，包括厌氧条件或光存在的条件。组织特异型、细胞类型特异型、和诱导型启动子构成“非组成型”启动子这一类别。“组成型”启动子是指在大多数环境条件、在所有或几乎所有的组织、发育过程的所有或几乎所有的阶段都有活性的启动子。

可以通过，例如基于转座子的基因失活来引入至少一个上述内源基因中的一个、至少两个或所有的中断。基因序列的一个或多个突变可以包含一个或多个转座子的***，并且，所述中断与缺少这种中断的相应的对照植物细胞或植物相比，至少抑制了中断的内源基因的表达和/或活性。例如，所述一个或多个突变包含在上述一个或多个基因中的纯合中断，或，所述一个或多个突变包含在上述的一个或多个基因中的杂合中断，或纯合中断和杂合中断的结合。

在20世纪40年代后期，Barbara McClintock首次在玉米中发现了转座子。在植物基因诱变中通常使用转座因子的Mutator家族，例如Robertson's Mutator(Mu)转座因子，因为该家族存在高拷贝数（10-100），且优选***基因中和基因附近。

转座因子基于其转座模式，可以分为两大类，且命名为类Ⅰ和类Ⅱ。这两类转座因子都可用作诱变剂和传递载体。类Ⅰ转座因子由RNA作介导并使用反转录酶进行转座，也就是说，类Ⅰ转座因子是逆转录因子。类Ⅰ转座因子至少有三种类型，如，反转录转座子、反转录子、短散在核重复序列类（SINE-like）因子。反转录转座子通常包含长末端重复序列（LTRs）、编码病毒外壳蛋白（gag）和反转录酶的基因、核糖核酸酶（Rnase）H、整合酶基因和聚合酶（pol）基因。在植物物种中存在大量的反转录转座子。在反转录酶和RNase H催化的反应中，这种反转录转座子经由RNA中间体进行活动和移位；其中，反转录酶和RNase H是由转座子编码的。归入Tyl-copia和Ty3-gypsy组的例子也可归入SINE-like和长散在核重复序列类（LINE-like）的分类中。在Kumar和Bennetzen(1999)Plant Retrotransposons in Annual Review ofGenetics33:479中可以找到更详细的论述。

此外，还发现DNA转座因子，如Ac，Taml和En/Spm，广泛存在于种类繁多的植物种类中，且这些DNA转座因子可以用于本发明中。

转座子（和IS因子）是在植物细胞中导入突变的常用工具。例如通过有性杂交，将这些可移动的遗传因子传递到细胞中。例如，为了得到感兴趣的表型，通过有性杂交而选择转座和筛选得到的***突变体。然后可以通过分离的、非天然的或转基因植物与非中断植物进行杂交，如通过有性杂交，将中断的基因导入其它植物中。根据要杂交的物种，可使用任何标准的育种技术。转座子（TN）在分离的、非天然的或转基因植物的基因组内的位置可由已知方法确定，例如，通过侧翼区的测序。例如，可使用依据植物的PCR反应，以扩增序列，这样可以进行诊断性测序，以确认该序列的来源。可选择地，筛选***突变体，以得到具有期望表型的突变体。如与对照植物相比，感兴趣基因的表达或活性被抑制。

TILLING技术也可以用于导入和确认本发明的中断。TILLING技术是定向诱导基因组局部突变技术（Targeting Induced Local Lesions In Genomes）。参见，例如，McCallum等，(2000)，“Targeting Induced Local Lesions In Genomes(TILLING)for Plant Functional Genomics”Plant Physiologv123：439-442；McCallum等，(2000)，“Targeted screening for induced mutations”NatureBiotechnologv18：455-457；和Colbert等，(2001)，“High-Throughput Screeningfor Induced Point Mutations”Plant Physiology126：480-484。

TILLING技术结合了高密度点突变和突变的快速灵敏检测。典型地，使用甲烷磺酸乙酯（EMS）诱变处理植物种子。EMS使鸟嘌呤烷基化，而这通常会导致错配。例如，将种子浸泡在约10-20mM的EMS溶液中，浸泡约10-20小时；然后洗净种子，随后进行播种。这一代的植物称为M1。然后M1植物进行自花受粉。存在于形成生殖组织的细胞中的突变，会遗传给下一代（M2）。典型地，筛选M2植物，以得到在期望的基因中存在突变和/或具有特定表型的植物。例如，将源自M2植物的DNA制成基因库，然后通过检测异源双链的形成来检测感兴趣基因中的突变。典型地，从每株M2植物制备DNA，并将该DNA制成基因库。通过PCR扩增期望的基因。然后将制库的样品变性、退火，以形成异源双链。如果突变存在于其中一株植物中，则PCR产物将有两种类型：野生型和突变型。通过分离PCR反应产物，例如通过变性高效液相色谱法（DHPLC），来确认包括异源双链的基因库。DHPLC检测异等位DNA在解链和退火过程中形成的异源双链中的错配。在加热DNA的同时，进行色谱分析。异源双链具有较低的热稳定性，且形成解链气泡，从而导致异源双链在色谱柱中运动更快。因此当异源双链与预期的同源双链同时存在时，可以看到双峰。从而确认出在感兴趣的基因上发生突变的基因库。然后，可确认组成该选出的基因库群组的、源自植物的单独DNA，并对其进行测序。可选择地，在感兴趣的基因上具有期望突变的植物可以与其它植物杂交，以去除背景突变。

其它诱变方法也可以用于导入本发明的中断。在植物基因中导入突变及选择具有理想性状的植物的方法是公知的。例如，根据标准技术，种子或其它植物材料可以用能致突变的化学物质处理。这些化学物质包括，但不限于下述物质：硫酸二乙酯，吖丙啶和N-亚硝基N-乙基脲。可选择地，可以使用来源于例如X射线或伽玛射线的电离辐射进行诱变。

本发明的含有期望的中断的植物可以和其它植物杂交，以将中断导入到另一种植物中。这可以利用标准的育种技术来实现。

同源重组也可用于导入本发明的中断。已证明植物中存在同源重组。同源重组经由特异性靶向体内感兴趣的基因，来诱导目标基因修饰。使用标准技术，在选定的基因的选定部位（包括5'上游，3'下游，和内含子）在体外制造突变，并将该突变的基因导入期望的植物中。所述突变的基因将与目标野生型基因相互作用，以使转基因植物中出现同源重组，从而使野生型基因发生定向置换。

本发明所述的非天然植物，可以供人类或动物食用，也可以，例如，直接或经已知的加工之后，作为食物或饲料使用。

本发明还涉及使用本发明上述非天然植物，细胞，细胞培养物，组成部分，例如，根，叶和源自非天然的繁殖材料，例如种子，块茎，甜菜根/肿的主根或果实，以制造食品或饲料、药物或精细化学品。

下面，本发明通过实施例作进一步地说明。

附图说明：

图1显示了在ckx突变体中T-DNA和转座子***的位置。通过PCR筛选确定***的突变体，由对边界序列的DNA进行测序确定***位点；黑色方格代理外显子，白色方格代表内含子，三角形表明T-DNA***；G，GABI-KATT-DNA-样本；S,Salk T-DNA-样本（collection）；T,托里梅萨（Torrey Mesa）T-DNA-样本，Z,ZIGIA转座子样本；

图2显示了ahp6-1和ahp6-3与野生型拟南芥（Col-0）的生殖发育过程的对照：（A）一个单株植物的主花茎上的角果数。（B）主花茎上的角果密度。（C）野生型和ahp6突变植物的种子的总产量。植物在温室中，在长日照条件下生长。数据显示平均值±SD（n=20）。利用学生t检测方法（Student's t test）比较与野生型的值。*,P<0.01；**,P<0.0001。

图3显示了ckx3和ckx3ahp6-3双突变体与野生型拟南芥的生殖发育过程的对照：图表表示主花茎上的角果数量。数据显示平均值±SD（n=20）。利用学生t检测方法进行统计学上的比较。*和°，P<0.01；*=相较于野生型（WT），°=相较于ckx3。

图4显示了ckx3ckx5双突变体和ckx3ckx5ahp6三突变体与野生型拟南芥的生殖发育过程的对照：图表A表示ckx3ckx5ahp6-1三突变体和对照植物的主花茎上的角果数量。数据显示平均值±SD（n=20）。利用学生t检测方法进行统计学上的比较。°，P<0.05；**，P<0.0001；*=相较于WT，°=相较于ckx3ckx5；

图表B表示ckx3ckx5ahp6-3三突变体和对照植物的主花茎上的角果数量。数据显示平均值±SD（n=20）。利用学生t检测方法进行统计学上的比较。*和°，P<0.01；**和⁰⁰,P<0.0001;*=相较于WT，°=相较于ckx3ckx5。

具体实施方式

方法

植物材料和生长条件

使用拟南芥Columbia(Col-0)生态型作为野生型。T-DNA***突变体ckx2-S1(SALK_068485)，ckx3-S1(SALK_050938)，ckx4-S1(SALK_055204)，ckx5-S1(SALK_064309)，和ckx6-S1(SALK_070071)来自萨克研究所基因组分析实验室（Salk Institute Genomic Analysis Laboratory(Alonso等，(2003)Science301,653-657)）；转座子***突变体ckx4-Z来自ZIGIA转座子组织（Baumann E,Lewald J,Saedler H,Schulz B,Wisman E(1998)SuccessfulPCR-based reverse genetic screens using an En-7-mutagenised Arabidopsisthaliana population generated via single-seed descent.Theoretical and AppliedGenetics97:729-734）；ckx5-G2（系编号332B10）和ckx7-G1（系编号363C02）来自GABI-KAT组织（Rosso,M.G.,Li,Y.,Strizhov,N.,Reiss,B.,Dekker,K.,和Weisshaar,B.(2003)Plant Mol.Biol.53,247-259）；以及ckx7-T1(SAIL_515_A07)来自托里梅萨研究所（现为先正达公司（Syngenta））。

通过针对与细胞***素受体CRE1/AHK4的wol突变相关联的决定性的根生长的抑制子筛选，确定和分离ahp6-1等位基因（

A.P.,Bonke,M.,Kauppinen,L,Riikonen,M.,Benfey,P.N.,和Helariutta,Y.(2000).A noveltwo-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of theArabidopsis root.Genes Dev.14,2938-2943；和

A.P.,Bishopp,A.,Higuchi,M.,Nieminen,K.M.,Kinoshita,K.,Tormakangas,K.,Ikeda,Y.,Oka,A.,Kakimoto,T.,和Helariutta,Y.(2006).Cytokinin signaling and its inhibitorAHP6regulate cell fate during vascular development.Science311,94-98）。ahp6-3等位基因是一种T-DNA***，表示可能的无效等位基因，并以与ahp6-1相似的方式抑制wol表型（

et al.,2006）。通过遗传杂交获得多突变体。植物在22°C，长日照条件（16小时光照/8小时黑暗）下，在温室的土壤上生长。用于测量种子产量的植物在24°C，～100μΕ和65%湿度，长日照条件下，在生长箱（Percival AR-66L）的土壤上生长。

产量参数的测定

在开花终止后，测定主茎上的角果数量。主茎上的角果数量是种子产量的熟知的识别指标。主茎上角果数量的增加通常预示着每株植物的种子的总量的增加（这可以从图2A和图2C得出）。为了直接分析种子的产量，在开花终止后，要将植株放入纸袋。植株保持干燥，继续放置三个星期以后，测定种子的总重量。

实施例

比较ahp6突变植物和野生型对照植物的生殖发育（reproductivedevelopment）。拟南芥通过不明确的花序***组织持续形成花。两种ahp6突变体形成较大的花序，与野生型中的相比，该花序包括明显较多的花。通过ahp6花序***组织形成的较大数量的花导致角果数量与野生型相比较的增加（图2A）。在最后的花形成后，比较主茎上的角果数量。与野生型植物相比，ahp6-1和ahp6-3突变体的角果分别增产了11%和21%（图2A）。而且，ahp花茎上的角果密度增加了。与野生型植物相比，在ahp6-1和ahp6-3突变体中，花茎单位长度上的角果数量分别增加了22%和20%（图2B）。为了测试增加的花和角果是否会影响突变植物的种子产量，在开花终止后，收集单株植物上的所有种子并称量种子的重量。与野生型相比，ahp6-1和ahp6-3的种子总量分别增加了19.5%和16.7%（图2C）。

为了分析ahp6突变对植物的生殖发育的影响，该植物通过一种或多种CKX基因的突变已经获得了增加的细胞***素水平，我们通过基因杂交将ahp6突变导入ckx3和ckx3ckx5突变背景中，并分析生成的杂交植物。

ckx3突变植物的主茎上的花和形成的角果的数量与野生型对照植物相似（图3）。但是，与野生型和ckx3植物相比，ckx3和ahp6突变的结合导致了花序尺寸的增加，并导致了形成的角果增加了大约14%（图3）。相似地，ahp6突变增强了具有突变的多种CKX基因的植物的生殖活性。例如，与野生型相比，ckx3ckx5双突变植物的主茎上形成了更多的角果（图4A和图4B）。但是，与ckx3ckx5双突变植物相比，ckx3ckx5ahp6三突变植物中的角果的数量进一步显著提高，导致了与野生型相比，ckx3ckx5ahp6三突变植物的主茎上的角果数量的基至更显著的增加（图4A显示了ahp6-1。图4B显示了ahp6-3）。

Claims (15)

1.增加植物种子产量的方法，这种方法包括中断植物细胞中的内源AHP6基因，相较于相应的缺少上述中断的对照植物，所述的中断抑制了所述内源AHP6基因产物的表达和/或活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：向植物基因组中引入内源AHP6基因的中断，和繁殖具有这种改变的基因组的植物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的中断被稳定的引入到植物基因组中。

4.根据前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述的内源AHP6基因编码AHP6蛋白质，所述蛋白质是组氨酸磷酸转移激酶/转移酶蛋白结构家族的成员；所述蛋白在对应于SEQ ID No.1的Asn83的位置缺少组氨酸；所述蛋白显示出与具有SEQ ID No.1或12的AHP6蛋白质基本相同的功能。

5.根据前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述的内源AHP6基因包括或由下述核酸组成：

（a）所述核酸编码AHP6蛋白质，所述蛋白质包括SEQ ID No.1，12或其直系同源序列的氨基酸序列；

（b）所述核酸编码AHP6蛋白质，所述蛋白质包括与SEQ ID No.1或12的整个氨基酸序列有至少70%一致性的氨基酸序列；

（c）所述核酸包括SEQ ID No.2,3,4,13或14的核酸序列；

（d）所述核酸包括与SEQ ID No.2,3,4,13或14的整个核酸序列有至少90%一致性的核酸序列；或

（e）在严格条件下与（a）,（b）,（c）和/或（d）所限定的核酸序列之一杂交的核酸。

6.根据前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括向植物基因组中引入至少一种内源CKX基因的中断的步骤。

7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述至少一种CKX基因是指：

编码CKX蛋白质的内源CKX1基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.5相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；

编码CKX蛋白质的内源CKX2基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.6相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；

编码CKX蛋白质的内源CKX3基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.7相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；

编码CKX蛋白质的内源CKX4基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.8相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；

编码CKX蛋白质的内源CKX5基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.9相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；

编码CKX蛋白质的内源CKX6基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.10相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；或

编码CKX蛋白质的内源CKX7基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.11相同或有至少90%一致性的氨基酸序列。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，编码CKX蛋白质的内源CKX3基因或其直系同源基因被中断，所述蛋白质包括与SEQ ID No.7相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；并且，编码CKX蛋白质的内源CKX5基因或其直系同源基因被中断，所述蛋白质包括与SEQ ID No.9相同或有至少90%一致性的氨基酸序列。

9.根据前述的任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，通过结构性中断，反义多核苷酸基因抑制，双链RNA诱导的基因沉默，核酶技术，基因组中断，TILLING技术和/或同源重组，从而引入一个，至少两个或全部中断。

10.根据前述的任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，一个，至少两个或全部中断是纯合中断。

11.根据权利要求1-10之一所述的方法的用途，所述方法用于增加植物及其衍生的子代的种子的产量。

12.根据权利要求1-10之一所述的方法的用途，所述方法用于制备具有增加的种子产量的非天然植物。

13.非天然植物，这种植物包括在内源AHP6基因和至少一个内源CKX基因中的中断。

14.权利要求13所述的非天然植物，其特征在于，所述内源AHP6基因包括或由下述核酸组成：

（a）所述核酸编码AHP6蛋白质，所述蛋白质包括SEQ ID No.1，12或其直系同源序列的氨基酸序列；

（b）所述核酸编码AHP6蛋白质，所述蛋白质包括与SEQ ID No.1或12的整个氨基酸序列有至少70%一致性的氨基酸序列；

（c）所述核酸包括SEQ ID No.2,3,4,13或14的核酸序列；

（d）所述核酸包括与SEQ ID No.2,3,4,13或14的整个核酸序列有至少90%一致性的核酸序列；或

（e）在严格条件下与（a）,（b）,（c）和/或（d）所限定的核酸序列之一杂交的核酸。

15.权利要求13或14所述的非天然植物，其特征在于，所述的至少一个CKX基因是指：

编码CKX蛋白质的内源CKX1基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.5相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；

编码CKX蛋白质的内源CKX2基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.6相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；

编码CKX蛋白质的内源CKX3基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.7相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；

编码CKX蛋白质的内源CKX4基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.8相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；

编码CKX蛋白质的内源CKX5基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.9相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；

编码CKX蛋白质的内源CKX6基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.10相同或有至少90%一致性的氨基酸序列；或

编码CKX蛋白质的内源CKX7基因或其直系同源基因，所述蛋白质包括与SEQID No.11相同或有至少90%一致性的氨基酸序列。

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