JP2014501489A - 細胞ベースのバイオプロセシング - Google Patents

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Abstract

本発明は、宿主細胞から免疫原性作用物質を産生するための組成物および方法を提供する。種々の実施形態において、免疫原性作用物質は、ポリペプチド、抗原剤、ウイルス粒子またはワクチンである。１つの態様において、本発明は宿主細胞から免疫原性作用物質を産生する方法を提供する。本方法は一般に、細胞を、その一部が標的遺伝子に対して相補的であるＲＮＡエフェクター分子と接触させることと、大規模なバイオリアクターにおける細胞を標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間維持することと（ここで調節は、細胞の免疫原性作用物質の産生を高める）、細胞から免疫原性作用物質を単離することとを含む。

Description

（関連出願）
本出願は、その各々が本明細書中に参照により本明細書中に十分に組み込まれる、Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏらによる、細胞ベースのバイオプロセシングと題された、２０１０年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／３１９，５７８号；Ｍａｒａｇａｎｏｒｅらによる、生物学的産物の産生を増強するための組成物および方法と題された、２００９年７月６日に出願された米国仮特許出願第６１／２２３，３７０号；Ｍａｒａｇａｎｏｒｅらによる、生物学的産物の産生を増強するための組成物および方法と題された、２００９年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／２４４，８６８号；Ｍａｎｏｈａｒａｎらによる、治療剤を送達するための新規な脂質および組成物と題された、２００９年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／２６７，４１９号；Ｍａｎｏｈａｒａｎらによる、核酸送達用の荷電脂質および組成物と題された、２０１０年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／３３４，３９８号；Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏらによる、生物学的産物の産生を増強させるための組成物および方法と題された、２０１０年１月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／２９３，９８０号；Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏらによる、細胞ベースのバイオプロセシングと題された、２０１０年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／３１９，５８９号；およびＲｏｓｓｏｍａｎｄｏらによる、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のトランスクリプトーム、対応するｓｉＲＮＡおよびその使用と題された、２０１０年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／３５４，９３２号の利益を主張する。
（表および配列に関する言及）
本明細書は、配列表を最初に出願された主題の一部として含む。配列番号１〜３，２９０，９３９の配列表は、本明細書において電子フォーマットで、ファイル名「５１０５８０７７．ＴＸＴ」として「ＣＲＦ」、「ＣＯＰＹ １」、「ＣＯＰＹ ２」及び「ＣＯＰＹ ３」とラベルを貼った４枚のコンパクトディスク（ＣＤ−Ｒ）で提供され、本出願においてこれらの全体を参照することによって本明細書で援用される。
本出願は、プリントされた紙コピーの代わりにＣＤ−Ｒで提出された「長い」配列表を含み、該配列表は、その全体を参照することによって本明細書で援用される。２０１０年７月１日付けで記録された前記ＣＤ−Ｒは、「ＣＲＦ」、「Ｃｏｐｙ １」、「Ｃｏｐｙ ２」及び「Ｃｏｐｙ ３」それぞれとしてラベルが貼られ、それぞれは、一つの同じ７７４，６３５ＫＢのファイル（５１０５８０７７．ＴＸＴ）だけを含む。
本発明は、一般に、バイオプロセシングの分野、さらに詳しくは、宿主細胞を、標的遺伝子の発現を変調することができるＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって該細胞において免疫原性作用物質を産生するための方法に関し、ここに、該変調は該免疫原性作用物質の生産を増強させる。また、本発明は、一般に、トランスクリプトーム、組織化されたトランスクリプトーム、および細胞における免疫原性作用物質の生産の標的化変調を設計するためのトランスクリプトームを用いるシステムおよび方法に関する。本発明は、さらに、免疫原性作用物質のより効果的かつ有効な生産のための細胞および細胞株の作成に関する。また、本発明は該方法を行うのに有用な分子、組成物、細胞およびキット、ならびに該方法によって生産された免疫原性作用物質に関する。
細胞培養技術は、生物医薬、バイオ燃料、代謝産物、ビタミン、栄養補助食品、免疫原性作用物質およびワクチンを含む広い範囲の生物学的産物を製造するのに用いられる。産業規模の生産を容易とし、産物の品質およびコンシステンシーについての適用可能な標準を満足させるために、細胞培養バイオプロセスの生産性、収率、有効性および他の態様を増強させるのに多数の戦略が開発されてきた。細胞培養のバイオプロセスを最適化するための伝統的な戦略は、培養基のような物理的および生化学的パラメータ（例えば、ｐＨ、栄養素）、および条件（例えば、温度、持続期間）を調整し、ならびに望ましい表現型を有する宿主細胞を選択することを含む。組換えＤＮＡを宿主細胞に導入することによって、細胞培養バイオプロセスを最適化するために遺伝子的アプローチも開発されており、そこでは、ＤＮＡは免疫原性作用物質の生産に影響し、または該免疫原性作用物質の生産に影響する内因性タンパク質の発現を調節する外因性タンパク質をコードする。そのような方法はコストがかかり、かつ時間も消費する実験室的操作を必要とするが、ある種の遺伝子、タンパク質、宿主細胞、および免疫原性作用物質を含む生物学的産物と適合できない可能性がある。従って、広い範囲の宿主細胞、および免疫原性作用物質のような生物学的産物を含む細胞培養バイオプロセスを最適化するための新しい遺伝子的アプローチに対する要望が当分野に存在する。
より最近では、生物学的産物の生産に影響する遺伝子のサイレンシングのためのｓｈＲＮＡを発現する遺伝子をそれらのゲノム遺伝子に組み込むために、生物学的生産用の宿主細胞が修飾されている。しかしながら、これらの場合においては、宿主細胞の生存性を危うくするｓｈＲＮＡの制御されていない意図しない発現のため、産物の収率は調節するのは困難であることが証明されている。ｓｈＲＮＡを組み込むプロセスは、時間がかかる細胞エンジニアリングも必要とする。さらに、制御されていない発現は、結局は、表現型の変化に導かれ、経時的には、発現されたｓｈＲＮＡ用の遺伝子を運ぶ宿主細胞は、いずれかの重要な収率にて生物学的産物を生産するそれらの能力を失う。
例えば、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）は、種々のバイオプロセスにおいて広く用いられてきたが、これらの細胞において遺伝子発現については比較的あまり知られていない；かくして、これらの細胞におけるバイオプロセスの標的化された賢明な変調は容易に行ったり、設計することができない。従って、ＣＨＯ細胞を含む広い範囲の宿主細胞、およびこれらの細胞において生産された免疫原性作用物質を含む細胞培養バイオプロセスを最適化するための新しい遺伝子的アプローチに対する要望が当分野に存在する。
本発明は、ＲＮＡエフェクター分子を培養中の細胞に低濃度で適用して、宿主細胞によって生産された免疫原性作用物質の質および量が、広範な細胞株のエンジニアリングに対する必要性無くして改良することができるように、遺伝子発現の優れた持続的変調を行うことができるという驚くべき発見に少なくとも部分的には基づく。このように、第一の態様において、本発明は、宿主細胞から免疫原性作用物質を生産するための組成物および方法を提供する。種々の実施形態において、免疫原性作用物質はポリペプチド、ウイルス産物、ウイルス粒子またはワクチンである。
１つの態様において、本発明は、宿主細胞から免疫原性作用物質を生産するための方法を提供する。該方法は、一般には、その一部が標的遺伝子に相補的であるＲＮＡエフェクター分子と該細胞とを接触させ、該細胞を、標的遺伝子の発現を変調するのに十分な時間の間、大規模なバイオリアクター中に維持し、ここに、該変調は該細胞からの免疫原性作用物質の生産を増強させ、次いで、該細胞から該免疫原性作用物質を単離する。
１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を一過的に変調させる。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を一過的に阻害する。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子を活性化することができる。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクターは標的遺伝子を阻害することができる。
さらなる実施形態において、該宿主細胞は動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、または真菌細胞である。１つの実施形態において、動物細胞は哺乳動物細胞である。さらなる実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞、げっ歯類細胞、イヌ細胞、または非ヒト霊長類細胞である。特別な実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞に由来する細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、免疫原性作用物質をコードする導入遺伝子を含有する。
１つの実施形態において、細胞は複数の異なるＲＮＡエフェクター分子と接触させる。該複数のＲＮＡエフェクター分子を用いて、単一の標的遺伝子または多数の標的遺伝子の発現を変調することができる。
別の実施形態において、例えば、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間またはそれ以上の頻度にて、本明細書中に記載された投薬計画に従って細胞に投与するための組成物が処方される。別の実施形態において、組成物の投与は、１以上の細胞成長期、例えば、誘導期、初期対数期、中期対数期、後期対数期、静止期、または死滅期の間、維持することができる。実施形態のいくつかにおいて、宿主細胞とＲＮＡエフェクター細胞（例えば、ｄｓＲＮＡ）との接触は、ウイルス感染またはベクター接種に先立って、その間に、またはその後に行って、免疫原性作用物質の収穫の収率および品質を危うくする細胞および／または抗ウイルスプロセスを阻害する。
別の実施形態において、別々の標的遺伝子に対して向けられた２以上のＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物を用いて、培養された細胞における第一の標的遺伝子および少なくとも第二の標的遺伝子の発現を変調することによって、細胞培養における免疫原性作用物質の生産を増強させる。別の実施形態において、同標的遺伝子に対して向けられた２以上のＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物を用いて、培養された細胞における標的遺伝子の発現を変調することによって、細胞培養における免疫原性作用物質の生産を増強させる。
別の実施形態において、第一のＲＮＡエフェクター分子を培養された細胞に投与し、次いで、第二のＲＮＡエフェクター分子を該細胞に投与する（またはその逆）。さらなる実施形態において、第一および第二のＲＮＡエフェクター分子は、実質的に同時に培養された細胞に投与される。
１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、免疫原性作用物質の生産を可能とする条件下で細胞を維持するのに用いられる細胞培養基に加えられる。ＲＮＡエフェクター分子は異なる時点において、または同時に加えることができる。１つの実施形態において、１以上の異なるＲＮＡエフェクター分子は、細胞培養基への連続的注入によって加えられて、例えば、連続的平均パーセント阻害またはＲＮＡエフェクター分子の濃度を維持する。別の実施形態において、１以上の異なるＲＮＡエフェクター分子は、細胞培養基への連続的注入によって加えられて、例えば、最小平均パーセント阻害またはＲＮＡエフェクター分子濃度を維持する。１つの実施形態において、連続的注入は、少なくとも１つの標的遺伝子について所望の平均パーセント阻害を達成する速度で投与される。１つの実施形態において、連続的注入は（反復することができる）区別される時間の間、例えば、１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、１８時間、２４時間、４８時間、７２時間またはそれ以上の間行われる。複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を適用する場合、該異なるＲＮＡエフェクター分子の各々は、同一の頻度または異なる頻度にて加えることができる。異なるＲＮＡエフェクター分子の各々は、同一の濃度にて、または異なる濃度にて加えられる。いくつかの実施形態において、細胞とＲＮＡエフェクター分子との最後の接触は、免疫原性作用物質の単離、または上清の収穫から少なくとも２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間またはそれ以上前である。
一般に、ＲＮＡエフェクター分子は、２００ｎＭ以下の所与の濃度（例えば、１００ｎＭ、８０ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭまたはそれ以下）で加えられる。本明細書中に記載されるように、低濃度のＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子を効果的に変調するために大規模なバイオプロセシングで用いることができる。低濃度のＲＮＡエフェクター分子を用いるかなり経済的かつ商業的利点（例えば、より低いコストおよびより容易な除去）がある。かくして、１つの実施形態において、細胞は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下の濃度にてＲＮＡエフェクター分子と接触させる。特別な実施形態において、１以上のＲＮＡエフェクター分子は、成長期および／または生産期の間に、１ｎＭの最終濃度にて、少なくとも１回（例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、またはそれ以上）細胞培養基に投与される。
さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、異なるＲＮＡエフェクター分子の各々の所与の出発濃度にて（例えば、各々、１ｎＭにて）加えられ、さらに、ＲＮＡエフェクター分子の連続的注入が補充される。
１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター組成物は、ＲＮＡエフェクター分子の摂取を容易とする試薬、例えば、エマルジョン、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、荷電脂質、リポソーム、アニオン性脂質、浸透促進剤、トランスフェクション試薬、または付着用のＲＮＡエフェクター分子に対する修飾、例えば、リガンド、標的化部位、ペプチド、親油性基等を含む。
細胞と接触させるべきＲＮＡエフェクター分子は、細胞への摂取および送達を容易とする処方に配合することができる。１以上の異なるＲＮＡエフェクター分子は、細胞を、ＲＮＡエフェクター分子、およびＲＮＡエフェクター分子の摂取を容易とする試薬、例えば、エマルジョン、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、荷電脂質、リポソーム、アニオン性脂質、浸透促進剤、トランスフェクション剤、または付着用のＲＮＡエフェクター分子に対する修飾、例えば、リガンド、標的化部位、ペプチド、親油性基等と接触させることによって加えることができる。
特定の実施形態において、脂質製剤が、ＲＮＡエフェクター分子組成物に、ＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する試薬として加えられる。特定の実施形態において、脂質製剤は、本明細書に記載のようなＬＮＰ製剤、ＬＮＰ０１製剤、ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ製剤又はＳＮＡＬＰ製剤であることができる。関連する実施形態において、ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ製剤は、次の通りであり：２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＸＴＣ）を、ＸＴＣ／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃＤＭＡが５７．１／７．１／３４．４／１．４の比率で及び約７の脂質：ｓｉＲＮＡ比率で使用する。さらに別の関連する実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ｄｓＲＮＡであり、次の通り：２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＸＴＣ）を、ＸＴＣ／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃＤＭＡが５７．１／７．１／３４．４／１．４の比率で及び約７の脂質：ｓｉＲＮＡ比率で使用してＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ製剤に製剤化される。あるいは、ＲＮＡエフェクター分子、例えば本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子は、次の通り：ＸＴＣ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ２０００−Ｃ１４を５０／１０／３８．５／１．５モル％の比率で及び約１１：１の脂質：ｓｉＲＮＡの比率で使用してＬＮＰ０９製剤に製剤化することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、次の通り：ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ２０００−Ｃ１４を５０／１０／３８．５／１．５モル％の比率で及び約１１：１の脂質：ｓｉＲＮＡの比率で使用してＬＮＰ１１製剤に製剤化される。さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ＬＮＰ０９製剤又はＬＮＰ１１製剤に製剤化され、ＰＢＳ対照群に比べて、標的遺伝子ｍＲＮＡ量を０．３ｍｇ／ｋｇの用量で約８５〜９０％減少させる。さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ＬＮＰ０９製剤又はＬＮＰ１１製剤に製剤化され、ＰＢＳ対照群に比べて、標的遺伝子ｍＲＮＡ量を０．１ｍｇ／ｋｇの用量で約５０％減少させる。さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ＬＮＰ０９製剤又はＬＮＰ１１製剤に製剤化され、標的遺伝子タンパク質量を、ウェスタンブロットによって測定されるようにＰＢＳ対照群に比べて用量に依存した方法で低下させる。さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、次の通り：ＤｌｉｎＤＭＡをＤＬｉｎＤＭＡ／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ２０００−ｃＤＭＡが５７．１／７．１／３４．４／１．４の比率で及び約７の脂質：ｓｉＲＮＡ比率で使用してＳＮＡＬＰ製剤に製剤化される。
いくつかの実施形態において、脂質製剤は、次式：
Figure 2014501489
 ｛式中：
Ｒ１及びＲ２は、それぞれの存在についてそれぞれ独立して、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルキル、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルコキシ、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルケニルオキシ、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルキニルオキシ、又は場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アシルであり；
Figure 2014501489
 は、Ｌ２とＬ１の間の結合を表し、この結合は：
（１）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子の間の単結合であり〔この場合、
Ｌ１は、Ｃ（Ｒｘ）、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｑ）であり；
Ｌ２は、−ＣＲ５Ｒ６−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、又は−Ｃ（Ｏ）−である〕；
（２）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子の間の二重結合であり〔この場合、
Ｌ１は、Ｃであり；
Ｌ２は、−ＣＲ５＝、−Ｎ（Ｑ）＝、−Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝である〕；
（３）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合、及びＬ２の第二の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合であり〔この場合、
Ｌ１は、Ｃであり；
Ｌ２は、次式：
Figure 2014501489
 を有し、式中のＸは、Ｌ２の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ２の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ１の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｚ１及びＺ４は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
Ｚ２は、ＣＨ又はＮであり；
Ｚ３は、ＣＨ又はＮであり；
あるいは、Ｚ２とＺ３は、一緒になって、単一のＣ原子であり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
それぞれのＺは、Ｎ、Ｃ（Ｒ５）、又はＣ（Ｒ３）であり；
ｋは、０、１、又は２であり；
それぞれのｍは、独立して０〜５であり；
それぞれのｎは、独立して０〜５であり；
この場合に、ｍとｎは、一緒になって３、４、５、６、７又は８員環を生じる〕；
（４）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合、及びＬ２の第一の原子とＬ１の第二の原子の間の単結合であり〔この場合に、
（Ａ）Ｌ１は、次式：
Figure 2014501489
 を有し、式中のＸは、Ｌ１の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ１の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ２の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｔ１は、ＣＨ又はＮであり；
Ｔ２は、ＣＨ又はＮであり；
あるいは、Ｔ１とＴ２は、一緒になって、Ｃ＝Ｃであり；
Ｌ２は、ＣＲ５であるか；又は
（Ｂ）Ｌ１は、次式：
Figure 2014501489
 を有し、式中のＸは、Ｌ１の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ１の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ２の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｔ１は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
Ｔ２は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
Ｌ２は、ＣＲ５又はＮである〕；
Ｒ３は、次式：
Figure 2014501489
 を有し、式中、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４のそれぞれは、独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、又はアルキニルであるか；あるいは、
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の任意の２つは、これらを結合しているＮ原子と一緒になって３〜８員複素環を形成するか；あるいは、
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、全てがこれらを結合しているＮ原子と一緒になって二環式５〜１２員複素環を形成し；
それぞれのＲｎは、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；
Ｌ３は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｌ４は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｌ５は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｒ５及びＲ６のそれぞれの存在は、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；あるいは、隣り合った２個の炭素原子上の２個のＲ５基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で二重結合を形成するか；又は隣り合った２個の炭素原子上の２個のＲ５基と、同じ隣り合った炭素原子上の２個のＲ６基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で三重結合を形成し；
それぞれのａは、独立して、０、１、２、又は３であり；
この場合に、
Ｌ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基は、場合によりＬ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基と一緒になって、３〜８員シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリール基を形成し；及び
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の任意の一つは、場合により、Ｌ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６基、及びこれらを結合している原子と一緒になって、３〜８員ヘテロシクリル基を形成し；
それぞれのＱは、独立して、Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり；並びに
それぞれのＱ２は、独立してＯ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）（Ｑ）、アルキル又はアルコキシである｝
を有する脂質を含んでなる。
特別な実施形態において、該処方は本明細書中に記載されたもの（例えば、脂質Ｈ、脂質Ｋ、脂質Ｌ、脂質Ｍ、脂質Ｐ、および脂質Ｒ）のような第四級アミンを含有する脂質を含む。かくして、いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子組成物は、その式が以下に示される、「脂質Ｈ」、「脂質Ｋ」、「脂質Ｌ」、「脂質Ｍ」、「脂質Ｐ」、または「脂質Ｒ」を含む、ＲＮＡエフェクター分子の摂取を容易とする試薬を含む。
Figure 2014501489
 ＲＮＡエフェクター分子組成物が送達促進剤と共に処方される実施形態において、該組成物は溶液（例えば、単位投与形態にパッケージされた、例えば、滅菌溶液）とすることができ、または（例えば、１Ｌの細胞培養基で用いられる単位にて予め投与される）滅菌凍結乾燥組成物とすることができる。
別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子組成物は、さらに、成長培地（例えば、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）ＰＯＷＥＲＣＨＯ（登録商標）培地（Ｌｏｎｚａ）、ＨＹＣＬＯＮＥ ＰＦ ＣＨＯ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＣＤ ＤＧ４４培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、培地Ｍ１９９（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＯＰＴＩＰＲＯ（商標）ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）等）を含む。ＲＮＡエフェクターは、培地中で復元する場合、所望の濃度を供するような濃度で存在することができる。
なお、別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子組成物は、さらに、必須アミノ酸（例えば、グルタミン）、２−メルカプト−エタノール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脂質濃縮物、コレステロール、カタラーゼ、インスリン、ヒトトランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、ビオチン、ＤＬα−トコフェロール酢酸、ＤＬα−トコフェロール、ビタミン類（例えば、ビタミンＡ）、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキサール塩酸、リボフラビン、チアミン塩酸塩、１−イノシトール、コルチコステロン、Ｄ−ガラクトース、エタノールアミンＨＣｌ、（還元された）グルタチオン、Ｌ−カルニチンＨＣｌ、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン２ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、Ｔ３（トロイド−Ｉ−チロニン）、成長因子（例えば、ＥＧＦ）、鉄、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ナトリウムヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン、アラキンドン酸、エチルアルコール１００％、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ステアリン酸１０、ＴＷＥＥＮ ８０（登録商標）非イオン性界面活性剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ピルビン酸ナトリウム、ならびにグルコースよりなる群から選択される剤を含む。
種々の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡ、ｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、またはリボザイムを含むことができる。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はｓｈＲＮＡではない。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はｄｓＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡの群から選択され、ここに、ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９のヌクレオチド等）を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１６の連続ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１７の連続ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１８の連続ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は、さらに、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は、さらに、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は、さらに、２つのデオキシチミジン残基を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、ここに、該アンチセンス鎖は少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチドまたは１９ヌクレオチド）を含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１６の連続ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１７の連続ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１８の連続ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は、さらに、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は、さらに、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は、さらに、２つのデオキシチミジン残基を含む。
いくつかの実施形態において、維持する工程は、さらに、細胞密度、培地ｐＨ、酸素レベル、グルコースレベル、乳酸レベル、温度、およびタンパク質生産よりなる群から選択される少なくとも１つの測定可能なパラメータをモニターすることを含む。
いくつかの実施形態において、細胞密度、培地ｐＨ、酸素レベル、グルコースレベル、乳酸レベル、温度、およびタンパク質生産のいずれか１つを含む、少なくとも１つの測定可能なパラメータは免疫原性作用物質の生産の間にモニターすることができる。
さらなる実施形態において、該方法は、さらに、第二の剤を宿主細胞に投与することを含む。第二の剤は成長因子；アポトーシス阻害剤；キナーゼ阻害剤；ホスファターゼ阻害剤；プロテアーゼ阻害剤；病原体の阻害剤（例えば、ウイルスが免疫原性作用物質である場合、他のウイルスまたは真菌または細菌病原体の成長および／または増殖を阻害する剤）；もしくはヒストン脱メチル化剤であり得る。増殖されつつあるウイルスがインフルエンザである場合、第二の剤は、プロナーゼ、テルモリシン、サブチリシンＡ、または組換えプロテアーゼのような、インフルエンザヘマグルチニンを切断するプロテアーゼであり得る。
別の実施形態において、本明細書中に記載されたＲＮＡエフェクター分子、例えば、宿主細胞標的遺伝子に対して向けられたｄｓＲＮＡを含有する組成物が、細胞による免疫原性作用物質の生産を増強させるのに有用な非ＲＮＡ剤と共に培養された細胞に投与される。非ＲＮＡ剤は、抗生物質、抗真菌薬、抗代謝産物（例えば、メトトレキセート）、抗体；成長因子（例えば、インスリン）；アポトーシス阻害剤；ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、および／またはＫ２５２ａのようなキナーゼ阻害剤；バナジン酸ナトリウムおよびオカダ酸のようなホスファターゼ阻害剤；プロテアーゼ阻害剤；および５−アザシチジンのようなヒストン脱メチル化剤よりなる群から選択することができる。
いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質はポリペプチドであって、標的遺伝子は、宿主細胞において翻訳後修飾に影響するタンパク質をコードする。種々の実施形態において、翻訳後修飾はタンパク質グリコシル化、タンパク質脱アミド化、タンパク質ジスルフィド結合形成、メチオニン酸化、タンパク質ピログルタメーション、タンパク質折畳み、またはタンパク質分泌であり得る。
さらなる実施形態において、標的遺伝子は、宿主細胞の生理学的プロセスに影響するタンパク質をコードする。種々の実施形態において、生理学的プロセスはアポトーシス、細胞周期進行、細胞免疫応答、炭素代謝または輸送、ラクテート形成、ＲＮＡｉ摂取および／または有効性、もしくはアクチン動態である。
さらなる実施形態において、標的遺伝子はプロ−オキシダント酵素または細胞ｐＨに影響するタンパク質をコードする。
別の態様において、本発明は、本明細書中に提供される少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子を含有する培養された真核生物細胞を提供する。該細胞はげっ歯類細胞、イヌ細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞のような哺乳動物細胞である。
別の態様において、本発明は、宿主細胞において標的遺伝子の発現を変調することによって、細胞培養における免疫原性作用物質の生産を増強させるための組成物を提供する。該組成物は、典型的には、本明細書中に記載された１以上のＲＮＡエフェクター分子、および適当なキャリアまたは送達ビヒクル、例えば、許容されるキャリアおよび／またはＲＮＡエフェクター分子の摂取を容易とする試薬を含む。ＲＮＡエフェクター分子組成物は、水性、非水性または混合培地中の懸濁液として処方することができ、脂質または非脂質処方にて処方することができる。ＲＮＡエフェクター分子組成物は、（例えば、濃度および／または容量によって区別される単位にて提供される）滅菌溶液にて提供できるか、または凍結乾燥することができる。
別の実施形態において、本明細書中に記載されるＲＮＡエフェクター分子、例えば、宿主細胞標的遺伝子に対して向けられたｄｓＲＮＡを含有する組成物は、細胞による免疫原性作用物質の生産を増強させるのに有用な非ＲＮＡ剤と共に培養された細胞に投与される。
１つの実施形態において、培養された細胞における標的遺伝子の発現を変調するためのベクターが提供され、ここに、標的遺伝子は、細胞による免疫原性作用物質の生産に影響するタンパク質をコードする。１つの実施形態において、ベクターは、ＲＮＡエフェクター分子の少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された少なくとも１つの調節配列を含む。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はベクターによってコードされていない。
別の実施形態において、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含有する細胞を提供する。該ベクターは、ＲＮＡエフェクター分子の少なくとも１つの鎖をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結された調節配列を含む。
本発明のさらに別の態様は、本明細書中に記載されたＲＮＡエフェクター分子を含むキットを含む。１つの実施形態において、該キットは、免疫原性作用物質の生産に影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を変調するＲＮＡエフェクター分子を含む。別の実施形態において、該キットは、さらに、免疫原性作用物質の生産に影響するタンパク質の発現を変調するＲＮＡエフェクター分子を発現する修飾された細胞株を含む。該キットは、本明細書中で提供された方法を行うための指示書も含むことができる。
１つの実施形態において、該キットは、さらに、宿主細胞を成長させるための適当な培養基および／またはＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列を宿主細胞に導入するための構築体（例えば、プラスミド、ウイルス等）を含む。さらに別の実施形態において、キットは、さらに、免疫原性作用物質を検出し、および／または精製するための試薬を含む。適当な試薬の非限定的例はＰＣＲプライマー、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、アフィニティークロマトグラフィー媒体等を含む。
１つの実施形態において、キットは、標的遺伝子の発現を変調して、潜在的、偶発的または内因性ウイルスの発現を阻害し、かくして、所望の免疫原性作用物質の生産に影響するＲＮＡエフェクター分子を含む。別の実施形態において、キットは、所望の免疫原性作用物質の生産に影響する潜在的、偶発的または内因性ウイルスの発現を変調するＲＮＡエフェクター分子を発現する宿主細胞を含む。そのようなキットは、本明細書中で提供された方法を行うための指示書を含むこともできる。該キットは、荷電脂質、エマルジョン、リポソーム、カチオン性または非カチオン性脂質、アニオン性脂質、トランスフェクション試薬または浸透促進剤を含む、ＲＮＡエフェクター分子摂取を容易とする少なくとも１つの試薬を含むこともできる。特別な実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子摂取を容易とする試薬は荷電脂質を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、微生物接種またはベクター形質導入の間または後に宿主細胞におけるＲＮＡ干渉を開始させて、収穫された免疫原性作用物質の収率および／または品質を危うくしかねない内因性、潜在的または偶発的ウイルスの発現を阻害することに関する。例えば、ある実施形態は、内因性、潜在的または偶発的ウイルス経路（例えば、鳥類細胞における内因性トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ−Ｅ）のｅｖ遺伝子座；ＣＨＯ細胞における内因性Ｃ型レトロウイルス様粒子ゲノム；Ｖｅｒｏ細胞におけるブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ−１）のｒｅｐ遺伝子）を標的とし、それにより、所望の免疫原性作用物質の品質および／または収率を増大させる、ｓｉＲＮＡ、または例えば、裸の、コンジュゲートされたまたは処方された形態（例えば、脂質ナノ粒子）のｓｈＲＮＡを投与する。
本発明のいくつかの実施形態において、単純な裸の（すなわち、コンジュゲートされていない）ＲＮＡエフェクター分子、またはコンジュゲートされた（例えば、コレステロールまたは他の標的化リガンドに直接的にコンジュゲートされた）ＲＮＡエフェクター分子を用いることができる。別の実施形態において、プラスミドまたはウイルスベクターでコードされたｓｈＲＮＡ用のＲＮＡエフェクター分子を用いることができる。
本発明のいくつかの実施形態において、ＬＮＰまたは交互ポリマー処方が用いられる。いくつかの実施形態において、該処方は、ＲＮＡエフェクター分子摂取を容易とする剤、例えば、荷電脂質、エマルジョン、リポソーム、カチオン性または非カチオン性脂質、アニオン性脂質、トランスフェクション試薬または浸透促進剤を含む。特別な実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子摂取を容易とする試薬は荷電脂質を含む。加えて、該処方は、感染性シードまたはベクターそれ自体に共処方し、または一体化させて、そこで剤／ベクターが所望の免疫原性作用物質を生産することができる関連細胞への送達を容易とし、またはＲＮＡｉ材料を容易とすることができる。
特別な実施形態において、標的遺伝子は内因性、偶発的または潜在的ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、ヘパドナウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、ボルナウイルス、レトロウイルス、アレナウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、ハンタウイルス、サーコウイルス、またはベッシウイルスに関連する。
本発明の方法によって標的化することができる特別な内因性および潜在的ウイルスはマウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）、マウス白血病／肉腫（ＭＬＶ）、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ−１、ＰＣＶ−２）を含むサーコウイルス、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）、アレナウイルスリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス（ＬＤＨまたはＬＤＶ）、ヒト種Ｃアデノウイルス、トリアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、霊長類内因性レトロウイルスファミリーＫ（ＥＲＶ−Ｋ）、およびヒト内因性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ−Ｋ）を含む。
さらに、ＥＲＶについて、本発明の実施形態において、ＥＲＶの標的遺伝子は霊長類／ヒトクラスＩガンマＥＲＶ ｐｔ０１−Ｃｈｒ １０ｒ−１７１１９４５８、ｐｔ０１−Ｃｈｒ５−５３８７１５０１、ＢａＥＶ、ＧａＬＶ、ＨＥＲＶ−Ｔ、ＥＲＶ−３、ＨＥＲＶ−Ｅ、ＨＥＲＶ−ＡＤＰ、ＨＥＲＶ−Ｉ、ＭＥＲ４様、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶＨ−ＲＴＶＬＨ２、ＨＥＲＶＨ−ＲＧＨ２、ＨＥＲＶ−Ｈコンセンサス、ＨＥＲＶ−Ｆｃ１；霊長類／ヒトイプシロンＥＲＶ ｈｇ１５−ｃｈｒ３−１５２４６５２８３；霊長類／ヒト中間（イプシロン様）ＨＥＲＶＬ６６；霊長類／ヒトクラスＩＩＩ Ｓｐｕｍａ様ＥＲＶｓ ＨＳＲＶ、ＨＦＶ、ＨＥＲＶ−Ｓ、ＨＥＲＶ−Ｌ、ＨＥＲＶＬ４０、ＨＥＲＶＬ７４；霊長類／ヒトデルタＥＲＶｓ ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２；霊長類／ヒトレンチＥＲＶｓ ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２；霊長類／ヒトクラスＩＩ、ベータＥＲＶ ＭＰＭＶ、ＭＭＴＶ、ＨＭＬ１、ＨＭＬ２、ＨＭＬ３、ＨＭＬ４、ＨＭＬ７、ＨＭＬ８、ＨＭＬ５、ＨＭＬ１０、ＨＭＬ６、またはＨＭＬ９のものであり得る。
本発明の他の実施形態において、ＥＲＶはげっ歯類クラスＩＩ、ベータＥＲＶ ＭＭＴＶ；げっ歯類クラスＩガンマＥＲＶ ＭＬＶ；ネコクラスＩガンマＥＲＶ ＦＬＶ；有蹄動物クラスＩガンマＥＲＶ ＰＥＲＶ；有蹄動物デルタＥＲＶ ＢＬＶ；有蹄動物レンチウイルスＶｉｓｎａ、ＥＩＡＶ；有蹄動物クラスＩＩ、ベータＥＲＶ ＪＳＲＶ；鳥類クラスＩＩＩ、Ｓｐｕｍａ様ＥＲＶｓ ｇｇ０１−ｃｈｒ７−７１６３４６２；ｇｇ０１−ｃｈｒＵ−５２１９０７２５、ｇｇ０１−Ｃｈｒ４−４８１３０８９４；鳥類アルファＥＲＶｓ ＡＬＶ、ｇｇ０１−ｃｈｒ１−１５１６８８４５；鳥類中間ベータ様ＥＲＶｓ ｇｇ０１−ｃｈｒ４−７７３３８２０１；ｇｇ０１−ＣｈｒＵ−１６３５０４８６９、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−５７３３７８２；爬虫類中間ベータ様ＥＲＶ インドニシキヘビ；魚類イプシロンＥＲＶ ＷＤＳＶ；魚類中間（イプシロン様）ＥＲＶ ＳｎＲＶ；両生類イプシロンＥＲＶ Ｘｅｎ１；昆虫エランチウイルスＥＲＶ Ｇｙｐｓｙから選択される。
本発明の他の実施形態は、ベシウイルス、サーコウイルス、ハンターンウイルス、マルブルグウイルス、ＳＶ４０、ＳＶ２０、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、シミアンウイルス５（ｓｖ５）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ブタパルボウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、マウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ）、タイラーの脳脊髄炎ウイルス（ＴＨＥＭＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＭＶまたはＭＶＭ）、マウスアデノウイルス（ＭＡＶ）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）、キルハム・ラット・ウイルス（ＫＲＶ）、トーランのＨ−１ウイルス、センダイウイルス（ＳｅＶ、マウス・パラインフルエンザ・ウイルス１型または日本血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）としても公知）、パーカーのラットコロナウイルス（ＲＣＶまたはＳＤＡ）、偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、レオウイルス、カシェ渓谷ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、ウシ・パラインフルエンザ・ウイルス３型、ウシ呼吸器系合胞体ウイルス、ウシアデノウイルス、ウシパルボウイルス、ウシヘルペスウイルス１（感染性ウシ鼻気管炎ウイルス）、他のウシヘルペスウイルス、ウシレオウイルス、狂犬病ウイルス、ブルータングウイルス、ウシ・ポリオーマ・ウイルス、ウシサーコウイルス、およびワクシニア以外のオルトポックスウイルス、偽牛痘ウイルス（ヒトに感染し得る広く分布したパラポックスウイルス）、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、またはレポリポックスウイルスのような動物起源の偶発的ウイルスを標的とする。
他の実施形態は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２；ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）およびＨＴＬＶ−ＩＩ；ヒトＡ、ＢおよびＣ型肝炎ウイルス；ヒトサイトメガロウイルス；エプスタインバールウイルス（ＥＢＶまたはＨＨＶ−４）；ヒトヘルペスウイルス６、７および８；ヒトパルボウイルスＢ１９；レオウイルス；ポリオーマ（ＪＣ／ＢＫ）ウイルス；ＳＶ４０ウイルス；ヒトコロナウイルス；ヒトパピローマウイルス；Ａ、ＢおよびＣ型インフルエンザウイルス；ヒトエンテロウイルス；ヒトパラインフルエンザウイルス；およびヒト呼吸器系合胞体ウイルスを含むヒト起源の偶発的剤を標的とする。
本発明のさらに他の実施形態は、内因性、潜在的または偶発的ウイルスが結合した、またはウイルス複製に必要な宿主細胞表面受容体または細胞内タンパク質を標的とする。例えば、特別な実施形態において、標的遺伝子は、細胞シアル酸の生産に関連する遺伝子のようなＣＨＯ細胞ＭＶＭ受容体遺伝子である。
本明細書中に記載されたようなシアル酸に関連する標的遺伝子に加えて、免疫原性作用物質の収率および／または品質は、宿主細胞においてグリコシル化に関連する遺伝子を標的化することによって最適化することができる。
ハムスターＧａｌｅ遺伝子はＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ、例えば、ＣＨＯ Ｇａｌｅ転写体配列番号：５５６４をコードし、そのうち１つが、配列番号：１８８８６５６〜１８８９００７よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、または１９ヌクレオチド）を含む、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡエフェクター分子を標的化することができる。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号：１８８８６５６〜１８８９００７よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６の連続ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、１つの鎖は、配列番号：１８８８６５６〜１８８９００７よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１７の連続ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、１つの鎖は、配列番号：１８８８６５６〜１８８９００７よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１８の連続ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、１つの鎖は、配列番号：１８８８６５６〜１８８９００７よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む。特別な実施形態において、アンチセンス鎖は配列番号：１８８８６５６〜１８８９００７の配列を含み、さらに、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む。別の特別な実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号：１８８８６５６〜１８８９００７の配列を含み、さらに、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドを含む。別の特別な実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号：１８８８６５６〜１８８９００７の配列を含み、さらに、少なくとも２つのデオキシチミジン残基を含む。この酵素は、ガラクトースをグルコースに変換することによって、細胞がそれを処理するのを可能とし、その逆も成立する。
ＵＤＰ−ガラクトースを用いて、ガラクトース含有タンパク質および脂肪を形成し、これは、化学的シグナリング、細胞構造の形成、分子の輸送、およびエネルギーの生産において非常に重要な役割を果たす。ハムスターＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤＳ）は、その１つが、配列番号：３１５２７５４〜３１５２７９３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、または１９ヌクレオチド）を含む、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡエフェクター分子に標的化され得る。１つの実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号：３１５２７５４〜３１５２７９３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６の連続ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、１つの鎖は、配列番号：３１５２７５４〜３１５２７９３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１７の連続ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、１つの鎖は、配列番号：３１５２７５４〜３１５２７９３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１８の連続ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、１つの鎖は、配列番号：３１５２７５４〜３１５２７９３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む。特別な実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号：３１５２７５４〜３１５２７９３の配列を含み、さらに、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む。別の特別な実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号：３１５２７５４〜３１５２７９３の配列を含み、さらに、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドを含む。別の特別な実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号：３１５２７５４〜３１５２７９３の配列を含み、さらに、少なくとも２つのデオキシチミジン残基を含む。
種々の実施形態において、免疫原性作用物質はポリペプチドである。該ポリペプチドは組換えポリペプチド、または宿主細胞に対して内因性であるポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは抗原、糖タンパク質、受容体、膜タンパク質、免疫エフェクター、結合性タンパク質、癌タンパク質またはプロト−癌タンパク質、または構造タンパク質である。いくつかの実施形態において、ポリペプチド免疫原性作用物質はワクチンであり、または免疫原性作用物質はワクチンにおいて用いることができる。
本発明の方法は、宿主細胞培養の成長、生産および活性化レベルをモニターし、ならびに宿主細胞培養の条件を変化させて、宿主細胞の成長、生産および活性化レベル、および所望の産物を最大化させ、および細胞または培養から免疫原性作用物質を収穫し、収穫された免疫原性作用物質を含む処方を調製し、および当該方法によって得られた処方をそれを必要とする対象に投与することによって病気を治療し、および／または予防する工程を含むこともできる。
１つの実施形態において、宿主細胞には、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子が投与されて、多数の標的遺伝子の発現を変調する。ＲＮＡエフェクター分子は異なる時点において、または同時に、同一頻度または異なる頻度にて、同一濃度にて、または異なる濃度にて投与することができる。
別の実施形態において、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を変調することによって、宿主細胞における免疫原性作用物質の生産を増強させるための組成物を提供する。該組成物は、典型的には、本明細書中に記載されたＲＮＡエフェクター分子のような１以上のオリゴヌクレオチド、および適当なキャリアまたは送達ビヒクルを含む。
さらなる実施形態において、標的遺伝子は、宿主細胞の生理学的プロセスに影響するタンパク質をコードする。種々の実施形態において、生理学的プロセスはアポトーシス、細胞性免疫、細胞周期の進行、炭素の代謝または輸送、ラクテート形成、またはＲＮＡｉ摂取および／または効率である。
より具体的には、いくつかの実施形態において、第二の標的遺伝子は宿主細胞の免疫応答に関連する遺伝子であって、標的遺伝子はＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ２１、ＲＩＧ−１、ＬＰＧＰ２、ＲＩＧ１様受容体、ＴＲＩＭ２５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＡＶＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＲ２、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＩＲＦ１０、２’，５’オリゴアデニル酸シンテターゼ、ＲＮａｓｅＬ、ｄｓＲＮＡ−ｄＰＫＲ、Ｍｘ、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、前炎症性サイトカイン、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ＰＫＲ、および前述のいずれかの調節領域よりなる群から選択される宿主細胞標的をコードする。
他の具体的実施形態において、第二の標的遺伝子は宿主細胞の生存性、成長または細胞周期に関連する遺伝子であって、標的細胞は、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０、ＴＲＡＩＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ１４、ＦＡＳＬＧ、ＤＰＦ２、ＡＩＦＭ２、ＡＩＦＭ３、ＳＴＫ１７Ａ、ＡＰＩＴＤ１、ＳＩＶＡ１、ＦＡＳ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦＢＲ１、ＬＯＣ３７８９０２、またはＢＣＬ２Ａ１、ＰＵＳＬ１、ＴＰＳＴ１、ＷＤＲ３３、Ｎｏｄ２、ＭＣＴ４、ＡＣＲＣ、ＡＭＥＬＹ、ＡＴＣＡＹ、ＡＮＰ３２Ｂ、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、ＤＯＣＫ４、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８、ＫＩＡＡ０７５３、ＬＰＧＡＴ１、ＭＳＭＢ、ＮＦＳ１、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＰＴＢＮ４、ＴＭＥＭ１４６、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＯＸＯ１、ＰＴＥＮ、ＦＮ１、ＣＳＫＮ２Ｂ、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、宿主シアリダーゼ、ＮＥＵ２シアリダーゼ２、ＮＥＵ３シアリダーゼ３、ダイサー、ＩＳＲＥ、Ｂ４ＧａｌＴ１、Ｂ４ＧａｌＴ６、Ｃｍａｓ、Ｇｎｅ、ＳＬＣ３５Ａ１、および前述のいずれかの調節領域よりなる群から選択される宿主細胞標的をコードする。
１つの態様において、本明細書中に記載された方法は、（ａ）培養における哺乳動物細胞を、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＬＤＨの発現の阻害を可能とする複数の異なるＲＮＡエフェクター分子と接触させ；次いで、（ｂ）該細胞を、Ｂａｘ、Ｂａｋ、およびＬＤＨの発現を阻害するのに十分な時間の間維持することを含み、ここに、該発現の阻害は哺乳動物細胞の生存性を改善する、培養における哺乳動物細胞の生存性を改善する方法に関する。この態様の１つの実施形態において、ＢＡＸを標的とするＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖を含み、ここに、少なくとも１つの鎖は、配列番号：３１５２４１２〜３１５２５３９、配列番号：３１５２７９４〜３１５２８０３、配列番号：３０２３２３４〜３０２３５１５、配列番号：３１５４３９３〜３１５４４１３、配列番号：３１５４４１４〜３１５４４３４、配列番号：３１５４９２３〜３１５４９７０、および配列番号：３１５４９７１〜３１５５０１８よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド等）を含む。この態様の別の実施形態において、ＢＡＫを標的とするＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖を含み、ここに、少なくとも１つの鎖は、配列番号：３１５２４１２〜３１５２４７５、配列番号：３１５２８０４〜３１５２８１３、配列番号：２２５９８５５〜２２６０１６１、配列番号：３１５４３９３〜３１５４４１３、配列番号：３１５４４１４〜３１５４４３４、配列番号：３１５４８２７〜３１５４８７４、配列番号：３１５４８７５〜３１５４９２２、および表２２にリストされた配列よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９のヌクレオチド等）を含む。この態様の別の実施形態において、ＬＤＨを標的とするＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖を含み、ここに、少なくとも１つの鎖は、配列番号：３１５２５４０〜３１５２６０３、配列番号：３１５２８１４〜３１５２８２３、配列番号：１２９７２８３〜１２９７６０４、配列番号：３１５４５５３〜３１５４５７８、配列番号：３１５４５７９〜３１５４６０４、配列番号：３１５５５８９〜３１５５６３５、および配列番号：３１５５６３６〜３１５５６８２よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９のヌクレオチド等）を含む。
１つの態様において、本明細書中に記載された方法は、（ａ）大規模な宿主細胞培養における宿主細胞を、その一部が宿主細胞の少なくとも１つの標的遺伝子に対して相補的である少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させ、（ｂ）該宿主細胞培養を、少なくとも１つの第一の標的遺伝子の発現を変調するのに十分な時間の間維持し、ここに、該発現の変調は該宿主細胞における免疫原性作用物質の生産を改善し；（ｃ）該宿主細胞から免疫原性作用物質を単離することを含み、ここに、該大規模な宿主細胞培養はサイズが少なくとも１リットルであり、および該宿主細胞は、該ＲＮＡエフェクター分子を、標的遺伝子発現が一過的に阻害されるように該大規模な宿主細胞培養の培養基に添加することによって少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触される、大規模な宿主細胞培養において免疫原性作用物質を生産する方法を提供する。
また、別の態様において、本明細書中で提供されるのは、（ａ）大規模な宿主細胞培養における宿主細胞を、その一部が宿主細胞の少なくとも１つの標的遺伝子に対して相補的である少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させ、（ｂ）該宿主培養を、少なくとも１つの第一の標的遺伝子の発現を変調するのに十分な時間の間維持し、ここに、該発現の変調は該宿主細胞における免疫原性作用物質の生産を改善し；次いで、（ｃ）該免疫原性作用物質を該宿主細胞から単離することを含み、ここに、該宿主細胞は、標的遺伝子発現が一過的に阻害されるように、免疫原性作用物質の生産を通じて複数回、ＲＮＡエフェクター分子を大規模な宿主細胞培養の培養基に添加することによって少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる、大規模な宿主細胞培養において免疫原性作用物質を生産する方法である。
本明細書中に記載された態様の１つの実施形態において、宿主細胞は、標的遺伝子の発現が一過的に阻害されるように、ＲＮＡエフェクター分子を大規模な宿主細胞培養の培養基に添加することによって複数のＲＮＡエフェクター分子と接触される。
本明細書中に記載された態様の１つの実施形態において、大規模な宿主細胞培養における宿主細胞は複数のＲＮＡエフェクター分子と接触され、ここに、該複数のＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも１つの標的遺伝子、少なくとも２つの標的遺伝子、または複数の標的遺伝子の発現を変調する。
本明細書中に記載された態様の別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子、または複数のＲＮＡエフェクター分子は二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、ここに、該ｄｓＲＮＡは相互に対して相補的である少なくとも２つの配列を含み、およびここに、センス鎖は第一の配列を含み、およびアンチセンス鎖は、標的遺伝子の少なくとも一部に対して実質的に相補的である相補性の領域を含む第二の配列を含み、およびここに、該相補性の領域は長さが１０〜３０ヌクレオチドである。
本明細書中に記載された態様の別の実施形態において、該接触する工程は、ＲＮＡエフェクター分子、または複数のＲＮＡエフェクター分子の、宿主細胞培養を維持して、免疫原性作用物質を生産するのに用いられる培養基への連続的注入によって行われる。
本明細書中に記載された態様の別の実施形態において、発現の変調は発現の阻害であり、ここに、該阻害は部分的阻害である。
本明細書中に記載された態様の別の実施形態において、該部分的阻害は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、および８５％よりなる群から選択されるパーセント阻害以下である。
本明細書中に記載された態様の別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は１００ｎＭ未満の濃度にて接触される。
本明細書中に記載された態様の別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は５０ｎＭ未満の濃度にて接触される。
いくつかの実施形態において、その一部が標的遺伝子に対して相補的である少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子は、ヌクレオチド配列の少なくとも１６の連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む対応するｓｉＲＮＡであり、ここに、該ヌクレオチド配列（配列番号）は本明細書に引用される。
また、免疫原性作用物質の生産を増強させるのに有用な組成物が本明細書中で提供される。１つの態様において、その一部が宿主細胞の少なくとも１つの標的遺伝子に対して相補的である少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子、および宿主細胞を培養するのに適した培養基を含み、ここに、ＲＮＡエフェクター分子は標的遺伝子の発現を変調することができ、該発現の変調は免疫原性作用物質の生産を増強させ、ここに、少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子は、本明細書中で言及されるヌクレオチド配列（配列番号）の少なくとも１６の連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである組成物が提供される。
本明細書中に記載される別の態様は、（ａ）免疫原性作用物質が生産される条件下で、細胞培養するのに適した１以上のアッセイ表面を含む基板；（ｂ）１以上のＲＮＡエフェクター分子、ここに、各ＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部は標的遺伝子に対して相補的であり；および（ｃ）免疫原性作用物質、または細胞によるその生産を検出するための試薬、ここに、該１以上のＲＮＡエフェクター分子は、本明細書中で言及されるヌクレオチド配列（配列番号）の少なくとも１６の連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである；を含む、培養された細胞による免疫原性作用物質の生産を増強させるためのキットを提供する。
また、（ａ）複数のアッセイ表面を含むマイクロアレイ基板、該アッセイ表面は、免疫原性作用物質が生産される条件下で細胞を培養するのに適しており；（ｂ）１以上のＲＮＡエフェクター分子、ここに、各ＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部は標的遺伝子に対して相補的であり；および（ｃ）該１以上のＲＮＡエフェクター分子の、免疫原性作用物質の生産に対する効果を検出するための試薬、ここに、該１以上のＲＮＡエフェクター分子は、本明細書中で言及されるヌクレオチド配列（配列番号）の少なくとも１６の連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである；を含む、培養された細胞による免疫原性作用物質の生産を最適化するためのキットが本明細書中で提供される。
１つの実施形態において、本発明は、本明細書中で提供される少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子を含有する宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、昆虫、両生類、魚類、爬虫類、鳥、哺乳動物またはヒトに由来することができるか、またはハイブリドーマ細胞であり得る。例えば、該細胞はヒト・ナマルワバーキット（Ｎａｍａｌｗａ Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ腫細胞（ＢＬｃｌ−ｋａｒ−Ｎａｍａｌｗａ）、ベビーハムスター腎臓線維芽細胞（ＢＨＫ）、ＣＨＯ細胞、マウスミエローマ細胞（例えば、ＮＳ０、ＳＰ２／０）、ハイブリドーマ細胞、ヒト胚腎臓細胞（２９３ＨＥＫ）、ヒト網膜由来細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）、昆虫細胞株（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣組織に由来するＳｆ９；またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ卵細胞ホモジネートに由来するＨｉ−５）、マディン・ダービー（Ｍｅｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、初代マウス脳細胞または組織、初代子ウシリンパ細胞または組織、初代サル腎臓細胞、胚化ニワトリ卵、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、アカゲザル胎児肺細胞（ＦＲｈＬ−２）、ヒト胎児肺細胞（ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（例えば、Ｖｅｒｏ、ＣＶ−１）、アカゲザル腎臓細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２）、または酵母細胞に由来することができる。特別な実施形態において、該細胞はＭＤＣＫ細胞である。
実施形態はまた、宿主細胞から、特にＣＨＯ細胞から免疫原性作用物質を産生させるための組成物及び方法を提供し、前記方法は、前記細胞を、ＲＮＡエフェクター分子、例えばＣＨＯトランスクリプトーム転写産物（その一部分は、標的転写産物と相補的である）を標的とする一つ又はそれ以上のｓｉＲＮＡ分子と接触させ、前記細胞をバイオリアクター中で、標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、前記調節は、細胞から免疫原性作用物質の産生を高める）、及び免疫原性作用物質を前記細胞から単離することを含む。
本発明の利点は、宿主細胞によって産生される免疫原性作用物質の収量及び／又は純度を実質的に上昇させることができ、従って生産コストを低下させることができること又は開発時間を著しく短縮できることである。改良された製造ロジスティクスは、品質を高める、及び免疫原性作用物質供給を拡大するという後から続く効果を有する。
本発明の一つ又はそれ以上の実施形態の詳細を、以下の記載において明らかにする。本発明のその他の特徴、目的及び利点は、本明細書の記載及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかであろう。
２日目のＣＨＯ−Ｓ細胞中のＢａｘタンパク質を標識する免疫ブロットである。Ｂａｘの発現は、ＣＨＯ−Ｓ細胞培養物において時間と共に生存率の低下と相関する。Ｂａｘの発現は、ＣＨＯ−Ｓ細胞培養物において時間と共に生存率の低下と相関する。 細胞生存率、全細胞数、及び生存細胞の割合を細胞培養の日数の関数として表すＣＨＯ−Ｓ細胞の増殖曲線を表すグラフである。生存率は、おおよそ６日目に急激に低下する。 ハムスターＢａｋ及びＢａｘ遺伝子（表３及び４それぞれ）に対するＲＮＡエフェクター分子によるＣＨＯ細胞でのＢａｘの発現の濃度に依存した抑制を表すグラフである。試験したＲＮＡエフェクター分子のそれぞれは、低いナノモル範囲のＩＣ５０で発現を抑制したＢａｘに対するＲＮＡエフェクター分子Ｂ２を除いて、サブナノモル範囲のＩＣ５０で発現を抑制した。 ハムスターＢａｋ及びＢａｘ遺伝子（表３及び４それぞれ）に対するＲＮＡエフェクター分子によるＣＨＯ細胞でのＢａｋの発現の濃度に依存した抑制を表すグラフである。試験したＲＮＡエフェクター分子のそれぞれは、低いナノモル範囲のＩＣ５０で発現を抑制したＢａｘに対するＲＮＡエフェクター分子Ｂ２を除いて、サブナノモル範囲のＩＣ５０で発現を抑制した。 ハムスター乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子に対するＲＮＡエフェクター分子によるＣＨＯ細胞におけるＬＤＨ（ＬＤＨ活性として測定される）の発現の濃度に依存した抑制を表すグラフである。試験したＲＮＡエフェクター分子のそれぞれは、サブナノモル範囲のＩＣ５０で発現を抑制した。 ハムスター乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に対するＲＮＡエフェクター分子は、対照細胞と比較してＣ２、Ｃ１６及びＣ３６ＣＨＯ細胞株においてＬＤＨ−Ａ ｍＲＮＡの量を低下させる。ＬＤＨの抑制は、ＣＨＯ細胞株の生産性を著しく高める（図４Ｄ）。 ハムスター乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に対するＲＮＡエフェクター分子は、対照細胞と比較してＣ２、Ｃ１６及びＣ３６ＣＨＯ細胞株においてＬＤＨ−Ａタンパク質の量を低下させる。 ハムスター乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に対するＲＮＡエフェクター分子は、対照細胞と比較してＣ２、Ｃ１６及びＣ３６ＣＨＯ細胞株においてＬＤＨ−Ａ活性の量を低下させる。 ＬＤＨの抑制は、ＣＨＯ細胞株の生産性を著しく高める。 培養ＣＨＯ細胞の生存率に関してＢａｘ／Ｂａｋ及びＬＤＨに対するＲＮＡエフェクター分子の効果を示す棒グラフ。ｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）を、培養細胞に０時間、４８時間及び９６時間の時間点（曲線上の矢印）で加え、細胞生存率を、５日目（グラフ）で及び時間と共に（曲線）積分細胞面積（ＩＣＡ）として測定した。対照細胞は、Ｓｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡ（スクランブル対照）で処理した。Ｂａｘ／Ｂａｋ及びＬＤＨに対するｓｉＲＮＡで処理した細胞は、測定した時間点の全てにおいて対照細胞と比較して高められた生存率を示した。 培養ＣＨＯ細胞の生存率に関してＢａｘ／Ｂａｋ及びＬＤＨに対するＲＮＡエフェクター分子の効果を示す線グラフ。ｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）を、培養細胞に０時間、４８時間及び９６時間の時間点（曲線上の矢印）で加え、細胞生存率を、５日目（グラフ）で及び時間と共に（曲線）積分細胞面積（ＩＣＡ）として測定した。対照細胞は、Ｓｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡ（スクランブル対照）で処理した。Ｂａｘ／Ｂａｋ及びＬＤＨに対するｓｉＲＮＡで処理した細胞は、測定した時間点の全てにおいて対照細胞と比較して高められた生存率を示した。 Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡの添加が、生存ＣＨＯ細胞密度を少なくとも９０％上昇させることを表すグラフである。対照細胞（■）及び処理細胞（▲）の密度を、細胞生存率が５０％に達するまで毎日測定した。積分細胞面積（ＩＧＡ）を、測定した（差し込み図；対照に対するＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理）。Ｘ軸の矢印は、ｓｉＲＮＡ投与日数又は栄養分供給日数を示す。 Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡの添加が、ＣＨＯの生存率を少なくとも５０％上昇させることを表すグラフである。対照細胞（■）及びＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞（▲）の生存率を、トリパンブルーを使用して測定した。アポトーシス細胞死の割合を、５日目から１２日目までそれぞれの試料の傾きを測定することによって調べた（差し込み図；対照に対するＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理）。Ｘ軸の矢印は、ｓｉＲＮＡ投与日数を示す。 ＬＤＨ酵素活性が、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞において低下することを表すグラフである。毎日のＬＤＨ活性を、対照処理細胞（■）及びＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞（▲）において監視した。Ｘ軸に沿った矢印は、ｓｉＲＮＡの投与日数を示す。 乳酸量が、対照処理細胞培地と比べてＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞培養培地では低いことを示すグラフである。培養培地の乳酸量は、対照ｓｉＲＮＡ処理細胞培養（■）及びＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞培養（▲）において毎日監視した。Ｘ軸の矢印は、ｓｉＲＮＡの投与日数を示す。 対照ｓｉＲＮＡ処理細胞におけるグルコース消費が増殖曲線の７日後に減少することを示すグラフである。Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞培地（▲）からのグルコース濃度は、対照ｓｉＲＮＡ処理細胞培地（■）よりも著しく低い。Ｘ軸に沿った矢印は、栄養分の供給日数を示す。 Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理ＣＨＯ細胞が、対照と比較して対数期増殖後のカスパーゼ３活性を低下させたことを示すグラフである。Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞は、６日より前では対照ｓｉＲＮＡ処理細胞と同様のカスパーセ３活性を実証するが、その後の時間点では、対照細胞ではそれよりも高いカスパーゼ活性を示す。Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞でのカスパーゼ３活性と対照処理細胞でのカスパーゼ３活性との間の比（▲）は、二相性活性反応を示す。 Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨ ｓｉＲＮＡ添加後のｍＲＮＡ量の抑制率を示すグラフである。 Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡが、ＣＨＯ細胞アポトーシス死亡率を〜３００％減少させることを示すグラフである。 対照ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）と比較したＢａｘ／Ｂａｋ ｓｉＲＮＡ（それぞれ１ｎＭ）で処理した細胞の生存率及び細胞密度を示すグラフである。 対照処理細胞と比較したＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨを標的とするｓｉＲＮＡで処理した細胞の細胞密度比及び生存率比を示すグラフである。 Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡが、大規模１ＬバイオリアクターでのＣＨＯ細胞の密度及び生存率の両方を向上させることを示す。 本発明の一つの実施形態のコンピュータシステムの線図を示す。 本発明の別の実施形態のコンピュータシステムの線図を示す。 本発明の一つの実施形態のデータ構造のダイアグラムを示す。 本発明の一つの実施形態の方法のフローダイアグラムを示す。 ３７℃及び２８℃の温度で、脂質ＲＮＡｉＭａｘで処理し、ｓｉＲＮＡで処理していない対照ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、すなわち脂質処理対照での日数での経過時間（Ｘ軸）にわたるＧＦＰの発現量（蛍光分析単位、ｙ軸）を示すグラフである。 ３７℃及び２８℃の温度で、脂質ＲＮＡｉＭａｘ又はｓｉＲＮＡで処理していない対照ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、すなわち未処理対照での日数での経過時間（Ｘ軸）にわたるＧＦＰの発現量（蛍光分析単位、ｙ軸）を示すグラフである。 日数での経過時間（Ｘ軸）にわたる３７℃及び２８℃の温度で、ＧＦＰに対して一時的形質移入ｓｉＲＮＡによるＤＧ４４ ＣＨＯ細胞でのＧＦＰ発現の抑制％（ｙ軸）を示すグラフである。図２２Ａは、０．１ｎＭ ｓｉＲＮＡである。 日数での経過時間（Ｘ軸）にわたる３７℃及び２８℃の温度で、ＧＦＰに対して一時的形質移入ｓｉＲＮＡによるＤＧ４４ ＣＨＯ細胞でのＧＦＰ発現の抑制％（ｙ軸）を示すグラフである。図２２Ｂは、１．０ｎＭ ｓｉＲＮＡである。 日数での経過時間（Ｘ軸）にわたる３７℃及び２８℃の温度で、ＧＦＰに対して一時的形質移入ｓｉＲＮＡによるＤＧ４４ ＣＨＯ細胞でのＧＦＰ発現の抑制％（ｙ軸）を示すグラフである。図２２Ｃは、１０ｎＭ ｓｉＲＮＡである。 リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘと比較した９個の取り込み増強製剤を使用する相対％ＧＦＰシグナルノックダウン（ｙ軸）を示す棒グラフである。ｘ軸に示した９個の製剤については、表１９を参照。 Ｋ８（製剤４）を種々の濃度で使用するＬＤＨ活性（ｙ軸）が、２５０ｍＬ振盪フラスコ中のＤＧ４４細胞内のＬＤＨに対するｓｉＲＮＡの取り込みエンハンサーとして有効であったことを示す棒グラフである。 Ｋ８（製剤４）、Ｌ８及びＰ８製剤を種々の濃度で使用するＬＤＨ活性（ｙ軸）が、懸濁物中のＤＧ４４内のＬＤＨに対するｓｉＲＮＡの取り込みエンハンサーとして有効であったことを示す棒グラフである。 Ｐ８製剤又は市販製剤ＲＮＡｉＭａｘを推奨濃度で使用して懸濁ＣＨＯ細胞５０ｍＬ振盪フラスコ中での時間にわたる細胞密度を示すグラフである。脂質製剤は、０日目に細胞に投与した。 Ｐ８製剤又は市販製剤ＲＮＡｉＭａｘを推奨濃度で使用して懸濁ＣＨＯ細胞５０ｍＬ振盪フラスコ中での時間にわたる％細胞生存率を示すグラフである。脂質製剤は、０日目に細胞に投与した。 Ｐ８ＮＤＬを使用する場合には、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に指向するｓｉＲＮＡが、１Ｌバイオリアクターで、単回１ｎＭ用量で６日間ＬＤＨの８０％〜９０％ノックダウンを達成することを示すグラフである。 ３Ｌ及び４０Ｌ培養において６日間の経過時間にわたる生存細胞密度及び％ＬＤＨ活性に対するＰ８脂質を用いて製剤された１ｎＭ ＬＤＨ ｓｉＲＮＡの単回投与の結果を示すグラフである。 Ｐ８をトランスフェクション試薬として使用する４０ＬのＤＧ４４細胞培養のトランスフェクション後の日数での経過時間にわたる生存細胞密度及び％生存率（ｙ軸）を示すグラフである。 ４０ＬのＤＧ４４細胞培養及び０日目でのｓｉＲＮＡの単回投与において経過時間にわたる％ＬＤＨ活性の低下を示すグラフである。 フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）及びＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラーゼ（ＧＭＤＳ）遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡと接触させた細胞の対照細胞から調製された抗体の棒グラフである。図３１Ａは、これらの細胞によって産生された抗体の濃度を示すグラフである。 フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）及びＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラーゼ（ＧＭＤＳ）遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡと接触させた細胞の対照細胞から調製された抗体の棒グラフである。図３１Ｂは、ＦＵＴ８及びＧＭＤＳ ｄｓＲＮＡ処理細胞から産生された抗体が、フコース特異的レクチンに対して＞８５％減少した結合を有することを示すグラフである。
詳細な説明
本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル及び組成物などに限定されず、それ自体変化し得る。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的とするものであり、特許請求の範囲によって単に定義されるだけである本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形は、特にその内容が明確に示されない限りは、複数言及を含み及びその逆も同様である。操作実施例又は別の方法で示した場合以外は、本明細書で使用する成分の量又は反応条件を表す全ての数値は、全ての場合において用語「約」で修飾されると解釈されるべきである。
本明細書において特定される全ての特許、遺伝子識別番号によって識別されるオリゴヌクレオチド配列及びの他の刊行物は、例えば本発明に関連して使用し得るような刊行物に記載される方法を記載及び開示することを目的として参照することによって明確に援用される。これらの刊行物は、これらの本出願の出願日前の開示についてのみ提供される。これに関して、先行発明によって又は任意のその他の理由で、本発明者らが、このような開示に先行する資格がないと認められると解釈されるべきではない。日付に関する全ての陳述又はこれらの文書の内容に関する説明は、本出願人らが入手できる情報に基づくものであり、これらの文書の日付又は内容の正確さに関して承認を構成するものではない。
特に定義されない限りは、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。ヒト遺伝子記号は、典型的には大文字で示されるが、本願明細書では、大文字又は小文字の遺伝子記号の使用は、同じ意味で使用し得、ヒト種又は非ヒト種の両方を含む。従って、例えば、「ＬＤＨＡ」（「Ｌｄｈａ」又は「ＬｄｈＡ」）のような遺伝子又は遺伝子標的「乳酸デヒドロゲナーゼＡ」に関する本明細書の言及は、ヒト及び／又は非ヒト（例えば、トリ、齧歯類、イヌ）遺伝子及び遺伝子標的を含む。すなわち、特定の遺伝子記号において大文字又は小文字は、遺伝子又は遺伝子標的の範囲をヒト種又は非ヒト種に限定しない。本明細書において提供される全ての遺伝子識別番号（遺伝子ＩＤ）は、特に特定されない限りは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）「Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ」ウェブサイトの遺伝子識別番号である。
本発明は、宿主細胞において免疫原性作用物質を産生させる方法であって、宿主細胞を、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、標的遺伝子の少なくとも一部分と相補的である）と接触させ、前記細胞を、標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合に、前記調節は、免疫原性作用物質の産生を高める）、及び前記免疫原性作用物質を前記細胞から回収する工程を含む方法を提供する。本明細書に提供される記載は、本明細書において提供される方法に従って宿主細胞において免疫原性作用物質を産生させるためにどのようにＲＮＡエフェクター分子を調製し、使用するかを開示する。また、開示された方法を実施するための細胞培養試薬及びＲＮＡエフェクター分子を含む組成物並びにキットが開示される。
Ｉ．定義
本明細書で使用する用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、本発明に不可欠であるが、不可欠であろうとなかろうと、特定されていない要素を含むことができる組成物、方法、及びこれらのそれぞれの成分（一つ又は複数）に関連して使用される。
本明細書で使用する用語「から本質的になる」は、所定の実施形態に必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその実施形態の基本的及び新規又は機能的特徴に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を可能にする。
用語「からなる」は、実施形態のその記載に挙げられていない任意の要素を含まない、本明細書に記載のような組成物、方法及びこれらのそれぞれの成分を指す。
本明細書中で用いるように、「免疫原性作用物質」とは、免疫系の１以上の機能が増加され、免疫原性作用物質に向けられるように、対象の免疫系を刺激するのに用いられる作用物質をいう。抗原または免疫原は、宿主の免疫系を刺激して、その抗原に対して特異的な分泌、液性および／または細胞性免疫応答を行うことができる１以上のエピトープを含有する分子を意味することを意図する。免疫原性作用物質は、当分野で公知の技術を用い、双方が単離されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体である抗体の生産で用いることができる。免疫原性作用物質はワクチンを含む。
本明細書中で用いるように、「ワクチン」とは、対象の免疫系によって自己抗原として認識されない抗原に対して保護が供されるように、対象の免疫系を刺激するのに用いられる剤をいう。免疫化とは、生物が暴露された病原体または抗原に対して向けられる、対象において高レベルの抗体および／または細胞免疫応答を誘導するプロセスをいう。本明細書中で用いられるワクチンおよび免疫原性作用物質とは、対象の免疫系：それにより、対象が、対象の細胞または細胞外流体を侵す抗原性材料に対して抗体および／または細胞性免疫応答を生じさせる、解剖学的特徴およびメカニズムをいう。抗体生産の場合には、そのように生産された抗体は、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭのような免疫学的クラスのいずれにも属することができる。免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の生産を刺激するワクチンは注目されている。なぜならば、ＩｇＡは、温血動物における分泌系の主たる免疫グロブリンだからである。ワクチンは、ＩｇＡの形成に加えて、広い範囲の他の免疫応答、例えば、細胞性および液性免疫を生じさせるようである。抗原に対する免疫応答はよく研究され、広く報告されている。例えば、Ｅｌｇｅｒｔ， ＩＭＭＵＮＯＬ．（Ｗｉｌｅｙ Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．，１９９６）；ＳｔｉｔｅｓらＢＡＳＩＣ ＆ ＣＬＩＮ． ＩＭＭＵＮＯＬ．，（第７版，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，１９９１）参照。対照的に、フレーズ「宿主細胞の免疫応答」とは、外来体の存在に対する単細胞宿主生物の応答をいう。
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」又は「核酸分子」は、発現されるか又は自然界に見出される核酸分子ばかりではなく、本明細書に記載のような又は当該技術において知られているような一つ又はそれ以上のリボ又はデオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシド類似体又は誘導体を含む核酸の類似体又は誘導体も包含する。このような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、本明細書においてさらに論じられる、例えば高められた細胞取り込み、ヌクレアーゼの存在下での上昇した安定性などの特性から、多くの場合、天然型全体にわたって使用される。「ヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基及びリボース糖を含み、「ヌクレオチド」は、１個、２個又は３個のリン酸部分を有するヌクレオシドである。用語「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」は、本明細書で使用されるように同等物であるとみなすことができる。オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡヌクレオチドへの修飾を含め、例えば本明細書に記載のように核酸塩基構造又はリボース−リン酸主鎖構造において修飾することができる。ヌクレオシド類似体又は誘導体を含む分子は、二重鎖を形成する能力を保持しなければならない。
非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの修飾ヌクレオシド、例えば以下に限定されないが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステロール誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に連結されたに末端ヌクレオシド、固定化ヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオシド、２’−アミノ−修飾ヌクレオシド、２’−アルキル−修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ヌクレオシドを含むホスホロアミデート又は非天然塩基、あるいはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。あるいは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個の修飾ヌクレオシド、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個又はそれ以上の修飾ヌクレオシドを、最大オリゴヌクレオチドの全長まで含むことができる。修飾は、オリゴヌクレオチドのこのような複数の修飾ヌクレオシドのそれぞれについて必ずしも同じである必要はない。ＲＮＡエフェクター分子が二本鎖である場合には、それぞれの鎖は、独立して、修飾ヌクレオシドの数、型及び／又は位置について修飾することができる。一つの実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物に使用することを意図する修飾オリゴヌクレオチドは、必要な二重鎖構造を形成する能力を有し及びＲＩＳＣ経路による標的ＲＮＡの特異的分解を可能にするか又は仲介するペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
用語「リボヌクレオシド」、「リボヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、又は「デオキシリボヌクレオチド」は、本明細書でさらに詳述するような修飾ヌクレオチド、又は代理置換部分を指すこともできる。当該技術では、チミン塩基を含むリボヌクレオチドは、５−メチルウリジンともいい、ウラシル塩基を含むデオキシリボヌクレオチドは、デオキシウリジンともいう。グアニン、シトシン、アデニン、チミン及びウラシルは、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変えることなく他の部分で置換することができる。例えば、限定されることなく、イノシンをその塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン又はウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合できる。従って、ウラシル、グアニン又はアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明において特徴付けられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置換することができる。別の例において、オリゴヌクレオチドのどこでもアデニン及びシトシンは、グアニン及びウラシルで置換して、それぞれ標的ｍＲＮＡとＧ−Ｕウォッブル塩基対合を形成することができる。このような置換部分を含有する配列は、本発明において特徴付けられる組成物及び方法に適する。
同様に、当業者は、用語「ＲＮＡ分子」又は「リボ核酸分子」が、発現されるか又は自然界に見出されるＲＮＡ分子ばかりではなく、本明細書に記載のような又は当該技術において知られているような一つ又はそれ以上のリボヌクレオチド又はリボヌクレオシド類似体又は誘導体を含むＲＮＡの類似体又は誘導体も包含することを理解するであろう。用語「リボヌクレオシド」及び「リボヌクレオチド」は、本明細書で使用するように同等物であるとみなすことができる。ＲＮＡは、例えば本明細書に記載のように、核酸塩基構造又はリボース−リン酸主鎖構造において修飾することができる。
一つの態様において、ＲＮＡエフェクター分子は、デオキシリボヌクレオシド残基を含むことができる。このような場合には、ＲＮＡエフェクター分子作用物質は、ｄｓＲＮＡの二本鎖部分内に、一つ又はそれ以上のデオキシヌクレオシド、例えばデオキシヌクレオシドオーバーハング（一つ又は複数）又は一つ又はそれ以上のデオキシヌクレオシドを含むことができる。
いくつかの実施形態において、複数のＲＮＡエフェクター分子が、一つ又はそれ以上の標的遺伝子の発現を調節するために使用される。「複数」とは、少なくとも２個又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子、例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、８０個、１００個のＲＮＡエフェクター分子又はそれ以上を指す。「複数」とは、少なくとも２個又はそれ以上の標的遺伝子、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個の標的遺伝子又はそれ以上を指すことができる。
本明細書で使用する「宿主細胞を接触させる」という用語は、作用物質が細胞に導入されるような作用物質による宿主細胞の処理を指す。典型的には、宿主細胞は、例えば培地に組成物を加えることによって培養物中で細胞を接触させるために、例えば多くの場合に細胞内へのＲＮＡエフェクターの取り込みを促進する送達剤を含む組成物中で調製される、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用する培養物中にある。一つの実施形態において、宿主細胞は、ＲＮＡエフェクター分子をコードするベクター、例えば組込み又は非組込みベクターと接触させる。一つの実施形態において、宿主細胞は、免疫原性作用物質の生産のために宿主細胞を培養する前に、例えばトランスフェクション又は形質導入によって、ＲＮＡエフェクター分子をコードするベクターと接触させる。
１つの実施形態において、宿主細胞を接触させることは、宿主細胞を、ＲＮＡエフェクター分子をコードするベクターと接触させることを含まない。１つの実施形態において、宿主細胞を接触させることは、宿主細胞を、免疫原性作用物質の生産のための宿主細胞の培養に先立って、ＲＮＡエフェクター分子をコードするベクターと接触させることを含まず、すなわち、該細胞は細胞成長培養においてのみＲＮＡエフェクター分子と接触し、例えば、免疫原性作用物質を生産するプロセスの間には宿主細胞培養に加えられる。例えば、本発明のいくつかの実施形態は、免疫原性作用物質の収穫の収率および品質を危うくする細胞および抗ウイルスプロセスを阻害するためのウイルス感染またはベクター接種に先立って、その間、またはその後に起こる、宿主細胞とＲＮＡエフェクター分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）との接触を提供する。培養における宿主細胞をＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程は、１回を超えて（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、３０回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回、またはそれ以上）反復することができる。１つの実施形態において、例えば、免疫原性作用物質の生産で用いられる細胞培養基へ、ＲＮＡエフェクター分子組成物を加えることによって、標的遺伝子が一過的にのみ変調されるように、細胞を接触させ、ここに、ＲＮＡエフェクター分子の存在は経時的に消え、すなわち、ＲＮＡエフェクター分子は細胞において構成的に発現されない。
「細胞に導入する」とは、ＲＮＡエフェクター分子について言及する場合には、当業者によって理解されるように、細胞内への取り込み又は吸収を促進する又は行うことを意味する。ＲＮＡエフェクター分子の吸収又は取り込みは、磁力拡散又は活性細胞プロセスによって、あるいは補助剤又は補助デバイスによって生じさせることができる。例えば、細胞に導入するとは、宿主細胞を少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させることを意味するか、又は多くの場合にＲＮＡエフェクター分子及びＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する送達剤（例えば、トランスフェクション試薬、エマルジョン、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、荷電脂質、リポソーム、陰イオン性脂質、浸透促進剤、又は例えばリガンド、標的部分、ペプチド、親油性基などを結合するためにＲＮＡエフェクター分子に対する修飾）を含む組成物中で調製される、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子及び細胞への取り込み又は吸収を促進するか又は行う作用物質による細胞の処理を意味する。細胞内への生体外導入としては、当該技術で公知の方法、例えば電気穿孔法及びリポフェクションが挙げられる。別のアプローチは、本明細書において以下に記載されるか又は当該技術で公知である。
本明細書で使用する「ＲＮＡエフェクター組成物」は、有効量のＲＮＡエフェクター分子と許容される担体とを含む。本明細書で使用する「有効量」とは、免疫原性作用物質の産生のためのバイオプロセスに効果（例えば、調節効果）をもたらすのに有効なＲＮＡエフェクター分子の量を指す。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター組成物は、ＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する試薬（例えば、トランスフェクション試薬、エマルジョン、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、荷電脂質、リポソーム、陰イオン性脂質、浸透促進剤、又は例えばリガンド、標的部分、ペプチド、親油性基などを結合するためにＲＮＡエフェクター分子に対する修飾）を含む。
用語「許容される担体」は、ＲＮＡエフェクター分子を培養細胞に投与するための担体を指す。このような担体としては、以下に限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及びこれらの組み合わせが挙げられる。一つの実施形態において、用語「許容される担体」は、具体的には細胞培地を除外する。
本明細書で使用する用語「発現」は、ＲＮＡ及び／又はポリペプチドの配列をコードする標的遺伝子からＲＮＡへの転写及び／又は一つ又はそれ以上のポリペプチドへの翻訳を意味することを意図する。
本明細書で使用する「標的遺伝子」とは、遺伝子の発現の調節が免疫原性作用物質の産生を高めるように、宿主細胞による免疫原性作用物質の産生の一つ又はそれ以上の態様に影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝子を指す。標的遺伝子は、宿主細胞から誘導できるし、宿主細胞に内在する（宿主細胞ゲノムに存在する）ことができるし、導入遺伝子（宿主細胞ゲノムの異所性部位で挿入される遺伝子構造物）であることができるし、あるいは宿主細胞に又は免疫原性作用物質又はその誘導体を使用するであろう被験者（例えば、ヒト）に感染することができる病原体（例えば、ウイルス、真菌類又は細菌類）から誘導できる。また、いくつかの実施形態において、「標的遺伝子」とは、遺伝子の発現の調節が免疫原性作用物質の産生を高めるように、細胞による免疫原性作用物質の産生の一つ又はそれ以上の態様に影響を及ぼす核酸の発現を調節する遺伝子（すなわち、非コード遺伝子）を指す。
「標的遺伝子ＲＮＡ」又は「標的ＲＮＡ」とは、標的遺伝子から転写されるＲＮＡを意味する。従って、標的遺伝子は、標的遺伝子のコード領域、プロモーター領域、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）及び／又は５’−ＵＴＲであることができる。
ポリペプチドをコードする標的遺伝子ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）としてより一般的に知られている。標的遺伝子は、宿主細胞から誘導できるし、宿主細胞中に潜在することができるし、宿主細胞に内在する（宿主細胞ゲノムに存在する）ことができるし、導入遺伝子（宿主細胞ゲノムの異所性部位で挿入される遺伝子構造物）であることができるし、あるいは宿主細胞に又は免疫原性作用物質あるいはその誘導体又は産生物を使用するであろう被験者に感染することができる病原体（例えば、ウイルス、真菌類又は細菌類）から誘導できる。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、宿主細胞による翻訳後修飾の一つ又はそれ以上の態様、例えばペプチドグリコシル化に影響を及ぼすタンパク質をコードする。例えば、翻訳後プロセシングに関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現の調節は、少なくとも一つの末端マンノースを含むポリペプチドの産生を高める。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば非翻訳領域をコードする。本明細書で使用するように、ｎｃＲＮＡとは、タンパク質に翻訳されない標的遺伝子ＲＮＡを指す。また、ｎｃＲＮＡは、当該技術において非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｐｃＲＮＡ）、非メッセンジャーＲＮＡ（ｎｍＲＮＡ）、小分子非メッセンジャーＲＮＡ（ｓｎｍＲＮＡ）及び機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）と呼ぶこともできる。標的遺伝子であってそれからｎｃＲＮＡが最終生成物として転写される標的遺伝子もまた、ＲＮＡ遺伝子又はｎｃＲＮＡ遺伝子と呼ばれる。ｎｃＲＮＡ遺伝子としては、極めて豊富な及び機能的に重要なＲＮＡ類、例えば転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、並びにＲＮＡ類、例えばｓｎｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｐｉＲＮＡが挙げられる。本明細書で使用されるように、ＲＮＡエフェクター分子は、ＲＮＡエフェクター分子が特定の部位内のどこでも転写産物の切断を促進する場合には、ＲＮＡ転写産物の特定の部位内を標的とすると言われる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、宿主細胞の内在性遺伝子である。例えば、標的遺伝子は、免疫原性作用物質がポリペプチドである場合には、免疫原性作用物質又はその一部分をコードすることができる。また、標的遺伝子は、免疫原性作用物質の産生の一つ又はそれ以上の態様に直接的に又は間接的に影響を及ぼす宿主細胞タンパク質をコードすることもできる。ポリペプチドの産生に影響を及ぼす標的遺伝子の例としては、ポリペプチドの分泌、折りたたみ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、脱アミド化、ジスルフィド結合形成、メチオニン酸化又はピログルタミン酸化）に関与するタンパク質をコードする遺伝子；宿主細胞の性質又は表現型（例えば、増殖、生存率、細胞ｐＨ、細胞周期の進行、アポトーシス、炭素の代謝又は輸送、乳酸形成、細胞骨格構造（例えば、アクチン動態）、ウイルス感染に対する感受性あるいはＲＮＡｉ取り込み、活性又は効果）に影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝子；及び宿主細胞による免疫原性作用物質の産生を損なうタンパク質（例えば、免疫原性作用物質を結合するか又は免疫原性作用物質と同時精製するタンパク質）をコードする遺伝子が挙げられる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、標的遺伝子の発現の抑制が免疫原性作用物質の産生を高めるように免疫原性作用物質の産生に間接的に影響を及ぼす宿主細胞タンパク質をコードする。例えば、標的遺伝子は、免疫原性作用物質の産生に直接影響を及ぼさないが、例えば他の方法で免疫原性作用物質の産生を高めることができる細胞源を利用することによってその産生を間接的に低下させる豊富に発現される宿主細胞タンパク質をコードすることができる。標的遺伝子は、本明細書でさらに詳細に説明する。
用語「の発現を調節する」及びその他は、それが標的遺伝子に言及する限りには、本明細書において、第一の細胞又は細胞の群と実質的に同じであるがそのように処理されていない第二の細胞又は細胞の群（対照細胞）と比較して、標的遺伝子が転写され及び標的遺伝子の発現が調節されるように処理されている第一の細胞又は細胞の群から単離できるかあるいは前記第一の細胞又は細胞の群において検出できる標的遺伝子ｍＲＮＡの量の変化（例えば、増加又は減少）によって明らかにされるような、標的遺伝子の発現の調節を指す。調節の度合いは、
Figure 2014501489
 で表すことができる
あるいは、調節の度合いは、標的遺伝子発現と機能的に関連があるパラメータ、例えば標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量、又は特定の表現型、例えば微小管の安定化を示す細胞の数に関して示すことができる。原則として、標的遺伝子の調節は、標的遺伝子を発現する任意の宿主細胞において、構成的に又はゲノム工学によって、及び当該技術において公知の適切なアッセイによって調べることができる。
例えば、場合によっては、標的遺伝子の発現は抑制される。例えば、標的遺伝子の発現は、本明細書において提供されるＲＮＡエフェクター分子の投与によって少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％抑制される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＲＮＡエフェクター分子の投与によって少なくとも約６０％、７０％、又は８０％抑制される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、本明細書に記載のようなＲＮＡエフェクター分子の投与によって少なくとも約８５％、９０％、又は９５％あるいはそれ以上抑制される。他の場合には、標的遺伝子の発現は、本明細書において提供されるＲＮＡエフェクター分子の投与によって少なくとも約１０％、２０％、２５％、５０％、１００％、２００％、４００％又はそれ以上活性化される。いくつかの実施形態において、前記発現の調節は、部分抑制である。いくつかの態様において、部分抑制は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％及び８５％からなる群から選択される抑制率よりも大きくない。
本明細書で使用する用語「ＲＮＡエフェクター分子」は、宿主細胞内で本明細書において定義されるような標的遺伝子の発現を調節できるオリゴヌクレオチド作用物質、又は場合により宿主細胞内で（すなわち、宿主細胞に導入されると）このようなオリゴヌクレオチドを形成することができるオリゴヌクレオチド作用物質を指す。ＲＮＡエフェクター分子の一部分は、標的遺伝子の少なくとも一部分、例えば標的遺伝子のコード領域、プロモーター領域、３’非非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）及び／又は５’−ＵＴＲと実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的とすべきヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、標的とすべきヌクレオチド配列の少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個又はそれ以上の連続したヌクレオチド）を含む。
本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子は、一般的に第一の鎖と第二の鎖（これらの一つは、少なくとも標的遺伝子の一部分と実質的に相補的である）を有し、種々様々なメカニズム、例えば以下に限定されないが、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のＡｒｇｏｎａｕｔｅ介在転写後切断（時には、当該技術においてＲＮＡｉと呼ばれる）及び／又はその他の転写前及び翻訳前メカニズムの一つ又はそれ以上によって標的遺伝子発現を調節する。
ＲＮＡエフェクター分子は、一本鎖又は二本鎖以上の鎖を含むことができ、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、プロモーター指向ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、発現干渉ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、ｄｅｃｏｙ ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド及びアプタマーを含むことができる。ＲＮＡエフェクター分子は、一本鎖又は二本鎖であることができる。一本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、二本鎖領域を有することができ、二本鎖ＲＮＡエフェクターは、一本鎖領域を有することができる。
用語「一部分」とは、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエフェクター分子）に関連して使用される場合には、標的遺伝子の領域に相補的結合を行う所望の長さを有するか又は所望の長さの二重鎖領域を有するＲＮＡエフェクター分子の一部分を指す。例えば、「一部分」又は「領域」とは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個又はそれ以上で最大完全ＲＮＡエフェクター分子よりも１個短いヌクレオチドまでの核酸配列を指す。いくつかの実施形態において、「領域」又は「一部分」は、ＲＮＡエフェクター分子に関連して使用される場合には、ＲＮＡエフェクター分子の鎖の完全核酸配列よりも短いヌクレオチドの核酸配列を含む。当業者は、標的遺伝子と相補的であるか又は所望の特徴（例えば、標的遺伝子の抑制又は安定性）を有するＲＮＡエフェクター分子が産生されるように二重鎖に配置される前記「一部分」の長さを変化させることができる。理論に束縛されないが、本明細書において提供されるＲＮＡエフェクター分子は、種々様々なメカニズム、例えば以下に限定されないが、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のＡｒｇｏｎａｕｔｅ介在転写後切断（時には、当該技術でＲＮＡｉと呼ばれる）及び／又はその他の転写前及び翻訳前メカニズムの一つ又はそれ以上によって標的遺伝子発現を調節できる。
本明細書に開示されるＲＮＡエフェクター分子は、３０ヌクレオチド以下の長さ、例えば、１０〜３０個のヌクレオチドの長さ又は１９〜２４個のヌクレオチドの長さである領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、その領域は、免疫原性作用物質の産生の一つ又はそれ以上の態様、例えば免疫原性作用物質の収量、純度、均一性、生物活性又は安定性に影響を及ぼす標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である。ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用し、その選択的分解に介在するか又はその翻訳を妨害する。
用語「アンチセンス鎖」は、標的配列に実質的に相補的である領域を含むＲＮＡエフェクター分子、例えばｄｓＲＮＡの鎖を指す。用語「相補性の領域」は、本明細書で定義するような配列、例えば標的配列と実質的に相補的であるアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が標的配列と完全に相補的でない場合には、誤対合が、分子の内部又は末端領域に存在し得る。一般的に、最も許容される誤対合は、末端領域、例えば５’及び／又は３’末端の５、４、３又は２ヌクレオチド内にある。
用語「センス鎖」は、この用語が本明細書において定義されるようなアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的である領域を含むＲＮＡエフェクター分子の鎖を指す。
本明細書で使用されるように及び特に明示されない限りは、用語「相補的な」は、第二のヌクレオチド配列に関連して第一のヌクレオチド配列を説明するのに使用される場合には、当業者によって理解されるように、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、第二のクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと特定の条件下でハイブリダイズし、二重鎖構造を形成できることを指す。「相補的」配列はまた、前記ヌクレオチドがハイブリダイズすることができることに関して上記の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対及び／又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含むことができるし又はこれらの塩基対から完全に形成されることができる。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、以下に限定されないが、Ｇ：Ｕウォッブル又はフーグステイン塩基対が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、ストリンジェントな条件であることができ、この場合、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃、１２〜１６時間、次いで洗浄を含むことができる。その他の条件、例えば生物内で遭遇し得るような生理学的に関連する条件が適用できる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適した一組の条件を決定できるであろう。
本明細書において用語「相補的な」、「完全に相補的な」及び「実質的に相補的な」は、使用する文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間又はＲＮＡエフェクター分子作用物質のアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基対合に関して使用できる。本明細書で使用されるように、標的遺伝子「の少なくとも一部分と実質的に相補的である」オリゴヌクレオチドとは、関心の標的遺伝子の近接部分と実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ、標的遺伝子のプロモーター領域又は３’ＵＴＲ、又はＥＲＶ ＬＴＲ）を指す。例えば、オリゴヌクレオチドは、配列が標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的である場合には、少なくとも標的ｍＲＮＡの一部分と相補的である。
ＲＮＡエフェクター分子内、例えば、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ（二本鎖リボ核酸）内の相補的配列は、ヌクレオチド配列の一つ又は両方の全長にわたって第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対する第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書において互いに関して「完全に相補的である」ということができる。第一の配列が本明細書において第二の配列に対して「実質的に相補的である」という場合には、この２つの配列は、完全に相補的であることができるし、又はこの２つの配列は、その最終用途、例えばＲＩＳＣ経路による遺伝子発現の抑制に最も適切な条件下でハイズリダイズする能力を保持しながら、最大３０塩基対までの二重鎖のためのハイブリダイゼーションに際して一つ又はそれ以上であるが、一般的には５個以下、４個以下、３個以下又は２個以下の誤対合塩基対を形成できる。２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションに際して、一つ又はそれ以上の一本鎖オーバーハングを形成するために設計される場合には、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関して誤対合とみなされないであろう。例えば、２１個のヌクレオチドの長さの一方のオリゴヌクレオチドと、２３個のヌクレオチドの長さの他方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡ（前記長いオリゴヌクレオチドは、前記短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的である２１個のヌクレオチドの配列を含む）は、本明細書に記載の目的に「完全に相補的」とさらにいうことができる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用し、該ＲＮＡ転写産物の切断を指示する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。例えば、一本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、該エフェクター分子をヌクレアーゼ分解から保護するために一つ又はそれ以上のリン酸基又はその類似体を含む５’修飾を含む。ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも標的遺伝子の「センス」核酸の一部分、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的であるヌクレオチド配列又はＲＮＡ配列、例えばｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを有する一本鎖アンチセンス核酸であることができる。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸標的と水素結合を形成できる。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも９個のヌクレオチドの長さの二重鎖領域を含む。
コード鎖配列（例えば、ｃＤＮＡ分子のセンス鎖の配列）を考慮に入れて、アンチセンス核酸は、ワトソン・クリック塩基対合の規則に従って設計できる。アンチセンス核酸は、ＲＮＡのコード領域又は非コード領域の一部分、例えばｐｒｅ−ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域、例えば５’ＵＴＲと相補的であることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約１０〜２５個のヌクレオチドの長さ（例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個又は２４個のヌクレオチドの長さ）であることができる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その分子の生物学的安定性及び／又はアンチセンス核酸と標的核酸の間で形成される二重鎖の物理的安定性を高めるために設計される、一つ又はそれ以上の修飾ヌクレオチド、例えばホスホロチオエート誘導体及び／又はアクリジン置換ヌクレオチドを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド）を含むことができるし又はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含むことができる。例えば、リボヌクレオチドのみからなるアンチセンス剤は、相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、標的ＲＮＡ転写産物への翻訳機構のアクセスを防止し、それによってタンパク質合成を防止することができる。デオキシリボヌクレオチドのみを含むか又はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとを含むアンチセンス分子は、相補的ＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ＲＮＡ標的は、その後に翻訳を防止するために酵素、例えばリボヌクレアーゼＨによって実質的に切断されることができる。フランキングＲＮＡ配列は、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、及びホスホロチオエート連鎖を含むことができ、内部ＤＮＡ配列は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連鎖を含むことができる。内部ＤＮＡ配列は、リボヌクレアーゼＨ活性による標的化が望まれる場合には、少なくとも５個のヌクレオチドの長さであることが好ましい。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、二本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書で使用する用語「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」は、標的ＲＮＡに関して「センス」及び「アンチセンス」配向を有すると言われるであろう２つの逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含むハイブリダイズした二重鎖領域を有するオリゴヌクレオチド分子又は分子の複合体を指す。典型的には、相補性の領域は、一般的に例えば１０〜２６個のヌクレオチドの長さ、１８〜２５個のヌクレオチドの長さ、又は１９〜２４個のヌクレオチドの長さを含め、３０個又はそれよりも少ないヌクレオチドの長さである。標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を、例えばＰＣＲ又は分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に基づいた方法で、あるいはタンパク質に基づいた方法で、例えばタンパク質免疫ブロットでアッセイされるように少なくとも１０％抑制する。細胞培養における標的遺伝子の発現は、標的遺伝子ｍＲＮＡ量を、例えばｂＤＮＡ又はＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイで測定することによって、あるいはタンパク質量を、例えば免疫蛍光分析で測定することによってアッセイすることができる。
二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路による所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さであることができるが、典型的には９〜３６個の塩基対の長さ、例えば１５〜３０個の塩基対の長さの範囲にあるであろう。さらに具体的には、二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路による所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さであることができるが、典型的には９〜３６個の塩基対の長さ、例えば１５〜３０個の塩基対の長さの範囲にあるであろう。９〜３６個の塩基対の二重鎖を考慮すると、二重鎖は、この範囲内の任意の長さであることができ、例えば９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５又は３６個の塩基対の長さであることができ、例えば、以下に限定されないが、１５〜３０塩基対、１５〜２６個の塩基対、１５〜２３個の塩基対、１５〜２２個の塩基対、１５〜２１個の塩基対、１５〜２０個の塩基対、１５〜１９個の塩基対、１５〜１８個の塩基対、１５〜１７個の塩基対、１８〜３０個の塩基対、１８〜２６個の塩基対、１８〜２３個の塩基対、１８〜２２個の塩基対、１８〜２１個の塩基対、１８〜２０個の塩基対、１９〜３０個の塩基対、１９〜２６個の塩基対、１９〜２３個の塩基対、１９〜２２個の塩基対、１９〜２１個の塩基対、１９〜２０個の塩基対、２０〜３０個の塩基対、２０〜２６個の塩基対、２０〜２５個の塩基対、２０〜２４個の塩基対、２０〜２３個の塩基対、２０〜２２個の塩基対、２０〜２１個の塩基対、２１〜３０個の塩基対、２１〜２６個の塩基対、２１〜２５個の塩基対、２１〜２４個の塩基対、２１〜２３個の塩基対，又は２１〜２２個の塩基対を含む任意の部分範囲であることができる。
ダイサー酵素及び類似酵素を用いるプロセシングによって細胞内で生じたｄｓＲＮＡは、一般的に１９〜２２個の塩基対の長さの範囲にある。ｄｓＤＮＡの二重鎖領域の一つの鎖は、標的ＲＮＡの領域と実質的に相補的である配列を含む。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、少なくとも一つの自己相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子に由来するものであることができるし、又は２個又はそれ以上の別個のＲＮＡ分子から形成されることができる。二重鎖領域が、単一分子の２つの鎖から形成される場合には、該分子は、一方の鎖の３’末端と、二重鎖構造を形成するそれぞれの他方の鎖の５’末端の間のヌクレオチドの一本鎖（「ヘアピンループ」）によって隔てられている二重鎖領域を有することができる。ヘアピンループは、少なくとも１個の不対ヌクレオチドを含むことができる；いくつかの実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個又はそれ以上の不対ヌクレオチドを含むことができる。ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が、別個のＲＮＡ分子によって構成される場合には、これらのＲＮＡ分子は、必ずしも必要ではないが、共有結合されることができる。前記２つの鎖が、ヘアピンループ以外の手段によって共有結合される場合には、その結合構造は、「リンカー」と呼ばれる。用語「ｓＲＮＡエフェクター分子」もまた、本明細書においてｄｓＲＮＡを指すために使用される。
標的遺伝子の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子が、本明細書に記載される。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子作用物質は、細胞において標的遺伝子の発現を抑制するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含み、前記ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現において形成される標的遺伝子の少なくとも一部分と相補的である相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含み、前記相補性の領域は、３０個以下のヌクレオチドの長さ、一般的には１０〜２４個のヌクレオチドの長さであり、及び前記ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、標的遺伝子の発現を、例えばＰＣＲ、ＰＥＲＴ、又はｂＤＮＡに基づいた方法で、あるいはタンパク質に基づいた方法、例えばウェスタンブロットでアッセイされるように少なくとも１０％抑制する。細胞での標的遺伝子の発現は、標的遺伝子ｍＲＮＡ量を、例えばＰＥＲＴ、ｂＤＮＡ又はＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイで測定することによって、あるいはタンパク質量を、例えば免疫蛍光分析又は定量タンパク質免疫ブブロットで測定することによってアッセイすることができる。
ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを使用するであろう条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分に相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、例えば標的遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列から誘導される標的配列と実質的に相補的であり、一般的に完全に相補的である相補性の領域を含む。ｄｓＲＮＡの他方の鎖（センス鎖）は、前記２つの鎖が、ハイブリダイズし、適当な条件下で結合した場合に二重鎖構造を形成するようにアンチセンス鎖と相補的である領域を含む。一般的に、二重鎖構造は、例えば９〜３６個の塩基対、１０〜３０個の塩基対、１８〜２５個の塩基対、１９〜２４個の塩基対又は１９〜２１個の塩基対の長さを含む。同様に、標的配列と相補性の領域は、例えば、１０〜３０個、１８〜２５個、１９〜２４個、又は１９〜２１個のヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１０〜２０個のヌクレオチドの長さを含む。その他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２５〜３０個のヌクレオチドの長さを含む。従って、一つの実施形態において、切断のために所望のＲＮＡを標的とする例えば１５〜３０個の塩基対の機能的二重鎖に処理される程度まで、ＲＮＡ分子又は３０個を超える塩基対の二重鎖領域を有するＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。当業者が認識するであろうように、切断のために標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合により大きいＲＮＡ分子、多くの場合にはｍＲＮＡ分子の一部分であろう。一つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである。
適切な場合には、ｍＲＮＡ標的の「一部分」は、ＲＮＡｉ指向切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路による切断）のための支持体であるのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続配列である。９個の塩基対ほどの短い二重鎖を有するｄｓＲＮＡは、ある状況下では、ＲＮＡｉ指向ＲＮＡ切断に介在する。ほとんどの場合、標的は、少なくとも１０個のヌクレオチドの長さ、例えば１５〜３０個のヌクレオチドの長さを含むであろう。
当業者は、２０〜２３個の塩基対、具体的には２１個の塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導することに特に有効であると認められていることをよく分かっている。Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２０ ＥＭＢＯ ６８７７−８８（２００１）。前記の実施形態において、オリゴヌクレオチド配列の性質によって、本明細書に記載のｄｓＲＮＡは、２１個のヌクレオチドの長さの少なくとも一つの鎖を含むことができる。一端又は両端の数個のヌクレオチドのみがない配列を有する短い二重鎖が、詳細に記載したｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であることができることが合理的に予測できる。従って、所定の配列由来の少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又はそれ以上の連続したヌクレオチドの部分配列を有し、完全な配列を含むｄｓＲＮＡとは標的遺伝子の発現を５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は３０％以下の抑制率まで抑制できることにおいて異なるｄｓＲＮＡが、本発明によって意図される。
ｄｓＲＮＡは、以下でさらに論じるような当該技術で公知の標準方法によって、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）から商業的に入手できるような自動化ＤＮＡ合成装置を使用することによって合成できる。一つの実施形態において、標的遺伝子は、ヒト標的遺伝子である。特定の実施形態において、第一の配列は、センス配列を含むｄｓＲＮＡのセンス鎖であり、及び第二の配列は、アンチセンス配列を含むｄｓＲＮＡの鎖である。標的配列のほかの部分を標的とする別のｄｓＲＮＡ作用物質は、標的配列及びフランキング標的配列を使用して容易に決定できる。この態様において、２つの配列の一つは、この２つの配列の他方と相補的であり、これらの配列の一つは、標的遺伝子の発現において生じたｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。従って、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含むであろうし、一つのオリゴヌクレオチドは、センス鎖として記載され及び第二のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖として記載される。本明細書の他の個所に記載されるように及び当該技術において知られているように、ｄｓＲＮＡの相補的配列は、別個のオリゴヌクレオチド上に存在するのとは対照的に、単一の核酸分子の自己相補的領域として含まれることもできる。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含むことができる。本明細書で使用する用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、二本鎖オリゴヌクレオチド、例えばｄｓＲＮＡの二重鎖構造の末端から突き出る少なくとも一つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて伸びるか又はその逆の場合には、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのヌクレオチドのオーバーハングを含むことができる；あるいは、前記オーバーハングは、少なくとも２個のヌクレオチド、少なくとも３個のヌクレオチド、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチド又はそれ以上を含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むことができるし又はヌクレオチド／ヌクレオシド類似体からなることができる。オーバーハング（一つ又は複数）は、センス鎖、アンチセンス鎖又はこれらの任意の組み合わせに存在することができる。また、オーバーハングのヌクレオチド（一つ又は複数）は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖又はセンス鎖いずれかの５’末端、３’末端又は両端に存在することができる。
一つの実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも一つの末端は、１〜４個、一般的には１個又は２個のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端化対応物に比べて意外にも優れた阻害特性を有する。また、一方の鎖（ｄｓＲＮＡの一方の末端）にのみヌクレオチドオーバーハングが存在すると、その全体の安定性に影響を及ぼすことなくｄｓＲＮＡの干渉活性を増強する。このようなオーバーハングは、必ずしも単一のヌクレオチドオーバーハングである必要はなく；ジヌクレオチドオーバーハングも存在することができる。
二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有し、例えば二本鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端及び／又は５’末端に１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。オーバーハングのヌクレオチド間連鎖の一つ又はそれ以上は、ホスホロチオエートで置換することができる。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、一つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレオシドを含むか又はオーバーハングは、一つ又はそれ以上のｄＴ、例えば配列５’−ｄＴｄＴ−３’又は５’−ｄＴｄＴｄＴ−３’を含む。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、配列５’−ｄＴ＊ｄＴ−３（式中、＊ は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連鎖である）を含む。
理論に束縛されることなく、少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチドは、その平滑末端化カウンターパートに比べて意外にも優れた阻害特性を有する。また、一方の鎖（ｄｓＲＮＡの一方の端部）にのみヌクレオチドオーバーハングが存在すると、二本鎖オリゴヌクレオチドの干渉活性を、その全体の安定性に影響を及ぼすことなく増強する。
一つのオーバーハングだけを有するｄｓＲＮＡは、生体内で、並びに種々様々な細胞、細胞培養培地、血液及び血清内で特に安定で、有効であることを証明している。一般的に、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端、あるいはセンス鎖の３’末端に配置される。一端にのみオーバーハングを有するｄｓＲＮＡもまた、一般的にアンチセンスの鎖の５’末端に配置された一つの平滑末端を有するであろう。このようなｄｓＲＮＡは、優れた安定性及び阻害活性を有し、従って低用量で、すなわち１日当たり５ｍｇ未満／受容者体重ｋｇで投与することを可能にする。一つの実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハングのヌクレオチドの一つ又はそれ以上は、ヌクレオシドホスホロチオエートで置換することができる。
二本鎖オリゴヌクレオチドに関連して本明細書で使用する用語「平滑末端」又は「平滑末端化」は、二本鎖オリゴヌクレオチドの所定の末端に不対ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体が存在しない、すなわちヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。二本鎖オリゴヌクレオチドの一端又は両端は、平滑末端であることができる。両端が平滑末端である場合には、オリゴヌクレオチドは、二重平滑末端化されるという。明確にするために、「二重平滑末端化」オリゴヌクレオチドは、両端が平滑末端である、すなわち分子のいずれかの端部にヌクレオチドオーバーハングが存在しない二本鎖オリゴヌクレオチドである。ほとんどの場合、このような分子は、その全長にわたって二本鎖であろう。一端のみが平滑末端である場合には、オリゴヌクレオチドは、単一平滑末端化されるという。明確にするために、「単一平滑末端化」オリゴヌクレオチドは、一端でのみ平滑末端である、すなわち分子の一端にヌクレオチドオーバーハングが存在しない二本鎖オリゴヌクレオチドである。一般的に、単一平滑末端化オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端で平滑末端化される。
本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子は、標的配列に対する一つ又はそれ以上の誤対合を含有することができる。例えば、本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子は、３個以下の誤対合を含有する。ＲＮＡエフェクター分子のアンチセンス鎖が、標的配列に対する誤対合を含有する場合には、誤対合の領域は、相補性の領域の中心に配置されないことが好ましい。ＲＮＡエフェクター分子のアンチセンス鎖が、標的配列に対する誤対合を含有する場合には、誤対合は、相補性の領域の５’末端又は３’末端のいずれかから最後の５個のヌクレオチド内にあるように制限されることが好ましい。例えば、標的遺伝子の領域と相補的である２３個のヌクレオチドのＲＮＡエフェクター分子作用物質ＲＮＡ鎖について、ＲＮＡ鎖は、一般的に中心の１３個のヌクレオチド内に何ら誤対合を含有しない。本明細書に記載の方法又は当該技術で公知の方法が、標的配列に対して誤対合を含有するＲＮＡエフェクター分子が、標的遺伝子の発現を抑制することにおいて有効であるか否かを調べるのに使用できる。特に標的遺伝子の相補性の特定の領域が、その集団内に多型配列変異を有することが知られている場合には、標的遺伝子の発現の抑制において誤対合を有するＲＮＡエフェクター分子の効果を考慮することが重要である。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の非コード領域の少なくとも一部分と実質的に相補的であるプロモーター指向ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）である。一つの実施形態において、ｐｄＲＮＡは、転写開始部位から上流に配置された部位、例えば転写開始部位から１００塩基を越える、２００塩基を越える又は１，０００塩基を越える上流に配置された部位の標的遺伝子ｍＲＮＡのプロモーター領域の少なくとも一部分と実質的に相補的である。別の実施形態において、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物の３’−ＵＴＲの少なくとも一部分と実質的に相補的である。一つの実施形態において、ｐｄＲＮＡは、場合によりそれぞれの鎖に３’ジ又はトリヌクレオチドオーバーハングを有する１８〜２８個の塩基のｄｓＲＮＡを含む。前記ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のプロモーター領域又は３’−ＵＴＲ領域の少なくとも一部分と実質的に相補的である。別の実施形態において、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のプロモーター領域又は３’−ＵＴＲ領域の少なくとも一部分と実質的に相補的であるＤＮＡ配列含む一本鎖ポリヌクレオチドからなり、ギャップマーを細胞ヌクレアーゼから保護する一つ又はそれ以上の修飾ヌクレオチド、例えば２’ＭＯＥ、２’ＯＭｅ、又は固定化核酸塩基（ＬＮＡ）を含むポリヌクレオチド配列（例えば、ギャップマーの５’末端及び３’末端のそれぞれに５個の末端塩基を含む）に隣接するギャップマーを含む。
ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子の発現を選択的に高めるか、低下させるか又は調節するのに使用できる。理論に制約されることなく、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物の非コード領域とオーバーラップする内在性アンチセンスＲＮＡ転写産物に結合し、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（ｄｓＲＮＡの場合）又は宿主細胞ヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼＨ）（ギャップマーの場合）補充して内在性アンチセンスＲＮＡを選択的に分解することによって標的遺伝子の発現を調節すると考えられる。いくつかの実施形態において、内在性アンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子の発現を負に調節し、ｐｄＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を活性化する。従って、いくつかの実施形態において、ｐｄＲＮＡは、内在性アンチセンスＲＮＡによる標的遺伝子発現の負の調節を抑制することによって標的遺伝子の発現を選択的に活性化させるのに使用できる。標的遺伝子のプロモーター配列によってコードされるアンチセンス転写産物を同定する方法及びプロモーター指向ＲＮＡを調製及び使用する方法が知られている。例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０４６３９７号明細書参照。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、非核酸リガンド、例えば有機小分子又はタンパク質、例えば転写又は翻訳因子に結合し、その後に活性を修飾する（例えば、抑制する）アプタマーを含む。アプタマーは、非核酸リガンドの標的化結合部位の認識を指示する特異構造に折り畳むことができる。アプタマーは、本明細書に記載の修飾のいずれかを含有することができる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）を含む。アンタゴミアは、ｍｉｃｒｏＲＮＡを標的とする一本鎖、二本鎖、部分的二本鎖又はヘアピン構造である。アンタゴミアは、内在性ｍｉＲＮＡ、さらに詳しくはｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヌクレオチド配列の標的配列と実質的に相補的である少なくとも１０個又はそれ以上の連続したヌクレオチドから本質的になるか又は該ヌクレオチドを含む。アンタゴミアは、アンタゴミアが標的配列にハイブリダイズすることを可能にするために約１２〜２５個のヌクレオチド、例えば約１５〜２３個のヌクレオチドのｍｉＲＮＡ標的配列と十分と相補的なヌクレオチド配列を有することが好ましい。さらに好ましくは、標的配列は、アンタゴミアの配列とは１個、２個又は３個以下のヌクレオチドが異なる。いくつかの実施形態において、アンタゴミアは、オリゴヌクレオチド作用物質の３’又は５’末端に結合させることができる非ヌクレオチド部分、例えばコレステロール部分を含む。
いくつかの実施形態において、アンタゴミアは、修飾、例えばヌクレオチド修飾の組み込みによって核酸分解に対して安定化される。例えば、いくつかの実施形態において、アンタゴミアは、ヌクレオチド配列の５’末端又は３’末端に少なくとも第一、第二及び／又は第三のヌクレオチド間連鎖を含むホスホロチオエートを含有する。別の実施形態において、アンタゴミアは、２’−修飾ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、又は２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含む。いくつかの実施形態において、アンタゴミアは、少なくとも一つの２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の非コード領域の少なくとも一部分と実質的に相補的であるプロモーター指向ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）である。一つの実施形態において、ｐｄＲＮＡは、転写開始部位から上流に配置された部位、例えば転写開始部位から１００塩基を越える、２００塩基を越える又は１，０００塩基を越える上流に配置された部位の標的遺伝子ｍＲＮＡのプロモーター領域の少なくとも一部分と実質的に相補的であることができる。また、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物の３’−ＵＴＲの少なくとも一部分と実質的に相補的であることができる。例えば、ｐｄＲＮＡは、場合によりそれぞれの鎖に３’ジ又はトリヌクレオチドオーバーハングを有する１８〜２８個の塩基のｄｓＲＮＡを含む。前記ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のプロモーター領域又は３’−ＵＴＲ領域の少なくとも一部分と実質的に相補的である。別の実施形態において、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のプロモーター領域又は３’−ＵＴＲ領域の少なくとも一部分と実質的に相補的であるＤＮＡ配列含む一本鎖ポリヌクレオチドからなり、ギャップマーを細胞ヌクレアーゼから保護する一つ又はそれ以上の修飾ヌクレオチド、例えば２’ＭＯＥ、２’ＯＭｅ、又は固定化核酸塩基（ＬＮＡ）を含むポリヌクレオチド配列（例えば、ギャップマーの５’末端及び３’末端のそれぞれに５個の末端塩基を含む）に隣接するギャップマーを含む。
ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子の発現を選択的に高めるか、低下させるか又は調節するのに使用できる。理論に制約されることなく、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物の非コード領域とオーバーラップする内在性アンチセンスＲＮＡ転写産物に結合し、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（ｄｓＲＮＡの場合）又は宿主細胞ヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼＨ）（ギャップマーの場合）補充して内在性アンチセンスＲＮＡを選択的に分解することによって標的遺伝子の発現を調節し得る。いくつかの実施形態において、内在性アンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子の発現を負に調節し、ｐｄＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を活性化する。従って、いくつかの実施形態において、ｐｄＲＮＡは、内在性アンチセンスＲＮＡによる標的遺伝子発現の負の調節を抑制することによって標的遺伝子の発現を選択的に活性化させるのに使用できる。標的遺伝子のプロモーター配列によってコードされるアンチセンス転写産物を同定する方法及びプロモーター指向ＲＮＡを調製及び使用する方法が知られている。例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０４６３９７号明細書参照。
発現干渉ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）は、標的遺伝子の発現を選択的に高めるか、低下させるか又は調節するのに使用できる。典型的には、ｅｉＲＮＡ、すなわち前記ｄｓＲＮＡは、発現ベクター由来の第一の形質移入細胞で発現される。このようなベクターにおいて、ｄｓＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、例えば核酸配列のいずれかの末端で２つの収束型プロモーターを使用するか、あるいはセンス配列又はアンチセンス配列を転写する別個のプロモーターを使用して同じ核酸配列から転写できる。あるいは、２つのプラスミドは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖を転写するために設計され、同時に他方が他方の鎖を転写するために設計される複数のプラスミドの一つを用いて形質移入できる。ｅｉＲＮＡエフェクター分子を調製し、使用する方法は、当該技術において公知である。例えば、国際公開第ＷＯ２００６／０３３７５６号、米国特許出願公開第２００５／０２３９７２８号及び同第２００６／００３５３４４号明細書参照。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、本明細書で定義されるような標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的であり及びＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質のＰｉｗｉ又はＡｕｂｅｒｇｉｎｅサブクラスのタンパク質に選択的に結合する小さな一本鎖Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡエフェクター分子）を含む。特定の理論に制約されることなく、ｐｉＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用し、Ｐｉｗｉ及び／又はＡｕｂｅｒｇｉｎｅタンパク質を補充して標的遺伝子の転写及び／又は転写後遺伝子サイレンシングを誘導するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成すると考えられる。ｐｉＲＮＡエフェクター分子は、約１０〜５０個のヌクレオチドの長さ、約２５〜３９個のヌクレオチドの長さ又は約２６〜３１個のヌクレオチドの長さであることができる。例えば、米国特許出願公開第２００９／００６２２２８号明細書参照。
ｍｉｃｒｏＲＮＡは、植物及び動物のゲノムのＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳されない高度に保存されたクラスの小ＲＮＡ分子である。ｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡは、ｍｉＲＮＡに処理される。処理されたｍｉｃｒｏＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれようになり及び発生、細胞増殖、アポトーシス及び分化の重要な調節剤として確認されている一本鎖〜１７−２５個のヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡ分子である。これらの処理されたｍｉｃｒｏＲＮＡは、特異的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合することによって遺伝子発現の調節において役割を果たすと考えられる。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、例えば標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制するか又は分解を開始することによって特異的標的遺伝子の転写後サイレンシングを引きこす。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、標的核酸と完全に相補的である。別の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、標的核酸と非相補性の領域を有し、非相補性の領域で「バルジ」をもたらす。いくつかの実施形態において、非相補性の領域（バルジ）は、二重鎖の形成を可能にするために、十分な相補性、例えば完全な相補性の領域が側面に配置されている。例えば、相補性の領域は、少なくとも８〜１０個のヌクレオチドの長さ（例えば、８個、９個又は１０個のヌクレオチドの長さ）である。
ｍｉＲＮＡは、例えばｍｉＲＮＡが標的核酸と完全に相補的でない場合には、例えば翻訳を抑制することによって、又はｍｉＲＮＡが完全な又は高度の相補性を有するその標的に結合する場合には標的ＲＮＡの分解を生じることによって、遺伝子の発現を抑制することができる。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、内在性ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド作用物質を含むことができる。例えば、ＲＮＡエフェクターは、ＲＮＡエフェクターが標的遺伝子のｍｉＲＮＡに基づいた抑制を緩和するように、標的遺伝子の発現を負に調節する内在性ｍｉＲＮＡを標的とすることができる。オリゴヌクレオチド作用物質は、天然核酸塩基、糖、及び共有ヌクレオチド間（主鎖）連鎖及び／又は望ましい特性、例えば高められた細胞取り込み、内在性ｍｉＲＮＡ標的に対する高められた親和性、及び／又はヌクレアーゼの存在下での高められた安定性を付与する一つ又はそれ以上の天然に存在しない特徴を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、特異的内在性ｍｉＲＮＡに結合するために設計されたオリゴヌクレオチド作用物質は、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも１０個、２０個又は２５個あるいはそれ以上の塩基と相当な相補性、例えば少なくとも７０％、８０％、９０％、又は１００％の相補性を有する。ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを標的とする典型的なオリゴヌクレオチド作用物質は、例えば米国特許出願公開第２００９０３１７９０７号、同第２００９０２９８１７４号、同第２００９０２９１９０７号、同第２００９０２９１９０６号、同第２００９０２８６９６９号、同第２００９０２３６２２５号、同第２００９０２２１６８５号、同第２００９０２０３８９３号、同第２００７００４９５４７号、同第２００５０２６１２１８号、同第２００９０２７５７２９号、同第２００９００４３０８２号、同第２００７０２８７１７９号、同第２００６０２１２９５０号、同第２００６０１６６９１０号、同第２００５０２２７９３４号、同第２００５０２２２０６７号、同第２００５０２２１４９０号、同第２００５０２２１２９３号、同第２００５０１８２００５号、及び同第２００５００５９００５号各明細書に記載されている。
ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、１０〜２００個のヌクレオチドの長さ、例えば１６〜８０個のヌクレオチドの長さであることができる。成熟ｍｉＲＮＡは、１６〜３０個のヌクレオチドの長さ、例えば２１〜２５個のヌクレオチドの長さ、特に２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のヌクレオチドの長さを有することができる。ｍｉＲＮＡ前駆物質は、７０〜１００個のヌクレオチドの長さを有することができ、ヘアピン立体配置を有することができる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、生体内で酵素ｃＤｉｃｅｒ及びＤｒｏｓｈａによりｐｒｅ−ｍｉＲＮＡから生じる。ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、細胞に基づいた系で、生体内で合成できるし又は化学的に合成できる。ｍｉＲＮＡは、例えばエンドサイトーシス依存又は非依存メカニズムによって、一つ又はそれ以上の所望の特性、例えば優れた安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織又は細胞型に対する標的化、及び／又は細胞透過性を付与する修飾を含むことができる。修飾はまた、配列特異性を高め、その結果として部位外標的化を減少させることもできる。
別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、内在性ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド作用物質を含むことができる。例えば、ＲＮＡエフェクターは、ＲＮＡエフェクターが標的遺伝子のｍｉＲＮＡに基づいて抑制を緩和するように、標的遺伝子の発現を負に調節する内在性ｍｉＲＮＡを標的とすることができる。
本明細書で使用する「少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子の存在下で」という語句は、細胞で発現されたＲＮＡエフェクター分子、例えばｓｈＲＮＡへの細胞の暴露、又は細胞へのＲＮＡエフェクター分子の外からの添加、例えば場合により細胞内への取り込みを促進する作用物質を使用する細胞へのＲＮＡエフェクター分子の送達による暴露を包含する。ＲＮＡエフェクター分子の一部分は、標的遺伝子ＲＮＡの少なくとも一部分、例えば標的遺伝子ＲＮＡのコード領域、プロモーター領域、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）又は長い末端反復（ＬＴＲ）と実質的に相補的である。本明細書に開示されるＲＮＡエフェクター分子は、３０個以下のヌクレオチドの長さ、例えば１０〜２００個のヌクレオチドの長さ又は１９〜２４個のヌクレオチドの長さである領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、その領域は、免疫原性作用物質の産生の一つ又はそれ以上の態様、例えば免疫原性作用物質の収量、純度、均一性、生物活性又は安定性に影響を及ぼすタンパク質をコードする標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である。ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用し、その選択的分解に介在するか又はその翻訳を妨害する。本発明の種々の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも一つのギャップマー、あるいはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、アンタゴミア又はリボザイムである。
ＲＮＡ干渉を誘導するのに有効である二本鎖及び一本鎖オリゴヌクレオチドは、本明細書ではｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ剤又はｉＲＮＡ剤ともいう。これらのＲＮＡ干渉誘導オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られている細胞質多タンパク質複合体と会合する。理論に拘束されることなく、ＲＮＡ干渉は、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のＡｒｇｏｎａｕｔｅ介在転写後切断をもたらす。多くの実施形態において、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡｉ作用物質は、内在性分子、例えばダイサーで切断され、ＲＩＳＣ機構に入り、標的配列、例えば標的ｍＲＮＡのＲＩＳＣ介在切断に関与できるより小さいオリゴヌクレオチドを生じることができるのに十分に長い。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ介在切断の影響を受け易い標的転写産物の部位を特定する。従って、本発明は、さらに、このような配列の一つの内部を標的とするＲＮＡエフェクター分子を特徴とする。このようなＲＮＡエフェクター分子は、一般的に標的遺伝子内の選択された配列に隣接する領域から採取されるさらなるヌクレオチド配列に結合された提供される配列の一つに由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む。
本明細書において並びに特許請求の範囲及び明細書全体を通じて使用する「ゲノム情報」という語句は、生物の部分ゲノム又は全ゲノム、例えばタンパク質コード領域又は非コード領域由来の配列情報を指すことを意味する。これらの配列は、同じ生物から生じるどんな細胞にも存在する。トランスクリプトーム配列情報とは対照的に、ゲノム情報は、コード領域ばかりではなく、例えばイントロン配列、プロモーター配列、サイレンサー配列及びエンハンサー配列も含む。従って、「ゲノム情報」とは、例えばヒトゲノム、マウスゲノム、ラットゲノムを指すことができる。データベース配列にさらなる長さを付加するために完全ゲノム情報又は部分ゲノム情報を使用して、ＲＮＡエフェクター分子を用いて修飾する可能性のある標的を増加させることができる。
「役割を果たす」という語句は、当業者に知られているか又は本明細書の他の個所に特定されている分子経路における転写産物又はタンパク質の任意の活性を指す。細胞活性のような経路は、以下に限定されないが、アポトーシス、細胞***、グリコシル化、増殖速度、細胞生産性、最大細胞密度、持続細胞生存性、アンモニア産生又は消費の速度、あるいは乳酸産生の速度を含む。
本明細書で使用する「バイオリアクター」とは、一般的に、宿主細胞が免疫原性作用物質を産生するように宿主細胞を増殖させ、保持するのに適した任意の反応容器、及びこのような免疫原性作用物質を回収するのに適した任意の反応容器を指す。本明細書に記載のバイオリアクターとしては、種々の大きさの細胞培養装置、例えば小培養フラスコ、Ｎｕｎｃ多層細胞工場、小さな高収量バイオリアクター（例えば、ＭｉｎｉＰｅｒｍ、ＩＮＴＥＧＲＡ−ＣＥＬＬｉｎｅ）、スピナーフラスコ、中空線維−ＷＡＶＥバッグ（Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｔａｇｅｌｓｗａｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び工業規模バイオリアクターが挙げられる。いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質は、免疫原性作用物質の製薬学的又は工業的生産に適した１Ｌ又はそれ以上の容量（例えば、少なくとも１Ｌ、少なくとも２Ｌ、少なくとも５Ｌ、少なくとも１０Ｌ、少なくとも２５Ｌ、少なくとも５０Ｌ、少なくとも１００Ｌ又はそれ以上の容量を含む）を有し、多くの場合ｐＨ、グルコース、乳酸、温度及び／又はその他のバイオプロセスパラメータを監視する手段を含む「大規模培養」バイオリアクターで生産される。一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも１Ｌの容量である。
一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも２Ｌの容量である。一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも５Ｌの容量である。一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも２５Ｌの容量である。一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも４０Ｌの容量である。一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも５０Ｌの容量である。一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも１００Ｌの容量である。
本明細書で使用する「宿主細胞」は、本明細書で定義するように、免疫原性作用物質の有用量の産生及び回収を可能にする条件下で細胞培養において増殖させ、保持することができる任意の細胞、細胞培養物、細胞バイオマス又は組織である。宿主細胞は、酵母、昆虫、両生類、魚類、爬虫類、鳥類、哺乳動物又はヒトから誘導できるし、あるいはハイブリドーマ細胞であることができる。宿主細胞は、未変性細胞又は細胞株、あるいは（例えば、免疫原性作用物質の産生を促進するために）遺伝子組換えされている細胞株であることができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、所定の条件、例えば血清無含有培地、細胞懸濁培養又付着細胞培養での増殖を可能にするために変性されている細胞株である。本明細書で使用する「ハムスター」はＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター）を指す。
哺乳動物宿主細胞は、免疫原性作用物質が哺乳動物組換えポリペプチドである場合、特に前記ポリペプチドが生物学的治療剤であるか又はヒトへの投与又はヒトによる消費を目的とする場合に好都合であり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、多数の組換えタンパク質の発現に使用される細胞株であるＣＨＯ細胞である。組換えタンパク質の発現に一般的に使用されるさらなる哺乳動物細胞としては、２９３ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ジャーカット細胞、ＮＳＯ細胞及びＨＵＶＥＣ細胞が挙げられる。
一実施形態において、宿主細胞はメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である。ＭＤＣＫ細胞はウイルス／ワクチン製造に関する当業者に日常的に使用されている。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、組換えタンパク質又はその他の免疫原性作用物質の産生を促進するために遺伝子組換えされているＣＨＯ細胞誘導体である。例えば、細胞の特定の遺伝子又は発現領域への組換えＤＮＡの安定した挿入、挿入されたＤＮＡの増幅、及び組換えタンパク質の高レベル発現を示す細胞の選択を可能にする種々のＣＨＯ細胞株が、開発されている。本明細書において提供される方法に有用なＣＨＯ細胞誘導体としては、以下に限定されないが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ Ｂ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞，及びＣＨＯ−ｈｌＦＮγ細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞において組換えタンパク質を発現させる方法は、当該技術において知られており、例えば米国特許第４，８１６，５６７号及び同第５，９８１，２１４号明細書に記載されている。
本明細書において提供される方法に有用なヒト細胞の例としては、細胞株２９３Ｔ（胎児腎臓）、７８６−０（腎臓）、Ａ４９８（腎臓）、Ａ５４９（肺胞基底上皮）、ＡＣＨＮ（腎臓）、ＢＴ−５４９（***）、ＢｘＰＣ−３（膵臓）、ＣＡＫＩ−１（腎臓）、Ｃａｐａｎ−１（膵臓）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（白血病）、ＣＯＬＯ２０５（結腸）、ＤＬＤ−１（結腸）、ＤＭＳ１１４（小細胞肺）、ＤＵ１４５（前立腺）、ＥＫＶＸ（非小細胞肺）、ＨＣＣ−２９９８（結腸）、ＨＣＴ−１５（結腸）、ＨＣＴ−１１６（結腸）、ＨＴ２９（結腸）、ＨＴ−１０８０（線維肉腫）、ＨＥＫ２９３（胎児腎臓）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）、ＨＬ−６０（ＴＢ）（白血病）、ＨＯＰ−６２（非小細胞肺）、ＨＯＰ−９２（非小細胞肺）、ＨＳ５７８Ｔ（***）、ＨＴ−２９（結腸腺癌）、ＩＧＲ−ＯＶ１（卵巣）、ＩＭＲ３２（神経芽細胞腫）、ジャーカット（Ｔリンパ球細胞）、Ｋ−５６２（白血病）、ＫＭ１２（結腸）、ＫＭ２０Ｌ２（結腸）、ＬＡＮ５（神経芽細胞腫）、ＬＮＣａｐ．ＦＧＣ（Ｃａｕｃａｓｉａｎ前立腺癌）、ＬＯＸ ＩＭＶＩ（黒色腫）、ＬＸＦＬ５２９（非小細胞肺）、Ｍ１４（黒色腫）、Ｍ１９−ＭＥＬ（黒色腫）、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ（黒色腫）、ＭＣＦｌＯＡ（***上皮）、ＭＣＦ７（乳腺）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（***上皮）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（***）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（***）、ＭＤＡ−Ｎ（***）、ＭＯＬＴ−４（白血病）、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ（卵巣）、ＮＣＩ−Ｈ２２６（非小細胞肺）、ＮＣＩ−Ｈ２３（非小細胞肺）、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（非小細胞肺）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（非小細胞肺）、ＮＣＩ−Ｈ５２２（非小細胞肺）、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣）、ＯＶＣＡＲ−４（卵巣）、ＯＶＣＡＲ−５（卵巣）、ＯＶＣＡＲ−８（卵巣）、Ｐ３８８（白血病）、Ｐ３８８／ＡＤＲ（白血病）、ＰＣ−３（前立腺）、ＰＥＲＣ６（登録商標）（Ｅ１形質転換胎生網膜）、ＲＰＭＩ−７９５１（黒色腫）、ＲＰＭＩ−８２２６（白血病）、ＲＸＦ３９３（腎臓）、ＲＸＦ−６３１（腎臓）、Ｓａｏｓ−２（骨）、ＳＦ−２６８（ＣＮＳ）、ＳＦ−２９５（ＣＮＳ）、ＳＦ−５３９（ＣＮＳ）、ＳＨＰ−７７（小細胞肺）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（神経芽細胞腫）、ＳＫ−ＢＲ３（***）、ＳＫ−ＭＥＬ−２（黒色腫）、ＳＫ−ＭＥＬ−５（黒色腫）、ＳＫ−ＭＥＬ−２８（黒色腫）、ＳＫ−ＯＶ−３（卵巣）、ＳＮ１２Ｋ１（腎臓）、ＳＮ１２Ｃ（腎臓）、ＳＮＢ−１９（ＣＮＳ）、ＳＮＢ−７５（ＣＮＳ）、ＳＮＢ−７８（ＣＮＳ）ＳＲ（白血病）、ＳＷ−６２０（結腸）、Ｔ−４７Ｄ（***）、ＴＨＰ−１（単細胞由来マクロファージ）、ＴＫ−１０（腎臓）、Ｕ８７（膠芽細胞種）、Ｕ２９３（腎臓）、Ｕ２５１（ＣＮＳ）、ＵＡＣＣ−２５７（黒色腫）、ＵＡＣＣ−６２（黒色腫）、ＵＯ−３１（腎臓）、Ｗ１３８（肺）及びＸＦ４９８（ＣＮＳ）が挙げられる。
本明細書において提供される方法に有用な非ヒト霊長類細胞株の例としては、細胞株サル腎（ＣＶＩ−７６）細胞、アフリカミドリザル腎（ＶＥＲＯ−７６）細胞、ミドリザル線維芽（ＣＯＳ−１）細胞、及びＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎（ＣＶＩ）細胞が挙げられる。さらなる哺乳動物細胞株が、当業者に知られており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）カタログ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に掲載されている。
本明細書において提供される方法に有用な齧歯類動物細胞株の他の例としては、細胞株ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞（例えば、ＢＨＫ２１、ＢＨＫ ＴＫ）、マウスセルトリ（ＴＭ４）細胞、バッファローラット肝（ＢＲＬ３Ａ）細胞、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ）細胞、ラット肝癌（ＨＴＣ）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞、ネズミハイブリドーマ（Ｓｐ２／０）、マウス胸腺腫（ＥＬ４）細胞、ネズミ胎児（ＮＩＨ／３Ｔ３、３Ｔ３ Ｌ１）細胞、ラット心筋（Ｈ９ｃ２）細胞、マウス筋芽（Ｃ２Ｃ１２）細胞及びマウス腎（ｍｉＭＣＤ−３）細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、多能性幹細胞又は前駆細胞である。本明細書において提供される方法に有用な多能性細胞の例としては、ネズミ胚性幹（ＥＳ−Ｄ３）細胞、ヒト臍帯静脈内皮（ＨｕＶＥＣ）細胞、ヒト臍帯動脈平滑筋（ＨｕＡＳＭＣ）細胞、ヒト分化幹（ＨＫＢ−Ｉ１）細胞、ヒト間葉幹（ｈＭＳＣ）細胞及び人工誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、植物細胞である。培養において容易に増殖する植物細胞の例としては、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（クレソン）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）中国イチイ（Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、イチイ（Ｔ．ｃｕｓｐｉｄａｔａ）、ヨーロッパイチイ（Ｔ．ｂａｃｃａｔａ）、タイヘイヨウイチイ（Ｔ．ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）及び南方イチイ（Ｔ．ｍａｉｒｅｉ）、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）（ナス科）、タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）、例えばタバコ細胞株、例えばＮＴ−１又はＢＹ−２（ＮＴ−１細胞は、ＡＴＣＣ、Ｎｏ．７４８４０から入手できる、米国特許第６，１４０，０７５号明細書も参照）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｕｌｅｎｔｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）及びクローバ（Ｍ．ｓａｔｉｖａ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種、チーク（Ｔｅｃｔｏｎａ ｇｒａｎｄｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ）種、クロチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ）、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）及びビチス・ガメイ（ブドウ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｉｕｓ ａｌｂａ）、アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）、ニレ（Ｕｌｍｕｓ）種、アキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ ｍｉｎｕｓ）、イボツヅラフジ（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）、ツルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ ｒｏｓｅａ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）種、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ニガキモドキ（Ｂｒｕｃｅａ ｊａｖａｎｉｃａ）、ドリティノプス（Ｄｏｒｉｔａｅｎｏｐｓｉｓ）属及びフェラノプシス（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ）属（ラン）、ホムロイイチゴ（Ｒｕｂｕｓ ｃｈａｍａｅｍｏｒｕｓ）、コーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ）、キウイ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）、ガマ（Ｔｙｐｈａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ）、インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）（ニーム）、キャッツクロー（Ｕｎｃａｒｉａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）及びキャッツクロー（Ｕ．ｇｕｉａｎｅｎｓｉｓ）、キキョウ（Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）、カイガンタバコ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ ｇｉｇａｎｔｅａ）、コツレッキア・バージニカ（Ｋｏｓｔｅｌｅｔｚｋｙａ ｖｉｒｇｉｎｉｃａ）（アオイ科植物）、リンゴ（Ｐｙｒｕｓ ｍａｌｕｓ）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、カンキツ（Ｃｉｔｒｕｓ）種、メキシカンオレンジ（Ｃｈｏｉｓｙａ ｔｅｒｎａｔａ）、トゲナシヌグラ（Ｇａｌｉｕｍ ｍｏｌｌｕｇｏ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ及びＤ．ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ステビア（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）、ハッショウマメ（Ｓｔｉｚｏｌｏｂｉｕｍ ｈａｓｓｊｏｏ）（スベリヒユ）、オオクサキビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、Ｒｕｄｇｅａ ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ、アメリカニンジン（Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ）、イトスギ〔モントレーイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）及びアリゾナイトスギ（Ｃ．ａｒｉｚｏｎｉｃａ）〕、ベチベルソウ（Ｖｅｔｉｖｅｒｉａ ｚｉｚａｎｉｏｉｄｅｓ）、インドニンジン（Ｗｉｔｈａｎｉａ ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）、ササゲ（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）、キダチミカンソウ（Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｒｕｒｉ） （トウダイグサ属）、インドクズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｔｕｂｅｒｏｓａ）及びクズ（Ｐ．ｌｏｂａｔａ）、シナカンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｅｃｈｉｎａｔａ）、ヨコマメヒ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、オオアザミ（Ｓｉｌｙｂｕｍ ｍａｒｉａｎｕｍ）、キンポウジュ（Ｃａｌｌｉｓｔｅｍｏｎ ｃｉｔｒｉｎｕｓ）、タネツケバナ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｃｈｒｙｓｏｃｈｌｏｒｕｓ）、コロニラ・バギナリス（Ｃｏｒｏｎｉｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、例えば細胞株３９ＲＡＲ（クラウンベッチ）、タンジン（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）、ギセキア・ファルナセオイデス（Ｇｉｓｅｋｉａ ｐｈａｒｎａｃｅｏｉｄｅｓ）、ヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｔａｔｕｌａ）及びシロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）並びにトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）種が挙げられる。
本明細書において提供される植物細胞培養は、植物細胞を形質転換する任意の特定の方法に限定されない。ＤＮＡを植物細胞に導入する方法は、当業者には周知である。例えば、米国特許出願公開第２０１０／０００９４４９号明細書参照。外来ＤＮＡを植物細胞中に送達させる基本的な方法、例えば化学的方法〔Ｇｒａｈａｍ＆ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，５４ Ｖｉｒｏｌ．，５３６−３９（１９７３）；Ｚａｔｌｏｕｋａｌら、６６０ Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１３６−５３（１９９２）〕；物理的方法、例えば微量注入法〔Ｃａｐｅｅｃｈｉ，２２ Ｃｅｌｌ．，４７９−８８（１９８０）〕、電気穿孔法〔Ｗｏｎｇ＆Ｎｅｕｍａｎｎ，１０７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｎ．，５８４−８７（１９８２）；Ｆｒｏｍｍら、８２ ＰＮＡＳ，５８２４−２８（１９８５）；米国特許第５，３８４，２５３号明細書〕及び「遺伝子銃」法〔Ｊｏｈｎｓｔｏｎ＆Ｔａｎｇ，４３ Ｍｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３５３−６５（１９９４）；Ｆｙｎａｎら、９０ ＰＮＡＳ，１１４７８−８２（１９９３）〕；ウイルス法〔Ｃｌａｐｐ，２０ Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．，１５５−６８（１９９３）；Ｌｕら、１７８ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０８９−９６（１９９３）；Ｅｇｌｉｔｉｓ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ，６ Ｂｉｏｔｅｃｈｓ．，６０８−１４（１９８８）；Ｅｇｌｉｔｉｓら、２４１ Ａｖｄ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１９−２７（１９８８）〕；及び受容体媒介法〔Ｃｕｒｉｅｌら、８８ ＰＮＡＳ，８８５０−５４（１９９１）；Ｃｕｒｉｅｌら、３ Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．，１４７−５４（１９９２）；Ｗａｇｎｅｒら、８９ ＰＮＡＳ，６０９９−１０３（１９９２）〕が、記載されている。遺伝子導入植物は、本明細書では、植物細胞培養物、植物細胞株、植物組織培養物、下等植物、単子葉植物細胞培養物、双子葉植物細胞培養物、又は形質転換植物細胞又はプロトプラストから誘導されるこれらの後代として定義され、前記形質転換植物のゲノムは、実験室技法によって導入され、同じ種の天然の非遺伝子導入植物細胞中に本来存在しない外来ＤＮＡを含有する。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真菌類、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パルトリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）又はピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、シゾサッカロミセス・ボンベ（Ｓｃｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓａｎｕｅｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）又はクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）である。例えば、Ｐｅｔｒａｎｏｖｉｃ＆Ｖｅｍｕｒｉ，１４４ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０４−１１（２００９）；Ｂｏｌｌｏｋら、３ Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９２−２０１（２００９）；Ｔａｋｅｇａｗａら、５３ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２７−３５（２００９）；Ｃｈｉｂａ＆Ａｋｅｂｏｓｈｉ，３２ Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，７８６−９５（２００９）参照。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞株〔ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のサナギ卵巣組織から誘導される〕；Ｈｉ−５〔イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）卵細胞ホモジネートから誘導される〕；又はＳ２細胞〔キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から誘導される〕である。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、懸濁培養での増殖に適している。懸濁適格宿主細胞は、一般的に単分散性であるか又は実質的な凝集なしにゆるい凝集物で増殖する。懸濁適格宿主細胞としては、順化又は操作なしで懸濁培養に適した細胞（例えば、造血細胞、リンパ系細胞）及び付着依存性細胞の修飾又は順化によって懸濁適格性にされている細胞（例えば、上皮細胞、線維芽細胞）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、付着培養において増殖し、保持される付着依存性細胞である。本明細書において提供される方法に有用なヒト付着細胞株の例としては、ヒト神経芽細胞腫（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＩＭＲ３２及びＬＡＮ５）細胞、ヒト子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞、ヒト胸部上皮（ＭＣＦｌＯＡ）細胞、ヒト胎児腎（２９３Ｔ）細胞、及びヒト乳癌（ＳＫ−ＢＲ３）細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、所定の条件下で、例えば血清無含有培地において、細胞懸濁培養において又は付着細胞培養において増殖を可能にするために変性されている細胞である。前記宿主細胞は、例えば、ヒトＮａｍａｌｗａ Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞（ＢＬｃｌ−ｋａｒ−Ｎａｍａｌｗａ）、ベビーハムスター腎線維芽細胞（ＢＨＫ）、ＣＨＯ細胞、ネズミ骨髄腫細胞（ＮＳ０、ＳＰ２／０）、ハイブリドーマ細胞、ヒト胎児腎細胞（２９３ＨＥＫ）、ヒト網膜由来細胞〔ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標Ｒ）細胞、米国特許第７，５５０，２８４号明細書〕、昆虫細胞株｛Ｓｆ９〔ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のサナギ卵巣組織から誘導される〕；又はＨｉ−５〔イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）卵細胞ホモジネートから誘導される〕；米国特許第７，０４１，５００号明細書も参照｝、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、初代マウス脳細胞又は組織、初代子牛リンパ細胞又は組織、初代サル腎細胞、孵化鶏卵、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、アカゲザル胎児肺細胞（ＦＲｈＬ−２）、ヒト胎児肺細胞（ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ、ＣＶ−１）、アカゲザル腎細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２）又は酵母細胞であることができる。組換えタンパク質の発現の一般的に使用される別の哺乳動物細胞株としては、以下に限定されないが、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ジャーカット細胞、及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）細胞が挙げられる。
宿主細胞は、未変性であることができるし又は遺伝子組換えすることができる（例えば、遺伝子導入動物由来の細胞）。例えば、遺伝子導入鶏卵由来のＣＥＦは、ＩＦＮ経路に不可欠な一つ又はそれ以上の遺伝子を有することができ、例えばインターフェロン受容体、ＳＴＡＴ１などは、破壊された、すなわちトランスジェニック「ノックアウト」である。例えば、Ｓａｎｇ，１２ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，４１５（１９９４）；Ｐｅｒｒｙら、２ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，１２５（１９９３）；Ｓｔｅｒｎ，２１２ Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９５−２０６（１９９６）；Ｓｈｕｍａｎ，４７ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，８９７（１９９１）参照。また、宿主細胞は、所定の条件下で、例えば３０℃でのインキュベーション下で増殖を可能にするために変性させることができる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、懸濁培養物での増殖に適している。懸濁適格宿主細胞は、一般的に単分散性であるか又は実質的な凝集なしにゆるい凝集物で増殖する。懸濁適格宿主細胞としては、順化又は操作なしで懸濁培養に適した細胞（例えば、造血細胞、リンパ系細胞）及び付着依存性細胞の修飾又は順化によって懸濁適格性にされている細胞（例えば、上皮細胞、線維芽細胞）が挙げられる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、付着培養において増殖し、保持される付着依存性細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、卵、例えば魚類、両生類又はトリの卵に含有される。
「免疫原性作用物質を宿主細胞から単離する」とは、免疫原性作用物質を、宿主細胞物質、例えば宿主細胞、宿主細胞培養培地、宿主細胞バイオマス又は宿主組織から分離する少なくとも一つの工程を意味する。従って、宿主細胞培養培地に分泌され、最終的に収穫される免疫原性作用物質を単離することは、「宿主細胞から単離する」という語句に包含される。有用な量とは、例えばアリコート又は試料を含め、標的遺伝子発現の調節を監視することを含め産生について選別するか又は産生を監視するのに使用される量を包含する。
本発明は、抗原、抗原性ポリペプチド、代謝産物、中間体、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、ウイルス粒子、欠陥ウイルス、生きた弱毒化ウイルス、殺したウイルス、またはワクチンを含む免疫原性作用物質の生産を提供する。免疫原性作用物質は、限定されるものではないが、ポリペプチド、糖タンパク質、および生きている生物またはそれらの産物から合成され、および予防剤または治療剤として用いられるワクチンのような「バイオロジック」を含む、宿主細胞によって生産され、かつ有用な量にて回収することができるいずれの免疫原性物質も含むことができる。かくして、免疫原性作用物質は、生物治療剤、ワクチン、研究または診断試薬等を含む広い範囲の適用で用いることができる。
いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質はポリペプチドである。該ポリペプチドは組換えポリペプチド、または宿主細胞にとって内因性のポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは糖タンパク質であって、宿主細胞は哺乳動物細胞である。本明細書中で提供される方法に従って生産することができるポリペプチドの非限定的例は、受容体、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、酵素、成長因子、成長因子受容体、抗体、抗体誘導体および他の免疫エフェクター、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン、インテグリン、可溶性主要組織適合性複合体抗原、結合性タンパク質、転写因子、翻訳因子、癌タンパク質またはプロト−癌タンパク質、筋肉タンパク質、骨髄タンパク質、神経活性タンパク質、腫瘍成長サプレッサー、構造タンパク質、および血液タンパク質（例えば、トロンビン、血清アルブミン第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子等）を含み、免疫応答がそれに対して望まれる。
本明細書中で用いるように、ポリペプチドは、脱アミド化、グリコシル化等のような、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質または他のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質は異常にグリコシル化されたタンパク質である。例えば、多くの癌抗原は特に、フコシル残基を含んで、異常にグリコシル化されていることが知られている。Ｍｏｒｉｗａｋｉ ＆ Ｍｉｙｏｓｈｉ，２ Ｗｏｒｌｄ Ｊ． Ｈｅｐａｒｏｌ．，１５１−６１（２０１０）。かくして、１つの実施形態において、癌抗原の生産は、（例えば、配列番号：２０９８４１〜２１０２２７よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって宿主ＣＨＯ細胞を接触させることによって）ＦＵＴ8のようなフコシルトランスフェラーゼをコードする標的遺伝子の発現を変調することによって増強される。特別な実施形態において、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を、ヌクレオチド配列の少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９のヌクレオチドまたはそれ以上）を含む１以上のＲＮＡエフェクター分子と接触させて、生物学的産物のフコシル化を変調することによって、フコシル化された免疫原（例えば、組換え癌抗原）の生産を増強させる方法が提供される。例えば、該細胞を、配列番号：３１５２７１４〜３１５２７５３の１以上のＲＮＡエフェクター分子と接触させることができ、ここに、該接触はＣＨＯ細胞フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）の発現を変調する。
１つの実施形態において、免疫原性作用物質の生産は、宿主細胞を、ＦＵＴ８、ＴＳＴＡ３、およびＧＭＤＳよりなる群から選択される標的遺伝子に対する少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子と接触させて、例えば、フコシル化を変調することによって増強される。１つの実施形態において、ＦＵＴ８、ＴＳＴＡ３、およびＧＭＤＳよりなる群から選択される標的遺伝子に対する少なくとも２つのＲＮＡエフェクター分子を用いる。これらの実施形態の１つの態様において、宿主細胞は、さらに、シアリルトランスフェラーゼ、例えば、ＣＨＯ細胞ＳＴ３のβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（配列番号：２０８８）、ＳＴ３のβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（配列番号：２１６７）、ＳＴ３のβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３（配列番号：３４１１）、ＳＴ３のβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ５（配列番号：３４８４）、ＳＴ６の（α−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−β−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ６（配列番号：４１８６）またはＳＴ３のβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２（配列番号：４３１９）をコードする遺伝子を標的化するＲＮＡエフェクター分子と接触することができる。シアリルトランスフェラーゼの標的化は、本明細書中でさらに議論するように、宿主細胞膜−結合シアル酸ウイルス受容体を改変する関係でやはり有利であり得る。
１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ＣＨＯ細胞ＳＴ３のβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（配列番号：６８１１０５〜６８１４５４）、ＳＴ３のβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（配列番号：７０７５３５〜７０７８７０）、ＳＴ３のβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３（配列番号：１１３１１２３〜１１３１４４５）、ＳＴ３のβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ５（配列番号：１１５５３２４〜１１５５７１１）、ＳＴ６の（α−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−β−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ６（配列番号：１３９１０７９〜１３９１４４９）、またはＳＴ３のβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２（配列番号：１４３５９８９〜１４３６３１７）よりなる群から選択される配列を有するｓｉＲＮＡである。
他の実施形態において、免疫原性作用物質は、免疫原性ウイルス、細菌、アレルゲン、真菌、寄生虫、原生動物、または発現ベクターに由来する組換えタンパク質である。
ウイルスベースのワクチンを生産するための別の例のアプローチは、複製が可能であるが、病原性ではなく、従って、免疫性の持続を供し、かつ病気に対するより大きな保護を与える弱毒化生ウイルスワクチンの使用を含む。弱毒化ウイルスを生産するための慣用的な方法は、その多くが温度感受性である宿主範囲突然変異体の偶然の単離を含み、例えば、ウイルスは非自然宿主を介して継代され、免疫原性であるが病原性ではない子孫ウイルスを選択する。有効なワクチンの生産は、宿主系から高い収率で生産された大量のウイルスの成長を必要とする。ウイルスの異なる型は、許容できる収率を得るために異なる成長条件を必要とする。従って、ウイルスがその中で成長する宿主は、非常に重要なものである。ウイルス型の機能として、ウイルスは孵化卵、初代組織培養細胞、または樹立された細胞株において成長させることができる。
かくして、本発明のいくつかの実施形態において、免疫原性作用物質はウイルス産物、例えば、天然に生じるウイルスの株、変異株または突然変異体；（例えば、変異原への暴露、反復された継代および／または非許容性宿主における継代によって生じた）突然変異誘発ウイルス、（セグメント化されたウイルスゲノムの場合における）再集合体、および／または所望の表現型を有する（例えば、「逆遺伝子学」技術を用いて）遺伝子工学的に作成されたウイルスである。これらの実施形態のウイルスは弱毒化することができ；すなわち、それらは感染性であって、イン・ビボで複製することができるが、低い力価を生じ、その結果、一般的には非病原性である臨界下レベルの感染をもたらす。
加えて、本発明の免疫原性作用物質は、本発明の組成物、細胞および／または方法を用い、例えば、ＲＮＡエフェクター分子を用い、それに対して免疫原性作用物質の生産を増強することができる細胞内寄生体に由来することができる。例えば、本発明の代替実施形態は、真核生物細胞における細菌免疫原の生産を提供する。これらの細菌はＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｓｐを含む。本発明のさらなる実施形態は、真核生物細胞における原生動物免疫原の生産を提供する。これらの原生動物はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｔｒｉｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、およびＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉを含む。
いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質の生産の増強は、培養における細胞の生存性を改善することによって達成される。本明細書中で用いるように、用語「細胞生存性の改善」とは、当該処理を行わないときの細胞密度またはアポトーシスレベルと比較した、ＲＮＡエフェクター分子の存在下での少なくとも１０％の（例えば、トリパンブルー排除アッセイによって評価した）細胞密度の増加、または（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを用いて評価した）アポトーシスの減少をいう。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子での処理に応答しての細胞密度の増加またはアポトーシスの減少は、未処理細胞と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％でさえある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子での処理に応答しての細胞密度の増加は、ＲＮＡエフェクター分子の不存在下における細胞密度よりも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれよりも高い。
本明細書中で用いる「バイオプロセシング」は、典型的には、以下の：（ａ）（例えば、ウイルス、または組換え抗原性ポリペプチドをコードする導入遺伝子のいずれかを含む）哺乳動物宿主細胞を、細胞培養基を含有するシード培養容器に接種し、該細胞を増殖させて、最小閾値交差−シーディング密度に到達させる工程と；（ｂ）該増殖させたシード培養細胞、またはその一部を大規模な培養リアクターに移す工程と；（ｃ）細胞が所定の密度に到達するまで、迅速な成長および細胞***を可能とする条件下で大規模培養を増殖させる工程と；（ｄ）継続した細胞成長および／または宿主細胞***に不都合であって、抗原性タンパク質またはウイルス粒子の発現を容易とする条件下で培養を維持する工程とを含む、（例えば、哺乳動物宿主細胞における）細胞培養における免疫原性作用物質（例えば、組換え抗原性ポリペプチド）の産業規模の生産のための例示的プロセスである。
前述方法の工程（ａ）〜（ｃ）は、一般に、「成長」期を含み、他方、工程（ｄ）は、一般に、「生産」期を含む。いくつかの実施形態において、供給されたバッチ培養または連続的細胞培養条件は、成長期における宿主細胞の成長および***を増強させ、および細胞の成長および／または***に不都合であって、生産期の間に免疫原性作用物質の発現を容易とするようにしつらえられる。例えば、いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質は約１ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌまたはそれより高いレベルで発現される。細胞の成長および／または***の速度は、温度、ｐＨ、溶解酸素（ｄＯ２）等のような培養条件を変化させることによって変調することができる。例えば、成長期についての適当な条件は、約ｐＨ６．５およびｐＨ７．５の間のｐＨ、約３０℃〜３８℃の間の温度、および約５％〜９０％飽和の間のｄＯ２を含むことができる。いくつかの実施形態において、異種タンパク質の発現は、より低い培養温度への温度シフト（例えば、約３７℃から約３０℃）を誘導し、細胞培養基中の溶質の濃度を増加させ、またはトキシン（例えば、酪酸ナトリウム）を細胞培養基に加えることによって、生産期において増強させることができる。いくつかの実施形態において、異種タンパク質の発現は、約２８℃への温度シフトを誘導して、例えば、細胞***が起こらないときにおけるタンパク質発現を増加させることによって、生産期において増強させることができる（例えば、実施例１１参照）。生産期の間に成長および／またはタンパク質発現を増強させるための種々のさらなるプロトコルおよび条件は当分野で知られている。
宿主細胞は、宿主細胞および培養基が最初に培養リアクターに供給され、さらなる培養栄養素が細胞培養プロセスを通じて連続的にまたは少しずつ供給される供給バッチ培養プロセスにおいて攪拌されたタンク培養リアクターシステムで培養することができる。供給バッチ培養プロセスは半連続的とすることができ、そこでは、周期的に、（細胞および培地を含む）全培養が除去され、新鮮な培地によって交換される。別法として、単純なバッチ培養プロセスを用いることができ、そこでは、（細胞および培養基を含む）細胞培養のための全ての成分が該プロセスの最初に培養容器に供給される。連続的灌流プロセスを用いることもでき、そこでは、細胞は、例えば、濾過、カプセル化、マイクロキャリアへの係留等によって培養に固定化され、および上清は培養中の容器から連続的に取り出され、プロセスの間に新鮮な培地と交換される。
１つの実施形態において、生産期の後に、免疫原性作用物質は、当分野で公知の種々の方法を用いて細胞培養基から回収される。例えば、分泌された異種タンパク質の回収は、典型的には、例えば、遠心または濾過によって培地からの宿主細胞およびデブリスの除去を含む。いくつかの場合において、特に、免疫原性作用物質がタンパク質であって、分泌されないならば、タンパク質の回収は、例えば、機械的剪断、浸透圧ショック、または酵素処理によって、培養された宿主細胞を溶解させて、細胞の内容物をホモジネートに放出させることによって行うこともできる。次いで、タンパク質は、分画遠心、濾過、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動手法（例えば、分取等電点電気泳動（ＩＥＦ））、硫酸アンモニウム沈殿等によって、細胞下断片、不溶性材料等から分離することができる。特定のタイプのタンパク質を回収し、精製する手法は当分野で知られている。
いくつかの実施形態において、細胞を無血清培地に適合させ、粘着性細胞を懸濁液中での細胞成長に適合させるのが望ましい。いくつかの実施形態において、細胞を適合させて、無血清培地中で成長させる。本発明の１つの態様において、細胞の適合は、可塑性の制御に関与する遺伝子を標的化するＲＮＡエフェクター分子を用いることにより細胞の可塑性を増加させることによって促進される。例えば、細胞周期レギュレーター（例えば、サイクリンキナーゼおよび本明細書中に記載された他のもの）（例えば、例としてのＣＨＯサイクリンキナーゼ標的遺伝子および例示的ｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）を確認する表１３参照）；ヒストンおよびＤＮＡメチラーゼ（例としてのＣＨＯ標的遺伝子および例示的ｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）を確認する表１〜２参照）；ｐ５３（例としてのＣＨＯ標的遺伝子および例示的ｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）を確認する表１３参照）；およびストレス応答タンパク質、例えば、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ９０等）（例としてのＣＨＯ標的遺伝子および例示的ｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）を確認する表１５参照）等を標的化するＲＮＡエフェクターを用いることができる。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクターは、配列番号：４９５７を含む形質転換関連タンパク質ｐ５３（ＣＨＯ４９５７．１）をコードする転写体を標的化する。１つの実施形態において、ｐ５３を標的化するＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：１６４９８５７〜１６５０１５７よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含む。
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 用語「システム」、「コンピューティングデバイス」、および「コンピュータベースのシステム」とは、本発明の情報を分析するのに用いられるコンピュータハードウェア、関連ソフトウェアおよびデータ記憶装置をいう。１つの実施形態において、本発明のコンピュータベースのシステムは、１以上の中央処理ユニット（例えば、ＣＰＵ、ＰＡＬ、ＰＬＡ、ＰＧＡ）、入力手段（例えば、キーボード、カーソル制御デバイス、タッチスクリーン）、出力手段（例えば、コンピュータディスプレイ、プリンター）、およびデータ記憶装置（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、揮発性および非揮発性メモリデバイス、ハード・ディスク・ドライブ、ネットワーク結合記憶、光学記憶装置、磁気記憶装置、固体状態記憶装置）を含む。このように、いずれの便宜なコンピュータベースのシステムも本発明で使用することができる。さらに、コンピューティングデバイスは計算ハードウェアおよび関連ソフトウェアまたはファームウェアの組合せに基づく埋め込みシステムを含むことができる。
「プロセッサ」は、プログラム制御下で機能を実行することができるいずれのハードウェアおよび／または関連ソフトウェアの組合せも含む。例えば、本明細書中におけるいずれのプロセッサも、埋め込みシステムの形態で利用可能なようなプログラム可能デジタルマイクロプロセッサ、プログラム可能コントローラ−、メインフレーム、サーバー、またはパーソナルコンピュータ（デスクトップまたはポータブル）であり得る。プロセッサが選択的にプログラム可能な場合、適当なプログラム、ソフトウェアまたはファームウェアはプロセッサに対して離れたロケーションから連絡可能であるか、あるいは（磁気的、光学的または固体状態デバイスに基づくかを問わず、ポータブルまたは固定されたコンピュータ読取可能記憶媒体のような）コンピュータプログラム産物に既に記憶されている。例えば、磁気媒体または光学ディスクはプログラムまたは操作指示書を記憶することができ、読み取って、その対応する局において各プロセッサに移すことができる。
本明細書中で用いられる「コンピュータ読取可能媒体」とは、指令および／またはデータを実行および／または処理のためのコンピュータに供するのに参画するいずれの記憶または伝達媒体もいう。記憶媒体の例は、デバイスがコンピュータに対して内部または外部であるか否かを問わず、フロッピーディスク、磁気媒体（テープ、ディスク）、ＵＢＳ、光学媒体（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ−Ｒａｙ）、固体状態媒体、ハード・ディスク・ドライブＲＡＭ、ＲＯＭまたは集積回路、光磁気ディスク、またはＰＣＭＣＩＡカード等のようなコンピュータ読取可能カードを含む。情報を含むファイルはコンピュータ読取可能媒体に「記憶」することができ、そこでは、「記憶する」は、それが、コンピュータによって後日にアクセス可能であって検索可能であるような情報の記録を意味する。
コンピュータ読取可能媒体に関して、「永久的メモリ」または「非揮発性メモリ」とは、データ記憶媒体に永久的に記憶されたメモリをいう。永久的メモリは、コンピュータまたはプロセッサへの電気的供給の停止によって消されない。コンピュータハード−ドライブ、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピーディスク、およびＤＶＤは、全て、永久的メモリの例である。ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）は、非永久的または揮発性メモリの例である。
コンピュータ読取可能媒体へデータ、プログラミングまたは他の情報を「記録し」または「記憶する」とは、いずれかの便宜な方法を用いて情報を記憶するためのプロセスをいう。記憶された情報にアクセスするのに用いられる手段に基づいて、いずれの便宜なデータ記憶構造を選択することもできる。
「メモリ」または「メモリユニット」とは、プロセッサによる引き続いての検索のために情報を記憶することができ、かつ（ハードディスク、フロッピーディスク、ＣＤまたはＤＶＤのような）磁気的または光学的デバイス、または（揮発性または非揮発性ＲＡＭのような）固体状態メモリデバイスを含むことができるいずれのデバイスもいう。メモリまたはメモリユニットは、同一または異なるタイプの１を超える物理的メモリデバイスを有することができる（例えば、メモリは、多数のハードドライブまたは多数の固体状態メモリデバイス、あるいはハードドライブおよび固体状態メモリデバイスのいくつかの組合せのような多数のメモリデバイスを有することができる）。
本出願は、核酸配列についての公知の名称を用い、種々の遺伝子、転写体、タンパク質等を記載する。特定の配列識別子がそのような名称に相互参照していない程度で、当業者は公知の手段によって容易にそのようにすることができる。例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄｓ．ｏｒｇのような多数のサーチ可能なサイト（全ての公知であって予測されるヒト遺伝子についての簡便なゲノム、トランスクリプトーム、遺伝子的、プロテオミック、機能的および病気関連情報を提供するヒト遺伝子の共同サーチ可能集積データベース；クラウン・ヒト・ゲノム・センター、分子遺伝子学の部門、ｔｈｅ Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅで開発されたデータベース）、およびそのようなサイトの基礎を形成する刊行物がある。該名称を容易に用いて、そのような配列相互参照を用い、配列および本明細書中で用いる配列番号を突き止めることができる。同様に、少なくとも１５の核酸の相補的配列を探すことによって、そのような遺伝子に対する対応するｓｉＲＮＡを同定する。
明細書を通じて、いくつかの場合において、本発明者らは、遺伝子略語または標的遺伝子の別名、およびその遺伝子についての対応するｓｉＲＮＡの配列番号を与えた。いくつかの場合において、本発明者らは、標的遺伝子の遺伝子フルネーム、標的遺伝子についての対応する配列番号（例えば、転写体の配列）、ならびに標的遺伝子に対して向けられた例としてのｓｉＲＮＡの配列を与えた。本発明の種々の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号によって本明細書中で確認されるｓｉＲＮＡ配列のいずれかのｓｉＲＮＡヌクレオチド配列の少なくとも１６の連続ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである。例えば、表１〜１６、２１〜２５、２７〜３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５０、５１〜６１、６４、６５および６６参照。
配列番号によって確認されるｓｉＲＮＡは、しばしば、例えば、配列番号：２４８００１８〜２４８０３６２から、配列番号の範囲内にここでは参照される。該範囲は全ての配列番号：該範囲内、例えば、配列番号：２４８００１８、配列番号：２４８００１９、配列番号：２４８００２０等、配列番号：２４８０３６２への全ての途中を含む。
ＩＩ バイオプロセシングの増強
本発明は、本明細書中に記載されたＲＮＡエフェクター分子を用いて免疫原性作用物質の生産を増強させる方法を提供する。該方法は、一般に、細胞を、その一部が標的細胞に相補的なＲＮＡエフェクター分子と接触させ、次いで、培養（例えば、大規模な培養リアクター）における該細胞を、標的遺伝子の発現を変調するのに十分な時間の間維持し、ここに、該変調は該細胞からの免疫原性作用物質の生産を増強させ、次いで、該細胞から免疫原性作用物質を単離することを含む。ＲＮＡエフェクター分子は、該細胞を、免疫原性作用物質の生産を可能とする条件下で維持して、例えば、標的遺伝子の一過的変調を供し、それにより、免疫原の発現を増強させるのに用いられる細胞培養基に加えることができる。
当業者に知られているように、脂質ポリヌクレオチドキャリアを用いるｓｉＲＮＡのリポソーム媒介送達は、研究適用において共通して用いられる。しかしながら、ＰＣＴ公開ＷＯ ２００９／０１２１７３に記載されているように、脂質ポリヌクレオチドキャリア、例えば、共通のリポソームトランスフェクション試薬の使用は、タンパク質のバイオプロセシングで用いられる場合に有害であることが判明している。ポリヌクレオチドキャリアは、それらが、産業的レベルに所望の免疫原性作用物質を生産する宿主細胞の能力を損なうような毒性のため、宿主細胞に対して毒性であると報告されている。加えて、ポリヌクレオチドキャリアは、宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞の表現型の有害かつ望まない変化を引き起こし、注目する免疫原性作用物質を生産する宿主細胞の能力を危うくすることが観察されている。従って、当業者であれば、そのようなポリヌクレオチドキャリアの使用は所望のタンパク質を生産する細胞の能力を妨げるであろうと予測するであろう。
驚くべきことに、本明細書中で記載されたように、ＲＮＡエフェクター分子（例えば、標的化ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＬＤＨ）は、細胞に対する有害な効果無くして、大規模な培養（例えば、１Ｌおよび４０Ｌ）におけるバイオプロセシング手法の間にポリヌクレオチドキャリア（例えば、脂質処方媒介送達）を用いることによって培養における宿主細胞まで一過的に送達することができ、例えば、細胞生存性および密度は維持される。かくして、細胞が培養（例えば、懸濁培養）中にある場合に、細胞におけるＲＮＡエフェクター摂取を容易とするために脂質試薬を用い、免疫原性作用物質の大規模な生産を産業規模で行うことができ、例えば、タンパク質の生産を増加させる遺伝子の一過的変調がもたらされる。しかしながら、本発明の実施形態は、脂質処方媒介送達によるＲＮＡエフェクター分子の送達に限定されないことは理解されるべきである。
１つの実施形態において、免疫原性作用物質の生産は、生産期の間に培養された細胞を本明細書中で提供されたＲＮＡエフェクター分子と接触させて、タンパク質発現、翻訳後修飾、折畳み、分泌、および／または免疫原性作用物質の生産および／または回収に関連する他のプロレスに影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を変調することによって増強される。さらなる実施形態において、免疫原性作用物質の生産は、培養された細胞を、生産期の間に細胞の成長および／または細胞の***を阻害するＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって増強される。
いくつかの実施形態において、培養された宿主細胞における免疫原性作用物質の生産は、細胞を、汚染ウイルスのタンパク質の発現を変調するＲＮＡエフェクター分子と接触させ、かくして、宿主細胞における汚染物の感染性および／またはウイルス負荷を低下させることによって増強される。さらなる実施形態において、培養された宿主細胞における免疫原性作用物質の生産は、細胞を、ウイルス感染に関与する宿主細胞タンパク質の発現を変調するＲＮＡエフェクター分子、例えば、細胞膜リガンド、またはウイルス再生産と接触させ、かくして、宿主細胞における汚染ウイルスの感染性および／または負荷を低下させることによって増強される。
いくつかの実施形態において、変調で有用な宿主細胞標的遺伝子は、以下の表１に記載されたものを含む。
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いくつかの実施形態において、標的遺伝子の変調に際しての免疫原性作用物質の生産の増強は、細胞密度、ｐＨ、酸素レベル、グルコースレベル、乳酸レベル、温度、およびタンパク質生産よりなる群から選択されるパラメータのような１以上の測定可能なバイオプロセスパラメータをモニターすることによって検出される。タンパク質の生産は、特定の生産性（ＳＰ）（溶液中における、異種的に発現されたポリペプチドのような産物の濃度）として測定することができ、ｍｇ／Ｌまたはｇ／Ｌとして表すことができ；別法として、特定の生産性はｐｇ／細胞／日として表すことができる。ＳＰの増加とは、（例えば、ＲＮＡエフェクター分子で処理されていない対照と比較した場合の）条件の２つの規定された組下で生産された産物の濃度の絶対的または相対的増加をいうことができる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子の変調に際しての、免疫原性作用物質の生産の増強は、細胞密度、培地のｐＨ、酸素レベル、グルコースレベル、乳酸のレベル、温度、ウイルスタンパク質またはウイルス粒子生産のような１以上の測定可能な培養プロセスパラメータをモニターすることによって検出される。例えば、タンパク質の生産は特定の生産性（ＳＰ）（溶液中の産物の濃度）として測定することができ、ｍｇ／Ｌまたはｇ／Ｌとして表すことができ；別法として、具体的生産性はｐｇ／細胞／日として表すことができる。ＳＰの増加とは、条件の２つの規定された組下で生産された免疫原性作用物質の濃度の絶対的または相対的増加をいうことができる。別法として、ウイルス粒子産物は、ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍＬ）として測定して、周知のプラークアッセイによって滴定することができる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター組成物は２以上のＲＮＡエフェクター分子を含み、例えば、２、３、４またはそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含む。種々の実施形態において、２以上のＲＮＡエフェクター分子は、同一の標的遺伝子および／または１以上の追加の標的遺伝子の発現を変調することができる。有利には、多数のＲＮＡエフェクター分子を含むある種の組成物は、個々のＲＮＡエフェクター分子を含む別々の組成物よりも、免疫原性作用物質の生産、またはそのような生産の１以上の態様を増強させる際により効果的である。
他の実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を細胞培養と接触させ、１以上の標的遺伝子の変調を可能とする。１つの実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子の少なくとも１つは、グルタミナーゼ、グルタミンデヒドロゲナーゼ、またはＬＤＨの発現を変調するＲＮＡエフェクター分子である。別の実施形態において、ＢａｘおよびＢａｋを標的化するＲＮＡエフェクター分子は、免疫原性作用物質の生産の間に細胞培養に共投与され、それは、所望により、少なくとも１つのさらなるＲＮＡエフェクター分子または剤を含有することができる。別の実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を培養における細胞と接触させ、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＬＤＨ発現の変調を可能とする。別の実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を培養における細胞と接触させて、ＢａｘおよびＢａｋ、ならびにグルタミナーゼおよび／またはグルタミンデヒドロゲナーゼの発現の変調を可能とする。
複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を用いて、１以上の標的遺伝子の発現を変調する場合、該複数のＲＮＡエフェクター分子は細胞と同時にまたは別々に接触させることができる。加えて、各ＲＮＡエフェクター分子はそれ自身の投薬計画を有することができる。例えば、複数のＲＮＡエフェクター分子を含む組成物を調製することができ、これを細胞と接触させる。別法として、１つのＲＮＡエフェクター分子をある時点で細胞培養に投与することができる。このように、特定のＲＮＡエフェクター分子の投与の頻度を変化させることによって、各標的遺伝子で望まれる平均パーセント阻害を容易にしつらえることができる。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の強力な阻害（例えば、＞８０%阻害）は、免疫原性作用物質の生産を有意に改善するのに常には必要でなく、いくつかの条件下では、いくつかの残存ＬＤＨ活性を有するのが好ましいであろう。かくして、細胞を、他のＲＮＡエフェクター分子についての投与よりもより低い頻度にて（例えば、しばしば未満）またはより少ない投与にて（例えば、ＩＣ５０を超えるより低い複数回）ＬＤＨを標的化するＲＮＡエフェクター分子と接触させることが望まれるであろう。細胞を各ＲＮＡエフェクター分子と別々に接触させると、標的遺伝子変調の有効性を低下させることができるＲＮＡエフェクター分子の間の相互作用をやはり妨げることができる。容易に用いるために、かつ潜在的汚染を妨げるためには、異なるＲＮＡエフェクター分子のカクテルを投与し、それにより、必要な容量の数を低下させ、細胞または細胞培養に汚染物を導入するチャンスを最小化させるのが好ましいであろう。
いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質の生産は、成長期の間に培養された細胞を本明細書中で提供されたＲＮＡエフェクター分子と接触させ、細胞の成長、細胞の***、細胞の生存性、アポトーシス、栄養素の取扱い、および／または細胞の成長および／または***に関連する他の特性に影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を変調することによって増強される。さらなる実施形態において、異種タンパク質の生産は、成長期の間に培養された細胞を、異種タンパク質の発現を一過的に阻害するＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって増強される。
なおさらなる実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子による標的遺伝子の発現の変調（例えば、阻害）は、細胞を第二のＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって緩和することができ、ここに、第二のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部は、宿主細胞においてＲＮＡｉを媒介するタンパク質をコードする標的遺伝子に対して相補的である。例えば、標的遺伝子の発現の変調は、細胞を、アルゴノートタンパク質（例えば、アルゴノート−２）の発現、または細胞のＲＮＡｉ経路の他の成分の発現を阻害するＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって緩和することができる。１つの実施形態において、免疫原性作用物質は組換えタンパク質であって、産物の発現は、細胞を、免疫原性作用物質をコードする導入遺伝子に対して標的化された第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって一過的に阻害される。次いで、免疫原性作用物質の発現の阻害は、宿主細胞を、細胞のＲＮＡｉ経路のタンパク質をコードする遺伝子に対して標的化された第二のＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって緩和される。
宿主細胞の免疫応答
さらなる実施形態において、宿主細胞における免疫原性作用物質の生産は、免疫原性作用物質の感染性、負荷、および／または生産が増加するように、微生物感染または複製に関与する宿主細胞タンパク質の発現を変調するＲＮＡエフェクター分子を導入することによってさらに増強される。宿主細胞の免疫応答の変調は、該免疫応答を変調することにそれ自体が関与するある種の免疫原性作用物質（例えば、インフルエンザ等）の生産でやはり有益であり得る。
例えば、数種類のヒト、哺乳動物および鳥類ウイルスは、（例えば、最終的にはワクチン生産のために）ウイルスの生産または異種タンパク質発現のいずれかのために細胞に導入され、および／または細胞中で培養される。感染またはトランスフェクションの結果、生きたウイルス粒子のような免疫原性作用物質が蓄積され、これは、適当なインキュベーション時間の後に細胞または細胞培地いずれかから収集することができる。例えば、ワクチン生産の標準的方法は、細胞を培養し、生きたウイルス（例えば、ロタウイルス、インフルエンザ、黄熱病）で感染させ、インキュベーションし、細胞または細胞培地を収穫し、下流プロセシングを行い、充填および仕上げを行うことよりなる。古典的な不活化インフルエンザウイルスでは、この収穫された免疫原性作用物質の生成、不活化、および安定化により、ワクチン産物が得られ、この技術は当分野で周知である。
組換えＤＮＡ技術および遺伝子工学技術は、理論的には、弱毒化ウイルスの生産に対する優れたアプローチを提供することができる。なぜならば、特異的な突然変異がウイルスゲノムに意図的に作成されるからである。しかしながら、ウイルスの弱毒化に必要な遺伝子改変は常には予測できない。一般に、ウイルスワクチンを作成するために組換えＤＮＡ技術を用いる試みは、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスのような組換えウイルスベクターにおいて発現された、免疫応答に関与する病原体のタンパク質サブユニットのみを含有するサブユニットワクチンの生産に向けられてきた。より最近では組換えＤＮＡ技術は、ヘルペスウイルス欠失突然変異体、または天然で見出された弱毒化ウイルスまたは公知の宿主範囲突然変異体を模倣するポリオウイルスを生産するのに利用されてきた。
宿主細胞において作られた、弱毒化生インフルエンザウイルスまたは免疫変調ポリペプチドのような免疫原性作用物質の収率は、宿主細胞の免疫応答、例えば、そこでウイルスまたはウイルスベクターが複製される宿主細胞のインターフェロン応答によって悪影響を受けかねない。加えて、感染された宿主細胞は、ウイルス収率が最大化される前にアポトーシス状態となり得る。かくして、これらの弱毒化ウイルスが免疫原性であって、非病原性であるが、それらが、しばしば、ワクチンを作成する目的では慣用的な細胞基板において増殖するのは困難である。よって、本発明のいくつかの実施形態は、ＲＮＡエフェクター分子を用いて、有害な宿主細胞応答の発現を変調させて、従って、収率を増大させる組成物および方法を提供する。例えば、本発明のいくつかの実施形態は、ウイルスまたはベクター投与に先立って、その間に、またはその後に細胞をＲＮＡｉベースの産物ｓｉＲＮＡと接触させて、産物の収穫の収率および品質を危うくする細胞および抗ウイルスプロセスを阻害することに関する。
免疫原性作用物質の製造のための細胞ベースのバイオプロセスの使用は、いくつかの実施形態において、ウイルス感染に対する宿主細胞の反応に影響する標的遺伝子の発現を変調することによって増強される。このアプローチは、免疫原性作用物質がウイルスまたはそうでなければ免疫変調性である場合に、またはウイルスベクターを用いて、異種タンパク質を宿主細胞に導入する場合に有用である。
例えば、いくつかの実施形態において、標的遺伝子は細胞インターフェロンタンパク質、またはインターフェロンシグナリングに関連するタンパク質である。特に、該遺伝子は、ＩＦＮ−α（例えば、Ｇａｌｌｕｓ（ニワトリ） ＩＦＮ−α、ＧｅｎｅＩＤ：３９６３９８）；ＩＦＮ−β（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＩＦＮ−β、ＧｅｎｅＩＤ：５５４２１９）；またはＩＦＮ−γ（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＩＦＮ−γ、ＧｅｎｅＩＤ：３９６０５４）のようなインターフェロン遺伝子であり得る。かくして、例えば、ＩＦＮ−β発現は、培養された細胞に依存して、配列番号：３１５６１５５〜３１５６１８０（Ｇａｌｌｕｓ、センス）、配列番号：３１５６１８１〜３１５６２０６（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）、配列番号：３１５５４９３〜３１５５５４０（Ｃａｎｉｓ（イヌ）、センス）、配列番号：３１５５４４５〜３１５５４９２（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
別法として、標的遺伝子は、ＩＦＮＡＲ１（インターフェロンα、βおよびω受容体１）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＩＦＮＡＲ１、ＧｅｎｅＩＤ：３９５６６５）、ＩＦＮＡＲ２（インターフェロンα、βおよびω受容体２）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＩＦＮＡＲ２、ＧｅｎｅＩＤ：３９５６６４）、ＩＦＮＧＲ１（インターフェロンγ受容体１）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＩＦＮＧＲ１、ＧｅｎｅＩＤ：４２１６８５）またはＩＦＮＧＲ２（インターフェロンγ受容体２（インターフェロンγトランスジューサー１））（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＩＦＮＧＲ２、ＧｅｎｅＩＤ：４１８５０２）のようなインターフェロン受容体であり得る。かくして、例えば、ＩＦＮＡＲ１の発現は、培養された細胞に依存して、配列番号：２４３６５３６〜２４３６８６３（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４６０５〜３１５４６３３（Ｇａｌｌｕｓ、センス）、配列番号：３１５４６３４〜３１５４６６２（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）、配列番号：３１５５３９７〜３１５５４４４（Ｃａｎｉｓ、センス）、配列番号：３１５５４４５〜３１５５４９２（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
いくつかの実施形態において、該遺伝子は、ＳＴＡＴ−１（シグナルトランスジューサーおよび転写１のアクチベーター）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｓｔａｔ１、ＧｅｎｅＩＤ：４２４０４４）、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｓｔａｔ３、ＧｅｎｅＩＤ：４２００２７）、ＳＴＡＴ−４（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｓｔａｔ４、ＧｅｎｅＩＤ：７６８４０６）、ＳＴＡＴ−５（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｓｔａｔ５、ＧｅｎｅＩＤ：３９５５５６；ＪＡＫ−１（Ｊａｎｕｓキナーゼ１）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｊａｋ１、ＧｅｎｅＩＤ：３９５６８１；ＪＡＫ−２（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｊａｋ２、ＧｅｎｅＩＤ：３７４１９９）、ＪＡＫ−３（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｊａｋ３、ＧｅｎｅＩＤ：３９５８４５）、ＩＲＦ１（インターフェロン調節因子１）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＩＲＦ１、ＧｅｎｅＩＤ：３９６３８４）、ＩＲＦ２（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：３９６１１５）、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：３７４１７９）、ＩＲＦ５（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：４３０４０９）、ＩＲＦ６（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：４１９８６３）、ＩＲＦ７（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：３９６３３０）、ＩＲＦ８（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：３９６３８５）、ＩＲＦ９、またはＩＲＦ１０（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：３９５２４３）のようなインターフェロンシグナリングと関連し得る。
かくして、例えば、ＩＲＦ３の発現は、培養された細胞に依存して、配列番号：１４３０４７３〜１４３０７８６（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３２８８９４８〜３２８９２４９（Ｇａｌｌｕｓ、センス）、配列番号：３２８９２５０〜３２８９５５１（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）、配列番号：３２９０１４２〜３２９０４４５（Ｃａｎｉｓ、センス）、配列番号：３２０４４６〜３２０７４９（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続オリゴヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
同様に、標的遺伝子は、２’，５’オリゴアデニル酸シンテターゼ（２−５ ＯＡＳ）；インターフェロン誘導抗ウイルスタンパク質；ＲＮＡａｓｅＬ（リボヌクレアーゼＬ（２’，５’−オリゴイソアデニル酸シンテターゼ依存性）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：４２４４１０（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら１４ Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．１０１−０４（１９９４））；ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）ａｋａ：真核生物翻訳開始因子２−αキナーゼ２（ＥＩＦ２ＡＫ２）（Ｌｉら１０６ ＰＮＡＳ １６４１０−０５（２００９））；Ｍｘ（ＭＸ１ミクソウイルス（インフルエンザウイルス）抵抗１、インターフェロン誘導性タンパク質ｐ７８）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＭＸ、ＧｅｎｅＩＤ：３９５３１３；Ｈａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，９Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．１６３６−４３（２００７））；ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３（Ｂｒａｓｓ ｅｔ ａｌ．；１３９ Ｃｅｌｌ １２４３−５４（２００９））；前炎症性サイトカイン；ウイルス攻撃に際してアップレギュレートされたＭＹＤ８８（ミエロイド分別初代応答遺伝子）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｍｙｄ８８、ＧｅｎｅＩＤ：４２０４２０）；またはＴＲＩＦ（ｔｏｌｌ様受容体アダプター分子１）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＴＲＩＦ、ＧｅｎｅＩＤ：１００００８５８５）、ＨｇｈｉｇｈｉらＣｌｉｎ．Ｖａｃｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０年１月１３日）のようなインターフェロン誘導タンパク質をコードすることができる。
かくして、例えば、ＭＸ１の発現は、培養された細胞に依存して、配列番号：２５８８６１５〜２５８８９５１（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３２６６８２〜３２８６９７５（Ｇａｌｌｕｓ、センス）、配列番号：３２８６９７６〜３２８７２６９（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）、配列番号：３２８６１３２〜３２８６４０６（Ｃａｎｉｓ、センス）、配列番号：３２８６４０７〜３２８６６８１（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
また、例えば、ＩＦＴＭ１の発現は、配列番号：３１５５１１５〜３１５５１６１（Ｃａｎｉｓ、センス）、配列番号：３１５５１６２〜３１５５２０８（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むオリゴヌクレオチド鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
加えて、ＩＦＩＴＭ２の発現は、培養された細胞に依存して、配列番号：３１５６５８７〜３１５６６３３（ＣＨＯ細胞、センス）、配列番号：３１５６６３４〜３１５６６８０（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：２６８５１７１〜２６８５５５０（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５５２０９〜３１５５２５５（Ｃａｎｉｓ、センス）、配列番号：３１５５２５６〜３１５５３０２（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むオリゴヌクレオチド鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
同様に、ＩＦＩＴＭ３の発現は、培養された細胞に依存して、配列番号：３１５６６８１〜３１５６７２７（ＣＨＯ細胞、センス）、配列番号：３１５６７２８〜３１５６７７４（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：２６９６１６９〜２６９６５４６（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５５３０３〜３１５５３４９（Ｃａｎｉｓ、センス）、配列番号：３１５５３５０〜３１５５３５０（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
さらに、例としてのインターフェロン誘導発現に関しては、ＰＫＲ（ＥＩＦ２ＡＫ２）の発現は、以下のように、表６７および６８から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる：
Figure 2014501489
Figure 2014501489
Figure 2014501489
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さらなる実施形態において、免疫原性作用物質は、１以上のレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞によって生産される。第一のレトロウイルスベクターでのトランスフェクションに際して、レトロウイルスベクターＥｎｖおよび／またはＧａｇ分子の発現は、細胞を、（ｅｎｖ遺伝子またはｇａｇ遺伝子を標的化する）第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させ、第二のレトロウイルスベクターでのより有効なトランスフェクションを可能とすることによって一過的に阻害される。例えば、（組換え免疫原性作用物質が双方のペプチドを含有するように）第一のレトロウイルスベクターは第一のペプチドをコードすることができ、および第二のレトロウイルスベクターは第二のペプチドをコードすることができる。加えて、発現の阻害は、細胞に、ＲＮＡｉ経路のタンパク質をコードする遺伝子に対して標的化されたさらなるＲＮＡエフェクター分子を導入することによって緩和することができる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、細胞の内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）の調節エレメントまたは遺伝子である。例えば、特別な実施形態において、標的遺伝子はＥＲＶ ＬＴＲ、ｅｎｖタンパク質またはｇａｇタンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ベシウイルス、またはサーコウイルスのような潜在的ウイルスの遺伝子である。特別な実施形態において、例えば、標的遺伝子は、（本明細書中において他の個所に記載された）潜在的ＨＳＶ糖タンパク質ＤまたはＰＣＶ−１ Ｒｅｐタンパク質のようなポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる。ここに、表６４に提供されるのは、ＰＣＶ−１を標的化するための例示的なＲＮＡエフェクター分子である：
Figure 2014501489
Figure 2014501489
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は内因性非ＥＲＶ遺伝子である。例えば、標的遺伝子は、免疫原性作用物質がポリペプチドである場合、免疫原性遺伝子またはその部分をコードすることができる。
免疫原性作用物質の生産は、免疫原性作用物質またはそのベクターに結合するタンパク質の発現を低下させることによって増強させることもできる。例えば、組換えタンパク質の生産の際に、宿主細胞におけるその発現が組換えベクターによって超−感染を阻害しないように、ＥＲＶによって生産される受容体／リガンドの発現を低下させ、または阻害するのが有利であり得る。受容体は細胞表面受容体または内部（例えば、核）受容体であり得るのは当業者に知られている。結合パートナーの発現は、宿主細胞を、本明細書中に記載された方法に従って、受容体遺伝子に向けられたＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって変調することができる。
さらなる実施形態において、標的遺伝子は、ｄｓＲＮＡを検出するＴＬＲ３（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＴＬＲ３、ＧｅｎｅＩＤ：４２２７２０）、ｓｓＲＮＡを検出するＴＬＲ7（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＴＬＲ７、ＧｅｎｅＩＤ：４１８６３８）、メチル化されていないＤＮＡをＣｐＧモチーフで認識するＴＬＲ２１（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｔｌｒ３、ＧｅｎｅＩＤ：４１５６２３）、ウイルス検知に関連するＲＩＧ−１（Ｍｙｏｎｇら３２３ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０７０−７４（２００９））；ウイルス検知の陽性レギュレーターである、ＬＰＧＰ２および他のＲＩＧ−１様受容体（Ｓａｔｏｈら１０７ ＰＮＡＳ １２６１−６２（２０１０）；Ｎａｋｈａｅｉら２００９）；ＴＲＩＭ２５（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｔｒｉｍ２５，ＧｅｎｅＩＤ：４１７４０１；Ｇａｃｋら５ Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂ，４３９−４９（２００９））；またはＲＩＧ−１と相互作用して、抗ウイルスシグナリングカスケードを開始するＭＡＶＳ／ＶＩＳＡ／ＩＰＳ−１／Ｇａｒｄｉｆ（ＭＡＶＳ）（Ｃｕｉら２９ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１６９−７９（２００８）；Ｋａｗａｉら６ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８１−８８（２００５））のようなウイルス感染性を媒介する標的タンパク質である。
かくして、例えば、ＴＬＲ３の発現は、培養された細胞に依存して、配列番号：３１５６４９１〜３１５６５３８（ＣＨＯ細胞、センス）、配列番号：３１５６５３９〜３１５６５８６（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：２５９３１７９〜２５９３５２５（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５５９６５〜３１５６０１１（Ｇａｌｌｕｓ、センス）、配列番号：３１５６０１２〜３１５６０５８（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）、配列番号：３１５７７７〜３１５５８２３（Ｃａｎｉｓ、センス）および配列番号：３１５５８２４〜３１５５８７０（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
加えて、例えば、ＭＡＶＳの発現は、培養された細胞に依存して、配列番号：３１５６３９７〜３１５６４４３（ＣＨＯ細胞、センス）、配列番号：３１５６４４４〜３１５６４９０（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：１６０７１８４〜１６０７５２７（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３２８６６８２〜３２８６９７５（Ｇａｌｌｕｓ、センス）、配列番号：３２８６９７６〜３２８７２６９（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）、配列番号：３２８６１３２〜３２８６４０６（Ｃａｎｉｓ、センス）および配列番号：３２８６４０７〜３２８６６８１（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
特異的な様式でウイルス複製を衝撃する宿主細胞タンパク質があるが、この活性についての正確なメカニズムは解明されていない。例えば、細胞タンパク質カゼインキナーゼ２β（ＣＳＫＮ２Ｂ）の抑制はインフルエンザの複製、タンパク質の生産およびウイルス力価を増加させる。Ｍａｒｊｕｋｉら３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｉｇｎａｌ．１３（２００８）。ＣＳＫＮ２Ｂの発現は、培養された細胞に依存して、配列番号：２６３４９７８〜２６３４３５８（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３２８９５５２〜３２８９８４６（Ｇａｌｌｕｓ、センス）、配列番号：３２８９８４７〜３２９０１４１（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）、配列番号：３２８８３６８〜３２８８６５７（Ｃａｎｉｓ、センス）、配列番号：３２８８６５８〜３２８８９４７（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
組成物は、代替実施形態において、細胞の共通する生物学的プロセスまたは特性、例えば、ＩＦＮを含むインターフェロンシグナリング経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナリング経路におけるＳＴＡＴタンパク質または他のタンパク質、ＩＦＮＲＡ１および／またはＩＦＮＲＡ２に関連する１または多数の遺伝子の発現を変調することができる１以上のＲＮＡエフェクター分子を含むことができる。例えば、ウイルスの感染の結果、ＩＦＮαおよびＩＦＮβの生産によって特徴付けられる、潜在的溶解性感染、形質転換および／またはアポトーシスに対する感染した細胞での迅速な先天的応答がもたらされる。このシグナリングの結果、ＩＦＮの効果を媒介するＩＦＮ−刺激遺伝子（ＩＳＧ）の活性化がもたらされる。ＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）は、コンセンサスＩＦＮ−刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）に結合し、他のＩＳＧを誘導する９つの細胞因子のファミリーである。Ｋｉｒｓｈｎｅｒら７９ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９３２０−２４（２００５）参照。ＩＦＮは、ＴＲＩＭ５α、Ｆｖ、Ｍｘ１、ｅＩＦ２αおよび２’−５’ＯＡＳを含む固有のタンパク質の発現を増加させ、ウイルスが感染した細胞のアポトーシス、およびウイルス感染に対する細胞の抵抗性を誘導する。Ｋｏｙａｍら４３ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ３３６−４１（２００８）。よって、特別な実施形態は、ＩＦＮＲＡ１遺伝子を標的化するＲＮＡエフェクター分子を提供する。他の実施形態は、ＩＦＮシグナリング経路における１以上の遺伝子を標的化する。
ＩＦＮシグナリング応答の阻害は、ウイルスｄｓＲＮＡに応答してリン酸化された、ウイルス感染に続いてのＩＦＮ経路の成分、例えば、ＩＲＦ−３のリン酸化された状態を測定することによって決定することができる。Ｉ型のＩＦＮに応答して、Ｊａｋ１キナーゼおよびＴｙＫ２キナーゼ、ＩＦＮ受容体のサブユニット、ＳＴＡＴ１、およびＳＴＡＴ２は迅速にチロシンがリン酸化される。かくして、ＲＮＡエフェクター分子がＩＦＮ応答を阻害するか否かを決定するためには、細胞をＲＮＡエフェクター分子と接触させることができ、ウイルス感染に続いて、細胞は溶解される。Ｊａｋ１キナーゼまたはＴｙＫ２キナーゼのようなＩＦＮ経路の成分は、特異的なポリクローナル血清または抗体、および抗ホスホチロシン抗体でのイムノブロットアッセイによって決定された該キナーゼのチロシンリン酸化状態を用い、感染された細胞の溶解物から免疫沈降される。例えば、Ｋｒｉｓｈｎａｎら２４７ Ｅｕｒ.Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９８−３０５（１９９７）参照。ウイルスでの感染に続いてのＩＦＮ経路の該成分のいずれかの減少したリン酸化状態は、ＲＮＡエフェクター分子に応答してのウイルスによる減少したＩＦＮ応答を示す。
ＩＦＮシグナリング阻害の有効性は、特異的ＤＮＡ配列に結合する能力、またはウイルス感染に応答して誘導された転写因子のトランスロケーション、およびＲＮＡエフェクター分子処理、例えば、ＩＲＦ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２等の標的化を測定することによって決定することもできる。特に、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２はリン酸化され、Ｉ型ＩＦＮに応答して細胞質から核に移動される。特異的ＤＮＡ配列に結合する能力、または転写因子のトランスロケーションは、当業者に知られた技術、例えば、電気移動度ゲルシフトアッセイ、細胞染色等によって測定することができる。ＩＦＮ誘導の阻害の測定に対する別のアプローチは、所望のウイルス産物を生産し、かつＲＮＡエフェクター分子と接触させた細胞培養からの抽出物は、ウイルス感染に対する保護活性を与えることができる。より具体的には、例えば、細胞を所望のウイルスで感染させ、ＲＮＡエフェクターと接触させる。感染からほぼ１５〜２０時間の後、細胞または細胞培地を収穫し、ウイルス力価について、あるいは定量的な産物−増強逆転写酵素（ＰＥＲＴ）アッセイ、免疫アッセイ、またはイン・ビボ挑戦によってアッセイされる。
宿主細胞受容体
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、膜受容体または他の部位の合成または調節をコードし、またはそれに関与する宿主細胞遺伝子（内因性）である。細胞膜の発現の変調は、（例えば、受容体発現を増加または減少させることによって）ウイルス感染を増加または減少させることができるか、あるいは（受容体発現を減少させることによって）そうでなければ宿主細胞膜に吸着される産物の回収を増加させることができる。
例えば、ＰＣＶ（Ｍｉｓｉｎｚｏら８０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３４８７−９４（２００６）；ＣＭＶ（Ｃｏｍｐｔｏｎら１９３ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８３４−４１（１９９３））；偽狂犬病ウイルス（Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒら６４ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２７８−８６（１９９０））；ＢＨＶ−１（Ｏｋａｚａｋｉら１８１ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６６６−７０（１９９１））；ブタ水疱病ウイルス（Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ−Ｒｏｍｅｒｏら８５ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６５３−６３（２００４））；およびＨＳＶ （ＷｕＤｕｎｎ ＆ Ｓｐｅａｒ，６３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５２−５８（１９８９））を含む、多くのウイルスは宿主細胞表面のヘパリンに接着する。加えて、表面ヘパリン結合に関連する感染性を有するエンベロープウイルスは、ＨＩＶ−１（Ｍｏｎｄｏｒら７２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３６２３−３４（１９９８））；ＡＡＶ−２（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，７２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１４３８−４５（１９９８））；ウマ動脈炎ウイルス（Ａｓａｇｏｅら５９ Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．７２７−２８（１９９７））；ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｂｅｒｎａｒｄら２７６ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９３−１０３（２０００））；シンドビスウイルス（Ｂｙｒｎｅｓ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｎ，７２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３４９−５６（１９９８）；Ｃｈｕｎｇら７２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１５７７−８５（１９９８））；ブタ熱ウイルス（Ｈｕｌｓｔら７５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９５８５−９５（２００１））；ブタ生殖系および呼吸器系症候群ウイルス（Ｊｕｓａら６２ Ｒｅｓ.Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．２６１−６４（１９９７））；およびＲＳＶ（Ｋｒｕｓａｔ ＆ Ｓｔｅｃｋｅｒｔ，１４２ Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１２４７−５４（１９９７））を含む。多数の非エンベロープウイルスが同様に細胞表面ヘパリンに会合する。***ウイルス（ＦＭＤＶ）（イン・ビトロ培養における結合）（Ｆｒｙら１８ ＥＭＢＯ Ｊ．５４３−５４（１９９９）；Ｊａｃｋｓｏｎら７０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５２８２−８７（１９９６））；コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）（Ｚａｕｔｎｅｒら７７ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１００７１−７７（２００３））；タイラーのマウス脳脊髄炎ウイルス（Ｒｅｄｄｉ ＆ Ｌｉｐｔｏｎ，７６ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４００−０７（２００２））；およびある種のエコウイルス血清型（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗら７５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９１８−２１（２００１））を含む、いくつかのピコルナウイルス科のメンバーは細胞表面のヘパリンに会合する。
よって、本発明の特別な実施形態において、ヘパリンの細胞発現を変調させて、宿主細胞へのウイルス吸着を減少または増加させることができる。例えば、１以上のＲＮＡエフェクター分子は、エピメラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼまたは２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼのような、ヘパリンの合成または構造に関連する１以上の遺伝子を標的化することができる。例えば、Ｒｏｓｔａｎｄ ＆ Ｅｓｋｏ，６５ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１−８（１９９７）参照。
細胞表面のヘパリンの発現が増加される場合、ＲＮＡエフェクター分子は、ヘパラナーゼ（ｈｅｐ）をコードする遺伝子（例えば、マウスｈｅｐ ＧｅｎｅＩＤ：１５４４２、マウスｈｅｐ２ ＧｅｎｅＩＤ：５４５２９１、ラットｈｅｐ ＧｅｎｅＩＤ：６４５３７、ラットｈｅｐ２ ＧｅｎｅＩＤ：３６８１２８、ヒトＨＥＰ ＧｅｎｅＩＤ：１０８５５、ヒトＨＥＰ２ ＧｅｎｅＩＤ：６０４９５、ツメガエル ｈｅｐ ＧｅｎｅＩＤ：１００１４５３２０、野生型ブタＳｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｈｅｐ ＧｅｎｅＩＤ：１００２７１９３２、Ｇａｌｌｕｓ ｈｅｐ ＧｅｎｅＩＤ：３７３９８１、Ｇａｌｌｕｓ ｈｅｐ２ ＧｅｎｅＩＤ：４２３８３４、イヌｈｅｐ ＧｅｎｅＩＤ：６０８７０７、ウシｈｅｐ ＧｅｎｅＩＤ：８２８４４７１、マーモセット（サル）ｈｅｐ ＧｅｎｅＩＤ：１００４０２６７１、マーモセットｈｅｐ２ ＧｅｎｅＩＤ：１００４０７５９８、Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ ｈｅｐ ＧｅｎｅＩＤ：４６１２０６、ウサギｈｅｐ ＧｅｎｅＩＤ：１００１０１６０１、アカゲザルｈｅｐ ＧｅｎｅＩＤ：７０７５８３、またはゼブラフィッシュｈｅｐ ＧｅｎｅＩＤ：５６３０２０）のような、ヘパリン分解に関連する標的遺伝子であり得る。Ｇｉｎｇｉｓ−Ｖｅｌｉｔｓｋｉら２７９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４４０８４−９２（２００４）。
同様に、インフルエンザウイルスの感染性は、ロタウイルス（Ｉｓａら２３ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．２７−３７（２００６）；Ｆｕｋｕｄｏｍｅら１７２ Ｖｉｒｏｌ． １９６−２０５（１９８９））、他のレオウイルス（Ｐａｌｕら１７２ Ｖｉｒｏｌ．３８２−８５（１９８９））、およびウシコロナウイルス（Ｓｃｈｕｌａｚｅ ＆ Ｈｅｒｒｌｅｒ，７３ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９０１−０６（１９９２））の感染性がそうであるように、細胞表面でのシアル酸の存在に依存する（Ｐｅｄｒｏｓｏら１２３６ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３２３−３０（１９９５））。さらなる宿主細胞表面の受容体は、脳心筋炎ウイルスについてのＶＣＡＭ１（Ｈｕｂｅｒｍ ６８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３４５３−５８（１９９４）；エコウイルスについてのインテグリンＶＬＡ−２（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎら１７１８−２０（１９９２）；およびポリオウイルスについての免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら５６ Ｃｅｌｌ ８５５−６５（１９８９））を含む。このように、宿主シアリダーゼ遺伝子を標的化するＲＮＡエフェクターを用いて、宿主細胞の感染性を変調することができる。
かくして、いくつかの実施形態において、標的遺伝子はシアリダーゼに関与する宿主細胞遺伝子を含む（Ｗａｎｇら１０ ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５１２（２００９）参照）。例えば、インフルエンザは細胞表面シアル酸残基に結合するゆえに、減少したシアリダーゼは精製の速度を増加させることができる。標的遺伝子は、例えば、ＮＥＵ２シアリダーゼ２（サイトゾルシアリダーゼ）（Ｇａｌｌｕｓ Ｎｅｕ２、ＧｅｎｅＩＤ：４３０５４２）；ＮＥＵ３シアリダーゼ３（膜シアリダーゼ）（Ｇａｌｌｕｓ Ｎｅｕ３、ＧｅｎｅＩＤ：６８８２３）；溶質キャリアファミリー３５（ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター）膜Ａ１（Ｓｌｃ３５Ａ１）を含む。ＳＣＬ３５Ａ１を標的化する例としてのＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：３１５４３４５〜３１５４３６８（Ｇａｌｌｕｓ、センス）および配列番号：３１５４３６９〜３１５４３９２（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）；およびＳＣＬ３５Ａ２については、配列番号：４６４６７４〜４６５０５５（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）に提供された配列を有することができる。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（Ｇｎｅ）については、ｓｉＲＮＡの例は配列番号：２０７３９７１〜２０７４３６８（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４２９７〜３１５４３２０（Ｇａｌｌｕｓ、センス）および配列番号：３１５４３２１〜３１５４３４４（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス））；シチジンモノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（Ｃｍａｓ）、配列番号：１６３３１０１〜１６３３４０６（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４２４９〜３１５４２７２（Ｇａｌｌｕｓ、センス）および配列番号：３１５４２７３〜３１５４２９６（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス））に示された例としてのｓｉＲＮＡ；ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃ β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＴ１）、配列番号：２５２８４５４〜２５２８７６３（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４１５３〜３１５４１７６（Ｇａｌｌｕｓ、センス）および配列番号：３１５４１７７〜３１５４２００（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス））から選択される配列を有するｓｉＲＮＡの例；およびＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧ１ｃＮＡｃ β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド６（Ｂ４ＧａｌＴ６）、配列番号：１６３５１７３〜１６３５５６１（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４２０１〜３１５４２２４（Ｇａｌｌｕｓ、センス）および配列番号：３１５４２２５〜３１５４２４８（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）におけるｓｉＲＮＡの例を含む。
宿主細胞の生存性
いくつかの実施形態において、宿主細胞における免疫原性作用物質の生産は、細胞成長、細胞***、細胞生存性、アポトーシス、栄養素取扱い、ならびに／もしくは細胞内での細胞成長および／または***に関連する他の特性に影響するさらなるＲＮＡエフェクター分子を該細胞に導入することによって増強される。標的遺伝子は、免疫原性作用物質の生産の１以上の態様に直接的にまたは間接的に影響する宿主細胞タンパク質をコードすることもできる。ポリペプチドの生産に影響する標的遺伝子の例は、ポリペプチドの分泌、折畳み、または翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、脱アミド化、ジスルフィド結合形成、メチオニン酸化、またはピログルタメーション）に関与するタンパク質をコードする遺伝子；宿主細胞の特性または表現型（例えば、成長、生存性、細胞ｐＨ、細胞周期進行、アポトーシス、炭素の代謝または輸送、ラクテート形成、ウイルス感染またはＲＮＡｉ摂取に対する感受性、活性または有効性）に影響するタンパク質をコードする遺伝子；および宿主細胞による免疫原性作用物質の生産を損なうタンパク質（例えば、免疫原性作用物質に結合し、またはそれと共精製されるタンパク質）をコードする遺伝子を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、標的遺伝子は、標的遺伝子の発現の阻害が免疫原性作用物質の生産を増強するように、免疫原性作用物質の生産に間接的に影響する宿主細胞タンパク質をコードする。例えば、標的遺伝子は、免疫原性作用物質の生産に直接的に影響しないが、例えば、免疫原性作用物質の生産をそうでなければ増強できるであろう細胞源を利用することによってその生産を間接的に減少させる豊富に発現された宿主細胞タンパク質をコードすることができる。
いくつかの実施形態において、Ａｇｏ１（真核生物翻訳開始因子２Ｃ、１）；ＢＬＫ（Ｂリンパ球チロシンキナーゼ）；ＣＣＮＢ３（サイクリンＢ３）；ＨＩＬＩ（ｐｉｗｉ様２（ショウジョウバエ）；ＨＩＷＩ１（ｐｉｗｉ様２（ショウジョウバエ）；ＨＩＷＩ２（ｐｉｗｉ様２（ショウジョウバエ）；ＨＩＷＩ３（ｐｉｗｉ様２（ショウジョウバエ）は、本明細書中に記載された方法および組成物を用いて標的化される。
本明細書中に記載された細胞ベースのバイオプロセスにおける免疫原性作用物質の最適な生産には、細胞生存性を最大化するのが望ましい。従って、１つの実施形態において、免疫原性作用物質の生産は、Ｂａｘ（ＢＣＬ２関連Ｘタンパク質）、例えば；Ｂａｋ（ＢＣＬ２−アンタゴニスト／キラー１）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｂａｋ、ＧｅｎｅＩＤ：４１９９１２）、ＬＤＨＡ（乳酸デヒドロゲナーゼＡ）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＬｄｈＡ、ＧｅｎｅＩＤ：３９６２２１）、ＬＤＨＢ（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＬｄｈＢ、ＧｅｎｅＩＤ：３７３９９７）、ＢＩＫ；ＢＡＤ（配列番号：３０４９４３６〜３０４９７２１）、ＢＩＤ（配列番号：２５８２５１７〜２５８２８２３）、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ（配列番号：１７１２０４５〜１７１２４２５）、ＢＯＫ（ＢＣＬ２関連卵巣キラー）（例えば、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｂｏｋ、ＧｅｎｅＩＤ：３９５４４５、Ｇａｌｌｕｓ Ｂｏｋ、ＧｅｎｅＩＤ：９９５４４５、ヒトＢＯＫ、ＧｅｎｅＩＤ：６６６）、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２（アポトーシス関連システインペプチダーゼ２）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｃａｓｐ２、ＧｅｎｅＩＤ：３９５８５７）（配列番号：２７１８６７５〜２７１９０３９）、ＣＡＳＰ３（アポトーシス関連システインペプチダーゼ）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｃａｓｐ３、ＧｅｎｅＩＤ：３９５４７６）（配列番号：１９２４８３６〜１９２５１９５）、ＣＡＳＰ６（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｃａｓｐ６、ＧｅｎｅＩＤ：３９５４７７（配列番号：２４０８４６６〜２４０８８４３）；ＣＡＳＰ７（例えば、Ｇａｌｌｕｓ、ＧｅｎｅＩＤ：４２３９０１（配列番号：２３０１６１８〜２３０１９６０）；ＣＡＳＰ８（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｃａｓｐ８、ＧｅｎｅＩＤ：３９５２８４、ヒトＣＡＳＰ８ ＧｅｎｅＤ：８４１、Ｍ． ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｃａｓｐ８、ＧｅｎｅＩＤ：１２３７０、Ｃａｎｉｓ Ｃａｓｐ８、ＧｅｎｅＩＤ：４８８４７３）（配列番号：２９９５５９３〜２９９５８７０）；ＣＡＳＰ９（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｃａｓｐ９、ＧｅｎｅＩＤ：４２６９７０）（配列番号：１４１２５８９〜１４１２８６０）、ＣＡＳＰ１０（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｃａｓｐ１０、ＧｅｎｅＩＤ：４２４０８１）、ＢＣＬ２（Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｂｃｌ２、ＧｅｎｅＩＤ：３９６２８２）、ｐ５３（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ｐ５３、ＧｅｎｅＩＤ：３９６２００）（配列番号：１２８３５０６〜１２８３８６７）、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｈｓｐ７０、ＧｅｎｅＩＤ：４２３５０４）（配列番号：３１４７０２９〜３１４７０８０）；ＴＲＡＩＬ（ＴＲＡＩＬ様ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド様）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｔｒａｉｌ、ＧｅｎｅＩＤ：３９５２８３）、ＢＣＬ２Ｌ１（ＢＣＬ２様１）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｂｃｌ２Ｌ１、ＧｅｎｅＩＤ：３７３９５４）ＢＣＬ２Ｌ１３（ＢＣＬ２様１３［アポトーシスファシリテーター］）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｂｃｌ２ｌ１３、ＧｅｎｅＩＤ：４１８１６３、ヒトＢＣＬ２Ｌ１３、ＧｅｎｅＩＤ：２３７８６）、ＢＣＬ２Ｌ１４（ＢＣＬ２様１４［アポトーシスファシリテーター］）（例えば、ａｌｌｕｓ Ｂｃｌ２ｌ１４、ＧｅｎｅＩＤ：４１９０９６）、ＦＡＳＬＧ（Ｆａｓリガンド［ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー６］）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｆａｓｌｇ、ＧｅｎｅＩＤ：４２９０６４）、ＤＰＦ２（Ｄ４、亜鉛および二重ＰＨＤフィンガーファミリー２）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｄｐｆ２、ＧｅｎｅＩＤ：４２９０６４）、ＡＩＦＭ２（アポトーシス誘導因子ミトコンドリア関連２）（例えば、ヒトＡＩＦＭ２、ＧｅｎｅＩＤ：８４８８３、Ｇａｌｌｕｓ Ａｉｆｍ２、ＧｅｎｅＩＤ：４２３７２０）、ＡＩＦＭ３（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ａｉｆｍ３、ＧｅｎｅＩＤ：４１６９９９）、ＳＴＫ１７Ａ（セリン／スレオニンキナーゼ１７ａ［アポトーシス誘導］）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｓｔｋ１７Ａ、ＧｅｎｅＩＤ：４２０７７５）、ＡＰＩＴＤ１（アポトーシス誘導、ＴＡＦ９様ドメイン１）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ａｐｉｔｄ１、ＧｅｎｅＩＤ：７７１４１７）、ＳＩＶＡ１（アポトーシス誘導因子）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｓｉｖａ１、ＧｅｎｅＩＤ：４２３４９３）、ＦＡＳ（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー６）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｆａｓ、ＧｅｎｅＩＤ：３９５２７４）、ＴＧＦβ２（トランスフォーミング成長因子β２）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＴｇｆＢ２、ＧｅｎｅＩＤ：４２１３５２）、ＴＧＦＢＲ１（トランスフォーミング成長因子、β受容体Ｉ）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＴｇｆＲ１、ＧｅｎｅＩＤ：３７４０９４）、ＬＯＣ３７８９０２（死滅ドメイン含有腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２３）（Ｇａｌｌｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：３７８９０２）、またはＢＣＬ２Ａ１（ＢＣＬ２関連タンパク質Ａ１）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｂｃｌ２Ａ１、ＧｅｎｅＩＤ：３９５６７３）のような、アポトーシスまたは細胞生存性に影響する細胞タンパク質の発現を変調することによって増強される。例えば、ＢＡＫタンパク質は、細胞アポトーシス経路をダウンレギュレートすることが知られている。ＳｕｙａｍａらＳｌ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０７−０８（２００１）。
例えば、ＬＤＨＡの発現は、配列番号：３１５４５５３〜３１５４５７８（Ｇａｌｌｕｓ、センス）、配列番号：３１５４５７９〜３１５４６０４（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）、配列番号：３１５２５４０〜３１５２６０３（ＣＨＯ細胞）、配列番号：３１５２８４３〜３１５２８２３（ＣＨＯ細胞）、配列番号：１２９７２８３〜１２９７６０４（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５５５８９〜３１５５６３５（Ｃａｎｉｓ、センス）、配列番号：３１５４９７１〜３１５５０１８（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）におけるヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
さらに、例えば、Ｂａｋタンパク質は細胞アポトーシス経路をダウンレギュレートすることが知られている。かくして、Ｂａｋを標的化するＲＮＡエフェクター分子を用いて、アポトーシスを抑制し、産物の収率を増加させることができ、および該分子は、配列番号：３１５２４１２〜３１５２４７５（ＣＨＯ細胞）、配列番号：３１５２８０４〜３１５２８１３、配列番号：２２５９８５５〜２２０１６１（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４３９３〜３１５４４１３（Ｇａｌｌｕｓ、センス）、配列番号：３１５４４１４〜３１５４４３４（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）、配列番号：３１５４８２７〜３１５４８７４（Ｃａｎｉｓ、センス）、配列番号：３１５４８７５〜３１５４９２２（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）におけるヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含むことができる。また、ＳｕｙａｍａらＳｌ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０７−０８（２００１）参照。かくして、特別な実施形態は、Ｂａｋ遺伝子を標的化するＲＮＡエフェクター分子を提供する。かくして、特別な実施形態は、ＢＡＫ１遺伝子を標的化するＲＮＡエフェクター分子を提供する。
同様に、Ｂａｘタンパク質は細胞アポトーシス経路をダウンレギュレートすることが知られている。かくして、ニワトリＢａｘを標的化するＲＮＡエフェクター分子を用いて、アポトーシスを抑制し、および免疫原産物の収率を増加させることができ、および該分子は、配列番号：３１５４３９３〜３１５４４１３（Ｇａｌｌｕｓ、センス）、配列番号：３１５４１４〜３１５４４３４（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）、配列番号：３１５２４１２〜３１５２５３９（ＣＨＯ細胞）、配列番号：３１５２７９４〜３１５２８０３（ＣＨＯ細胞）、配列番号：３０２３２３４〜３０２３５１５（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４９２３〜３１５４９７０（Ｃａｎｉｓ、センス）、および配列番号：３１５４９７１〜３１５５０１８（Ｃａｎｉｓ、アンチセンス）におけるヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含むことができる。
いくつかの実施形態において、アポトーシスに関与する少なくとも１つの遺伝子を標的化するＲＮＡエフェクター分子（例えば、Ｂａｋ、Ｂａｘ、カスパーゼ等）の投与に続いて、グルコースを細胞培養基に投与して、細胞密度を増加させ、および細胞をラクテート利用モードに切り替える。いくつかの実施形態において、グルコースの濃度は少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍増加する。
別の実施形態は複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を提供し、これは培養中の細胞と接触させて、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＬＤＨ発現の変調を可能とする。別の実施形態において、ＢａｘおよびＢａｋを標的化するＲＮＡエフェクター分子は免疫原性作用物質の生産の間に細胞培養に共投与され、所望により、少なくとも１つのさらなるＲＮＡエフェクター分子または剤を含有することができる。
別法として、ある時点に１つのＲＮＡエフェクター分子を細胞培養に投与することができる。このように、特定のＲＮＡエフェクター分子の投与の頻度を変化させることによって、各標的遺伝子で望まれる平均パーセント阻害を容易にしつらえることができる。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の＞８０％阻害は、免疫原性作用物質の生産を有意に改善するのに常には必要でなく、いくつかの条件下では、細胞生存性に対して有害でさえあろう。かくして、他のＲＮＡエフェクター分子（例えば、Ｂａｘ／Ｂａｋ）と接触させる頻度よりも少ない頻度で（例えば、しばしば未満）ＬＤＨを標的化するＲＮＡエフェクター分子と細胞を接触させるのが望まれるであろう。別法として、細胞は、他のＲＮＡエフェクター分子（例えば、Ｂａｘ／Ｂａｋ）についての投与量よりも少ない投与量にて（例えば、ＩＣ５０を超えるより少ない複数）ＬＤＨを標的化するＲＮＡエフェクター分子と接触させることができる。使用を容易にするため、かつ潜在的な汚染を妨げるには、異なるＲＮＡエフェクター分子のカクテルを投与し、それにより、必要な用量の数を低下させ、かつ汚染物を細胞培養に導入するチャンスを最小化するのが好ましいであろう。
本明細書中に記載された細胞ベースのバイオプロセスにおける免疫原性作用物質の生産は、スクリーニングを通じて同定された遺伝子を標的化することによって最適化することもできる。これらは、例えば、ＰＵＳＬ１（プソイドウリジル酸シンターゼ様１）（ＣＨＯ−Ｐｕｓｌ１：配列番号：３１５７２３７；ｓｉＲＮＡ 配列番号：３２４９２１７〜３２４９３１６）；ＴＰＳＴ１（チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ１）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｔｐｓｔ１、ＧｅｎｅＩＤ：４１７５４６）（ＣＨＯ ＴＰＳＴ１：配列番号：２６１３、対応するｓｉＲＮＡ：配列番号：８５８８０８〜８５９１０４）、およびＷＤＲ３３（ＷＤ反復ドメイン３３）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｗｄｒ３３、ＧｅｎｅＩＤ：４２４７５３）（ＣＨＯ：配列番号：３４３３、対応するｓｉＲＮＡ：配列番号：１１３８３４１〜１１３８６４９）（Ｂｒａｓｓら１３９ Ｃｅｌｌ １２４３−５４（２００９））；Ｎｏｄ２（ヌクレオチド−結合オリゴマー化ドメイン含有２）（ＣＨＯ：配列番号：６８５８；ｓｉＲＮＡ 配列番号：２３２２１２３〜２３２２４２９）（Ｓａｂｂａｈら１０ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７３−８０（２００９））；ＭＣＴ４（溶質キャリアファミリー１６、メンバー４［モノカルボン酸トランスポーター４］）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｍｃｔ４、ＧｅｎｅＩＤ：３９５３８３）、ＡＣＲＣ（酸性反復含有）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＡｃｒＣ．ＧｅｎｅＩＤ：４２２２０２）、ＡＭＥＬＹ、ＡＴＣＡＹ（小脳、カイマンタイプ［カイタキシン］）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ａｔｃａｙ、ＧｅｎｅＩＤ：４２００９４）、ＡＮＰ３２Ｂ（酸性［ロイシン−リッチ］核ホスホタンパク質３２ファミリーメンバー）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ａｎｐ３２Ｂ、ＧｅｎｅＩＤ：４２００８７）、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、ＤＯＣＫ４（サイトキネシスのデディケーター４）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｄｏｃｋ４、ＧｅｎｅＩＤ：４１７７７９）、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ（ＦＫ５０６結合タンパク質１Ｂ）（例えば、ヒトＦＫＣＢ１Ｂ、ＧｅｎｅＩＤ：２２８１、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｆｋｂｐ１ｂ、ＧｅｎｅＩＤ：１４２２６、Ｇａｌｌｕｓ Ｆｋｂｐ１Ｂ、ＧｅｎｅＩＤ：３９５２５４）、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８（ｋｅｌｃｈ反復およびＢＴＢ［ＰＯＺ］ドメイン含有８）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｋｂｔｂｄ８、ＧｅｎｅＩＤ：４１６０８５）、ＫＩＡＡ０７５３（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｋｉａａ０７５３、ＧｅｎｅＩＤ：４１７６８１）、ＬＰＧＡＴ１（リソホスファチジル−グリセロールアシルトランスフェラーゼ１）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｌｐｇａｔ１、ＧｅｎｅＩＤ：４２１３７５）、ＭＳＭＢ（ミクロセミノタンパク質β）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｍｓｍｂ、ＧｅｎｅＩＤ：４２３７７３）、ＮＦＳ１（窒素固定１ホモログ）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｎｆｓ１、ＧｅｎｅＩＤ：４１９１３３）、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３（ヌクレオホスミン／ヌクレオプラスミン３）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｎｐｍ３、ＧｅｎｅＩＤ：７７０４３０）、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４（溶質キャリアファミリー１６、メンバー４［モノカルボン酸トランスポーター５］）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｓｌｃ１６ａ４、ＧｅｎｅＩＤ：４１９８０９）、ＳＰＴＢＮ４（スペクトリン、β、非赤血球４）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ ＳｐｔＢｎ４、ＧｅｎｅＩＤ：４３０７７５）、またはＴＭＥＭ１４６（Ｋｒｉｓｈｎａｎら２００８）を含む。
免疫原生産を最適化するように影響され得る他の標的遺伝子は、ＣＤＫＮ１Ｂ（サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｂ、ｐ２７、ｋｉｐ１）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｃｄｋｎ１ｂ、ＧｅｎｅＩＤ：３７４１０６）、ｐ２７ｋｉｐ１に対するｓｉＲＮＡが増殖を誘導する標的（Ｋｉｋｕｃｈｉら４７ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．４８０３−０９（２００６））；またはＦＯＸ０１、ｓｉＲＮＡが大動脈内皮細胞増殖を誘導する標的（ＦｏｓｂｒｉｎｋらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９００９−１８（２００６））のような細胞周期および／または細胞増殖に関連する遺伝子を含む。かくして、例えば、ＣＥＦまたは他のニワトリ細胞において、細胞***に関するＣＤＫＮ２Ａの発現は、配列番号：３１５４６６３〜３１５４６９６（Ｇａｌｌｕｓ、センス）および配列番号：３１５４６９７〜３１５４７３０（Ｇａｌｌｕｓ、アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子を用いて変調することができる。
反応性酸素種（ＲＯＳ）は宿主細胞に対して毒性であって、非特異的酸化、分解および／または切断、および増大した不均一性に導く免疫原性作用物質の他の構造的修飾、減少した生物学的活性、より低い回収、および／または本明細書中に提供された方法によって生産されたバイオロジックに対する他の損傷を媒介し得る。従って、免疫原性作用物質の生産は、ＮＡＤ（ｐ）Ｈオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ（例えば、各々、配列番号：７２１３、配列番号：７５８２、配列番号：８０１１、および配列番号：９７５６のオリゴヌクレオチドによってコードされた、グルタチオンペルオキシダーゼ１、グルタチオンペルオキシダーゼ４、グルタチオンペルオキシダーゼ８（推定）、グルタチオンペルオキシダーゼ３）のようなペルオキシダーゼ（ＲＮＡエフェクター分子：各々、配列番号：２４３９２１７〜２４３９６１２、配列番号：２５６０５５９〜２５６０８９５、配列番号：２７０３８６５〜２７０４２２５、配列番号：３１５１５８９〜３１５１６８５）、ミエロペルオキシダーゼ、構成的ニューロン一酸化窒素シンターゼ（ｃｎＮＯＳ）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）（配列番号：３７４８４６〜３７５２１６）およびミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、１５−リポキシゲナーゼ−１（配列番号：２４８００１８〜２４８０３６２）、ＮＡＤＰＨチトクロームｃレダクターゼ、ＮＡＰＨチトクロームｃレダクターゼ、ＮＡＤＨチトクロームｂ５レダクターゼ（各々、配列番号：５６９４６０〜５６９７７７、配列番号：１２６１９１０〜１２６２２１８、配列番号：２１９５３１１〜２１９５６８１、配列番号：３１４６０４８〜３１４６０７１、配列番号：２５９８２７〜２６００６０）、およびチトクロームＰ４５０２Ｅ１よりなる群から選択されるＣＨＯ細胞タンパク質のような、プロ−オキシダント酵素の発現を変調することによって増強される。
加えて、タンパク質の生産は、各々、配列番号：２４４７３４０〜２４４７６３２、配列番号：２４６３７８２〜２４６４０７３、配列番号：２４６６００４〜２４６６２７４、配列番号：２６５９５０２〜２６５９８７１、配列番号：２７３１０７６〜２７３１４４０、配列番号：２７４８５８３〜２７４８９１４、配列番号：２８９５０１５〜２８９５３５９、配列番号：２９０４１８３〜２９０４５３０、配列番号：２９６６３６２〜２９６６６５７、配列番号：３０８８８４８〜３０８９０６１、配列番号：３１０７７０６〜３１０７９１９、および配列番号：３１２２５８９〜３１２２７３４よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む対応するＲＮＡエフェクター分子、またはサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の使用によって、サイクリン（例えば、サイクリンＭ４、サイクリンＪ、サイクリンＴ２、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ａ（Ｐ２１）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｂ、サイクリンＭ３、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ｐ１５、ＣＤＫ４を阻害する）、サイクリンＥ２、Ｓ１００カルシウム−結合タンパク質Ａ６（カルシクリン）、サイクリン依存性キナーゼ５、調節サブユニット１（ｐ３５）、サイクリンＴ１、ＣＤＫの阻害剤、サイクリンＡ１相互作用タンパク質１のような宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）の細胞周期に影響するタンパク質の発現を変調することによって増強することができる。いくつかの実施形態において、サイクリン依存性キナーゼは、ＣＤＫ２（配列番号：１１９３３３６〜１１９３６８４）、ＣＤＫ４（配列番号：１６０９５２２〜１６０９８５２）、Ｐ１０（配列番号：３０１３９９８〜３０１４２７４）、Ｐ２１（配列番号：２６５９５０２〜２６５９８７１）、Ｐ２７（配列番号：２７３１０７６〜２７３１４４０）、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ、およびＣＤＫ４（配列番号：１６０９５２２〜１６０９８５２）よりなる群から選択されるＣＨＯ細胞サイクリン依存性キナーゼである。例えば、種々の実施形態において、細胞周期進行に影響する１以上のタンパク質の発現は、異種タンパク質生産の成長および／または生産期の間に一過的に変調して、異種タンパク質の発現および回収を増強させることができる。
加えて、バイオプロセシングにおける過剰なアンモニアの生産は大規模な細胞培養において共通の問題である。高いアンモニア濃度は、細胞株およびプロセスの条件に依存して、低下した細胞および産物の収率をもたらす。アンモニアの遊離は、グルタミナーゼによるグルタミンのグルタメートへの分解を通じて、および／またはグルタミン酸デヒトロゲナーゼによるグルタメートのａ−ケトグルタレートへの変換を通じて起こると考えられる。従って、１つの実施形態において、バイオロジックの生産は、グルタミナーゼまたはグルタミン酸デヒドロゲナーゼのような、アンモニアの生産に影響するタンパク質の発現を変調することによって増強させることができる。特別な実施形態は、配列番号：３１１の転写体を有するＣＨＯ細胞グルタミナーゼ（ＣＨＯ３１１．１）を標的化するＲＮＡエフェクターを提供する。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクターは、グルタミナーゼを標的化する、配列番号：１０５１７０〜１０５４３８から選択されるｓｉＲＮＡである。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクターは、配列番号：５６９を有するＣＨＯ細胞グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＣＨＯ５６９．１）を標的化する。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクターは、ＣＨＯ細胞グルタミン酸デヒドロゲナーゼ１を標的化する、配列番号：１７７７７９〜１７８０１０から選択されるｓｉＲＮＡである。
細胞培養における乳酸の生産は細胞の成長を阻害し、解糖およびグルタミノリシスに関与する代謝経路に影響することが知られている（Ｌａｏ ＆ Ｔｏｔｈ，１３ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｒｏｇ．，６８８−９１（１９９７））。細胞中へのラクテートの蓄積は、主として、グルコースのＣＯ２およびＨ２Ｏへの不完全な酸化によって引き起こされ、そこでは、グルコースのほとんどはピルベートまで酸化され、最終的には、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によってラクテートまで変換される。細胞中への乳酸の蓄積は、高い細胞の密度および生存性を達成するのに有害である。従って、１つの実施形態において、免疫原性タンパク質生産は、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）のような、ラクテート形成に影響するタンパク質の発現を変調することによって増強される。よって、特別な実施形態は、ＬＤＨＡ１遺伝子を標的化するＲＮＡエフェクター分子を提供する。
いくつかの実施形態において、細胞のグルコースの利用は、例えば、標的遺伝子ＭｙｃおよびＡＫＴの発現の変調によって操作される。１つの実施形態において、標的遺伝子は配列番号：２１８５の配列を含むＣＨＯミエロサイトマトーシス癌遺伝子（ＣＨＯ２１８５．１）である。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：７１３４３８〜７１３７４５から選択される配列を有するｓｉＲＮＡである。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：７１３４３８〜７１３４７３から選択される配列を有するｓｉＲＮＡである。１つの実施形態において、標的遺伝子は、配列番号：１７９３のヌクレオチドを含むＣＨＯ胸腺腫ウイルスプロト−癌遺伝子−１（ＣＨＯ１７９３．１）である。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：５８１２８６〜５８１６４３から選択される配列を有するｓｉＲＮＡである。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：５８１２８６〜５８１３３４から選択される配列を有するｓｉＲＮＡである。
１つの実施形態において、細胞培養は、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＬＤＨの発現の変調を可能とするＲＮＡエフェクター分子で本明細書中に記載されたように処理される。１つの実施形態において、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＬＤＨを標的化するＲＮＡエフェクター分子は、１以上のさらなるＲＮＡエフェクター分子および／または剤と組み合わせて投与することができる。本明細書中において、所望により、さらなるＲＮＡエフェクター分子、または本明細書中に記載された他の生体活性剤と組み合わせることができる、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＬＤＨ発現を標的化するＲＮＡエフェクター分子のカクテルが提供される。
いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質の生産は、ＬＤＨまたはリソソームＶ型ＡＴＰａｓｅのような、細胞ｐＨに影響するタンパク質の発現を変調することによって増強される。
いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質の生産は、例えば、（ＲＮＡエフェクター分子と共に、ここに、該ＲＮＡエフェクター分子は配列番号：６９０９１〜６９４０４（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む）ＲＮＡエフェクター分子（ここに、ＲＮＡエフェクター分子は配列番号：４３８１５５〜４３８４９０よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ＰＴＥＮ（配列番号：６０９１〜６９４０）を含む）、または（ＲＮＡエフェクター分子と共に、ここに、該ＲＮＡエフェクター分子は配列番号：１２９７２８３〜１２９７６０４よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む−ＬＤＨについては表１０も参照）ＬＤＨと細胞とを接触させることによって、ＧＬＵＴ１のような、炭素の代謝または輸送に影響するタンパク質の発現を変調することによって増強される。
Figure 2014501489
 いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質の生産は、コフィリン（例えば、筋肉コフィリン２、または非筋肉コフィリン−１）の発現を変調することによって増強される。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子を持つ細胞であり、ここに、該ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：４３５２１３〜４３５６１０よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含み、ＣＨＯ筋肉コンフィリン２（配列番号：１３６６）を標的化する。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子を持つ細胞であり、ここに、該ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：１９１４０３６〜１９１４３５６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含み、ＣＮＯ非筋肉コンフィリン１（配列番号：５７１６）を標的化する。
いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質の生産は、ＡｐｏＥ、マンノース／ＧａｌＮＡｃ−受容体、およびＥｒｉｌのような、宿主細胞におけるＲＮＡエフェクター分子の摂取または効率に影響するタンパク質の発現を変調することによって増強される。種々の実施形態において、細胞においてＲＮＡｉの摂取または効率に影響する１以上のタンパク質の発現は、本明細書中に記載された標的遺伝子のような、１以上のさらなる標的遺伝子の変調と同時に本明細書中に提供された方法に従って変調して、１以上のさらなる標的遺伝子の変調の度合いおよび／または程度を増強される。
いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質の生産は、成長の阻止および増加した生産性を引き起こす宿主細胞におけるストレス応答を誘導することによって増強される。ストレス応答は、例えば、栄養素利用性の制限、溶質の濃度の増加、または低い温度またはｐＨシフト、および酸化的ストレスによって誘導することができる。増大した生産性と共に、ストレス応答もまた、タンパク質の折畳みおよび分泌に対して悪影響を有し得る。いくつかの実施形態において、そのような有害効果は、本明細書中に記載されたタンパク質折畳みおよび／または分泌に影響するタンパク質のようなストレス応答タンパク質をコードする標的遺伝子の発現を変調することによって軽減される。
いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質の生産は、細胞骨格構造に影響するタンパク質の発現を変調することによって、例えば、モノマーおよびフィラメント状アクチンの間の平衡を改変することによって増強される。１つの実施形態において、標的遺伝子はコフィリンをコードし、ＲＮＡエフェクター分子はコフィリンの発現を阻害する。１つの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子は、細胞質アクチンキャッピングタンパク質（ＣａｐＺ）、エズリン（ＶＩＬ２）、およびラミニンＡよりなる群から選択される標的遺伝子の発現を増加させる。例えば、以下の表５参照。
Figure 2014501489
 ＲＮＡエフェクター分子による標的遺伝子の発現の変調（例えば、阻害）は、第二のＲＮＡエフェクター分子を導入することによってさらに軽減することができ、ここに第二のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部は、宿主細胞においてＲＮＡｉを媒介するタンパク質をコードする標的遺伝子に対して相補的である。例えば、標的遺伝子の発現の変調は、該細胞に、アルゴノートタンパク質（例えば、アルゴノート−２）、または該細胞のＲＮＡｉ経路の他の成分の他の発現を変調するＲＮＡエフェクター分子を導入することによってさらに軽減することができる。１つの実施形態において、免疫原性作用物質は、免疫原性作用物質に対して標的化された第一のＲＮＡエフェクター分子を該細胞と接触させることによって一過的に阻害される。従って、免疫原性作用物質の発現の阻害は、ＲＮＡｉ経路のタンパク質をコードする遺伝子に対して標的化された第二のＲＮＡエフェクター分子を細胞に導入することによって緩和される。
加えて、所望の免疫原性作用物質の生産は、生産期の間にＲＮＡエフェクター分子を細胞に導入して、タンパク質発現、翻訳後修飾、折畳み、分泌、および／または所望の免疫原性作用物質の生産および／または回収に関連する他のプロセスに影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を変調することによって増強させることができる。別法として、免疫原性作用物質の生産は、生産期の間に細胞の成長および／または細胞の***を阻害するＲＮＡエフェクター分子を細胞に導入することによって増強される。
翻訳後プロセシング
翻訳後修飾は、修飾されたおよび修飾されていないポリペプチドを分離するためのさらなるバイオプロセス工程、増大するコスト、およびバイオロジック生産の効率の低下を必要とし得る。従って、いくつかの実施形態において、細胞におけるポリペプチド剤の生産では、翻訳後修飾に影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を変調することによって増強される。さらなる実施形態において、バイオロジック生産は、第一の翻訳後修飾に影響するタンパク質をコードする第一の標的遺伝子の発現を変調し、第二の翻訳後修飾に影響するタンパク質をコードする第二の標的遺伝子の発現を変調することによって増強される。
より具体的には、真核生物細胞で発現されたタンパク質は、生産および／または構造、生物学的活性、安定性、均一性、および／または免疫原性作用物質の他の特性を損傷し得るいくつかの翻訳後修飾を受け得る。これらの修飾の多くは細胞の成長およびポリペプチドの発現の間に自発的に起こり、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、および所与のポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端を含むいくつかの部位で起こり得る。加えて、所与のポリペプチドは、いくつかの異なるタイプの修飾を含むことができる。例えば、鳥類および哺乳動物細胞において発現されたタンパク質はアセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ユビキチン化、メチオニン酸化、ジスルフィド結合形成、メチル化、脱メチル化、硫酸化、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、グルコノイル化、配列突然変異、Ｎ−末端グルタミン環化および脱アミド化、およびアスパラギン脱アミド化を受け得る。Ｎ−末端アスパラギン脱アミド化は、（例えば、配列番号：５９５０によってコードされる）Ｎ−末端Ａｓｎアミダーゼを標的化するＲＮＡエフェクター分子と細胞を接触させることによって低下させることができ、ここに、該ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：１９９９４１０〜１９９９７５６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９）を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、免疫原の生産は、タンパク質脱アミド化に関与するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を変調することによって増強される。タンパク質は、Ｎ−末端グルタミンの環化および脱アミド化、ならびにアスパラギンの脱アミド化を含むいくつかの経路を介して脱アミド化することができる。かくして、１つの実施形態において、タンパク質脱アミド化に関与するタンパク質は、Ｎ−末端アスパラギンアミドヒドロラーゼである。タンパク質脱アミド化は、改変された構造的特性、低下した能力、低下した生物学的活性、低下した効率、増大された免疫原性、および／または他の望ましくない特性に導くことができ、限定されるものではないが、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、毛細管電気泳動、天然ゲル電気泳動、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、質量分析、またはＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼによる電荷に基づくタンパク質の分離を含む、いくつかの方法によって測定することができる。
免疫原性作用物質が、ウイルス表面膜タンパク質、またはグリコシル化アミノ酸残基を有するモノクローナル抗体を有するウイルス産物のような糖タンパク質を含む場合、バイオロジックの生産は、タンパク質グリコシル化に関与するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を変調することによって増強させることができる。グリコシル化パターンは、しばしば、哺乳動物糖タンパク質の構造および機能の重要な決定因子であって、糖タンパク質の溶解性、熱安定性、プロテアーゼ耐性、抗原性、免疫原性、血清中半減期、安定性、および生物学的活性に影響し得る。
種々の実施形態において、グリコシル化に影響するタンパク質は、ドリキル−ジホスホオリゴ糖−タンパク質グリコシルトランスフェラーゼ（配列番号：２７４２８９４〜２７４３２３９）、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃベータ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（配列番号：８５１１１５〜８５１４８９、配列番号：１５５２４６１〜１５５２７２８、配列番号：１５６２８１３〜１５６３１０８、および配列番号：１６３５１７３〜１６３５５６１）、ＵＤＰ−ガラクトース−セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ（配列番号：２０９８４１〜２１０２２７）、タンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ（配列番号：９１６７２６〜９１７０３５）、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（配列番号：５７１４７〜５７４２２、配列番号：６５７３７〜６５９９９、配列番号：１０１３００２〜１０１３３７６、配列番号：１３６３５８３〜１３６３７９０、配列番号：１５４６６０９〜１５４６９９９、配列番号：１９６５２１７〜１９６５６１３、配列番号：２８７６２４１〜２８７６５９５）、特に、Ｔ４（配列番号：２８７６２４１〜２８７６５９５）、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（配列番号：６０６０１２〜６０７３４８）、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（配列番号：８９７３〜９００２４、配列番号：２６２３６８〜２６２６２１）、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、およびα−ガラクトシダーゼ（配列番号：１６００９６８〜１６０１２８８）およびβ−ガラクトシダーゼ（配列番号：６９０６０１〜６９０９８９）よりなる群から選択される。
他の実施形態において、グリコシル化に影響するタンパク質は、例えば、以下のように、表６から選択される。
Figure 2014501489
Figure 2014501489
さらなる実施形態において、免疫原性糖タンパク質の生産は、シアリダーゼまたはシアリルトランスフェラーゼ酵素の発現を変調することによって増強される。糖タンパク質の末端シアル酸残基は、糖タンパク質の溶解性、熱安定性、プロテアーゼ攻撃に対する抵抗性、抗原性、および特異的活性の特に重要な決定因子である。例えば、末端シアル酸が血清糖タンパク質から除去されると、脱シアル化タンパク質は、シアル化カウンターパートに対して、生物学的活性を有意に減少させ、循環半減期を降下させている。糖タンパク質中でのシアル酸の量は、２つの対向するプロセス、すなわち、シアリルトランスフェラーゼによるシアル酸の細胞内添加およびシアリダーゼによるシアル酸の除去の結果である。かくして、いくつかの実施形態において、糖タンパク質の生産は、シアリダーゼの発現を阻害し、および／またはシアリルトランスフェラーゼの発現を活性化することによって増強される。例としてのシアリルトランスフェラーゼ標的および例示的なｓｉＲＮＡは以下の表７に見出される。
Figure 2014501489
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いくつかの実施形態において、免疫原性作用物質の生産は、Ｎ−末端グルタミン残基のピログルタミン酸への分子内環化を触媒するグルタミニルシクラーゼの発現を変調させ、アンモニアを遊離させる（ピログルタメーション）ことによって増強される。グルタミニルシクラーゼの変調は、細胞を、グルタミニルシクラーゼ遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子（例えば、配列番号：５４８６によってコードされるハムスターグルタミルシクラーゼ）と細胞を接触させることによって達成することができ、ここに、該ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：１８３２６２６〜１８３２９９３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合を含有する免疫原性作用物質の生産は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼまたはスルフフィドリルオキシダーゼのような、ジスルフィド結合の酸化、還元、および／または異性化に影響するタンパク質の発現を変調することによって増強される。ジスルフィド結合の形成は、真核生物細胞培養におけるマルチ−サブユニットのタンパク質またはペプチドの生産にとって特に問題であり得る。マルチ−サブユニットのタンパク質またはペプチドの例は、ＭＨＣタンパク質、全鎖抗体および抗体断片、酵素および膜タンパク質のような、受容体、細胞外マトリックスタンパク質、免疫調節因子を含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質の生産は、メチオニン酸化に影響するタンパク質の発現を変調することによって増強される。反応性酸素種（ＲＯＳ）はメチオニン（Ｍｅｔ）をメチオニンスルホキシド（ＭｅｔＯ）に酸化することができ、その結果、増大した分解および産物の不均一性、および低下した生物学的活性および安定性をもたらす。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＭｅｔＯ残基のメチオニンに戻す還元を触媒するメチオニンスルホキシドレダクダーゼをコードする。例えば、ここに、ＣＨＯ細胞ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：２０４４３８７〜２０４４６７６、配列番号：２５５７４９２〜２５５７８０９、および配列番号：３０７６１０４〜３０７６３０９よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む。
産業規模での細胞培養で生産された（いくつかの生きた弱毒化ウイルスを含む）免疫原性作用物質は、典型的には、培養された細胞によって分泌され、周囲の細胞培養基から回収され、精製される。一般に、タンパク質生産の速度、および回収されたタンパク質の収率は、宿主細胞によるタンパク質の折畳みおよび分泌の速度に直接的に関係している。例えば、宿主細胞の小胞体（ＥＲ）への誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積は、折り畳まれていないタンパク質の応答（ＵＰＲ）経路を介しての分泌を遅らせ、または停止させ得る。ＵＰＲは、過剰の折り畳まれていないタンパク質を検出するＥＲ膜中のストレス−検知タンパク質によってトリガーされる。ＵＰＲ活性化は、誤って折り畳まれたタンパク質に結合し、かつ適切な折畳みを促進するシャペロンタンパク質（例えば、Ｂｉｐ）のアップレギュレーションに導く。また、ＵＰＲ活性は、転写因子ＸＢＰ−１（例えば、ＣＨＯ細胞配列番号：１８７９５５〜１８８１５２）およびＣＨＯＰ（例えば、ＣＨＯ細胞配列番号：２８１３６２２〜２８１３９５６）をアップレギュレートする。ＣＨＯＰは、一般的には、細胞の成長、分化および生存の負のレギュレーターとして機能し、ＵＰＲを介するそのアップレギュレーションは細胞周期の阻止を引き起こし、細胞からの明らかな過剰の折り畳まれていないタンパク質へのタンパク質折畳みおよび分泌の速度を増加させる。よって、細胞周期は最初は促進され、次いで、ウイルス生産期の間に抑制されて、ウイルス産物収率を増加させることができる。宿主細胞による免疫原性タンパク質の分泌の速度は、例えば、経時的な培養基中に存在するタンパク質の量をモニターすることによって測定することができる。
本発明は、宿主細胞によるタンパク質分泌に影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を変調することによって、培養された真核生物宿主細胞における分泌されたポリペプチドの生産を増強させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ４（ＣＨＯ細胞、配列番号：１５５２０６７〜１５５２４６０）、ＡＴＦ６（ＣＨＯ細胞、配列番号：５７０１３８〜５６０４９８）、ｅＩＦ２α（ＣＨＯ細胞、配列番号：１８２８１２２〜１８２８４９２）、ＧＲＰ７８（ＣＨＯ細胞、配列番号：２９２５９０〜２９２８３７）、ＧＲＰ９４（ＣＨＯ細胞、配列番号：１８０５７４〜１８０９５４）、カルレチクリン（ＣＨＯ細胞、配列番号：８９５６９１〜８９６０５１）のようなＵＰＲ経路のタンパク質、またはその変種、あるいは転写制御エレメント（例えば、シス−作用性ＵＰＲエレメント（ＵＰＲＥ））のようなＵＰＲ経路を調節するタンパク質をコードする。
タンパク質の分泌に関与する他の標的遺伝子は、例としてのハムスター転写体標的遺伝子および例示的ｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）を確認する表８にリストされている。
Figure 2014501489
 いくつかの実施形態において、タンパク質の分泌に影響するタンパク質は、Ｈｓｐ４０（例えば、ＣＨＯ細胞配列番号：６７７２０３〜６７７５５８）、ＨＳＰ４７（例えばＣＨＯ細胞配列番号：７７７０３６〜７７７３１７）、ＨＳＰ６０（例えば、ＣＨＯ細胞配列番号：４９４７４３〜４９５０８６）、Ｈｓｐ７０（例えば、ＣＨＯ細胞配列番号：３１４７０２９〜３１４７０８０）、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１００、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（例えば、ＣＨＯ細胞配列番号：７２７４８〜７２９９６）、ペプチジルプロリルイソメラーゼ（例えば、ＣＨＯ細胞配列番号：３８７８１〜３９０６７）、配列番号：１０７４１３９〜１０７４４７５、配列番号：１１２７０６１〜１１２７４２６、配列番号：１６４９１７０〜１６４９５１５、配列番号：２１９７１４６〜２１９７５３２、配列番号：２２５３９７８〜２２５４３７３、配列番号：２２６１７６５〜２２６２０５８、配列番号：２２７５３３０〜２２７５６３３、配列番号：２５７９５４７〜２５７９９０８、および配列番号：３１１５０１０〜３１１５１９９）、カルネキシン（例えば、ＣＨＯ細胞配列番号：６１５５９〜６１７８５）、Ｅｒｐ５７（例えば、ＣＨＯ細胞配列番号：７７４３５５〜７７４６７７）、およびＢＡＧ−１よりなる群から選択される分子シャペロンである。
いくつかの実施形態において、タンパク質の分泌に影響するタンパク質は；γ−セクレターゼ、ｐ１１５、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）タンパク質、セクレチン、およびキナーゼ（例えば、ＭＥＫ）よりなる群から選択される。
細胞培養における免疫原性作用物質の生産は、免疫原性作用物質に対して親和性を有するタンパク質、または免疫原性作用物質に対して特異的に結合する分子または因子によって負に影響され得る。例えば、多数の異種タンパク質が、宿主細胞表面における糖タンパク質ヘパリンおよびヘパラン硫酸に結合することが示されている。これは、組換えタンパク質産物との、ヘパリン、ヘパラン硫酸、および／またはヘパリン／ヘパラン硫酸−結合タンパク質の共精製に導くことができ、収率を減少させ、および回収されたタンパク質の不均一性、安定性、生物学的活性および／または他の特性を低下させる。ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸に結合されることが示されている異種タンパク質の例は、ＢＭＰ３（骨形態形成タンパク質３またはオステオゲニン）、ＴＮＦ−α、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ−βファミリーメンバー、およびＨＧＦを含む。従って、１つの実施形態において、培養された宿主細胞におけるＢＭＰ３、ＴＮＦ−α、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ−βファミリーメンバー、またはＨＧＦ、あるいは別の免疫原性作用物質のような異種タンパク質の生産は、細胞を、ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸の発現および／または生産を変調（例えば、阻害）するＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって増強される。１つの実施形態において、ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸のレベルは、宿主細胞キシロトランスフェラーゼ（配列番号：１５５４７７４〜１５５５０５４）のような、ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸の生産に関与する宿主細胞酵素の発現を変調することによって低下する。
いくつかの実施形態において、例えば、免疫原性作用物質がインフルエンザウイルスのようなウイルス粒子である場合、標的遺伝子は、ウイルス結合を低下させ、従って、細胞培養基におけるウイルスの回収を増加させる（すなわち、より少ないウイルスが宿主細胞膜上に積み重ねられたままである）、宿主細胞表面からシアル酸を低下させることに関与するものを含むことができる。これらの標的は、溶質キャリアファミリー３５（ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター）メンバーＡ１（ＳＬＣ３５Ａ１）（例えば、Ｍ．ｍｕｓｃｕｓｌｕｓ Ｓｌａｃ３５ａｌから導かれるＣＨＯ遺伝子、ＧｅｎｅＩＤ：２４０６０）（配列番号：３１５４３４５〜３１５４３６８および配列番号：３１５４３６９〜３１５４３９２から選択されるＧａｌｌｕｓ標的遺伝子配列）（配列番号：４６４６７４〜４６５０５５から選択されるＣＨＯ細胞標的遺伝子配列）、溶質キャリアファミリー３５（ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター）、メンバーＡ２（ＳＬＣ３５Ａ２）（例えば、Ｍ．ｍｕｓｃｕｓｌｕｓ Ｓｌｃ３５ａ２から導かれるＣＨＯ遺伝子、ＧｅｎｅＩＤ：２２２３２）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）（例えば、Ｍ． ｍｕｓｃｕｓｌｕｓ Ｇｎｅから導かれたＣＨＯ遺伝子、ＧｅｎｅＩＤ：１００９０）（配列番号：３１５４２９７〜３１５４３２０および配列番号：３１５４３２１〜３１５４３４４から選択されるＧｌｌｕｓ標的遺伝子配列）（配列番号：２０７３９７１〜２０７４３６８から選択されるＣＨＯ細胞標的遺伝子配列）、シチジンモノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（Ｃｍａｓ）例えば、Ｍ．ｍｕｓｃｕｓｌｕｓ Ｃｍａｓから導かれたＣＨＯ遺伝子、ＧｅｎｅＩＤ：１２７６４）（配列番号：３１５４２４９〜３１５４２７２および配列番号：３１５４２７３〜３１５４２９６から選択されるＧａｌｌｕｓ標的遺伝子配列）（配列番号：１６３３１０１〜１６３３４０６から選択されるＣＨＯ細胞標的遺伝子）、ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＴ１）（例えば、Ｍ．ｍｕｓｃｕｓｌｕｓ Ｂ４ｇａｌＴ１から導かれたＣＨＯ遺伝子、ＧｅｎｅＩＤ：１４５９５）（配列番号：３１５４１５３〜３１５４１７６および配列番号：３１５４１７７〜３１５４２００から選択されるＧａｌｌｕｓ標的遺伝子配列）（配列番号：２５２８４５４〜２５２８７６３から選択されるＣＨＯ細胞標的遺伝子配列）、およびＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃ β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド６（Ｂ４ＧａｌＴ６）（例えば、Ｍ．ｍｕｓｃｕｓｌｕｓ Ｂ４ＧａｌＴ６から導かれたＣＨＯ遺伝子、ＧｅｎｅＩＤ：５６３８６）（配列番号：３１５４２０１〜３１５４２２４および配列番号：３１５４２２５〜３１５４２４８から選択されるＧａｌｌｕｓ標的遺伝子配列）（配列番号：１６３５１７３〜１６３５５６１から選択されるＣＨＯ細胞標的遺伝子配列）を含む。
さらなる標的は鳥類宿主シアリダーゼに関与するものを含むことができる（Ｗａｎｇら１０ ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５１２（２００９）参照）。なぜならば、インフルエンザは細胞表面シアル酸残基に結合し、かくして、減少したシアリダーゼは感染または精製の速度を増加させることができるからである：ＮＥＵ２シアリダーゼ２（サイトゾルシアリダーゼ）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｎｅｕ２、ＧｅｎｅＩＤ：４３０５４２）およびＮＥＵ３シアリダーゼ３（膜シアリダーゼ）（例えば、Ｇａｌｌｕｓ Ｎｅｕ３、ＧｅｎｅＩＤ：６８８２３）。さらなる標的遺伝子は、これが細胞中でよく成長しないいくつかのウイルスの基礎となっているかを決定するのに用いることができるｍｉＲＮＡアンタゴニスト、例えば、ダイサー（ダイサー１、リボヌクレアーゼＩＩＩ型）を含む。なぜならば、ダイサーのノックダウンは、感染の速度の中程度の増加に導くからである（Ｍａｔｓｋｅｖｉｃｈら８８ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２６２７−３５（２００７））；あるいはデコイはＩＳＲＥ含有プロモーターから離れるようにＴＦｓを滴定するので、ＩＳＲＥ（インターフェロン−刺激応答エレメント）が含まれる。シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）に関連する例示的な遺伝子および標的は以下の表９に示される。
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 産業的規模での免疫原性作用物質の製造のためのバイオプロセスの使用は、しばしば、活性ウイルス粒子、および他の偶発的剤（例えば、プリオン）のような病原体の存在によって混乱され、しばしば、調節手法に適合させるためにそれらの検出、除去（例えば、ウイルス濾過）および／または不活化（例えば、熱処理）のための出費がかさみかつ時間が消費される工程の処理を必要とする。そのような問題は、そのようなウイルスの存在の検出およびモニタリングの混乱性のため悪化し得る。従って、いくつかの実施形態において、宿主細胞の病原性感染に対する感受性に影響する標的遺伝子の発現を変調することによって免疫原性作用物質の生産を増強させる方法が提供される。例えば、いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、膜貫通タンパク質ＸＰＲ１（例えば、ＣＨＯ細胞配列番号：６２０２１〜６２３６２）、ＲＤＲ、Ｆｌｖｃｒ、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４、Ｐｉｔ１、およびＰｉｔ２（例えば、ＣＨＯ細胞配列番号：３０６８２２２〜３０６８４５５）のようなウイルス感染性を媒介する宿主細胞タンパク質である。
標的配列は、一般に、長さが１０〜３０ヌクレオチドであるが、いずれかの所与の標的ＲＮＡの切断を指令するためのこの範囲における特定の配列の適当性において広い変動がある。種々のソフトウエアパッケージおよび本明細書中に記載されたガイドラインは、いずれかの所与の遺伝子標的に対する最適な標的配列の同定のための指針を提供するが、経験的なアプローチも採用することができ、そこでは、所与のサイズ（非限定的例として、２１ヌクレオチド）の「ウインドウ」または「マスク」が標的ＲＮＡ配列上に文字通りにまたは比喩的に置かれて（例えば、イン・シリコを含む）、標的配列として働くことができるサイズ範囲の配列を同定する。配列「ウインドウ」を最初の標的配列のロケーションの蒸留または下流に徐々に１ヌクレオチドだけ移動させることによって、可能な配列の完全な組がいずれかの選択された所与の標的サイズについて同定されるまで、次の潜在的標的配列を同定することができる。実行するこれらの配列を同定するために（本明細書中に記載されたアッセイを用いて、または当分野で知られたように）系統的な合成および同定された配列のテストとカップリングされたこのプロセスは、最適には、ＲＮＡエフェクター分子剤で標的化された場合に、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するこれらのＲＮＡ配列を同定することができる。かくして、本明細書中で同定された配列は効果的な標的配列を表すが、阻害効率のさらなる最適化は、所与の配列の下流または上流へ１ヌクレオチドだけ徐々に「ウインドウを歩いて」、同等なまたはより良好な阻害特徴を持つ配列を同定することによって達成することができると考えられる。
さらに、本明細書中で同定されたいずれの配列についても、ヌクレオチドを系統的に加えるかまたは除去するか、のいずれかをして、より長いまたは短い配列を生じさせ、それら、およびその地点から標的ＲＮＡを上にまたは下により長いまたはより短いサイズのウインドウの歩行によって生じた配列をテストすることによって、さらなる最適化を達成できよう。新しい候補標的を生じさせることに対するこのアプローチを、当分野で公知の、または本明細書中に記載された粗害アッセイにおけるそれらの標的配列に基づいてＲＮＡエフェクター分子の有効性についてテストすることとカップリングさせると、阻害の有効性のさらなる改善に導くことができる。なおさらに、そのような最適化された配列は、例えば、本明細書中に記載された、または当分野で公知の修飾されたヌクレオチドの導入、突出の負荷または変化、あるいは発現阻害剤としての分子をさらに最適化するための当分野で公知の、および／または本明細書中で議論された他の修飾（例えば、血清中安定性または循環半減期の増加、熱安定性の増加、膜貫通送達の増強、特定のロケーションまたは細胞型に対する標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増大、エンドソームからの放出の増大等）によって調製することができる。
ＩＩＩ．バイオ汚染
ＣＨＯ細胞のような、バイオテクノロジー製造プロセスにおいて共通的に使用される細胞株は、レトロウイルス様粒子を生産することが証明されている。さらに、大規模なバイオロジック製造プロセスにおけるＭＭＶ（マウス微小ウイルス）汚染が起こっており、これは、生産で用いられる原料の偶発的汚染に帰せられた。結果として、国際的規制当局は、バイオロジック製造業者が、細胞株および原料の特徴付け、頑強なウイルス不活化および除去工程の使用、およびプロセス中間体および最終産物のテストを含む、包括的なウイルスクリアランス戦略を使用することを要求する。クロマトグラフィー方法、物理化学的不活化（例えば、低いｐＨ、溶媒洗剤）、およびサイズ排除ベースの濾過を含む多数の関係しない工程が、一緒になって、ウイルスの累積的不活化および除去を生じさせる。例えば、Ｍａｒｑｕｅｓら２５ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｒｏｇ．４８３−９１（２００９）；Ｋｈａｎら５２ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９３−３０１（２００９）参照。ウイルスクリアランスおよびクリアランス検証は、バイオプロセシングにおいて最も時間を消費し、かつ収益を減少させる活動のなかのものであり：下流プロセシングは合計バイオ製造コストの約７０％を占める。Ｃｈｏｃｈｏｉｓら３６ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｌ．（２００９年６月）。下流バイオプロセシング濾過産物は、単独で、バイオテクノロジーおよびワクチンメーカーのコストを毎年十億ドルを超えるものとしている。
かくして、さらなる実施形態において、生産は、細胞に、宿主細胞においてウイルスタンパク質の発現を阻害するＲＮＡエフェクター分子を導入することによって増強される。より具体的には、例えば、（ヘルペスウイルスのような）潜在的ＤＮＡウイルス、および内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）またはレトロウイルスエレメントは全ての脊椎動物に存在するようである。内因性レトロウイルスの配列は真核生物ゲノムの統合的部分であるが、これらの配列の大部分は欠陥があり、いくつかは、同時にまたは長期の培養に対して、感染性ウイルスを生産し得る。ＥＲＶウイルスの生産もまた、正常な生産系の一部であり得る種々の化学物質または他の剤での処理に際して誘導され得る。加えて、多くの内因性レトロウイルスはそれら自身の細胞に容易に再度感染しないが、それらはイン・ビトロおよびイン・ビボにて他の種に感染し得る。例えば、ブタＥＲＶ（ＰＥＲ Ｖ）の３つの亜群のうち２つはイン・ビトロにてヒト細胞に感染し得る。
ヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）の少なくとも２６の区別される群があり；および鳥類、マウス、ネコ、およびブタは関連する内因性ウイルスと相互作用することができる複製能力があるＥＲＶを保有する。レトロウイルス誘導腫瘍原性は、レトロウイルス配列の上流または下流挿入によるロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）による複製能力があるおよび欠陥がある配列の間の組換えおよび／または細胞癌遺伝子の活性化による新規な病原性ウイルスの生成を含むことができる。かくして、バイオロジックの生産で用いられる細胞基質における内因性の感染性レトロウイルスの活性化は、最小の精製および不活化工程が高いワクチン能力を維持するために用いられる場合に、特に、生きたウイルスワクチンの場合に重要な安全性の関心事である。
偶発的ウイルスは、ヒトで用いるためのワクチンを含む、細胞−基質由来の生物学的物質の使用に関連した主たる危険性を表す。ウイルス汚染についての可能性は初代培養および樹立された培養、ならびにマスター・セル・バンク（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）、生産細胞の目的、およびバルク収穫流体に存在する。例えば、これは、形質転換のメカニズムが不明である新形成−不滅化細胞の使用に対して主な障害である。なぜならば、これらは癌遺伝子性ウイルスを含有するより高い危険性を有し得るからである。潜在的外来性剤の存在についての広範なテストが、従って、ウイルスの安全性を確認することが求められる。バイオロジックの偶発的ウイルス汚染についての最も普通のシナリオは、胎児ウシ血清中のウシウイルス性下痢ウイルス；ブタ基質におけるブタパルモウイルス；およびＣＨＯ細胞由来バルク収穫におけるマウス微小ウイルス、レオウイルス、ベシウイルス、およびカシュ渓谷ウイルスを含む。３つの最後の名称のウイルスの存在は、（スケールアップの間に、または全プロセスの間に）製造プロセスの間に用いられるウシ血清を介して導入されると信じられている。
生きた弱毒化ウイルスワクチンの生産の間に、汚染性ウイルス粒子、核酸またはタンパク質の除去は問題がある。なぜならば、いずれの抗ウイルスアプローチもウイルス産物を無傷かつ免疫原性のままにしなければならないからである。事実、内因性鳥類ウイルス粒子が、ニワトリ胚線維芽細胞に由来する商業的に放出されたヒトはしかおよびおたふくかぜワクチンで見出されている。さらに、内因性ウイルスタンパク質、特に、エンベロープタンパク質は、しばしば、形質転換細胞株を作り出すのに用いられる組換えウイルスベクターの有効性を阻害する。さらに、内因性ウイルスは、しばしば、ウイルスの生産またはレトロウイルスの形質導入の間にトリガーされた、宿主細胞の免疫応答を悪化させ得る。よって、偶発的、潜在的および内因性ウイルス活性を阻害し、かくして、細胞で生産された免疫原性作用物質の純度および収率を増加させる技術に対する要望が依然として存在する。
本発明は、細胞にＲＮＡエフェクター分子を導入して、偶発的、潜在的または内因性ウイルスの発現に関与する、所望により、タンパク質をコードする標的遺伝子の発現を変調することによって、免疫原性作用物質の生産を増強させることを提供する。かくして、いくつかの実施形態において、宿主細胞における免疫原性作用物質の生産は、細胞における所望の免疫原性作用物質の感染性および／または負荷が増大するように、潜在的または内因性ウイルスタンパク質の発現を阻害するＲＮＡエフェクター分子を細胞に導入することによって増強される。
例えば、細胞−培養ベースの不活化インフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス抗原の特別な利点は、卵タンパク質に対するアレルギー反応をトリガーするかもしれない卵−特異的タンパク質の不存在である。従って、本発明による使用は、特に、喘息患者、アレルギーを持つもの、および抑制された免疫性を持つヒト、および老人のようなより高い危険性の群を構成する集団において、インフルエンザウイルス感染の予防に特に適している。
ウイルス株が細胞培養において成長する培養条件もまた、該株の許容可能に高い収率を達成することに関して大きな重要性のものである。所望のウイルス株の収率を最大化するためには、宿主系および培養条件の双方を特異的に適合させて、所望のウイルス株の生産に有利な環境を提供しなければならない。多くのウイルスは、そのいくつかがウイルス収率に関して非常に非効率的である非常に特異的な宿主系に制限される。ウイルス宿主系として用いられる哺乳動物細胞のいくつかは高い収率にてウイルスを生産するが、そのような細胞の腫瘍原性質は、ワクチン生産でそれらを用いることに対する規則的拘束を惹起する。
細胞培養における血清および／または培養基に加えられた動物またはヒト源に由来するタンパク質添加剤の使用から生起する問題、例えば、異なるバッチの変化する変質および組成、およびマイコプラズマ、ウイルスまたはＢＳＥ剤での汚染の危険性は周知である。一般に、アルブミン、トランスフェリンまたはインスリンのような血清または血清由来物質は、培養およびそこから生じる免疫原性作用物質を汚染し得る望まない剤を含有し得る。さらに、ヒト血清由来添加剤は、血清によって伝達され得る、肝炎またはＨＩＶのような全て公知のウイルスについてテストされてきた。ウシ血清およびそれに由来する産物、例えば、トリプシンは、ウシ海綿状脳症−汚染の危険性を担っている。加えて、全ての血清由来産物は依然として不明な剤によって汚染され得る。従って、血清または他の血清由来を必要としない細胞および培養条件は追跡されつつある。
例えば、天然痘ワクチン生産では、修飾されたワクニシアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）は一次または二次ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞培養において増幅される。ＣＥＦは、１０〜１２日インキュベートされたニワトリ卵の胚から得られ、それから次いで細胞が解離され、精製される。これらの一次ＣＥＦ細胞は直接的に用いることができるか、あるいは１細胞継代の後に二次ＣＥＦ細胞として用いることができる。引き続いて、一次または二次ＣＥＦ細胞はＭＶＡで感染される。ＭＶＡの増幅では、感染された細胞は３７℃にて２〜３日間インキュベートされる。例えば、Ｍｅｙｅｒら７２ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１０３１−３８（１９９１）；Ｓｕｔｔｅｒら１２ Ｖａｃｃｉｎｅ １０３２−４０（１９９４）参照。多くのポックスウイルスは、３０℃のような３７℃未満の温度でインキュベートされたＣＥＦにおいて効果的に複製する。米国特許第６９，９２４，１３７号参照。
マディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）株のような樹立された哺乳動物細胞株の使用は、いくつかのウイルス株を複製するにおいて成功してきた。それにも拘わらず、多数のウイルス株はＭＤＣＫ系においては複製しないであろう。加えて、ヒトワクチン生産のための腫瘍形成潜在能力を持つ細胞の使用に関連した可能な有害効果についての心配は、この関係で、高度に形質転換された細胞株であるＭＤＣＫの使用を排除した。
別法ワクチン生産方法を開発する他の試みがなされてきた。米国特許第４，７８３，４１１号は、金魚細胞培養においてインフルエンザワクチンを調製する方法を議論する。金魚細胞培養を感染されるウイルス粒子は、それらの樹立後に、ニワトリ胚培養からまたは感染されたＣＤ−I株マウスから得られた。該ウイルスは金魚細胞培養において少なくとも２回継代され、その結果、生ワクチンとして用いることができる弱毒化インフルエンザウイルスがもたらされる。加えて、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）およびニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）が、無血清無タンパク質培地においてインフルエンザウイルスおよび組換えインフルエンザタンパク質を成長させ、および生産するように適合されてきた。ＷＯ ９６／０１５２３１参照。
タンパク質および無血清培地の使用は偶発的ウイルス汚染からの危険性を制限するが、それは、細胞バンクに存在する潜在的ウイルスまたは内因性レトロウイルスによって持ち出される継続した危険性に取り組んでいない。バイオロジックの生産で用いられる細胞基質における内因性の感染性レトロウイルスの活性化は、高いワクチン能力を維持するための最小の精製および不活化工程がある場合に、特に、ウイルス生ワクチンの場合に、重要な安全性の関心事である。
いくつかの実施形態において、ベシウイルスを標的化するＲＮＡエフェクター分子は、本明細書中に記載された方法および組成物と共に用いることができる。ベシウイルスを標的化する例示的なＲＮＡエフェクター分子は、限定されるものではないが、以下の表６３中のものを含む。
Figure 2014501489
Figure 2014501489
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内因性レトロウイルス
レトロウイルスは、ウイルスｐｏｌ遺伝子によってコードされたＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）によって媒介された逆転写によって複製する。レトロウイルスは少なくとも２つのさらなる遺伝子も運び：ｇａｇ遺伝子はウイルスの骨格、マトリックス、ヌクレオキャプシド、およびキャプシドのタンパク質をコードし；ｅｎｖ遺伝子はエンベロープ糖タンパク質をコードする。加えて、レトロウイルス転写は、レトロウイルスゲノムの両末端に存在する高度に反復された領域（ＬＴＲ）に位置するプロモーター領域または「エンハンサー」によって調節される。
細胞の感染の間に、逆転写酵素はＲＮＡゲノムのＤＮＡコピーを作成し；次いで、このコピーは宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。レトロウイルスは初期の段階で胚細胞または胚に感染でき、垂直メンデル伝達によって伝達され得る。これらの内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）は宿主生物の世代の間に変性でき、それらの最初の特性を喪失する。いくつかのＥＲＶはそれらの特性、またはそれらの構成モチーフの特性の全部または一部を保存し、あるいは宿主生物に対する利点を有する新規な機能的特性を獲得する。これらのレトロウイルス配列は、世代にわたって、それらの潜在能力のいくつかをトリガーし、および病理学的プロセスを生じさせ、または促進することができる区別される修飾も受け得る。
ヒト内因性レトロウイルス配列（ＨＥＲＶ）は、ヒトゲノムの実質的部分を表す。これらのレトロウイルス領域はいくつかの形態：感染性レトロウイルスのＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ＬＴＲ構造とのかなりの類似性を呈する反復核酸配列に近接して挟まれた、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖモチーフを組み合わせる完全な内因性レトロウイルス構造；切形されたレトロウイルス配列、例えば、レトロトランスポゾンはそれらのｅｎｖドメインを欠如する；およびｅｎｖおよびＬＴＲ領域を欠如するレトロポゾンで存在する。ウイルス粒子を放出することができるＥＲＶは、しばしば、Ｃ型ＥＲＶと呼ばれる。
重要なＥＲＶはヒト・テラトカルシノーマ・レトロウイルス（ＨＴＤＶ）、またはＨＥＲＶ−Ｋ、内因性プロウイルスからウイルス粒子を生産することが知られている内因性レトロウイルスを含む。Ｌｏｅｗｅｒら６８ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２８０７−１５（１９８７）；Ｍｏｌｄら４ Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．７８０８２（２００５）。ＨＥＲＶ−Ｒは別の重要なＥＲＶである。なぜならば、それは、副腎皮質、および皮質腺腫およびクローム親和細胞腫のような種々の副腎腫瘍を含む多くの組織で発現することが見出されているからである。Ｋａｔｓｕｍａｔａら６６ Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０９−１５（１９９８）。マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）は、誘導に際して、げっ歯類由来細胞培養において感染性ウイルス粒子を生産する別の重要なＥＲＶである。Ｋｈａｎ ＆ Ｓｅａｒｓ，１０６ Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．３８７−９２（２００１）。事実、細胞の代謝状態および／またはタンパク質発現の速度を有意に改変する細胞培養の変化（例えば、ｐＨ、温度シフト、酪酸ナトリウムの添加）は、ＣＨＯ細胞における内因性レトロウイルスの合成の速度を測定可能に増加させた。Ｂｒｏｒｓｏｎら８０ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．２５７−６７（２００２）。
ＨＥＲＶｄ−ヒト内因性レトロウイルスデータベース（ＮＡＲ 分子生物学データベースコレクションのエントリー番号０４９５）と呼ばれるオンラインデータベースは、種々の進行中のヒトゲノムプロジェクトにおいてほとんど得られたヒトゲノムヌクレオチド配列から編集してきた。これは、ＨＥＲＶをスクリーニングするための比較的単純で速い環境を提供し、レトロウイルスファミリーの分類および特徴付けを継続的に改良することを可能とする。ＨＥＲＶｄデータベースは、今日、ヒトゲノムの９０％を超えるものからのレトロウイルスを含む。加えて、ＥＲＶ配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのオンラインの「Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ」サイトを通じて容易に得ることができる。
さらに、ＥＲＶに関しては、本発明の実施形態は、霊長類／ヒトクラスＩガンマＥＲＶs ｐｔ０１−Ｃｈｒ１０ｒ−１７１１９４５８、ｐｔ０１−Ｃｈｒ５−５３８７１５０１、ＢａＥＶ、ＧａＬＶ、ＨＥＲＶ−Ｔ、ＨＥＲＶ−Ｒ（ＨＥＲＶ−３、ＥＲＶ３ ｅｎｖ遺伝子、ＧｅｎｅＩＤ：２０８６）、ＨＥＲＶ−Ｅ（ＥＲＶＥ１、ＧｅｎｅＩＤ：８５３１４）、ＨＥＲＶ−ＡＤＰ、ＨＥＲＶ−Ｉ、ＭＥＲ４様、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ（ＥＲＶＦＲＤ１、Ｅｎｖタンパク質、ＧｅｎｅＩＤ：４０５７５４；Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ Ｅｎｖタンパク質、ＧｅｎｅＩＤ：４７１８５６；Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｈｅｒｖ−ｆｒｄ Ｅｎｖポリプロテイン、ＧｅｎｅＩＤ：２９０３４８）、ＨＥＲＶ−Ｗ（ＥＲＶＷＥ２、ＥＲＶ−Ｗ、ｅｎｖ（Ｃ７）、メンバー２、Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、ＧｅｎｅＩＤ：１００１９０９０５；ＨＥＲＶＷＥ１、ＥＲＶ−Ｗ、ｅｎｖ（Ｃ７）、メンバー１、ＧｅｎｅＩＤ：３０８１６）、ＨＥＲＶ−Ｈ（ＨＨＬＡ１、ＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴＲ関連タンパク質１、ＧｅｎｅＩＤ：１００８６、Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ ＧｅｎｅＩＤ：７３６２８２；Ｈｈｌａ１、マウスＧｅｎｅＩＤ：６５４４９８；ＨＨＬＡ２、ＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴＲ関連タンパク質２、ＧｅｎｅＩＤ：１１１４８；ＨＨＬＡ３、ＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴＲ関連タンパク質３、ＧｅｎｅＩＤ：１１１４７；ツメガエルｈｈｌａ２、ＧｅｎｅＩＤ：７３４１３１）、ＨＥＲＶＨ−ＲＴＶＬＨ２、ＨＥＲＶＨ−ＲＧＨ２、ＨＥＲＶ−Ｈコンセンサス、ＨＥＲＶ−Ｆｃ１；霊長類／ヒトイプシロン内因性レトロウイルスｈｇｌ５−ｃｈｒ３−１５２４６５２８３；霊長類／ヒト中間体（イプシロン様）ＨＥＲＶＬ６６；霊長類／ヒトクラスＩＩ Ｓｐｕｍａ様ＥＲＶｓ ＨＳＲＶ、ＨＦＶ、ＨＥＲＶ−Ｓ、ＨＥＲＶ−Ｌ、ＨＥＲＶＬ４０、ＨＥＲＶＬ７４；霊長類／ヒトデルタＥＲＶ ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２；霊長類／ヒトレンチＥＲＶ（レンチウイルス）ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２；霊長類／ヒトクラスＩＩ、ベータＥＲＶｓ ＭＰＭＶ、ＭＭＴＶ、ＨＭＬ１、ＨＭＬ２、ＨＭＬ３、ＨＭＬ４、ＨＭＬ７、ＨＭＬ８、ＨＭＬ５、ＨＭＬ１０、ＨＭＬ６、ＨＭＬ９、ヒトテトラトカルシノーマ由来レトロウイルス（ＨＴＤＶ／ＨＥＲＶ―Ｋ）、またはＨＥＲＶ−Ｖ（ＨＥＲＶ−Ｖ１ Ｅｎｖ１、ＧｅｎｅＩＤ：１４７６６４；ＨＥＲＶ−Ｖ２、ＨＳＶ２、ＧｅｎｅＩＤ：１００２７１８４６）の少なくとも１つの遺伝子またはＬＴＲを標的とする。
本発明の方法によって標的化することができるさらなる霊長類ＥＲＶ遺伝子は、ＬＯＣ４７１５８６（ＥＲＶ−ＢａｂＦｃｅｎｖプロウイルス先祖Ｅｎｖポリプロテインと同様、Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ ＧｅｎｅＩＤ：４７１５８６）、ＬＯＣ４７０６３９（ＥＲＶ−ＢａｂＦｃｅｎｖプロウイルス先祖Ｅｎｖポリプロテインと同様、Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ ＧｅｎｅＩＤ：４７０６３９）；ＬＯＣ１００１３８３２２（ＨＥＲＶ−Ｋ ７ｐ２２．１プロウイルス先祖Ｐｏｌタンパク質、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：１００１３８２２と同様；ＬＯＣ１１０１３８４３１（ＨＥＲＶ−Ｋ １ｑ２２プロウイルス先祖Ｐｏｌタンパク質と同様、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：１００１３８４３１；ＬＯＣ１００１３７７５７と同様（ＨＥＲＶ−Ｋ ６ｑ１４．１プロウイルス先祖Ｇａｇ−Ｐｏｌポリプロテインと同様、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：１００１３７７５７）；ＬＯＣ１００１４１０８５（ＨＥＲＶ−Ｋ ８ｐ２３．１プロウイルス先祖Ｐｏｌタンパク質と同様、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：１００１４１０８５）；ＬＯＣ１００１３８１０６（ＨＥＲＶ−Ｆ（ｃ）１ Ｘｑ２１．３３プロウイルス先祖Ｇａｇ糖タンパク質と同様、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：ＬＯＣ１００１３８１０６）と同様；ＬＯＣ１００１４０７３１（ＨＥＲＶ−Ｗ ３ｑ２６．３２プロウイルス先祖Ｇａｇポリプロテインと同様、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ、ＧｅｎｅＩＤ：１００１４０７３１）；ＬＯＣ１００１３９６５７（ＨＥＲＶ−Ｗ ３ｑ２６．３２プロウイルス先祖Ｇａｇポリプロテインと同様、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ ＧｅｎｅＩＤ：１００１３９６５７）を含む。
本発明の他の実施形態において、ＥＲＶは、げっ歯類クラスＩＩ、ベータＥＲＶマウス乳腺腫瘍（ＭＭＴＶ、ＧｅｎｅＩＤ：２８２８７２９；ＭＭＴＶｇｐ７、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１８６３；ＭＭＴＶ ｅｎｖ ＧｅｎｅＩＤ：１４９１８６２；ＭＭＴＶｇｐ１、ＧｅｎｅＩＤ：１７２４７２４；ＭＭＴＶｇｐ２、ＧｅｎｅＩＤ：１７２４７２３；ＭＭＴＶ ｐｏｌ ＧｅｎｅＩＤ：１４９１８６５；ＭＭＴＶ ｐｒｏ、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１８６５；ＭＭＴＶ ｇａｇ、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１８６４）；げっ歯類クラスＩガンマＥＲＶ ＭＬＶ（Ｍｌｖ１、マウスＧｅｎｅＩＤ：１０８３１７）；ネコクラスＩガンマＥＲＶ ＦＬＶ；有蹄類クラスＩガンマＥＲＶ ＰＥＲＶ；有蹄類デルタＥＲＶ ＢＬＶ；有蹄類レンチウイルス Ｖｉｓｎａ、ＥＩＡＶ；有蹄類クラスＩＩ、ベータＥＲＶ ＪＳＲＶ；鳥類クラスＩＩＩ、Ｓｐｕｍａ様ＥＲＶｓ ｇｇ０１−ｃｈｒ７−７１６３４６２；ｇｇ０１−ｃｈｒＵ−５２１９０７２５、ｇｇ０１−Ｃｈｒ４−４８１３０８９４；鳥類アルファＥＲＶs ＡＬＶ（ＡＬＶ ｐｏｌ ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９１０；ＡＬＶ ｐ２、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９０９；ＡｌＶｐ１０、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９０８；ＡＬＶ ｅｎｖ、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９０７；ＡＬＶ膜貫通タンパク質、ｔｍ、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９０６；ＡＬＶトランス−作用性因子、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９１１）、ｇｇ０１−ｃｈｒ１−１５１６８８４５；鳥類中間体ベータ様ＥＲＶｓ ｇｇ０１−ｃｈｒ４−７７３３８２０１；ｇｇ０１−ＣｈｒＵ−１６３５０４８６９、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−５７３３７８２；爬虫類中間体ベータ様ＥＲＶインドニシキヘビ；魚類イプシロンＥＲＶ ＷＤＳＶ；魚類中間体（イプシロン様）ＥＲＶ ｓｎＲＶ；両生類イプシロンＥＲＶ Ｘｅｎ１；昆虫エランチウイルスＥＲＶ Ｇｙｐｓｙ；またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＴｙｌ、酵母ＯＲＦ１６１（ＥＲＶ−１様タンパク質、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ ｓｉｌｉｃｕｌｏｓｕｓウイルス１、ＧｅｎｅＩＤ：９２０７１６）である。
さらに、ＥＲＶｓに関しては、本明細書中で述べたように、ＨＥＲＶ−Ｋ ＥＲＶｓは特に重要である。なぜならば、それらは種々の刺激によって活性化できるからである。よって、本発明の態様は、ＨＥＲＶ−Ｋ３、ＧｅｎｅＩＤ：２０８８；ＨＥＲＶ−Ｋ２、ＧｅｎｅＩＤ：２０８７；ＨＥＲＶ−Ｋ １１ｑ２２．１プロウイルス先祖Ｐｏｌタンパク質、ＧｅｎｅＩＤ：１００１３３４９５；ＨＥＲＶ−Ｋ７、ＧｅｎｅＩＤ：４４９６１９；ＨＥＲＶ−Ｋ６、ＧｅｎｅＩＤ：６４００６；ＨＥＲＶ−Ｋ（１）、ＥＲＶＫ４、ＧｅｎｅＩＤ：６０３５９；およびＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）、ＥＲＶＫ５、ＧｅｎｅＩＤ：６０３５８；ＬＯＣ１００１３３４９５（ＨＥＲＶ−Ｋ １１ｑ２２．１プロウイルス先祖Ｐｏｌタンパク質、ＧｅｎｅＩＤ：１００１３３４９５）を含むＨＥＲＶ−Ｋファミリーの遺伝子を標的化する。
本明細書中に記載されたように、本発明の特別な態様において、標的遺伝子はＥＲＶ ｅｎｖ遺伝子、例えば、ｅＥＲＶファミリーＷ、ｅｎｖ（Ｃ７）、メンバー１（ＥＲＶＷＥ１）、ＧｅｎｅＩＤ：３０８１６；ＬＯＣ１４７６６４（ＨＥＲＶ−Ｖ１またはＥｎｖ Ｖ１）、ＧｅｎｅＩＤ：１４７６６４；ＨＥＲＶ−ＦＲＤプロウイルスＥｎｖポリプロテイン（ＥＲＶＦＲＤＥ１）、ＧｅｎｅＩＤ：４０５７５４およびＧｅｎｅＩＤ：４７１８５６；ＥＲＶ配列Ｋ、６（ＥＲＶＫ６またはＨＥＲＶ−Ｋ１０８）、ＧｅｎｅＩＤ：６４００６；ＥＲＶ配列３エンベロープタンパク質（ＥＲＶ３）、ＧｅｎｅＩＤ：２０８６およびＧｅｎｅＩＤ：１００１９０８９３；ＡＬＶ Ｅｎｖタンパク質、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９０７、またはＨＥＲＶ−Ｋ１８のＥｎｖタンパク質である。
特別な実施形態において、ＨＥＲＶ−Ｋ Ｅｎｖ１の発現は、配列番号：３２８７２７０〜３２８７５６９（センス）および配列番号：３２８７５７０〜３２８７８６９（アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
ＥＲＶ遺伝子および調節配列を標的化することに加えて、本発明のいくつかの実施形態はＥＲＶ受容体を標的化する。例えば、ヒト溶質キャリアファミリー１（中性アミノ酸トランスポーター）、メンバー５（ＳＬＣ１Ａ５、ＧｅｎｅＩＤ：６５１０）は、サルＤ型レトロウイルスおよびネコ内因性ＲＤ−１１４ウイルスに対する受容体である。溶質キャリアファミリー１（グルタメート／中性アミノ酸トランスポーター）、メンバー４（Ｓｌｃ ｌａ４、ＧｅｎｅＩＤ：５５９６３）およびメンバー５（Ｓｌｃ ｌａ５、ＧｅｎｅＩＤ：２０５１４）は関連タンパク質のマウスバージョンである。ヒト溶質キャリアファミリー１（グルタメート；中性アミノ酸トランスポーター）、メンバー４（ＳＬＣ１Ａ４、ＧｅｎｅＩＤ：６５０９）は、ＨＥＲＶ−Ｗ Ｅｎｖ糖タンパク質によって受容体として用いられる。かくして、細胞ウイルス受容体の阻害は受容体干渉、潜在的、内因性または偶発的ウイルス感染を減少させることができ、かくして、細胞における免疫原性作用物質の生産を増加させることができる。
潜在的ウイルス
ボルナウイルスは細胞核において執拗な感染を樹立する非セグメント化陰性非レトロウイルスＲＮＡウイルスの遺伝子である。ボルナウイルスヌクレオタンパク質（Ｎ）遺伝子に相同なエレメントが、いくつかの哺乳動物種のゲノムに存在し、内因性Ｂｏｒｎａ様Ｎ（ＥＢＬＮ）エレメントをコードするｍＲＮＡを生産する。Ｈｏｒｉｅら４６３ Ｎａｔｕｒｅ ８４−８７（２０１０）。よって、本発明のいくつかの実施形態において、標的遺伝子はボルナウイルス遺伝子である。
本発明の方法によって標的化することができる潜在性ＤＮＡウイルスはアデノウイルスを含む。例えば、Ｃ血清型アデノウイルスの種は、ヒト組織において潜在的感染を確立することができる。Ｇａｒｎｅｔｔら８３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２４１７−２８（２０００）参照。鳥類アデノウイルスおよびアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）タンパク質は、特異的−無病原体ヒヨコによって生産されており、これは、鳥類ＡＡＶがニワトリの生殖系において潜在的感染として存在できることを示す。Ｓａｄａｓｉｖら３３ Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．１２５−３３（１９８９）；Ｋａｔａｎｏら３６ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ．６７６−８０（２００４）も参照されたし。本発明のいくつかの実施形態において、標的遺伝子は潜在的ＤＮＡウイルスである。例えば、標的遺伝子は、ＨＨＶ−４（ＥＢＶ）、ＧｅｎｅＩＤ：３７８３７５１からの潜在的膜タンパク質（ＬＭＰ）−２Ａであり得るが、そのタンパク質は、また、ＨＥＲＶ−Ｋ１８のＥｎｖタンパク質をトランス活性化する。
サーコウイルスは、潜在的期を呈するＤＮＡウイルスである。ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）は、汚染されたＶｅｒｏ細胞バンクを有し、それから、ロタウイルスワクチンが作成され、ワクチンの投与に対して一時的なＦＤＡの停止を引き起こしていることが判明している。Ａｓｓｏｃ．Ｐｒｅｓｓ，Ｍａｒｃｈ ２３（２０１０）。ＰＣＶ１ウイルスのゲノムを本明細書に提供し、それはＰＣＶ１ ＡＹ１９３７１２．１（配列番号：３１５４１４８）、ＰＣＶ１ ＥＦ５３３９４１．１（配列番号：３１５４１４９）、ＰＣＶ１ ＦＪ４７５１２９．２（配列番号：３１５４１５０）、ＰＣＶ１ ＧＵ３７１９０８．１（配列番号：３１５４１５１）、およびＰＣＶ１ ＧＵ７２２３３４．１（配列番号：３１５４１５２）である。
本発明の実施形態は、ＰＣＶ１ ｒｅｐまたはｃａｐ遺伝子を阻害するＲＮＡエフェクター分子を提供する。ＰＣＶ１のｒｅｐ遺伝子は、ウイルスＤＮＡの複製に欠かせない。Ｍａｎｋｅｒｔｚ ＆ Ｈｉｌｌｅｎｂｒａｎｄ，２７９ Ｖｉｒｏｌ．４２９−３８（２００１）。特別な実施形態において、ＰＣＶ１ Ｒｅｐタンパク質の発現は、配列番号：３１５２８２４〜３１５３４８５（センス）、配列番号：３１５３４８６〜３１５４１４７（アンチセンス）、および本明細書中に提供された表よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
別の特別な実施形態において、ＰＣＶ１ Ｃａｐタンパク質の発現は、配列番号：３１５４７３１〜３１５４７７８（センス）、配列番号：３１５４７７８〜３１５４８２６（アンチセンス）、および本明細書中に提供される表よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
偶発的ウイルス
本明細書中で用いるように、「偶発的ウイルス」または「偶発的ウイルス剤」とは、例えば、ワクチン、細胞株および他の細胞由来産物を含む、免疫原性作用物質内に存在するウイルス汚染物をいう。ワクチン産物に関しては、例えば、外因性の偶発的ＡＬＶが、異なる製造業者によってＣＥＦまたはＤＥＦ細胞培養で増殖させた商業的マレック病ワクチンで見出された。さらに、これらのワクチンのいくつかもまた内因性ＡＬＶで汚染されていた。Ｆａｄｌｙら５０ Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３８０−８５（２００６）；Ｚａｖａｌａ ＆ Ｃｈｅｎｇ，５０ Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０９−１５（２００６）。
本発明の他の実施形態は、ベシウイルス、ブタサーコウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ブタパルボウイルス、アデノ関連ウイルス、レオウイルス、狂犬病ウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、レポリポックスウイルス、および白血症ウイルス（ＡＬＶ）、ハンターンウイルス、マーブルグウイルス、ＳＶ４０、ＳＶ２０、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シミアンウイルス５（ｓｖ５）、ネコ肉腫ウイルス、ブタパルボウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶまたはＭＭＬＶ、ｇａｇタンパク質ＧｅｎｅＩＤ：１４９１８７０）、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、マウス肺炎ウイルス（ＰＶＭ）、タイラーの脳脊髄炎ウイルス（ＴＨＥＭＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＭＶまたはＭＶＭ）、ＧｅｎｅＩＤ：２８２８４９５、ｖｐｌ、ＧｅｎｅＩＤ：１４８５９２；ｖｐ、ＧｅｎｅＩＤ：１４８９５９１；ｎｓｌ、ＧｅｎｅＩＤ：１４８９５９０）、マウスアデノウイルス（ＭＡＶ）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）、キルハム・ラット・ウイルス（ＫＲＶ）、トーランのＨ−１ウイルス、センダイウイルス（ＳｅＶ、マウス・パラインフルエンザ・ウイルス１型または日本血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）としても公知）、ラットコロナウイルス（ＲＣＶまたは唾液腺炎ウイルス（ＳＤＡ））、偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、カシェ渓谷ウイルス、ウシ下痢ウイルス、ウシ・パラインフルエンザ・ウイルス３型、ブタ呼吸器系合胞体ウイルス、ブタアデノウイルス、ブタパルボウイルス、ブタヘルペスウイルス１（感染性ウシ鼻気管炎ウイルス）、他のウシヘルペスウイルス、ウシレオウイルス、他のウシヘルペスウイルス、ウシレオウイルス、ブルータングウイルス、ウシ・ポリオーマ・ウイルス、ウシサーコウイルス、およびワクシニア以外のオルソポックスウイルス、偽牛痘ウイルス（ヒトに感染し得る広く分布したパラポックスウイルス）、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、レポリポックスウイルス、または外因性レトロウイルスを含む偶発的動物ウイルスの遺伝子を標的化する。
特別な実施形態において、ＭＭＬＶ Ｇａｇタンパク質の発現は、配列番号：３２８７８７０〜３２８８１１８：（センス）および配列番号：３２８８１１９〜３２８８３６７（アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
特別な実施形態において、ベシウイルスの発現は、配列番号：３１５２６０４〜３１５２７１３、および本明細書中に提供された表よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
他の実施形態は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２；ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）およびＨＴＬＶ−ＩＩ；ヒトＡ、ＢおよびＣ型肝炎ウイルス；ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；ＥＢＶ；ＨＨＶ ６、７および８；ヒトパルボウイルスＢ１９；レオウイルス；ポリオーマ（ＪＣ／ＢＫ）ウイルス；ＳＶ４０ウイルス；ヒトコロナウイルス；ヒトパピローマウイルス；インフルエンザＡ、ＢおよびＣウイルス；種々のヒトエンテロウイルス；ヒトパラインフルエンザウイルス；およびヒト呼吸器系合胞体ウイルスを含む、ヒト起源の偶発的剤を標的化する。
パルボウイルス科は、約４〜５キロベースのゲノムを持つ一本鎖ＤＮＡウイルスである。この科は、ヒトヘルパー依存性アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）血清型１〜８、自律性鳥類パルボウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ １〜８）のようなディペンドウイルス；ヒトパルボウイルスＢ１９（第五病の原因）およびＶ９を含む、ウシ、シマリス、および自律性霊長類パルボウイルスのようなエリスロウイルス；およびＭＶＭを含む、他の動物およびげっ歯類、肉食動物、およびブタのパルボウイルスを含むパルボウイルスを含む。これらのパルボウイルスはいくつかの細胞型に感染することができ、非常に重要な試料において記載されてきた。ＡＡＶは、特に、減少した複製、増殖、および他のウイルスの成長に関連付けられてきた。
ＭＶＭは、ビリオンタンパク質１（ＶＰ１、ＭＭＶｇｐ３とも呼ばれる）、ＭＶＭの従たるコートタンパク質、ＧｅｎｅＩＤ：１４８９５９２のＮ−末端で発現される脂肪溶解性酵素であるホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）を展開することによって細胞への進入を獲得する。Ｆａｒｒら１０２ ＰＮＡＳ １７１４８−５３（２００５）。他のＭＶＭ標的は、（ＭＭＶｇｐ２とも呼ばれる）ＭＶＭ ＶＰ、ＧｅｎｅＩＤ：１４８９５９１；およびＭＶＭ非構造イニシエータータンパク質（ＮＳ１、ＭＭＶｇｐ１とも呼ばれる）、ＧｅｎｅＩＤ：１４８９５９０から選択することができる。特別な実施形態において、ＭＶＭ ＮＳ２タンパク質の発現は、配列番号：３２８５５２４〜３２８５８２７（センス）および配列番号：３２８５８２８〜３２８６１３１（アンチセンス）よりなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応するＲＮＡエフェクター分子の使用によって変調することができる。
ポリオーマウイルスは、例えば、ヒト、霊長類、げっ歯類、ウサギおよび鳥類に感染することができる二本鎖ＤＮＡウイルスである。ポリオーマウイルス（ＰｙＶ）はＳＶ４０、ＪＣおよびＢＫウイルス、マウス肺向性ウイルス、ハムスターＰｙＶ、マウスＰｙＶウイルス、およびリンパ球向性パポバウイルス（ＬＰＶ、アフリカミドリザル・パピローマウイルス）を含む。これらのウイルスについての配列はＧｅｎＢａｎｋを介して入手可能である。また、米国特許公開番号２００９／０２２０９３７も参照されたし。それらの腫瘍形成および癌形成潜在能力のため、ワクチン生産で用いる細胞基質中のこれらのウイルスを排除するのが重要である。
パピローマウイルス科は、種々の宿主−特異性および配列相同性を表す１５０を超える公知の種を含む。それらは哺乳動物（ヒト、サル、ウシ、イヌ、ヒツジ）において、および鳥類において同定されている。伝統的には、生殖器および粘膜ＨＰＶと呼ばれる全てのＨＰＶ型を含むヒトパピローマウイルス科（ＨＰＶ）の大部分はスーパーグループＡに属する。スーパーグループＡ内には、１１のグループがあり；これらの最も医療的に重要なのはヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ６およびＨＰＶ２である。これらの各々は、医学文献において「高リスク」ウイルスとして報告されてきた。
外因性レトロウイルスは、広い範囲の種にわたる動物において種々の悪性および非悪性病を引き起こすことが知られている。これらのウイルスはほとんどの公知の動物およびげっ歯類に感染する。その例は、デルタレトロイドウイルス（ＨＴＬＶ−１、−２、−３、および−４、ＳＴＬＶ−１、−２、および−３）、ガンマレトロウイルス（ＭＬＶ、ＰＥＲＶ）、アルファレトロウイルス（鳥類白血症ウイルスおよび鳥類内因性ウイルス）、およびＨＩＶ １および２を含む。
本発明の実施形態が向けられる潜在的な偶発的汚染物である他のウイルス科は、ブニヤウイルス科（ＬＣＭＶ、ハンタウイルス）、ヘルペス科（ヒトヘルペスウイルス１〜８、ウシヘルペスウイルス、イヌヘルペスウイルスおよびサルサイトメガロウイルス）、ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）、ヘペウイルス科（Ｅ型肝炎ウイルス）、デルタウイルス（デルタ型肝炎ウイルス）、アデノウイルス科（ヒトアデノウイルスＡ〜Ｆ、およびマウスアデノウイルス）、コロナウイルス科、フラビウイルス科（ウシウイルス性下痢ウイルス、ＴＢＥ、黄熱病ウイルス、デングウイルス１〜４、ＷＮＹおよびＣ型肝炎ウイルス）、オルソミクソウイルス科（インフルエンザ）、パラミクソウイルス科（パラインフルエンザ、おたふくかぜ、はしか、ＲＳＶ、マウスの肺炎ウイルス、センダイウイルス、およびサルパラインフルエンザウイルス５）、トガウイルス科（西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、風疹）、ピコルナウイルス科（ポリオーマウイルス１〜１３型、コサッキーＢ、エコウイルス、リノウイルス、ヒトＡ型肝炎、ヒトコサッキーウイルス、ヒトカルジオウイルス、ヒトリノウイルスおよびウシリノウイルス）、レオウイルス科（マウスロタウイルス、レオウイルス３型およびコロラドダニ熱ウイルス）、およびラブドウイルス科（水疱性口内炎ウイルス）を含む。
例えば、免疫原性作用物質を作成するのに用いられるマウスおよびハムスター細胞バンクは、ヒトに対して病原性であることが知られているウイルスで感染させることができる。マウス細胞バンクはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、センダイウイルス、ハンターンウイルス、および／または乳酸デヒドロゲナーゼウイルスを運ぶことができ；ハムスター細胞バンクはＬＣＭ、センダイウイルス、および／またはレオウイルス３型を運ぶことができる。事実、トランスジェニックマウス由来細胞から生産された商業的に入手可能なモノクローナル抗体は、ＬＣＭ、欠肢症（ＭＥＶ）、マウス脳脊髄炎ウイルス（ＧＤＶＩＩ）、ハンターン、ＭＶＭ、マウスアデノウイルス（ＭＡＶ）、マウス肝炎（ＭＨＶ）、マウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ）、ポリオーマ、レオウイルス３型（ＲＥＯ−３）、センダイ（ＳｅＶ）、幼いマウスの家畜流行性下痢のウイルス（ＥＤＩＭ）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、パポバウイルスＫ、およびＬＤＶＨウイルス；胸腺剤ウイルス；ウシウイルス性下痢（ＢＶＤ）、感染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）、呼吸器系パラインフルエンザ−３（ＰＩ−３）、パピローマウイルス（ＢＰＶ）およびアデノウイルス−３（ＢＡＶ−３）ウイルス；およびヤギ（ヤギ）アデノウイルス（ＣＡＶ）、ヘルペスウイルス（ＣＨＶ）、および関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ウイルスを含むウイルスについてテストされる。Ｇｅｉｇｅｒｔ，ＣＨＡＬＬＥＮＧＥ ＯＦ ＣＭＣ ＲＥＧＵＬＡＴＯＲＹ ＣＯＭＰＬＩＡＮＣＥ ＦＯＲ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，１０９−１１（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００４）；ＢＬＡ文献番号９８−９９１２、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ Ｄｅｔａｉｌｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｖｉｅｗ（１９９７）；ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊ．（Ｆａｌｌ，２００９）。
いくつかの実施形態において、宿主細胞における免疫原性作用物質の生産は、細胞成長、細胞***、細胞生存性、アポトーシス、細胞の免疫応答、栄養素の取扱い、および／または細胞内で細胞成長および／または***に関連する他の特性に影響するさらなるＲＮＡエフェクター分子を細胞に導入することによって増強される。さらなる実施形態において、生産は、成長期の間に免疫原性作用物質の発現を一過的に阻害するＲＮＡエフェクター分子を細胞に導入することによって増強される。
ＩＶ．トランスクリプトーム
また、本発明の実施形態は、「ＣＨＯ細胞トランスクリプトーム」とも呼ばれる、ＣＨＯ細胞において発現される転写体の組も提供し、さらに、ＣＨＯ細胞トランスクリプトームの転写体のいずれか１つを標的化するように設計されたｓｉＲＮＡ分子を提供する。エフェクターＲＮＡを変調するＣＨＯ細胞を選択し、設計するための組織化されたＣＨＯ細胞転写体配列データベースの形態でのトランスクリプトームの使用もまた、該形態または方法およびシステムでやはり提供される。他の実施形態は、さらに、ＣＨＯトランスクリプトームにおける転写体の各々に対して標的化されたｓｉＲＮＡの選択、およびＣＨＯ細胞を作成し、または修飾するための、例えば、生体分子の改良された生産のためのその使用を提供する。従って、特別な実施形態は修飾されたＣＨＯ細胞を提供する。
３７℃の化学的に規定された培地下で標準的な条件で成長させた、初期、中期、および後期対数期細胞を含む、異なる条件下でプールされたＣＨＯ細胞で発見された転写体の組。該転写体は本明細書中の表において、および対応する配列（配列番号ファイル）において記載されている。
ＣＨＯトランスクリプトームの発見は、例えば、そのような細胞中での生体分子の生産のために、ＣＨＯ細胞において１以上の細胞プロセスを特異的に修飾するのに有用である。例えば、公知の発現された転写体に基づき、アポトーシス調節因子、細胞周期遺伝子、ＤＮＡ増幅（ＤＨＦＲ）調節遺伝子、ウイルス遺伝子生産調節遺伝子、例えば、細胞において生体分子を生産するのに用いられるウイルスプロモーターの場合では、グリコシル化関連遺伝子、炭素代謝調節遺伝子、プロオキシダント酵素をコードする遺伝子を変調させることができる。公知の発現された遺伝子または転写体を変調することによって、さらに、タンパク質の折畳み、メチオニン酸化、タンパク質のピログルタメーション、ジスルフィド結合形成、タンパク質分泌、細胞の生存性、細胞の特異的生産性、栄養素の要件、内部細胞ｐＨをさらに変調することができる。
宿主細胞、特に、ＣＨＯ細胞における免疫原性作用物質の生産を変調する方法が提供され、該方法は、その一部が標的遺伝子の少なくとも一部に対して相補的であるＲＮＡエフェクター分子と細胞とを接触させる工程と、該細胞を、標的遺伝子の発現を変調するのに十分な時間の間バイオリアクター中で維持する工程とを含み、ここに、該変調は免疫原性作用物質の生産、および免疫原性作用物質の細胞からの回収を増強させる。
本開示は、ＣＨＯトランスクリプトームの転写体の核酸配列と、該転写体が翻訳されたタンパク質と、転写されたタンパク質が役割を果たすいくつかの経路とを含む。当該記載は、トランスクリプトームの配列を標的化するように設計されたＲＮＡエフェクター分子としてのｓｉＲＮＡ分子の編集も記載する。公知のトランスクリプトーム転写体配列に基づいて、細胞、特に、ＣＨＯ細胞において遺伝子発現を変調するために適切なＲＮＡエフェクター分子を選択するための、コンピュータ援助システムを含むシステム、およびコンピュータ援助方法を含む方法も記載される。
ＣＨＯ細胞トランスクリプトーム
本発明者らは、ＣＨＯ細胞において発現された転写体の規定された組を発見した。転写体の該規定された組を本明細書では「トランスクリプトーム」という。転写体の名称、転写体が役割を果たす少なくとも１つの経路、関連する配列番号、および対応する例示的なｓｉＲＮＡ分子の配列番号は、例えば、表１〜１６、２１、２３、２４、２７〜３０、５２〜６１、６５または６６を含む本明細書中に記載された表のいずれかに記載される。ＣＨＯ細胞トランスクリプトームにおける転写体の配列は、関連する配列番号１〜９７７１および配列番号：３１５７１４９〜３１５８４２０に記載されている。
かくして、１つの実施形態において、本発明は、配列番号：１〜９７７１を有する転写体の選択または編集を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞トランスクリプトームを提供する。いくつかの実施形態において、ＣＨＯトランスクリプトームは、配列番号：１〜９７７１を有する転写体の選択または編集より実質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＨＯ細胞トランスクリプトームは、配列番号：１〜９７７１を有する転写体の選択または編集よりなる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に示された表のいずれかに記載されたＣＨＯ細胞トランスクリプトームの転写体のいずれかの１つに向けられた少なくとも１つのｓｉＲＮＡを提供する。例えば、表１〜１６、２１〜２５、２７〜３０、５２〜６１、６５または６６参照。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、表１〜１６、２１〜３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５０、５１〜６１、６３〜６５、または６６に記載されたｓｉＲＮＡの群から選択される。いくつかの実施形態において、全ての転写体配列番号が本明細書中に記載された表に存在するのではない。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：９７７２〜３１５２３９９および配列番号：３１６１１２１〜３１７６７８３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む。発現の改良された品質／量のために変調することができるさらなる標的が本明細書に記載される。本明細書に提供されるのはＣＨＯ転写体、すなわち、配列番号の１〜９７７１、および配列番号：３１５７１４９〜３１５８４２０である。これらの転写体は、コードされたタンパク質の名称に帰属させることができ、機能的グループにカテゴリー化することができる。機能的グループを容易に決定して、転写体を、相同性によって、特定の機能を有することが知られている配列に分類することができる。１つの実施形態において、公知の機能的ドメインを用い、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の相同性を探す。配列番号の転写体を、コードされたタンパク質および機能、例えば、表１３の細胞周期／細胞***転写体の記載と相関させる表１０〜１６参照。転写体をグループ分けすることができる例示的なカテゴリーは出願を通じて記載されており、例えば、アポトーシス、細胞周期遺伝子、ＤＮＡ増幅（ＤＨＦＲ）、グリコシル化、炭素代謝、プロオキシダント酵素、タンパク質折畳み、メチオニン酸化、タンパク質ピログルタメーション、ジスルフィド結合形成、タンパク質分泌、免疫応答、細胞栄養素の要件、およびシャッティングダウンＲＮＡ干渉に関与するタンパク質についてコードする転写体（すなわち、転写遺伝子）を含む。その機能が本明細書中において具体的に引用されていない本明細書中に開示された転写体については、当業者であれば、（公知のアルゴリズムおよびプログラムを用いて）配列番号：１〜９７７１および配列番号：３１５７１４９〜３１５８４２０の転写体配列を、種々の生物のいずれかに見出された転写体の配列情報と容易に比較し、先に記載された機能および／またはタンパク質がコードされた名称を割り当てることができる。例えば、当業者であれば、本明細書中に記載された配列の情報を用いて、Ｆｒｅｉｔａｓ ｅｔ ａｌ．のいずれかにレビューされたような世界的なウェブ、７ ＩＥＥＥ／ＡＣＭ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＴＣＢＢ）１７２−８２（２０１０）；Ｒｅｎｔｚｓｃｈａ ＆ Ｏｒｅｎｇｏａ，２７ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１０−１９（２００９）；Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎら１０ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０７（２００９）またはＢｒｉｅｄｂｅｒｇ，７ Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２２５−４２（２００６）に見出されるいずれかの予測方法、アルゴリズム、および／または源および適用を用いてタンパク質の機能を予測することができる。別法として、転写体配列は、タンパク質コーディングおよび非コーディング領域を含む、生物の部分的または全ゲノム（ゲノム情報）と比較することができる。
配列番号：９７７２〜３１５２３９９および配列番号：３１６１１２１〜３１７６７８３に記載されたような、ｓｉＲＮＡを用いて標的転写体をサイレントとすることができる。特別なｓｉＲＮＡは、９０％相補性である相補的配列を含有する転写体を探すことによってその対応する標的に容易にマッチさせることができる。周知のアルゴリズムを用いて、本明細書中で確認される転写体を標的化するための適当なＲＮＡエフェクター分子を決定することができる。例えば、当業者であれば、本明細書中に記載された配列情報を用いて、Ｐａｐｐａｓ ｅｔ ａｌ．においてレビューされた、またはそこに記載された世界的なウェブ、１２ Ｅｘｐ．Ｏｐ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ １１５−２７（２００８）；Ｋｕｒｒｅｃｋら２００９，４８ Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ １３７８−９８（２００９）；Ｇｒｅｄｅｌｌら１６ Ｅｎｇｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔ．ｂｙ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇｉｎ．１７５−９４（２００９）；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４４６６２（２００６年６月１５日）；ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３９９３７（２００９年１０月１５日）；またはＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５１６４８（２０１０年１月２８日）に見出されるいずれかの予測方法、アルゴリズム、および／または源および適用を用い、本明細書中に記載された転写体を標的化するための、およびそれらのＲＮＡ配列に対する免疫応答を妨げ／促進するために、適切なＲＮＡ配列を決定することができる。
かくして、（細胞におけるタンパク質発現を変調するのに適した少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子の配列について選択するための）本明細書中に記載されたシステムを用いて、宿主細胞におけるいずれかの特別な機能を変調するために用いることができる、ＣＨＯ転写体配列およびＲＮＡエフェクター分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）の双方を同定することができる。ＣＨＯ転写体には、転写体配列が、その機能およびタンパク質名称が知られている生物の転写体を同定するために少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有する場合、機能および／またはコードされたタンパク質名称が割り当てられる。
ＲＮＡエフェクター分子を選択するためのシステムおよび方法
公知のＣＨＯトランスクリプトームに基づき、本発明者らは、ＲＮＡエフェクター分子を選択して、細胞プロセスを操作することを通じて細胞に影響するための方法およびシステムを開発して、例えば、細胞における生体分子の生産を改良した。
従って、本実施形態は、ＣＨＯトランスクリプトーム配列、および所望により、特定の細胞プロセスまたは経路における転写体の役割、および特に、ＣＨＯ細胞における生物学的プロセスの最適化のために標的およびエフェクターＲＮＡ分子の設計および選択を可能とする対応するｓｉＲＮＡのような、転写体の各々の少なくとも１つの機能的態様を概説するＣＨＯトランスクリプトームの組織化された編集を用いることを含むデータベースおよびシステムを提供する。
転写体の機能的態様は、例えば、アポトーシス、細胞周期、ＤＮＡ増幅（ＤＨＦＲ）、ウイルス遺伝子生産、例えば、細胞において生体分子の生産を駆動するのに用いられるウイルスプロモーターの場合には、グリコシル化、炭素代謝、プロオキシダント酵素、タンパク質折畳み、メチオニン酸化、タンパク質ピログルタメーション、ジスルフィド結合形成、タンパク質分泌、細胞生存性、細胞の特異的生産性、栄養素の要件、内部細胞ｐＨにおける転写体の役割に関する。他の細胞プロセスは当業者に知られており、例えば、世界的なウェブを通じて入手可能なＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベースで見出すことができる。
従って、図１６に示されるように、本発明は、細胞においてタンパク質発現を変調するのに適した少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子の配列を選択するためのシステム１００を提供し、該システムは、プロセッサ１１２および関連メモリ１１４を有するコンピューティングデバイス１１０、および少なくとも１つの細胞トランスクリプトーム情報を含むデータベース１２０、該情報はトランスクリプトームの各転写体についての配列および、所望により、転写体の名称、および転写体が役割を果たす経路を含み；および少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子の情報、該情報は少なくともＲＮＡエフェクター分子の配列および、所望により、ＲＮＡエフェクター分子の標的特異性を含み、ここに、各ＲＮＡエフェクター分子は、該少なくとも１つの細胞トランスクリプトームにおける少なくとも１以上の配列にマッチするように設計され；該コンピューティングデバイス１１０によって実行され、かつユーザの入力デバイス１１８を介してユーザから受け取るように構成されたメモリ１１４に記憶されたコンピュータプログラム、パラメータは細胞型選択、標的生物選択、細胞経路選択、交差−反応性選択、標的遺伝子の名称および／または配列の選択および、所望により、イン・ビボまたはイン・ビトロ送達オプションを含む送達選択の方法を含み；およびさらに、所望により、ユーザのアドレスの情報；該パラメータおよびトランスクリプトーム転写体配列の組合せをマッチさせるためのデータベース中の配列に対して該パラメータをチェックするように構成された第一のモジュール；および細胞においてタンパク質発現を変調するのに適した少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子の選択された配列を表示するための第二のモジュールを含む。
コンピューティングデバイス１１０、およびメモリ１１４に記憶された関連プログラムは、例えば、１以上のドロップダウンメニューまたは構造化されたもしくはフリー・フォーム・テキスト入力を用いてユーザがサーチ標的パラメータを入力するのを可能とし、所望の細胞における適切な標的を見出すための適切なパラメータを選択する、グラフィカルなユーザインターフェースのようなユーザインターフェースを供するように適合し、かつ構成することができる。例えば、ユーザがＣＨＯ細胞において炭素代謝を変調するための標的を見出したいならば、ユーザは標的細胞を「ＣＨＯ」として、および経路を「炭素代謝」として同定し、サーバーは、例えば、Ｇｌｕｔｓ、ＰＴＥＮおよびＬＤＨ遺伝子についての転写体を同定するであろうデータベースを通じてサーチを行い、それらを、ｓｉＲＮＡデータベース部分からの適切なｓｉＲＮＡ分子とマッチさせる。この出力情報は、コンピュータディスプレイ１１６またはプリンターのような他の出力デバイス上にてユーザに提示することができる。
該システムはスタンド−アローンシステムまたはインターネットベースのシステムとすることができ、そこでは、エフェクターＲＮＡ分子の計算および選択が同一または異なるロケーションで行われる。図１６に示されたように、トランスクリプトーム情報はデータベース１２０に記憶することができ、コンピューティングデバイス１１０によってアクセスできる。本明細書中で用いるように、用語データベースは、それが要求される情報の検索を可能とする構造であるか、または構造でないかに関わらずデータのいずれかの組織化を含む。データベースはメモリに記憶されたフラットファイルまたはフラットファイルのセット、メモリに記憶された１以上の表、メモリに記憶された区別されるデータ要素のセットとすることができる。データベースは、ユーザがデータベースに（もう１つのプログラムを介して）直接的にまたは間接的にアクセスできるようにするいずれの周知のデータベースプログラムも含むことができる。これらの例は、ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ（登録商標）、ＡＣＣＥＳＳ（登録商標）、およびＯＲＡＣＬＥ（登録商標）データベース、およびＭＹＳＱＬ（登録商標）オープン・ソース・データベースを含む。
図１７に示された本発明の代替実施形態において、システム２００はネットワークベースのシステムとすることができる。システム２００は、プライベート・ユーザ・ネットワークまたはイーサネット（登録商標）、もしくはインターネットのようなネットワーク２３０に連結されたサーバーシステム２１０および１以上のクライアントシステム２４０および２５０を含むことができる。サーバーシステム２１０およびクライアントシステム２４０および２５０は、本明細書中に記載されたようにコンピューティングデバイスとすることができる。サーバーシステム２１０は、１以上のプロセッサ２１２および関連メモリ２１４、およびサーバーシステム２１０の操作および機能を制御するように適合され、かつ構成された１以上のコンピュータプログラムまたはソフトウェアを含むことができる。サーバーシステム２１０は、有線または無線を介して、ネットワーク２３０に連結するための１以上のネットワークインターフェースを含むことができる。サーバーシステムの例は、ＩＮＴＥＬ（登録商標）に基づいたコンピュータサーバー、およびＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，ＬＰ；Ｄｅｌｌ；およびＡＰＰＬＥ（登録商標）Ｉｎｃ．から入手可能なマイクロプロセッサアーキテクチャーを含む。
クライアントシステム２４０および２５０は、１以上のプロセッサ２４２および２５２、および関連メモリ２４４および２５４、ならびにクライアントシステム２４０および２５０の操作および機能を制御するのに適合させ、かつそのように構成された１以上のコンピュータプログラムまたはソフトウェアを含むことができる。クライアントシステム２４０および２５０は、有線または無線を介して、ネットワーク２３０に連結させるための１以上のネットワークインターフェースを含むことができる。クライアントシステムの例は、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，ＬＰ；ＤＥＬＬ；およびＡｐｐｌｅ Ｉｎｃ．から入手可能なＩＮＴＥＬ（登録商標）およびＡＭＤマイクロプロセッサアーキテクチャー、およびパーソナル・デジタル・アシスタント（ＰＤＡ）（例えば、ＤＲＯＩＤ（登録商標）、ＨＴＣ Ｃｏｒｐ．）、スマートフォン（例えば、ＢＬＡＣＫＢＥＲＲＹ（登録商標）スマートフォン、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎ Ｍｏｔｉｏｎ， Ｌｔｄ．）、ｉＰｏｄ（登録商標）、ｉＰａｄ（商標）およびｉＰｈｏｎｅ（登録商標）デバイス（ＡＰＰＬＥ（登録商標）ＩＮＣ．）のようなより小さなネットワークが可能な携帯式デバイスに基づいたデスクトップおよびポータブルコンピュータを含む。
１つの実施形態によると、サーバーシステム２１０は、例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）のためのインターネット・インフォメーション・サービス（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＩＩＳ）、またはＮＥＴ ＦＲＡＭＥＷＯＲＫ製品（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ（登録商標） Ｃｏｒｐ．）、またはＡｐａｃｈｅオープン−ソースＨＴＴＰサーバー（Ａｐａｃｈｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）に基づいたウェブサーバーであり、インターネットを介する遠隔クライアントシステムによってアクセスされるウェブベースの適用を用いて、トランスクリプトーム情報のデータベースをサーチして、細胞におけるタンパク質発現を変調するのに適当であり得るＲＮＡエフェクター分子を同定する。該システムは、ユーザが、ユーザに送達されるべき所望の量の同定されたＲＮＡエフェクター分子を選択し、購入するのを可能とするフルフィルメントシステムを含むことができるか、またはそれに連結することができる。
また、コンピュータによって実行されるべきソフトウェアを販売することによってシステムを提供することもでき、そこでは、配列情報および他の情報にパラメータをマッチさせるデータベースおよびアルゴリズムがユーザに提供される。従って、ユーザは、エフェクターＲＮＡ分子を合成できるか、またはそれらを第三者のプロバイダーから別々に注文することができる。
いくつかの実施形態において、該システムは、さらに、少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子を容器中に記憶するための記憶モジュール、ここに、２以上のＲＮＡエフェクター分子があれば、各ＲＮＡエフェクター分子は別々の容器に記憶され、およびマッチング組合せの選択に際して、マッチング容器を選択し、所望により、該容器に、イン・ビボまたはイン・ビトロ送達用のユーザ選択に基づいた添加剤を加え、および所望により、さらに、ユーザの住所に送られるべきマッチングＲＮＡエフェクター分子を含む容器を包装するロボット取扱いモジュールを含む。ｓｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡの混合物に加えることができる例示的な添加剤は本明細書中に記載される。
記憶モジュールは、システム構成要素に連結された、冷却されたモジュールであり得る。
該システムは、核酸または他の生体分子シンセサイザーに連結させることもできる。
ロボット取扱いモジュールは、記憶モジュール、または生体分子シンセサイザーからの成分を検索し、所望により、それを混合でき、および所望により、容器をパッケージすることができるいずれのシステムとすることもできる。ロボット取り扱いモジュールは、該システムからのコマンドに基づく１以上のパーツ機能を含むことができる。ロボット取扱いモジュールは、計算が行われる場合と同一または異なるロケーションに存在させることができる。
いくつかの実施形態において、該システムは、さらに、細胞のゲノム情報を含み、ここに、ユーザの選択によって、ＲＮＡエフェクター分子を、ゲノムに存在するプロモーター、エンハンサー、イントロンおよびエクソンを含む標的ゲノム配列にマッチさせることができる。
本発明のいくつかの実施形態において、該システムは、ハードウェア構成要素、またはハードウェア構成要素のシステム、およびシステムの（情報、プロセシング情報等の入力および出力の管理のような）具体的タスクを実行するソフトウェア構成要素を含むことができ、該システムを構成する１以上のコンピューティングデバイスに対する、およびそれを横切ってのソフトウェア適用の実行によって行うことができる。本発明は、例えば、サーバー、メイン−フレームコンピュータ、ワークステーション等のようないずれの便宜な型のコンピューティングデバイスも含むことができる。１を超えるコンピューティングデバイスが存在する場合、各デバイスは、例えば、イーサネット（登録商標）（有線または無線の「ＷｉＦｉ」）、ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ（登録商標）技術、ＺＩＧＢＥＥ（登録商標）無線技術、ＡＴ＆Ｔ（商標）３Ｇネットワーク、またはＳＰＲＩＮＴ（商標）３Ｇまたは３Ｇ／４Ｇネットワークを含む、周知の相互連結技術を用いて、本明細書中においてはネットワークという、いずれの便宜な型の通信相互連結を介して連結することもできる。１を超えるコンピューティングデバイスを用いる場合、該デバイスは共通した位置とすることができるか、あるいはそれらは物理的に分離することができる。種々の操作システムをコンピューティングデバイスのいずれにおいても使用することができ、そこでは、代表的な操作システムはＭＩＣＲＯＳＯＦＴ（登録商標）ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）操作システム、ＭＡＣＯＳ（商標）操作システムソフトウェア（ＡＰＰＬＥ（登録商標）Ｉｎｃ.）、ＳＯＬＡＲＩＳ（登録商標）操作システム（Ｏｒａｃｌｅ Ｃｏｒｐ．）、Ｌｉｎｕｘ（Ｌｉｎｕｘ Ｏｎｌｉｎｅ，Ｉｎｃ．）、ＵＮＩＸ（登録商標）サーバーシステムおよびＯＳ／４００ソフトウェア（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．）、ＡＮＤＲＯＩＤ（商標）（Ｓｐｒｉｎｔ）、Ｃｈｒｏｍｅ ＯＳ（Ｇｏｏｇｌｅ Ｉｎｃ．）などを含む。システムの機能的エレメントもまた、種々のソフトウェアファシリテーター、プラットフォーム、または他の便宜な方法に従って実行することもできる。
同一のデータ入力（例えば、ファイル名またはディレクトリ名またはサーチ用語）が（同一ファイル中の、またはそうでない）連結されたアイテムを検索し、または連結されたアイテムの１以上の入力が他の１以上を検索する場合、データのアイテムはメモリ中で相互に「連結」させることができる。
図１８は、本発明の１つの実施形態によるデータ構造の線図を示す。この実施形態においては、入力フィールドの用語を、データベース中のそれらの関連配列ＩＤによるなどして、かつ本発明に従って、標的ＲＮＡに連結させることができ、入力フィールドの用語の１以上についてサーチするためにソフトウェアモジュールを実行させ、標的の１以上の配列ＩＤを戻す。加えて、各標的ＲＮＡは、それらの関連配列ＩＤによるなどして、かつ本発明に従って、１以上のＲＮＡエフェクター分子に連結させることができ、各同定された標識については、ソフトウェアモジュールを実行して、同定された標的のいくつかまたは全てについての引き続いてのサーチを行うことができ、所望のＲＮＡエフェクター分子についての１以上の配列ＩＤを戻し、ＲＮＡエフェクター分子およびそれらの配列ＩＤのリストを戻すことができる。
別法として、同定された各標的については、所望のＲＮＡエフェクター分子を決定するための１以上の周知のアルゴリズムを実施し、ＲＮＡエフェクター分子およびそれらの配列ＩＤのリストを戻すソフトウェアモジュールを実行することができる。
図１９は、本発明の１つの実施形態に従ってＲＮＡエフェクター分子を同定するための方法のフローチャートを示す。方法４００は、所望の細胞において標的を見出すための所望のパラメータをユーザが入力できるようにする入力スクリーン４０２をユーザに提示することを含む。該入力は、テキスト、あるいはユーザが予め定義された用語を選択するのを可能とする１以上のドロップ−ダウンボックス無しとすることができる。工程４０４において、ユーザは適切なユーザ・インターフェース・エレメント、例えば、「サーチ」ボタンを選択し、該システムは入力パラメータに関連する標的についてデータベースをサーチする。工程４０６において、ユーザには、各々がチェックボックスに関連する標的のリストを提示することができ、ユーザは、各標的に関連するチェックボックスを選択し、または選択しないことが可能であって、さらに、それらのサーチを洗練することができる。工程４０８において、ユーザは、適切なユーザ・インターフェース・エレメント、例えば、「サーチ」ボタンを選択し、該システムは入力標的に関連したＲＮＡエフェクター分子についてのデータベースをサーチすることができ、および／または周知のアルゴリズムを用いて、入力標的に関連するＲＮＡエフェクター分子を決定することができる。該システムは、例えば、ＲＮＡエフェクター分子についてサーチすることができ、何も見つからなければ、周知のアルゴリズムを用いて、適切なＲＮＡエフェクター分子を決定することができる。引き続いて、決定された分子をデータベースに加えることができ、引き続いてのサーチにおいて出現することができる。別法として、ＲＮＡエフェクター分子が見出された場合においてさえ、該システムは、加えて、周知のアルゴリズムを用いて、追加の適切なＲＮＡエフェクター分子を決定することができる。工程４１０において、ユーザには、データベースで見出された情報からの報告されたＲＮＡエフェクター分子の注文のような任意の機能を供することができる。例えば、オンライン獲得は米国特許出願公開番号２００５／０２４０３５２に記載されたように供することができる。
該システムの１つの例および該システムを用いる方法において、顧客のような人は、細胞株を用いるタンパク質の生産における問題を経験している。該問題は、例えば、グリコシル化、例えば、余りにも多いフコシル化におけるようなタンパク質の翻訳後修飾、および／または余りにも多い乳酸形成または余りにも低い収率のようなもう１つのプロセスにおけるものであり得る。
本発明のシステムは、ユーザが、彼らが経験している問題または多数の問題（余りにも低い細胞成長速度または余りにも多いフコシル化）のようなパラメータ、および／またはＦＵＴ８、ＧＭＤＳ、および／またはＴＳＴＡ３のような、彼らが変調したい標的遺伝子、または転写体、または多数の標的遺伝子または転写体を、ユーザインターフェースに入力するのを可能とする。
該システムはパラメータを採用し、それらを、配列データおよびＲＮＡエフェクター分子データとマッチさせ、提案されたＲＮＡエフェクター分子を顧客に送達する。例えば、該システムは、グリコシル化のような細胞経路に対する問題を、グリコシル化において役割を果たすことが知られている転写体にマッチさせることができ、次いで、これらの配列を標的化するＲＮＡエフェクター分子をマッチさせ、例えば、顧客がそれを使って実験することができるｓｉＲＮＡ配列のリストを送達する。
顧客が配列のうち１以上を受領することを望めば、顧客は該システムに対して、適切な核酸を合成し、および／またはそれを顧客が規定したロケーションに送るよう注文し、または指令することができる。該システムは、ヌクレオチド合成システムに対して指令を送って、配列を作成することもできる。シンセサイザーは、他のシステムのパーツからの同一または遠隔ロケーションに存在させることができる。該システムは、記憶ロケーションからの既製の配列を選択し、適切な分子を顧客が規定したロケーションまで送ることができるように、パッケージング情報を供することもできる。顧客がＲＮＡエフェクター分子の異なる混合物を得ることを望むならば、それは、最終的注文を提出するに先立って規定することができ、次いで、該システムは、例えば、１つのバイアルまたはチューブまたは他の容器中にアンチセンスおよびセンス鎖を含む、ｓｉＲＮＡデュプレックスのような適切なＲＮＡエフェクター分子を混合するようにロボット構成要素に指令するであろう。
本発明者らは、さらに、ＣＨＯ細胞トランスクリプトームにおける転写体の少なくとも１つを標的化するｓｉＲＮＡ分子の組を発見した。表１は、ＣＨＯ細胞トランスクリプトームにおける転写体を標的とするｓｉＲＮＡ分子の組も記載する。
かくして、例えば、ＣＨＯ細胞のような細胞を、組換え抗体またはその部分もしくは誘導体のフコシル化の変調を可能とする１以上のＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって、組換え抗体またはその部分もしくは誘導体の生産を増強させる方法がここに提供される。例えば、配列番号：３１５２７１４〜３１５２７５３を細胞と接触させて、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）の発現を変調することができる。別の実施形態において、細胞を１以上のＲＮＡエフェクター分子と接触させ、ここに、該接触は、（例えば、配列番号：５０６９によってコードされた）ＧＤＰ０マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤＳ）の発現を変調させる。ＧＭＤＳを標的化するＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：１６８８２０２〜１６８８５１９よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含むことができる。
別の実施形態において、細胞を１以上のＲＮＡエフェクター分子と接触させ、ここに、該接触は、（例えば、配列番号：５５０５によってコードされた）、（ＴＳＴＡ３によってコードされた）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースエピメラーゼ−レダクターゼをコードする遺伝子の発現を変調する。ＴＳＴＡ３を標的化するＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：１８３９５７８〜１８３９９３７よりなる群から選択されるオリゴヌクレオチド分子の少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含むことができる。なおさらなる実施形態において、細胞を、ＦＵＴ８、ＧＭＤＳ、およびＴＳＴＡ３のうち１を超えるものの発現を標的化する複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させる。
抗体の低下したシアル酸含有量は、ＡＤＣＣをさらに増加させると考えられる。従って、さらに別の実施形態において、細胞を１以上のＲＮＡエフェクター分子と接触させ、ここに、該接触はシアリルトランスフェラーゼの発現を変調させる。細胞におけるシアリルトランスフェラーゼ活性は、細胞を、少なくとも１つのシアリルトランスフェラーゼ遺伝子を標的化させるＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって変調することができる。表７は、変調させることができるいくつかのシアリルトランスフェラーゼ、ならびにシアリルトランスフェラーゼを標的化するＲＮＡエフェクター分子をリストする。
シアリルトランスフェラーゼを標的化するＲＮＡエフェクター分子は、先に提示した配列番号（すなわち、配列番号：６８１１０５〜６８１４５４、配列番号：７０７５３５ないす７０７８７０、配列番号：１１３１１２３〜１１３１４４５、配列番号：１１５５３２４〜１１５５７１１、配列番号：１３９１０７９〜１３９１４４９、配列番号：１４３５９８９〜１４３６３１７）のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６の連続ヌクレオチド（例えば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む。
さらに別の実施形態において、細胞を、ＦＵＴ８、ＧＭＤＳ、およびＴＳＴＡ３のうちの１つを標的化する少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子、および１つのシアリルトランスフェラーゼを標的化するもう１つのＲＮＡエフェクター分子と接触させる。特別な実施形態において、細胞を、ＦＵＴ８およびＳＴ６（α−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−β−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ６と接触させる。
本発明の実施形態は、当業者に知られた、または本明細書中の他の個所で確認される分子経路において転写体またはタンパク質の活性を変調した。細胞活性のそのような分子経路は限定されるものではないが、アポトーシス、細胞***、グリコシル化、成長速度、細胞生産性、ピーク細胞密度、維持された細胞生存性、アンモニアの生産または消費の速度、またはラクテート生産の速度を含む。表１０〜１６により、細胞において標的が果たすそれらの機能または役割に基づいて例示的標的が確認される。
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Ｖ．ＲＮＡエフェクター修飾
本発明のいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエフェクター分子）は化学的に修飾されて、安定性または他の有益な特徴を増強させる。１つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は化学的に修飾されていない。
オリゴヌクレオチドを修飾して、エンド−およびエキソ−ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの迅速な分解を妨げ、および望ましくないオフ−標的効果を回避することができる。本発明において特徴とされる核酸は、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（Ｂｅａｕｃａｇｅらｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）に記載されたもののような、当分野でよく確立された方法によって合成し、および／または修飾することができる。修飾は、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆位連結等）、または３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆位連結等）；（ｂ）塩基修飾、例えば、安定化塩基、脱安定化塩基、またはパートナーの拡大されたレパートリーと塩基対合する塩基での置き換え、塩基（塩基脱落ヌクレオチド）、またはコンジュゲートされた塩基の除去；（ｃ）（例えば、２’位置または４’位置における）糖修飾、または糖の置き換え；ならびに（ｄ）ホスホジエステル連結の修飾または置き換えを含むヌクレオシド間連結修飾を含む。本発明で有用なオリゴヌクレオチド化合物の具体的な例は、限定されるものではないが、修飾された骨格を含む、または天然のヌクレオシド間連結を含むＲＮＡを含む。修飾された骨格を有するＲＮＡは、とりわけ、骨格にリン原子を有しないものを含む。本発明で有用なオリゴヌクレオチド化合物の具体的な例は、限定されるものではないが、修飾されたまたは非天然のヌクレオチド間連結を含むオリゴヌクレオチドを含む。修飾されたヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチドは、とりわけ、ヌクレオシド間連結にリン原子を有しないものを含む。
本明細書の目的では、かつ時々当分野において言及されるように、それらのヌクレオシド間連結にリン原子を有しない修飾されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。特別な実施形態において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、そのヌクレオシド間連結においてリン原子を有するであろう。本明細書の目的では、かつ時々当分野で言及されているように、それらのヌクレオシド骨格においてリン原子を有しない修飾されたＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることもできる。特別な実施形態において、修飾されたＲＮＡはそのヌクレオシド間骨格においてリン原子を有するであろう。
修飾されたヌクレオシド間連結は、（例えば、ＲＮＡ骨格）を含み、例えば、ホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルなホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３’−５’連結を有するボラノホスフェート、逆転した極性を有するこれらおよびそれらの２’−５’連結アナログを含み、ここに、ヌクレオシドユニットの隣接する対は、３’−５’〜５’−３’、または２’−５’〜５’−２’連結している。種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。
前述リン含有連結の調製を教示する代表的な特許は、限定されるものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９５号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５、４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３１６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，６２５，０５０号；第６，０２８，１８８号；第６，１２４，４４５号；第６，１６０，１０９号；第６，１６９，１７０号；第６，１７２，２０９号；第６，２３９，２６５号；第６，２７７，６０３号；第６，３２６，１９９号；第６，３４６，６１４号；第６，４４４，４２３号；第６，５３１，５９０号；第６，５３４，６３９号；第６，６０８，０３５号；第６，６８４，１６７号；第６，８５８，７１５号；第６，８６７，２９４号；第６，８７８，８０５号；第７，０１５，３１５号；第７，０４１，８１６号；第７，２７３，９３３号；第７，３２１，０２９号；および第ＲＥ３９４６４号を含む。
その中にリン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結（例えば、ＲＮＡ骨格）は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１以上の短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間連結によって形成されるヌクレオシド結合を有する。これらは、（部分的には、ヌクレオシドの糖部分から形成された）モルホリノ連結；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有するその他ものを含む。
前述オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な特許は、限定されるものではないが、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；および第5，６７７，４３９号を含む。
ＲＮＡエフェクター分子で用いるのに適した、または用いることが考えられる他の修飾されたオリゴヌクレオチドにおいて、糖およびヌクレオシド間連結の双方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格は新規な基で置き換えられる。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのオリゴマー化合物については、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡミメティックは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と言われる。ＰＮＡ化合物においては、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。ヌクレオ塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ−窒素原子に直接的にまたは間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な特許は、限定されるものではないが、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号を含む。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら２５４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １４９７−１５００（１９９１）に見出すことができる。
本発明において特徴付けられるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を備えたオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格および、特に、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られた］−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２―、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここに、天然ホスホジエステルヌクレオシド間連結は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表わされる］（米国特許第５、４８９、６７７号参照）、およびアミド骨格（米国特許第５、６０２、２４０号参照）を備えたオリゴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書中で特徴が述べられたオリゴヌクレオチドはモルホリノ骨格構造（米国特許第５，０３４，５０６号参照）を有する。
修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、１以上の置換された糖部位を含有することができる。本明細書中で特徴付けられる、ＲＮＡエフェクター分子、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位置において以下のうちの１つを含むことができる：Ｈ（デオキシリボース）；ＯＨ（リボース）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここに、該アルキル、アルケニルおよびアルキミルは置換されたまたは置換されていないＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適当な修飾はＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、ここに、ｎおよびｍは包括的に１〜１０である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは２’位置において以下のもののうちの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２，ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエフェクター分子）の薬物動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエフェクター分子）の薬物動態特性を改良する基、および同様な特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態において、修飾は２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られた２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎら７８ Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４８６−５０４（１９９５））、すなわち、アルコキシ−アルキル基を含む。もう１つの例示的な修飾は２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書中において以下の実施例に記載される、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られたＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および（２’―Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’―ＤＭＡＥＯＥとして当分野でやはり知られている）２’―ジメチルアミノエトキシエトキシ、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の修飾は２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様な修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上、または２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位置、および５’末端ヌクレオチドの５’位置でなすこともできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部位のような糖ミミックを有することもできる。そのような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な特許は、限定されるのではないが、そのうちあるものは本出願と共通して所有されている、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号を含む。
オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエフェクター分子）は、（しばしば、当分野においては、単に「塩基」という）ヌクレオ塩基修飾または置換を含むこともできる。本明細書中で用いられるように、「修飾されていない」または「天然」ヌクレオ塩基はプリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基のシトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾されたヌクレオ塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアノシン、ツベルシジン、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンテニル）アデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６、Ｎ６（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン、２（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６（メチル）グアニン、７（アルキル）グアニン、７（メチル）グアニン、７（デアザ）グアニン、８（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３（デアザ）５（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル、５（メチル）２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５（アミノアリル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシルー５オキシ酢酸、５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、６（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、５−ウラシル（すなわち、プソイドウラシル）、２（チオ）プソイドウラシル、４（チオ）プソイドウラシル、２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）プソイドウラシル、５−（メチル）プソイドウラシル、５−（アリル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、１置換プソイドウラシル、１置換２（チオ）−プソイドウラシル、１置換４（チオ）プソイドウラシル、１置換２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）―フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニジン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、５−（メチル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（アザ）インドリル、６−（メチル）、７−（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、２，４，５−（トリメチル）フェニル、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４−（フルオル）−６−（メチル）ベンズイミダゾール、４−（メチル）ベンズイミダゾール、６−（アゾ）チミン、２−ピリジノン、５ニトロインドール、３ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５置換ピリミジン類、Ｎ２−置換プリン類、Ｎ６−置換プリン類、Ｏ６−置換プリン類、置換された１，２，４−トリアゾール、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル、またはそれらのいずれかのＯ−アルキル化またはＮ−アルキル化誘導体のような他の合成および天然ヌクレオ塩基を含む。修飾されたヌクレオ塩基は、コンジュゲートされた部位、例えば、リガンドを含む天然塩基も含む。
さらなるヌクレオ塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号；ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ ＢＩＯＣＨＥＭ．，ＢＩＯＴＥＣＨ．＆ＭＥＤＩＣＩＮＥ （Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ， ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， ２００８）；ＷＯ ２００９／１２０８７８； ＣＯＮＣＩＳＥ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ ＯＦ ＰＯＬＹＭＥＲ ＳＣＩＥＮＣＥ ＆ ＥＮＧＩＮ．８５８−５９（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０）；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら３０ Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．６１３（１９９１）；Ｓａｎｇｈｖｉ，１５ ＤＳＲＮＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＆ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ２８９−３０２（Ｃｒｏｏｋｅ ＆ Ｌｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９３）に開示されているものを含む。これらのヌクレオ塩基のうちあるものは、本発明において特徴とされるオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６および０〜６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃だけ核酸デュプレックス安定性を増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，２７６−７８において）、および２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合にはさらにより特別に、例示的な塩基置換である。
前述した修飾されたヌクレオ塩基ならびに他の修飾されたヌクレオ塩基のうちのあるものの調製を教示する代表的な特許は、限定されるものではないが、前述した米国特許第３，６８７，８０８号；第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１９１号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号，第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６８１，９４１号；第６，０１５，８８６号；第６，１４７，２００号；第６，１６６，１９７号；第６，２２２，０２５号；第６，２３５，８８７号；第６，３８０，３６８号；第６，５２８，６４０号；第６，６３９，０６２号；第６，６１７，４３８号；第７，０４５，６１０号；第７，４２７，６７２号；第７，４９５，０８８号；および第５，７５０，６９２号を含む。
該オリゴヌクレオチドは、１以上のロックされた核酸（ＬＮＡ）を含むよう修飾することもできる。ロックされた核酸は、２’および４’炭素を連結する過剰なブリッジを含む修飾されたリボース部位を有するヌクレオチドである。この構造は、３’−エンド構造立体配座にリボースを効果的に「ロック」する。ロックされた核酸のオリゴヌクレオチド分子への付加は、血清中でのオリゴヌクレオチド分子の安定性を増加させ、およびオフ−標的効果を低下させることが示されてきた。Ｅｌｍｅｎら３３−Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３９−４７（２００５）；Ｍｏｏｋら６ Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．８３３−４３（２００７）;Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒら３１、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１８５−９３（２００３）；米国特許第６，２６８，４９０号；第６，６７０，４６１号；第６，７９４，４９９号；第６，９９８，４８４号；第７，０５３，２０７号；第７，０８４，１２５号；および第７，３９９，８４５号。
ある場合には、ＲＮＡエフェクター分子のオリゴヌクレオチドは、非リガンド基によって修飾することができる。オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞摂取を増強させるために、多数の非リガンド分子がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、そのようなコンジュゲーションを実行するための手法は科学文献で入手可能である。そのような非リガンド部位は、コレステロール（Ｋｕｂｏら３６５ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．５４−６１（２００７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら８６ ＰＮＡＳ ６５５３（１９８９））；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら１９９４）；チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら１９９２；Ｍａｎｏｈａｒａｎら１９９３）；チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら１９９２）；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら１９９１；Ｋａｂａｎｏｖら２５９ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３２７（１９９０）；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら７５ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７５（１９９３））；リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたは１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロー３−Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（Ｍａｎｏｈａｒａｎら（１９９５）；Ｓｈｅａら１８ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７７７（１９９０））；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（ＭａｎｏｈａｒａｎらＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５）；またはアダマンタン酢酸（ＭａｎｏｈａｒａｎらＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５）；パルミチル部位（Ｍｉｓｈｒａら１９９５）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部位（Ｃｒｏｏｋｅら１９９６）のような脂質部位を含むものであった。そのようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は本明細書中にリストされている。典型的なコンジュゲーションプロトコルは、配列の１以上の位置にアミノリンカーを担持するオリゴヌクレオチドの合成を含む。次いで、適当なカップリングまたは活性化試薬を用い、アミノ基を、コンジュゲートされるべき分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、溶液相中で、固体支持体に依然として結合しているＲＮＡを用いて、またはＲＮＡの切断に従って、のいずれかで実行することができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製は、典型的には、純粋なコンジュゲートを与える。
例示的なＲＮＡエフェクター分子の核酸配列は、標準的な命名法、具体的には、以下のように、表１７の略語を用いて以下に表わす：
Figure 2014501489
 リガンド
本発明で特徴とされる（例えば、ＲＮＡエフェクター分子の）オリゴヌクレオチドのもう１つの修飾は、オリゴヌクレオチドの１以上のリガンドに、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞摂取を増強させる部位またはコンジュゲートを化学的に連結させることを含む。そのような部位は、限定されるものではないが、コレステロール部位（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら ８６ ＰＮＡＳ ６５５３−５６（１９８９）；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら４ Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．１０５３−６０（１９９４））；チオエーテル、例えば、べリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら６６０ Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３０６３０９（１９９２）；Ｍａｎｏｈａｒａｎら３ Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．２７６５−７０（１９９３））；チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら２０ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．５３３−３８（１９９２））；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら１０ ＥＭＢＯ Ｊ． １１１１−１８（１９９１）；Ｋａｂａｎｏｖら２５９ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３２７−３０（１９９０）；ＳｖｉｎａｒｃｈｕｋらＢｉｏｃｈｉｍｉｅ ４９−５４（１９９３））；リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチル−１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホン酸アンモニウム（Ｍａｎｏｈａｒａｎら３６ Ｔｅｔｒａｈｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３６５１−５４（１９９５）；Ｓｈｅａら１８ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７７７−８３（１９９０））；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら１４ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ９６９−７３（１９９５））；またはアダマンタン酢酸（ＭａｎｏｈａｒａｎらＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５）；パルミチル部位（Ｍｉｓｈｒａら１２６４ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，Ａｃｔａ ２２９−３７（１９９５））；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部位（Ｃｒｏｏｋｅら２２７ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．９２３−３７（１９９６））；のような脂質部位を含む。
１つの実施形態において、リガンドは、それが取り込まれるＲＮＡエフェクター分子剤の分布、標的化または寿命を改変する。いくつかの実施形態において、例えば、そのようなリガンドが存在しない種と比較して、リガンドは、選択された標的、例えば、分子、細胞または細胞型、区画、例えば、細胞または器官の区画、身体の組織、器官または領域に対する増強された親和性を供する。理想的には、リガンドは、デュプレックス化された核酸でのデュプレックス対合において役割を果たさないであろう。
リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ），またはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）または脂質のような天然に生じる物質を含むことができる。リガンドは、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸のような組換えまたは合成分子とすることもできる。ポリアミノ酸の例は、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬアスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポオリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンを含む。ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチドミメティックポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはα−らせんペプチドを含む。
リガンドは、標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、腎臓細胞のような特定の細胞型に結合する抗体を含むこともできる。標的化基はチロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォレート、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチドミメティックとすることができる。
リガンドの他の例は、色素、インターカレイティング剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環状芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオ−ル、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リチオコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレイン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換されたアルキル、放射性方式マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収ファシリテーター（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰを含む。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コ−リガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞のような特定の細胞型に結合する抗体とすることができる。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体を含むこともできる。それらは、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン多価マンノース、または多価フコースのような非ペプチド種を含むこともできる。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのアクチベーター、またはＮＦ−κＢのアクチベーターとすることができる。
リガンドは、物質、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間フィラメントを破壊することによってＲＮＡエフェクター分子剤の細胞への取り込みを増加させることができる薬物とすることができる。該薬物は、例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトリンクリン、Ａ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンとすることができる。
例としてのリガンドは脂質または脂質ベースの分子である。そのような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートの標的組織、例えば、身体の非腎臓標的組織への分布を可能とする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合することができる他の分子はリガンドとして用いることもできる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを用いることができる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する抵抗性を増加させ、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的または輸送を増加させ、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整することができる。
脂質ベースのリガンドを用いて、変調する、例えば、コンジュゲートの標的組織への結合を制御することができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して標的化されるようではなく、従って、胚からあまり除去されないようである。ＨＳＡにあまり強くなく結合する脂質または脂質ベースのリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓に標的化することができる。例えば、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合し、あるいは、それは、コンジュゲートが非腎臓組織に分布されるが、可逆的でもあるように、十分な親和性をもってＨＳＡに結合する。別法として、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが腎臓に分布するように、ＨＳＡに弱く結合するか、または全く結合しない。腎臓細胞に標的化する他の部位は、脂質ベースのリガンドの代わりに、またはそれに加えて用いることもできる。
１つの態様において、リガンドは部位、例えば、胚細胞、例えば、増殖する細胞によって取り込まれるビタミンである。例示的なビタミンは、ビタミンＡ、ＥおよびＫを含む。他の例示的なビタミンは、胚細胞によって取り込まれる、Ｂビタミン、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは他のビタミンまたは栄養素を含む。また、ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質も含まれる。
別の態様において、リガンドは細胞浸透剤、好ましくは、らせん細胞浸透剤である。好ましくは、該剤は両親媒性である。例示的な剤はｔａｔまたはアンテノペリアのようなペプチドである。剤がペプチドであれば、それを修飾することができ、ペプチジルミメティック、逆転異性体、非ペプチドまたはプソイド−ペプチド連結、およびＤ−アミノ酸の使用を含む。らせん剤はα−らせん剤とすることができ、親油性および疎油性相を含むことができる。
リガンドはペプチドまたはペプチドミメティックとすることができる。（本明細書中においては、オリゴペプチドミメティックとも言われる）ペプチドミメティックは、天然ペプチドと同様な規定された三次元構造に折り畳まれ得る分子である。ペプチドおよびペプチドミメティックスのＲＮＡエフェクター分子材への付着は、細胞認識および吸収を増強させることなどにより、ＲＮＡエフェクター分子の薬物動態的分布に影響し得る。ペプチドまたはペプチドミメティック部位は約５〜５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る（例えば、表１８参照）。
Figure 2014501489
 ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば、細胞浸透ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）、または架橋ペプチドであり得る。別の実施態様では、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号３２８４９５８）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦ類似物（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３２８４９５９））もまた、ターゲッティング部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質などの大きな極性分子を細胞膜のいたる所で運ぶ「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ［配列番号３２８４９６０］）及びショウジョウバエ・アンテナペディア・タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ［配列番号２８４９６１］）に由来する配列は、送達ペプチドとして機能し得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドなどのランダム配列のＤＮＡによってコードされ得る。Ｌａｍら、３５４ Ｎａｔｕｒｅ ８２−８４（１９９１）。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ物質に繋留され得、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、またはＲＧＤ模倣薬などの細胞標的ペプチドである。記載されるように、ペプチド部分は、安定性を増大させるか、または配座特性を管理するなどの構造修飾を有し得る。本明細書において記載される任意の構造修飾が利用され得る。
ＲＧＤペプチド部分は、内皮系腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするのに使用され得る。Ｚｉｔｚｍａｎｎら、６２ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１３９−４３（２００２）。ＲＧＤペプチドは、ｄｓＲＮＡ物質が、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む様々な他の組織の腫瘍にターゲッティングするのを容易にし得る。Ａｏｋｉら、８ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７８３−８７（２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、ＲＮＡエフェクター分子物質が腎臓にターゲッティングするのを容易にするであろう。ＲＧＤペプチドは、直線状または環状であり得るか、または特定の組織にターゲッティングするのを容易にするために修飾（例えば、グリコシル化またはメチル化）され得る。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、ＲＮＡエフェクター分子物質を、αＶβ３を発現する腫瘍細胞に送達し得る。Ｈａｕｂｎｅｒら、４２ Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３２６−３６（２００１）。
「細胞浸透ペプチド」は、細胞を浸透することができる。それは、例えば、αヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ−３７またはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシン、またはバクテネシン）、または一つもしくは２つの支配的アミノ酸（ｄｏｍｉｎａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）のみを含むペプチド（例えば、ＰＲ−３９またはインドリシジン）であり得る。細胞浸透ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含み得る。例えば、細胞浸透ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン及びＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳに由来する二部分両親媒性ペプチド（例えば、ＭＰＧ）であり得る。Ｓｉｍｅｏｎｉら、３１ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７１７−２４（２００３）。
オリゴヌクレオチド複合体の調製を教示する代表的な特許としては、米国特許第４，８２８，９７９号、米国特許第４，９４８，８８２号、米国特許第５，２１８，１０５号、米国特許第５，５２５，４６５号、米国特許第５，５４１，３１３号、米国特許第５，５４５，７３０号、米国特許第５，５５２，５３８号、米国特許第５，５７８，７１７，米国特許第５，５８０，７３１号、米国特許第５，５９１，５８４号、米国特許第５，１０９，１２４号、米国特許第５，１１８，８０２号、米国特許第５，１３８，０４５号、米国特許第５，４１４，０７７号、米国特許第５，４８６，６０３号、米国特許第５，５１２，４３９号、米国特許第５，５７８，７１８号、米国特許第５，６０８，０４６号、米国特許第４，５８７，０４４号、米国特許第４，６０５，７３５号、米国特許第４，６６７，０２５号、米国特許第４，７６２，７７９号、米国特許第４，７８９，７３７号、米国特許第４，８２４，９４１号、米国特許第４，８３５，２６３号、米国特許第４，８７６，３３５号、米国特許第４，９０４，５８２号、米国特許第４，９５８，０１３号、米国特許第５，０８２，８３０号、米国特許第５，１１２，９６３号、米国特許第５，２１４，１３６号、米国特許第５，０８２，８３０号、米国特許第５，１１２，９６３号、米国特許第５，２１４，１３６号、米国特許第５，２４５，０２２号、米国特許第５，２５４，４６９号、米国特許第５，２５８，５０６号、米国特許第５，２６２，５３６号、米国特許第５，２７２，２５０号、米国特許第５，２９２，８７３号、米国特許第５，３１７，０９８号、米国特許第５，３７１，２４１，米国特許第５，３９１，７２３号、米国特許第５，４１６，２０３，米国特許第５，４５１，４６３号、米国特許第５，５１０，４７５号、米国特許第５，５１２，６６７号、米国特許第５，５１４，７８５号、米国特許第５，５６５，５５２号、米国特許第５，５６７，８１０号、米国特許第５，５７４，１４２号、米国特許第５，５８５，４８１号、米国特許第５，５８７，３７１号、米国特許第５，５９５，７２６号、米国特許第５，５９７，６９６号、米国特許第５，５９９，９２３号、米国特許第５，５９９，９２８号、米国特許第５，６８８，９４１号、米国特許第６，２９４，６６４号、米国特許第６，３２０，０１７号、米国特許第６，５７６，７５２号、米国特許第６，７８３，９３１号、米国特許第６，９００，２９７号、及び米国特許第７，０３７，６４６号が挙げられるが、これらに限定されない。
所定の化合物中のすべての位置が均一に修飾されることは必要ではなく、実際に、２つ以上の上記修飾は、単一の化合物中に、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにおいても組み込まれ得る。本発明はまた、キメラ化合物であるオリゴヌクレオチド分子化合物を含む。本発明の文脈において、「キメラ」ＲＮＡエフェクター分子化合物または「キメラ」は、２つ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチド化合物（例えば、ｄｓＲＮＡ）であり、ｄｓＲＮＡ化合物の場合、それぞれが少なくとも一つのモノマー単位（すなわち、ヌクレオチド）で構成されている。これらのＲＮＡエフェクター分子は、典型的には少なくとも一つの領域を含み、ここで、ＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解耐性の増大、細胞取り込みの増大及び／または標的核酸に対する結合親和性の増大をＲＮＡエフェクター分子に付与するように修飾される。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として働き得る。例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のＲＮＡエフェクター分子阻害の効率を非常に高める。その結果として、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同一の標的領域に対してハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いＲＮＡエフェクター分子を用いて同程度の結果がしばしば得られる。オリゴヌクレオチドの切断は、ゲル電気泳動によって、そして必要な場合には当技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、通常検出され得る。
ＶＩ．ＲＮＡエフェクター分子の導入／送達
本明細書で提供される方法によるオリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡエフェクター分子）の細胞への送達は、多くの異なる方法で達成され得る。例えば、ＲＮＡエフェクター分子、例えばｄｓＲＮＡを含有する組成物を細胞培養物に投与することによって直接的に送達を実施することができる。あるいは、ＲＮＡエフェクター分子をコードし、その発現を指令する１またはそれ以上のベクターを細胞に投与することによって間接的に送達を実施することができる。これらの選択肢を本明細書中でさらに論じる。
一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、１もしくはそれ以上のｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡエフェクター分子または１もしくはそれ以上のｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡエフェクター分子をコードするＤＮＡを含有する侵入性細菌を細胞に導入すること（時としてトランスキングダムＲＮＡｉ（ｔｋＲＮＡｉ）と称されるプロセス）によって細胞に導入されるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡエフェクター分子である。侵入性細菌は、リステリア属、赤痢菌属、サルモネラ属、大腸菌もしくはビフィドバクテリウム属の弱毒株、または、例えば侵入性細菌が細胞の細胞質にアクセスすることを可能にする１もしくはそれ以上の遺伝子を導入することによって、その侵入特性を高めるように遺伝的に修飾された非侵入性細菌であり得る。そのような細胞質標的遺伝子の例は、リステリア属のリステリオリシンＯ及び偽結核エルジニア菌のインベーシンタンパク質を含む。トランスキングダムＲＮＡｉ（ｔｋＲＮＡｉ）を誘導するためにＲＮＡエフェクター分子を動物細胞に送達する方法は当技術分野において公知である。例えば、米国特許出願公開第２００８／０３１１０８１号及び同第２００９／０１２３４２６号参照。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡ分子である。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子はｓｈＲＮＡ分子ではない。
本明細書で述べるように、オリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防ぎ、望ましくないオフターゲット効果を回避するように修飾され得る。例えば、ＲＮＡエフェクター分子を、細胞取込みを増強し、分解を防ぐためにコレステロールなどの親油基に化学結合することによって修飾できる。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は親油基、例えばコレステロールへの化学結合によって修飾されない。
選択的実施形態では、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソームまたはカチオン送達システム（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）などの薬剤送達システムを用いてＲＮＡエフェクター分子を送達することができる。正に荷電したカチオン送達システムは、ＲＮＡエフェクター分子（負に荷電している）の結合を促進し、また効率的な細胞取込みを可能にする負に荷電した細胞膜での相互作用を増強する。カチオン性脂質、デンドリマーまたはポリマーをＲＮＡエフェクター分子に結合するか、またはＲＮＡエフェクター分子を包み込む小胞またはミセルを形成するように誘導することができる。例えば、Ｋｉｍら、１２９ Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌｅａｓｅ １０７−１６（２００８）参照。カチオン−ＲＮＡエフェクター分子複合体を作製し、使用するための方法は、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、３２７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７６１−６６（２００３）、Ｖｅｒｍａら、９ Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２９１−１３００（２００３）、Ａｒｎｏｌｄら、２５ Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ． １９７−２０５（２００７）参照。
ＲＮＡエフェクター分子が、センス鎖とアンチセンス鎖を含む、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの二本鎖分子である場合は、センス鎖とアンチセンス鎖を別々にかつ経時的に細胞、細胞溶解物、組織または細胞培養物に暴露することができる。「別々にかつ経時的に」という語句は、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子の各々の鎖を一本鎖形態で、例えば両方の鎖のアニーリングしていない混合物の形態でまたは各々の鎖の別々の、すなわち非混合製剤を細胞、細胞溶解物、組織または細胞培養物に導入することを指す。一部の実施形態では、各々の鎖の導入の間に、数秒間から数分間、さらには約１時間またはそれ以上、例えば１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間または１０８時間またはそれ以上にわたり得る時間間隔が存在する。別々かつ経時的な投与は、正準または非正準ＲＮＡエフェクター分子を用いて実施できる。
複数のＲＮＡエフェクター分子を別々にかつ経時的に投与することも本明細書で企図される。従って、標的遺伝子に対する所望の平均パーセント阻害を達成するために複数のＲＮＡエフェクター分子の各々を別々の時点でまたは異なる頻度間隔で投与できる。例えば、Ｂａｋを標的するＲＮＡエフェクター分子はＬＤＨを標的するＲＮＡエフェクター分子よりも頻繁に投与することができ、これは、Ｂａｋの発現がＢａｋ ＲＮＡエフェクター分子での処理後により速く回復するためである。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を約０．０１ｎＭ〜２００ｎＭの濃度で添加する。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を約５０ 分子／細胞〜５００，０００分子／細胞の量で添加する。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を約０．１ｆｍｏｌ／１０６細胞〜約 １ｐｍｏｌ／１０６細胞の濃度で添加する。
別の態様では、標的遺伝子の発現を調節するためのＲＮＡエフェクター分子を、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入した転写単位から発現させることができる。例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅら、１２ ＴＩＧ ５−１０（１９９６）、国際公開広報第ＷＯ００／２２１１３号、国際公開広報第ＷＯ００／２２１１４号、米国特許第６，０５４，２９９号参照。発現は、使用される特定の構築物及び標的組織または細胞型に依存して、一過性（およそ数時間から数週間）または持続性（数週間から数か月間またはそれ以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組込みまたは非組込みベクターであり得る、線状構築物、環状プラスミドまたはウイルスベクターとして導入できる。導入遺伝子はまた、染色体外プラスミドとして遺伝されることを可能にするように構築することもできる。Ｇａｓｓｍａｎｎら、９２ ＰＮＡＳ １２９２（１９９５）。
ＲＮＡエフェクター分子の個々の鎖または両方の鎖は、発現ベクター上のプロモーターから転写され得る。２つの別々の鎖を、例えばｄｓＲＮＡを生成するように発現させる場合、２つの別々の発現ベクターを標的細胞に同時導入することができる（例えばトランスフェクションまたは感染によって）。あるいは、ｄｓＲＮＡの各々個々の鎖は、両方ともが同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一つの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステム及びループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向反復配列として発現される。
ＲＮＡエフェクター分子発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞と適合性の発現ベクター、例えば脊椎動物細胞、昆虫細胞または酵母細胞と適合性のものは、本明細書で述べるＲＮＡエフェクター分子の発現のための組換え構築物を作製するために使用できる。真核細胞発現ベクターは当技術分野において周知であり、多くの商業的供給元から入手可能である。典型的には、所望核酸セグメントの挿入のために好都合な制限部位を含むそのようなベクターが提供される。ＲＮＡエフェクター分子発現ベクターは、標準的なトランスフェクション及び形質導入法を用いて標的細胞に直接的に送達できる。
ＲＮＡエフェクター分子発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）トランスフェクション試薬）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴＲＡＮＳＩＴ−ＴＫＯ（登録商標）トランスフェクション試薬、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）との複合体として標的細胞にトランスフェクトできる。１週間またはそれ以上の期間にわたって標的ＲＮＡの種々の領域を標的するＲＮＡエフェクター分子を介したノックダウンのための複数の脂質トランスフェクションも本発明によって企図される。宿主細胞へのベクターの導入の成功は、様々な公知の方法を用いて観測できる。例えば、一過性トランスフェクションは、蛍光マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーターで示され得る。エクスビボでの細胞の安定なトランスフェクションは、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定の環境因子（例えば抗生物質及び薬剤）に対する耐性を備えたトランスフェクト細胞を提供するマーカーを使用して確保され得る。ＲＮＡエフェクター分子発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）試薬）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴＲＡＮＳＩＴ−ＴＫＯ（登録商標）トランスフェクション試薬）との複合体として標的細胞にトランスフェクトできる。１週間またはそれ以上の期間にわたって標的ＲＮＡの種々の領域を標的するＲＮＡエフェクター分子を介したノックダウンのための複数の脂質トランスフェクションも本発明によって企図される。宿主細胞へのベクターの導入の成功は、様々な公知の方法を用いて観測できる。例えば、一過性トランスフェクションは、蛍光マーカー、例えばＧＦＰなどのレポーターで示され得る。エクスビボでの細胞の安定なトランスフェクションは、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定の環境因子（例えば抗生物質及び薬剤）に対する耐性を備えたトランスフェクト細胞を提供するマーカーを使用して確保され得る。
本明細書で述べる方法及び組成物に関して利用できるウイルスベクター系は、（ａ）アデノウイルスベクター、（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス等を含むがこれらに限定されない、レトロウイルスベクター、（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター、（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ４０ベクター、（ｆ）ポリオーマウイルスベクター、（ｇ）パピローマウイルスベクター、（ｈ）ピコルナウイルスベクター、（ｉ）オルトポックス、例えばワクシニアウイルスベクターまたはアビポックス、例えばカナリアポックスまたはニワトリポックスウイルスベクターなどのポックスウイルスベクター、及び（ｊ）ヘルパー依存型またはガットレスアデノウイルスを含むが、これらに限定されない。複製欠損ウイルスも好都合であり得る。種々のベクターが細胞のゲノムに組み込まれるまたは組み込まれない。構築物は、所望する場合は、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物を、エピソーム複製することができるベクター、例えばＥＰＶ及びＥＢＶベクターに組み込むことができる。ＲＮＡエフェクター分子の組換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞におけるＲＮＡエフェクター分子の発現を確実にするための調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー等を必要とする。ベクター及び構築物について考慮する他の態様を本明細書でさらに説明する。
ＲＮＡエフェクター分子の送達のために有用なベクターは、所望標的細胞または組織におけるＲＮＡエフェクター分子の発現のために十分な調節エレメント（プロモーター、エンハンサー等）を含む。調節エレメントは、構成的または調節的／誘導的発現のいずれかを提供するように選択され得る。
ＲＮＡエフェクター分子の発現は、例えば、特定の生理的調節因子、例えばグルコースレベルに対して感受性である誘導的調節配列を使用することによって正確に調節できる。Ｄｏｃｈｅｒｔｙら、８ ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０−２４（１９９４）。細胞におけるｄｓＲＮＡ発現の制御のために適切な、かかる誘導的発現系は、例えば、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学的誘導物質及びイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む。当業者は、ＲＮＡエフェクター分子導入遺伝子の意図される用途に基づいて適切な調節／プロモーター配列を選択することができる。
特定の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用できる。例えば、レトロウイルスベクターが使用できる。Ｍｉｌｌｅｒら、２１７ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８１−９９（１９９３）、米国特許第６，９４９，２４２号参照。レトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要な成分を含有する。ＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列を１またはそれ以上のベクターにクローニングし、これによって細胞への核酸の送達が促進される。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、例えば、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするためにｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するレトロウイルスベクターの使用を述べる、Ｂｏｅｓｅｎら、６ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ２９１−３０２（１９９４）に見出される。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓら、９３ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６４４−６５１（１９９４）、Ｋｉｅｍら、８３ Ｂｌｏｏｄ １４６７−７３（１９９４）、Ｓａｌｍｏｎｓ＆Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，４ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２９−１１（１９９３）、Ｇｒｏｓｓｍａｎ＆Ｗｉｌｓｏｎ，３ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｄｅｖｅｌ．１１０−１４（１９９３）を含む。使用のために企図されるレンチウイルスベクターは、例えば、米国特許第６，１４３，５２０号、同第５，６６５，５５７号、及び同第５，９８１，２７６号に記載されているＨＩＶベースのベクターを含む。
本明細書で論じるように、レトロウイルスの侵入のための宿主細胞表面受容体がＥＲＶ Ｅｎｖタンパク質によって占拠され得ること（ウイルス干渉）に留意すべきである。Ｍｉｌｌｅｒ，９３ ＰＮＡＳ １１４０７−１３（１９９６）参照。レトロウイルスエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質は、ウイルス粒子のそれらの細胞受容体への結合を媒介し、ウイルスの侵入を可能にする、新たな複製周期の第一段階である。ＥＲＶが細胞において発現された場合、関連する外因性レトロウイルスによる再感染が干渉を介して阻止される（受容体干渉とも呼ばれる）、細胞膜に挿入されたＥＲＶのＥｎｖタンパク質は、受容体競合によって対応する外因性ウイルスを妨げる。これは、細胞をレトロウイルスの過剰負荷から保護する。例えば、外因性ＪＳＲＶはすべて細胞ヒアルロニダーゼ２を受容体として利用するので、内因性ＪＳＲＶは外因性ＪＳＲＶの侵入をブロックすることができる。Ｓｐｅｎｃｅｒら、７７ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７４９−５３（２００３）。欠損ＥＲＶは全く干渉しないことに注目すべきである。２つの内因性ＪＳＲＶ、内因性ＪＳ５６Ａ１及び内因性ＪＳＲＶ−２０は、外因性ＪＳＲＶの後期複製を妨げ得る突然変異型Ｇａｇポリタンパク質を含有する。Ａｒｎａｕｄら、２ ＰＬｏＳ ｅ１７０（２００７）。従って、欠損レトロウイルスと自律複製可能なレトロウイルスの間の干渉は、ＥＲＶコピー数の制御の重要な機構を提供する。ＥＲＶによって発現されるＥｎｖ分子（例えばＨＥＲＶ−Ｈファミリーによって発現される）による受容体干渉は、組換えタンパク質を生産することを意図された細胞のトランスフェクションまたは再感染を妨げ得る。そのような作用は、各々が一本の相補的な抗体鎖をコードする２つのレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた宿主細胞のような、レトロウイルスベクターを介した組換え宿主細胞における低いコピー数または低い発現を説明し得る。従って、ＥＲＶ Ｅｎｖタンパク質の発現を阻害する本実施形態の標的遺伝子は、宿主細胞におけるレトロウイルスベクターの多重度の上昇及び免疫原性作用物質の収量の増大を提供する。
アデノウイルスもＲＮＡエフェクター分子の送達における使用のために企図される。本発明を特徴付けるＲＮＡエフェクター分子を発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｘｉａら、２０ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１００６−１０（２００２）に記載されている。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用も企図される（Ｗａｌｓｈら、２０４ Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２８９−３００（１９９３）、米国特許第５，４３６，１４６号）。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、例えばＵ６もしくはＨ１ ＲＮＡプロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組換えＡＡＶから２つの別々の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡを発現するための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、６１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３０９６−１０１（１９８７）、Ｆｉｓｈｅｒら、７０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２０−３２（１９９６）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、６３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３８２２−２６ （１９８９）、米国特許第５，２５２，４７９号及び同第５，１３９，９４１号、国際公開広報第ＷＯ９４／１３７８８号、同第ＷＯ９３／２４６４１号に記載されている。
もう一つのウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、例えば改変ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）もしくはＮＹＶＡＣなどの弱毒ワクシニアウイルス、ニワトリポックスもしくはカナリアポックスなどのアビポックスウイルスのようなポックスウイルスである。
ウイルスベクターの指向性は、適宜に、他のウイルスからのエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原でベクターを偽型化することによって、または異なるウイルスキャプシドタンパク質を代用することによって改変できる。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルス、バキュロウイルス等からの表面タンパク質で偽型化できる。モノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）、例えばＶＳＶまたはＲＳウイルス（ＲＳＶ）は、バキュロウイルスで偽型化できる。米国特許第７，０４１，４８９号。ＡＡＶベクターは、異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを遺伝子操作することによって異なる細胞を標的させることができる。例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、７６ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９１−８０１（２００２）参照。
一つの実施形態では、本発明は、本明細書で述べるＲＮＡエフェクター分子及び許容される担体を含有する組成物を提供する。ＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物は、細胞における標的遺伝子の発現または活性を調節することによって細胞による免疫原性作用物質の産生を増強するために有用である。そのような組成物は、送達の方法に基づいて製剤される。免疫原性作用物質の産生を改善するうえで有用な例示的ＲＮＡエフェクター分子が本明細書で提供される。一つの実施形態では、組成物中のＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡである。あるいは、組成物中のＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡではない。
別の実施形態では、ＩＮＦＲＡ１またはＩＦＮＢ遺伝子及びＰＴＥＮ、ＢＡＫ、ＦＮ１またはＬＤＨＡ遺伝子などの、免疫応答経路及び細胞プロセスの発現の阻害を可能にする複数のＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物が本明細書で提供される。組成物は、場合により、以下を含むがこれらに限定されない付加的な細胞プロセスを標的する少なくとも一つの付加的なＲＮＡエフェクター分子と組み合わせる（または投与する）ことができる：炭素の代謝及び輸送、アポトーシス、ＲＮＡｉの取込み及び／または効率、反応性酸素種の産生、細胞周期の制御、タンパク質の折りたたみ、ピログルタミン酸化タンパク質修飾、デアミダーゼ、グリコシル化、ジスルフィド結合の形成、タンパク質分泌、遺伝子増幅、ウイルス複製、ウイルス感染、ウイルス粒子の放出、ｐＨの制御ならびにタンパク質産生。
一つの実施形態では、本明細書で述べる組成物は複数のＲＮＡエフェクター分子を含有する。この態様の一つの実施形態では、複数のＲＮＡエフェクター分子の各々は異なる濃度で提供される。この態様の別の実施形態では、複数のＲＮＡエフェクター分子の各々は同じ濃度で提供される。この態様の別の実施形態では、複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも２つは同じ濃度で提供され、複数のうちの少なくとも一つの他のＲＮＡエフェクター分子は異なる濃度で提供される。ＲＮＡエフェクター分子及び濃度の様々な組合せが、本明細書で述べる所望作用を生じさせるために培養細胞に提供され得ることは当業者に認識される。
一つの実施形態では、第一ＲＮＡエフェクター分子を培養細胞に投与し、次に第二ＲＮＡエフェクター分子を細胞に投与する（または逆も同様である）。さらなる実施形態では、第一ＲＮＡエフェクター分子と第二ＲＮＡエフェクター分子を実質的に同時に培養細胞に投与する。
別の実施形態では、本明細書で述べるＲＮＡエフェクター分子、例えば宿主細胞標的遺伝子に対するｄｓＲＮＡを含有する組成物を、細胞による免疫原性作用物質の産生を増強するために有用な非ＲＮＡ物質と共に培養細胞に投与する。
本明細書を特徴付ける組成物は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で投与される。一般に、ＲＮＡエフェクター分子の適切な用量は、１日につき単位容量当たり０．００１〜２００．０ｍｇの範囲内である。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を１日当たり０．００１ｎＭ〜２００ｍＭの範囲内、一般に０．１ｎＭ〜５００ｎＭ（両端を含む）の範囲内で提供する。例えば、ｄｓＲＮＡは単回用量当たり０．０１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１ｎＭ、１．５ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭまたは５００ｎＭで投与し得る。
組成物は１日１回投与することができ、またはＲＮＡエフェクター分子を、１日を通して適切な間隔で２、３もしくはそれ以上の分割用量としてまたは制御放出製剤による送達として投与できる。その場合、各分割用量に含まれるＲＮＡエフェクター分子は、総１日用量を達成するために対応してより少用量でなければならない。投与単位はまた、例えば数日間にわたるＲＮＡエフェクター分子の持続放出を提供する従来の持続放出製剤を用いて、数日間にわたる送達用に配合され得る。持続放出製剤は当技術分野で周知であり、本発明の物質に関して使用できるような、特定部位への薬剤の送達のために特に有用である。留意すべき点として、複数のＲＮＡエフェクター分子を投与する場合、ＲＮＡエフェクター分子の総用量が各々を単独で投与した場合よりも高くなることを考慮しなければならない。例えば、各々１ｎＭの３つのＲＮＡエフェクター分子の投与（例えば標的遺伝子発現の有効な阻害のため）は、必然的に細胞への３ｎＭの総用量を生じさせる。当業者は、ＲＮＡエフェクター分子または送達剤のいずれかの高濃度から生じる胚への望ましくない毒性作用を予防しつつ、各標的遺伝子の有効な阻害を生じさせるように各ＲＮＡエフェクター分子の必要量を変更することができる。
標的遺伝子の転写産物レベルへの単回用量の作用は、その後の用量が多くても３、４もしくは５日の間隔で、または多くても１、２、３または４週間の間隔で投与されるように、長時間作用性であり得る。
一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子の投与を、免疫原性作用物質の単離の少なくとも６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１８時間前、少なくとも３６時間前、少なくとも４８時間前、少なくとも６０時間前、少なくとも７２時間前、少なくとも９６時間前または少なくとも１２０時間前または少なくとも１週間前に停止する。従って一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子と宿主細胞（例えば大規模宿主細胞培養物中の）との接触は、免疫原性作用物質の単離の少なくとも６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１８時間前、少なくとも３６時間前、少なくとも４８時間前、少なくとも６０時間前、少なくとも７２時間前、少なくとも９６時間前または少なくとも１２０時間前または少なくとも１週間前に完了する。
また、特定の実施形態では、各細胞につき一定数（または少なくとも最小数）のＲＮＡエフェクター分子が維持されるように培養細胞をＲＮＡエフェクター分子と接触させることが有益であり得ることが留意される。ＲＮＡエフェクター分子自体のレベルを維持することにより、高い細胞密度であっても標的遺伝子発現の調節を確実に維持することができる。
あるいは、細胞密度に応じたＲＮＡエフェクター分子の量を投与することができる。かかる実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を少なくとも０．０１ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも０．１ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも０．５ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも０．７５ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも１ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも２ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも５ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも１０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも２０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも３０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも４０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも５０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも６０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも１００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも２００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも３００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも４００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも５００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも７００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも８００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも９００ｆｍｏｌ／１０６細胞または少なくとも１ｐｍｏｌ／１０６細胞またはそれ以上の濃度で添加する。
選択的実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を細胞につき少なくとも１０分子、細胞につき少なくとも２０分子（分子／細胞）、少なくとも３０分子／細胞、少なくとも４０分子／細胞、少なくとも５０分子／細胞、少なくとも６０分子／細胞、少なくとも７０分子／細胞、少なくとも８０分子／細胞、少なくとも９０分子／細胞、少なくとも１００分子／細胞、少なくとも２００分子／細胞、少なくとも３００分子／細胞、少なくとも４００分子／細胞、少なくとも５００分子／細胞、少なくとも６００分子／細胞、少なくとも７００分子／細胞、少なくとも８００分子／細胞、少なくとも９００分子／細胞、少なくとも１０００分子／細胞、少なくとも２０００分子／細胞、少なくとも５０００分子／細胞またはそれ以上（包括的）の用量で投与する。
一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を１０〜１００分子／細胞、１０〜９０分子／細胞、１０〜８０分子／細胞、１０〜７０分子／細胞、１０〜６０分子／細胞、１０〜５０分子／細胞、１０〜４０分子／細胞、１０〜３０分子／細胞、１０〜２０分子／細胞、９０〜１００分子／細胞、８０〜１００分子／細胞、７０〜１００分子／細胞、６０〜１００分子／細胞、５０〜１００分子／細胞、４０〜１００分子／細胞、３０〜１００分子／細胞、２０〜１００分子／細胞、３０〜６０分子／細胞、３０〜５０分子／細胞、４０〜５０分子／細胞、４０〜６０分子／細胞の範囲内またはそれらの間の任意の範囲内の用量で投与する。
本明細書で述べる方法の一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を持続注入中で細胞に提供する。持続注入は、ゼロ日目（例えば細胞培養の１日目またはＲＮＡエフェクター分子の接種の当日）に開始し得るかまたは免疫原性作用物質の生産工程の間の任意の時点で開始できる。同様に、持続注入は免疫原性作用物質の生産工程の間の任意の時点で停止できる。従って、ＲＮＡエフェクター分子または組成物の注入は、細胞増殖の特定の期、生産工程中の時間帯または任意の他の所望時点で提供及び／または除去できる。持続注入はまた、標的遺伝子に対する「所望平均パーセント阻害」［この用語が本明細書で使用される場合］を達成するように提供できる。
一つの実施形態では、細胞培養物へのＲＮＡエフェクター分子の初期ボーラス投与後に持続注入を使用することができる。この実施形態では、持続注入は、所望期間にわたってＲＮＡエフェクター分子の濃度を最小レベルより上に維持する。持続注入は、培養物０．０３ｐｍｏｌ／Ｌ／時〜培養物３ｐｍｏｌ／Ｌ／時、例えば０．０３ｐｍｏｌ／Ｌ／時、０．０５ｐｍｏｌ／Ｌ／時、０．０８ｐｍｏｌ／Ｌ／時、０．１ｐｍｏｌ／Ｌ／時、０．２ｐｍｏｌ／Ｌ／時、０．３ｐｍｏｌ／Ｌ／時、０．５ｐｍｏｌ／Ｌ／時、１．０ｐｍｏｌ／Ｌ／時、２ｐｍｏｌ／Ｌ／時または３ｐｍｏｌ／Ｌ／時またはそれらの間の任意の値の速度で送達され得る。
一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を滅菌水溶液として投与する。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を非脂質製剤中に製剤する。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子をカチオン性または非カチオン性脂質製剤中に製剤する。さらに別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を、宿主細胞を培養するのに適した細胞培地（例えば無血清培地）中に製剤する。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子の初期濃度を、標的遺伝子の発現の調節を維持するためにＲＮＡエフェクター分子の持続注入で補完する。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を、一定濃度（例えば１ｎＭ）を達成するためにボーラス投与において細胞増殖の特定の段階（例えば初期対数期）で培養細胞に適用し、ＲＮＡエフェクター分子の持続注入を行う。
ＲＮＡエフェクター分子は１日１回投与することができ、またはＲＮＡエフェクター分子治療は、免疫原性作用物質の生産中を通して適切な間隔／頻度で組成物を培地に添加することによって反復できる（例えば２回、３回またはそれ以上の投与）。本明細書で使用される「頻度」という用語は、細胞培養物のトランスフェクションが生じる間隔であり、各標的遺伝子に対する所望阻害レベルを維持するように当業者によって最適化され得る間隔を指す。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を４８時間ごとの頻度で培養細胞と接触させる。他の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を、免疫原性作用物質の生産期間中、例えば４時間ごと、６時間ごと、１２時間ごと、１８時間ごと、２４時間ごと、３６時間ごと、７２時間ごと、８４時間ごと、９６時間ごと、５日ごと、７日ごと、１０日ごと、１４日ごと、３週間ごとまたはそれ以上の期間ごとの頻度で投与する。頻度はまた、各々の投与の間の間隔が異なるように（例えば最初は３６時間の間隔；２回目は４８時間の間隔；３回目は７２時間の間隔等）変化させ得る。
「頻度」という用語は、同様に免疫原性作用物質の生産の間の細胞培養物の栄養供給にも適用され得る。ＲＮＡエフェクター分子での処理の頻度と栄養供給の頻度は同じである必要はない。明瞭にするため、栄養分は、ＲＮＡエフェクター処理の時点でまたは交互に添加することができる。栄養供給の頻度は、ＲＮＡエフェクター分子処理より短い間隔であってもよくまたはより長い間隔であってもよい。例えば、ＲＮＡエフェクター分子の用量を４８時間の間隔で適用し、栄養供給を２４時間の間隔で適用することができる。免疫原性作用物質を生産するための間隔全体（例えば３週間）の間に、ＲＮＡエフェクター分子より多い栄養分の投与量またはＲＮＡエフェクター分子より少ない栄養分の投与量が供給され得る。あるいは、ＲＮＡエフェクター分子での処理の量は栄養供給の量に等しい。
ＲＮＡエフェクター分子処理の頻度は、特定標的遺伝子の「平均パーセント阻害」を維持するように最適化できる。本明細書で使用される、「所望平均パーセント阻害」という用語は、所望作用を生じさせるのに必要であり、かつ望ましくないまたは負の作用を生じさせる阻害の程度よりも低い、経時的な標的遺伝子発現の阻害の平均度合を指す。例えば、Ｂａｘ／Ｂａｋの所望阻害は、典型的にはアポトーシスの低減を生じさせるために＞８０％阻害であり、一方ＬＤＨの所望平均阻害は、高度のＬＤＨ平均阻害（例えば９０％）は細胞生存能を低下させるので、より低くてよい（例えば７０％）。一部の実施形態では、所望平均パーセント阻害は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも ９９％、さらには１００％（すなわち不在）である。当業者は、所望パーセント阻害についての上限（例えば望ましくない作用を生じさせる阻害のレベル）を決定するために通常の細胞死アッセイを使用することができる。当業者はまた、遺伝子調節を生じさせるＲＮＡエフェクター分子の量を決定するために標的遺伝子発現を検出する方法（例えばＰＥＲＴ）が使用できる。Ｚｈａｎｇら、１０２ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１４３８−４７（２００９）参照。阻害の量は動的であり、ＲＮＡエフェクター分子の用量間でわずかに変動し得るので、本明細書ではパーセント阻害を経時的な平均値として述べる。
本明細書で述べる方法の一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を培養細胞の培地に添加する。本明細書で述べる方法は、任意の大きさの細胞培養フラスコ及び／またはバイオリアクターに適用できる。例えば、該方法は、１Ｌ、３Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、４０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、２０００Ｌ、３０００Ｌ、４０００Ｌ、５０００Ｌまたはそれ以上のバイオリアクターまたは細胞培養物において適用できる。一部の実施形態では、細胞培養物の大きさは、０．０１Ｌ〜５０００Ｌ、０．１Ｌ〜５０００Ｌ、１Ｌ〜５０００Ｌ、５Ｌ〜５０００Ｌ、４０Ｌ〜５０００Ｌ、１００Ｌ〜５０００Ｌ、５００Ｌ〜５０００Ｌ、１０００Ｌ〜５０００Ｌ、２０００Ｌ〜５０００Ｌ、３０００Ｌ〜５０００Ｌ、４０００Ｌ〜５０００Ｌ、４５００Ｌ〜５０００Ｌ、０．０１Ｌ〜１０００Ｌ、０．０１Ｌ〜５００Ｌ、０．０１Ｌ〜１００Ｌ、０．０１Ｌ〜４０Ｌ、１５Ｌ〜２０００Ｌ、４０Ｌ〜１０００Ｌ、１００Ｌ〜５００Ｌ、２００Ｌ〜４００Ｌまたはそれらの間の任意の整数にわたり得る。
ＲＮＡエフェクター分子は、誘導期、定常期、初期対数期、中間対数期、後期対数期、指数期または死滅期を含むがこれらに限定されない、細胞増殖の任意の期の間に添加できる。細胞が死滅期に入る前に細胞をＲＮＡエフェクター分子と接触させることが好ましい。アポトーシス経路を標的する場合のような、一部の実施形態では、誘導期、初期対数期、中間対数期または後期対数期などの早期増殖期に細胞を接触させることが望ましいと考えられる（例えばＢａｘ／Ｂａｋ阻害）。他の実施形態では、例えば乳酸塩などの増殖制限生成物が形成される場合（例えばＬＤＨ阻害）、細胞増殖周期の後期（例えば後期対数期または定常期）に標的遺伝子発現を阻害することが望ましいまたは許容されると考えられる。
組成物
宿主細胞中の標的遺伝子の発現を調節することによって細胞培養物における免疫原性作用物質の産生を増強するための組成物も提供される。
一つの実施形態では、本発明は、本明細書で述べるＲＮＡエフェクター分子及び許容される担体を含有する組成物を提供する。ＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物は、細胞における標的遺伝子の発現または活性を調節することによって細胞による免疫原性作用物質の産生を増強するために有用である。そのような組成物は、送達の方法に基づいて製剤される。免疫原性作用物質の産生を改善するうえで有用な例示的ＲＮＡエフェクター分子が本明細書で提供される。一つの実施形態では、組成物中のＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡである。あるいは、組成物中のＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡではない。
本発明のＲＮＡエフェクター分子組成物は、水性、非水性または混合媒質中の懸濁液として製剤でき、また、例えば本明細書で述べるような、脂質または非脂質製剤中に製剤できる（例えば、本明細書の以下の表題の章参照：リガンド、脂質／オリゴヌクレオチド複合体、乳剤、界面活性剤、透過促進剤及び付加的な担体）。
一つの実施形態では、組成物は、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子及びＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬、例えば乳剤、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、荷電脂質、リポソーム、アニオン性脂質、透過促進剤、トランスフェクション試薬または結合のためのＲＮＡエフェクター分子への修飾物、例えばリガンド、標的部分、ペプチド、親油基等を含有する。
一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子組成物は、脂質Ｎｏ．２００としても知られる「脂質Ｈ」、脂質Ｎｏ．２０１またはＫ８としても知られる「脂質Ｋ」、脂質Ｎｏ．２０２またはＬ８としても知られる「脂質Ｌ」、脂質Ｎｏ．２０３としても知られる「脂質Ｍ」、脂質Ｎｏ．２０４またはＰ８としても知られる「脂質Ｐ」または脂質Ｎｏ．２０５としても知られる「脂質Ｒ」を含む、ＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬を含有し、前記脂質の式は以下のように示される：
Figure 2014501489
 別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物は、例えば宿主細胞の増殖に適した、増殖培地をさらに含有する。一つの実施形態では、増殖培地は、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）ＰＯＷＥＲＣＨＯ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＹＣＬＯＮＥ ＰＦ ＣＨＯ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＣＤ ＤＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｍｅｄｉｕｍ Ｍ１９９（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＯＰＴＩＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）等のような化学的組成の明らかな培地である。ＲＮＡエフェクターは、理想的には、再溶解されたとき、最適な製剤を提供する濃度で存在する。
さらに別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子組成物は、増殖培地添加物、例えば必須アミノ酸（例えばグルタミン）、２−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脂質濃縮物、コレステロール、カタラーゼ、インスリン、ヒトトランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、ビオチン、ＤＬ α−トコフェロールアセテート、ＤＬ α−トコフェロール、ビタミン類（例えばビタミンＡ（アセテート）、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ニコチンアミド、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ｉ−イノシトール）、コルチコステロン、Ｄ−ガラクトース、エタノールアミンＨＣｌ、グルタチオン（還元型）、Ｌ−カルニチンＨＣｌ、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン２ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、Ｔ３（トリヨード−Ｉ−チロニン）、増殖因子（例えばＥＧＦ）、鉄、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ヒポキサンチンナトリウム、アミノプテリン及びチミジン、アラキドン酸、エチルアルコール１００％、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、プルロニックＦ−６８（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ステアリン酸１０、ＴＷＥＥＮ ８０（登録商標）非イオン性界面活性剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ピルビン酸ナトリウム及びグルコースから成る群より選択される物質を含有する。
ＲＮＡエフェクター分子組成物は、滅菌溶液中でまたは凍結乾燥されて提供され得る。一つの実施形態では、組成物は、例えば様々な投与頻度及び用量、例えば本明細書で述べる頻度及び用量での投与に適したＲＮＡエフェクター分子を供給するために、濃度及び／または容量別に個別単位で包装される。
一つの実施形態では、組成物は、本明細書で述べる投与レジメンに従った、例えば６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間またはそれ以上の頻度での、細胞への投与用に製剤される。あるいは、組成物は持続注入用の用量で製剤される。
別々の標的遺伝子に対する２またはそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物も提供される。組成物は、培養細胞中の第一標的遺伝子及び少なくとも第二標的遺伝子の発現を調節することによって細胞培養物における免疫原性作用物質の産生を増強するために使用できる。別の実施形態では、同じ標的遺伝子に対する２またはそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物が提供される。
脂質／オリゴヌクレオチド複合体
一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、本明細書で述べる荷電脂質、乳剤、リポソーム、カチオン性または非カチオン性脂質、アニオン性脂質、トランスフェクション試薬または透過促進剤を含む。一つの実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、２００９年１２月７日出願の米国仮特許出願第６１／２６７，４１９号に記載されている荷電脂質を含む。
本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内に封入され得るかまたはリポソームとの複合体、特にカチオン性リポソームとの複合体を形成し得る。あるいは、ＲＮＡエフェクター分子は、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成し得る。適切な脂肪酸及びエステルは、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはＣ１〜２０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたはそれらの許容される塩を含むが、これらに限定されない。
一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は脂質製剤中に完全に封入される（例えばＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰまたは他の核酸−脂質粒子を形成するように）。「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定な核酸−脂質粒子：ＲＮＡエフェクター分子またはＲＮＡエフェクター分子がそこから転写されるプラスミドなどの核酸を含有する、水分量の低い内部を被覆する脂質の小胞を指す。ＳＮＡＬＰは、例えば米国特許出願公開第２００６／０２４００９３号、同第２００７／０１３５３７２号、同第２００９／０２９１１３１号、米国特許出願第１２／３４３，３４２号、同第１２／４２４，３６７号に記載されている。「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内に封入されたプラスミドＤＮＡを含有する核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を防ぐ脂質（例えばＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＰＬＰは「ｐＳＰＬＰ」を包含し、ｐＳＰＬＰは、国際公開広報第ＷＯ００／０３６８３号に示されている封入された縮合剤−核酸複合体を含む。この実施形態の粒子は、典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、または約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、または約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、または典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍ（両端を含む）の平均直径を有し、実質的に非毒性である。加えて、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する場合の核酸は、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性である。核酸−脂質粒子及びそれらの作製方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号、同第５，９８１，５０１号、同第６，５３４，４８４号、同第６，５８６，４１０号、同第６，８１５，４３２号、及び国際公開広報第ＷＯ９６／４０９６４号に報告されている。
脂質対薬剤の比率（質量／質量比）（例えば脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１または約６：１〜約９：１（両端を含む）の範囲内であり得る。
製剤のカチオン性脂質は、４〜１５のｐＫａを有する少なくとも一つのプロトン化可能な基を含有し得る。カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン、またはそれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％〜約７０モル％（両端を含む）、または約４０モル％〜約６０モル％（両端を含む）を構成し得る。一つの実施形態では、カチオン性脂質はリガンドにさらに結合できる。
非カチオン性脂質は、アニオン性脂質または中性脂質、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物であり得る。非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％（両端を含む）、またはコレステロールが含まれる場合は、約１０モル％〜約５８モル％（両端を含む）であり得る。
粒子の凝集を阻害する脂質は、例えば、以下に限定しないが、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）またはそれらの混合物を含むポリエチレングリコール−脂質であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リピドであり得る。粒子の凝集を防ぐ脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％〜約２０モル％または約２モル％であり得る。一つの実施形態では、ＰＥＧ脂質はリガンドにさらに結合できる。
一部の実施形態では、核酸−脂質粒子は、例えば粒子中に存在する総脂質の約１０モル％〜約６０モル％（両端を含む）または約４８モル％の、コレステロールなどのステロイドをさらに含む。
一つの実施形態では、脂質粒子は、ステロイド、ＰＥＧ脂質及び式（Ｉ）：
Figure 2014501489
 ［式中、各々のＸａ及びＸｂは、存在する各々の場合に、独立してＣ１〜６アルキレンであり、
ｎは０、１、２、３、４または５であり、各々のＲは、独立してＨ、
Figure 2014501489
 ［式中、ｍは０、１、２、３または４であり；Ｙは、存在しないか、Ｏ、ＮＲ２またはＳであり、Ｒ１は、各々が場合により１またはそれ以上の置換基で置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルである］
であり；及びＲ２は、Ｈ、各々が場合により１またはそれ以上の置換基で置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルである］
のカチオン性脂質を含有する。
一例では、脂質ＲＮＡエフェクター分子ナノ粒子（例えばＬＮＰ０１粒子）を作製するためにリピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（分子量１４８７）（式２）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）が使用できる。エタノール中の各々の保存溶液は以下のように調製できる：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍＬ、コレステロール、２５ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍＬ。ＮＤ９８、コレステロール及びＰＥＧ−セラミドＣ１６保存溶液を、次に、例えば４２：４８：１０のモル比で合わせることができる。合わせた脂質溶液を、最終エタノール濃度が約３５％〜４５％及び最終酢酸ナトリウム濃度が約１００ｍＭ〜３００ｍＭ（両端を含む）になるように水性ＲＮＡエフェクター分子と混合し得る（例えばｐＨ５の酢酸ナトリウム中で）。脂質ＲＮＡエフェクター分子ナノ粒子は、典型的には混合時に自発的に形成される。所望粒子径分布に依存して、生じたナノ粒子混合物を、例えばＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用してポリカーボネート膜（例えば１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。一部の場合は、押出工程を省くことができる。エタノール除去及び同時緩衝液交換は、例えば透析または接線流ろ過によって達成し得る。緩衝液は、例えば約ｐＨ７、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と交換できる。
Figure 2014501489
 ＬＮＰ０１製剤は、例えば国際公開広報第ＷＯ２００８／０４２９７３号に記載されている。
一つの実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、２００９年１２月７日出願の米国仮特許出願第６１／２６７，４１９号及び２０１０年５月１３日出願の米国仮特許出願第６１／３３４，３９８号に記載されているような荷電した脂質を含む。様々な実施形態において、本明細書で述べるＲＮＡエフェクター分子組成物は、「脂質Ｈ」、「脂質Ｋ」、「脂質Ｌ」、「脂質Ｍ」、「脂質Ｐ」または「脂質Ｒ」から成る群より選択されるカチオン性脂質を含有し、前記脂質の式は以下のように示される：
Figure 2014501489
Figure 2014501489
 別の実施形態では、本明細書で述べるＲＮＡエフェクター分子組成物は、脂質Ｈ、脂質Ｋ、脂質Ｌ、脂質Ｍ、脂質Ｐ及び脂質Ｒから成る群より選択される脂質を含む脂質製剤をさらに含有し、中性脂質及びステロールをさらに含有する。特定の実施形態では、脂質製剤は約２５モル％〜１００モル％の脂質を含む。別の実施形態では、脂質製剤は約０モル％〜５０モル％のコレステロールを含む。さらに別の実施形態では、脂質製剤は３０モル％〜６５モル％の中性脂質を含む。特定の実施形態では、脂質製剤は、以下のように表２０に列挙される相対モル％の成分を含有する：
Figure 2014501489
 さらなる例示的な脂質−ｓｉＲＮＡ製剤は、下記のように、表６９に示されているとおりである。
Figure 2014501489
Figure 2014501489
ＬＮＰ０９製剤及びＸＴＣ含有製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年９月３日出願の米国仮特許出願第６１／２３９，６８６号に記載されている。ＬＮＰ１１製剤及びＭＣ３含有製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年９月２２日出願の米国仮特許出願第６１／２４４，８３４号に記載されている。ＬＮＰ１２製剤及びＴｅｃｈＧ１含有製剤は、例えば、２００９年５月５日出願の米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号に記載されている。
標準法または押出フリー法のいずれかによって調製される製剤を同様の方法で特徴付けることができる。例えば、典型的には目視検査によって製剤を特徴付ける。それらは、凝集体または沈降物を含まない白っぽい透明な溶液であるはずである。脂質−ナノ粒子の粒径及び粒径分布は、例えばＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）を用いて光散乱によって測定できる。粒子は約２０〜３００ｎｍ、例えば４０〜１００ｎｍの大きさであるはずである。粒径分布は単峰型であるはずである。製剤ならびに取り込まれた画分中の総ｄｓＲＮＡエフェクター分子濃度は、色素排除アッセイを用いて推定される。製剤されたＲＮＡエフェクター分子の試料を、製剤破壊界面活性剤、例えば０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在下または不在下でＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合色素と共にインキュベートすることができる。製剤中の総ＲＮＡエフェクター分子は、標準曲線と比較した、界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定できる。取り込まれた画分は、総ＲＮＡエフェクター分子含量から「遊離」ＲＮＡエフェクター分子含量（界面活性剤の不在下でのシグナルによって測定される）を差し引くことによって決定される。取り込まれるＲＮＡエフェクター分子のパーセントは、典型的には＞８５％である。脂質ナノ粒子製剤に関して、粒径は少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍまたは少なくとも１２０ｎｍである。適切な範囲は、典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍ（両端を含む）である。
リポソームは、親油性物質から形成される膜と水性内部を有する単層または多重層の小胞である。水性部分は送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、効率的に細胞壁と融合することはできないが、インビボでマクロファージによって取り込まれる。無傷細胞膜を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、各々が直径５０ｎｍ未満の一連の微細孔を通り抜けなければならない。従って、高度に変形可能であり、そのような微細孔を通過できるリポソームを使用することが望ましい。
リポソームのさらなる利点は、天然リン脂質から得られるリポソームは生体適合性及び生分解性であること；リポソームは広範囲の水溶性及び脂溶性薬剤を組み込み得ること；ならびにリポソームは、その内部区画内に封入された薬剤を代謝及び分解から保護し得ることを含む。例えば、Ｗａｎｇら、ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ＆ＡＰＰＬ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２００５）；Ｒｏｓｏｆｆ，１９８８参照。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な点は、脂質表面の電荷、小胞の大きさ及びリポソームの水分容量である。
リポソームは、作用部位への有効成分の輸送及び送達のために有用である。リポソーム膜は構造的に生体膜に類似するので、リポソームを組織に適用した場合、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞の融合が進行すると共に、リポソームの内容物が細胞内に流入して、そこで活性物質が作用し得る。リポソーム製剤は多くの薬剤のための送達方法として広範な研究の中心となってきた。局所投与に関して、リポソームが他の製剤に比べていくつかの利点を示すことの証拠が増えつつある。かかる利点は、投与された薬剤の高い全身吸収に関連する副作用の低減、所望標的における投与薬剤の蓄積の増大、ならびに親水性及び疎水性の両方の多種多様な薬剤を皮膚内に投与できることを含む。
リポソームは２つの大きなクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電したポリヌクレオチド分子と相互作用して安定な複合体を形成する、正に荷電したリポソームである。正に荷電したポリヌクレオチド／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム内にインターナライズされる。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂して、その内容物を細胞質中に放出する。Ｗａｎｇら、１４７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９８０−８５（１９８７）。
ｐＨ感受性であるかまたは負に荷電したリポソームは、ポリヌクレオチドと複合体を形成するのではなくポリヌクレオチドを取り込む。ポリヌクレオチドと脂質の両方が同様に荷電しているので、複合体形成ではなく斥力が生じる。それにもかかわらず、一部のポリヌクレオチドはこれらのリポソームの水性内部に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養下の細胞単層に送達するために使用されてきた。外因性遺伝子の発現が標的細胞において検出された。Ｚｈｏｕら、１９ Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．２６９−７４（１９９２）。
リポソーム組成物の主要なタイプの一つは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成できる。アニオン性リポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性の膜融合性リポソームは主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えばダイズＰＣ及び卵ＰＣなどから形成される。別のタイプは、リン脂質及び／またはホスファチジルコリン及び／またはコレステロールの混合物から形成される。
リポソームはまた、「立体的に安定化された」リポソームを含み、この用語は、本明細書で使用される場合、リポソームに組み込まれたとき、そのような特殊な脂質を欠くリポソームと比較して長い循環寿命を生じさせる１またはそれ以上の特殊な脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１のような１もしくはそれ以上の糖脂質を含む、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような１またはそれ以上の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧで誘導体化された脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームに関しては、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の延長は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取込みの減少に由来すると当技術分野では考えられている。Ａｌｌｅｎら、２２３ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２（１９８７）；Ｗｕら、５３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３７６５（１９９３）。
１またはそれ以上の糖脂質を含有する様々なリポソームが当技術分野において公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（５０７ Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６４（１９８７））は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を改善する能力を報告した。これらの所見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（８５ ＰＮＡＳ ６９４９（１９８８））によって詳しく説明された。いずれもＡｌｌｅｎらへの米国特許第４，８３７，０２８号及び国際公開広報第ＷＯ８８／０４９２４号は、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開広報第ＷＯ９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）に開示されている。
１またはそれ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム及びその調製法が当技術分野において公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（５３ Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．２７７８（１９８０））は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性界面活性剤２Ｃ１２１５Ｇを含有するリポソームを記述した。Ｉｌｌｕｍら（１６７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．７９（１９８４））は、高分子グリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングが血中半減期の有意の延長を生じさせることを指摘した。ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）のカルボキシル基の結合によって修飾された合成リン脂質がＳｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号及び同第４，５３４，８９９号）によって記述されている。加えて、ポリアルキレンで誘導体化されたリポソームに抗体を結合することができる（例えば、米国特許出願公開第２００８／００１４２５５号参照）。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（２６８ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２３５（１９９０））は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが血液循環半減期の有意の延長を有することを実証する実験を記述した。Ｂｌｕｍｅら（１０２９ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０２９，（１９９０））は、そのような所見を他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組合せから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧに拡大適用した。外表面上にＰＥＧ部分が共有結合しているリポソームが欧州特許第０４４５１３１Ｂ１号及びＦｉｓｈｅｒへの国際公開広報第ＷＯ９０／０４３８４号に記載されている。
１〜２０モル％のＰＥＧで誘導体化されたＰＥを含有するリポソーム組成物及びその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号及び同第５，３５６，６３３号）ならびにＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号及び欧州特許第０４９６８１３Ｂ１号）によって記述されている。多くの他の脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームが、国際公開広報第ＷＯ９１／０５５４５号及び米国特許第５，２２５，２１２号及び国際公開広報第ＷＯ９４／２００７３号に開示されている。ＰＥＧ修飾されたセラミド脂質を含むリポソームは、国際公開広報第ＷＯ９６／１０３９１号に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号及び同第５，５５６，９４８号は、表面上の官能基部分でさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームを記述する。ＰＥＧを含むリポソームに関する方法及び組成物は、例えば米国特許第６，０４９，０９４号、同第６，２２４，９０３号、同第６，２７０，８０６号、同第６，４７１，３２６号、同第６，９５８，２４１号に認められる。
上述したように、リポソームは、場合により、抗体または抗体フラグメント、細胞表面受容体と相互作用するための小さなエフェクター分子、抗原及び他の同様の化合物などの表面基を含むように作製することができ、これらの基は特定の細胞集団へのリポソーム及びその内容物の送達を促進し得る。標的分子で誘導体化された脂質またはあらかじめ形成されたリポソーム中の標的分子で誘導体化され得る極性頭部化学基を有する脂質をリポソーム脂質に含めることにより、そのようなリガンドをリポソームに含めることができる。あるいは、あらかじめ形成されたリポソームをリガンド−ポリマー−脂質コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、標的部分をあらかじめ形成されたリポソームに挿入できる。
脂質は、リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン類（例えばリボフラビン）及びモノクロナール抗体などの様々な標的部分を用いて、リガンドを親水性ポリマー鎖の遊離遠位端に共有結合し、それを近位端で小胞形成脂質に結合することによって誘導体化できる。選択した親水性ポリマーを選択した脂質に結合し、選択したリガンドとの反応のためにポリマーの遊離非結合末端を活性化するための多種多様な技術が存在し、上述したように、親水性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は広く検討されてきた。Ａｌｌｅｎら、１２３７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９９−１０８（１９９５）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，４ Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２９６−９９（１９９３）、Ｚａｌｉｐｓｋｙら、３５３ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１−７４（１９９４）、Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．７０５−０８（１９９５）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｉｎ ＳＴＥＡＬＴＨ ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ（Ｌａｓｉｃ＆Ｍａｒｔｉｎ，ｅｄｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９５）。
高分子量核酸をリポソームに封入するための方法のような、核酸を含有する多くのリポソームが当技術分野において公知である。国際公開広報第ＷＯ９６／４００６２号。Ｔａｇａｗａらへの米国特許第５，２６４，２２１号はタンパク質結合リポソームを開示し、そのようなリポソームの内容物はｄｓＲＮＡを含み得ると主張している。米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに封入する特定の方法を記述する。国際公開広報第ＷＯ９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームに言及している。加えて、核酸を含有するリポソーム組成物を作製するための方法は、例えば、米国特許第６，０１１，０２０号、同第６，０７４，６６７号、同第６，１１０，４９０号、同第６，１４７，２０４号、同第６，２７１，２０６号、同第６，３１２，９５６号、同第６，４６５，１８８号、同第６，５０６，５６４号、同第６，７５０，０１６号、同第７，１１２，３３７号に見出される。
トランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）はさらに別のタイプのリポソームであり、薬剤送達ビヒクルの魅力的な候補物である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、高度に変形可能な脂質小滴であるため該小滴よりも小さい細孔を容易に通り抜けることができる脂質小滴と表すことができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応性であり、例えばそれらは自己最適化性であり、自己修復性であり、しばしば分断されることなく標的に到達し、そしてしばしば自己充填性である。トランスファーソームを作製するために、標準的なリポソーム組成物に表面端活性化剤、通常は界面活性剤を添加することが可能である。
封入されたナノ粒子もＲＮＡエフェクター分子の送達に使用できる。そのような封入ナノ粒子の例は、酵母細胞壁粒子（ＹＣＷＰ）を用いて作製されるものを含む。例えば、グルカンが封入されたｓｉＲＮＡ粒子（ＧｅＲＰ）は、酵母細胞壁粒子（ＹＣＷＰ）外部及び多層ナノ粒子内部から作られるペイロード送達系であり、該多層ナノ粒子内部は、捕捉剤と複合体形成したペイロードを含むコアを有する。２００８年１０月２９日出願の米国特許出願第１２／２６０，９９８号に記載されているもののような、グルカン封入送達システムは、インビトロ及びインビボでサイレンシングを達成するためにｓｉＲＮＡ二本鎖を送達するのに使用できる。
乳剤
本発明の組成物は、乳剤として調製し、製剤することができる。乳剤は、典型的には一方の液体が通常は直径０．１μｍを超える小滴の形態で他方の中に分散している不均一系である。例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．（８ｔｈ ｅｄ．Ａｌｌｅｎら、ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＮＹ，２００４）、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ １ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ １９９（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ １ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ２４５（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）、Ｂｌｏｃｋ ｉｎ ２ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ３３５（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）、Ｈｉｇｕｃｈｉら、ｉｎ ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．３０１（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５）参照。乳剤は、しばしば、互いに十分に混合され、分散された２つの非混和性の液相を含む二相系である。
一般に、乳剤は油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水相が大量の油相中に微細に分割され、細かい小滴として分散される場合、生じる組成物は油中水型（ｗ／ｏ）乳剤と呼ばれる。あるいは、油相が大量の水相中に微細に分割され、細かい小滴として分散される場合、生じる組成物は水中油型（ｏ／ｗ）乳剤と呼ばれる。乳剤は、分散相に加えて、付加的な成分及び、水相、油相中またはそれ自体が分離した相としての溶液として存在し得る活性薬剤を含有し得る。乳化剤、安定剤、染料及び酸化防止剤などの医薬賦形剤も、必要に応じて乳剤中に存在し得る。医薬乳剤はまた、例えば油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）乳剤及び水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）乳剤の場合のような、３以上の相で構成される多相乳剤であり得る。そのような複雑な製剤は、単純な２成分の乳剤にはない特定の利点をしばしば提供する。ｏ／ｗ型乳剤の個々の油滴が小さな水滴を囲む多相乳剤は、ｗ／ｏ／ｗ型乳剤を構成する。同様に油性連続相中に安定化された水の小球に囲まれた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏ型乳剤を提供する。
乳剤は、熱力学的安定性がほとんどまたは全くないことを特徴とする。多くの場合、乳剤の分散相または不連続相は、外相または連続相中に十分に分散しており、乳化剤の使用または製剤の粘性を介してこの形態に維持される。乳剤型の軟膏基剤及びクリームの場合のように、乳剤の相のいずれかは半固体または固体であり得る。乳剤を安定化する他の手段は、乳剤のいずれかの相に組み込むことができる乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、大きく４つのカテゴリー：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤及び微細分散固体に分類できる。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．，２００４、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ，１９８８参照。
表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、乳剤の製剤において広い適用性が認められており、文献で総説されている。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．，２００４、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ，１９８８、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ，１９８８参照。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性と疎水性の比率は親水／親油バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製において界面活性剤を分類し、選択するうえで有益なツールである。界面活性剤は、親水基の性質に基づいて種々のクラス：非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類できる。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．，２００４、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ，１９８８、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ，１９８８参照。
乳剤製剤において使用される天然の乳化剤は、ラノリン、蜜ろう、ホスファチド、レシチン及びアラビアゴムを含む。無水ラノリン及び親水ワセリンなどの吸収基剤は、水分を吸収してｗ／ｏ型乳剤を形成し、それでもなおそれらの半固体粘稠度を維持できるように親水性特性を有する。微粉固体も、特に界面活性剤と組み合わせて及び粘性製剤において、良好な乳化剤として使用されてきた。これらは、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸マグネシウムアルミニウムなどの非膨潤性粘土、色素ならびに炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固体を含む。
乳化作用のない種々様々な物質も乳剤製剤中に含まれ、乳剤の特性に寄与する。これらは、脂肪、油、ろう、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水コロイド、防腐剤及び酸化防止剤を含む。Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ １ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ３３５（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ（１９８８）。
親水コロイドまたはハイドロコロイドは、天然に存在するゴム及び合成ポリマー、例えば多糖類（例えばアラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤゴム及びトラガント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）ならびに合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル及びカルボキシビニルポリマー）を含む。これらは水中で分散または膨張し、分散相の小滴の周囲に丈夫な界面膜を形成すること及び外相の粘性を高めることによって乳剤を安定化するコロイド溶液を形成する。
乳剤はしばしば、微生物の増殖を容易に促進し得る炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドなどの多くの成分を含有するので、これらの製剤には防腐剤が組み込まれることが多い。乳剤製剤に含められる一般的に使用される防腐剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル及びホウ酸を含む。酸化防止剤も、製剤の劣化を防ぐために乳剤製剤に一般的に添加される。使用される酸化防止剤は、フリーラジカル捕捉剤、例えばトコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなど、または還元剤、例えばアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなど、ならびに酸化防止相乗剤、例えばクエン酸、酒石酸及びレシチンなどであり得る。
一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子及び核酸の組成物はマイクロエマルジョンとして製剤される。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定な溶液である、水、油及び両親媒性物質の系と定義され得る。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．（８ｔｈ ｅｄ．，Ａｌｌｅｎら、ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＮＹ，２００４）、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ，１９８８参照。典型的には、マイクロエマルジョンは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散させ、次に十分な量の第四成分、一般には中鎖長アルコールを添加して透明な系を形成することによって調製される系である。従って、マイクロエマルジョンはまた、表面活性分子の界面膜によって安定化された２つの非混和性液体の、熱力学的に安定で等方的に透明な分散液とも表されてきた。Ｌｅｕｎｇ＆Ｓｈａｈ，ｉｎ ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ ＲＥＬＥＡＳＥ ＤＲＵＧＳ：ＰＯＬＹＭＥＲＳ＆ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ ＳＹＳ．１８５−２１５（Ｒｏｓｏｆｆ，ｅｄ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８９）。マイクロエマルジョンは一般に、油、水、界面活性剤、共界面活性剤及び電解質を含む３〜５の成分の組合せによって調製される。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）であるか水中油型（ｏ／ｗ）であるかは、使用される油及び界面活性剤の性質ならびに界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的充填に依存する。Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．２７１（１９８５）。
状態図を利用する現象学的アプローチが広汎に検討されており、マイクロエマルジョンを製剤する方法についての包括的な知識が当業者にもたらされている。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．（８ｔｈ ｅｄ．，Ａｌｌｅｎら、ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＮＹ，２００４）、Ｒｏｓｏｆｆ，１９８８、Ｂｌｏｃｋ，１９８８参照。従来の乳剤と比較して、マイクロエマルジョンは、自然に形成される熱力学的に安定な小滴の製剤中に水不溶性の薬剤を可溶化するという利点を提供する。
マイクロエマルジョンは、本明細書でさらに論じる界面活性剤、例えば、限定されることなく、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）などを、単独でまたは共界面活性剤と組み合わせて含み得る。通常は、エタノール、１−プロパノール及び１−ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤の界面膜に浸透し、その結果として界面活性剤分子の間に生じた空隙による不規則な膜を作り出すことによって界面の流動性を高める役割を果たす。マイクロエマルジョンは、しかしながら、共界面活性剤を使用せずに調製され得、アルコール不含の自己乳化型マイクロエマルジョン系が当技術分野において公知である。水相は、典型的には水、薬剤の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール及びエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相は、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油を含み得るが、これらに限定されない。
マイクロエマルジョンは、より良好な薬剤の可溶化、酵素加水分解からの薬剤の保護、界面活性剤が誘導する膜の流動性及び透過性の変化による薬剤吸収の増大の可能性、調製の容易さ、ならびに低い毒性という利点を提供する。例えば、米国特許第６，１９１，１０５号、同第７，０６３，８６０号、同第７，０７０，８０２号、同第７，１５７，０９９号、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、１１ Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３８５（１９９４）、Ｈｏら、８５ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１３８−４３（１９９６）参照。多くの場合、マイクロエマルジョンはその成分を周囲温度で組み合わせた場合に自然に形成され得る。このことは、熱不安定薬剤、ペプチドまたはＲＮＡエフェクター分子を製剤する場合に特に有利であり得る。
本発明のマイクロエマルジョンはまた、製剤の性質を改善し、本発明のＲＮＡエフェクター分子及び核酸の吸収を高めるために、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ及び浸透促進剤などの付加的な成分及び添加剤も含み得る。本発明のマイクロエマルジョンにおいて使用される浸透促進剤は、５つの広いカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤及び非キレート化非界面活性剤の一つに属すると分類され得る。Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９２（１９９１）。
マイクロエマルジョン以外にも薬剤の製剤のために検討され、使用されてきた多くの組織化された界面活性剤構造体が存在する。これらは、単層、ミセル、二重層及び小胞を含む。リポソームなどの小胞は、薬剤送達の見地から、それらが提供する特異性及び作用持続時間のゆえに大きな関心を集めてきた。本発明において使用される、「リポソーム」という用語は、球状の１またはそれ以上の二重層中に配置された両親媒性脂質から成る小胞を意味する。
界面活性剤
一部の実施形態では、本発明を特徴付けるＲＮＡエフェクター分子は、１またはそれ以上の浸透促進剤、界面活性剤及び／またはキレート剤と共に投与される。適切な界面活性剤は、脂肪酸及び／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸及び／またはその塩を含む。適切な胆汁酸／塩は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムを含む。適切な脂肪酸は、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはモノグリセリド、ジグリセリドまたはそれらの医薬的に許容される塩（例えばナトリウム塩）を含む。一部の実施形態では、浸透促進剤の組合せ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。一つの例示的な組合せは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。
界面活性剤は、乳剤（マイクロエマルジョンを含む）及びリポソームなどの製剤において広く適用される。天然及び合成の両方の多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類し、ランクづける最も一般的な方法は、親水／親油バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水基（「頭部」としても知られる）の性質は、製剤に使用される種々の界面活性剤を分類するために最も有用な手段を提供する。例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，ＳＵＲＦＡＣＴＡＮＴＳ＆ＰＯＬＹＭＥＲＳ ＩＮ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．（Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，ＮＹ，２００２）、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ２８５（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）参照。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、その分子は非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品及び化粧品に広い用途が見出され、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に依存して２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤は、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグルセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル及びエトキシ化エステルなどの非イオン性エステルを含む。非イオン性アルカノールアミド及びエーテル、例えば脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシ化アルコール及びエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなどもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は非イオン性界面活性剤クラスの最も一般的な成員である。
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたとき負電荷を担持する場合、その界面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤は、セッケン、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミドなどのカルボキシレート、硫酸アルキル及びエトキシ化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネートならびにホスフェートを含む。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な成員は硫酸アルキル及びセッケンである。
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたとき正電荷を担持する場合、その界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤は、第四級アンモニウム塩及びエトキシ化アミンを含む。第四級アンモニウム塩はこのクラスの最も広く使用される成員である。界面活性剤分子が正電荷または負電荷のどちらも担持する能力を有する場合、その界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤は、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びホスファチドを含む。
浸透促進剤
一つの実施形態では、本発明は、細胞への核酸、特にＲＮＡエフェクター分子の効率的な送達を生じさせるために様々な浸透促進剤を使用する。大部分の薬剤は、イオン化形態及び非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。通常は、脂溶性または親油性薬剤だけが容易に細胞膜を横断する。横断する細胞膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬剤であっても細胞膜を横断し得ることが発見された。、浸透促進剤はまた、非親油性薬剤が細胞膜を越えて拡散するのを助けることに加えて、親油性薬剤の透過性も上昇させる。
浸透促進剤は、５つの広いカテゴリー：界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤及び非キレート化非界面活性剤の一つに属すると分類され得る。例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，２００２、Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９２（１９９１）参照。
本発明に関連して、浸透促進剤は界面活性剤（または「表面活性剤」）を含み、界面活性剤とは、水溶液中に溶解された場合、溶液の表面張力または水溶液と別の液体との間の界面張力を低下させ、その結果として細胞膜及び他の生物学的障壁を通してのＲＮＡエフェクター分子の吸収を増大させる化学的実体である。胆汁酸塩及び脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，２００２、Ｌｅｅら、１９９１参照）、ならびにＦＣ−４３（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、４０ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２５２（１９８８））などのペルフルオロケミカル乳剤を含む。
浸透促進剤として働く様々な脂肪酸及びそれらの誘導体は、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノグリセリド及びジグリセリド（すなわちオレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエート等）を含む。例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕら、ＥＮＨＡＮＣＥＭＥＮＴ ＩＮ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６）、Ｌｅｅら、１９９１、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，７ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．１−３３（１９９０）、Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉら、４４ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５１−５４（１９９２）参照。
胆汁の生理的役割は、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進を含む。例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，２００２、Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔ．３８ ｉｎ ＧＯＯＤＭＡＮ＆ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，９ＴＨ ＥＤ．９３４−３５（Ｈａｒｄｍａｎら、ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９９６）参照。様々な天然胆汁酸塩及びそれらの合成誘導体は浸透促進剤として働く。従って「胆汁酸塩」という用語は、天然に存在する胆汁の成分の任意のものならびにそれらの合成誘導体の任意のものを包含する。適切な胆汁酸塩は、例えばコール酸（またはその医薬的に許容されるナトリウム塩であるコール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）を含む（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，２００２、Ｌｅｅら、１９９１、Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔ．３９ ｉｎ ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．，１８ｔｈ Ｅｄ．７８２−８３（Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０）、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０、Ｙａｍａｍｏｔｏら、２６３ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５（１９９２）、Ｙａｍａｓｈｉｔａら、７９ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．５７９−８３（１９９０）参照）。
キレート剤は、本発明に関連して使用される場合、金属イオンと複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、その結果として粘膜を介したＲＮＡエフェクター分子の吸収を高める化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、特徴付けられている大部分のＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、従ってキレート剤によって阻害されるので、キレート剤はＤＮアーゼ阻害剤としての役割も果たすという付加的な利点を有する。Ｊａｒｒｅｔｔ，６１８ Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３１５−３９（１９９３）。適切なキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えばサリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート及びホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９ならびにβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｋａｔｄａｒｅら、ＥＸＣＩＰＩＥＮＴ ＤＥＶＥＬ．ＰＨＡＲＭ．ＢＩＯＴＥＣＨ．＆ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６）、Ｌｅｅら、１９９１、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０、Ｂｕｕｒら、１４ Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．４３−５１（１９９０）参照。
本明細書で使用される場合、非キレート化非界面活性剤である浸透促進化合物は、キレート剤としてまたは界面活性剤としては有意ではない活性を示すが、それにもかかわらず消化管粘膜を介したＲＮＡエフェクター分子の吸収を高める化合物と定義され得る。例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０参照。このクラスの浸透促進剤は、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロアルカノン誘導体（Ｌｅｅら、１９９１）ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンなどの非ステロイド系抗炎症薬を含む（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９８７）。
細胞レベルでＲＮＡエフェクター分子の取込みを増強する作用物質も、本発明の医薬組成物及び他の組成物に添加し得る。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号）などのカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリシン（国際公開広報第ＷＯ９７／３０７３１号）などのポリカチオン分子も、ｄｓＲＮＡの細胞内取込みを増強することが公知である。市販のトランスフェクション試薬の例としては、例えば、数ある中でも特に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００（商標）、２９３ＦＥＣＴＩＮ（商標）、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＭＡＸ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００ＣＤ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＲＮＡｉＭＡＸ、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）及びＯＰＴＩＦＥＣＴ（商標）トランスフェクション試薬（各々Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）、ならびにＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（Ａｖａｎｔｅ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）、ＤＯＳＰＥＲリポソームトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）、またはＦｕＧＥＮＥ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ（商標）−２０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ（商標）−５０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＤＲＥＡＭＦＥＣＴ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（登録商標）Ｄ１トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、ＬＹＯＶＥＣ（商標）／ＬＩＰＯＧＥＮ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＮＥＵＲＯＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ ２トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）、ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）、ＢＡＣＵＬＯＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）、ＴＲＯＧＡＮＰＯＲＴＥＲ（商標）トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）、ＲＩＢＯＦＥＣＴ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）、ＰＬＡＳＦＥＣＴ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、ＵＮＩＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、ＳＵＲＥＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、もしくはＨＩＦＥＣＴ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔ’ｌ）が含まれる。
付加的な担体
投与した核酸の浸透を促進するために、エチレングリコール及びプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン、ならびにリモネン及びメントンなどのテルペンを含む他の作用物質を利用し得る。
本発明の特定の組成物はまた、製剤中に担体化合物を組み込む。本明細書で使用される、「担体化合物」または「担体」は、不活性である（すなわちそれ自体は生物学的活性を有さない）が、例えば生物学的に活性な核酸を分解するまたはその除去を促進することにより、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを低下させるインビボプロセスによって核酸として認識される、核酸またはその類似体を表し得る。
本発明の組成物は、他の補助成分を、添加された場合にかかる物質が本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨げない限り、付加的に含有し得る。製剤は、滅菌することができ、所望する場合は、製剤のＲＮＡエフェクター分子と有害な相互作用を生じない補助剤と混合し得る。
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増大させる物質を含み得る。懸濁液はまた、安定剤も含み得る。
そのような化合物の毒性及び治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％を死に至らせる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養物または細胞における標準的な薬学的手順によって測定し得る。毒性作用と治療効果との間の用量比が治療指数であり、治療指数はＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物は特に有用である。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータを、本発明の方法における使用のための用量範囲の策定に使用できる。本発明を特徴付ける組成物の用量は、一般に毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を含む濃度範囲内にある。用量は、使用される剤形及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動し得る。
さらに別の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現が長期間、例えば少なくとも２日間、３日間、４日間またはそれ以上、例えば１週間、２週間、３週間または４週間またはそれ以上にわたって低下するように、本発明を特徴付ける組成物を宿主細胞に投与することによって宿主細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。標的遺伝子の発現低下の作用は、好ましくは、処置前のレベルと比較して、標的遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％または少なくとも６０％またはそれ以上の低下を生じさせる。
ＶＩＩ．キット及びアッセイ
一部の実施形態では、細胞による免疫原性作用物質の産生への１個のＲＮＡエフェクター分子または一連のＲＮＡエフェクター分子の作用を試験するためのキットが提供され、該キットは、免疫原性作用物質の産生を可能にする条件下で細胞を培養するのに適した１またはそれ以上のアッセイ表面を有する支持体を含む。一部の実施形態では、支持体の外側は、アッセイ表面に対応する位置に穴、刻み目、境界等を含む。一部の実施形態では、穴、刻み目、境界等は、アッセイ表面の上に細胞培養培地などの液体を保持する。
一部の実施形態では、支持体上のアッセイ表面は無菌であり、免疫原性作用物質の大規模（例えば工業規模）生産の間の培養条件を代表する条件下で宿主細胞を培養するのに適する。好都合には、本明細書で提供されるキットは、免疫原性作用物質の生産に関して広い範囲の作用物質及び／または条件を試験するための迅速で費用効率が高い手段を提供し、免疫原性作用物質の本格的生産に先立って細胞培養条件を確立することを可能にする。
一部の実施形態では、支持体の１またはそれ以上のアッセイ表面は、アッセイ表面に適切な培地を添加することによってアッセイ表面の周囲のＲＮＡエフェクター分子の所望濃度がもたらされるように、ＲＮＡエフェクター分子などの濃縮試験物質を含有する。一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、アッセイ表面にプリントし得るもしくは染み込ませ得るか、または、適切な量の培地を添加したときエフェクター分子が再構成され得るように、例えば穴内に、凍結乾燥形態で提供され得る。一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、支持体のアッセイ表面に細胞を塗布することによって再構成される。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、対象とする免疫原性作用物質の産生を可能にする条件下で細胞を培養するのに適した細胞培養培地をさらに含む。培地は、すぐに使用できる形態であり得るか、または濃縮され得る（例えば保存溶液として）、凍結乾燥され得るもしくは別の再構成可能な形態で提供され得る。
さらなる実施形態では、本明細書で提供されるキットは、細胞、細胞培養物または組織培養物による免疫原性作用物質の産生を検出するのに適した１またはそれ以上の試薬を含む。さらなる実施形態では、試薬は、所望免疫原性作用物質の生産を示す、最大細胞密度、細胞生存能等のような細胞の特性を検出するのに適する。一部の実施形態では、試薬は、免疫原性作用物質またはその特性、例えば免疫原性作用物質のインビトロまたはインビボでの生物学的活性、均一性または構造などを検出するのに適する。
一部の実施形態では、支持体の１またはそれ以上のアッセイ表面は、細胞によるＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進するための担体をさらに含む。ＲＮＡエフェクター分子のための担体は当技術分野において公知であり、本明細書で説明する。例えば、一部の実施形態では、担体は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの脂質製剤または関連製剤である。そのような担体の製剤の例は本明細書に記載されている。一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、本出願全体にわたって述べる荷電脂質、乳剤、リポソーム、カチオン性または非カチオン性脂質、アニオン性脂質、トランスフェクション試薬または透過促進剤を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、２００９年１２月７日出願の米国仮特許出願第６１／２６７，４１９号に記載されている荷電脂質を含む。
一部の実施形態では、支持体の１またはそれ以上のアッセイ表面は、試験細胞をアッセイ表面に塗布することにより、細胞によるＲＮＡエフェクター分子の取込み及びＲＮＡエフェクター分子によって標的される１またはそれ以上の遺伝子の発現の調節を促進するために有効なＲＮＡエフェクター分子及び担体の濃度がもたらされるように、各々濃縮された形態の、１個のＲＮＡエフェクター分子または一連のＲＮＡエフェクター分子及び担体を含む。
一部の実施形態では、支持体は、３次元（３Ｄ）細胞増殖及び／または細胞による免疫原性作用物質の産生を促進する基材をさらに含む。さらなる実施形態では、基材は、細胞の足場依存性増殖を促進する。本明細書で述べる様々なキットに関する使用に適する基材の材料の非限定的な例は、寒天、アガロース、メチルセルロース、アルギネートヒドロゲル（例えば５％アルギネート＋５％Ｉ型コラーゲン）、キトサン、ハイドロアクティブな親水コロイドポリマーゲル、ポリビニルアルコール−ヒドロゲル（ＰＶＡ−Ｈ）、ポリアクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、コラーゲンビトリゲル、ＰＨＥＭＡ（ポリ（２−ヒドロキシルメタクリレート））ヒドロゲル、ＰＶＰ／ＰＥＯヒドロゲル、ＢＤ ＰＵＲＡＭＡＴＲＩＸ（商標）ヒドロゲル、及び２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）のコポリマーを含む。
一部の実施形態では、支持体は、培養細胞による免疫原性作用物質の産生に関する様々な試験物質、条件及び／またはそれらの組合せの高処理能力の自動検査を可能にする、マイクロアレイプレート、バイオチップ等を含む。例えば、支持体は、アッセイ表面のｍ縦列とｎ横列を有する（例えば穴内に存在する）２次元マイクロアレイプレートまたはバイオチップを含み得、それらは試験物質及び／または条件のｍ×ｎの組合せの検査を可能にする（例えば２４穴、９６穴または３８４穴マイクロアレイプレート上で）。マイクロアレイ支持体は、好ましくは、すべての必要な陽性及び陰性対照が試験物質及び／または条件の検査と並行して実施できるように設計される。
さらなる実施形態では、免疫原性作用物質の生産に影響を及ぼす特定の経路、機能または細胞の特性を調節するように設計されたひと組のＲＮＡエフェクター分子を接種した１またはそれ以上のマイクロアレイ支持体を含むキットが提供される。例えば、一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、細胞による組換えタンパク質産物の発現、折りたたみ、分泌または翻訳後修飾に関与する経路を含む標的遺伝子を対象とする。
さらなる実施形態では、細胞ベースの系における免疫原性物質の生産に関連する特定の問題または問題のクラスに対処するように設計されたひと組のＲＮＡエフェクター分子を接種した１またはそれ以上のマイクロアレイ支持体を含むキットが本明細書で提供される。例えば、一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、潜在もしくは内在性ウイルスによって発現される標的遺伝子、または免疫原性作用物質の生産もしくは精製を阻害するもしくは妨げる、細胞周期進行、細胞代謝もしくはアポトーシスなどの細胞プロセスに関与する標的遺伝子を対象とする。さらなる実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、免疫原性作用物質の活性、均一性、安定性及び／または他の品質を低下させる酵素分解、凝集、ミスフォールディングまたは他のプロセスを媒介する標的遺伝子を対象とする。なおさらなる実施形態では、エフェクター分子は、外因性または偶発的汚染微生物の感染性に影響を及ぼす標的遺伝子を対象とする。一つの実施形態では、免疫原性作用物質は糖タンパク質を含み、ＲＮＡエフェクター分子は、グリコシル化（例えばフコシル化）及び／または宿主細胞による糖タンパク質のタンパク質分解プロセシングに関与する標的遺伝子を対象とする。別の実施形態では、免疫原性作用物質はマルチサブユニット組換えタンパク質であり、ＲＮＡエフェクター分子は、宿主細胞によるタンパク質の折りたたみ及び／または分泌に関与する標的遺伝子を対象とする。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、細胞における免疫原性作用物質の翻訳後修飾、例えばメチオニン酸化、グリコシル化、ジスルフィド結合形成、ピログルタミン酸化及び／またはタンパク質の脱アミド化などに関与する標的遺伝子を対象とする。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、免疫原性作用物質の生産における２またはそれ以上の因子の組合せの選択または最適化を可能にする。例えば、キットは、一連の候補ＲＮＡエフェクター分子の中から１個の適切なＲＮＡエフェクター分子を選択することならびにＲＮＡエフェクター分子の一つの濃度を選択することを可能にし得る。さらなる実施形態では、本明細書で提供されるキットは、第一シリーズの候補ＲＮＡエフェクター分子から第一ＲＮＡエフェクター分子を選択し、第二シリーズの候補ＲＮＡエフェクター分子から第二のＲＮＡエフェクター分子を選択することを可能にする。一部の実施形態では、第一及び／または第二シリーズの候補ＲＮＡエフェクター分子は、共通の標的遺伝子を対象とする。さらなる実施形態では、第一及び／または第二シリーズのＲＮＡエフェクター分子は、２もしくはそれ以上の機能的に関連する標的遺伝子または共通の宿主細胞経路の２もしくはそれ以上の標的遺伝子を対象とする。
別の実施形態では、細胞における免疫原性作用物質の産生を増大させるためのキットは、少なくとも、その一部が少なくとも潜在または内在性ウイルスの第一標的遺伝子に相補的である第一ＲＮＡエフェクター分子、その一部が少なくとも細胞免疫応答の第二標的遺伝子に相補的である第二ＲＮＡエフェクター分子、及び、場合により、その一部が少なくとも細胞プロセスの第三標的遺伝子に相補的である第三ＲＮＡエフェクター分子を含む。例えば、第一標的遺伝子はＥＲＶ ｅｎｖ遺伝子であり、第二標的遺伝子はＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＢ遺伝子であり、及び第三標的遺伝子はＰＴＥＮ、ＢＡＫ１、ＦＮ１またはＬＤＨＡ遺伝子である。キットは、少なくとも、炭素の代謝及び輸送、アポトーシス、ＲＮＡｉの取込み及び／または効率、反応性酸素種の産生、細胞周期の制御、タンパク質の折りたたみ、ピログルタミン酸化タンパク質修飾、デアミダーゼ、グリコシル化、ジスルフィド結合の形成、タンパク質分泌、遺伝子増幅、ウイルス複製、ウイルス感染、ウイルス粒子の放出、ｐＨの制御ならびにタンパク質産生を含むがこれらに限定されない細胞プロセスを標的する付加的なＲＮＡエフェクター分子をさらに含み得る。
さらに別の態様では、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。該方法は、標的遺伝子の発現が、例えば長期間、例えば少なくとも２日間、３日間、４日間またはそれ以上にわたって低下するように、本発明を特徴付ける組成物を細胞に投与することを含む。本発明を特徴付ける方法及び組成物のために有用なＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセシングされた）を特異的に標的する。ＲＮＡエフェクター分子を使用してこれらの標的遺伝子の発現を阻害するための組成物及び方法は、本明細書で述べるように作製し、実施し得る。
本発明は、以下の番号を付したパラグラフのいずれか一つに定義される通りであり得る。
１．大規模宿主細胞培養において免疫原性作用物質を産生させる方法であって、（ａ）宿主細胞を、大規模宿主細胞培養において、少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である）と接触させ；（ｂ）宿主細胞培養物を、前記少なくとも一つの第一の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、発現の調節は、宿主細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる）；（ｃ）免疫原性作用物質を宿主細胞から単離する；ことを含み、前記大規模宿主細胞培養が、少なくとも１リットルの規模であり、及び前記ＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に標的遺伝子の発現が一時的に抑制されるように加えることによって、前記宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる、免疫原性作用物質を産生させる方法。
２．大規模宿主細胞培養において免疫原性作用物質を産生させる方法であって、（ａ）宿主細胞を、大規模宿主細胞培養において、少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である）と接触させ；（ｂ）宿主細胞培養物を、前記少なくとも一つの第一の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、発現の調節は、宿主細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる）；（ｃ）免疫原性作用物質を宿主細胞から単離する；ことを含み、前記ＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に、標的遺伝子の発現が一時的に抑制されるように免疫原性作用物質の産生全体を通じて多数回加えることによって、前記宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる、免疫原性作用物質を産生させる方法。
３．前記宿主細胞を、大規模宿主細胞培養において、複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させ、前記複数のＲＮＡエフェクター分子が、少なくとも一つの標的遺伝子、少なくとも２つの標的遺伝子又は複数の標的遺伝子の発現を調節する、パラグラフ１または２に記載の方法。
４．細胞において免疫原性作用物質を産生させる方法であって、（ａ）宿主細胞を、複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させ（この場合、２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、複数の標的遺伝子の発現を調節する）；（ｂ）前記細胞を、前記複数の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、発現の調節は、宿主細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる）；及び（ｃ）免疫原性作用物質を細胞から単離する；ことを含み、前記複数の標的遺伝子が少なくともＢａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨを含む、免疫原性作用物質を産生させる方法。
５．前記ＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に、標的遺伝子の発現が一時的に抑制されるように加えることによって、前記宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる、パラグラフ４に記載の方法。
６．前記ＲＮＡエフェクター分子又は複数のＲＮＡエフェクター分子が、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、前記ｄｓＲＮＡが、相互に相補的である少なくとも２つの配列を含み並びにセンス鎖が、第一の配列を含み及びアンチセンス鎖が、標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である相補性の領域を含む第二の配列を含み、並びに前記相補性の領域が、１０〜３０個のヌクレオチドの長さである、パラグラフ１〜５に記載の方法。
７．前記接触工程を、前記ＲＮＡエフェクター分子又は複数のＲＮＡエフェクター分子を、前記宿主細胞培養物を保持して免疫原性作用物質を産生させるために使用する培地に連続的に注入することによって行う、パラグラフ１〜６のいずれかに記載の方法。
８．前記発現の調節が発現の抑制であり、及び前記抑制が部分抑制である、パラグラフ１〜７のいずれかに記載の方法。
９．前記部分抑制が、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、及び８５％からなる群から選択される抑制率よりも大きくない、パラグラフ７に記載の方法。
１０．前記接触工程を少なくとも１回繰り返す、パラグラフ１〜６又は８〜９のいずれかに記載の方法。
１１．前記接触工程を、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間及び１０８時間からなる群から選択される頻度で多数回繰り返す、パラグラフ１〜６又は８〜９のいずれかに記載の方法。
１２．前記発現の調節が、発現の抑制であり及び前記接触工程を、免疫原性作用物質の産生全体を通じて標的遺伝子（一つ又は複数）について少なくとも５０％の平均抑制率を維持するために、多数回繰り返すか又は連続的に注入する、パラグラフ１〜１１のいずれか１に記載の方法。
１３．前記平均抑制率が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％からなる群から選択される、パラグラフ１２に記載の方法。
１４．前記ＲＮＡエフェクター分子を、１００ｎＭ未満の濃度で接触させる、パラグラフ１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．前記ＲＮＡエフェクター分子を、２０ｎＭ未満の濃度で接触させる、パラグラフ１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．宿主細胞を、大規模宿主細胞培養において、ＲＮＡエフェクター分子と接触させる前記接触を、免疫原性作用物質の単離又は上清の回収の少なくとも６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１８時間前、少なくとも３６時間前、少なくとも４８時間前、少なくとも６０時間前、少なくとも７２時間前、少なくとも９６時間前又は少なくとも１２０時間前あるいは少なくとも１週間前に行う、パラグラフ１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．前記ＲＮＡエフェクター分子が、脂質製剤に製剤された組成物である、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．前記ＲＮＡエフェクター分子が、非脂質製剤に製剤された組成物である、パラグラフ１〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．前記ＲＮＡエフェクター分子が、ｓｈＲＮＡではない、パラグラフ１〜１８のいずれかに記載の方法。
２０．前記ＲＮＡエフェクター分子が、ｓｉＲＮＡである、パラグラフ１〜１９のいずれかに記載の方法。
２１．前記ＲＮＡエフェクター分子が、化学的に修飾される、パラグラフ１〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．前記ＲＮＡエフェクター分子が、化学的に修飾されない、パラグラフ１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．さらに、細胞密度、培地ｐＨ、酸素濃度、グルコース濃度、乳酸濃度、温度及びタンパク質産生からなる群から選択される少なくとも一つの測定可能パラメータを監視することを含む、パラグラフ１〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．前記複数の異なるＲＮＡエフェクター分子のそれぞれを、同時に又は異なる時間で加える、パラグラフ２〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．前記複数の異なるＲＮＡエフェクター分子のそれぞれを、同じ濃度で又は異なる濃度で加える、パラグラフ２〜２３のいずれかに記載の方法。
２６．前記複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を、同じ頻度で又は異なる頻度で加える、パラグラフ２〜６又は８〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．さらに、前記細胞を、第二の作用物質と接触させることを含む、パラグラフ１〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．前記第二の作用物質が、抗体、増殖因子、アポトーシス阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤及びヒストン脱メチル化剤からなる群から選択される、パラグラフ２７に記載の方法。
２９．前記キナーゼ阻害剤が、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤及びＫ２５２ａからなる群から選択される、パラグラフ２８に記載の方法。
３０．前記ホスファターゼ阻害剤が、バナジン酸ナトリウム及びオカダ酸からなる群から選択される、パラグラフ２８に記載の方法。
３１．前記ヒストン脱メチル化剤が、５−アザシチジンである、パラグラフ２８に記載の方法。
３２．前記免疫原性作用物質がポリペプチドである、パラグラフ１〜３１のいずれかに記載の方法。
３３．前記免疫原性作用物質がウイルスである、パラグラフ１〜３１のいずれかに記載の方法。
３４．前記ウイルスがＰＣＶである、パラグラフ３３に記載の方法。
３５．前記細胞を、ＲＮＡエフェクター分子と、定常期、初期対数期、中期対数期、後期対数期、誘導期及び死滅期からなる群から選択される細胞増殖の期で接触させる、パラグラフ１〜３４のいずれかに記載の方法。
３６．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、二重鎖領域を含む、請パラグラフ１〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、１５〜３０個のヌクレオチドの長さである、パラグラフ１〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、１７〜２８個のヌクレオチドの長さである、パラグラフ１〜３７のいずれかに記載の方法。
３９．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、パラグラフ１〜３８のいずれかに記載の方法。
４０．前記細胞が、植物細胞、真菌細胞、又は動物細胞である、パラグラフ１〜３９のいずれかに記載の方法。
４１．前記細胞が哺乳動物細胞である、パラグラフ１〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、パラグラフ４１に記載の方法。
４３．前記ヒト細胞が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＩＭＲ３２細胞、ＬＡＮ５細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦｌＯＡ細胞、２９３Ｔ細胞及びＳＫ−ＢＲ３細胞からなる群から選択される付着細胞である、パラグラフ４２に記載の方法。
４４．前記ヒト細胞が、ＨｕＶＥＣ細胞、ＨｕＡＳＭＣ細胞、ＨＫＢ−Ｉ１細胞及びｈＭＳＣ細胞からなる群から選択される初代細胞である、パラグラフ４２に記載の方法。
４５．前記ヒト細胞が、Ｕ２９３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲＣ６（登録商標）細胞、ジャーカット細胞、ＨＴ−２９細胞、ＬＮＣａｐ．ＦＧＣ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＡ ＭＢ４５３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＴＨＰ−Ｉ細胞、ＭＣＦ７細胞、ＢｘＰＣ−３細胞、Ｃａｐａｎ−１細胞、ＤＵ１４５細胞及びＰＣ−３細胞からなる群から選択される、パラグラフ４２に記載の方法。
４６．前記哺乳動物細胞が、ＢＨＫ２１細胞、ＢＨＫ（ＴＫ−）細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＥＬ４細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞誘導体、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＥＳ−Ｄ３細胞、Ｈ９ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞及びｍｉＭＣＤ３細胞からなる群から選択される齧歯類動物細胞である、パラグラフ４１に記載の方法。
４７．前記ＣＨＯ細胞誘導体が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸＢ１及びＣＨＯ−ＤＧ４４細胞からなる群から選択される、パラグラフ４６に記載の方法。
４８．前記細胞が、ＰＥＲＣ６細胞、ＨＴ−２９細胞、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＡ ＭＢ４５３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＴＨＰ−１細胞、ｍｉＭＣＤ−３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｃｏｓ−７細胞、ＢｘＰＣ−３細胞、ＤＵ１４５細胞、ジャーカット細胞、ＰＣ−３細胞及びＣａｐａｎ−１細胞からなる群から選択される、パラグラフ４２に記載の方法。
４９．前記細胞が、ＢＨＫ２１、ＢＨＫ（ＴＫ−）、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、Ｕ２９３細胞、ＥＬ４細胞、ＣＨＯ細胞，及びＣＨＯ細胞誘導体からなる群から選択される齧歯類動物細胞である、請求項４１に記載の方法。
５０．前記細胞が、さらに、前記免疫原性作用物質をコードする遺伝子構造物を含む、パラグラフ１〜４９のいずれかに記載の方法。
５１．前記細胞が、さらに、ウイルス受容体をコードする遺伝子構造物を含む、パラグラフ１〜５０のいずれかに記載の方法。
５２．前記標的遺伝子が、タンパク質グリコシル化に影響を及ぼすタンパク質をコードする、パラグラフ１〜５１のいずれかに記載の方法。
５３．前記標的遺伝子が、前記免疫原性作用物質をコードする、パラグラフ１〜５２のいずれかに記載の方法。
５４．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つを、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ及び１００ｎＭからなる群から選択される濃度で加える、パラグラフ１〜５３のいずれかに記載の方法。
５５．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つを、５０分子／細胞、１００分子／細胞、２００分子／細胞、３００分子／細胞、４００分子／細胞、５００分子／細胞、６００分子／細胞、７００分子／細胞、８００分子／細胞、９００分子／細胞、１０００分子／細胞、２０００分子／細胞、又は５０００分子／細胞の量で加える、パラグラフ１〜５３のいずれかに記載の方法。
５６．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つを、０．０１フェムトモル／１０６細胞、０．１フェムトモル／１０６細胞、０．５フェムトモル／１０６細胞、０．７５フェムトモル／１０６細胞、１フェムトモル／１０６細胞、２フェムトモル／１０６細胞、５フェムトモル／１０６細胞、１０フェムトモル／１０６細胞、２０フェムトモル／１０６細胞、３０フェムトモル／１０６細胞、４０フェムトモル／１０６細胞、５０フェムトモル／１０６細胞、６０フェムトモル／１０６細胞、１００フェムトモル／１０６細胞、２００フェムトモル／１０６細胞、３００フェムトモル／１０６細胞、４００フェムトモル／１０６細胞、５００フェムトモル／１０６細胞、７００フェムトモル／１０６細胞、８００フェムトモル／１０６細胞、９００フェムトモル／１０６細胞，及び１ピコモル／１０６細胞からなる群から選択される濃度で加える、パラグラフ１〜５３のいずれかに記載の方法。
５７．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴミア、リボザイム及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ１〜５６のいずれかに記載の方法。
５８．前記方法が、さらに、前記細胞を、炭素の代謝及び輸送、アポトーシス、ＲＮＡｉ取り込み及び／又は効率、活性酸素種産生、細胞周期の調節、タンパク質折りたたみ、タンパク質ピログルタミン酸化、タンパク質脱アミド化、タンパク質グリコシル化、ジスルフィド結合形成、タンパク質分泌、遺伝子増幅、ウイルス複製、ウイルス感染、ウイルス粒子放出、細胞ｐＨの調節、及びタンパク質産生からなる群から選択される細胞プロセスを調節する少なくとも一つの追加のＲＮＡエフェクター分子又は作用物質と接触させることを含む、パラグラフ１〜５７のいずれかに記載の方法。
５９．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸 ３−ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群から選択され、及び前記発現の調節が、細胞内の炭素の代謝又は輸送を調節することによって細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
６０．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）であり及び前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２５４０〜３１５２６０３からなる群から選択される配列を含む、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
６１．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、Ｂｃｌ−Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢｉｍＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｏｏ、Ｍｃｌ−１、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９及びＣＡＳＰ１０からなる群から選択され、及び前記発現の調節が、細胞のアポトーシスを調節することによって細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
６２．前記少なくとも一つの標的遺伝子がＢａｋであり及び前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２４１２〜３１５２４７５からなる群から選択される配列を含む、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
６３．前記少なくとも一つの標的遺伝子がＢａｘであり及び前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２４７６〜３１５２５３９からなる群から選択される配列を含む、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
６４．前記ＲＮＡエフェクター分子が、初期アポトーシスに入る細胞の比率を著しく低下させる、パラグラフ１６又は１７に記載の方法。
６５．前記複数の標的遺伝子が、少なくともＢａｘ及びＢａｋである、パラグラフ３に記載の方法。
６６．前記複数の標的遺伝子が、少なくともＢａｘ、Ｂａｃ及びＬＤＨである、パラグラフ３に記載の方法。
６７．その一部分がＢａｘと相補的である前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２４７６〜３１５２５３９からなる群から選択される配列を含み、その一部分がＢａｋと相補的である前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２４１２〜３１５２４７５からなる群から選択される配列を含む、パラグラフ４、５、６５又は６６のいずれかに記載の方法。
６８．その一部分がＬＤＨと相補的である前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２５４０〜３１５２６０３からなる群から選択される配列を含む、パラグラフ４又は６６に記載の方法。
６９．前記の少なくとも２つの標的遺伝子の発現が調節され及び前記少なくとも２つの標的遺伝子が、Ｂｃｌ−Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ，及びＢｉｍＬからなる群から選択される、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７０．さらに、前記細胞を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）と相補的な配列を含むＲＮＡエフェクター分子と接触させることを含む、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７１．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、Ａｇｏ４、ＨＩＷＩ１、ＨＩＷＩ２、ＨＩＷＩ３、ＨＩＬＩ、インターフェロン受容体、ＡｐｏＥ、Ｅｒｉ１及びマンノース／ＧａｌＮＡｃ受容体からなる群から選択され、及び前記発現の調節が、細胞でのＲＮＡｉ取り込み及び／又は効率を調節することによって細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７２．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＮＡＤ（ｐ）Ｈオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、構成性神経一酸化窒素シンターゼ（ｃｎＮＯＳ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）、１５−リポキシゲナーゼ−１、ＮＡＤＰＨシトクロムｃ２レダクターゼ、ＮＡＰＨシトクロムｃレダクターゼ、ＮＡＤＨシトクロムｂ５レダクターゼ及びシトクロムＰ４５０２Ｅ１からなる群から選択され、及び前記発現の調節が、細胞での活性酸素種の産生を抑制することによって細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７３．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＭｕＬＶタンパク質、ＭＶＭタンパク質、Ｒｅｏ−３タンパク質、ＰＲＶタンパク質及びベシウイルスタンパク質からなる群から選択され；及び前記発現の調節が、細胞のウイルス感染を抑制することによって細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７４．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、キシローストランスフェラーゼである、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７５．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ベシウイルスタンパク質であり、かつ前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２６０４〜３１５２７１３からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの連続する少なくとも１６個のヌクレオチドを有する少なくとも１つの鎖を含む、パラグラフ７３に記載の方法。
７６．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ及びＣＤＫ４からなる群から選択され、及び前記発現の調節が、細胞の細胞周期を調節することによって細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７７．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ４、ＡＴＦ６、ｅＩＦ２α、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、Ｂｉｐ、Ｈｓｐ４０、ＨＳＰ４７、ＨＳＰ６０、Ｈｓｐ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１００、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ、カルレチクリン、カルネキシン、Ｅｒｐ５７及びＢＡＧ−１からなる群から選択され；及び前記発現の調節が、タンパク質の折りたたみを高めることによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７８．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、宿主細胞内のメチオニンスルホキシドレダクターゼ遺伝子であり、及び前記発現の調節が、メチオニン酸化によるタンパク質の修飾を抑制することによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７９．前記標的遺伝子が、宿主細胞内のグルタミニルシクラーゼ遺伝子であり、及び前記発現の調節が、ピログルタミン酸化によるタンパク質の修飾を抑制することによって細胞でのタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８０．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、アスパラギンデアミダーゼ及びグルタミンデアミダーゼからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、脱アミド化によってタンパク質の修飾を抑制することによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８１．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ドリチル−ジホスホオリゴサッカライド−タンパク質グリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、タンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＴ−４、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、タンパク質のグリコシル化を調節することによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８２．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及びスルフヒドリルオキシダーゼからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、タンパク質においてジスルフィド結合形成を調節することによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８３．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、γ−セクレターゼ、ｐ１１５、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）タンパク質、セクレチン及びキナーゼからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、タンパク質の分泌を調節することによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８４．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、宿主細胞内のデヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子であり、及び前記発現の調節が、細胞での遺伝子増幅を高めることによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８５．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ウイルスの遺伝子又は細胞の標的遺伝子であり、それによって減少したウイルス量を有する宿主細胞から免疫原性作用物質を産生させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８６．前記ウイルスが、ベシウイルス、ＭＭＶ、ＭｕＬＶ、ＰＲＶ及びＲｅｏ−３からなる群から選択される、パラグラフ８５に記載の方法。
８７．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ウイルスタンパク質をコードする、パラグラフ８５に記載の方法。
８８．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、非ウイルスタンパク質をコードする、パラグラフ８５に記載の方法。
８９．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、酸化促進酵素、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦＩ及びＨＳＰ７０からなる群から選択され；及び前記発現の調節が、細胞の生存率を高めることによって細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
９０．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、Ｂｃｌ−Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢｉｍＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｏｏ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸 ３−ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群から選択され；及び前記発現の調節が、細胞の特異的生産性を高めることによって細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
９１．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸 ３−ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ及びＣＤＫ４からなる群から選択され；及び前記発現の調節が、細胞の栄養必要量を調節することによって細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
９２．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ及びリソソームＶ型ＡＴＰアーゼからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、細胞のｐＨを調節することによって細胞での免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
９３．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、細胞質アクチンキャッピングタンパク質（ＣａｐＺ）、エズリン（ＶＩＬ２）、ラミニンＡ及びコフィリン（ＣＦＬ１）からなる群から選択され；及び前記遺伝子発現の調節が、細胞のアクチン動態を調節することによって細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
９４．少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、標的遺伝子コフィリンの発現を調節する、パラグラフ９３に記載の方法。
９５．少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、細胞質アクチンキャッピングタンパク質（ＣａｐＺ）、エズリン（ＶＩＬ２）及びラミニンＡからなる群から選択される標的遺伝子の発現を増加させる、パラグラフ９３に記載の方法。
９６．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、宿主細胞潜在ウイルス、外来ウイルス又は宿主細胞内在性レトロウイルスの遺伝子であるか、あるいはこのようなウイルスの宿主細胞結合リガンドである、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
９７．前記標的遺伝子が、ＨＥＲＶ−Ｋ、ｐｔ０１−Ｃｈｒ１０ｒ−１７１１９４５８、ｐｔ０１−Ｃｈｒ５−５３８７１５０１、ＢａＥＶ、ＧａＬＶ、ＨＥＲＶ−Ｔ、ＥＲＶ−３、ＨＥＲＶ−Ｅ、ＨＥＲＶ−ＡＤＰ、ＨＥＲＶ−Ｉ、ＭＥＲ４様、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶＨ−ＲＴＶＬＨ２、ＨＥＲＶＨ−ＲＧＨ２、ＨＥＲＶ−Ｈコンセンサス、ＨＥＲＶ−Ｆｃ１、ｈｇ１５−ｃｈｒ３−１５２４６５２８３、ＨＥＲＶＬ６６、ＨＳＲＶ、ＨＦＶ、ＨＥＲＶ−Ｓ、ＨＥＲＶ−Ｌ、ＨＥＲＶＬ４０、ＨＥＲＶＬ７４、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＭＰＭＶ、ＭＭＴＶ、ＨＭＬ１、ＨＭＬ２、ＨＭＬ３、ＨＭＬ４、ＨＭＬ７、ＨＭＬ８、ＨＭＬ５、ＨＭＬ１０、ＨＭＬ６、ＨＭＬ９、ＭＭＴＶ、ＦＬＶ、ＰＥＲＶ、ＢＬＶ、ＥＩＡＶ、ＪＳＲＶ、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−７１６３４６２、ｇｇ０１−ｃｈｒＵ−５２１９０７２５、ｇｇ０１−Ｃｈｒ４−４８１３０８９４、ＡＬＶ、ｇｇ０１−ｃｈｒ１−１５１６８８４５、ｇｇ０１−ｃｈｒ４−７７３３８２０１、ｇｇ０１−ＣｈｒＵ−１６３５０４８６９、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−５７３３７８２、ニシキヘビ、ＷＤＳＶ、ＳｎＲＶ、Ｘｅｎ１、Ｇｙｐｓｙ及びＴｙ１から選択される内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）の遺伝子である、パラグラフ９６に記載の方法。
９８．前記標的遺伝子が、Ｃ血清型アデノウイルス、トリアデノウイルス、トリアデノウイルス随伴ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−４（ＥＢＶ）及びサーコウイルスからなる群から選択される潜在ウイルスの遺伝子である、パラグラフ９６に記載の方法。
９９．前記潜在ウイルスがサーコウイルスであり、及び前記標的遺伝子が、ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）又はサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のｒｅｐ遺伝子である、パラグラフ９８に記載の方法。
１００．前記潜在ウイルスがＥＢＶであり及び前記標的遺伝子が潜在膜タンパク質（ＬＭＰ）−２Ａである、パラグラフ９８に記載の方法。
１０１．前記標的遺伝子が、外来性レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、ヒトＴ細胞リンパ指向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ヒト肝炎Ａ型（ＨＨＡ）、ＨＨＢ、ＨＨＣ、ヒトサイトメガロウイルス、ＥＢＶ、ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ６）、ＨＨＶ７、ＨＨＶ８、ヒトパルボウイルスＢ１９、レオウイルス、ポリオーマ（ＪＣ／ＢＫ）ウイルス、ＳＶ４０、ヒトコロナウイルス、パピローマウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザＡ型、Ｂ型及びＣ型ウイルス、ヒトエンテロウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ベシウイルス、ブタサーコウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス、ブタパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス、レオウイルス、狂犬病ウイルス、レポリポックスウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ハンターンウイルス、マルブルグウイルス、ＳＶ２０、セムリキ森林ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ブタパルボウイルス、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、マウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ）、タイラー脳脊髄炎ウイルス、ネズミ微小ウイルス、マウスアデノウイルス（ＭＡＶ）；マウスサイトメガロウイルス、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）、キルハムラットウイルス、トゥーランＨ−１ウイルス、センダイウイルス、ラットコロナウイルス、偽性狂犬病ウイルス、カシェ渓谷ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシアデノウイルス、ウシパルボウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ウシヘルペスウイルス、ウシレオウイルス、ブルータングウイルス、ウシポリオーマウイルス、ウシサーコウイルス、牛痘、牛痘以外のオルトポックスウイルス、偽牛痘ウイルス及びレポリポックスウイルスからなる群から選択される外来ウイルスの遺伝子である、パラグラフ９６に記載の方法。
１０２．標的遺伝子が、内在性ウイルス、潜在ウイルス又は外来ウイルスのための宿主細胞結合リガンドである、パラグラフ９６に記載の方法。
１０３．前記標的遺伝子が、ＳＬＣ３５Ａ１、Ｇｎｅ、Ｃｍａｓ、Ｂ４ＧａｌＴ１又はＢ４ＧａｌＴ６である、パラグラフ１０２に記載の方法。
１０４．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＦＵＴ８、ＴＳＴＡ３及びＧＭＤＳからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、フコシル化を調節することによって細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
１０５．さらに、宿主細胞を、シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を標的とする少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させることを含む、請パラグラフ１０４に記載の方法。
１０６．前記シアリルトランスフェラーゼが、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ５、ＳＴ６（α−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−β−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ６及びＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２からなる群から選択される、パラグラフ１０５に記載の方法。
１０７．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、グルタミナーゼ及びグルタミンデヒドロゲナーゼからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、アンモニア増強を調節することによって細胞において免疫原性作用物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
１０８．さらに、前記宿主細胞を、グルタミナーゼの発現を調節する少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させることを含む、パラグラフ１〜１０８のいずれかに記載の方法。
１０９．さらに、前記宿主細胞を、グルタミンシンテターゼの発現を調節する少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させることを含む、パラグラフ１〜１０８のいずれかに記載の方法。
１１０．少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である）と、宿主細胞を培養するのに適した細胞培地とを含んでなる組成物であって、前記ＲＮＡエフェクター分子が、標的遺伝子の発現を調節でき及び前記発現の調節が、免疫原性作用物質の産生を高め、前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３３９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである組成物。
１１１．２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含んでなり、前記２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子がそれぞれ異なる標的遺伝子と相補的である、パラグラフ１１０に記載の組成物。
１１２．複数のＲＮＡエフェクター分子を含んでなる組成物であって、それぞれのＲＮＡエフェクター分子の一部分が、宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的であり、並びに前記組成物がＢａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨの発現を調節することができ及び前記発現の調節が免疫原性作用物質の産生を高める組成物。
１１３．さらに、少なくとも一つの追加のＲＮＡエフェクター分子又は物質を含む、パラグラフ１１０又は１１２に記載の組成物。
１１４．前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子がｓｉＲＮＡである、パラグラフ１１０又は１１２に記載の組成物。
１１５．前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が二重鎖領域を含む、パラグラフ１１０又は１１２に記載の組成物。
１１６．前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、１５〜３０個のヌクレオチドの長さである、パラグラフ１１０又は１１２に記載の組成物。
１１７．前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、１７〜２８個のヌクレオチドの長さである、パラグラフ１１０又は１１２に記載の組成物。
１１８．前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、修飾ヌクレオチドを含む、パラグラフ１１０又は１１２に記載の組成物。
１１９．前記細胞培地が血清無含有培地である、パラグラフ１１０に記載の組成物。
１２０．前記組成物が、非脂質製剤に製剤される、パラグラフ１１０〜１１９のいずれかに記載の組成物。
１２１．前記組成物が、脂質製剤に製剤される、パラグラフ１１０〜１１９のいずれかに記載の組成物。
１２２．前記製剤中の脂質が、陽イオン性又は非イオン性脂質を含む、パラグラフ１２１に記載の組成物。
１２３．前記組成物が、さらに一つ又はそれ以上の細胞培養培地補助物質を含む、パラグラフ１１０〜１２２のいずれかに記載の組成物。
１２４．前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、前記ｄｓＲＮＡが、相互に相補的である少なくとも２つの配列を含み及び前記センス鎖が、第一の配列を含み及びアンチセンス鎖が、標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である相補性の領域を含む第二の配列を含み、並びに前記相補性の領域が、１０〜３０個のヌクレオチドの長さである、パラグラフ１１０〜１２３のいずれかに記載の組成物。
１２５．培養細胞による免疫原性作用物質の産生を高めるキットであって、
（ａ）免疫原性作用物質が産生される条件下で細胞を培養するのに適した一つ又はそれ以上のアッセイ表面を含む支持体；
（ｂ）一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子（それぞれのＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は、標的遺伝子と相補的である）、及び
（ｃ）免疫原性作用物質又はその細胞による産生を検出するための試薬、
を含み、前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３３９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであるキット。
１２６．前記一つ又はそれ以上のアッセイ表面が、さらに宿主細胞の増殖及び維持を支持するための基材を含む、パラグラフ１２５に記載のキット。
１２７．前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、前記支持体表面に沈着している、パラグラフ１２５に記載のキット。
１２８．さらに、前記宿主細胞によるＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進するための担体を含む、パラグラフ１２５に記載のキット。
１２９．前記担体が陽イオン性脂質組成物を含む、パラグラフ１２８に記載のキット。
１３０．前記担体が、支持体表面に沈着している、パラグラフ１２８に記載のキット。
１３１．さらに、宿主細胞を培養するのに適した細胞培養培地を含む、パラグラフ１２５に記載のキット。
１３２．さらに、一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子の存在下で宿主細胞を培養し、前記細胞を免疫原性作用物質の産生についてアッセイするための取扱説明書を含む、パラグラフ１２５に記載のキット。
１３３．培養細胞による免疫原性作用物質の産生を最適化するためのキットであって、
（ａ）複数のアッセイ表面を含むマイクロアレイ支持体（前記アッセイ表面は、免疫原性作用物質が産生される条件下で細胞を培養するのに適している）；
（ｂ）一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子（それぞれのＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は、標的遺伝子と相補的である）；及び
（ｃ）前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子の免疫原性作用物質の産生に対する効果を検出するための試薬；
を含み、前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３３９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであるキット。
１３４．前記支持体が、マルチウエルプレート又はバイオチップである、パラグラフ１３３に記載のキット。
１３５．前記支持体が、二次元マイクロアレイプレート又はバイオチップある、パラグラフ１３３に記載のキット。
１３６．前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、支持体のアッセイ表面に沈着している、パラグラフ１３３に記載のキット。
１３７．複数の異なるＲＮＡエフェクター分子が、マイクロアレイの第一の寸法にわたってアッセイ表面に沈着している、パラグラフ１３５に記載のキット。
１３８．前記複数のＲＮＡエフェクター分子が、それぞれ異なる標的遺伝子と相補的である、パラグラフ１３７に記載のキット。
１３９．前記異なる標的遺伝子が、Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨである、パラグラフに記載のキット。
１４０．複数のＲＮＡエフェクター分子が、それぞれ同じ標的遺伝子の異なる領域と相補的である、パラグラフ１３７に記載のキット。
１４１．前記複数を含むＲＮＡエフェクター分子のそれぞれが、マイクロアレイの第二の寸法に沿ったアッセイ表面に種々の濃度で沈着している、パラグラフ１３７に記載のキット。
１４２．前記ＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、標的遺伝子と相補的である）が、ヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む対応ｓｉＲＮＡであり、前記ヌクレオチド配列が、本明細書中の表に記載のものであるパラグラフ１〜１０９のいずれかに記載の方法。
１４３．前記脂質製剤が、次式：
Figure 2014501489
 ｛式中：
Ｒ１及びＲ２は、それぞれの存在についてそれぞれ独立して、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルキル、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルコキシ、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルケニルオキシ、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルキニルオキシ、又は場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アシルであり；
Figure 2014501489
 は、Ｌ２とＬ１の間の結合を表し、この結合は：
（１）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子の間の単結合であり〔この場合、
Ｌ１は、Ｃ（Ｒｘ）、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｑ）であり；
Ｌ２は、−ＣＲ５Ｒ６−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、又は−Ｃ（Ｏ）−である〕；
（２）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子の間の二重結合であり〔この場合、
Ｌ１は、Ｃであり；
Ｌ２は、−ＣＲ５＝、−Ｎ（Ｑ）＝、−Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝である〕；
（３）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合、及びＬ２の第二の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合であり〔この場合、
Ｌ１は、Ｃであり；
Ｌ２は、次式：
Figure 2014501489
 を有し、式中のＸは、Ｌ２の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ２の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ１の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｚ１及びＺ４は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
Ｚ２は、ＣＨ又はＮであり；
Ｚ３は、ＣＨ又はＮであり；
あるいは、Ｚ２とＺ３は、一緒になって、単一のＣ原子であり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
それぞれのＺは、Ｎ、Ｃ（Ｒ５）、又はＣ（Ｒ３）であり；
ｋは、０、１、又は２であり；
それぞれのｍは、独立して０〜５であり；
それぞれのｎは、独立して０〜５であり；
この場合に、ｍとｎは、一緒になって３、４、５、６、７又は８員環を生じる〕；
（４）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合、及びＬ２の第一の原子とＬ１の第二の原子の間の単結合であり〔この場合に、
（Ａ）Ｌ１は、次式：
Figure 2014501489
 を有し、式中のＸは、Ｌ１の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ１の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ２の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｔ１は、ＣＨ又はＮであり；
Ｔ２は、ＣＨ又はＮであり；
あるいは、Ｔ１とＴ２は、一緒になって、Ｃ＝Ｃであり；
Ｌ２は、ＣＲ５であるか；又は
（Ｂ）Ｌ１は、次式：
Figure 2014501489
 を有し、式中のＸは、Ｌ１の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ１の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ２の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｔ１は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
Ｔ２は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
Ｌ２は、ＣＲ５又はＮである〕；
Ｒ３は、次式：
Figure 2014501489
 を有し、式中、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４のそれぞれは、独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、又はアルキニルであるか；あるいは、
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の任意の２つは、これらを結合しているＮ原子と一緒になって３〜８員複素環を形成するか；あるいは、
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、全てがこれらを結合しているＮ原子と一緒になって二環式５〜１２員複素環を形成し；
それぞれのＲｎは、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；
Ｌ３は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｌ４は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｌ５は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｒ５及びＲ６のそれぞれの存在は、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；あるいは、隣り合った２個の炭素原子上の２個のＲ５基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で二重結合を形成するか；又は隣り合った２個の炭素原子上の２個のＲ５基と、同じ隣り合った炭素原子上の２個のＲ６基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で三重結合を形成し；
それぞれのａは、独立して、０、１、２、又は３であり；
この場合に、
Ｌ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基は、場合によりＬ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基と一緒になって、３〜８員シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリール基を形成し；及び
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の任意の一つは、場合により、Ｌ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６基、及びこれらを結合している原子と一緒になって、３〜８員ヘテロシクリル基を形成し；
それぞれのＱは、独立して、Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり；並びに
それぞれのＱ２は、独立してＯ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）（Ｑ）、アルキル又はアルコキシである｝
を有する脂質を含んでなる、パラグラフ１２１に記載の方法。
（実施例）
（実施例１） ＲＮＡエフェクター分子合成
試薬の供給源が本明細書中で具体的に記載されていない場合、そのような試薬は、分子生物学における応用に標準的な品質／純度で分子生物学用試薬の任意の供給元から入手することができる。
オリゴヌクレオチド合成：オリゴヌクレオチドは全てＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置で合成する。市販のコントロールドポアガラス固体支持体（ｄＴ−ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）及び標準的保護基を有するＲＮＡホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−-イソブチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、及び５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をオリゴヌクレオチド合成のために使用した。２’−Ｆホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルロ−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイト及び５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイトを（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入する。１０％ＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中０．２Ｍの濃度で使用するグアノシン以外、全てのホスホルアミダイトはアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中０．２Ｍの濃度で使用する。１６分のカップリング／リサイクリング時間を使用する。アクチベータは、５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり；ＰＯ酸化には、ヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ酸化には、２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）中ＰＡＤＳ（２％）を使用する。
３’−リガンド結合鎖は、対応するリガンドを含む固体支持体を使用して合成する。例えば、配列中のコレステロール単位の導入は、ヒドロキシプロリノール−コレステロールホスホルアミダイトから実施する。コレステロールを６−アミノヘキサノエート結合によりｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリノールと結合させて、ヒドロキシプロリノール−コレステロール部分を得る。５’末端Ｃｙ−３及びＣｙ−５．５（フルオロフォア）標識されたＲＮＡエフェクター分子を、対応するＱｕａｓａｒ（登録商標）５７０インドカルボシアニンから合成する。Ｃｙ（商標）３ホスホルアミダイトをＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）から購入する。リガンドの５’末端及び又は内部位置への結合は、適切に保護されたリガンド−ホスホルアミダイトビルディングブロックを用いることによって達成される。ホスホルアミダイトの無水ＣＨ３ＣＮ中０．１Ｍ溶液の、５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾールアクチベータの存在下での固体支持体結合オリゴヌクレオチドへの拡大された１５分のカップリング。ヌクレオチド間ホスファイトのホスフェートへの酸化は、文献で報告されているように、標準的ヨウ素−水を用いるか、又はｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）での処理（１０分間の酸化待ち時間を伴う）によって実施する。ホ硫黄転移試薬、例えばＤＤＴＴ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入）、ＰＡＤＳ及び又はＢｅａｕｃａｇｅ試薬を使用することによりホスファイトをホスホロチオエートに酸化することによって、スホロチオエートを導入する。コレステロールホスホルアミダイトを自家合成し、ジクロロメタン中０．１Ｍの濃度で使用する。コレステロールホスホルアミダイトのカップリング時間は１６分である。
脱保護Ｉ（核酸塩基脱保護）：合成完了後、支持体を１００ｍＬのガラスビン（ＶＷＲ）に移す。８０ｍＬのエタノール性アンモニア混合物［アンモニア：エタノール（３：１）］で６．５時間５５℃にて、塩基及びリン酸基を同時に脱保護して、オリゴヌクレオチドを支持体から切断する。ビンを氷上で短時間冷却し、次いでエタノール性アンモニア混合物を新しい２５０ｍＬビン中にろ過する。ＣＰＧを２×４０ｍＬのエタノール／水（１：１ｖ／ｖ）で洗浄する。混合物の体積を次いでロト・バップにより〜３０ｍＬまで減じる。混合物を次いでドライアイス上で凍結させ、スピード・バックで真空乾燥する。
脱保護ＩＩ（２’−ＴＢＤＭＳ基の除去）：乾燥残留物を２６ｍＬのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ・３ΗＦ）又はピリジン−ＨＦ及びＤＭＳＯ（３：４：６）中に再懸濁させ、６０℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去する。反応を次いで５０ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムでクエンチし、ｐＨを６．５に調節する。オリゴヌクレオチドを精製するまで冷凍庫中で保存する。
分析：オリゴヌクレオチドを精製前に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、緩衝液及びカラムの選択は、配列及び又は結合リガンドの性質に依存する。
ＨＰＬＣ精製：リガンド結合オリゴヌクレオチドを逆相分取ＨＰＬＣにより精製する。非結合オリゴヌクレオチドを、自家充填したＴＳＫゲルカラム上アニオン交換ＨＰＬＣにより精製する。緩衝液は、１０％ＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ａ）；及び１０％ＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１Ｍ ＮａＢｒ（緩衝液Ｂ）である。全長オリゴヌクレオチドを含むフラクションをプールし、脱塩し、凍結乾燥する。約０．１５ＯＤの脱塩されたオリゴヌクレオチドを水中で１５０μＬに希釈し、次いでＣＧＥ及びＬＣ／ＭＳ分析用の特別なバイアル中にピペッティングする。化合物を次いでＬＣ−ＥＳＭＳ及びＣＧＥにより分析する。
ＲＮＡエフェクター分子調製：ＲＮＡエフェクター分子の一般的な調製のために、等モル量のセンス鎖及びアンチセンス鎖を１×ＰＢＳ中、９５℃で５分間加熱し、そして室温までゆっくりと冷却する。二本鎖の完全性をＨＰＬＣ分析により確認する。
ハムスターＢａｘ、Ｂａｋ、及びＬＤＨ ｍＲＮＡを分解するように設計されたｓｉＲＮＡを、一般公開されている配列データに基づいて合成した。約３２のｓｉＲＮＡの１セットを各標的に関して設計し、合成した。各ｓｉＲＮＡを細胞培地に１０ｎＭで３日間添加して、効果についてスクリーニングした。９６ウェルプレート中で、２９．５μＬのＣＤＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）を試験ウェルに添加し、４７μＬを対照ウェルに添加した。このために、ＣＤＣＨＯ培地中１００ｎＭのｓｉＲＮＡ（１７．５μＬ）を試験ウェルに添加した。全てのウェルに対して、ＣＤＣＨＯ培地中で１：１０に希釈した３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。混合物を室温で１５分間インキュベートし、次いで２０，０００〜３０，０００細胞を含有する１２５μＬのＣＤＣＨＯ培地を全てのウェルに添加した。プレートを次いで３７℃ＣＯ２インキュベータ中に３日間入れた。
３日後、細胞を毒性について視覚的に調査し、次いで製造業者の指示にしたがってＭａｇＭＡＸ（商標）９６ウェルＲＮＡ抽出キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ．／Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して、ＲＮＡを抽出した。製造業者の指示にしたがってＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ．）を使用して、ｃＤＮＡをＲＮＡから作製した。最後に、ｑＰＣＲを用いて、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＰＣＲ装置及びＲｏｃｈｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｂｅｓマスターミックスで標的ｃＤＮＡの２５倍希釈を定量化した。ＡＰＤＨを内部標準として使用するΔΔＣｔ法を用いて、標的遺伝子の相対的ノックダウンを計算した。
ｑＰＣＲに関して、以下のプライマー及びプローブを使用した：
Ｂａｘ
順方向プライマー ５’−ＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＧＧＡＧＧＣＧ−３’（配列番号３１５２４００）
逆方向プライマー ５’−ＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡ−３’（配列番号３１５２４０１）
プローブ ５’−６ＦＡＭ−ＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＧＡＧＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３１５２４０２）
Ｂａｋ
順方向プライマー ５’−ＣＣＴＣＣＴＡＧＧＣＡＧＧＡＣＴＧＴＧＡ−３’（配列番号３１５２４０３）
逆方向プライマー ５’−ＣＣＡＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＴＴＣＴ−３’（配列番号３１５２４０４）
プローブ ５’−６ＦＡＭ−ＴＣＡＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３１５２４０５）
ＬＤＨ
順方向プライマー ５’−ＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＴＴＧＧ−３’（配列番号３１５２４０６）
逆方向プライマー ５’−ＴＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＧＡＧＡＴＴＣＣＡ−３’（配列番号３１５２４０７）
プローブ ５’−６ＦＡＭ−ＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＴＡＧＧＣＧＧＧＴＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３１５２４０８）
ＧＡＰＤＨ
順方向プライマー ５’−ＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＴＧＧ−３’（配列番号３１５２４０９）
逆方向プライマー ５’−ＧＴＧＡＧＧＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＧＴＧＴ−３’（配列番号３１５２４１０）
プローブ ５’−ＶＩＣ−ＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＣＣＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３１５２４１１）
１０ｎＭでの最初のスクリーンの後、１７．５μＬのＣＤＣＨＯ培地中のｓｉＲＮＡの濃度を必要に応じて変更して所望の最終濃度を得る以外は、前述と同じ条件下、１００ｎＭ〜１ｐＭの範囲の濃度で、最も強力なｓｉＲＮＡをさらに試験した。
ＬＤＨ活性アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して、３〜４日のＬＤＨ ｓｉＲＮＡでの処理後のＬＤＨのレベルの低下について試験した。９６ウェルプレートのウェル中で、細胞を１７５μＬの培地中に溶解させるために、２０μＬの１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し、プレートを１０分間室温にて振盪した。アッセイを製造業者のプロトコルにしたがって実施した。
Figure 2014501489
Figure 2014501489
ハムスター（モンゴルキヌゲネズミ）Ｂａｘに対する例示的ｄｓＲＮＡ配列を本明細書中では配列番号：３１５２４７６〜３１５２５３９として開示し、ここで、偶数の配列番号（たとえば、配列番号３１５２４７６）はセンス鎖を表し、奇数の配列番号（たとえば、配列番号３１５２４７７）は相補性アンチセンス鎖を表し；本明細書中で記載される実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子はこれらの配列の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含み得る。
ハムスター（モンゴルキヌゲネズミ）ＬＤＨ−Ａに対する例示的ｄｓＲＮＡ配列を、本明細書中では配列番号３１５２５４０〜３１５２６０３として開示し、ここで、偶数の配列番号（たとえば、配列番号３１５２５４０）はセンス鎖を表し、奇数の配列番号（たとえば、配列番号３１５２５４１）は相補性アンチセンス鎖を表し；本明細書中で記載される実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子はこれらの配列の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含み得る。
Figure 2014501489
 （実施例２） ヒトＨＴ−１０８０細胞におけるグルコセレブロシダーゼの増大した産生
ヒトグルコセレブロシダーゼの産生は、ヒトＨＴ−１０８０細胞において増大し、この場合、グルコセレブロシダーゼ遺伝子は、細胞を１以上のＲＮＡエフェクター分子と接触させることにより、米国特許第５，６４１，６７０号（Ｇｅｎｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ（登録商標）ＧＣＢ（ＧＡ−ＧＣＢ））で記載されるように活性化され、ここで、各ＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部は、宿主細胞マンノシダーゼをコード化する標的遺伝子に相補的である。ＲＮＡエフェクター分子は、ゴルジマンノシダーゼＩＡ、ゴルジマンノシダーゼＩＢ、ゴルジマンノシダーゼＩＣ、及び／又はゴルジマンノシダーゼＩＩなどのクラス１プロセシング及び／又はクラス２プロセシングマンノシダーゼをコード化する標的遺伝子の発現を阻害する。種々のマンノシダーゼのコーディング鎖配列が開示されている。たとえば、Ｂａｕｓｅ，２１７ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３５−４０（１９９３）；Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２７４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１３７５−８６（１９９９）；Ｍｉｓａｇｏら、９２ ＰＮＡＳ １１７６６−７０（１９９５）；Ｔｒｅｍｂｌａｙら、８ Ｇｌｙｃｏｂｉｏ．５８５−９５（１９９８）；Ｔｒｅｍｂｌａｙら、２７５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３１６５５−６０（２０００）を参照。マンノシダーゼを標的とするＲＮＡエフェクター分子を、ワトソン・クリックの塩基対合則及び本明細書中に開示されているか、さもなければ当該技術分野で公知の他の検討事項にしたがって設計することができる。
ＧＡ−ＧＣＢ糖型に対するＲＮＡエフェクター分子の影響：ＧＡ−ＧＣＢを産生するＨＴ−１０８０細胞を蒔き、生産培地を、０（薬剤を含まない）〜１０μｇ／ｍＬの範囲のＲＮＡエフェクター分子濃度が得られるように調節する。培地を収集し、細胞を２４時間ごとに３日間再供給する。第３日からの試料を等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析に付して、発現されたグルコセレブロシダーゼに対するＲＮＡエフェクター分子の影響を分析する。タンパク質の見かけの等電点（ｐＩ）は、ＲＮＡエフェクター分子の濃度に依存して増大する。最も急なｐＩの増大を示すＲＮＡエフェクター分子は、グルコセレブロシダーゼの産生を増大させるための好ましいＲＮＡエフェクター分子と認定される。
ＧＡ−ＧＣＢ産生に対するＲＮＡエフェクター分子の影響：１０本のローラービン（表面積、それぞれ１７００ｃｍ２）に、増殖培地（１０％仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ）中、ＧＡ−ＧＣＢを産生するＨＴ−１０８０細胞を播種する。２週間の増殖後、培地を吸引し、２００ｍＬの新しい生産培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、０％仔ウシ血清）を３セットのローラービンに添加する。４本のローラービンの２セットを〜１μｇ／ｍＬのＲＮＡエフェクター分子で処理する。２本のローラービンの第３群には薬物処置をしない。約２４時間後、各ローラービンからの培地を収集し、プールし、そしてＧＡ−ＧＣＢ酵素活性分析のために試料を採取する。酵素活性分析を次のように実施する：試験物を酵素基質（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド）と混合し、１時間、３７℃でインキュベートする。ＮａＯＨ／グリシン緩衝液を添加することにより反応を停止させ、蛍光分光光度計の使用により蛍光を定量化する。比活性は２，５００単位／ｍｇと表され、ここで、１単位は、３７℃で１時間に１マイクロモルの基質が変換されることと定義される。全処理を７日間繰り返す。ＧＡ−ＧＣＢの安定な産生が７つの毎日収集したもの全てにわたって全ローラービンで観察される。しかし、酵素の絶対レベルは、ＲＮＡエフェクター分子処理群によって変化し得る。
ｈｍＧＣＢの精製及び特性化：ｈｍＧＣＢを、ＲＮＡエフェクター分子の存在下で増殖させたヒトヒト繊維芽細胞の培地から精製する。ｈｍＧＣＢ上に存在する４つのＮ結合グリカンは、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦにより放出され、Ｓｅｐ−ｐａｋ Ｃ１８カートリッジを用いて精製する。５％酢酸フラクション中に溶出するオリゴ糖を、水酸化ナトリウム及びヨウ化メチルを用いて過メチル化し、メタノール：水（８０：２０）中に溶解させ、過メチル化グリカン混合物の一部をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により分析する。２，５−ジヒドロキシ安息香酸のマトリックスを使用した遅延引き出しを伴うＶＯＹＡＧＥＲ（商標）ＳＴＲＢＩＯＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ（商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｔｉｏｎレーザー脱離質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ．）で試料を分析する。擬分子（ｐｓｅｕｄｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ）イオンのパターンがｍ／ｚ１５００〜２５００の範囲で見られ、このことは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２までの範囲の高マンノースグリカンの存在を示す。
存在する最も多量の高マンノースグリカンは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２及びＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２であり、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、及びＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の量は減少する。２個のシアル酸残基を含む微量のフコシル化二分岐複合型グリカンが観察される。各グリカンの相対量の近似表示は、ピークの高さを測定することにより得られる。高マンノースグリカンの平均鎖長のより正確な評価は、インタクト糖タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により得られる。グリカン鎖の均一性のために、およそｍ／ｚ６２，４８３．１で鋭いピークが得られる。アミノ酸配列から計算される成熟ペプチドの質量は、約５５，５７７．６であり、このことは、４個のＮ結合グリカン鎖がｈｍＧＣＢの合計量に対する寄与は６９０５．５であることを示す。この数値から、平均グリカン長さは８．１５マンノース残基であると計算できる。
マクロファージ中へのＧＡ−ＧＣＢ取り込みに対するＲＮＡエフェクター分子の効果：
ＨＴ−１０８０細胞において産生されるＧＡ−ＧＣＢをインビトロアッセイで使用して、マウスマクロファージ細胞系における取り込み効率を測定する。実験の具体的な目的は、マウスＪ７７４Ｅ細胞におけるＧＡ−ＧＣＢの絶対及びマンノース受容体特異的取り込みを測定することである。アッセイの１日前に、Ｊ７７４Ｅ細胞を５０，０００細胞／ｃｍ２で１２ウェルプレートにおいて増殖培地中に蒔く。アッセイのために、５０ｎＭのビタミンＤ３（１，２−５，ジヒドロキシビタミンＤ３）を含む０．５ｍＬの生産培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、０％仔ウシ血清）を細胞に添加する。未精製ＧＡ−ＧＣＢを、２μｇ／ｍＬマンナン（マンノース受容体の競合相手）の存在下又は非存在下で１０μｇ／ｍＬの最終濃度にて試験ウェルに添加する。
以下の形態のＧＡ−ＧＣＢを使用する：ＲＮＡエフェクター分子（１μｇ／ｍＬ）で処理した細胞由来のＧＡ−ＧＣＢ及び未処理細胞由来のＧＡ−ＧＣＢ（１μｇ／ｍＬ）。対照ウェルにはＧＡ−ＧＣＢを加えない。ウェルを４時間３７℃でインキュベートし、次いで緩衝塩溶液中でよく洗浄し、ＧＡ−ＧＣＢ酵素反応緩衝液中にかき落とし、２回の凍結／解凍サイクルを経て、遠心分離により清澄化する。上清を次いで酵素活性及び全タンパク質について定量的に試験する。酵素活性を次のように測定する：試料を酵素基質（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド）と混合し、１時間、３７℃でインキュベートする。ＮａＯＨ／グリシン緩衝液を添加することにより反応を停止させる。蛍光分光光度計の使用により蛍光を定量化する。全タンパク質をビシンコニン酸（ＢＣＡ）により凍結／解凍細胞可溶化物中で測定する。活性を単位／ｍｇ全タンパク質として報告し、ここでは、１単位は、３７℃で１時間での１マイクロモルの基質の変換と定義される。ＲＮＡエフェクター分子で処理された細胞は、マンナン（２μｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でＲＮＡエフェクター分子を受ける。ＧＡ−ＧＣＢのマウスＪ７４４Ｅ細胞中へのインタナリゼーションを単位／ｍｇ細胞可溶化物で報告する。
結果は、ＲＮＡエフェクター分子処理細胞からのＧＡ−ＧＣＢの取り込みは、バックグラウンドよりも約７倍〜１４倍高く、マンナンにより約６７％〜７３％阻害可能であることを示す。加えて、この結果により、未処理細胞からのＧＡ−ＧＣＢの取り込みがバックグラウンドよりも約３倍高く、マンナンにより５３％阻害可能であることも示される。したがって、ＲＮＡエフェクター分子による細胞内マンノシダーゼの阻害の結果、マンノース受容体により効率的に細胞中に輸送できるＧＡ−ＧＣＢが得られる。マンノース受容体による細胞に対するＧＡ−ＧＣＢの標的化における改善は、したがって、１以上のＲＮＡエフェクター分子の存在下でのＧＡ−ＧＣＢの産生により最適化することができる。
（実施例３） 様々なｓｉＲＮＡで処理された懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞の増殖曲線
５０ｍＬの全体積中約４００，０００細胞／ｍＬでフラスコを準備した。まず、２０μＭのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｔｅａｌｔｈ ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡ２．５μＬ又は１μＭのＢａｘ ｓｉＲＮＡ５０μＬ及び１μＭのＢａｋ ｓｉＲＮＡ５０μＬの又は１μＭのＬＤＨ ｓｉＲＮＡ５０μＬを、３つの異なる１４．３ｍＬの体積のＣＤＣＨＯ培地（ＧＩＢＣＯ）に添加した。溶液を穏やかに混合し、次いで８５．５μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれに添加し、溶液を穏やかに再度混合した。溶液を室温で１５分間インキュベートした。１５分後、３２．８ｍＬの温めた培地を各溶液に添加した。最後に、２．９ｍＬの培地を７，０００，０００細胞／ｍＬで添加し、フラスコを３７℃ＣＯ２インキュベータ中、１６０ｒｐｍに設定されたシェーカープレート上に置いた。翌日、アリコートを培地からとり、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞カウンターで細胞を計数し、それらの生存度を測定した。
２及び４日に、さらなるｓｉＲＮＡを添加した。これを行うために、２５ｍＬを各フラスコから取り出し、〜４００×ｇで５分間回転させて、細胞をペレット化した。次いで、１４．３ｍＬの無細胞培地を別の試験管に取り出し、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ試薬を前述のように添加した。溶液を穏やかに混合し、室温で１５分間インキュベートした。溶液を各細胞ペレットに戻し、ピペットで混合して、細胞集塊を壊し、次いでもとのフラスコに戻した。
（実施例４） Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨの阻害は、培養における細胞の生存度を増強する。
Ｂａｘ及びＢａｋは、重要なプロアポトーシス（プログラムされた細胞死を誘発できる）機能を果たすミトコンドリア調節ＢＣＬ−２タンパク質ファミリーのメンバーである。前述のように、低ピコモル濃度範囲内にＩＣ５０を有するＢａｘ及びＢａｋに対して有効なｓｉＲＮＡを、１Ｌのバイオリアクター中で増殖させたＣＨＯ細胞に周期的間隔で添加した。加えて、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に対するｓｉＲＮＡもｓｉＲＮＡ配合物中に含める。ＬＤＨは嫌気性ストレスの期間中のピルビン酸から乳酸への変換を触媒する。乳酸は、培養中で増殖させた細胞で産生された主要代謝老廃物であり、細胞増殖及び代謝経路の両方を阻害することが示された。Ｂａｘ／Ｂａｋ及びＬＤＨ経路の活性化は、培養中の細胞の増殖可能性を制限すると考えられるので、これらの遺伝子に対する有効なｓｉＲＮＡを１Ｌのバイオプロセシング様条件下で、懸濁液中で増殖させたＣＨＯ細胞に添加する効果を評価した。非特異的ＦＩＴＣで標識されたｓｉＲＮＡで処理されたＣＨＯ細胞と比較した場合、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞は、対照よりも９０％高い細胞密度まで増殖し、対応してアポトーシス死亡率が２倍減少した。
材料及び方法：懸濁適応させたＣＨＯ細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、１Ｌの使い捨てバイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）中、３７℃及び５．５％ＣＯ２でＤＧ４４既知組成培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃１２６１０−０１０）を用いて、製造業者により指示された速度で一定して撹拌しながら増殖させた（０．２×１０６細胞／ｍＬ播種密度）。播種後４日から始めて、ＣＨＯＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１０２３４，１０２４０）を用いて細胞培養に５％培養量（３０ｍＬ）を追加した。培養に次いで４８時間ごとに同じフィード培地及び体積を用いて供給した。
Ｂａｘ、Ｂａｋ、及びＬＤＨ ｓｉＲＮＡ配列を表１０に示し、まずＲＬＤ小規模合成により修飾なしに小規模で合成し（３’ｄＴｄＴを除く）、続いて中規模合成を行った。対照ｓｉＲＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した（ＦＩＴＣ標識されたｏｌｉｇｏ；＃４４−２９２６）。各ｓｉＲＮＡを１Ｌのバイオリアクターに１ｎＭの最終濃度で添加し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクション用に処方した。Ｂａｘ、Ｂａｋ、及びＬＤＨ ｓｉＲＮＡをあわせて混合して、最終合計ｓｉＲＮＡ濃度３ｎＭにした。対照ｓｉＲＮＡ配合物は、６ｍＬのＤＧ４４培地、２４０μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭａｘ試薬、及び３０μＬのＦＩＴＣ標識オリゴ（２０μＭストック濃度）を含んでいた。実験のｓｉＲＮＡ配合物は、６ｍＬのＤＧ４４培地、２４０μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＲＮＡｉＭａｘ試薬、及びそれぞれ６ｕＬのＢａｘ、Ｂａｋ、及びＬＤＨ ｓｉＲＮＡ（１００μＭストック濃度）を含んでいた。０日から始めて培地に添加する前に、対照及び実験ｓｉＲＮＡの両方を室温で１５分間インキュベートし、同様の濃度で４８時間ごとに合計６回再度添加した。毎日、５ｍＬの培養試料を取り出し、細胞を計数し、血球計でトリパンブルー色素（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）排除を用いて生存度を測定した。すべての細胞試料を、ｓｉＲＮＡ又は栄養フィードのさらなる添加の前に採取した。残りの細胞を等分し、細胞ペレットを沈降させ、次のアッセイ：ｑＰＣＲ、乳酸塩、グルコース、ＬＤＨ、及びカスパーゼ３に必要になるまで−７０℃で凍結した。
Figure 2014501489
 結果：Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡをＣＨＯ細胞培養に添加することにより、非特異的ＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡを用いた対照トランスフェクションと比較した場合、生存細胞密度が約２倍改善される（図６）。対照細胞集団は、６日に〜１．５×１０６細胞／ｍＬの最大細胞密度に達し；一方、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞は、７日に〜１．８×１０６細胞／ｍＬの最大細胞密度を達成した。Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ処理細胞の総細胞面積（ＩＧＡ）は対照ｓｉＲＮＡ処理細胞よりも〜９０％増大した（図６、挿入画）。
対照細胞の５０％生存度がＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ処理細胞について１０日及び１６日で観察された（図７）。両試料は０日から始まって５日まで比較的安定した生存度を示した。細胞生存度は、対照処理試料については６日、実験試料については７日からはじまって９０％以下に減少し始めた。細胞死亡速度は％生存度反応曲線の傾きに正比例する。傾斜が鋭い方が、なだらかな傾斜に比べてアポトーシス死亡速度が速いことを示す。アポトーシス細胞死の速度は、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理培養物と比較して対照について２．８倍速かった（図７、挿入画）。
これらのデータは、１Ｌのバイオリアクターにおいて懸濁液中で増殖させたＣＨＯ細胞に添加した場合の可溶性ｓｉＲＮＡが、非特異的対照ｓｉＲＮＡと比較した場合、細胞密度と生存度との両方に対してプラスの影響を及ぼし得ることを強力に支持する。
乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性及び乳酸レベルはどちらも、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理後のＣＨＯ細胞において減少する。
乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を細胞増殖曲線のコースで追跡した（図８）。曲線下面積（ＡＵＣ）分析は対照ｓｉＲＮＡ処理細胞と比較してＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞において酵素活性の６７％減少を示した。乳酸レベルにおいて対応する減少が観察された（図９）。ＡＵＣ分析により測定されるように、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理培養物において観察される乳酸レベルの減少は約３３％であり、酵素活性減少について観察されるものの約半分であり、このことは、ＬＤＨピルビン酸から乳酸への変換率が増大して、減少した酵素濃度が相殺されたことを示す。
対照ｓｉＲＮＡ処理細胞におけるグルコース消費量は増殖曲線の７日後に減少する。グルコースを培養フィーディイング法の一部として使用し、増殖曲線全体にわたってモニタリングした。７日の前に、対照と実験培養とはどちらも、グルコースを同じ程度まで利用した（図１０）。７日の後に、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞は、７日の前と同様に引き続きグルコースを使用するが、対照細胞集団はそれらのグルコース消費量が減るようである。
これらのデータは、Ｂａｘ／Ｂａｘ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡが、１ＬのＣＨＯバイオプロセシング培養物に添加された場合、対照ｓｉＲＮＡ処理培養物と比較して対数期増殖後のグルコース利用を促進することを証明し（対照ｓｉＲＮＡ処理培養物は促進しなかった）、このことは、対照細胞が死滅するか、またはグルコース代謝ができないことを示唆する。
Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡは、１ＬのＣＨＯバイオプロセシング培養物に添加された場合に、対照ｓｉＲＮＡと比較して、カスパーゼ３活性を有意に減少させる。カスパーゼ３活性化は、アポトーシス死を遂げる細胞におけるＤＮＡ分解に至る最後から２番目のステップである。Ｂａｘタンパク質及びＢａｋタンパク質はどちらもこのプロセスの上流であるので、Ｂａｘ／Ｂａｋノックダウンは、カスパーゼ３活性も減少させることが予想される。二相カスパーゼ３活性反応が対照条件と実験条件との両方について観察された（図１１）。対数期増殖中に、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ−ｓｉＲＮＡ処理細胞培養及び対照ｓｉＲＮＡ処理細胞培養はどちらも類似したカスパーゼ３レベルを有していた。非アポトーシス細胞において活性なカスパーゼ３の理由はわからないが、対数期後に、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞培養は対照細胞集団と比較して著しく低いカスパーゼ３活性を有し、９日にカスパーゼ３活性は観察されず、対照と比較して１２日の実験細胞集団では＜１０％活性であった。
これらのデータから、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡは、Ｂａｘ及びＢａｋがミトコンドリアにより誘発されるアポトーシスを活性化する能力をブロックし、適切な標的経路が影響を受けたことを示す。
Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡは、２週間にわたって複数回投与された場合、＞８０％ｍＲＮＡノックダウンを維持することができる。最近の刊行物では、アポトーシスの最大ブロックを維持するために、Ｂａｘ及びＢａｋ ｍＲＮＡはどちらも相当ノックダウンされなければならないことが報告されているが（Ｌｉｍら、８ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇ．５０９−２２（２００６））、別のグループは、ＬＤＨがＬＤＨ活性を減少させるには＞８０％ ｍＲＮＡノックダウンで十分であることを示唆した（Ｋｉｍ＆Ｌｅｅ，７４ Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５２−５９（２００７））。したがって、複数回ｓｉＲＮＡを投与する目的は、３つの遺伝子全てについて％ノックダウンを＞８０％に維持することであった。時間経過のほとんどにわたってＢａｘ及びＬＤＨメッセージノックダウンは実際に＞８０％であった（図１２）。Ｂａｋ ｍＲＮＡノックダウンは時間経過を通して８０％前後で推移した。このｓｉＲＮＡは、それぞれの新しい用量と相関するようであるジグザグ反応パターンにより示唆されるように、複数の用量から最も恩恵を受けるようであった。ジグザグ効果は、他のｓｉＲＮＡについても観察されるが、Ｂａｋ ｓｉＲＮＡほど大きくはなかった。
これらのデータは、この研究で使用した３つのｓｉＲＮＡ全てが２週間にわたってｍＲＮＡノックダウンを維持したことを示す。Ｂａｋ ｓｉＲＮＡについてのメッセージノックダウンＩＣ５０がＢａｘと類似していても、時間経過にわたるｍＲＮＡノックダウンの維持は匹敵しなかった。この理由はわからないが、他のＢａｋ ｓｉＲＮＡを評価すべきであることが示唆される。
まとめ：アポトーシス調節因子Ｂａｘ及びＢａｋに対するサイレンシングＲＮＡを、重要な代謝酵素である乳酸デヒドロゲナーゼに対するｓｉＲＮＡと組み合わせて、１Ｌのバイオリアクターを使用して、２週間にわたりチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるノックダウン活性について評価した。本明細書中で提示する結果は、サイレンシングＲＮＡがバイオプロセシング様条件下、懸濁液中で増殖させたＣＨＯ細胞中への効率的な取り込みのために適切に処方することができるという考えを明らかに支持する。Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡは、２週間にわたって複数回投与された場合、＞８０％ｍＲＮＡノックダウンを維持し、これは、カスパーゼ３及びＬＤＨ活性の両方を低下させ、結果として非特異的ｓｉＲＮＡ対照と比較して細胞密度及び生存度を増大させるのに十分であった。さらに、これらのデータは、複数のｓｉＲＮＡｓ（少なくとも３）をそれぞれがその所望のノックダウン効果を有する懸濁細胞培養において複数量と同時に添加することができ、生存度に対する影響が最小でＣＨＯ細胞により十分に許容されるトランスフェクション試薬を認定できることを示す。
（実施例５） ＲＮＡエフェクターの使用による抗体の改善されたＡＤＣＣ
多くの治療抗体、特に抗癌治療抗体は、有効性のために抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を必要とする。高ＡＤＣＣを達成するために、抗体の適切なグリコシル化が必要であると考えられる。例えば、Ｆｃオリゴ糖のコアフコースが無い抗体は、それらのフコシル化カウンターパートよりもヒトにおいてはるかに高いＡＤＣＣを示すことが判明した。加えて、抗体におけるＮ結合オリゴ糖の広範囲のα２，６−シアル化はまた、ＡＤＣＣを減少させると考えられる。
したがって、フコシル化の量が実質的に減少し、またα２，６−シアル化が減少した抗体を産生するのが望ましい。

抗体のフコシル化、特にα１，６−フコシル化は、
（ｉ）ＧＤＰ−マンノース４，６デヒドラターゼ（ＧＭＤＳによりコード化される）（ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへの変換を触媒する）；
（ｉｉ）ＧＤＰ−Ｄ−マンノース代謝における２ステップエピメラーゼ及びリダクターゼ反応を触媒するＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースエピメラーゼリダクターゼ（ＴＳＴＡ３によりコード化される）（ＧＤＰ−４−ケト−６−Ｄ−デオキシマンノースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する。ここで、ＧＤＰ−Ｌ−フコースは、いくつかのフコシルトランスフェラーゼの基質である）；及び
（ｉｉｉ）ＧＤＰ−フコースからＮ結合型複合糖ペプチドへのフコースの転移を触媒するフコシルトランスフェラーゼ８（α１，６）フコシルトランスフェラーゼ）（ＦＵＴ８によりコード化される）
を含む多くの酵素ステップにより行う。
α１，６，フコシルトランスフェラーゼにおいて欠失又は不足している細胞を単離し、本発明で使用して、フコシル化が減少した抗体を産生する。しかし、細胞の倍加時間はゆっくりであり、増殖するために特別な条件を必要とする。さらに、細胞は多くの遺伝的背景で利用できない。
抗体の高シアル化はまた、ＡＤＣＣの減少をもたらすことも示唆されている。シアル化は、本明細書に記載されているものなどのシアリルトランスフェラーゼの作用により起こる。
したがって、抗体の増大したＡＤＣＣは、本明細書中に記載されている方法を用いて宿主細胞において抗体を産生することによって達成される。例えば、抗体を発現する宿主細胞を：
ＦＵＴ８：配列番号２０９８４１〜２１０２２７の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス配列；又は配列番号３１５２７１４〜３１５２７５３から選択される少なくとも一つの鎖を含むｓｉＲＮＡ、若しくは本明細書に記載されているもの；
ＧＭＤＳ：配列番号１６８８２０２〜１６８８５１９；及び配列番号３１５２７５４〜３１５２７９３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続するヌクレオチド（たとえば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡ；
ＴＳＴＡ３：ＴＳＴＡ３を標的とするｄｓＲＮＡ分子は、配列番号１８３９５７８〜１８３９９３７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド分子の少なくとも１６個の連続するヌクレオチド（たとえば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含み得る
のいずれか一つに対するｓｉＲＮＡと接触させる。
ヒト抗ＣＤ２０抗体を発現するＣＨＯ細胞の１２の別個の培養を培養フラスコ中で増殖させ、まず１日に〜２００，０００細胞／ｍｌの密度で播種し、２日に以下の処理を施す：
フラスコＡ：トランスフェクション剤のみ；
フラスコＢ：負の対照として１ｎＭ（添加後の最終濃度）のルシフェラーゼｄｓＲＮＡを含むトランスフェクション剤；
フラスコＣ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＦＵＴ８ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＤ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＴＳＴＡ３ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＥ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＧＭＤＳ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＦ：トランスフェクション試薬中１ｎＭ ＴＳＴＡ３ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭ ＦＵＴ８ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＧ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＧＭＤＳ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭ ＦＵＴ８ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＨ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＴＳＴＡ３ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭのＧＭＤＳ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＩ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＳｔ６ＧａｌＮａｃ６ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭのＦＵＴ８ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＪ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＳｔ６ＧａｌＮａｃ６ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭのＧＭＤＳ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＫ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＳｔ６ＧａｌＮａｃ６ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭのＴＳＴＡ３ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＬ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＳｔ６ＧａｌＮａｃ６ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭ ＦＵＴ８ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭのＧＭＤＳ ｄｓＲＮＡ；
細胞をさらに４日間増殖させ、各フラスコの上清を集める。タンパク質Ａ−セファロースクロマトグラフィーを用いて上清から抗体を単離する。部分的に精製された抗体を全収率（抗ヒトＡｂを用いたＥＬＩＳＡによる）、抗原結合（たとえば、ＣＤ２０結合）、及びＡＤＣＣ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイを使用）について特性化する。様々な細胞から単離された抗体のオリゴ糖構造を陽イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により特性化する。
ハムスター（モンゴルキヌゲネズミ）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）に対する例示的ｄｓＲＮＡ配列を本明細書中では配列番号３１５２７１４〜３１５２７５３として開示し、ここで、偶数の配列番号（たとえば、番号３１５２７１４）はセンス鎖を表し、そして奇数の配列番号（たとえば、番号３１５２７１５）は相補性アンチセンス鎖を表し；本明細書中で記載される実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含み得る。
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 （実施例６） 高濃度グルコース培養におけるＢａｘ／Ｂａｋの使用
一般的に、バイオプロセシングにおいて細胞の増殖中に高濃度のグルコース（たとえば、少なくとも１５ｍＭ）を含めると、増殖培地中に乳酸が蓄積し、このことは細胞増殖にとって有害であり得る。乳酸蓄積の結果、早期アポトーシスが起こる。それを別にすれば高レベルの炭素源、例えばグルコースを提供することは非常に有利であるので、乳酸蓄積及びその後のアポトーシスを引き起こすことなく高グルコースで細胞を増殖させる方法が非常に望ましい。
この実施例では、プロアポトーシス遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を用いて、アポトーシスを受けることなく増殖培地中、少なくとも１０ｍＭ（例えば、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ又はそれ以上）のさらに高いグルコース濃度で細胞を増殖させる。
０日目に、免疫原性作用物質を発現できる宿主細胞を、通常のグルコースレベル（約４〜６ｍＭ）を含む増殖培地中でそれぞれ１ｎＭのＢａｘ及びＢａｋを標的とするＲＮＡエフェクターと（場合によって１ｎＭのＬＤＨを標的とするｄｓＲＮＡとも）接触させる。約２４時間後に、１５ｍＭのグルコースを含む培地に細胞を切り替える。その後、Ｂａｘ及びＢａｋを標的とするＲＮＡエフェクターをさらに３〜５日ごとに１ｎＭで提供する。これらの細胞におけるタンパク質産生を、ＲＮＡエフェクター分子でトランスフェクトされていない（又は非特異的対照ＲＮＡエフェクターでトランスフェクトされた）細胞からのものと比較する。
高グルコースでの増殖を可能にするために有用な他のＲＮＡエフェクターは、本明細書に記載されているものをはじめとする、任意のプロアポトーシス遺伝子を標的とするものを含み得る。他の例には、表３０からの以下のものからなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続するヌクレオチド（たとえば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含むＲＮＡエフェクター分子が含まれる：
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 （実施例７） ＰＫ１５細胞及びＤＧ４４細胞におけるｓｉＲＮＡの有効性
ＤＧ４４細胞におけるｓｉＲＮＡスクリーニング：対象のＣＨＯ標的に対するｓｉＲＮＡを設計し、合成する。数セットのスクリーンされるｓｉＲＮＡ（二本鎖）を細胞培地に１００ｐＭ〜１０ｎＭで１〜４日間効果を得るために添加する。９６ウェルプレート中、８ｍＭのＬ−グルタミン及び０．１８％のＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８（登録商標）を追加した２９．５μＬのＣＤ ＤＧ４４培地（ＧＩＢＣＯ（商標） Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を試験ウェルに添加し、４７μＬを対照ウェルに添加する。このために、ＣＤ ＤＧ４４培地中所望の最終濃度の１０倍で１７．５μＬのｓｉＲＮＡを試験ウェルに添加する。全てのウェルに、ＣＤ ＤＧ４４培地中１：１０に希釈した３μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加する。混合物を１５分間室温でインキュベートし、次いで約２０，０００ＤＧ４４細胞を含む１２５μＬのＣＤ ＤＧ４４培地を全てのウェルに添加する。プレートを次いで３７℃ＣＯ２インキュベータ中に１〜４日間入れる。
インキュベーション後、細胞を毒性について視覚的に調査し、ＭａｇＭａｘ９６ウェルＲＮＡ抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造業者の指示に従って使用してＲＮＡを抽出する。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）を製造業者の指示に従って使用して、ｃＤＮＡをＲＮＡから作製する。最後に、ｑＰＣＲを用いて、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＰＣＲ装置及びＲｏｃｈｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｂｅｓマスターミックスで標的のｃＤＮＡの適切な希釈を定量化する。ＧＡＰＤＨを内部標準として使用するΔΔＣｔ法を用いて標的遺伝子の相対的ノックダウンを計算した。標的遺伝子ｃｏｆｉｌｉｎｌ、ＬＤＬＲ、ＧＮＥ、ＳＬＣ３５Ａ１．ＧＡＬＥ、ＦＵＴ８、ＧＭＤＳ、及びＸＹＬＡＴの％ｍＲＮＡノックダウンは本明細書中の他の場所で示されている。
最も有効なｓｉＲＮＡを様々な濃度で更に試験する。この試験法は、種々のｓｉＲＮＡ濃度を同時に試験する以外は前記と同じであった。
ＰＫｌ５細胞におけるｓｉＲＮＡスクリーニング：対象のＰＣＶｌ標的に対するｓｉＲＮＡを設計し、合成する。スクリーンする数セットのｓｉＲＮＡを、効果を得るために、細胞培地に１０ｎＭで１日間添加する。９６ウェルプレートにおいて、アールの平衡塩を含むイーグル（ＥＭＥＭ）最小必須培地培地（ＡＴＣＣ）２９．５μＬを試験ウェルに添加し、４７μＬを対照ウェルに添加する。このために、１７．５μＬのｓｉＲＮＡ（ＣＤ ＤＧ４４培地中１００ｎＭ）を試験ウェルに添加する。全てのウェルに、４μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭｌＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＥＭＥＭ培地中１：１０に希釈）を添加する。混合物を室温で１５分間インキュベートし、次いで約２０，０００ＰＫｌ５細胞を含む１２５μＬのＥＭＥＭ培地を全てのウェルに添加する。プレートを次いで３７℃ＣＯ２インキュベータ中に１日間入れた。
インキュベーション後、細胞を毒性について視覚的に調査し、次いでＭａｇＭａｘ９６ウェルＲＮＡ抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ）を製造業者の指示にしたがって使用して、ＲＮＡを抽出する。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の指示に従って使用して、ｃＤＮＡをＲＮＡから作製した。最後に、ｑＰＣＲを使用して、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＰＣＲ装置及びＲｏｃｈｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｂｅｓマスターミックスで標的ｃＤＮＡの適切な希釈を定量化する。ＧＡＰＤＨを内部標準として使用するΔΔＣｔ法を用いて標的遺伝子の相対的ノックダウンを計算する。
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（実施例８） ＤＧ４４懸濁培養中の一時的にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡは、０．１ｎＭもの低い濃度で最高１８日まで遺伝子発現の有意かつ長期にわたる干渉を示す。
種々の温度で増殖させた懸濁培養のＲＮＡ干渉：ＣＭＶ−ＧＦＰ構築物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で安定してトランスフェクトされたＧＦＰ発現ＣＨＯ ＤＧ４４細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中に０日で（３７℃細胞について２×１０４細胞／ウェルで、そして２８℃細胞については１０５細胞／ウェルで）播種し、これもまた０日に、０．１、１、及び１０ｎＭ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘと混合）でＧＦＰに対するｓｉＲＮＡで一時的にトランスフェクトした。蛍光測定によりＧＦＰ発現を測定し、発現の阻害（各温度及び時間で、ＲＮＡｉＭａｘのみの対照と比較した発現の％として表す）。発現の阻害を、初期ｓｉＲＮＡトランスフェクション後、１８日までの間モニタリングした。
対照実験：未処理であるか又はＲＮＡｉＭａｘのみで処理されたかのいずれかのＣＨＯ ＤＧ４４細胞におけるＧＦＰの発現を時間とともにモニタリングした。結果を図２０（未処理）及び図２１（脂質（ＲＮＡｉＭａｘのみで処理、ｓｉＲＮＡはなし）に示す。ＧＦＰは全期間にわたって発現されるが、２８℃細胞におけるＧＦＰの発現は、最終的にはるかに高くなり、このことは、細胞***の非存在下でも、継続してタンパク質が発現されることを示す（図２０及び２１）。
脂質処理対照（図２０）を、ＲＮＡ干渉の有効性を測定するための対照として使用した。図２２Ａ〜２２Ｃのグラフは、０．１ｎＭもの低いｓｉＲＮＡ濃度でＧＦＰの発現の有意な阻害を示す（図２２Ａ）。さらに、発現の阻害は、測定値が得られるかぎり維持された（すなわち、数例では初期発現後１８日まで）。
（実施例１３） ４０Ｌバイオリアクター中で増殖させたＣＨＯ細胞の計測可能なｓｉＲＮＡ取り込みプロトコル
当業者には公知のように、脂質ポリヌクレオチド担体を使用したｓｉＲＮＡのリポソーム介在性送達を、研究用途で一般的に使用するが、ＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０１２１７３（２００８年７月１１日出願）で記載されているように、脂質ポリヌクレオチド担体、例えば一般的なリポソームトランスフェクション試薬の使用は、タンパク質のバイオプロセシングで使用される場合、有害であることが判明している。ポリヌクレオチド担体は、おそらくは毒性のために典型的に使用される濃度で宿主細胞の増殖に有害であり、したがって宿主細胞が所望の生物由来物質を工業的レベルで産生する能力を損なうことが報告されている。加えて、ポリヌクレオチド担体は、宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞の表現型における有害かつ望ましくない変化を引き起こし、宿主細胞が対象の生物由来物質を産生する能力を損なうことが観察されている。したがって、当業者は、そのようなポリヌクレオチド担体の使用が所望のタンパク質を産生する細胞の能力を損なうであろうと予想する。驚くべきことに、本発明者等は、明細書全体にわたって記載されるように、細胞に関して試験される条件下で細胞に対して有害な影響をおよぼすことなく（たとえば細胞生存度及び密度が維持される）、大規模培養（たとえば、１Ｌ及び、たとえば４０Ｌ）でのバイオプロセシング処理の間、ポリヌクレオチド担体（たとえば、リポソーム介在性送達）を用いることによって（たとえば、ＢＡＸ、ＢＡＣ及び／又はＬＤＨを標的とする）ＲＮＡエフェクター分子を宿主細胞へ一時的に送達することができることを見出した。したがって、生物由来物質の大規模産生は、培養（たとえば、懸濁培養）中にある場合に細胞中のＲＮＡエフェクター取り込みを促進するために、例えば、生物由来物質（例えば、ポリペプチド）の産生を改善する遺伝子発現の有効な一時的調節をもたらすために、脂質試薬を用いて工業的規模で実施することができる。
さらに、本発明者らは、細胞増殖や生存度に対する影響を最小にして産生細胞系中への効率的なｓｉＲＮＡ取り込みを促進する、効率的な取り込みを増強する試薬を同定するために種々の脂質組成物を調査した。本発明者らは、第四カチオン性脂質配合物のパネルをスクリーニングして、９６ウェルプレート培養において、ＬＤＨ活性が９０％を超えて減少すること（ＬＤＨに対するｓｉＲＮＡを使用）を以前に証明した（データは省略）。この実施例では、本発明者らは、取り込みインデューサとしてＰ８と混合したｓｉＲＮＡ（たとえば表１９を参照）は、５０ｍｌ培養における細胞密度及び細胞生存度に対する各配合物の影響に関して市販のＲＮＡｉＭａｘよりも十分に寛容性であることを示す。本発明者らは、本発明者らの培養を大規模バイオリアクターにスケールアップし、ＬＤＨに対するＰ８配合ｓｉＲＮＡを使用することによって、１回の１ｎＭ量で６日間ＬＤＨ活性において８０〜９０％減少したことを見出した。本発明者らは次いで、本発明者らの培養を３Ｌ及び４０Ｌにスケールアップした。本発明者らは、配合物Ｐ８が乳酸デヒドロゲナーゼに対するｓｉＲＮＡ（ＬＤＨ−Ａ）の効率的な取り込みを促進し、その結果、３Ｌ又は４０Ｌバイオリアクターのいずれかで増殖させたＣＨＯ細胞においてＬＤＨ活性の＞９０％ＬＤＨ減少がもたらされたことを見出した。驚くべきことに、３Ｌ培養を４０Ｌ培養と比較するスケールアップ実験では、サイレンシング効率は完全に直線的である。結果を本明細書中に示す。
材料／方法
トランスフェクション試薬の処方：クロロホルム中のカチオン性脂質及びコリピッド（たとえば、コレステロール及びＤＯＰＥ）をＮ２流とそれに続く真空乾燥により乾燥して、有機溶媒を除去した。乾燥した脂質フィルムを、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４を３７℃で使用して水和した。形成されたリポソームを押し出して、〜２００ｎｍの平均粒径を得た。
播種されたＧＦＰ−ＣＨＯ細胞に対するトランスフェクション試薬の試験：９の異なる登録商標のトランスフェクション配合物（たとえば表１９を参照）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＧＦＰに対する有効なｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）をＧＦＰ−ＣＨＯ細胞系に送達した。ＲＮＡｉＭａｘを０．４μＬ／ｍＬで試験し、９の配合物を０．５、１、及び２．５μｇ／ｍＬで使用した。トランスフェクション試薬とｓｉＲＮＡとの混合物を光学用黒底９６ウェルプレート中で作製し、次いで細胞を添加した。２日後、蛍光プレートリーダーを用いて相対的ＧＦＰ強度を測定した。
懸濁されたＤＧ４４ＣＨＯ細胞に関するトランスフェクション試薬の試験：ＧＦＰ−ＣＨＯ試験からの３つの最も活性なトランスフェクション剤（Ｋ８、Ｌ８及びＰ８）を用いて、懸濁されたＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。５μＬの１０μＭ ＬＤＨ−Ａ ｓｉＲＮＡのアリコートを試験管に添加し、５００μＬのＣＤ ＤＧ４４培地をこれに添加した。トランスフェクション試薬を混合物に添加し、試験管をピペット吸引により混合し、そして室温で１５分間インキュベートした。次いで、２００，０００細胞／ｍｌを含む培地４９．５ｍＬに混合物を添加した。フラスコをインキュベートし、１２０ｒｐｍで数日間振とうした。ＬＤＨ活性をＶｅｔＴｅｓｔ８００８スライドアナライザにより測定した。
４０Ｌのトランスフェクション：ＤＧ４４細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＤ ＤＧ４４培地中で増殖させた。４０Ｌバイオリアクターに播種するために、細胞を４つの１Ｌの使い捨てバイオリアクターからとった。４０Ｌの培養物中の出発細胞密度は１２０，０００細胞／ｍｌであった。バイオリアクターを添加された細胞とトランスフェクション前１時間平衡化させた。トランスフェクションのために、４００μＬのＬＤＨ−Ａ ｓｉＲＮＡ（配列番号３１５２５６０及び３１５２５６１の対）（１００ｕＭストック溶液）を４００ｍＬの培地に添加し、混合した。次いで１ｍｇ／ｍＬのＰ８試薬３２ｍＬを添加し、再度混合した。これを室温で１５分間インキュベートし、次いで４０Ｌのバイオリアクターに添加した。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞カウンターを用いて細胞密度及び生存度を測定し、トランスフェクションの効率を測定し、ＶｅｔＴｅｓｔ８００８スライドアナライザを用いてＬＤＨ活性を測定した。
結果及び考察
９のカチオン性脂質配合物の振とうフラスコ中のＣＨＯ細胞における取り込み効率に関する評価：脂質配合物の有効性を測定するために、ＧＦＰ−ＣＨＯ細胞において強力なＧＦＰ ｓｉＲＮＡとともに使用した。有効濃度のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭｌＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡｘ試薬と比較すると、３つの化合物は活性であった（図２３）。これらの処方をＫ８、Ｌ８、及びＰ８と表示した。任意の配合物の試験した濃度で明らかな細胞毒性は観察されなかった。
Ｋ８はＧＦＰ−ＣＨＯ細胞において最も活性な配合物であったので、２５０ｍＬの振とうフラスコにおいて、５０ｍＬの培養物中ＤＧ４４ＣＨＯ細胞及び強力なＬＤＨ ｓｉＲＮＡを用いて試験した。種々のＫ８濃度を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭｌＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡｘトランスフェクション試薬の有効濃度とともに試験した。３日後、ＬＤＨ活性は、Ｋ８を使用した培養物中で低かった（図２４）。ＲＮＡｉＭＡｘ試薬と比較して、フラスコ中の細胞密度もさらに高く、０．６μｇ／ｍＬ又は１．２μｇ／ｍＬのＫ８であった。ＲＮＡｉＭＡｘ試薬は、Ｋ８処理細胞と比較した場合、懸濁液中でＣＨＯ細胞の増殖を阻害したようである。Ｋ８の最高濃度は、ＬＤＨ活性がさらに減少する場合でも細胞密度を減少させた。
一部のトランスフェクション試薬は振とうフラスコ中で９６ウェルプレート中と同じ活性を有さないように見えたので、３つの最も活性の高い配合物を、２５０ｍＬの振とうフラスコ中、５０ｍＬのＤＧ４４中で同様に試験した。驚くべきことに、ＧＦＰ−ＣＨＯ細胞に対してごくわずかしか活性でなかった配合物Ｐ８が、懸濁されたＤＧ４４細胞培養を用いて最も良好に機能した（図２５）。５日後、０．８μｇ／ｍＬのＰ８の結果、最高のＬＤＨ活性ノックダウンが得られた。また、Ｐ８の存在下での細胞密度が、トランスフェクション試薬が添加されていない対照細胞以上であったということは重要である。０．８μｇ／ｍＬの最終濃度でのＰ８をさらに小さなバイオリアクター中で多数回使用し（データは省略）、４０Ｌの系で試験した。
図２６は、推奨される濃度でＰ８配合物又は市販のＲＮＡｉＭａｘ配合物を使用して、５０ｍＬの振とうフラスコ中懸濁ＣＨＯ細胞において長時間にわたる細胞密度（図２６Ａ）又は％細胞生存度（図２６Ｂ）を示す。脂質配合物を０日に細胞上に添加した。Ｐ８は市販のＲＮＡｉＭａｘよりも十分に寛容性であることが判明した。図３０は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に対するＰ８混合ｓｉＲＮＡを使用した場合、１Ｌのバイオリアクター中で１回の１ｎＭ用量で６日間にＬＤＨ活性の８０％〜９０％ノックダウンが達成されることを示す。ＬＤＨ活性のノックダウンは永続的であり、効果が６日間にわたって持続することが見いだされた。
カチオン性脂質配合物Ｐ８の３Ｌ対４０Ｌバイオリアクターにおける取り込み効率に関する評価。図２８は、Ｐ８脂質と混合した１ｎＭのＬＤＨ ｓｉＲＮＡの１回投与の、３Ｌ及び４０Ｌ培養において６日間の経過時間にわたる生存細胞密度及び％ＬＤＨ活性に対する結果を示す。驚くべきことに、３Ｌ培養を４０Ｌ培養と比較するスケールアップ実験では、サイレンシング効率は完全に直線的であり、このことは、さらに大規模でも成功することを示す。複数用量のプロトコルを用いて、効果の期間を延長することができる。
カチオン性脂質配合物Ｐ８の４０Ｌバイオリアクターにおける取り込み効率に関する評価。４０Ｌのバイオリアクターに播種した後、細胞は一般的に約２４時間の倍加時間で増殖し、細胞生存度は９８％超であった（図２６Ｂ）。細胞は５日で３．１×１０６細胞／ｍＬの最高濃度に達し、その後、減少し始めた。この無供給バッチ培養で予想されるように、６日までに細胞は減少した。
ｓｉＲＮＡ処理細胞のＬＤＨ活性は、播種及びトランスフェクション後に細胞が増殖するにつれ、減少した。ＬＤＨ活性は、３回以上に倍加した後でも〜８０％減少した（図３０）。実験全体にわたってＬＤＨ活性が減少した。有意に減少したＬＤＨ活性に基づいて、トランスフェクションはＣＨＯ細胞において検出可能な毒性がなく成功した。
これらの実験は、ｓｉＲＮＡでの培養における細胞のトランスフェクションは、生物学的産生に必要な大きな体積で機能できることを示す。
（実施例１４） 標的遺伝子の発現を滴定するためのＲＮＡエフェクターの使用
安定にトランスフェクトされたｓｈＲＮＡを有する細胞と異なり、ｄｓＲＮＡ分子の使用により、細胞工学を必要とすることなく宿主細胞内で実際的に任意の標的遺伝子の発現を調節することが可能になる。加えて、前述のように、構成的に阻害された標的遺伝子を有する細胞は十分に増殖することができず、望ましくない特性（たとえば、特別な増殖培地又は他の増殖条件の必要性、増大した変異率など）を示す可能性がある。細胞の増殖又は生物学的産生中の所望の時点で、標的遺伝子の発現を調節する能力を有することが、したがって非常に望ましい。
安定なトランスフェクションに依存しないｄｓＲＮＡ剤などのＲＮＡエフェクター分子を使用するさらに別の利点は、所定の標的遺伝子の発現を微調整する潜在能力である。数例では、標的遺伝子の発現を調節して、その発現レベルが中程度にのみ変更され（たとえば、未処理状態から〜５０％減少し）、望ましくない表現型を回避するか、又は生物学的産生の質を改善することが重要であり得る。このように、本発明者らは所定の標的遺伝子の発現を滴定できる条件を見いだすために実験を行った。
０日に、ＣＤ ＤＧ４４培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させたＣＨＯ ＤＧ−４４細胞を、５００μＬの体積で配合物８中脂質Ｐを含む配合物（すなわち、配合物「Ｐ８」；表１９を参照）中、ＬＤＨＡ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ（本明細書中で記載のとおり；例えば表６２を参照）で、０ｎＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ及び５ｎＭ（２５ｍＬの培養中最終濃度）にてトランスフェクトした。使用したｄｓＲＮＡ二本鎖は同様の条件下で〜５０ｐＭの見かけのＥＣ５０を有する。トランスフェクション後、２４．５ｍＬの培地を含むフラスコに細胞を添加し（２００，０００細胞／ｍｌの細胞密度）、そして３７℃で増殖させた。３日後、ＬＤＨ活性を測定し、細胞密度に対して正規化した。
ＬＤＨ活性を下記表６２に示す：
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 結果から、ｄｓＲＮＡの濃度を滴定することにより、ＬＤＨ活性を１５％〜７５％超阻害の範囲に調節できることがわかる。したがって、本明細書中に示すｄｓＲＮＡなどのＲＮＡエフェクター分子を使用して、標的遺伝子の所望の発現レベルを達成することができる。加えて、先の実験（不掲載）に基づいて、部分的阻害が達成される濃度（例えば、１０〜１００ｐＭ）で処理された細胞は、さらに高濃度で処理されたものよりも迅速にＲＮＡ干渉から回復すると予想される。このように、細胞が標的遺伝子の阻害からより早く回復することが望ましい（すなわち、遺伝子発現の阻害の持続時間が短い）場合、低濃度のＲＮＡエフェクター分子（たとえば、見かけのＥＣ５０の３倍以下、例えば見かけのＥＣ５０の２倍、見かけのＥＣ５０の１倍など）を提供することができる。
下記表は、本明細書中に記載する方法及び組成物に関して有用な標的遺伝子及びｓｉＲＮＡ配列を例示する。
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Claims (143)

  1. 大規模宿主細胞培養において免疫原性作用物質を産生する方法であって、
    （ａ）大規模宿主細胞培養において、宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程であって、第一のＲＮＡエフェクター分子の一部分は宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である工程と、
    （ｂ）宿主細胞培養物を、少なくとも一つの第一の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持する工程であって、発現の調節が宿主細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる工程と、
    （ｃ）免疫原性作用物質を宿主細胞から単離する工程と
    を含み、大規模宿主細胞培養が、少なくとも１リットルの規模であり、かつＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に添加することによって宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させることにより、標的遺伝子の発現が一時的に抑制される方法。
  2. 大規模宿主細胞培養において免疫原性作用物質を産生する方法であって、
    （ａ）大規模宿主細胞培養において、宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程であって、第一のＲＮＡエフェクター分子の一部分は宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である工程と、
    （ｂ）宿主細胞培養物を、少なくとも一つの第一の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持する工程であって、発現の調節が宿主細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる工程と、
    （ｃ）免疫原性作用物質を宿主細胞から単離する工程と
    を含み、免疫原性作用物質の産生全体を通じてＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に多数回加えることによって宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させることにより、標的遺伝子の発現が一時的に抑制される方法。
  3. 大規模宿主細胞培養において、宿主細胞を複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させ、複数のＲＮＡエフェクター分子が、少なくとも一つの標的遺伝子、少なくとも２つの標的遺伝子又は複数の標的遺伝子の発現を調節する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 細胞において免疫原性作用物質を産生する方法であって、
    （ａ）宿主細胞を複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程であって、２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が複数の標的遺伝子の発現を調節する工程と、
    （ｂ）細胞を、複数の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持する工程であって、発現の調節が細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる工程と、
    （ｃ）免疫原性作用物質を細胞から単離する工程と
    を含み、複数の標的遺伝子が少なくともＢａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨを含む方法。
  5. ＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に添加することによって宿主細胞を複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させることにより、標的遺伝子の発現が一時的に抑制される請求項４に記載の方法。
  6. ＲＮＡエフェクター分子又は複数のＲＮＡエフェクター分子が、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、ｄｓＲＮＡが相互に相補的である少なくとも２つの配列からなり、センス鎖が第一の配列からなるとともにアンチセンス鎖が標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である相補性の領域を含む第二の配列からなり、かつ、相補性の領域が１０〜３０ヌクレオチド長である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 接触させる工程が、宿主細胞培養物を保持して免疫原性作用物質を産生するために使用する培地にＲＮＡエフェクター分子又は複数のＲＮＡエフェクター分子を連続的に注入することによって実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 発現の調節が発現の抑制であり、かつ前記抑制が部分的抑制である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 部分的抑制が、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、及び８５％からなる群から選択される抑制率以下である、請求項７に記載の方法。
  10. 接触させる工程が少なくとも１回繰り返される、請求項１〜６及び８〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 接触させる工程を、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間及び１０８時間からなる群から選択される頻度で多数回繰り返す、請求項１〜６及び８〜９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 発現の調節が発現の抑制であり、かつ、免疫原性作用物質の産生全体を通じて一つまたは複数の標的遺伝子に対して少なくとも５０％の平均抑制率を維持するために、接触させる工程を多数回繰り返すか又は連続的に注入する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 平均抑制率が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. ＲＮＡエフェクター分子を１００ｎＭ未満の濃度で接触させる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. ＲＮＡエフェクター分子を２０ｎＭ未満の濃度で接触させる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 大規模宿主細胞培養における宿主細胞のＲＮＡエフェクター分子との接触が、免疫原性作用物質の単離又は上清の回収の少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間又は少なくとも１２０時間あるいは少なくとも１週間前に実施される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ＲＮＡエフェクター分子が、脂質製剤に製剤化された組成物である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. ＲＮＡエフェクター分子が、非脂質製剤に製剤化された組成物である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ＲＮＡエフェクター分子がｓｈＲＮＡではない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. ＲＮＡエフェクター分子がｓｉＲＮＡである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ＲＮＡエフェクター分子が化学的に修飾される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. ＲＮＡエフェクター分子が化学的に修飾されない、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 細胞密度、培地ｐＨ、酸素濃度、グルコース濃度、乳酸濃度、温度及びタンパク質産生量からなる群から選択される少なくとも一つの測定可能パラメータを監視することをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 複数の異なるＲＮＡエフェクター分子のそれぞれを、同時に又は異なる時間で添加する、請求項２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 複数の異なるＲＮＡエフェクター分子のそれぞれを、同じ濃度で又は異なる濃度で添加する、請求項２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を、同じ頻度で又は異なる頻度で添加する、請求項２〜６及び８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 細胞を第二の作用物質と接触させる工程をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 第二の作用物質が、抗体、増殖因子、アポトーシス阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤及びヒストン脱メチル化剤からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. キナーゼ阻害剤が、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤及びＫ２５２ａからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. ホスファターゼ阻害剤が、バナジン酸ナトリウム及びオカダ酸からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  31. ヒストン脱メチル化剤が５−アザシチジンである、請求項２８に記載の方法。
  32. 免疫原性作用物質がポリペプチドである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 免疫原性作用物質がウイルスである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  34. ウイルスがＰＣＶである、請求項３３に記載の方法。
  35. 細胞を、ＲＮＡエフェクター分子と、定常期、初期対数期、中期対数期、後期対数期、誘導期及び死滅期からなる群から選択される細胞増殖期で接触させる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが二重鎖領域を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが１５〜３０ヌクレオチド長である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが１７〜２８ヌクレオチド長である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 細胞が、植物細胞、真菌細胞、又は動物細胞である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項４１に記載の方法。
  43. ヒト細胞が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＩＭＲ３２細胞、ＬＡＮ５細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦｌＯＡ細胞、２９３Ｔ細胞及びＳＫ−ＢＲ３細胞からなる群から選択される付着細胞である、請求項４２に記載の方法。
  44. ヒト細胞が、ＨｕＶＥＣ細胞、ＨｕＡＳＭＣ細胞、ＨＫＢ−Ｉ１細胞及びｈＭＳＣ細胞からなる群から選択される初代細胞である、請求項４２に記載の方法。
  45. ヒト細胞が、Ｕ２９３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲＣ６（登録商標）細胞、ジャーカット細胞、ＨＴ−２９細胞、ＬＮＣａｐ．ＦＧＣ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＡ ＭＢ４５３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＴＨＰ−Ｉ細胞、ＭＣＦ７細胞、ＢｘＰＣ−３細胞、Ｃａｐａｎ−１細胞、ＤＵ１４５細胞及びＰＣ−３細胞からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
  46. 哺乳動物細胞が、ＢＨＫ２１細胞、ＢＨＫ（ＴＫ−）細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＥＬ４細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞誘導体、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＥＳ−Ｄ３細胞、Ｈ９ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞、及びｍｉＭＣＤ３細胞からなる群から選択される齧歯類動物細胞である、請求項４１に記載の方法。
  47. ＣＨＯ細胞誘導体が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸＢ１及びＣＨＯ−ＤＧ４４細胞からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 細胞が、ＰＥＲＣ６細胞、ＨＴ−２９細胞、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＡ ＭＢ４５３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＴＨＰ−１細胞、ｍｉＭＣＤ−３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｃｏｓ−７細胞、ＢｘＰＣ−３細胞、ＤＵ１４５細胞、ジャーカット細胞、ＰＣ−３細胞及びＣａｐａｎ−１細胞からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
  49. 細胞が、ＢＨＫ２１、ＢＨＫ（ＴＫ−）、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、Ｕ２９３細胞、ＥＬ４細胞、ＣＨＯ細胞、及びＣＨＯ細胞誘導体からなる群から選択される齧歯類動物細胞である、請求項４１に記載の方法。
  50. 細胞が、免疫原性作用物質をコードする遺伝子構造物をさらに含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 細胞が、ウイルス受容体をコードする遺伝子構造物をさらに含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 標的遺伝子が、タンパク質グリコシル化に影響を及ぼすタンパク質をコードする、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 標的遺伝子が免疫原性作用物質をコードする、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つを、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ及び１００ｎＭからなる群から選択される濃度で加える、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つを、５０分子／細胞、１００分子／細胞、２００分子／細胞、３００分子／細胞、４００分子／細胞、５００分子／細胞、６００分子／細胞、７００分子／細胞、８００分子／細胞、９００分子／細胞、１０００分子／細胞、２０００分子／細胞、又は５０００分子／細胞の量で加える、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、０．０１フェムトモル／１０６細胞、０．１フェムトモル／１０６細胞、０．５フェムトモル／１０６細胞、０．７５フェムトモル／１０６細胞、１フェムトモル／１０６細胞、２フェムトモル／１０６細胞、５フェムトモル／１０６細胞、１０フェムトモル／１０６細胞、２０フェムトモル／１０６細胞、３０フェムトモル／１０６細胞、４０フェムトモル／１０６細胞、５０フェムトモル／１０６細胞、６０フェムトモル／１０６細胞、１００フェムトモル／１０６細胞、２００フェムトモル／１０６細胞、３００フェムトモル／１０６細胞、４００フェムトモル／１０６細胞、５００フェムトモル／１０６細胞、７００フェムトモル／１０６細胞、８００フェムトモル／１０６細胞、９００フェムトモル／１０６細胞，及び１ピコモル／１０６細胞からなる群から選択される濃度で添加される、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  57. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴミア、リボザイム及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 細胞を、炭素の代謝及び輸送、アポトーシス、ＲＮＡｉ取り込み及び効率の少なくとも一方、活性酸素種産生、細胞周期の調節、タンパク質折りたたみ、タンパク質ピログルタミン酸化、タンパク質脱アミド化、タンパク質グリコシル化、ジスルフィド結合形成、タンパク質分泌、遺伝子増幅、ウイルス複製、ウイルス感染、ウイルス粒子放出、細胞ｐＨの調節、及びタンパク質産生からなる群から選択される細胞プロセスを調節する少なくとも一つの追加のＲＮＡエフェクター分子又は作用物質と接触させる工程をさらに含む、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸３−ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞内の炭素の代謝又は輸送を調節することによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 少なくとも一つの標的遺伝子が乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）であり、かつＲＮＡエフェクター分子が配列番号３１５２５４０〜３１５２６０３から選択される配列を含む、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  61. 少なくとも一つの標的遺伝子が、Ｂｃｌ−Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢｉｍＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｏｏ、Ｍｃｌ−１、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９及びＣＡＳＰ１０からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞のアポトーシスを調節することによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  62. 少なくとも一つの標的遺伝子がＢａｋであり、かつＲＮＡエフェクター分子が配列番号３１５２４１２〜３１５２４７５から選択される配列を含む、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  63. 少なくとも一つの標的遺伝子がＢａｘであり、かつＲＮＡエフェクター分子が配列番号３１５２４７６〜３１５２５３９から選択される配列を含む、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  64. ＲＮＡエフェクター分子が、初期アポトーシスに入る細胞の比率を著しく低下させる、請求項１６又は１７に記載の方法。
  65. 複数の標的遺伝子が、少なくともＢａｘ及びＢａｋである、請求項３に記載の方法。
  66. 複数の標的遺伝子が、少なくともＢａｘ、Ｂａｃ及びＬＤＨである、請求項３に記載の方法。
  67. その一部分がＢａｘと相補的であるＲＮＡエフェクター分子が、配列番号３１５２４７６〜３１５２５３９から選択される配列を含み、その一部分がＢａｋと相補的であるＲＮＡエフェクター分子が、配列番号３１５２４１２〜３１５２４７５から選択される配列を含む、請求項４、５、６５及び６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. その一部分がＬＤＨと相補的であるＲＮＡエフェクター分子が、配列番号３１５２５４０〜３１５２６０３から選択される配列を含む、請求項４又は６６に記載の方法。
  69. 少なくとも２つの標的遺伝子の発現が調節され、かつ少なくとも２つの標的遺伝子が、Ｂｃｌ−Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ，及びＢｉｍＬからなる群から選択される、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 細胞を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）と相補的な配列を含むＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程をさらに含む、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  71. 少なくとも一つの標的遺伝子が、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、Ａｇｏ４、ＨＩＷＩ１、ＨＩＷＩ２、ＨＩＷＩ３、ＨＩＬＩ、インターフェロン受容体、ＡｐｏＥ、Ｅｒｉ１及びマンノース／ＧａｌＮＡｃ受容体からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞でのＲＮＡｉ取り込み及び効率の少なくとも一方を調節することによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  72. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＮＡＤ（ｐ）Ｈオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、構成型神経性一酸化窒素シンターゼ（ｃｎＮＯＳ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）、１５−リポキシゲナーゼ−１、ＮＡＤＰＨシトクロムｃ２レダクターゼ、ＮＡＰＨシトクロムｃレダクターゼ、ＮＡＤＨシトクロムｂ５レダクターゼ及びシトクロムＰ４５０２Ｅ１からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞での活性酸素種の産生を抑制することによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  73. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＭｕＬＶタンパク質、ＭＶＭタンパク質、Ｒｅｏ−３タンパク質、ＰＲＶタンパク質及びベシウイルスタンパク質からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞のウイルス感染を抑制することによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  74. 少なくとも一つの標的遺伝子がキシローストランスフェラーゼである、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  75. 少なくとも一つの標的遺伝子がベシウイルスタンパク質であり、かつ少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が配列番号３１５２６０４〜３１５２７１３から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む少なくとも一つの鎖を含む、請求項７３に記載の方法。
  76. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ及びＣＤＫ４からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞の細胞周期を調節することによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  77. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ４、ＡＴＦ６、ｅＩＦ２α、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、Ｂｉｐ、Ｈｓｐ４０、ＨＳＰ４７、ＨＳＰ６０、Ｈｓｐ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１００、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ、カルレチクリン、カルネキシン、Ｅｒｐ５７及びＢＡＧ−１からなる群から選択され、かつ発現の調節が、タンパク質の折りたたみを高めることによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  78. 少なくとも一つの標的遺伝子が、宿主細胞内のメチオニンスルホキシドレダクターゼ遺伝子であり、かつ発現の調節が、メチオニン酸化によるタンパク質の修飾を抑制することによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  79. 標的遺伝子が、宿主細胞内のグルタミニルシクラーゼ遺伝子であり、かつ発現の調節が、ピログルタミン酸化によるタンパク質の修飾を抑制することによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３又は６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 少なくとも一つの標的遺伝子が、アスパラギンデアミダーゼ及びグルタミンデアミダーゼからなる群から選択され、かつ発現の調節が、脱アミド化によってタンパク質の修飾を抑制することによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  81. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ドリチル−ジホスホオリゴサッカライド−タンパク質グリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、タンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＴ−４、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択され、かつ発現の調節が、タンパク質のグリコシル化を調節することによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  82. 少なくとも一つの標的遺伝子が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及びスルフヒドリルオキシダーゼからなる群から選択され、かつ発現の調節が、タンパク質においてジスルフィド結合形成を調節することによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  83. 少なくとも一つの標的遺伝子が、γ−セクレターゼ、ｐ１１５、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）タンパク質、セクレチン及びキナーゼからなる群から選択され、かつ発現の調節が、タンパク質の分泌を調節することによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  84. 少なくとも一つの標的遺伝子が、宿主細胞内のデヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子であり、かつ発現の調節が、細胞での遺伝子増幅を高めることによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  85. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ウイルスの遺伝子又は細胞の標的遺伝子であり、それによって減少したウイルス量を有する宿主細胞から免疫原性作用物質を産生させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  86. ウイルスが、ベシウイルス、ＭＭＶ、ＭｕＬＶ、ＰＲＶ及びＲｅｏ−３からなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
  87. 少なくとも一つの標的遺伝子がウイルスタンパク質をコードする、請求項８５に記載の方法。
  88. 少なくとも一つの標的遺伝子が非ウイルスタンパク質をコードする、請求項８５に記載の方法。
  89. 少なくとも一つの標的遺伝子が、酸化促進酵素、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦＩ及びＨＳＰ７０からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞の生存率を高めることによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、Ｂｃｌ−Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢｉｍＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｏｏ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸３−ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞の特異的生産性を高めることによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  91. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸 ３−ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ及びＣＤＫ４からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞の栄養必要量を調節することによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  92. 少なくとも一つの標的遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ及びリソソームＶ型ＡＴＰアーゼからなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞のｐＨを調節することによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  93. 少なくとも一つの標的遺伝子が、細胞質アクチンキャッピングタンパク質（ＣａｐＺ）、エズリン（ＶＩＬ２）、ラミニンＡ及びコフィリン（ＣＦＬ１）からなる群から選択され、かつ遺伝子発現の調節が、細胞のアクチン動態を調節することによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  94. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が標的遺伝子コフィリンの発現を調節する、請求項９３に記載の方法。
  95. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、細胞質アクチンキャッピングタンパク質（ＣａｐＺ）、エズリン（ＶＩＬ２）及びラミニンＡからなる群から選択される標的遺伝子の発現を増加させる、請求項９３に記載の方法。
  96. 少なくとも一つの標的遺伝子が、宿主細胞潜在ウイルス、外来ウイルス又は宿主細胞内在性レトロウイルスの遺伝子であるか、あるいはこのようなウイルスの宿主細胞結合リガンドである、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  97. 標的遺伝子が、ＨＥＲＶ−Ｋ、ｐｔ０１−Ｃｈｒ１０ｒ−１７１１９４５８、ｐｔ０１−Ｃｈｒ５−５３８７１５０１、ＢａＥＶ、ＧａＬＶ、ＨＥＲＶ−Ｔ、ＥＲＶ−３、ＨＥＲＶ−Ｅ、ＨＥＲＶ−ＡＤＰ、ＨＥＲＶ−Ｉ、ＭＥＲ４様、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶＨ−ＲＴＶＬＨ２、ＨＥＲＶＨ−ＲＧＨ２、ＨＥＲＶ−Ｈコンセンサス、ＨＥＲＶ−Ｆｃ１、ｈｇ１５−ｃｈｒ３−１５２４６５２８３、ＨＥＲＶＬ６６、ＨＳＲＶ、ＨＦＶ、ＨＥＲＶ−Ｓ、ＨＥＲＶ−Ｌ、ＨＥＲＶＬ４０、ＨＥＲＶＬ７４、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＭＰＭＶ、ＭＭＴＶ、ＨＭＬ１、ＨＭＬ２、ＨＭＬ３、ＨＭＬ４、ＨＭＬ７、ＨＭＬ８、ＨＭＬ５、ＨＭＬ１０、ＨＭＬ６、ＨＭＬ９、ＭＭＴＶ、ＦＬＶ、ＰＥＲＶ、ＢＬＶ、ＥＩＡＶ、ＪＳＲＶ、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−７１６３４６２、ｇｇ０１−ｃｈｒＵ−５２１９０７２５、ｇｇ０１−Ｃｈｒ４−４８１３０８９４、ＡＬＶ、ｇｇ０１−ｃｈｒ１−１５１６８８４５、ｇｇ０１−ｃｈｒ４−７７３３８２０１、ｇｇ０１−ＣｈｒＵ−１６３５０４８６９、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−５７３３７８２、インドニシキヘビ（Ｐｙｔｈｏｎ−ｍｏｌｕｒｕｓ）、ＷＤＳＶ、ＳｎＲＶ、Ｘｅｎ１、Ｇｙｐｓｙ及びＴｙ１から選択される内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）の遺伝子である、請求項９６に記載の方法。
  98. 標的遺伝子が、Ｃ血清型アデノウイルス、トリアデノウイルス、トリアデノウイルス随伴ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−４（ＥＢＶ）及びサーコウイルスからなる群から選択される潜在ウイルスの遺伝子である、請求項９６に記載の方法。
  99. 潜在ウイルスがサーコウイルスであり、かつ標的遺伝子がブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）又はサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のｒｅｐ遺伝子である、請求項９８に記載の方法。
  100. 潜在ウイルスがＥＢＶであり、かつ標的遺伝子が潜在膜タンパク質（ＬＭＰ）−２Ａである、請求項９８に記載の方法。
  101. 標的遺伝子が、外来性レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、ヒトＴ細胞リンパ指向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ヒト肝炎Ａ型（ＨＨＡ）、ＨＨＢ、ＨＨＣ、ヒトサイトメガロウイルス、ＥＢＶ、ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ６）、ＨＨＶ７、ＨＨＶ８、ヒトパルボウイルスＢ１９、レオウイルス、ポリオーマ（ＪＣ／ＢＫ）ウイルス、ＳＶ４０、ヒトコロナウイルス、パピローマウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザＡ型、Ｂ型及びＣ型ウイルス、ヒトエンテロウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ベシウイルス、ブタサーコウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス、ブタパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス、レオウイルス、狂犬病ウイルス、レポリポックスウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ハンターンウイルス、マルブルグウイルス、ＳＶ２０、セムリキ森林ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ブタパルボウイルス、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、マウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ）、タイラー脳脊髄炎ウイルス、ネズミ微小ウイルス、マウスアデノウイルス（ＭＡＶ）；マウスサイトメガロウイルス、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）、キルハムラットウイルス、トゥーランＨ−１ウイルス、センダイウイルス、ラットコロナウイルス、偽性狂犬病ウイルス、カシェ渓谷ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシアデノウイルス、ウシパルボウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ウシヘルペスウイルス、ウシレオウイルス、ブルータングウイルス、ウシポリオーマウイルス、ウシサーコウイルス、牛痘、牛痘以外のオルトポックスウイルス、偽牛痘ウイルス及びレポリポックスウイルスからなる群から選択される外来ウイルスの遺伝子である、請求項９６に記載の方法。
  102. 標的遺伝子が、内在性ウイルス、潜在ウイルス又は外来ウイルスのための宿主細胞結合リガンドである、請求項９６に記載の方法。
  103. 標的遺伝子が、ＳＬＣ３５Ａ１、Ｇｎｅ、Ｃｍａｓ、Ｂ４ＧａｌＴ１又はＢ４ＧａｌＴ６である、請求項１０２に記載の方法。
  104. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＦＵＴ８、ＴＳＴＡ３及びＧＭＤＳからなる群から選択され、かつ発現の調節が、フコシル化を調節することによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  105. 宿主細胞を、シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を標的とする少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程をさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
  106. シアリルトランスフェラーゼが、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ５、ＳＴ６（α−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−β−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ６及びＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２からなる群から選択される、請求項１０５に記載の方法。
  107. 少なくとも一つの標的遺伝子が、グルタミナーゼ及びグルタミンデヒドロゲナーゼからなる群から選択され、かつ発現の調節が、アンモニア増強を調節することによって細胞における免疫原性作用物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  108. 宿主細胞を、グルタミナーゼの発現を調節する少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程をさらに含む、請求項１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
  109. 宿主細胞を、グルタミンシンテターゼの発現を調節する少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程をさらに含む、請求項１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. その一部分が宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と、宿主細胞を培養するのに適した細胞培地とを含む組成物であって、ＲＮＡエフェクター分子が標的遺伝子の発現を調節可能であり、かつ発現の調節が免疫原性作用物質の産生を高めるとともに、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、配列番号９７７２〜３１５２３３９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである組成物。
  111. ２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含み、前記２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子がそれぞれ異なる標的遺伝子と相補的である、請求項１１０に記載の組成物。
  112. 複数のＲＮＡエフェクター分子を含む組成物であって、それぞれのＲＮＡエフェクター分子の一部分が宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的であり、かつ組成物がＢａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨの発現を調節可能であるとともに、発現の調節が免疫原性作用物質の産生を高める組成物。
  113. 少なくとも一つの追加のＲＮＡエフェクター分子又は作用物質をさらに含む、請求項１１０又は１１２に記載の組成物。
  114. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子がｓｉＲＮＡである、請求項１１０又は１１２に記載の組成物。
  115. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が二重鎖領域を含む、請求項１１０又は１１２に記載の組成物。
  116. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が１５〜３０ヌクレオチド長である、請求項１１０又は１１２に記載の組成物。
  117. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が１７〜２８ヌクレオチド長である、請求項１１０又は１１２に記載の組成物。
  118. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が修飾ヌクレオチドを含む、請求項１１０又は１１２に記載の組成物。
  119. 細胞培地が血清非含有培地である、請求項１１０に記載の組成物。
  120. 組成物が非脂質製剤に製剤化される、請求項１１０〜１１９のいずれか一項に記載の組成物。
  121. 組成物が脂質製剤に製剤化される、請求項１１０〜１１９のいずれか一項に記載の組成物。
  122. 製剤中の脂質が陽イオン性又は非イオン性脂質を含む、請求項１２１に記載の組成物。
  123. 組成物が、さらに一つ又はそれ以上の細胞培養培地補助物質を含む、請求項１１０〜１２２のいずれか一項に記載の組成物。
  124. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、ｄｓＲＮＡが相互に相補的である少なくとも２つの配列からなり、センス鎖が第一の配列からなり、アンチセンス鎖が標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である相補性の領域を含む第二の配列からなり、かつ相補性の領域が１０〜３０ヌクレオチド長である、請求項１１０〜１２３のいずれか一項に記載の組成物。
  125. 培養細胞による免疫原性作用物質の産生を高めるキットであって、
    （ａ）免疫原性作用物質が産生される条件下で細胞を培養するのに適した一つ又はそれ以上のアッセイ表面を含む支持体、
    （ｂ）一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子であって、それぞれのＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は標的遺伝子と相補的であるＲＮＡエフェクター分子、及び
    （ｃ）免疫原性作用物質又はその細胞による産生を検出するための試薬
    を含み、一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、配列番号９７７２〜３１５２３３９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであるキット。
  126. 一つ又はそれ以上のアッセイ表面が、さらに宿主細胞の増殖及び維持を支持するための基材を含む、請求項１２５に記載のキット。
  127. 一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が支持体表面に沈着している、請求項１２５に記載のキット。
  128. 宿主細胞によるＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進するための担体をさらに含む、請求項１２５に記載のキット。
  129. 担体が陽イオン性脂質組成物を含む、請求項１２８に記載のキット。
  130. 担体が支持体表面に沈着している、請求項１２８に記載のキット。
  131. 宿主細胞を培養するのに適した細胞培養培地をさらに含む、請求項１２５に記載のキット。
  132. 一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子の存在下で宿主細胞を培養し、細胞を免疫原性作用物質の産生についてアッセイするための取扱説明書をさらに含む、請求項１２５に記載のキット。
  133. 培養細胞による免疫原性作用物質の産生を最適化するためのキットであって、
    （ａ）免疫原性作用物質が産生される条件下で細胞を培養するのに適した複数のアッセイ表面を含むマイクロアレイ支持体、
    （ｂ）一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子であって、それぞれのＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は標的遺伝子と相補的であるＲＮＡエフェクター分子、及び
    （ｃ）免疫原性作用物質の産生に対する一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子の効果を検出するための試薬
    を含み、一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、配列番号９７７２〜３１５２３３９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチを有するアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであるキット。
  134. 支持体がマルチウェルプレート又はバイオチップである、請求項１３３に記載のキット。
  135. 支持体が二次元マイクロアレイプレート又はバイオチップある、請求項１３３に記載のキット。
  136. 一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が支持体のアッセイ表面に沈着している、請求項１３３に記載のキット。
  137. 複数の異なるＲＮＡエフェクター分子が、マイクロアレイの第一の寸法にわたってアッセイ表面に沈着している、請求項１３５に記載のキット。
  138. 複数のＲＮＡエフェクター分子が、それぞれ異なる標的遺伝子と相補的である、請求項１３７に記載のキット。
  139. 異なる標的遺伝子が、Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨである、請求項に記載のキット。
  140. 複数のＲＮＡエフェクター分子が、それぞれ同じ標的遺伝子の異なる領域と相補的である、請求項１３７に記載のキット。
  141. 複数を含むＲＮＡエフェクター分子のそれぞれが、マイクロアレイの第二の寸法に沿ったアッセイ表面に様々な濃度で沈着している、請求項１３７に記載のキット。
  142. その一部分が標的遺伝子と相補的であるＲＮＡエフェクター分子が、ヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む対応ｓｉＲＮＡであり、前記ヌクレオチド配列が本明細書中の表に記載のものである、請求項１〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
  143. 脂質製剤が、次式：
    Figure 2014501489
     ｛式中：
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれの存在についてそれぞれ独立して、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルコキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニルオキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニルオキシ、又は任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アシルであり；
    Figure 2014501489
     は、Ｌ２とＬ１の間の結合を表し、この結合は：
    （１）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子との間の単結合であり〔この場合、
    Ｌ１は、Ｃ（Ｒｘ）、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｑ）であり；
    Ｌ２は、−ＣＲ５Ｒ６−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、又は−Ｃ（Ｏ）−である〕；
    （２）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子との間の二重結合であり〔この場合、
    Ｌ１は、Ｃであり；
    Ｌ２は、−ＣＲ５＝、−Ｎ（Ｑ）＝、−Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝である〕；
    （３）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子との間の単結合、及びＬ２の第二の原子とＬ１の第一の原子との間の単結合であり〔この場合、
    Ｌ１は、Ｃであり；
    Ｌ２は、次式：
    Figure 2014501489
     を有し、式中のＸはＬ２の第一の原子であり、ＹはＬ２の第二の原子であり、−−−−−はＬ１の第一の原子に対する単結合を表し、かつＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
    Ｚ１及びＺ４は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
    Ｚ２は、ＣＨ又はＮであり；
    Ｚ３は、ＣＨ又はＮであり；
    あるいは、Ｚ２とＺ３は、一緒になって、単一のＣ原子であり；
    Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
    それぞれのＺは、Ｎ、Ｃ（Ｒ５）、又はＣ（Ｒ３）であり；
    ｋは、０、１、又は２であり；
    それぞれのｍは、独立して０〜５であり；
    それぞれのｎは、独立して０〜５であり；
    この場合、ｍとｎは、一緒になって３、４、５、６、７又は８員環を生じる〕；
    （４）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子との間の単結合、及びＬ２の第一の原子とＬ１の第二の原子との間の単結合であり〔この場合、
    （Ａ）Ｌ１は、次式：
    Figure 2014501489
     を有し、式中のＸはＬ１の第一の原子であり、ＹはＬ１の第二の原子であり、−−−−−はＬ２の第一の原子に対する単結合を表し、かつＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
    Ｔ１は、ＣＨ又はＮであり；
    Ｔ２は、ＣＨ又はＮであり；
    あるいは、Ｔ１とＴ２は、一緒になって、Ｃ＝Ｃであり；
    Ｌ２は、ＣＲ５であるか；又は
    （Ｂ）Ｌ１は、次式：
    Figure 2014501489
     を有し、式中のＸはＬ１の第一の原子であり、ＹはＬ１の第二の原子であり、−−−−−はＬ２の第一の原子に対する単結合を表し、かつＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
    Ｔ１は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
    Ｔ２は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
    Ｌ２は、ＣＲ５又はＮである〕；
    Ｒ３は、次式：
    Figure 2014501489
     を有し、式中、
    Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４のそれぞれは、独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、又はアルキニルであるか；あるいは、
    Ｙ１、Ｙ２及びＹ３のうち任意の２つは、これらと結合しているＮ原子と一緒になって３〜８員複素環を形成するか；あるいは、
    Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、全てがこれらと結合しているＮ原子と一緒になって二環式５〜１２員複素環を形成し；
    それぞれのＲｎは、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；
    Ｌ３は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
    Ｌ４は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
    Ｌ５は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
    Ｒ５及びＲ６のそれぞれの存在は、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；あるいは、隣り合った炭素原子上の２個のＲ５基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で二重結合を形成するか；又は隣り合った炭素原子上の２個のＲ５基と、隣り合った同じ炭素原子上の２個のＲ６基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で三重結合を形成し；
    それぞれのａは、独立して、０、１、２、又は３であり；
    この場合、
    Ｌ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基は、任意にＬ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基と一緒になって、３〜８員シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリール基を形成し；かつ
    Ｙ１、Ｙ２及びＹ３のうち任意の一つは、任意にＬ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６基、及びこれらと結合している原子と一緒になって、３〜８員ヘテロシクリル基を形成し；
    それぞれのＱは、独立して、Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり；かつ
    それぞれのＱ２は、独立してＯ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）（Ｑ）、アルキル又はアルコキシである｝
    を有する脂質を含む、請求項１２１に記載の方法。
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