CN111254145A - 用于调节tau表达的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于使用Tau反义化合物调节动物中Tau mRNA的剪接的方法。本文还公开了用于使用Tau反义化合物降低动物中Tau mRNA和蛋白的表达的方法。所述化合物和方法适用于治疗、预防或改善有此需要的个体内的神经变性疾病。可使用Tau反义寡核苷酸的施用来治疗、预防和改善的神经变性疾病的实例包括阿尔茨海默氏病、额颞痴呆(FTD)、FTDP‑17、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、癫痫和Dravet综合征。

Description

用于调节TAU表达的组合物和方法
本申请是申请号为201480014009.6、申请日为2014年3月14日、发明名称为“用于调节TAU表达的组合物和方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2014/029752的国家阶段申请，该国际申请分别要求申请日为2013年3月14日、申请号为61/785,177，和申请日为2014年2月24日、申请号为61/943,931的美国申请的优先权。
序列表
本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表是提供为2014年3月14日建立的大小为约208KB的题为BIOL0220WOSEQ_ST25.txt的文档。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。
背景
1.领域
本文公开了涉及反义化合物生物化学、分子生物学和药物的领域的组合物和方法。本文描述的实施方案涉及用于通过抑制细胞和/或动物中的Tau表达或调节Tau剪接来治疗、预防或改善神经变性疾病的化合物、组合物和方法，所述神经变性疾病包括Tau蛋白病、阿尔茨海默氏病、额颞痴呆(FTD)、FTDP-17、进行性核上性麻痹(PSP)、慢性创伤性脑病(CTE)、皮质基底节变性(CBD)、癫痫和Dravet综合征。
2.描述
Tau的主要功能是结合并稳定微管，微管是涉及有丝***、胞质***和囊泡转运的细胞骨架的重要结构组分。Tau存在于多种组织中，但在神经元的轴突中特别丰富。在人体内，存在通过外显子2、3和10的可变剪接所产生的六种Tau同工型。蛋白质N端处外显子2和3的剪接导致零个、一个或两个29氨基酸酸性结构域的保留并且分别称作0N、1N或2N Tau。这些结构域对Tau功能的影响不完全明了，但可能在与质膜的相互作用方面起到作用。在C端的外显子10的保留导致由外显子10编码的微管结合结构域的保留。因为在Tau中的别处存在3个微管结合结构域，所以这个Tau同工型(包括有外显子10)被称为4R Tau，其中‘R’是指微管结合结构域的重复的数目。没有外显子10的Tau称为3R Tau。因为更多的微管结合结构域(4R相比于3R)增加了与微管的结合，所以4R Tau可能显著增加微管结合和组装。3R/4RTau之比是受发育调节的，其中胎儿组织只表达3R Tau，而成年人体组织表达大约相等水平的3R/4R Tau。偏离3R/4R Tau的正常比率是神经变性FTD Tau蛋白病的特征。尚不清楚如何改变成人动物中晚期阶段的3R/4R Tau比率将影响Tau蛋白病。
丝氨酸-苏氨酸定向的磷酸化调节Tau的微管结合能力。高度磷酸化促进Tau从微管脱离。对Tau的其它翻译后修饰已经得到描述，然而这些修饰的意义尚不清楚。Tau的磷酸化也是受发育调节的，其中胎儿组织中的磷酸化更高，而成人中的磷酸化要低很多。神经变性病症的一个特征是Tau磷酸化的异常增加。
微管网络涉及细胞内的许多重要过程，包括保持细胞形态和操作转运机器所需要的结构完整性。因为Tau与微管的结合使微管稳定，所以Tau可能是这些过程中的一些过程的关键介体，并且神经变性疾病中正常Tau的破坏可能破坏这些关键细胞过程中的一些过程。
对于Tau可能在神经变性综合征中具有重要性的一个早期指示是认识到Tau是阿尔茨海默氏病中神经纤维包涵体的关键组分。事实上，神经纤维包涵体是高度磷酸化的Tau蛋白的聚集体。神经纤维包涵体与含有β淀粉样蛋白的斑块一道是阿尔茨海默氏病的标志并且与认知损伤显著相关。AD中95％的Tau积累发生于神经元过程中并且被称作神经炎性营养不良。这种与微管结合的蛋白变得与微管脱离并形成蛋白积累的过程以及这与神经元毒性的关系尚未充分了解。
神经元Tau包涵体不仅是阿尔茨海默氏病的而且是额颞痴呆(FTD)亚群、PSP和CBD的病理特征。Tau与神经变性之间的联系因为发现Tau基因的突变导致FTD亚群而得到支持。这些遗传学数据也已经突出了Tau的3R:4R比率的重要性。许多引起FTD的Tau突变导致Tau剪接的变化，这种变化导致外显子10的优先保留并因此导致增加的4R Tau。总体Tau水平是正常的。是Tau同工型变化还是氨基酸变化还是两者都引起神经变性仍不可知。最近数据表明PSP也与增加的4R:3R Tau比率相关联并且因此可适用于类似的剪接策略。
为了帮助理解Tau比率对神经变性的影响，使用包括Tau启动子和外显子10的侧翼内含子序列的小基因生成了基于一种剪接Tau突变(N279K)的小鼠模型。和在人体内一样，这些小鼠展现了与表达WT Tau的转基因动物相比有所增加的4R Tau水平，并且发展出行为和运动异常以及大脑和脊髓中聚集Tau的积累。
蛋白“Tau”已经与大脑的多种疾病相关联，这些疾病包括阿尔茨海默氏病、额颞痴呆、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、拳击员痴呆、与染色体连锁的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结主导的痴呆、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅毒性脑病、结节性硬化症、哈-斯二氏病、皮克氏病、嗜银颗粒性疾病、皮质基底变性或额颞叶变性以及其它。Tau相关病症如AD是老年人痴呆的最常见原因。AD影响全世界估计1500万人和40％的85岁以上的人口。AD以两个病例标志为特征：Tau神经纤维包涵体(NFT)和β淀粉样蛋白(Aβ)斑块。
在中风发作病症中，大脑的电活动被周期性地扰动，导致一定程度的临时脑功能障碍。正常的大脑功能需要有序的、有组织的、协调的电脉冲放电。电脉冲使大脑能够与脊髓、神经和肌肉以及其自身内部进行通信。当大脑的电活动受到破坏时可导致中风发作。存在两种基本中风发作类型：癫痫性的和非癫痫性的。癫痫性中风发作没有明显原因或触发且重复发生。非癫痫性中风发作是受刺激大脑的病症或其它病状触发或驱使。某些精神病症可引起被称为精神性非癫痫性中风发作的中风发作症状。
已知阿尔茨海默氏病(AD)是迟发型中风发作的临床危险因素。多种AD小鼠模型概括了这种增加的中风发作敏感性。在过去5年内，已经在小鼠tau敲除(tau-/-)环境中研究了许多这样的AD模型。在这些淀粉样蛋白沉积的tau敲除动物系中，增加的中风发作敏感性得到改善。此外，有趣的是，单独的tau-/-表现出了针对化学诱导的中风发作的保护性。
抗惊厥药代表了中风发作的常用治疗方案。然而，抗惊厥药在具有中风发作病症的较大比例人群中是无效的并且对于这些个体，手术是唯一选项。鉴于缺乏可用于中风发作病症和神经变性疾病的治疗，本发明实施方案的某些方法提供用于通过抑制动物中的Tau表达或调节Tau剪接来治疗、预防或改善中风发作病症和神经变性疾病的方法。
概述
本文提供了用于调节细胞、组织和动物中的Tau mRNA紧接的方法。本文还提供了用于调节细胞、组织和动物中的Tau mRNA的表达产物的方法。
在某些实施方案中，可在细胞或组织中进行调节。在某些实施方案中，细胞或组织处于动物体内。在某些实施方案中，动物为人。在某些实施方案中，Tau mRNA水平降低。在某些实施方案中，Tau蛋白水平降低。在某些实施方案中，调节了Tau mRNA的剪接。在某些实施方案中，调节了Tau mRNA的表达产物。在某些实施方案中，促进了Tau外显子10的排除。在某些实施方案中，降低了Tau RNA或蛋白的4R同工型的表达。在某些实施方案中，增加了TauRNA或蛋白的3R同工型的表达。在某些实施方案中，降低了Tau RNA或蛋白的4R同工型的表达并且增加了Tau RNA或蛋白的3R同工型的表达。在某些实施方案中，减少了高度磷酸化的Tau。所述降低和调节可以时间依赖性方式或以剂量依赖性方式出现。
若干实施方案涉及降低或减少tau相关病症的一种或多种症状的方法。在某些实施方案中，症状为中风发作。在某些实施方案中，tau相关病症或神经变性病症为阿尔茨海默氏病、额颞痴呆、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、拳击员痴呆、与染色体连锁的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结主导的痴呆、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅毒性脑病、结节性硬化症、哈-斯二氏病、皮克氏病、嗜银颗粒性疾病、皮质基底变性或额颞叶变性。某些实施方案涉及一种减少具有高4R:3R tau同工型比率的受试者中的中风发作的方法。在某些实施方案中，所述方法包括向受试者施用反义药剂，其中所述药剂减少tau的表达或降低受试者的中枢神经***中的4R:3R tau比率。
还提供适用于预防、治疗和改善与Tau相关的疾病、病症和病状的方法。在某些实施方案中，所述与Tau相关的疾病、病症和病状是神经变性疾病。在某些实施方案中，神经变性疾病是阿尔茨海默氏病、额颞痴呆(FTD)、FTDP-17、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、癫痫或Dravet综合征中的任一种。在某些实施方案中，神经变性疾病的一种或多种症状被改善、预防或延迟(进展减慢)。在某些实施方案中，所述症状时记忆丧失、焦虑或运动功能丧失。在某些实施方案中，神经变性功能得到改善。在某些实施方案中，减少了神经纤维包涵体。
所述疾病、病症及病状可共同具有一个或多个风险因素、成因或结果。发展神经变性疾病的某些风险因素和成因包括遗传素质和年龄。
在某些实施方案中，治疗方法包括向有需要的个体施用Tau反义化合物。反义化合物可抑制Tau的表达或调解Tau的剪接。在某些实施方案中，反义化合物是单链反义寡核苷酸。在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸是与Tau核酸互补的。
在某些实施方案中，本发明提供了包含寡核苷酸的化合物。在某些实施方案中，所述寡核苷酸与Tau转录物互补。在某些所述实施方案中，寡核苷酸与包含外显子10的Tau转录物的靶区域互补。在某些所述实施方案中，寡核苷酸与包含邻近外显子10的内含子的Tau转录物的靶区域互补。在某些所述实施方案中，寡核苷酸与包含邻近外显子10且位于外显子10下游的内含子的Tau转录物的靶区域互补。在某些所述实施方案中，寡核苷酸与包含邻近外显子10且位于外显子10上游的内含子的Tau转录物的靶区域互补。在某些实施方案中，Tau转录物包含外显子10的外显子剪接沉默子。在某些实施方案中，寡核苷酸抑制外显子10的保留。在某些实施方案中，寡核苷酸促进外显子10的跳跃。在某些所述实施方案中，增加了3R Tau mRNA。在某些所述实施方案中，减少了具有外显子10mRNA的Tau mRNA。在某些实施方案中，减少了Tau蛋白的4R同工型。在某些实施方案中，增加了Tau蛋白的3R同工型。
在某些实施方案中，包括但不限于以上编号的实施方案中的任一种，Tau转录物是在人体内。在某些实施方案中，包括但不限于以上列出的实施方案中的任一种，Tau转录物是在小鼠体内。
本公开提供以下非限制性编号的实施方案：
实施方案1.一种包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸是由8至30个连接核苷组成且具有包含含有至少8个连续核碱基的互补区域的核碱基序列，所述互补区域与Tau转录物的等长度靶区域互补。
实施方案2.如实施方案1所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述互补区域与所述靶区域100％互补。
实施方案3.如实施方案1或2所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列的所述互补区域包含至少10个连续核碱基。
实施方案4.如实施方案1或2所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列的所述互补区域包含至少15个连续核碱基。
实施方案5.如实施方案1或2所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列的所述互补区域包含至少18个连续核碱基。
实施方案6.如实施方案1-5中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列，如在所述寡核苷酸的整个长度上所测量的，与所述Tau转录物的等长度区域为至少80％互补。
实施方案7.如实施方案1-5中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列，如在所述寡核苷酸的整个长度上所测量的，与所述Tau转录物的等长度区域为至少90％互补。
实施方案8.如实施方案1-5中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列，如在所述寡核苷酸的整个长度上所测量的，与所述Tau转录物的等长度区域为100％互补。
实施方案9.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在所述Tau转录物的外显子10之内。
实施方案10.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在所述Tau转录物的内含子9之内。
实施方案11.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在所述Tau转录物的内含子10之内。
实施方案12.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域包含一部分内含子9和一部分外显子10。
实施方案13.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域包含一部分外显子10和一部分内含子10。
实施方案14.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域包含一部分外显子10和在外显子10的5’末端的内含子的一部分。
实施方案15.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域包含一部分外显子10和在外显子10的3’末端的内含子的一部分。
实施方案16.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQID NO.:1的核碱基121708和核碱基122044之内。
实施方案17.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121796和核碱基122044之内。
实施方案18.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121796和核碱基121885之内。
实施方案19.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121873和核碱基121898之内。
实施方案20.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121869和核碱基121943之内。
实施方案21.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基122020和核碱基122044之内。
实施方案22.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121881和核碱基121898之内。
实施方案23.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121880和核碱基121897之内。
实施方案24.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121879和核碱基121896之内。
实施方案25.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121878和核碱基121895之内。
实施方案26.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121877和核碱基121894之内。
实施方案27.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121876和核碱基121893之内。
实施方案28.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121875和核碱基121892之内。
实施方案29.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121874和核碱基121891之内。
实施方案30.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121873和核碱基121890之内。
实施方案31.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列包含SEQ ID NO:8-200中的任一个的核碱基序列。
实施方案32.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列由SEQ ID NO:8-200中的任一个的核碱基序列组成。
实施方案33.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列包含SEQ ID NO:33、34、147、148、149、150、151、152或153中的任一个的核碱基序列。
实施方案34.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列由SEQ ID NO:33、34、147、148、149、150、151、152或153中的任一个的核碱基序列组成。
实施方案35.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列包含SEQ ID NO:31、33、34、35、36、37、45、72、79、82、83、97、106、107、112、113、130、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、157、158、160或200中的任一个的核碱基序列。
实施方案36.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列由SEQ ID NO:31、33、34、35、36、37、45、72、79、82、83、97、106、107、112、113、130、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、157、158、160或200中的任一个的核碱基序列组成。
实施方案37.如实施方案1-36中任一项所述的化合物，其中修饰寡核苷酸包含至少一个修饰核苷。
实施方案38.如实施方案37所述的化合物，其中至少一个修饰核苷包含修饰的糖部分。
实施方案39.如实施方案37所述的化合物，其中至少一个修饰的糖部分为2’-取代的糖部分。
实施方案40.如实施方案39所述的化合物，其中至少一个2’-取代的糖部分的2’-取代基选自：2’-OMe、2’-F和2’-MOE。
实施方案41.如实施方案39所述的化合物，其中至少一个2’-取代的糖部分的2’-取代基为2’-MOE。
实施方案42.如实施方案37-38中任一项所述的化合物，其中至少一个修饰的糖部分为双环糖部分。
实施方案43.如实施方案42所述的化合物，其中至少一个双环糖部分为LNA或cEt。
实施方案44.如实施方案37-43中任一项所述的化合物，其中至少一个糖部分为糖替代物。
实施方案45.如实施方案44所述的化合物，其中至少一个糖替代物为吗啉代。
实施方案46.如实施方案44所述的化合物，其中至少一个糖替代物为修饰吗啉代。
实施方案47.如实施方案1-46中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少5个修饰核苷，所述修饰核苷各自独立地包含修饰的糖部分。
实施方案48.如实施方案47所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少10个修饰核苷，所述修饰核苷各自独立地包含修饰的糖部分。
实施方案49.如实施方案47所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少15个修饰核苷，所述修饰核苷各自独立地包含修饰的糖部分。
实施方案50.如实施方案47所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷为修饰核苷并且各自独立地包含修饰的糖部分，其中每个修饰核苷的所述修饰的糖部分各自彼此相同。
实施方案51.如实施方案47所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷为修饰核苷，所述修饰核苷各自独立地包含修饰的糖部分。
实施方案52.如实施方案1-51中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少两个修饰核苷，所述修饰核苷包含彼此相同的修饰的糖部分。
实施方案53.如实施方案1-52中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少两个修饰核苷，所述修饰核苷包含彼此不同的修饰的糖部分。
实施方案54.如实施方案1-53中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含含有至少5个连续修饰核苷的修饰区域。
实施方案55.如实施方案54所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含含有至少10个连续修饰核苷的修饰区域。
实施方案56.如实施方案54所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含含有至少15个连续修饰核苷的修饰区域。
实施方案57.如实施方案54所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含含有至少18个连续修饰核苷的修饰区域。
实施方案58.如实施方案54所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含含有至少20个连续修饰核苷的修饰区域。
实施方案59.如实施方案53-58中任一项所述的化合物，其中所述修饰区域的每个修饰核苷具有修饰的糖部分，所述修饰的糖部分独立地选自：2’-F、2’-OMe、2’-MOE、cEt、LNA、吗啉代和修饰吗啉代。
实施方案60.如实施方案54-59中任一项所述的化合物，其中所述修饰区域的所述修饰核苷各自包含彼此相同的修饰。
实施方案61.如实施方案60所述的化合物，其中所述修饰区域的所述修饰核苷各自包含相同的2’-取代的糖部分。
实施方案62.如实施方案61所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷的所述2’-取代的糖部分选自2’-F、2’-OMe和2’-MOE。
实施方案63.如实施方案61所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷的所述2’-取代的糖部分为2’-MOE。
实施方案64.如实施方案59所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷各自包含相同的双环糖部分。
实施方案65.如实施方案64所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷的所述双环糖部分选自LNA和cEt。
实施方案66.如实施方案59所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷各自包含糖替代物。
实施方案67.如实施方案66所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷的所述糖替代物为吗啉代。
实施方案68.如实施方案66所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷的所述糖替代物为修饰吗啉代。
实施方案69.如实施方案1-68中任一项所述的化合物，其中所述修饰核苷酸包含不超过4个连续的天然存在核苷。
实施方案70.如实施方案1-68中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷均为修饰核苷。
实施方案71.如实施方案70所述的化合物，其中每个修饰核苷包含修饰的糖部分。
实施方案72.如实施方案71所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述修饰核苷包含彼此相同的修饰。
实施方案73.如实施方案72所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述修饰核苷各自包含相同的2’-取代的糖部分。
实施方案74.如实施方案73所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述2’-取代的糖部分选自2’-F、2’-OMe和2’-MOE。
实施方案75.如实施方案74所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述2’-取代的糖部分为2’-MOE。
实施方案76.如实施方案72所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述修饰核苷各自包含相同的双环糖部分。
实施方案77.如实施方案76所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述双环糖部分选自LNA和cEt。
实施方案78.如实施方案72所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述修饰核苷各自包含糖替代物。
实施方案79.如实施方案78所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述糖替代物为吗啉代。
实施方案80.如实施方案78所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述糖替代物为修饰吗啉代。
实施方案81.如实施方案1至36中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有A-B2-A-B2-A-B2-A-B2-A-B2-A-B2-A2基序，其中每个A包含双环糖部分，并且其中每个B选自2’-取代的糖部分和未修饰的2’-脱氧糖部分。
实施方案82.如实施方案81所述的化合物，其中每个A为cEt糖部分。
实施方案83.如实施方案81所述的化合物，其中每个A为LNA糖部分。
实施方案84.如实施方案81至83中任一项所述的化合物，其中每个B为未修饰的2’-脱氧糖部分。
实施方案85.如实施方案81至83中任一项所述的化合物，其中每个B为2’-MOE糖部分。
实施方案86.如实施方案1-85中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联。
实施方案87.如实施方案86所述的化合物，其中每个核苷间键联为修饰的核苷间键联。
实施方案88.如实施方案86或87所述的化合物，其包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键联。
实施方案89.如实施方案1-85中任一项所述的化合物，其中每个核苷间键联为修饰的核苷间键联并且其中每个核苷间键联包含相同的修饰。
实施方案90.如实施方案89所述的化合物，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
实施方案91.如实施方案86所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少4个磷酸二酯核苷间键联。
实施方案92.如实施方案86所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少5个磷酸二酯核苷间键联。
实施方案93.如实施方案86所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少6个磷酸二酯核苷间键联。
实施方案94.如实施方案86所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少7个磷酸二酯核苷间键联。
实施方案95.如实施方案91至94中任一项所述的化合物，其中每个剩余的核苷间键联为磷酸二酯核苷间键联。
实施方案96.如实施方案1-85中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有NSNSNONSNONSNONSNONSNONSNONSNONSNSN核苷间键联基序，其中每个N代表核苷，每个S代表硫代磷酸酯核苷间键联，并且每个O代表磷酸二酯核苷间键联。
实施方案97.如实施方案1-85中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有NSNONONONSNSNSNSNSNSNSNSNONONONSNSN核苷间键联基序，其中每个N代表核苷，每个S代表硫代磷酸酯核苷间键联，并且每个O代表磷酸二酯核苷间键联。
实施方案98.如实施方案1-97中任一项所述的化合物，其包含至少一个缀合物。
实施方案99.如实施方案1-98中任一项所述的化合物，其由所述修饰寡核苷酸组成。
实施方案100.如实施方案1-99中任一项所述的化合物，其中所述化合物调节所述Tau转录物的剪接。
实施方案101.如实施方案1-99中任一项所述的化合物，其中所述化合物降低所述4R Tau同工型的表达。
实施方案102.如实施方案1-99中任一项所述的化合物，其中所述化合物降低包含外显子10的Tau mRNA的表达。
实施方案103.如实施方案1-99中任一项所述的化合物，其中所述化合物降低包含由外显子10mRNA编码的氨基酸的Tau蛋白的表达。
实施方案104.如实施方案1-8或30-103中任一项所述的化合物，其具有包含SEQID NO.8-200中所列出的序列中的任一个的核碱基序列。
实施方案105.如实施方案1-8或30-103中任一项所述的化合物，其具有包含SEQID NO.33、34、147、148、149、150、151、152或153中所列出的序列中的任一个的核碱基序列。
实施方案106.如实施方案1-8或30-103中任一项所述的化合物，其具有由SEQ IDNO.8-200中所列出的序列中的任一个组成的核碱基序列。
实施方案107.如实施方案1-8或30-103中任一项所述的化合物，其具有由SEQ IDNO.33、34、147、148、149、150、151、152或153中所列出的序列中的任一个组成的核碱基序列。
实施方案108.一种双链化合物，其包含如实施方案1-107中任一项所述的化合物。
实施方案109.一种化合物，其由ISIS 670011组成。
实施方案110.一种化合物，其由ISIS 670012组成。
实施方案111.一种化合物，其由ISIS 670013组成。
实施方案112.一种化合物，其由ISIS 670014组成。
实施方案113.一种化合物，其由ISIS 670015组成。
实施方案114.一种化合物，其由ISIS 670016组成。
实施方案115.一种化合物，其由ISIS 670017组成。
实施方案116.一种化合物，其由ISIS 670018组成。
实施方案117.一种化合物，其由ISIS 670019组成。
实施方案118.一种化合物，其由ISIS 670020组成。
实施方案119.一种化合物，其由ISIS 670021组成。
实施方案120.一种化合物，其由ISIS 670022组成。
实施方案121.一种化合物，其由ISIS 670023组成。
实施方案122.一种化合物，其由ISIS 670024组成。
实施方案123.一种化合物，其由ISIS 670025组成。
实施方案124.一种化合物，其由ISIS 670026组成。
实施方案125.一种化合物，其由ISIS 670027组成。
实施方案126.一种化合物，其由ISIS 670028组成。
实施方案127.一种化合物，其由ISIS 678329组成。
实施方案128.一种化合物，其由ISIS 678330组成。
实施方案129.一种化合物，其由ISIS 678331组成。
实施方案130.一种化合物，其由ISIS 678332组成。
实施方案131.一种化合物，其由ISIS 678333组成。
实施方案132.一种化合物，其由ISIS 678334组成。
实施方案133.一种化合物，其由ISIS 693840组成。
实施方案134.一种化合物，其由ISIS 693841组成。
实施方案135.一种化合物，其由ISIS 693842组成。
实施方案136.一种化合物，其由ISIS 693843组成。
实施方案137.一种化合物，其由ISIS 693844组成。
实施方案138.一种化合物，其由ISIS 693845组成。
实施方案139.一种化合物，其由ISIS 693846组成。
实施方案140.一种化合物，其由ISIS 693847组成。
实施方案141.一种化合物，其由ISIS 693848组成。
实施方案142.一种化合物，其由ISIS 693849组成。
实施方案143.一种化合物，其由ISIS 549577组成。
实施方案144.一种化合物，其由ISIS 549580组成。
实施方案145.一种化合物，其由ISIS 549581组成。
实施方案146.一种化合物，其由ISIS 549582组成。
实施方案147.一种化合物，其由ISIS 549583组成。
实施方案148.一种化合物，其由ISIS 549584组成。
实施方案149.一种化合物，其由ISIS 549585组成。
实施方案150.一种化合物，其由ISIS 549586组成。
实施方案151.一种化合物，其由ISIS 617341组成。
实施方案152.一种化合物，其由ISIS 617351组成。
实施方案153.一种化合物，其由ISIS 617352组成。
实施方案154.一种化合物，其由ISIS 617353组成。
实施方案155.一种化合物，其由ISIS 617358组成。
实施方案156.一种化合物，其由ISIS 617360组成。
实施方案157.一种化合物，其由ISIS 617361组成。
实施方案158.一种化合物，其由ISIS 617362组成。
实施方案159.一种调节细胞中的Tau转录物的剪接的方法，其包括使所述细胞与如实施方案1-158中任一项所述的化合物接触。
实施方案160.如实施方案158所述的方法，其中所述细胞在体外。
实施方案161.如实施方案158所述的方法，其中所述细胞在动物中。
实施方案162.一种调节细胞中的Tau蛋白的表达的方法，其包括使所述细胞与如实施方案1-158中任一项所述的化合物接触。
实施方案163.如实施方案162所述的方法，其中使Tau蛋白的4R同工型的表达减少。
实施方案164.如实施方案162所述的方法，其中使Tau蛋白的3R同工型的表达增加。
实施方案165.如实施方案162至164中任一项所述的方法，其中所述细胞在体外。
实施方案166.如实施方案162至164中任一项所述的方法，其中所述细胞在动物中。
实施方案167.一种减少或改善与tau相关病症相关联的一种或多种症状的方法，其包括使细胞与如实施方案1-158中任一项所述的化合物接触。
实施方案168.如实施方案167所述的方法，其中所述症状为中风发作。
实施方案169.如实施方案167-168中任一项所述的方法，其中所述细胞在动物中。
实施方案170.一种药物组合物，其包含如实施方案1-158中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
实施方案171.如实施方案170所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体或稀释剂是无菌盐水。
实施方案172.一种方法，其包括向动物施用如实施方案170或171所述的药物组合物。
实施方案173.如实施方案172所述的方法，其中所述施用是通过注射。
实施方案174.如实施方案172或173所述的方法，其中所述施用是全身性的。
实施方案175.如实施方案172或173所述的方法，其中所述施用是向CNS施用。
实施方案176.如实施方案172-175中任一项所述的方法，其中所述动物具有与一种或多种tau相关病症相关联的一种或多种症状。
实施方案177.如实施方案176所述的方法，其中所述施用导致与一种或多种tau相关病症相关联的一种或多种症状的改善。
实施方案178.如实施方案172-175中任一项所述的方法，其中所述动物具有与阿尔茨海默氏病相关联的一种或多种症状。
实施方案179.如实施方案178所述的方法，其中所述施用导致与阿尔茨海默氏病相关联的一种或多种症状的改善。
实施方案180.如实施方案172-179中任一项所述的方法，其中所述动物为小鼠。
实施方案181.如实施方案172-179中任一项所述的方法，其中所述动物为人。
实施方案182.如实施方案1至158中任一项所述的化合物或实施方案170-171所述的组合物的用途，其用于制备用于治疗tau相关病症的药物。
实施方案183.如实施方案1至158中任一项所述的化合物或实施方案170-171所述的组合物的用途，其用于制备用于改善与tau相关病症相关联的一种或多种症状的药物。
实施方案184.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述核碱基序列不由SEQ ID NO.:45、66、68、69或200中所列出的核碱基序列组成。
实施方案185.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述核碱基序列不由核碱基序列CCAGCTTCTTATTAATTATC或TAAGATCCAGCTTCTTATTA组成。
实施方案186.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121828和核碱基121847之内。
实施方案187.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121834和核碱基121853之内。
实施方案188.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121840和核碱基121859之内。
实施方案189.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121924和核碱基121941之内。
实施方案190.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121012和核碱基121029之内。
实施方案191.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121020和核碱基121037之内。
实施方案192.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121024和核碱基121041之内。
附图简述
图1示出Tau同工型的图形表示。同工型可在微管蛋白结合结构域的数目(位于蛋白的C-端半部中的三个或四个重复)方面彼此不同并且分别被称为3R或4R Tau同工型。它们也可在蛋白的N-端部分处是否存在一个或两个29氨基酸长的高度酸性***物(突出结构域)方面有所不同。在突出结构域与微管结合结构域之间存在碱性富脯氨酸区。
详述
除非提供确切的定义，否则结合本文所描述的分析化学、合成有机化学和医药化学所使用的命名法和这些化学领域的工序和技术为本领域熟知和常用的那些。标准技术可用于化学合成和化学分析。某些此类技术和程序可见于“Carbohydrate Modifications inAntisense Research”，Sangvi和Cook编，美国化学学会，Washington D.C.,1994；“Remington's Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,第21版,2005；和“Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications”，Stanley T.Crooke编,CRC Press,Boca Raton,Florida；和Sambrook等，“MolecularCloning,A laboratory Manual,”第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989，所述文献出于任何目的而以引用方式并入本文。如果允许，本公开通篇提及的所有专利、申请、已公布的申请和其它出版物以及其它数据以引用的方式整体并入本文。
除非另外指出，否则以下术语具有以下含义：
如本文所使用，“核苷”意指包含核碱基部分和糖部分的化合物。核苷包括但不限于天然存在的核苷(如在DNA和RNA中发现的)和修饰核苷。核苷可连接至磷酸部分。
如本文所使用，“化学修饰”意指当与天然存在的对应物相比时化合物的化学差异。就寡核苷酸而言，化学修饰不包括仅在核碱基序列上的差异。寡核苷酸的化学修饰包括核苷修饰(包括糖部分修饰和核碱基修饰)和核苷间键联修饰。
如本文所使用，“呋喃糖基”意指包含5元环的结构，所述5元环包含四个碳原子和一个氧原子。
如本文所使用，“天然存在的糖部分”意指如在天然存在的RNA中发现的呋喃核糖基或如在天然存在的DNA中发现的脱氧呋喃核糖基。
如本文所使用，“糖部分”意指核苷的天然存在的糖部分或修饰的糖部分。
如本文所使用，“修饰糖部分”意指取代的糖部分、双环或三环糖部分或糖替代物。
如本文所使用，“取代的糖部分”意指包含不同于天然存在的糖部分的至少一个取代基基团的呋喃糖基。取代的糖部分包括但不限于在2’-位、3’-位、5’-位和/或4’-位上包含取代基的呋喃糖基。
如本文所使用，“2’-取代的糖部分”意指在2’-位上包含除H或OH之外的取代基的呋喃糖基。除非另外指出，否则2’-取代的糖部分不是双环糖部分(即，2’-取代的糖部分的2’-取代基与呋喃糖基环的另一个原子不形成桥联。
如本文所使用，“MOE”意指-OCH2CH2OCH3。
如本文所使用，“双环糖部分”意指包含4至7元环的修饰的糖部分(包括但不限于呋喃糖基)，所述糖部分包含连接4至7元环的两个原子以形成第二个环，从而产生双环结构的桥联。在某些实施方案中，4至7元环为糖环。在某些实施方案中，4至7元环为呋喃糖基。在某些所述实施方案中，桥联连接了呋喃糖基的2’-碳和4’-碳。
如本文所使用，术语“糖替代物”意指不包含呋喃糖基并且能够替代核苷的天然存在的糖部分以使得所产生的核苷能够(1)结合到寡核苷酸中和(2)与互补核苷杂交的一种结构。所述结构包括如下环：所述环包含与呋喃糖基(例如，4元环、6元环或7元环)不同的原子数；用非氧原子(例如，碳、硫或氮)替代呋喃糖基的氧；或原子数和氧替代均有所变化。所述结构还可包含对应于对于取代的糖部分所描述的那些取代的取代(例如，任选包含另外取代基的6元碳环双环糖替代物)。糖替代物还包括更复杂的糖代替物(例如，肽核酸的非环***)。糖替代物包括但不限于吗啉代、修饰吗啉代、环己烯基和环己六醇。
如本文所使用，“核苷酸”意指还包含磷酸酯连接基团的核苷。如本文所使用，“连接核苷”可或可不通过磷酸酯键联连接并且因此包括但不限于“连接的核苷酸”。如本文所使用，“连接核苷”为以连续顺序连接的核苷(即，在那些连接的核苷之间不存在另外的核苷)。
如本文所使用，“核碱基”意指可连接至糖部分以形成能够掺入到寡核苷酸中的核苷的原子基团，并且其中原子基团能够与另一个寡核苷酸或核酸的互补的天然存在的核碱基键合。核碱基可为天然存在的或可为修饰的。
如本文所使用，“杂环碱基”或“杂环核碱基”意指包含杂环结构的核碱基。
如本文所使用，术语“未修饰的核碱基”或“天然存在的核碱基”意指RNA或DNA的天然存在的杂环核碱基：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基C)和尿嘧啶(U)。
如本文所使用，“修饰核碱基”意指并非天然存在的核碱基的任何核碱基。
如本文所使用，“修饰核苷”意指与天然存在的RNA或DNA核苷相比包含至少一个化学修饰的核苷。修饰核苷包含修饰的糖部分和/或修饰的核碱基。
如本文所使用，“双环核苷”或“BNA”意指包含双环糖部分的核苷。
如本文所使用，“约束的乙基核苷”或“cEt”意指包含双环糖部分的核苷，所述双环糖部分包含4’-CH(CH3)-O-2’桥联。
如本文所使用，“锁核酸核苷”或“LNA”意指包含双环糖部分的核苷，所述双环糖部分包含4’-CH2-O-2’桥联。
如本文所使用，“2’-取代的核苷”意指在2’-位上包含除H或OH之外的取代基的核苷。除非另外指出，否则2’-取代的核苷不是双环核苷。
如本文所使用，“2’-脱氧核苷”意指包含如在天然存在的脱氧核糖核苷(DNA)中所发现的2’-H呋喃糖基糖部分的核苷。在某些实施方案中，2’-脱氧核苷可包含修饰的核碱基或可包含RNA核碱基(例如，尿嘧啶)。
如本文所使用，“寡核苷酸”意指包含多个连接核苷的化合物。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个未修饰的核糖核苷(RNA)和/或未修饰的脱氧核糖核苷(DNA)和/或一个或多个修饰核苷。
如本文所使用，“寡核苷”意指其中没有核苷间键联含有磷原子的寡核苷酸。如本文所使用，寡核苷酸包含寡核苷。
如本文所使用，“修饰寡核苷酸”意指包含至少一个修饰核苷和/或至少一个修饰的核苷间键联的寡核苷酸。
如本文所使用，“核苷间键联”意指寡核苷酸中相邻核苷之间的共价键联。
如本文所使用，“天然存在的核苷间键联”意指3'至5'磷酸二酯键联。
如本文所使用，“修饰的核苷间键联”意指除了天然存在的核苷间键联之外的任何核苷间键联。
如本文所使用，“低聚化合物”意指包含两个或更多个子结构的聚合结构。在某些实施方案中，低聚化合物包含寡核苷酸。在某些实施方案中，低聚化合物包含一个或多个缀合物基团和/或端基。在某些实施方案中，低聚化合物由寡核苷酸组成。
如本文所使用，“端基”意指连接至寡核苷酸的3’末端或5’末端中的任一或两者的一个或多个原子。在某些实施方案中，端基为缀合物基团。在某些实施方案中，端基包含一个或多个端基核苷。
如本文所使用，“缀合物”意指结合至寡核苷酸或低聚化合物的原子或原子基团。通常，缀合物基团改变它们所连接至的化合物的一种或多种性质，包括但不限于药效学、药物代谢动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除性质。
如本文所使用，“缀合物连接基团”意指用于将缀合物连接至寡核苷酸或低聚化合物的原子或原子基团。
如本文所使用，“反义化合物”意指包含寡核苷酸或由寡核苷酸组成的化合物，所述寡核苷酸的至少一部分与其能够杂交的靶核酸互补，从而导致至少一种反义活性。
如本文所使用，“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测和/或可测量的变化。
如本文所使用，“检测”或“测量”意指用于进行检测或测量的测试或测定。所述检测和/或测量可能得到零值。因此，如果用于检测或测量的测试得到没有活性(活性为零)的发现，尽管如此，也已经进行了检测或测量活性的步骤。
如本文所使用，“可检测和/或可测量的活性”意指不为零的在统计学上显著的活性。
如本文所使用，“基本上未变化”意指具体地相对于变化更多的另一个参数，具体参数几乎没有或没有变化。在某些实施方案中，当参数变化小于5％时，所述参数基本上未变化。在某些实施方案中，如果参数变化小于两倍而另一个参数变化至少十倍，则所述参数基本上未变化。例如，在某些实施方案中，反义活性为靶核酸的量的变化。在某些所述实施方案中，如果非靶核酸的量比靶核酸的量变化的小得多，那么所述非靶核酸的量基本上未变化，但变化不必需为零。
如本文所使用，“表达”意指基因最终产生蛋白质的过程。表达包括但不限于转录、转录后修饰(例如，剪接、聚腺苷酸化、添加5’-帽)以及翻译。
如本文所使用，“靶核酸”意指反义化合物所杂交的核酸分子。
如本文所使用，“mRNA”意指编码蛋白的RNA分子。
如本文所使用，“前体mRNA”意指未完全加工成mRNA的RNA转录物。前体RNA包括一个或多个内含子。
如本文所使用，“转录物”意指由DNA转录而来的RNA分子。转录物包括但不限于mRNA、前体mRNA和部分加工RNA。
如本文所使用，“Tau转录物”意指由Tau基因转录而来的转录物。在某些实施方案中，Tau转录物由从核苷酸9240000至9381000截短的GENBANK登录号NT_010783.15(SEQ IDNO:1)或其变体代表。
如本文所使用，“Tau基因”意指编码Tau蛋白和任何Tau蛋白同工型的基因。在某些实施方案中，Tau蛋白同工型包括3R同工型和4R同工型。
如本文所使用，“3R”意指不包括外显子10的Tau转录物。
如本文所使用，“3R Tau同工型”意指不包括由外显子10编码的氨基酸的Tau蛋白同工型。
如本文所使用，“4R”意指包括外显子10的Tau转录物。
如本文所使用，“4R Tau同工型”意指包括由外显子10编码的氨基酸的Tau蛋白同工型。
如本文所使用，“Tau相关疾病”意指与Tau相关联的任何神经性或神经变性疾病。Tau相关病症的非限制性实例包括阿尔茨海默氏病、进行性核上性麻痹、拳击员痴呆、额颞痴呆、与染色体连锁的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结主导的痴呆、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅毒性脑病、结节性硬化症、哈-斯二氏病、皮克氏病、皮质基底节变性、嗜银颗粒性疾病、核上性麻痹、皮质基底变性、额颞痴呆或额颞叶变性。
如本文所使用，“Tau蛋白病”意指以大脑中Tau蛋白的堆积为特征的病症。
如本文所使用，“Tau特异性抑制剂”包括但不限于靶向于Tau的“反义化合物”。
如本文所使用，“靶向”或“靶向于”意指反义化合物与特定靶核酸分子或靶核酸分子的特定区域的结合。如果反义化合物与靶核酸足够互补以允许在生理条件下杂交，那么反义化合物靶向靶核酸。
如本文所使用，在提到核碱基时的“核碱基互补性”或“互补性”意指能够与另一个核碱基碱基配对的核碱基。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补。在某些实施方案中，互补核碱基意指能够与其靶核酸的核碱基碱基配对的反义化合物的核碱基。例如，如果反义化合物的某个位置上的核碱基能够与靶核酸的某个位置上的核碱基氢键合，那么寡核苷酸与靶核酸之间的氢键合的位置被认为在所述核碱基对上是互补的。包含某些修饰的核碱基可维持与对应核碱基配对的能力，并且因此仍能够具有核碱基互补性。
如本文所使用，关于核碱基的“非互补性”意指彼此不形成氢键的核碱基对。
如本文所使用，关于低聚化合物(例如，连接核苷、寡核苷酸或核酸)的“互补性”意指所述低聚化合物或其区域与另一个低聚化合物或其区域在严格条件下通过核碱基互补性杂交的能力。互补的低聚化合物不必需在每个核苷上均具有核碱基互补性。相反，容忍一些错配。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区域在70％的核碱基上互补(70％互补)。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区域80％互补。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区域90％互补。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区域95％互补。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区域100％互补。
如本文所使用，“杂交”意指互补低聚化合物(例如，反义化合物及其靶核酸)的配对。虽然不限于具体机制，但配对的最常见机制涉及氢键合，所述氢键合可为互补核碱基之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。
如本文所使用，“特异性杂交”意指低聚化合物与一个核酸位点杂交比它与另一个核酸位点杂交具有更大亲和力的能力。在某些实施方案中，反义寡核苷酸与多于一个靶位点特异性杂交。
如本文所使用，“互补百分比”意指与靶核酸的等长部分互补的低聚化合物的核碱基的百分数。通过将与靶核酸中的对应位置上的核碱基互补的低聚化合物的核碱基数除以低聚化合物的总长度来计算互补百分比。
如本文所使用，“同一性百分比”意指与第二核酸中的对应位置上的核碱基相同类型(不依赖于化学修饰)的第一核酸中的核碱基数除以第一核酸中的核碱基总数。
如本文所使用，“调节”意指当与调节前的分子、功能或活性的量或质量相比时分子、功能或活性的量或质量的变化。例如，调节包括基因表达的变化，增加(刺激或诱导)或减少(抑制或降低)。作为另一个实例，表达的调节可包括前体mRNA加工的剪接位点选择的变化，从而导致与不存在调节情况下的量相比的具体剪接变体的绝对或相对量的变化。
如本文所使用，“基序”意指低聚化合物或其区域中的化学修饰的模式(pattern)。可通过低聚化合物的某些核苷和/或某些连接基团上的修饰来定义基序。
如本文所使用，“核苷基序”意指低聚化合物或其区域中的核苷修饰的模式。这样的低聚化合物的键联可为修饰或未修饰的。除非另外指出，否则本文中仅描述核苷的基序意图为核苷基序。因此，在所述情况下，键联不受限制。
如本文所使用，“糖基序”意指低聚化合物或其区域中的糖修饰的模式。
如本文所使用，“键联基序”意指低聚化合物或其区域中的键联修饰的模式。这样的低聚化合物的核苷可为修饰或未修饰的。除非另外指出，否则本文中仅描述键联的基序意图为键联基序。因此，在所述情况下，核苷不受限制。
如本文所使用，“核碱基修饰基序”意指沿着寡核苷酸的核碱基的修饰的模式。除非另外指出，否则核碱基修饰基序不依赖于核碱基序列。
如本文所使用，“序列基序”意指沿着寡核苷酸或其部分布置的核碱基的模式。除非另外指出，否则序列基序不依赖于化学修饰并且因此可具有化学修饰的任何组合，包括没有化学修饰。
如本文所使用，关于核苷或一种“类型”的核苷的“修饰类型”意指核苷的化学修饰并且包括修饰和未修饰的核苷。因此，除非另外指出，否则“具有第一类型的修饰的核苷”可为未修饰的核苷。
如本文所使用，“不同修饰的”意指彼此不同的化学修饰或化学取代基，包括不存在修饰。因此，例如，MOE核苷和未修饰的DNA核苷为“不同修饰的”，即使DNA核苷为未修饰的。同样，DNA和RNA为“不同修饰的”，即使这两者均为天然存在的未修饰的核苷。相同但包含不同核碱基的核苷不为不同修饰的。例如，包含2’-OMe修饰的糖和未修饰的腺嘌呤核碱基的核苷和包含2’-OMe修饰的糖和未修饰的胸腺嘧啶核碱基的核苷不为不同修饰的。
如本文所使用，“相同类型的修饰”是指彼此相同的修饰，包括不存在修饰。因此，例如，两个未修饰的DNA核苷具有“相同类型的修饰”，即使DNA核苷为未修饰的。具有相同类型修饰的所述核苷可包含不同的核碱基。
如本文所使用，“药学上可接受的载体或稀释剂”意指适合用于向动物施用的任何物质。在某些实施方案中，药学上可接受的载体或稀释剂为无菌盐水。在某些实施方案中，所述无菌盐水为药用级盐水。
如本文所使用，“取代基(substituent)”和“取代基(substituent group)”意指替代指定母体化合物的原子或基团的原子或基团。例如，修饰核苷的取代基为不同于在天然存在的核苷中发现的原子或基团的任何原子或基团(例如，修饰的2’-取代基为在核苷的2’-位上的除H或OH之外的任何原子或基团)。取代基可为保护或未保护的。在某些实施方案中，本发明的化合物在母体化合物的一个位置上或多于一个位置上具有取代基。取代基还可进一步被其它取代基取代并且可直接连接或通过连接基团如烷基或烃基连接至母体化合物。
同样，如本文所使用，关于化学官能团的“取代基”意指不同于通常存在于指定官能团中的原子或原子基团的原子或原子基团。在某些实施方案中，取代基替代官能团的氢原子(例如，在某些实施方案中，取代的甲基的取代基为替代未取代的甲基的一个氢原子的除氢之外的原子或基团)。除非另外指出，否则适合用作取代基的基团包括但不限于卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、酰基(-C(O)Raa)、羧基(-C(O)O-Raa)、脂族基团、脂环基、烷氧基、取代的氧基(-O-Raa)、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基、杂芳基烷基、氨基(-N(Rbb)(Rcc))、亚氨基(＝NRbb)、酰胺基(-C(O)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(O)Raa)、叠氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、脲基(carbamido)(-OC(O)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(O)ORaa)、脲基(ureido)(-N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc))、硫脲基(-N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc))、胍基(-N(Rbb)C(＝NRbb)N(Rbb)(Rcc))、脒基(-C(＝NRbb)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(＝NRbb)(Raa))、巯基(-SRbb)、亚硫酰基(-S(O)Rbb)、磺酰基(-S(O)2Rbb)以及氨磺酰基(-S(O)2N(Rbb)(Rcc)-或-N(Rbb)S(O)2Rbb)。其中每个Raa、Rbb和Rcc独立地为H、任选连接的化学官能团或另外的具有优选列表的取代基，所述列表包括但不限于烷基、烯基、炔基、脂肪族、烷氧基、酰基、芳基、芳烷基、杂芳基、脂环族、杂环和杂芳基烷基。本文描述的化合物内的所选取代基以一定递归度存在。
如本文所使用，如本文所使用的“烷基”意指含有最多至二十四个碳原子的饱和直链或支链烃基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基通常包括1至约24个碳原子，更通常地1至约12个碳原子(C1-C12烷基)，其中1至约6个碳原子更优选。
如本文所使用，“烯基”意指含有最多至二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳双键的直链或支链链烃基。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、二烯如1,3-丁二烯等。烯基通常包括2至约24个碳原子，更通常地2至约12个碳原子，其中2至约6个碳原子更优选。如本文所使用的烯基可任选地包括一个或多个另外的取代基。
如本文所使用，“炔基”意指含有最多至二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳三键的直链或支链烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基等。炔基通常包括2至约24个碳原子，更通常地2至约12个碳原子，其中2至约6个碳原子更优选。如本文所使用的炔基可任选地包括一个或多个另外的取代基。
如本文所使用，“酰基”意指通过从有机酸中去除羟基形成的基团并且具有通式-C(O)-X，其中X通常为脂肪族、脂环族或芳香族。实例包括脂肪族羰基、芳香族羰基、脂肪族磺酰基、芳香族亚硫酰基、脂肪族亚硫酰基、芳香族磷酸酯、脂肪族磷酸酯等。如本文所使用的酰基可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“脂环族”意指其中环为脂肪族的环***。环***可包含一个或多个环，其中至少一个环为脂肪族。优选的脂环族包括其中具有约5至约9个碳原子的环。如本文所使用的脂环族可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“脂肪族”意指含有最多至二十四个碳原子的直链或支链烃基，其中任何两个碳原子之间的饱和度为单键、双键或三键。脂肪族基团优选含有1至约24个碳原子，更通常地1至约12个碳原子，其中1至约6个碳原子更优选。脂肪族基团的直链或支链可被一个或多个杂原子中断，所述杂原子包括氮、氧、硫和磷。被杂原子中断的所述脂肪族基团包括但不限于聚烷氧基，如聚亚烷基二醇、聚胺和聚亚胺。如本文所使用的脂肪族基团可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“烷氧基”意指在烷基与氧原子之间形成的基团，其中氧原子用来将烷氧基连接至母体分子。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。如本文所使用的烷氧基可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“氨基烷基”意指氨基取代的C1-C12烷基。基团的烷基部分与母体分子形成共价键。氨基可位于任何位置并且氨基烷基可在烷基和/或氨基部分上被另外的取代基取代。
如本文所使用，“芳烷基”和“芳基烷基”意指共价连接至C1-C12烷基的芳香族基团。所得到的芳烷基(或芳基烷基)的烷基部分与母体分子形成共价键。实例包括但不限于苯甲基、苯乙基等。如本文所使用的芳烷基可任选地包括连接至烷基、芳基或形成基团的这两个基团的另外的取代基。
如本文所使用，“芳基”和“芳香族”意指具有一个或多个芳环的单环或多环碳环***基团。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。优选的芳环***在一个或多个环中具有约5至约20个碳原子。如本文所使用的芳基可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“卤代基”和“卤素”意指选自氟、氯、溴和碘的原子。
如本文所使用，“杂芳基”和“杂芳香族”意指包含单环或多环芳环、环***或稠环***的基团，其中至少一个环为芳香族的并且包括一个或多个杂原子。杂芳基还意图包括稠环***，所述稠环***包括其中一个或多个稠环不含有杂原子的***。杂芳基通常包括一个选自硫、氮或氧的环原子。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。杂芳基可直接或通过连接部分如脂肪族基团或杂原子连接至母体分子。如本文所使用的杂芳基可任选地包括另外的取代基。
低聚化合物
在某些实施方案中，本发明提供了低聚化合物。在某些实施方案中，所述低聚化合物包含任选地包含一个或多个缀合物和/或端基的寡核苷酸。在某些实施方案中，低聚化合物由寡核苷酸组成。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个化学修饰。所述化学修饰包括对一个或多个核苷的修饰(包括对糖部分和/或核碱基的修饰)和/或对一个或多个核苷间键联的修饰。
某些糖部分
在某些实施方案中，本发明的低聚化合物包含一个或多个修饰核苷，所述修饰核苷包含修饰的糖部分。相对于仅包含含有天然存在的糖部分的核苷的低聚化合物，包含一个或多个糖修饰的核苷的所述低聚化合物可具有希望的性质，如增强的核酸酶稳定性或增大的与靶核酸的结合亲和力。在某些实施方案中，修饰的糖部分为取代的糖部分。在某些实施方案中，修饰的糖部分为双环或三环糖部分。在某些实施方案中，修饰的糖部分为糖替代物。所述糖替代物可包含对应于取代的糖部分的那些取代的一个或多个取代。
在某些实施方案中，修饰的糖部分为包含一个或多个取代基的取代的糖部分，包括但不限于在2’位和/或5’位上的取代基。适于2’-位的糖取代基的实例包括但不限于：2’-F、2'-OCH3(“OMe”或“O-甲基”)和2'-O(CH2)2OCH3(“MOE”)。在某些实施方案中，2’位上的糖取代基选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、O-C1-C10取代的烷基；O-C1-C10烷氧基；O-C1-C10取代的烷氧基、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基。5’-位上的糖取代基的实例包括但不限于：5’-甲基(R或S)；5'-乙烯基和5’-甲氧基。在某些实施方案中，取代的糖包含多于一个非桥联糖取代基，例如，2'-F-5'-甲基糖部分(对于另外的5',2'-双取代的糖部分和核苷，参见，例如，PCT国际申请WO 2008/101157)。
包含2’-取代的糖部分的核苷称为2’-取代的核苷。在某些实施方案中，2’-取代的核苷包含选自以下的2'-取代基：卤代基、烯丙基、氨基、叠氮基、O-C1-C10烷氧基、O-C1-C10取代的烷氧基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O-烷基、S-烷基或N(Rm)-烷基；O-烯基、S-烯基或N(Rm)-烯基；O-炔基、S-炔基或N(Rm)-炔基；O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H、氨基保护基或取代或未取代的C1-C10烷基。这些2'-取代基可被独立地选自以下的一个或多个取代基进一步取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基(NO2)、巯基、硫代烷氧基(S-烷基)、卤素、烷基、芳基、烯基以及炔基。
在某些实施方案中，2’-取代的核苷包含选自以下的2’-取代基：F、NH2、N3、OCF3、O-CH3、O(CH2)3NH2、CH2-CH＝CH2、O-CH2-CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2以及N-取代的乙酰胺(O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H、氨基保护基或取代或未取代的C1-C10烷基。
在某些实施方案中，2’-取代的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的2’-取代基：F、OCF3、O-CH3、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(CH3)2、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2以及O-CH2-C(＝O)-N(H)CH3。
在某些实施方案中，2’-取代的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的2’-取代基：F、O-CH3和OCH2CH2OCH3。
某些修饰的糖部分包含桥联糖取代基，所述桥联糖取代基形成第二个环，从而产生双环糖部分。在某些所述实施方案中，双环糖部分在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间包含桥联。所述4’至2’糖取代基的实例包括但不限于：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或–C(RaRb)-O-N(R)-；4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(cEt)和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'以及其类似物(参见，例如，2008年7月15日授权的美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其类似物(参见，例如，2009年1月8日公布的WO2009/006478)；4'-CH2-N(OCH3)-2'及其类似物(参见，例如，2008年12月11日公布的WO2008/150729)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见，例如，2004年9月2日公布的US2004/0171570)；4'-CH2-O-N(R)-2'以及4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每个R独立地为H、保护基或C1-C12烷基；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R为H、C1-C12烷基或保护基(参见，2008年9月23日授权的美国专利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见，例如，Chattopadhyaya等，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4'-CH2-C(＝CH2)-2'及其类似物(参见，2008年12月8日公布的已公布的PCT国际申请WO 2008/154401)。
在某些实施方案中，所述4’至2’桥联独立地包含1至4个连接的基团，所述基团独立地选自以下：-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-以及-N(Ra)-；
其中：
x为0、1或2；
n为1、2、3或4；
每个Ra和Rb独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚磺酰基(S(＝O)-J1)；并且
每个J1和J2独立地为H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
包含双环糖部分的核苷称为双环核苷或BNA。双环核苷包括但不限于如下所描绘的(A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、(B)β-D-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA(也称为锁核酸或LNA)、(C)亚乙基氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA、(D)氨基氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA、(E)氧氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA、(F)甲基(亚甲基氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(也称为约束乙基或cEt)、(G)亚甲基-硫代基(4’-CH2-S-2’)BNA、(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA、(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA，以及(J)丙烯碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA。
Figure BDA0002379293430000401
其中Bx为核碱基部分并且R独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
另外的双环糖部分为本领域中已知的，例如：Singh等，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等，Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等，J.Am.Chem.Soc.,129(26)8362-8379(2007年7月4日)；Elayadi等，Curr.OpinionInvens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等，Chem.Biol.,2001,8,1-7；Orum等，Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利号7,053,207、6,268,490、6,770,748、6,794,499、7,034,133、6,525,191、6,670,461和7,399,845；WO 2004/106356、WO1994/14226、WO 2005/021570和WO 2007/134181；美国专利公布号US2004/0171570、US2007/0287831和US2008/0039618；美国专利序列号12/129,154、60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,844；以及PCT国际申请号PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154和PCT/US2008/068922。
在某些实施方案中，双环糖部分和掺入所述双环糖部分的核苷通过异构构型进一步定义。例如，包含4’-2’亚甲基-氧基桥联的核苷可呈α-L构型或呈β-D构型。先前，已将α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)双环核苷掺入到显示反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等，Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
在某些实施方案中，取代的糖部分包含一个或多个非桥联糖取代基和一个或多个桥联糖取代基(例如，5’-取代的糖和4’-2’桥联的糖)。(参见，11/22/07公布的PCT国际申请WO 2007/134181，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
在某些实施方案中，修饰的糖部分为糖替代物。在某些所述实施方案中，天然存在的糖的氧原子被例如硫、碳或氮原子取代。在某些所述实施方案中，所述修饰的糖部分还包含如上所述的桥联取代基和/或非桥联取代基。例如，某些糖替代物包含4’-硫原子和2'-位(参见，例如，2005年6月16日公布的已公布的美国专利申请US2005/0130923)和/或5’位上的取代。通过另外举例的方式，具有4'-2'桥联的碳环双环核苷已有所描述(参见，例如，Freier等，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443和Albaek等，J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有除了5个原子以外的环。例如，在某些实施方案中，糖替代物包含六元四氢吡喃。所述四氢吡喃可被进一步修饰或取代。包含所述修饰的四氢吡喃的核苷包括但不限于己糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(参见Leumann,CJ.Bioorg.&Med.Chem.(2002)10:841-854)、氟代HNA(F-HNA)以及具有式VII的那些化合物：
Figure BDA0002379293430000421
其中独立地对于所述至少一种式VII的四氢吡喃核苷类似物中的每一个：
Bx为核碱基部分；
T3和T4各自独立地为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团或T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团并且T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合物基团或5'或3'-端基；
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；并且
R1和R2中的每一个独立地选自以下：氢、卤素、取代或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2以及CN，其中X为O、S或NJ1，并且每个J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，提供式VII的修饰THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个不是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个为甲基。在某些实施方案中，提供了式VII的THP核苷，其中R1和R2中的一个为F。在某些实施方案中，R1为氟代基并且R2为H，R1为甲氧基并且R2为H，并且R1为甲氧基乙氧基并且R2为H。
许多可用来修饰核苷的其它双环和三环糖和糖替代物环***也为本领域中已知的(参见，例如，综述文章：Leumann,J.C,Bioorganic&Medicinal Chemistry,2002,10,841-854)。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有多于5个原子和多于一个杂原子的环。例如，包含吗啉代糖部分的核苷及其在低聚化合物中的用途已被报道(参见例如：Braasch等，Biochemistry,2002,41,4503-4510；和美国专利5,698,685；5,166,315；5,185,444和5,034,506)。如在此所使用，术语“吗啉代”意指具有以下结构的糖替代物：
Figure BDA0002379293430000431
在某些实施方案中，可例如通过添加或改变来自以上吗啉代结构的各种取代基来修饰吗啉代。所述糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉代”。
还提供了修饰的组合，不限于如2'-F-5'-甲基取代的核苷(对于其它公开的5',2'-双取代核苷，参见8/21/08公布的PCT国际申请WO 2008/101157)和用S替代核糖基环氧原子以及在2'-位上的进一步取代(参见2005年6月16日公布的已公布的美国专利申请US2005-0130923)或替代地双环核酸的5'-取代(参见11/22/07公布的PCT国际申请WO2007/134181，其中4'-CH2-O-2'双环核苷在5'位上被5'-甲基或5'-乙烯基进一步取代)。碳环双环核苷的合成和制备连同其低聚和生物化学研究也已有所描述(参见，例如，Srivastava等，J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
某些核碱基
在某些实施方案中，本发明的核苷包含一个或多个未修饰核碱基。在某些实施方案中，本发明的核苷包含一个或多个修饰核碱基。
在某些实施方案中，修饰核碱基选自以下：通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、尺寸膨胀碱基以及如本文所定义的氟化碱基。5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代基、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代基具体地为5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤、通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、尺寸膨胀碱基以及如本文所定义的氟化碱基。另外的修饰核碱基包括三环嘧啶如吩噁嗪胞嘧啶([5,4-b][1,4]苯并嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞嘧啶(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)；G-夹如取代的吩噁嗪胞嘧啶(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞嘧啶(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞嘧啶(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。修饰核碱基还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮替代的那些。另外的核碱基包括公开于美国专利号3,687,808中的那些、公开于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering,Kroschwitz,J.I.编著，John Wiley&Sons,1990,858-859中的那些；由Englisch等，Angewandte Chemie，国际版，1991,30,613公开的那些；以及由Sanghvi,Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编著，CRCPress,1993,273-288公开的那些。
教导某些上述修饰核碱基以及其它修饰核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于U.S.3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653和6,005,096，某些所述美国专利与本申请共有，并且所述美国专利中的每一个均以引用的方式整体并入本文。
某些核苷间键联
在某些实施方案中，本发明提供了包含连接核苷的低聚化合物。在所述实施方案中，核苷可使用任何核苷间键联连接在一起。通过磷原子的存在或不存在来定义两大类核苷间连接基团。代表性含磷核苷间键联包括但不限于磷酸二酯(P＝O)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯以及硫代磷酸酯(P＝S)。代表性的不含磷的核苷间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫二酯(-O-C(O)-S-)、氨基甲硫羰酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-Si(H)2-O-)；以及N,N'-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。与天然磷酸二酯键联相比，修饰的键联可用来改变(通常为增加)低聚化合物的核酸酶抗性。在某些实施方案中，具有手性原子的核苷间键联可制备为外消旋混合物或制备为单独的对映异构体。代表性手性键联包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。制备含磷和不含磷核苷间键联的方法是本领域技术人员熟知的。
本文描述的寡核苷酸含有一个或多个不对称中心并且因此产生对映异构体、非对映异构体和可根据绝对立体化学定义为(R)或(S)、α或β如对于糖端基异构体或定义为(D)或(L)如对于氨基酸等的其它立体异构构型。在本文提供的反义化合物中包括所有所述可能的异构体以及其外消旋形式和光学纯形式。
中性核苷间键联包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3'-CH2-N(CH3)-O-5')、酰胺-3(3'-CH2-C(＝O)-N(H)-5')、酰胺-4(3'-CH2-N(H)-C(＝O)-5')、甲乙缩醛(3'-O-CH2-O-5')以及硫代甲乙缩醛(3'-S-CH2-O-5')。另外的中性核苷间键联包括包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯以及酰胺的非离子键联(参见例如：Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编著，ACS座谈会系列580；第3和4章，40-65)。另外的中性核苷间键联包括包含混合的N、O、S和CH2组成部分的非离子键联。
某些基序
在某些实施方案中，本发明提供了包含寡核苷酸的低聚化合物。在某些实施方案中，所述寡核苷酸包含一个或多个化学修饰。在某些实施方案中，化学修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰核苷。在某些实施方案中，化学修饰的寡核苷酸包含含有修饰的糖的一个或多个修饰核苷。在某些实施方案中，化学修饰的寡核苷酸包含含有一个或多个修饰的核碱基的一个或多个修饰核苷。在某些实施方案中，化学修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，化学修饰(糖修饰、核碱基修饰和/或键联修饰)限定模式或基序。在某些实施方案中，糖部分、核苷间键联和核碱基的化学修饰的模式各自彼此独立。因此，可通过其糖修饰基序、核苷间键联基序和/或核碱基修饰基序来描述寡核苷酸(如本文所使用，核碱基修饰基序描述对核碱基的化学修饰，而与核碱基的序列无关)。
某些糖基序
在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式或糖修饰基序沿着寡核苷酸或其区域布置的一种或多种类型的修饰的糖部分和/或天然存在的糖部分。所述基序可包括本文讨论的任何糖修饰和/或其它已知的糖修饰。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有缺口聚物糖修饰基序的区域或由所述区域组成，所述缺口聚物糖修饰基序包含两个外部区域或“翼”以及内部区域或“缺口”。缺口聚物基序的三个区域(5’-翼、缺口和3’-翼)形成连续的核苷序列，其中每个翼的核苷的至少一些糖部分不同于缺口的核苷的至少一些糖部分。确切来说，每个翼的核苷的至少最接近缺口的糖部分(5’-翼的最3’核苷和3’-翼的最5’核苷)不同于邻近缺口核苷的糖部分，从而限定了翼与缺口之间的边界。在某些实施方案中，缺口内的糖部分彼此相同。在某些实施方案中，缺口包括一个或多个核苷，所述核苷具有不同于缺口的一个或多个其它核苷的糖部分的糖部分。在某些实施方案中，两翼的糖修饰基序彼此相同(对称的缺口聚物)。在某些实施方案中，5'-翼的糖修饰基序不同于3'-翼的糖修饰基序(不对称的缺口聚物)。在某些实施方案中，寡核苷酸包含翼中的2’-MOE修饰核苷和缺口中的2’-F修饰核苷。
在某些实施方案中，寡核苷酸是完全修饰的。在某些所述实施方案中，寡核苷酸是统一修饰的。在某些实施方案中，寡核苷酸是统一的2’-MOE。在某些实施方案中，寡核苷酸是统一的2’-F。在某些实施方案中，寡核苷酸是统一的吗啉代。在某些实施方案中，寡核苷酸是统一的BNA。在某些实施方案中，寡核苷酸是统一的LNA。在某些实施方案中，寡核苷酸是统一的cEt。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含统一修饰区域和未修饰或不同修饰的其它核苷。在某些实施方案中，统一修饰区域为至少5、10、15或20个核苷的长度。在某些实施方案中，统一区域为2’-MOE区域。在某些实施方案中，统一区域为2’-F区域。在某些实施方案中，统一区域为吗啉代区域。在某些实施方案中，统一区域为BNA区域。在某些实施方案中，统一区域为LNA区域。在某些实施方案中，统一区域为cEt区域。
在某些实施方案中，寡核苷酸不包含多于4个连续的未修饰2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，包含多于4个连续的2’-脱氧核苷的反义寡核苷酸活化RNase H，从而导致靶RNA裂解。在某些实施方案中，所述裂解通过不具有多于4个连续的2’-脱氧核苷而得以避免，例如在期望剪接的改变并且期望靶RNA不裂解的情况下。
某些核苷间键联基序
在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式或修饰的核苷间键联基序沿着寡核苷酸或其区域布置的修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，核苷间键联以有缺口的基序布置，如上文对于糖修饰基序所描述。在所述实施方案中，两个翼区的每一个中的核苷间键联不同于缺口区中的核苷间键联。在某些实施方案中，翼中的核苷间键联为磷酸二酯并且缺口中的核苷间键联为硫代磷酸酯。糖修饰基序被独立地选择，使得具有有缺口的核苷间键联基序的所述寡核苷酸可以具有或可不具有有缺口的糖修饰基序并且如果它具有有缺口的糖基序，那么翼和缺口长度可以相同或可不同。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有交替的核苷间键联基序的区域。在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含具有统一修饰的核苷间键联的区域。在某些所述实施方案中，寡核苷酸包含通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接的区域。在某些实施方案中，寡核苷酸通过硫代磷酸酯统一连接。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯并且至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少6个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少6个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少8个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少10个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸至少包含具有至少一种12个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端的3个核苷内。
在某些实施方案中，向CNS递送化合物和组合物，包括修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，通过脑室内施用或脑室内团注施用向CNS递送化合物和组合物，包括修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，一种或多种修饰寡核苷酸可表现出针对核酸靶标的高效力和高选择性，但是当通过脑室内施用被递送到CNS中时可能具有一定程度的急性毒性。在某些实施方案中，向修饰寡核苷酸的核苷间键联引入一个或多个修饰改善或降低了与通过脑室内施用进行的CNS递送相关联的急性毒性。在某些实施方案中，向修饰寡核苷酸引入一个或多个磷酸二酯核苷间键联改善或降低了与通过脑室内施用进行的CNS递送相关联的急性毒性。
在某些实施方案中，低聚化合物具有选自下表的核苷间键联基序，其中每个“N”代表核苷，每个下标“s”代表硫代磷酸酯核苷间键联，并且每个下标“o”代表磷酸二酯核苷间键联：
核苷间键联基序
N<sub>S</sub>N<sub>S</sub>N<sub>O</sub>N<sub>S</sub>N<sub>O</sub>N<sub>S</sub>N<sub>O</sub>N<sub>S</sub>N<sub>O</sub>N<sub>S</sub>N<sub>O</sub>N<sub>S</sub>N<sub>O</sub>N<sub>S</sub>N<sub>O</sub>N<sub>S</sub>N<sub>S</sub>N
N<sub>S</sub>N<sub>O</sub>N<sub>O</sub>N<sub>O</sub>N<sub>S</sub>N<sub>S</sub>N<sub>S</sub>N<sub>S</sub>N<sub>S</sub>N<sub>S</sub>N<sub>S</sub>N<sub>S</sub>N<sub>O</sub>N<sub>O</sub>N<sub>O</sub>N<sub>S</sub>N<sub>S</sub>N
在某些实施方案中，于修饰寡核苷酸中包括3、4、5、6、7、8或9个磷酸二酯核苷间键联改善或降低了与通过脑室内施用进行的CNS递送相关联的急性毒性。
某些核碱基修饰基序
在某些实施方案中，寡核苷酸包含对以限定的模式或核碱基修饰基序沿着寡核苷酸或其区域布置的核碱基的化学修饰。在某些所述实施方案中，核碱基修饰以有缺口的基序布置。在某些实施方案中，核碱基修饰以交替基序布置。在某些实施方案中，每个核碱基均为修饰的。在某些实施方案中，没有一个核碱基为化学修饰的。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含修饰核碱基的嵌段。在某些所述实施方案中，嵌段处于寡核苷酸的3’-末端。在某些实施方案中，嵌段在寡核苷酸的3’-末端的3个核苷酸内。在某些所述实施方案中，嵌段处于寡核苷酸的5’-末端。在某些实施方案中，嵌段在寡核苷酸的3’-末端的5个核苷酸内。
在某些实施方案中，核碱基修饰随寡核苷酸的具***置上的天然碱基变化。例如，在某些实施方案中，寡核苷酸中的每个嘌呤或每个嘧啶均为修饰的。在某些实施方案中，每个腺嘌呤均为修饰的。在某些实施方案中，每个鸟嘌呤均为修饰的。在某些实施方案中，每个胸腺嘧啶均为修饰的。在某些实施方案中，每个胞嘧啶均为修饰的。在某些实施方案中，每个尿嘧啶均为修饰的。
在某些实施方案中，寡核苷酸中的一些、所有或没有一个胞嘧啶部分为5-甲基胞嘧啶部分。在本文中，5-甲基胞嘧啶不为“修饰核碱基”。因此，除非另外指出，否则未修饰的核碱基包括具有5-甲基的胞嘧啶残基和缺乏5甲基的那些胞嘧啶残基。在某些实施方案中，指定了所有或一些胞嘧啶核碱基的甲基化状态。
某些总长度
在某些实施方案中，本发明提供了包括具有各种长度范围中的任何一个的寡核苷酸的低聚化合物。在某些实施方案中，本发明提供由X至Y个连接核苷组成的低聚化合物或寡核苷酸，其中X表示范围内的最小核苷数并且Y表示范围内的最大核苷数。在某些所述实施方案中，X和Y各自独立地选自：8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50；前提是X≤Y。例如，在某些实施方案中，本发明提供包含由以下组成的寡核苷酸的低聚化合物：8至9、8至10、8至11、8至12、8至13、8至14、8至15、8至16、8至17、8至18、8至19、8至20、8至21、8至22、8至23、8至24、8至25、8至26、8至27、8至28、8至29、8至30、9至10、9至11、9至12、9至13、9至14、9至15、9至16、9至17、9至18、9至19、9至20、9至21、9至22、9至23、9至24、9至25、9至26、9至27、9至28、9至29、9至30、10至11、10至12、10至13、10至14、10至15、10至16、10至17、10至18、10至19、10至20、10至21、10至22、10至23、10至24、10至25、10至26、10至27、10至28、10至29、10至30、11至12、11至13、11至14、11至15、11至16、11至17、11至18、11至19、11至20、11至21、11至22、11至23、11至24、11至25、11至26、11至27、11至28、11至29、11至30、12至13、12至14、12至15、12至16、12至17、12至18、12至19、12至20、12至21、12至22、12至23、12至24、12至25、12至26、12至27、12至28、12至29、12至30、13至14、13至15、13至16、13至17、13至18、13至19、13至20、13至21、13至22、13至23、13至24、13至25、13至26、13至27、13至28、13至29、13至30、14至15、14至16、14至17、14至18、14至19、14至20、14至21、14至22、14至23、14至24、14至25、14至26、14至27、14至28、14至29、14至30、15至16、15至17、15至18、15至19、15至20、15至21、15至22、15至23、15至24、15至25、15至26、15至27、15至28、15至29、15至30、16至17、16至18、16至19、16至20、16至21、16至22、16至23、16至24、16至25、16至26、16至27、16至28、16至29、16至30、17至18、17至19、17至20、17至21、17至22、17至23、17至24、17至25、17至26、17至27、17至28、17至29、17至30、18至19、18至20、18至21、18至22、18至23、18至24、18至25、18至26、18至27、18至28、18至29、18至30、19至20、19至21、19至22、19至23、19至24、19至25、19至26、19至29、19至28、19至29、19至30、20至21、20至22、20至23、20至24、20至25、20至26、20至27、20至28、20至29、20至30、21至22、21至23、21至24、21至25、21至26、21至27、21至28、21至29、21至30、22至23、22至24、22至25、22至26、22至27、22至28、22至29、22至30、23至24、23至25、23至26、23至27、23至28、23至29、23至30、24至25、24至26、24至27、24至28、24至29、24至30、25至26、25至27、25至28、25至29、25至30、26至27、26至28、26至29、26至30、27至28、27至29、27至30、28至29、28至30或29至30个连接核苷。在低聚化合物或寡核苷酸的核苷数限制至一定范围或具体数字的实施方案中，低聚化合物或寡核苷酸仍然还可包含另外的其它取代基。例如，包含8-30个核苷的寡核苷酸不包括具有31个核苷的寡核苷酸，但是，除非另外指出，否则这样的寡核苷酸还可包含例如一个或多个缀合物、端基或其它取代基。在某些实施方案中，缺口聚物寡核苷酸具有以上长度中的任一个。
本领域的技术人员将理解对于某些基序而言，某些长度可能是不可能的。例如，具有由四个核苷酸组成的5’-翼区、由至少六个核苷酸组成的缺口和由三个核苷酸组成的3’-翼区的缺口聚物不能具有少于13个核苷酸的总长。因此，将理解长度下限为13并且“10-20”中10的限制在该实施方案中没有影响。
另外，在通过总长度范围和通过具有指定长度的区域来描述寡核苷酸时并且在区域的指定长度的总和小于总长度范围的上限时，寡核苷酸可具有超出指定区域的那些核苷的另外的核苷，前提是核苷的总数不超过总长度范围的上限。例如，由20-25个连接核苷组成且所述连接核苷包含由5个连接核苷组成的5’-翼、由5个连接核苷组成的3’-翼和由10个连接核苷组成的中央缺口(5+5+10＝20)的寡核苷酸可具有不属于5’-翼、3’-翼和缺口的至多5个核苷(在达到25的总长限制之前)。所述另外的核苷可以是5’-翼的5’和/或3’-翼的3’。
某些寡核苷酸
在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸通过其糖基序、核苷间键联基序、核碱基修饰基序和总长度来表征。在某些实施方案中，所述参数各自彼此独立。因此，具有缺口聚物糖基序的寡核苷酸的每个核苷间键联均可为修饰或未修饰的并且可或可不遵循糖修饰的缺口聚物修饰模式。因此，糖-缺口聚物的翼区内的核苷间键联可为彼此相同或不同的，并且可与缺口区的核苷间键联相同或不同。同样，所述糖-缺口聚物寡核苷酸可包含一个或多个独立于糖修饰的缺口聚物模式的修饰核碱基。本文中如果寡核苷酸或低聚化合物的描述没有提及一个或多个参数，那么所述参数不受限制。因此，仅被描述为具有缺口聚物糖基序而没有进一步描述的低聚化合物可具有任何长度、核苷间键联基序和核碱基修饰基序。除非另外指出，否则所有化学修饰与核碱基序列无关。
某些缀合物基团
在某些实施方案中，通过连接一个或多个缀合物基团来修饰低聚化合物。通常，缀合物基团改变所连接的低聚化合物的一种或多种性质，包括但不限于药效学、药物代谢动力学、稳定性、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除率。缀合物基团在化学领域中按常规使用并且直接地或通过任选的缀合物连接部分或缀合物连接基团连接至母体化合物，诸如低聚化合物如寡核苷酸。缀合物基团包括但不限于嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫代胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。某些缀合物基团先前已经得到描述，例如：胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)、胆酸(Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053-1060)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309；Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.AcidsRes.,1992,20,533-538)、脂肪族链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J.,1991,10,1111-1118；Kabanov等，FEBS Lett.,1990,259,327-330；Svinarchuk等，Biochimie,1993,75,49-54)、磷脂例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基-铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan等，TetrahedronLett.,1995,36,3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)，或十八胺或己基氨基-羰基-氧胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)。
在某些实施方案中，缀合物基团包含活性药物，例如阿司匹林(aspirin)、华法林(warfarin)、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)-普拉洛芬((S)-(+)-pranoprofen)、卡洛芬(carprofen)、丹酰基肌氨酸(dansylsarcosine)、2,3,5-三碘苯甲酸、氟灭酸(flufenamicacid)、亚叶酸(folinic acid)、苯并噻二嗪、***、二氮杂卓、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸盐(barbiturate)、头孢菌素(cephalosporin)、磺胺药、抗糖尿病剂、抗菌剂或抗生素。
在某些实施方案中，缀合物基团直接连接至低聚化合物中的寡核苷酸。在某些实施方案中，缀合物基团通过缀合物连接基团连接至寡核苷酸。在某些所述实施方案中，缀合物连接基团，包括但不限于双官能连接部分诸如本领域中已知的那些，适用于本文提供的化合物。缀合物连接基团适用于将缀合物基团诸如化学稳定基团、官能团、报道基团和其它基团连接到母体化合物例如像低聚化合物中的选择性位点。通常，双官能连接部分包括具有两种官能团的烃基部分。选择官能团中的一个结合到目标母体分子或化合物，而选择另一个基本上结合任何选择的基团，诸如化学官能团或缀合物基团。在一些实施方案中，缀合物接头包含重复单元诸如乙二醇或氨基酸单元的链结构或低聚物。在双官能连接部分中常规使用的官能团的实例包括但不限于用于与亲核基团反应的亲电子试剂和用于与亲电子基团反应的亲核试剂。在一些实施方案中，双官能连接部分包括氨基、羟基、羧酸、硫醇、不饱和键(例如双键或三键)等。
缀合物连接部分的一些非限制性实例包括吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)和6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其它连接基团包括但不限于取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10烯基或取代或未取代的C2-C10炔基，其中优选取代基的非限制性列表包括羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
缀合物基团可连接至寡核苷酸的任一端或两端(末端缀合物基团)和/或任何内部位置。
在某些实施方案中，缀合物基团处于低聚化合物的寡核苷酸的3’-末端。在某些实施方案中，缀合物基团靠近3’-末端。在某些实施方案中，缀合物连接在低聚化合物的3’末端处，但位于一个或多个端基核苷之前。在某些实施方案中，缀合物基团安排在端基内。
在某些实施方案中，本发明提供了低聚化合物。在某些实施方案中，低聚化合物包含寡核苷酸。在某些实施方案中，低聚化合物包含寡核苷酸和一个或多个缀合物和/或端基。所述缀合物和/或端基可添加至具有上述任何化学基序的寡核苷酸。因此，例如，包含具有交替核苷的区域的寡核苷酸的低聚化合物可包含端基。
反义化合物
在某些实施方案中，本发明的低聚化合物为反义化合物。所述反义化合物能够与靶核酸杂交，产生至少一种反义活性。在某些实施方案中，反义化合物与一种或多种靶核酸特异性杂交。在某些实施方案中，特异性杂交的反义化合物具有核碱基序列，所述核碱基序列包含与靶核酸具有足够互补性以允许杂交和产生反义活性并且与任何非靶标具有不足够的互补性以便在希望特异性杂交的条件下(例如，在用于体内或治疗用途的生理条件下，和在体外测定的情况下进行测定的条件下)避免与非靶核酸序列的非特异性杂交的区域。
在某些实施方案中，本发明提供了包含寡核苷酸的反义化合物，所述寡核苷酸在寡核苷酸的整个长度上与靶核酸完全互补。在某些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸99％互补。在某些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸95％互补。在某些实施方案中，所述寡核苷酸与靶核酸90％互补。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸与靶核酸85％互补。在某些实施方案中，所述寡核苷酸与靶核酸80％互补。在某些实施方案中，反义化合物包含与靶核酸完全互补并且在寡核苷酸的整个长度上与靶核酸至少80％互补的区域。在某些所述实施方案中，具有完全互补性的区域的长度为6至14个核碱基。
在某些实施方案中，反义化合物和反义寡核苷酸包含单链化合物。在某些实施方案中，反义化合物和反义寡核苷酸包含双链化合物。
某些修饰寡核苷酸
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.31的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.33的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ IDNO.34的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.35的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.36的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQID NO.37的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.45的序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.72的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.79的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ IDNO.82的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.83的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.97的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQID NO.106的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.107的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.112的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.113的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.130的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.140的序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.141的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.142的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQID NO.143的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.144的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.145的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.146的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.147的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.148的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.149的序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.150的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.151的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQID NO.152的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.153的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.157的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.158的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.160的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO.200的序列。
与神经变性病症相关联的某些途经和机制
在某些实施方案中，神经变性综合征或病症可以是与Tau相关联的任何神经变性综合征或病症。与Tau相关联的神经变性病症的非限制性实例包括阿尔茨海默氏病、进行性核上性麻痹、拳击员痴呆、额颞痴呆、与染色体连锁的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结主导的痴呆、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅毒性脑病、结节性硬化症、哈-斯二氏病、皮克氏病、皮质基底节变性、嗜银颗粒性疾病、核上性麻痹、皮质基底变性、额颞痴呆或额颞叶变性。在一些实施方案中，本发明的方法包括修饰额颞痴呆(FTD)。在其它实施方案中，本发明的方法包括修饰阿尔茨海默氏病(AD)。在其它实施方案中，本发明的方法包括修饰进行性核上性麻痹。在其它实施方案中，本发明的方法包括修饰皮质基底节变性。
在某些实施方案中，本文描述了通过改变核酸编码Tau的剪接来修饰神经变性综合征的组合物和方法。Tau是存在于多种组织中的蛋白，但在神经元的轴突中特别丰富。Tau的主要功能是结合并稳定微管，微管是涉及有丝***、胞质***和囊泡转运的细胞骨架的重要结构组分。在人体内，存在通过外显子2、3和10的可变剪接所产生的六种Tau同工型。蛋白质N端处外显子2和3的剪接导致零个、一个或两个29氨基酸酸性结构域的保留并且分别称作0N、1N或2N Tau。在C端的外显子10的保留导致由外显子10编码的微管结合结构域的保留。因为在Tau中的别处存在3个微管结合结构域，所以这个Tau同工型(包括有外显子10)被称为4R Tau，其中R是指微管结合结构域的重复的数目。(图1)。没有外显子10的Tau称为3RTau。在健康受试者中，3R:4R Tau之比是受发育调节的，其中胎儿组织几乎只表达3R Tau，而成年人体组织表达大约相等水平的3R/4R Tau。偏离3R/4R Tau的正常比率是神经变性综合征诸如FTD Tau蛋白病的特征。
在某些实施方案中，受试者的中枢神经***中的4R:3R Tau比率可以是正常的、低的或高的。如本文所使用，中枢神经***中的“正常4R:3R Tau比率”表示与来自相同物种和大约相同年龄且未遭受神经变性疾病的受试者的中枢神经***中的4R:3R Tau比率基本相同的中枢神经***中的4R:3R Tau比率。在某些实施方案中，某些反义寡核苷酸组合物和/或方法减少受试者的中枢神经***中的正常4R:3R Tau比率。在某些实施方案中，某些反义寡核苷酸组合物和/或方法减少受试者的中枢神经***中的低4R:3R Tau比率。
在某些实施方案中，某些反义寡核苷酸组合物和/或方法减少受试者的中枢神经***中的高4R:3R Tau比率。在某些实施方案中，某些反义寡核苷酸组合物和/或方法减少受试者中因核酸编码Tau的剪接缺陷造成的高4R:3R Tau比率。受试者中的核酸编码Tau的剪接缺陷可例如由改变核酸编码Tau的剪接且导致高4R:3R Tau比率的基因突变造成。突变可以是产生新的反常的剪接元件的取代突变或缺失突变。可改变核酸编码Tau的剪接且导致高4R:3R Tau比率的基因突变的非限制性实例可包括N279K、P301S、280、L284L、N296H、N296N、296N、P301S、G303V、E10+11、E10+12、E10+13、E+10+14和E10+16以及E10+19。
在某些实施方案中，反义寡核苷酸的施用通过改变核酸编码Tau的剪接来减少受试者的中枢神经***中的4R:3R Tau比率。
在某些实施方案中，增加Tau转录物的外显子10的排除抑制了一种或多种tau相关病症。在某些实施方案中，tau相关病症可以是以下中的任一种：阿尔茨海默氏病、额颞痴呆(FTD)、FTDP-17、进行性核上性麻痹(PSP)、慢性创伤性脑病(CTE)、皮质基底节变性(CBD)、癫痫、Dravet综合征、拳击员痴呆、与染色体连锁的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结主导的痴呆、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅毒性脑病、结节性硬化症、哈-斯二氏病、皮克氏病、嗜银颗粒性疾病、核上性麻痹、皮质基底变性或额颞叶变性。
某些靶核酸和机制
在某些实施方案中，反义化合物包含或由包含与靶核酸互补的区域的寡核苷酸组成。在某些实施方案中，靶核酸为内源性RNA分子。在某些实施方案中，靶核酸为前体mRNA。在某些实施方案中，靶核酸为tau转录物。在某些实施方案中，靶RNA为Tau前体mRNA。
在某些实施方案中，反义化合物与Tau前体mRNA的区域互补。在某些实施方案中，反义化合物在包含编码4R同工型的外显子的Tau前体mRNA的区域内互补。在某些实施方案中，反义化合物与包含内含子-外显子剪接点的Tau前体mRNA的区域互补。在某些实施方案中，反义化合物与包含邻近外显子10的内含子-外显子剪接点的Tau前体mRNA的区域互补。在某些实施方案中，反义化合物与包含位于内含子9与外显子10之间的内含子-外显子剪接点的Tau前体mRNA的区域互补。在某些实施方案中，反义化合物与包含位于外显子10与内含子10之间的内含子-外显子剪接点的Tau前体mRNA的区域互补。在某些实施方案中，反义化合物在由外显子10组成的Tau前体mRNA的区域内互补。
在某些实施方案中，反义化合物在包含外显子10内的外显子剪接沉默子的Tau前体mRNA的区域内互补。在某些实施方案中，反义化合物在包含外显子10内的外显子剪接增强子的Tau前体mRNA的区域内互补。
在某些实施方案中，一种反义化合物包含修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸是由8至30个连接核苷组成且具有包含含有至少8个连续核碱基的互补区域的核碱基序列，所述互补区域与Tau转录物的等长度靶区域互补。
在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121708和核碱基122044之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121796和核碱基122044之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121796和核碱基121885之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121873和核碱基121898之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121869和核碱基121943之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基122020和核碱基122044之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQID NO.:1的核碱基121881和核碱基121898之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121880和核碱基121897之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121879和核碱基121896之内。
在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121878和核碱基121895之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121877和核碱基121894之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121876和核碱基121893之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121875和核碱基121892之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121874和核碱基121891之内。在某些实施方案中，靶区域在SEQ ID NO.:1的核碱基121873和核碱基121890之内。
在某些实施方案中，反义寡核苷酸调节前体mRNA的剪接。在某些实施方案中，反义寡核苷酸调节Tau前体mRNA的剪接。在某些实施方案中，反义寡核苷酸增加Tau 3R mRNA的量。在某些实施方案中，反义寡核苷酸增加Tau mRNA中外显子10的排除。在某些实施方案中，反义寡核苷酸减少Tau mRNA中外显子10的保留。在某些实施方案中，反义寡核苷酸增加3R Tau mRNA的量。在某些实施方案中，反义寡核苷酸减少4R Tau mRNA的量。
在某些实施方案中，期望改变Tau前体mRNA的剪接以排除外显子10。通过改变Tau前体mRNA的剪接来排除外显子10，3R Tau的表达将增加并且4R Tau的表达将减少。在某些实施方案中，期望改变Tau前体mRNA的剪接以减少4R Tau的表达。
在某些实施方案中，反义寡核苷酸减少Tau 3R mRNA的量。在某些实施方案中，反义寡核苷酸减少Tau mRNA中外显子10的排除。在某些实施方案中，反义寡核苷酸增加TaumRNA中外显子10的保留。在某些实施方案中，反义寡核苷酸减少3R Tau mRNA的量。在某些实施方案中，反义寡核苷酸增加4R Tau mRNA的量。在某些实施方案中，期望改变Tau前体mRNA的剪接来包括外显子10，例如以便产生小鼠或动物模型中的表型效应。
某些药物组合物
在某些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种反义化合物的药物组合物。在某些实施方案中，所述药物组合物包含合适的药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施方案中，药物组合物包含无菌盐水溶液和一种或多种反义化合物。在某些实施方案中，所述药物组合物由无菌盐水溶液和一种或多种反义化合物组成。在某些实施方案中，无菌盐水为药用级盐水。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种反义化合物和无菌水。在某些实施方案中，药物组合物由一种或多种反义化合物和无菌水组成。在某些实施方案中，无菌盐水为药用级水。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种反义化合物和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在某些实施方案中，药物组合物由一种或多种反义化合物和无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)组成。在某些实施方案中，无菌盐水为药用级PBS。
在某些实施方案中，反义化合物可与药学上可接受的活性物质和/或惰性物质混合用于制备药物组合物或制剂。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病的程度或待施用的剂量。
包含反义化合物的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或所述酯的盐。在某些实施方案中，包含反义化合物的药物组合物包含一种或多种寡核苷酸，当向动物(包括人)施用时，所述一种或多种寡核苷酸能够(直接地或间接地)提供生物活性代谢物或其残余物。因此，例如，本公开还涉及反义化合物的药学上可接受的盐、前药、所述前药的药学上可接受的盐以及其它生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。
前药可包括在低聚化合物的一端或两端上并入可由体内内源性核酸酶裂解而形成活性反义低聚化合物的额外核苷。
脂质部分已用于各种方法中的核酸疗法中。在某些所述方法中，将核酸引入到由阳离子脂质和中性脂质的混合物制成的预先形成的脂质体或脂质复合物中。在某些方法中，在不存在中性脂质的情况下形成具有单阳离子脂质或聚阳离子脂质的DNA复合物。在某些实施方案中，对脂质部分进行选择，以增加药剂至具体细胞或组织的分布。在某些实施方案中，对脂质部分进行选择，以增加药剂至脂肪组织的分布。在某些实施方案中，对脂质部分进行选择，以增加药剂至肌肉组织的分布。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含一种或多种修饰寡核苷酸和一种或多种赋形剂。在某些所述实施方案中，赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素以及聚乙烯吡咯烷酮。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含递送***。递送***的实例包括但不限于脂质体和乳剂。某些递送***有用于制备某些药物组合物，所述药物组合物包括包含疏水化合物的那些。在某些实施方案中，使用了某些有机溶剂如二甲亚砜。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含一种或多种经设计用来将一种或多种本发明药剂递送到特定组织或细胞类型的组织特异性递送分子。例如，在某些实施方案中，药物组合物包括涂覆有组织特异性抗体的脂质体。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含共溶剂***。某些所述共溶剂***包含例如苯甲醇、非极性表面活性剂、水可混溶的有机聚合物以及水相。在某些实施方案中，所述共溶剂***用于疏水化合物。所述共溶剂***的非限制性实例为VPD共溶剂***，其为包含3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨酯80TM和65％w/v聚乙二醇300的无水乙醇溶液。所述共溶剂***的比例可在不显著改变其溶解度和毒性特征的情况下明显改变。此外，共溶剂组分的身份可改变：例如，可使用其它表面活性剂替代聚山梨酯80TM；可改变聚乙二醇的分数大小；其它生物相容的聚合物可替代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；并且其它糖或多糖可取代右旋糖。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物被制备用于经口施用。在某些实施方案中，药物组合物被制备用于经颊施用。
在某些实施方案中，药物组合物被制备用于通过注射(例如，静脉内、皮下、肌肉内等)施用。在某些所述实施方案中，药物组合物包含载体并且配制在水溶液中，如水或生理上相容的缓冲液如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。在某些实施方案中，包括其它成分(例如，帮助溶解或充当防腐剂的成分)。在某些实施方案中，使用适当的液体载体、悬浮剂等制备可注射悬浮液。某些注射用药物组合物以单位剂型呈现，例如在安瓿中或在多剂量容器中。某些注射用药物组合物为油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。某些适用于注射用药物组合物的溶剂包括但不限于亲脂溶剂和脂肪油(如芝麻油)、合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)以及脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选地，所述悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加药剂溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。
在某些实施方案中，制备药物组合物用于透粘膜施用。在某些所述实施方案中，在配制中使用适用于待渗透的屏障的渗透剂。所述渗透剂通常为本领域中已知的。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含治疗有效量的寡核苷酸。在某些实施方案中，治疗有效量足以预防、减轻或改善疾病的症状或延长正在治疗的受试者的存活。确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内。
在某些实施方案中，本文提供的一种或多种修饰寡核苷酸被配制成前药。在某些实施方案中，当体内施用时，前药化学转化为寡核苷酸的生物学、药学或治疗学上更具活性的形式。在某些实施方案中，前药为有用的，因为它们比对应的活性形式更容易施用。例如，在某些情况下，前药可比对应的活性形式生物利用度更高(例如，通过经口施用)。在某些情况下，与对应的活性形式相比，前药可具有改进的溶解度。在某些实施方案中，前药比对应的活性形式水溶性更小。在某些情况下，所述前药具有优越的跨越细胞膜传输的能力，其中水溶性不利于迁移性。在某些实施方案中，前药为酯。在某些所述实施方案中，当施用时酯被代谢水解为羧酸。在某些情况下，含有羧酸的化合物为对应的活性形式。在某些实施方案中，前药包含结合至酸基团的短肽(聚氨基酸)。在某些所述实施方案中，当施用时肽裂解以形成对应的活性形式。
在某些实施方案中，本发明提供了用于减少细胞中靶核酸的量或活性的组合物和方法。在某些实施方案中，细胞在动物中。在某些实施方案中，动物为哺乳动物。在某些实施方案中，动物为啮齿动物。在某些实施方案中，动物为灵长类动物。在某些实施方案中，动物为非人灵长类动物。在某些实施方案中，动物为人。
在某些实施方案中，本发明提供了向动物施用包含本发明的低聚化合物的药物组合物的方法。合适的施用途径包括但不限于经口、直肠、透粘膜、肠、肠内、局部、栓剂、通过吸入、鞘内、脑室内、腹膜内、鼻内、眼内、瘤内以及肠胃外(例如，静脉内、肌肉内、髓内和皮下)。在某些实施方案中，施用鞘内药物(pharmaceutical intrathecal)以实现局部暴露而非全身暴露。例如，可将药物组合物直接注射在希望作用的区域中(例如，到眼部、耳部中)。
在某些实施方案中，向具有至少一种Tau相关病症的动物施用药物组合物。在某些实施方案中，所述施用导致4R同工型表达减少。在某些实施方案中，向具有与Tau相关病症相关联的至少一种症状的动物施用药物组合物。在某些实施方案中，所述施用导致至少一种症状的改善。在某些实施方案中，药物组合物向动物的施用导致动物细胞中4R mRNA的减少。在某些实施方案中，所述施用导致3R mRNA的增加。在某些实施方案中，所述施用导致4R蛋白的减少和3R蛋白的增加。在某些实施方案中，3R蛋白相对于4R蛋白是优选的。在某些实施方案中，某些反义寡核苷酸的施用延迟了一种或多种Tau相关病症的发作。在某些实施方案中，某些反义寡核苷酸的施用预防或减少了中风发作。在某些实施方案中，某些反义寡核苷酸的施用致使CNS中4R蛋白的量减少。在某些实施方案中，某些反义寡核苷酸的施用挽救了细胞表型。
非限制性公开并且以引用的方式并入
虽然已根据某些实施方案具体描述了本文所述的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用以说明本文所述的化合物并且不意图限制所述化合物。本申请中引用的每个参考文献、GenBank登录号和类似物均以引用的方式整体并入本文。
虽然在要求时随附本文件的序列表将每个序列鉴定为“RNA”或“DNA”，但实际上，那些序列可用任何化学修饰组合来修饰。本领域技术人员将容易了解，在某些情况下，这种命名为“RNA”或“DNA”来描述修饰寡核苷酸是任意的。例如，包含含有2’-OH糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的寡核苷酸可被描述为具有修饰的糖(对于DNA的天然2’-H为2’-OH)的DNA或具有修饰碱基(对于RNA的天然尿嘧啶为胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶))的RNA。
因此，本文提供的核酸序列(包括但不限于序列表中的那些)意图涵盖含有任何组合的天然或修饰RNA和/或DNA的核酸，包括但不限于具有修饰核碱基的所述核酸。通过进一步举例，并且没有限制地，具有核碱基序列“ATCGATCG”的低聚化合物包括具有此类核碱基序列(不论经修饰或未经修饰)的任何低聚化合物，其包括(但不限于)此类包含RNA碱基的化合物，诸如那些具有序列“AUCGAUCG”的化合物和那些具有一些DNA碱基和一些RNA碱基的化合物，诸如“AUCGATCG”，以及具有其它修饰或天然存在碱基的低聚化合物，诸如“ATmeCGAUCG”，其中meC表示在5位置处包含甲基的胞嘧啶碱基。
本文还提供了以下实施方案：
实施方案1.一种包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸是由8至30个连接核苷组成且具有包含含有至少8个连续核碱基的互补区域的核碱基序列，所述互补区域与Tau转录物的等长度靶区域互补。
实施方案2.如实施方案1所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述互补区域与所述靶区域100％互补。
实施方案3.如实施方案1或2所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列的所述互补区域包含至少10个连续核碱基。
实施方案4.如实施方案1或2所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列的所述互补区域包含至少15个连续核碱基。
实施方案5.如实施方案1或2所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列的所述互补区域包含至少18个连续核碱基。
实施方案6.如实施方案1-5中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列，如在所述寡核苷酸的整个长度上所测量的，与所述Tau转录物的等长度区域为至少80％互补。
实施方案7.如实施方案1-5中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列，如在所述寡核苷酸的整个长度上所测量的，与所述Tau转录物的等长度区域为至少90％互补。
实施方案8.如实施方案1-5中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列，如在所述寡核苷酸的整个长度上所测量的，与所述Tau转录物的等长度区域为100％互补。
实施方案9.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在所述Tau转录物的外显子10之内。
实施方案10.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在所述Tau转录物的内含子9之内。
实施方案11.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在所述Tau转录物的内含子10之内。
实施方案12.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域包含一部分内含子9和一部分外显子10。
实施方案13.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域包含一部分外显子10和一部分内含子10。
实施方案14.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域包含一部分外显子10和在外显子10的5’末端的内含子的一部分。
实施方案15.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述靶区域包含一部分外显子10和在外显子10的3’末端的内含子的一部分。
实施方案16.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQID NO.:1的核碱基121708和核碱基122044之内。
实施方案17.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121796和核碱基122044之内。
实施方案18.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121796和核碱基121885之内。
实施方案19.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121873和核碱基121898之内。
实施方案20.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121869和核碱基121943之内。
实施方案21.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基122020和核碱基122044之内。
实施方案22.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121881和核碱基121898之内。
实施方案23.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121880和核碱基121897之内。
实施方案24.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121879和核碱基121896之内。
实施方案25.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121878和核碱基121895之内。
实施方案26.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121877和核碱基121894之内。
实施方案27.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121876和核碱基121893之内。
实施方案28.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121875和核碱基121892之内。
实施方案29.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121874和核碱基121891之内。
实施方案30.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述靶区域是在SEQ IDNO.:1的核碱基121873和核碱基121890之内。
实施方案31.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列包含SEQ ID NO:8-200中的任一个的核碱基序列。
实施方案32.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列由SEQ ID NO:8-200中的任一个的核碱基序列组成。
实施方案33.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列包含SEQ ID NO:33、34、147、148、149、150、151、152或153中的任一个的核碱基序列。
实施方案34.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列由SEQ ID NO:33、34、147、148、149、150、151、152或153中的任一个的核碱基序列组成。
实施方案35.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列包含SEQ ID NO:31、33、34、35、36、37、45、72、79、82、83、97、106、107、112、113、130、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、157、158、160或200中的任一个的核碱基序列。
实施方案36.如实施方案1-15中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列由SEQ ID NO:31、33、34、35、36、37、45、72、79、82、83、97、106、107、112、113、130、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、157、158、160或200中的任一个的核碱基序列组成。
实施方案37.如实施方案1-36中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰核苷。
实施方案38.如实施方案37所述的化合物，其中至少一个修饰核苷包含修饰的糖部分。
实施方案39.如实施方案37所述的化合物，其中至少一个修饰的糖部分为2’-取代的糖部分。
实施方案40.如实施方案39所述的化合物，其中至少一个2’-取代的糖部分的2’-取代基选自：2’-OMe、2’-F和2’-MOE。
实施方案41.如实施方案39所述的化合物，其中至少一个2’-取代的糖部分的2’-取代基为2’-MOE。
实施方案42.如实施方案37-38中任一项所述的化合物，其中至少一个修饰的糖部分为双环糖部分。
实施方案43.如实施方案42所述的化合物，其中至少一个双环糖部分为LNA或cEt。
实施方案44.如实施方案37-43中任一项所述的化合物，其中至少一个糖部分为糖替代物。
实施方案45.如实施方案44所述的化合物，其中至少一个糖替代物为吗啉代。
实施方案46.如实施方案44所述的化合物，其中至少一个糖替代物为修饰吗啉代。
实施方案47.如实施方案1-46中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少5个修饰核苷，所述修饰核苷各自独立地包含修饰的糖部分。
实施方案48.如实施方案47所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少10个修饰核苷，所述修饰核苷各自独立地包含修饰的糖部分。
实施方案49.如实施方案47所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少15个修饰核苷，所述修饰核苷各自独立地包含修饰的糖部分。
实施方案50.如实施方案47所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷为修饰核苷并且各自独立地包含修饰的糖部分，其中每个修饰核苷的所述修饰的糖部分各自彼此相同。
实施方案51.如实施方案47所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷为修饰核苷，所述修饰核苷各自独立地包含修饰的糖部分。
实施方案52.如实施方案1-51中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少两个修饰核苷，所述修饰核苷包含彼此相同的修饰的糖部分。
实施方案53.如实施方案1-52中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少两个修饰核苷，所述修饰核苷包含彼此不同的修饰的糖部分。
实施方案54.如实施方案1-53中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含含有至少5个连续修饰核苷的修饰区域。
实施方案55.如实施方案54所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含含有至少10个连续修饰核苷的修饰区域。
实施方案56.如实施方案54所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含含有至少15个连续修饰核苷的修饰区域。
实施方案57.如实施方案54所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含含有至少18个连续修饰核苷的修饰区域。
实施方案58.如实施方案54所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含含有至少20个连续修饰核苷的修饰区域。
实施方案59.如实施方案53-58中任一项所述的化合物，其中所述修饰区域的每个修饰核苷具有修饰的糖部分，所述修饰的糖部分独立地选自：2’-F、2’-OMe、2’-MOE、cEt、LNA、吗啉代和修饰吗啉代。
实施方案60.如实施方案54-59中任一项所述的化合物，其中所述修饰区域的所述修饰核苷各自包含彼此相同的修饰。
实施方案61.如实施方案60所述的化合物，其中所述修饰区域的所述修饰核苷各自包含相同的2’-取代的糖部分。
实施方案62.如实施方案61所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷的所述2’-取代的糖部分选自2’-F、2’-OMe和2’-MOE。
实施方案63.如实施方案61所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷的所述2’-取代的糖部分为2’-MOE。
实施方案64.如实施方案59所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷各自包含相同的双环糖部分。
实施方案65.如实施方案64所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷的所述双环糖部分选自LNA和cEt。
实施方案66.如实施方案59所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷各自包含糖替代物。
实施方案67.如实施方案66所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷的所述糖替代物为吗啉代。
实施方案68.如实施方案66所述的化合物，其中所述修饰核苷区域的所述修饰核苷的所述糖替代物为修饰吗啉代。
实施方案69.如实施方案1-68中任一项所述的化合物，其中所述修饰核苷酸包含不超过4个连续的天然存在核苷。
实施方案70.如实施方案1-68中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷均为修饰核苷。
实施方案71.如实施方案70所述的化合物，其中每个修饰核苷包含修饰的糖部分。
实施方案72.如实施方案71所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述修饰核苷包含彼此相同的修饰。
实施方案73.如实施方案72所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述修饰核苷各自包含相同的2’-取代的糖部分。
实施方案74.如实施方案73所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述2’-取代的糖部分选自2’-F、2’-OMe和2’-MOE。
实施方案75.如实施方案74所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述2’-取代的糖部分为2’-MOE。
实施方案76.如实施方案72所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述修饰核苷各自包含相同的双环糖部分。
实施方案77.如实施方案76所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述双环糖部分选自LNA和cEt。
实施方案78.如实施方案72所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述修饰核苷各自包含糖替代物。
实施方案79.如实施方案78所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述糖替代物为吗啉代。
实施方案80.如实施方案78所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述糖替代物为修饰吗啉代。
实施方案81.如实施方案1至36中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有A-B2-A-B2-A-B2-A-B2-A-B2-A-B2-A2基序，其中每个A包含双环糖部分，并且其中每个B选自2’-取代的糖部分和未修饰的2’-脱氧糖部分。
实施方案82.如实施方案81所述的化合物，其中每个A为cEt糖部分。
实施方案83.如实施方案81所述的化合物，其中每个A为LNA糖部分。
实施方案84.如实施方案81至83中任一项所述的化合物，其中每个B为未修饰的2’-脱氧糖部分。
实施方案85.如实施方案81至83中任一项所述的化合物，其中每个B为2’-MOE糖部分。
实施方案86.如实施方案1-85中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联。
实施方案87.如实施方案86所述的化合物，其中每个核苷间键联为修饰的核苷间键联。
实施方案88.如实施方案86或87所述的化合物，其包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键联。
实施方案89.如实施方案1-85中任一项所述的化合物，其中每个核苷间键联为修饰的核苷间键联并且其中每个核苷间键联包含相同的修饰。
实施方案90.如实施方案89所述的化合物，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
实施方案91.如实施方案86所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含4个磷酸二酯核苷间键联。
实施方案92.如实施方案86所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含5个磷酸二酯核苷间键联。
实施方案93.如实施方案86所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含6个磷酸二酯核苷间键联。
实施方案94.如实施方案86所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含7个磷酸二酯核苷间键联。
实施方案95.如实施方案91至94中任一项所述的化合物，其中每个剩余的核苷间键联为磷酸二酯核苷间键联。
实施方案96.如实施方案1-85中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有NSNSNONSNONSNONSNONSNONSNONSNONSNSN核苷间键联基序，其中每个N代表核苷，每个S代表硫代磷酸酯核苷间键联，并且每个O代表磷酸二酯核苷间键联。
实施方案97.如实施方案1-85中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有NSNONONONSNSNSNSNSNSNSNSNONONONSNSN核苷间键联基序，其中每个N代表核苷，每个S代表硫代磷酸酯核苷间键联，并且每个O代表磷酸二酯核苷间键联。
实施方案98.如实施方案1-97中任一项所述的化合物，其包含至少一个缀合物。
实施方案99.如实施方案1-98中任一项所述的化合物，其由所述修饰寡核苷酸组成。
实施方案100.如实施方案1-99中任一项所述的化合物，其中所述化合物调节所述Tau转录物的剪接。
实施方案101.如实施方案1-99中任一项所述的化合物，其中所述化合物降低所述4R Tau同工型的表达。
实施方案102.如实施方案1-99中任一项所述的化合物，其中所述化合物降低包含外显子10的Tau mRNA的表达。
实施方案103.如实施方案1-99中任一项所述的化合物，其中所述化合物降低包含由外显子10mRNA编码的氨基酸的Tau蛋白的表达。
实施方案104.如实施方案1-8或30-103中任一项所述的化合物，其具有包含SEQID NO.8-200中所列出的序列中的任一个的核碱基序列。
实施方案105.如实施方案1-8或30-103中任一项所述的化合物，其具有包含SEQID NO.33、34、147、148、149、150、151、152或153中所列出的序列中的任一个的核碱基序列。
实施方案106.如实施方案1-8或30-103中任一项所述的化合物，其具有由SEQ IDNO.8-200中所列出的序列中的任一个组成的核碱基序列。
实施方案107.如实施方案1-8或30-103中任一项所述的化合物，其具有由SEQ IDNO.33、34、147、148、149、150、151、152或153中所列出的序列中的任一个组成的核碱基序列。
实施方案108.一种双链化合物，其包含如实施方案1-107中任一项所述的化合物。
实施方案109.一种化合物，其由ISIS 670011组成。
实施方案110.一种化合物，其由ISIS 670012组成。
实施方案111.一种化合物，其由ISIS 670013组成。
实施方案112.一种化合物，其由ISIS 670014组成。
实施方案113.一种化合物，其由ISIS 670015组成。
实施方案114.一种化合物，其由ISIS 670016组成。
实施方案115.一种化合物，其由ISIS 670017组成。
实施方案116.一种化合物，其由ISIS 670018组成。
实施方案117.一种化合物，其由ISIS 670019组成。
实施方案118.一种化合物，其由ISIS 670020组成。
实施方案119.一种化合物，其由ISIS 670021组成。
实施方案120.一种化合物，其由ISIS 670022组成。
实施方案121.一种化合物，其由ISIS 670023组成。
实施方案122.一种化合物，其由ISIS 670024组成。
实施方案123.一种化合物，其由ISIS 670025组成。
实施方案124.一种化合物，其由ISIS 670026组成。
实施方案125.一种化合物，其由ISIS 670027组成。
实施方案126.一种化合物，其由ISIS 670028组成。
实施方案127.一种化合物，其由ISIS 678329组成。
实施方案128.一种化合物，其由ISIS 678330组成。
实施方案129.一种化合物，其由ISIS 678331组成。
实施方案130.一种化合物，其由ISIS 678332组成。
实施方案131.一种化合物，其由ISIS 678333组成。
实施方案132.一种化合物，其由ISIS 678334组成。
实施方案133.一种化合物，其由ISIS 693840组成。
实施方案134.一种化合物，其由ISIS 693841组成。
实施方案135.一种化合物，其由ISIS 693842组成。
实施方案136.一种化合物，其由ISIS 693843组成。
实施方案137.一种化合物，其由ISIS 693844组成。
实施方案138.一种化合物，其由ISIS 693845组成。
实施方案139.一种化合物，其由ISIS 693846组成。
实施方案140.一种化合物，其由ISIS 693847组成。
实施方案141.一种化合物，其由ISIS 693848组成。
实施方案142.一种化合物，其由ISIS 693849组成。
实施方案143.一种化合物，其由ISIS 549577组成。
实施方案144.一种化合物，其由ISIS 549580组成。
实施方案145.一种化合物，其由ISIS 549581组成。
实施方案146.一种化合物，其由ISIS 549582组成。
实施方案147.一种化合物，其由ISIS 549583组成。
实施方案148.一种化合物，其由ISIS 549584组成。
实施方案149.一种化合物，其由ISIS 549585组成。
实施方案150.一种化合物，其由ISIS 549586组成。
实施方案151.一种化合物，其由ISIS 617341组成。
实施方案152.一种化合物，其由ISIS 617351组成。
实施方案153.一种化合物，其由ISIS 617352组成。
实施方案154.一种化合物，其由ISIS 617353组成。
实施方案155.一种化合物，其由ISIS 617358组成。
实施方案156.一种化合物，其由ISIS 617360组成。
实施方案157.一种化合物，其由ISIS 617361组成。
实施方案158.一种化合物，其由ISIS 617362组成。
实施方案159.一种调节细胞中的Tau转录物的剪接的方法，其包括使所述细胞与如实施方案1-158中任一项所述的化合物接触。
实施方案160.如实施方案158所述的方法，其中所述细胞在体外。
实施方案161.如实施方案158所述的方法，其中所述细胞在动物中。
实施方案162.一种调节细胞中的Tau蛋白的表达的方法，其包括使所述细胞与如实施方案1-158中任一项所述的化合物接触。
实施方案163.如实施方案162所述的方法，其中使Tau蛋白的4R同工型的表达减少。
实施方案164.如实施方案162所述的方法，其中使Tau蛋白的3R同工型的表达增加。
实施方案165.如实施方案162至164中任一项所述的方法，其中所述细胞在体外。
实施方案166.如实施方案162至164中任一项所述的方法，其中所述细胞在动物中。
实施方案167.一种减少或改善与tau相关病症相关联的一种或多种症状的方法，其包括使细胞与如实施方案1-158中任一项所述的化合物接触。
实施方案168.如实施方案167所述的方法，其中所述症状为中风发作。
实施方案169.如实施方案167-168中任一项所述的方法，其中所述细胞在动物中。
实施方案170.一种药物组合物，其包含如实施方案1-158中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
实施方案171.如实施方案170所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体或稀释剂为无菌盐水。
实施方案172.一种方法，其包括向动物施用如实施方案170或171所述的药物组合物。
实施方案173.如实施方案172所述的方法，其中通过注射进行所述施用。
实施方案174.如实施方案172或173所述的方法，其中所述施用是全身性的。
实施方案175.如实施方案172或173所述的方法，其中所述施用是向CNS施用。
实施方案176.如实施方案172-175中任一项所述的方法，其中所述动物具有与一种或多种tau相关病症相关联的一种或多种症状。
实施方案177.如实施方案176所述的方法，其中所述施用导致与一种或多种tau相关病症相关联的一种或多种症状的改善。
实施方案178.如实施方案172-175中任一项所述的方法，其中所述动物具有与阿尔茨海默氏病相关联的一种或多种症状。
实施方案179.如实施方案178所述的方法，其中所述施用导致与阿尔茨海默氏病相关联的一种或多种症状的改善。
实施方案180.如实施方案172-179中任一项所述的方法，其中所述动物为小鼠。
实施方案181.如实施方案172-179中任一项所述的方法，其中所述动物为人。
实施方案182.如实施方案1至158中任一项所述的化合物或实施方案170-171所述的组合物的用途，其用于制备用于治疗tau相关病症的药物。
实施方案183.如实施方案1至158中任一项所述的化合物或实施方案170-171所述的组合物的用途，其用于制备用于改善与tau相关病症相关联的一种或多种症状的药物。
实施方案184.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述核碱基序列不由SEQ ID NO.:45、66、68、69或200中所列出的核碱基序列组成。
实施方案185.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述核碱基序列不由核碱基序列CCAGCTTCTTATTAATTATC或TAAGATCCAGCTTCTTATTA组成。
实施方案186.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121828和核碱基121847之内。
实施方案187.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121834和核碱基121853之内。
实施方案188.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121840和核碱基121859之内。
实施方案189.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121924和核碱基121941之内。
实施方案190.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121012和核碱基121029之内。
实施方案191.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121020和核碱基121037之内。
实施方案192.如实施方案1-183中任一项所述的化合物、组合物或方法，其中所述靶区域不在SEQ ID NO.:1的核碱基121024和核碱基121041之内。
实施例
非限制性公开且以引用方式并入
虽然已根据某些实施方案具体描述了本文所述的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用以说明本文所述的化合物并且不意图限制所述化合物。本申请中所述的各参考文献以引用的方式整体并入本文。
实施例1：统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10的作用
设计一系列修饰寡核苷酸来靶向人Tau的外显子10并针对其体外减少外显子10保留的作用进行筛选。这些修饰寡核苷酸是通过使4个核苷酸跨靶位点向上游或下游转移(即，微步移)来设计的。存在18个核苷的长度，其中每个核苷都具有2’-MOE修饰。整个修饰寡核苷酸当中的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联(P＝S)。整个修饰寡核苷酸当中的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。
“起始位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最5’核苷。“终止位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最3’核苷。下表中列出的每个修饰寡核苷酸都靶向于SEQ ID NO:1(从核苷酸9240000至9381000截短的GENBANK登录号NT_010783.15)。
使用Lipofectamine
Figure BDA0002379293430000851
以5nM浓度的修饰寡核苷酸转染A172细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量含有外显子10的Tau转录物的mRNA水平。使用人引物探针集9_10或10_11测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002379293430000852
所测量的总RNA含量调整Tau外显子10mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照物水平的Tau外显子10mRNA表达百分比且表示为“％UTC”。
人引物探针集9_10(正向序列：CACTGAGAACCTGAAGCAC C，本文指定为SEQ ID NO:2；反向序列：GGACTGGACGTTGCT AAGATC，本文指定为SEQ ID NO:3；探针序列：TTAATTATCTGCACCTTCCCGCCTCC，本文指定为SEQ ID NO:4)。
人引物探针集10_11(正向序列：GGATAATATCAAACACGTCCCG，本文指定为SEQ IDNO:5；反向序列：TGCCTAATGAGCCACACTTG，本文指定为SEQ ID NO:6；探针序列：GTCTACAAACCAGTTGACCTGAGC，本文指定为SEQ ID NO:7)。
如表1和2中所示，ISIS 549583、549584、549585、549586、549595、549571、549566、549570、549587、549568、549617、549567、549576、549577、549580和549581显示出与未处理的对照物相比减少70％或更多的人Tau外显子10保留。
表1
使用引物探针集9_10得到的统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10的作用
Figure BDA0002379293430000861
Figure BDA0002379293430000871
表2
使用引物探针集10_11得到的统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10的作用
Figure BDA0002379293430000872
Figure BDA0002379293430000881
Figure BDA0002379293430000891
实施例2：统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10的作用
设计一系列修饰寡核苷酸来靶向人Tau的外显子10并针对其体外减少外显子10保留的作用进行筛选。这些修饰寡核苷酸是通过使1个核苷酸跨靶位点向上游或下游转移(即，微步移)来设计的。存在18个核苷的长度，其中每个核苷都具有2’-MOE修饰。整个修饰寡核苷酸中的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联(P＝S)。整个修饰寡核苷酸当中的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。
“起始位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最5’核苷。“终止位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最3’核苷。下表中列出的每个修饰寡核苷酸都靶向于SEQ ID NO:1(从核苷酸9240000至9381000截短的GENBANK登录号NT_010783.15)。
使用Lipofectamine
Figure BDA0002379293430000901
以5nM浓度的修饰寡核苷酸转染A172细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量含有外显子10的Tau转录物的mRNA水平。使用人Tau引物探针集10_11或9_10R5测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002379293430000902
所测量的总RNA含量调整Tau外显子10mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照物水平的Tau外显子10mRNA表达百分比且表示为“％UTC”。
人引物探针集10_11(正向序列：GGATAATATCAAACACGTCCCG，本文指定为SEQ IDNO:5；反向序列：TGCCTAATGAGCCACACTTG，本文指定为SEQ ID NO:6；探针序列：GTCTACAAACCAGTTGACCTGAGC，本文指定为SEQ ID NO:7)。
人Tau引物探针集9_10R5(正向序列：CACTGAGAACCTGAAGCACC，本文指定为SEQ IDNO:2；反向序列：GGACGTTGCTAAGATCCAGCT，本文指定为SEQ ID NO:3；探针序列：TTAATTATCTGCACCTTCCCGCCTCC，本文指定为SEQ ID NO:4)。
表3
使用人Tau引物探针集10_11得到的统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10的作用
Figure BDA0002379293430000911
Figure BDA0002379293430000921
表4
使用人Tau引物探针集9_10R5得到的统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10的作用
Figure BDA0002379293430000922
Figure BDA0002379293430000931
Figure BDA0002379293430000941
实施例3：统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10的抑制作用
选择来自表3和4的若干修饰寡核苷酸并进一步评价它们体外抑制人Tau外显子10表达的作用。研究中包括了ISIS 549595用于比较。
“起始位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最5’核苷。“终止位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最3’核苷。下表中列出的每个修饰寡核苷酸都靶向于SEQ ID NO:1(从核苷酸9240000至9381000截短的GENBANK登录号NT_010783.15)。
使用Lipofectamine
Figure BDA0002379293430000942
以0、0.1、0.3、1、3、10或30nM浓度的下表中规定的修饰寡核苷酸转染A172细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量含有外显子10的Tau转录物的mRNA水平。除了ISIS 549581之外，使用人Tau引物探针集9_10R5测量mRNA水平。这种寡核苷酸使用人Tau引物探针集10_11。根据如由
Figure BDA0002379293430000952
所测量的总RNA含量调整人Tau外显子10mRNA水平。
每种寡核苷酸的半最大抑制浓度(IC50)呈现在下表中并且计算如下：将使用的寡核苷酸浓度对每种浓度下达到的人Tau外显子10mRNA表达的抑制百分比绘图，并记录与对照物相比达到人Tau外显子10mRNA表达的50％抑制时寡核苷酸的浓度。结果在下面呈现。
表5
统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10表达的抑制作用
Figure BDA0002379293430000951
实施例4：统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10的抑制作用
选择来自4的若干修饰寡核苷酸并进一步评价它们体外抑制人Tau外显子10表达的作用。研究中包括了ISIS 549595用于比较。
“起始位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最5’核苷。“终止位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最3’核苷。下表中列出的每个修饰寡核苷酸都靶向于SEQ ID NO:1(从核苷酸9240000至9381000截短的GENBANK登录号NT_010783.15)。
使用Lipofectamine
Figure BDA0002379293430000962
以0、0.1、0.3、1、3、10或30nM浓度的下表中规定的修饰寡核苷酸转染A172细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量含有外显子10的Tau转录物的mRNA水平。使用人Tau引物探针集9_10R5测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0002379293430000963
所测量的总RNA含量调整人Tau外显子10mRNA水平。
以与实施例3中所说明类似的方式计算每种寡核苷酸的IC50并且在下面呈现结果。
表6
统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10表达的抑制作用
Figure BDA0002379293430000961
实施例5：统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10的抑制作用
选择来自表3和4的若干修饰寡核苷酸并进一步评价它们体外抑制人Tau外显子10表达的作用。研究中包括了ISIS 549595用于比较。
“起始位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最5’核苷。“终止位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最3’核苷。下表中列出的每个修饰寡核苷酸都靶向于SEQ ID NO:1(从核苷酸9240000至9381000截短的GENBANK登录号NT_010783.15)。
使用Lipofectamine
Figure BDA0002379293430000972
以0、0.1、0.3、1、3、10或30nM浓度的下表中规定的修饰寡核苷酸转染A172细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量含有外显子10的Tau转录物的mRNA水平。除了ISIS 549595之外，使用人Tau引物探针集10_11测量mRNA水平。这种寡核苷酸使用人Tau引物探针集9_10R5。根据如由
Figure BDA0002379293430000973
所测量的总RNA含量调整人Tau外显子10mRNA水平。
以与实施例3中所说明类似的方式计算每种寡核苷酸的IC50并且在下面呈现结果。
表7
统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10表达的抑制作用
Figure BDA0002379293430000971
Figure BDA0002379293430000981
实施例6：统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10的抑制作用
选择来自表1和4的若干修饰寡核苷酸并进一步评价它们体外抑制人Tau外显子10表达的作用。研究中包括了ISIS 617782、617781和415833用于比较。
“起始位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最5’核苷。“终止位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最3’核苷。下表中列出的每个修饰寡核苷酸都靶向于SEQ ID NO:1(从核苷酸9240000至9381000截短的GENBANK登录号NT_010783.15)。
ISIS 617782为21核苷的长度，其中每个核苷都具有2’-OCH3修饰并且表示为下标“m”。整个修饰寡核苷酸中的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联(P＝S)。
ISIS 617781为18核苷的长度，其中每个核苷都具有2’-OCH3修饰并且表示为下标“m”。整个修饰寡核苷酸中的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联(P＝S)。
ISIS 415833为20个核苷的长度，其中每个核苷都具有2’-MOE修饰。整个修饰寡核苷酸中的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联(P＝S)。整个修饰寡核苷酸当中的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“
使用Lipofectamine
Figure BDA0002379293430000982
以0、0.1、0.3、1、3、10或30nM浓度的下表中规定的修饰寡核苷酸转染A172细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量含有外显子10的Tau转录物的mRNA水平。除了ISIS 617781和415883之外，使用人Tau引物探针集9_10R5测量mRNA水平。这两种寡核苷酸使用人Tau引物探针集10_11。根据如由
Figure BDA0002379293430000992
所测量的总RNA含量调整人Tau外显子10mRNA水平。
以与实施例3中所说明类似的方式计算每种寡核苷酸的IC50并且在下面呈现结果。
表8
统一2’-MOE修饰寡核苷酸对人Tau外显子10表达的抑制作用
Figure BDA0002379293430000991
实施例7：靶向人Tau的外显子10的修饰寡核苷酸
设计一系列修饰寡核苷酸来靶向人Tau的外显子10。“起始位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最5’核苷。“终止位点”表示修饰寡核苷酸所靶向的最3’核苷。下表中列出的每个修饰寡核苷酸都靶向于SEQ ID NO:1(从核苷酸9240000至9381000截短的GENBANK登录号NT_010783.15)。
在下表中，“mC”表示5-甲基胞嘧啶，下标“e”表示2’-O-甲氧基乙基，下标“f”表示2’-脱氧氟基，下标“d”表示2′-脱氧，下标“p”表示肽核酸单体，下标“s”表示硫代磷酸酯核苷间键联，下标“o”表示磷酸二酯核苷间键联，“P-”表示在5’末端处的O形接头(PNA Bio,Thousand Oaks,CA)，“-N”表示3’-末端羧基酰胺。
表9
靶向人Tau的修饰寡核苷酸
Figure BDA0002379293430001001
Figure BDA0002379293430001011
Figure BDA0002379293430001021
实施例8：靶向人Tau外显子10的寡核苷酸的体内分析
将Sprague Dawley大鼠针对表11中呈现的实验分成每组3只大鼠的组，而针对表12中呈现的实验分成每组2或4只大鼠的组。对每个大鼠组中的每只大鼠施用单一3mg鞘内(IT)剂量的选自表3、4或9的寡核苷酸。在注射后3小时至8周的不同时间点，对每只大鼠评价身体的7个不同部位的活动。7个身体部位为：(1)大鼠尾部；(2)大鼠后位姿；(3)大鼠后肢；(4)大鼠后爪；(5)大鼠前爪；(6)大鼠前位姿；和(7)大鼠头部。对于7个不同身体部位的每个部位，如果这个身体部位是活动的，那么为每只大鼠给出0的分项分数，如果这个身体部位是瘫痪的，那么给出1的分项分数。在评价了7个身体部位中的每个部位之后，对每只大鼠的分项分数求和，然后对每个组求平均。例如，如果在3mg IT剂量3小时之后大鼠的尾部、头部和所有其它被评价的身体部位是活动的，那么它将得到0的求和分数。如果在3mg IT剂量3小时后另一只大鼠的尾部是不活动的，但所有其它被评价的身体部位是活动的，那么它将得到1的分数。盐水处理的大鼠通常得到0的分数。在范围顶端的分数将表明有毒性。结果在表11和12中呈现为每个治疗组的平均分数。
表11
3mg IT团注体内研究
Figure BDA0002379293430001031
Figure BDA0002379293430001041
表12
3mg IT团注体内研究
Figure BDA0002379293430001042
实施例9：靶向人Tau外显子10的修饰寡核苷酸的体内抑制作用
B6.Cg-Mapttm1(EGFP)Klt Tg(MAPT)8cPdav/J小鼠(The Jackson Laboratory)表达人Tau的3R和4R同工型。在这个小鼠模型中评估选自表3、4和8的寡核苷酸对4R同工型转移到3R同工型的作用。
通过脑室内(ICV)团注对每组四只B6.Cg-Mapttm1(EGFP)Klt Tg(MAPT)8cPdav/J小鼠(3-4月大)的组施用500μg寡核苷酸。每组四只小鼠的对照组用PBS进行类似处理。所述剂量两周以后，处死动物并从大脑皮层、海马和/或脊髓提取RNA。通过qRT-PCR分析4R同工型和总人Tau的mRNA表达。使用引物探针集hTau 9_10接合序列(正向序列5’-CACTGAGAACCTGAAGCACC-3’，SEQ ID NO:219；反向序列5’-GTTGCTAAGATCCAGCTTCTT-3’，SEQID NO:220；探针序列5’-TTAATTATCTGCACCTTCCCGCCTCC-3’，SEQ ID NO:221)或引物探针集hTau 10_11接合序列(正向序列5’-AATATCAAACACGTCCCGGGAG-3’，SEQ ID NO:222；反向序列5’-TGCCTAATGAGCCACACTTG-3’，SEQ ID NO:223；探针序列5’-GTCTACAAACCAGTTGACCTGAGC-3’，SEQ ID NO:224)分析4R同工型。使用引物探针集RTS3104(正向序列5’-AAGATTGGGTCCCTGGACAAT-3’，SEQ ID NO:225；反向序列5’-AGCTTGTGGGTTTCAATCTTTTTATT-3’，SEQ ID NO:226；探针序列5’-CACCCACGTCCCTGGCGGA-3’，SEQ ID NO:227)分析总Tau。将4R同工型与总Tau mRNA水平的比率标准化为小鼠GAPDH水平，所述小鼠GAPDH水平是使用引物探针集mGapdh_LTS00102(正向序列5’-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3’，SEQ ID NO:228；反向序列5’-GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT-3’，SEQID NO:229；探针序列5’-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-3’，SEQ ID NO:230)分析的。结果在表13-15中呈现为每个治疗组经标准化为GAPDH水平的4R同工型与总Tau mRNA的平均比率除以PBS组的平均比率。“ND”指示无数据。
还通过执行RT-PCT评估了炎症，以确定皮层、海马和/或脊髓中AIF1的表达水平。在所有样品标准化为GADPH之后，将每个治疗组的平均AIF1值除以PBS对照组的平均AIF1值。结果呈现于表13-15中。
表13
修饰寡核苷酸对转基因小鼠中Tau外显子10跳跃的作用
Figure BDA0002379293430001061
表14
修饰寡核苷酸对转基因小鼠中Tau外显子10跳跃的作用
Figure BDA0002379293430001062
表15
修饰寡核苷酸对转基因小鼠中Tau外显子10跳跃的作用
Figure BDA0002379293430001063
Figure BDA0002379293430001071
实施例10：混合主链寡核苷酸对人Tau外显子10跳跃的体内作用
通过ICV团注对每组四只B6.Cg-Mapttm1(EGFP)Klt Tg(MAPT)8cPdav/J小鼠(见实施例9)的组施用125μg选自表3、4或9的寡核苷酸或PBS。所述剂量两周以后，处死动物，并且从大脑皮层和/或海马提取RNA并如实施例9中所述加以分析。结果在表16和17中呈现为对于每个治疗组经标准化为PBS的4R同工型与总Tau mRNA的平均比率。
通过执行RT-PCT来测试异体移植炎症因子(AIF1)的表达作为炎症的量度，以确定AIF1在皮层和脊髓中的表达水平。在所有样品标准化为GADPH之后，将每个治疗组的平均AIF1值除以PBS对照组的平均AIF1值。结果呈现于表16和17中。
表16
修饰寡核苷酸对转基因小鼠中Tau外显子10跳跃的作用
Figure BDA0002379293430001072
Figure BDA0002379293430001081
表17
修饰寡核苷酸对转基因小鼠中Tau外显子10跳跃的作用
Figure BDA0002379293430001082
序列表
<110> IONIS制药公司
<120> 用于调节TAU表达的组合物和方法
<130> BIOL0220WO
<150> 61/785,177
<151> 2013-03-14
<150> 61/943,931
<151> 2014-02-24
<160> 232
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 141001
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
aatttataaa ggaaaaaggt ttaattgact cacagttcag catgtctggg gaagtgttag 60
gaaacttaca atcatggcag aagagaaagc aaaccatcct ttctcacatg gtgacaggaa 120
gagcaaagcg gggtaagccc cttacaaaac caccagatct catgagaact cactatcacg 180
agaacaccat ggaggtaact gcccccatga ttcaattacc tcccaccagg tccctcccac 240
gacatgtggg gattatgcga actccaactc aagatgagat ttgggtgggg acacagccaa 300
accatatcag aagcttaacc ttctttggag catgattatt cagttgaacc taagttcagt 360
agtcacccag ttatgctgtc ttcagctact attttccata tgtttctcaa acatctgata 420
tatcacactg gctagtgcac tttcttccac cagcatacca tctcaattta ccactttaac 480
aattggactg ccactttgtg tcagggacta tctgtgctcc aactactaca agtgataagg 540
tcctcactga cagccaggga gcaagtgatc cagctctaaa actcacctta tcatctgctt 600
tcctagacca ctcctaacaa ccaactattc tgggttgagt tctccaagag gcagagagtt 660
caggatacag aatgttgttt tgtttttgtt gttgttgctg ttgttgtttg tgtgtgtgtt 720
tgggcttttt tgagacggag tctcactctg ttgcccaggt agaagtgcag tggcatgatc 780
tcagctccct gcaacctcca cctcctgggt ttaagtgatt cccctgcctc cacctcctga 840
gtagctggga ctacaagtgt gcgccaccac acccagctaa tttttgtgtt tttagtagaa 900
atggggtttt accatgttgg ctaggctgct cccaaactcc tgacctccag tgatccacct 960
acctctgcct cccaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc accacaccca gcccagaatg 1020
tttattagaa tgcacaatta ataccagagg cagtggggaa ggaaggactg agcagaggag 1080
gaagttgagt tgtgattcaa cccaacaact gcctggctgg catggggagc tctggagtta 1140
aatagggcca tcagactttc ccagtgtggg gccaacatga ctgggtcttt atacccccac 1200
ctctgtcagt cactcaacgt ggtctccctg caacaaggtg actcttgcag ccgagacaat 1260
ccctgaaggg acagagggct gaagcctgtc tgccaacagc actcccagtg gctggaacaa 1320
gtccttccct ataggggaat ctgggcggca cacctccatc tccatgtcca tcacatacga 1380
tatcacagac atttaaatat tttgataact gtacataaga gtttccttta taatcttata 1440
gatcttattt tatgcatttg aaaatattct tctgagacag ggcttttatc atattgccat 1500
agggtgccac gatataaaaa aggttaaata ctctctgatt cagaagtatc caatgatgac 1560
ttctctctca tgcatttaat tgaaaatctg gtttttctcc ttctctgcta gttctctacc 1620
tctctcccca cctcccacat catagcctat tcacatatgt ctgaatctca tgatagacaa 1680
gttcaggttc ttttcccagg ttctttttac cacatccccc cacccccaca taaaaagtat 1740
atatggcaca gcctaggttc cacccaaatc ctttctcctc ttcttcctgg gcccacaact 1800
ctcctacata cattggtata ccttgcgctt agggatggcc atgtgactaa gttctaacag 1860
tggaacatga tcagatgcca cttccagcct ctaagacagc cagtgtgttt cctccataag 1920
ctccttctct tcctcccaac tggagactct aaatgatgac cctgcctcaa gcaagcaaac 1980
aacaagtccc tcaggggtgg tgtaggctgc aaatggaagg agcttgagtc ccaaaccttc 2040
cacggagaag gctggctacc aacctggatc actcacccaa gactgctcga agagttggtt 2100
tgaaccattg tgttttgggg tctatttatt acaacagttt agcttgcttt gtgaatagat 2160
ttagtggcag agcctccaaa ttctatagat acattgatct cagtcctaac cgcatctgga 2220
acaccattaa ataaaggaat tgcaaaccca gagaaggtaa tgaatttgtc taaggtcata 2280
caagatggct aggatcagga cccaactctc cagttttctt tcttctctgc tattctgcct 2340
tctgtgatcc tacataagtg ggcatgattg tataacatat gcggccatga gatttctctt 2400
tcagcaagag aaagggacag gaagaaagag agggaatgca ttttcttggc ctgaattagt 2460
gtgagccatt agttacctac attgactaaa ttatctggaa tgaacattca actctacatc 2520
acatatagtt aaaatgacag atctgcttaa gattgtttct agcatacgtt atttcaattt 2580
aggcaaatgt gaccattcag tgtgagggga ccatactgtc attaggtccc tgtcagttct 2640
caattatact gttatcttag agggggaaaa atgtgaaatt tgaatgtaga cgagtgttga 2700
tttgactgct acagtttatt ttacgtatag aaataaaata atgtgtagca aaagcattat 2760
tacaaagatg ataatgaaat aactagtatt tataatagta taatagtata gtatttataa 2820
tagtatgata gtttaatgac tatttgtcag atgttgtgta agaaacttta tacacacaca 2880
cacacacacc tcatttaatt cctgtatcaa tcaggataca ggacgctgtg gtaacaactc 2940
ctcaaatctc ggtggcttgc acaacaaatg cttatttctt tttttttttt gacaccaagt 3000
cttgctctgt aacaggctgg agtgcaatgg tgcaatctcg gctcactgca gcctctgcct 3060
cctgggttca agcgattctc ctgcctcagt ctctcgagta gctgggaaca caggcacgcg 3120
ccaccacatc tggctaattt ttgtgatttt agtagagatg ggatttcacc atgttgctca 3180
ggctggcctt gaactcctga cctcaagcga tccacccacc tcagcctccc aaagtgctgg 3240
gattacaggc atgagccact gcgcccagcc ccaaatgttt atttcttgct catgtgacat 3300
gtacttcctc gagtttttcc ttcctgagat ctaagctgaa ggaacagctc tctggagcca 3360
cgccattctg gtggcggaaa ggaagagtaa aagtggtaga accttgcaat gctcttgaag 3420
cgcctatttg gaatgtctac atcatgtaaa tggtaatgga caagtatgta taatccccac 3480
accaaaaaaa ggggacacta ttggggacaa taaccacatt tcaatgctgc aagacggata 3540
ttgactgcac ccccttccca ctttcagaaa gaagaagagt aattttgctg aactccttct 3600
agagactgga aatgtccctt ccagttgggg tgattaggga aggctttggt aaaatttgag 3660
ctagagtttg aaggttaggt agactactgg tgggtgaaga aagaacaagg acctttgtag 3720
gcaaaggaaa acctcagaat tacagaggtg gaaaaagagt tctagtcaag ccacttcagc 3780
tggctacaga gtaggtggga aagaaaatgg gaggacaagg gctcagatga tggggggttg 3840
gggcattggg gggacacttg aaagctaaac taaggggttg aacttaattt aggaggcagt 3900
tagaagcttt tacatatttt tgagcaagag agtgacataa ttaaaatgat ctgggccagg 3960
tgtggtggct cacacctgta atcccagcac tttgggaggc tgaggagctt gggtcacctg 4020
aggtcaggag atcgagacca gcctggccaa catggtgaaa tcccgtccta ctaaaaatac 4080
aaaaattagc cgggagtggt ggcatatgcc tgtaatccca gtagctggga ggctgagaca 4140
ggaaaatcgc ttgaacccgg gaaacaggtt gcagtgagcc gagatcgtgc cactgcactc 4200
cagcctgggc aacagagcga gactccatct caaaaaaaca aaacaaacac acacaaaaaa 4260
ccaaaaataa ataaataaaa tgatcacttc tgaatactga tctaactagg ggttgcaggg 4320
tgggctgata tagggagaaa ctggagagca aggagatcac taaggtccct acatgtccag 4380
aaccaagata gaggtcttga actaggatgg tggcagttag aacaacaaca acaaaaagtc 4440
aattccaggc tgagtgcagt ggctcatgcc tgtaatccca acgctttggg aggctgaggt 4500
gggagttaga aagcagcctg ggcaacactg caagacctcc tctctaaaaa aaaaaaaaaa 4560
aaaaagttag ccaggtgtgg tggtgcccac ctgtagtccc agcaactcag aaggctgagg 4620
tgggaagatt gcttgagccc caggagttca agcttgccgt gagctacgat tgtgccactg 4680
cactccagcc tgagcaagac cttgtctcca aaaaaaggtc aattccactg acttttctaa 4740
ggtgtacacc atcaaggggc agctccatct ccaggccatt ggctcatgag acattctgta 4800
gtcagaaggc tagggcagat tgctttgagc aagcccccat ggtggttctc actcctactt 4860
ctttgggtat atgcccctct gtttaaaaat aaagttaata tgcatttaaa aaaaaaaagg 4920
agaaaaaggt cagttccaga aactgtgtga ataaagcatt ttacttgctt tttctattaa 4980
tctataacat atgttgattt tttaaaaaga atataagagc tatgcaaatt ggagcttcaa 5040
gacaacttcc catctcccta ggaggagatg gctgccctaa acccccctac atagaaatca 5100
tcccactgct tgggcttaaa cttgatgttg gggaaatgaa aaatccaagc taaggccgaa 5160
gcctggggcc tgggcgacca gcagaatgag gaccactggt cagtttcagg ctgaggtgcg 5220
tcttccaggg gacaatctct agctggccct taaacattca gacttcaagc tctatttaca 5280
gcataaaggt gtttcaaaag acgtgataca aataactgca aatgctctgc gatgtgttaa 5340
gcactgtttg aaattcgtct aatttaagat ttttttttct gacgtaacgg ttagattcac 5400
gtttcttttt ttttaagtac agttctactg tattgtaact gagttagctt gctttaagcc 5460
gatttgttaa ggaaaggatt caccttggtc agtaacaaaa aaggtgggaa aaaagcaagg 5520
agaaaggaag cagcctgggg gaaagagacc ttagccaggg gggcggtttc gggactacga 5580
agggtcgggg cggacggact cgagggccgg ccacgtggaa ggccgctcag gacttctgta 5640
ggagaggaca ccgccccagg ctgactgaaa gtaaagggca gcggacccag cggcggagcc 5700
actggccttg ccccgacccc gcatggcccg aaggaggaca cccacccccg caacgacaca 5760
aagactccaa ctacaggagg tggagaaagc gcgtgcgcca cggaacgcgc gtgcgcgctg 5820
cggtcagcgc cgcggcctga ggcgtagcgg gagggggacc gcgaaagggc agcgccgaga 5880
ggaacgagcc gggagacgcc ggacggccga gcggcagggc gctcgcgcgc gcccactagt 5940
ggccggagga gaaggctccc gcggaggccg cgctgcccgc cccctcccct ggggaggctc 6000
gcgttcccgc tgctcgcgcc tgcgccgccc gccggcctca ggaacgcgcc ctcttcgccg 6060
gcgcgcgccc tcgcagtcac cgccacccac cagctccggc accaacagca gcgccgctgc 6120
caccgcccac cttctgccgc cgccaccaca gccaccttct cctcctccgc tgtcctctcc 6180
cgtcctcgcc tctgtcgact atcaggtaag cgccgcggct ccgaaatctg cctcgccgtc 6240
cgcctctgtg cacccctgcg ccgccgcccc tcgccctccc tctccgcaga ctggggcttc 6300
gtgcgccggg catcggtcgg ggccaccgca gggcccctcc ctgcctcccc tgctcggggg 6360
ctggggccag ggcggcctgg aaagggacct gagcaaggga tgcacgcacg cgtgagtgcg 6420
cgcgtgtgtg tgtgctggag ggtcttcacc accagattcg cgcagacccc aggtggaggc 6480
tgtgccggca gggtggggcg cggcggcggt gacttggggg agggggctgc ccttcactct 6540
cgactgcagc cttttgccgc aatgggcgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 6600
tgtgtgtgtg gaggggtccg ataacgaccc ccgaaaccga atctgaaatc cgctgtccct 6660
gccgctgttc gccatcagct ctaagaaaga cgtggatcgg gttctagaaa agatgactcc 6720
ctgcacgccc ctccctgcac ctcccgagca gtgattccga cagggccttc actgcccctg 6780
attttaggcg ggggccggcc ccctcccctt ttcctccttc agaaacccgt aggggacatt 6840
tgggggctgg gagaaatcga ggagatgggg aggggtccac gcgctgtcac tttagttgcc 6900
cttccccctg cgcacgcctg gcacagagac gcgagcagcg ccgtgcctga gaacagtgcg 6960
cggatcccac tgtgcacgct cgcaaaggca gggttcacct ggcctggcga tgtggacgga 7020
ctcggcggcc gctggtcccc gttcgcgggc acgcacagcc gcagccacgc acggatgggc 7080
gcggggctgc aggtgcatct cggggcggat ttctttctca gcgctcggag cgcagggcgc 7140
ccggcgtgtg cgctccctgc cggaggcgcg gggctggcgc gcagggctcg cccctcactg 7200
cggcagtggg tgtggaccct ggtgggcgag gaagggggag gataggctgt gcctcctccc 7260
actcccgccc ccagcccccc tttttttccc cctcggaacg cgaggtgcca tcttttttcg 7320
gcgtgtcacg tctttacggt gccatgccaa accgggtggc cgggcttcat aggacagggc 7380
ggggcctggc attaaaggga gggggacaat cagcgctgaa atcttggcgt tttgctgctg 7440
cgggcgtgag cactgggggc gttcgcccag caccttcttc gggggctctt tgctttgtct 7500
gtagaggtta cgtgatctgc gctcccagcc ctggtttctg gcttttattc tgagggtgtt 7560
cagtcaacct cccccctacg cccatgcgcc tctctttcct ttttcgctcc tcatttccga 7620
gcccattgtt ggatctcgag gcttgctggg ttcgatgaac tcgagtcaac cccccgaccc 7680
ccggcacgca tggaacgggc gtgaccgcgc gcagcctcgt ctcggagtct gccggcgccg 7740
ggaagcttct gaagggatgg gattcgagtc tccgtgcgcg ctgcgggcgg cggcagaggg 7800
atctcgcccc tccctacacc ccaagtgtcc tgagggccac gccacaccag gttgcccagc 7860
gagggacgct ggctacccat ccggggatgg gtggggagcc ctggcggggc ctctccggct 7920
ttacgccctg ttgcttcgcc tggccggaga atgtgaggaa ggggcataag gttactggtg 7980
cttcggccac acccatcttt ctgagcccac tggactgggc gcagaggggg gattgccatg 8040
gaaaccacag gtgtccggag aggggatctt ggggctggcc tcaccccttc cctgcggaga 8100
ttggggaccc tggggtaggg ggagccgcgc ccagtcggcc tcctggagga cacgggagga 8160
agccccgaac ccccgcgcct gaggctgttt ctgattggcc cctggaggcc gcagacacgc 8220
agataggcgg ccctgggtgt atttttatta atattatgtc cgtactgatt aatattattt 8280
atcttaaata aatttcaccc gtgtccaagt tcaccgcgcc cccaaaaccg agtctggggc 8340
ggcaggggga actcctggcc aacgaatcca tgcctcgccc tcctgtgatg aacctggtac 8400
gcacggtttt ctggttaatt ctatcgctga aaactggtgc ggggggcgca cttctgagac 8460
ggaagagcat ctaggagctg aatcctccac gcgggtcgcc caggttgatc tgaatttctg 8520
gggaatggct tggctgcccg cccgggacca ggccgaccct ccttgacggt ggcgtagagg 8580
gctggagcct gggtactgcg aggctcctcg catggctggg cccgccgcga ggggttgcag 8640
agcggctcag ggatcgattc aagcatcgtc tctcctccct cgcccccaga cagagctggg 8700
cgcggggttc cccttccaga tggagcgagg gtctcggggt ggccccggaa aaggggagcc 8760
cgcggccacg gctacgtatt gccatctcgc gagcagagat gtcacctcct gcctttggag 8820
gaaagggagc ccggtgggga tgagcgcatt tagcccaatg ctgggaacaa agcgcactcc 8880
gcgcttctgc gatttcgctc cattttgaaa tgtgttggcg ctttggtggg gccgctgcgg 8940
tgggcaaggc cgggggcgct gttaatggag gaacctcagg gggacggtcc ttcgtaggaa 9000
actctatcct ggctctgcgc gcgctttaag gaaatggctt ccctccagga cctcgaggga 9060
tgcagctttt gcgcggatga cggtggggtg ctgaaccagc cggtgcgcct ctggaaatgt 9120
ctgggcacgg atcctggggc catcgacgac tcctccccat tcccagcagg cgggagctct 9180
tacattccga gcgagtgacc cctctcaccc tctggcgctc acacacctgt aactccaaac 9240
ctccgtctca gaatggtcca ggctggaagg gatgatgggg gctccgacag cgactgccta 9300
gctcacccct ctgcgtgctc aggctccagg ctcagcagga ccaatttgag ttctatctga 9360
tccccctcgg ccccttaact gacccatcct acaggagaca gggaaatgtc tttcctaccg 9420
cggttgattc tggggtgtca ttttgtgttt tgtgatggct gcttatattt actgtataag 9480
cattgtattt actgtataag cattgtatta taattactgt ataagctgct tatatttact 9540
gtataagcat ctccaaatcc tccctctacg taaacaaatt aatggataaa cagataagtg 9600
tatcccctgc ccccacccct gctacgcagg tccggagtga ctcttgaagc tcatacattc 9660
cttggccaag tttgcttctc taacagatgt ttatatagca ataacctggc ttggctcttg 9720
ggttcacctt tggacgattt ggggaagggg cttgttggct ttgctgggtt ttggatgagt 9780
gacagtccat gactgttcct gctggaaggg cgtgactttt aagtggtttc taatatcagg 9840
cattgctcct ccgacaggaa caaaagaaat ggatactgcc cataaattgt tagaaaactt 9900
agaatcgctt tgattgagga aaggttagat ttattccggt tggaaaaagt ggcctttcta 9960
ttaaacgtgc cctttgaccc tcatgccctt ggaggtcggt gccagcctgg agatgggata 10020
agattgtggt tttccttctg cctttttaac atctgttgtt acagtccatt tgttgaaaat 10080
ttaaagaaac tgttttattc cactttccct cagcatttat gtgtgtggtt tcagtagctc 10140
tgtggctata tgtacgaaca cgtgttattt ttccaattgg acatgtgata attttccaac 10200
tggaccttgc cttctattga tgtatttatt tagcatcttc cttactccct ccttgaaaaa 10260
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tgatcctgat tttggacttt ggccttcaga agtgtgaggg aatgaatatc tgttgtttta 24180
agccaccaag tttatggtca tttcctacag cagccacagg aatcaaaaac agtaagtatg 24240
tcccatgcaa tgtttgtgac acacaccaaa aatattactt gttgttcacc tgaaattcaa 24300
atttaactgg gtctcctgta ttttatttgg ccaacctagt tcccaggccc aaagaaagag 24360
gcttttgaaa tttgcaagaa agctggttgg agctgtcaga aagtggactt tgtaaacaca 24420
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aaagaaaaag aattgcaaga aataaattat tgtttatgag ctatatggtc tgtggtacct 30660
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cacatcatgc agctattcat tgactcagca agtatcagct ttgcatgcga ccttggccta 35160
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gttctgtgtg gctccagggc actgagcagg acccatttgc caaagtctca gggacacagt 52260
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ctgtgccaca gagggagtgt ttgcaatttc cagactaaaa gtccccatgt gcttgacggg 80100
gtatgtgact acaacgtgat gcttgacttt tcctcatatg accagagcca ctttgtccat 80160
ctggtacaat gtcagctatc tgctaggggc cctccaggat tcccagtcaa ttccatatct 80220
gcatcaccac cattggcact aaataaaata aaatactcaa gttcctgctg gtgagcatga 80280
gcagtgctac actgggccct tcaaccaagg tgacatgata atgactgaaa ataatcactg 80340
ccacttattg gggacgtctc atctgccagg catggtacaa agtgctttaa ataagcattc 80400
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gtcttccaga gttgagtcta agccatgaat aggacaatta gacagcagag gaaacccatt 80640
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aggggattct cgctacaccc aaaccagata ccatctagag gctagaatct ttgggaggct 93960
caaattccct agaaagcagg agaagcttct gtagccctcc cgctttccca gtagattaag 94020
cccagggcgg ctccagatgt gtgacatgct ctgtgcccaa ccagagccca tcataggcag 94080
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acttgtctga ggccacacag cttgttggag cccatctctt gacccaaaga ctgtggagcc 107640
gagttggcca cctctctggg agcgggtatt ggatggtggt tgatggtttt ccattgcttt 107700
cctgggaaag gggtgtctct gtccctaagc aaaaaggcag ggaggaagag atgcttcccc 107760
agggcagccg tctgctgtag ctgcgcttcc aacctggctt ccacctgcct aacccagtgg 107820
tgagcctggg aatggaccca cgggacaggc agcccccagg gccttttctg accccaccca 107880
ctcgagtcct ggcttcactc ccttccttcc ttcccaggtg aacctccaaa atcaggggat 107940
cgcagcggct acagcagccc cggctcccca ggcactcccg gcagccgctc ccgcaccccg 108000
tcccttccaa ccccacccac ccgggagccc aagaaggtgg cagtggtccg tactccaccc 108060
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aagaatgtca agtccaagat cggctccact gagaacctga agcaccagcc gggaggcggg 108180
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tctggaccct cttcaaggaa gttcagttct ttattgggct ctccactaca ctgtgagtgc 108420
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gggagagggc tggtgggtgg atggaaggag aaggcacagc ccccccttgc agggacagag 121140
ccctcgtaca gaagggacac cccacatttg tcttccccac aaagcggcct gtgtcctgcc 121200
tacggggtca gggcttctca aacctggctg tgtgtcagaa tcaccagggg aacttttcaa 121260
aactagagag actgaagcca gactcctaga ttctaattct aggtcagggc taggggctga 121320
gattgtaaaa atccacaggt gattctgatg cccggcaggc ttgagaacag ccgcagggag 121380
ttctctggga atgtgccggt gggtctagcc aggtgtgagt ggagatgccg gggaacttcc 121440
tattactcac tcgtcagtgt ggccgaacac atttttcact tgacctcagg ctggtgaacg 121500
ctcccctctg gggttcaggc ctcacgatgc catccttttg tgaagtgagg acctgcaatc 121560
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cttcaaccta ggcaacagag tgagactttg tctcaaaaaa caatcatata ataattttaa 122940
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tgtctactaa aaatacaaaa actagccagg catggtggca catgcctgta atcccagcta 127800
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ctcacactgt gtagaaatta gtgctgtcgg ccaggcgcgg tggctcatgc ctgtaatcgc 128040
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gtgatggaaa tattctgtat ctgtgctgtc cagtatagta gccactagct acatgtggca 128400
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agataggtag atgattgata gatagataga tagataaata gatggataga taagtcgcta 134460
gacagtcatc catccaccca tccacacata aaaaggcctt tgtcatgtca tgttttgtgg 134520
cccacctgcc agtgttgccc acagttgctg cccctccaaa ctcatcagtc actggcaaac 134580
aggaggaatg tgtggctcat gtctgggcat cagtggctgt gggagacatc cttgatcttc 134640
tccagcttct ccttccacat tttcctttgc aatctggcaa tatctattaa aataaaatgt 134700
gcatgccttt tgacctaaga gcttcacttc taggacccac ttacacgtgt gtgacatgat 134760
gttcatacgg gtttatttat ctgaggttgt tcatacacac cattgcctgt aatcactaaa 134820
ggcgggagca gcctacacat ccatccacag aggagtagat gccttttggt acatccgtgg 134880
cgacggaata ctaagcagcc tgtgtatcta tacactcaca cgtgtttgtt tatgtgtgga 134940
atatctctgg agggtacaca agaaacttaa aatgatcact gtctctgggg agggtacctg 135000
ggtgcctggg aggcaggtca gggaaggagt gggcacaggt attaccaatt ggaagacaat 135060
aaaaacaaca gctcctggcc aggcgcagtg gctcacgcct gtaatggcag cactctgaga 135120
ggctgaggcg ggcagattgc ttgcgtccag gagttcaaga ccagcctggg caacatagca 135180
aaaccccgtt tctattaaaa atacaaaaaa ttagccaggt gtggtggcat gcacctgtaa 135240
tcccagctac tcgggaggct gaggtgggag aatcacctga gcctgggagg tcaaggctgc 135300
agtgaggtga gattgtgcca ccgcactcta gcctgggcga tagagcaaga ccctgtctca 135360
aaaacaaaca aaaaacagtc cctggcactc tgggccaggc ctggcagggc agttggcagg 135420
gctggtcttt ctctggcact tcatctcacc ctccctccct tcctcttctt gcagattgaa 135480
acccacaagc tgaccttccg cgagaacgcc aaagccaaga cagaccacgg ggcggagatc 135540
gtgtacaagt cgccagtggt gtctggggac acgtctccac ggcatctcag caatgtctcc 135600
tccaccggca gcatcgacat ggtagactcg ccccagctcg ccacgctagc tgacgaggtg 135660
tctgcctccc tggccaagca gggtttgtga tcaggcccct ggggcggtca ataattgtgg 135720
agaggagaga atgagagagt gtggaaaaaa aaagaataat gacccggccc ccgccctctg 135780
cccccagctg ctcctcgcag ttcggttaat tggttaatca cttaacctgc ttttgtcact 135840
cggctttggc tcgggacttc aaaatcagtg atgggagtaa gagcaaattt catctttcca 135900
aattgatggg tgggctagta ataaaatatt taaaaaaaaa cattcaaaaa catggccaca 135960
tccaacattt cctcaggcaa ttccttttga ttcttttttc ttccccctcc atgtagaaga 136020
gggagaagga gaggctctga aagctgcttc tgggggattt caagggactg ggggtgccaa 136080
ccacctctgg ccctgttgtg ggggtgtcac agaggcagtg gcagcaacaa aggatttgaa 136140
acttggtgtg ttcgtggagc cacaggcaga cgatgtcaac cttgtgtgag tgtgacgggg 136200
gttggggtgg ggcgggaggc cacgggggag gccgaggcag gggctgggca gaggggagag 136260
gaagcacaag aagtgggagt gggagaggaa gccacgtgct ggagagtaga catccccctc 136320
cttgccgctg ggagagccaa ggcctatgcc acctgcagcg tctgagcggc cgcctgtcct 136380
tggtggccgg gggtgggggc ctgctgtggg tcagtgtgcc accctctgca gggcagcctg 136440
tgggagaagg gacagcgggt aaaaagagaa ggcaagctgg caggagggtg gcacttcgtg 136500
gatgacctcc ttagaaaaga ctgaccttga tgtcttgaga gcgctggcct cttcctccct 136560
ccctgcaggg tagggggcct gagttgaggg gcttccctct gctccacaga aaccctgttt 136620
tattgagttc tgaaggttgg aactgctgcc atgattttgg ccactttgca gacctgggac 136680
tttagggcta accagttctc tttgtaagga cttgtgcctc ttgggagacg tccacccgtt 136740
tccaagcctg ggccactggc atctctggag tgtgtggggg tctgggaggc aggtcccgag 136800
ccccctgtcc ttcccacggc cactgcagtc accccgtctg cgccgctgtg ctgttgtctg 136860
ccgtgagagc ccaatcactg cctatacccc tcatcacacg tcacaatgtc ccgaattccc 136920
agcctcacca ccccttctca gtaatgaccc tggttggttg caggaggtac ctactccata 136980
ctgagggtga aattaaggga aggcaaagtc caggcacaag agtgggaccc cagcctctca 137040
ctctcagttc cactcatcca actgggaccc tcaccacgaa tctcatgatc tgattcggtt 137100
ccctgtctcc tcctcccgtc acagatgtga gccagggcac tgctcagctg tgaccctagg 137160
tgtttctgcc ttgttgacat ggagagagcc ctttcccctg agaaggcctg gccccttcct 137220
gtgctgagcc cacagcagca ggctgggtgt cttggttgtc agtggtggca ccaggatgga 137280
agggcaaggc acccagggca ggcccacagt cccgctgtcc cccacttgca ccctagcttg 137340
tagctgccaa cctcccagac agcccagccc gctgctcagc tccacatgca tagtatcagc 137400
cctccacacc cgacaaaggg gaacacaccc ccttggaaat ggttcttttc ccccagtccc 137460
agctggaagc catgctgtct gttctgctgg agcagctgaa catatacata gatgttgccc 137520
tgccctcccc atctgcaccc tgttgagttg tagttggatt tgtctgttta tgcttggatt 137580
caccagagtg actatgatag tgaaaagaaa aaaaaaaaaa aaaaaggacg catgtatctt 137640
gaaatgcttg taaagaggtt tctaacccac cctcacgagg tgtctctcac ccccacactg 137700
ggactcgtgt ggcctgtgtg gtgccaccct gctggggcct cccaagtttt gaaaggcttt 137760
cctcagcacc tgggacccaa cagagaccag cttctagcag ctaaggaggc cgttcagctg 137820
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aactcctgca tcacaagaaa aaggaagcca ctgccagctg gggggatctg cagctcccag 138060
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tcaggagaca ctgttcccaa agccttgacc agagcacctc agcccgctga ccttgcacaa 138300
actccatctg ctgccatgag aaaagggaag ccgcctttgc aaaacattgc tgcctaaaga 138360
aactcagcag cctcaggccc aattctgcca cttctggttt gggtacagtt aaaggcaacc 138420
ctgagggact tggcagtaga aatccagggc ctcccctggg gctggcagct tcgtgtgcag 138480
ctagagcttt acctgaaagg aagtctctgg gcccagaact ctccaccaag agcctccctg 138540
ccgttcgctg agtcccagca attctcctaa gttgaaggga tctgagaagg agaaggaaat 138600
gtggggtaga tttggtggtg gttagagata tgcccccctc attactgcca acagtttcgg 138660
ctgcatttct tcacgcacct cggttcctct tcctgaagtt cttgtgccct gctcttcagc 138720
accatgggcc ttcttatacg gaaggctctg ggatctcccc cttgtggggc aggctcttgg 138780
ggccagccta agatcatggt ttagggtgat cagtgctggc agataaattg aaaaggcacg 138840
ctggcttgtg atcttaaatg aggacaatcc ccccagggct gggcactcct cccctcccct 138900
cacttctccc acctgcagag ccagtgtcct tgggtgggct agataggata tactgtatgc 138960
cggctccttc aagctgctga ctcactttat caatagttcc atttaaattg acttcagtgg 139020
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ccttggggtt tctcttttcc actgacaggc tttcccaggc agctggctag ttcattccct 139260
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ttctgatttc tcttcagctt tgaaaagggt taccctgggc actggcctag agcctcacct 139620
cctaatagac ttagccccat gagtttgcca tgttgagcag gactatttct ggcacttgca 139680
agtcccatga tttcttcggt aattctgagg gtggggggag ggacatgaaa tcatcttagc 139740
ttagctttct gtctgtgaat gtctatatag tgtattgtgt gttttaacaa atgatttaca 139800
ctgactgttg ctgtaaaagt gaatttggaa ataaagttat tactctgatt aaataaggtc 139860
tccattcatg gattccaagg acaagaaagt catatagaat gtctattttt taagttcttt 139920
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ttgcagttgc ttctttgtga tgctggcaaa ccatcctagt cccattcaaa gggcaataca 140100
aagccttgtg gctgacctca cgatgcagca ctcagtttgc aagaccggca ccagtgtatg 140160
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gaggcctggg gctggagcag aacaccaagc caatcagctt aatgaatggc ttagattcct 140280
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caaaaacaaa acagtaatcc atcatattat tccttagtaa ctatgccaag gtcatgatac 140460
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cgcaggcaga tgtttaagta aaacagattt taactgcagc tacaaaagca gcaacaggcc 140580
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cacttattca tcttgtacaa aaaaaaagca cctaccagcc taggctacat agtgagacac 140760
tatctccaca aaaaacccac gaaaactagc tgggtatggt ggcacatgcc tacagtccca 140820
gctactggta aggctgtggt gggaggatct cttgaggcca ggaaggagat ccaggctgca 140880
gtgagccaag attgcaccac tgcactccag tctggacaat cgagcaagat cccatctcaa 140940
acaataaaaa aaaaaagcgt gtaacctcct cagaagaaag atgttataat ctcaggcagc 141000
a 141001
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
cactgagaac ctgaagcacc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
ggactggacg ttgctaagat c 21
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Probe
<400> 4
ttaattatct gcaccttccc gcctcc 26
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
ggataatatc aaacacgtcc cg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
tgcctaatga gccacacttg 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Probe
<400> 7
gtctacaaac cagttgacct gagc 24
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 8
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<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 9
tggacccgcc tacttgct 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 10
accctggacc cgcctact 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 11
catgcgccac cctggacc 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 12
gtgacatgcg ccaccctg 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 13
atgagtgaca tgcgccac 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 14
ttcgatgagt gacatgcg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 15
cactttcgat gagtgaca 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
cctccacttt cgatgagt 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
gacgcctcca ctttcgat 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 18
caaggacgcc tccacttt 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
ctcgcaagga cgcctcca 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
cttgctcgca aggacgcc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
cctgcttgct cgcaagga 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
cccgcctgct tgctcgca 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
tggacccgcc tgcttgct 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
accctggacc cgcctgct 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
cgccaccctg gacccgcc 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
gacacgccac cctggacc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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gagtgacacg ccaccctg 18
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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ggatgagtga cacgccac 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
aaaaggatga gtgacacg 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
agaaaaaagg atgagtga 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
agccagaaaa aaggatga 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
tggtagccag aaaaaagg 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
ttatcctttg agccacac 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
gatattatcc tttgagcc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
gtttgatatt atcctttg 18
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
acgtgtttga tattatcc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 37
cgggacgtgt ttgatatt 18
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
ctcccgggac gtgtttga 18
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
ccgcctcccg ggacgtgt 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
actgccgcct cccgggac 18
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 41
tcacactgcc gcctcccg 18
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
gtactcacac tgccgcct 18
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 43
gaaggtactc acactgcc 18
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
gtgtgaaggt actcacac 18
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
ggacgtgtga aggtactc 18
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
catgggacgt gtgaaggt 18
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 47
ggcgcatggg acgtgtga 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 48
gcacggcgca tgggacgt 18
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 49
cacagcacgg cgcatggg 18
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 50
aagccacagc acggcgca 18
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 51
attcaagcca cagcacgg 18
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 52
aataattcaa gccacagc 18
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 53
tcctaataat tcaagcca 18
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 54
cacttcctaa taattcaa 18
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 55
acaccacttc ctaataat 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 56
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 57
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 58
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 59
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<212> DNA
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<220>
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<400> 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 61
atgcagtgtc tcgcaagt 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 62
ttctatgcag tgtctcgc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 63
tttattctat gcagtgtc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 72
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<400> 74
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 85
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 94
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 95
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<212> DNA
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<400> 96
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 98
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 100
tctgcacctt tggtagcc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 101
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<212> DNA
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<220>
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<400> 102
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<212> DNA
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<220>
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<400> 103
ttatctgcac ctttggta 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 104
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 105
aattatctgc acctttgg 18
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
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<400> 106
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 107
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
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<400> 108
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 110
cttattaatt atctgcac 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 111
tcttattaat tatctgca 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 112
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 113
cttcttatta attatctg 18
<210> 114
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 114
gcttcttatt aattatct 18
<210> 115
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 115
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<210> 116
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 116
cagcttctta ttaattat 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 117
ccagcttctt attaatta 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 118
tccagcttct tattaatt 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 119
atccagcttc ttattaat 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 120
gatccagctt cttattaa 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 121
agatccagct tcttatta 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 122
aagatccagc ttcttatt 18
<210> 123
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 123
taagatccag cttcttat 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 124
ctaagatcca gcttctta 18
<210> 125
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 125
tgctaagatc cagcttct 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 126
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 127
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 128
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<210> 129
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 129
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<210> 130
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 130
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 131
ctggacgttg ctaagatc 18
<210> 132
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 132
actggacgtt gctaagat 18
<210> 133
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 133
gactggacgt tgctaaga 18
<210> 134
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 134
tggactggac gttgctaa 18
<210> 135
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 135
ttggactgga cgttgcta 18
<210> 136
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 136
cttggactgg acgttgct 18
<210> 137
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 137
cacttggact ggacgttg 18
<210> 138
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 138
acacttggac tggacgtt 18
<210> 139
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 139
cacacttgga ctggacgt 18
<210> 140
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 140
gccacacttg gactggac 18
<210> 141
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 141
agccacactt ggactgga 18
<210> 142
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 142
gagccacact tggactgg 18
<210> 143
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 143
ttgagccaca cttggact 18
<210> 144
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 144
tttgagccac acttggac 18
<210> 145
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 145
ctttgagcca cacttgga 18
<210> 146
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 146
cctttgagcc acacttgg 18
<210> 147
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 147
tcctttgagc cacacttg 18
<210> 148
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 148
atcctttgag ccacactt 18
<210> 149
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 149
tatcctttga gccacact 18
<210> 150
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 150
attatccttt gagccaca 18
<210> 151
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 151
tattatcctt tgagccac 18
<210> 152
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 152
atattatcct ttgagcca 18
<210> 153
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 153
tgatattatc ctttgagc 18
<210> 154
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 154
ttgatattat cctttgag 18
<210> 155
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 155
tttgatatta tcctttga 18
<210> 156
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 156
tgtttgatat tatccttt 18
<210> 157
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 157
gtgtttgata ttatcctt 18
<210> 158
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 158
cgtgtttgat attatcct 18
<210> 159
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 159
gacgtgtttg atattatc 18
<210> 160
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 160
ggacgtgttt gatattat 18
<210> 161
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 161
gggacgtgtt tgatatta 18
<210> 162
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 162
ccgggacgtg tttgatat 18
<210> 163
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 163
cccgggacgt gtttgata 18
<210> 164
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 164
tcccgggacg tgtttgat 18
<210> 165
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 165
cactgccgcc tcccggga 18
<210> 166
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 166
acactgccgc ctcccggg 18
<210> 167
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 167
cacactgccg cctcccgg 18
<210> 168
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 168
ctcacactgc cgcctccc 18
<210> 169
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 169
actcacactg ccgcctcc 18
<210> 170
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 170
tactcacact gccgcctc 18
<210> 171
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 171
ggtactcaca ctgccgcc 18
<210> 172
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 172
aggtactcac actgccgc 18
<210> 173
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 173
aaggtactca cactgccg 18
<210> 174
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 174
tgaaggtact cacactgc 18
<210> 175
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 175
gtgaaggtac tcacactg 18
<210> 176
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 176
tgtgaaggta ctcacact 18
<210> 177
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 177
cgtgtgaagg tactcaca 18
<210> 178
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 178
acgtgtgaag gtactcac 18
<210> 179
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 179
gacgtgtgaa ggtactca 18
<210> 180
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 180
gggacgtgtg aaggtact 18
<210> 181
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 181
tgggacgtgt gaaggtac 18
<210> 182
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 182
atgggacgtg tgaaggta 18
<210> 183
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 183
gcatgggacg tgtgaagg 18
<210> 184
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 184
cgcatgggac gtgtgaag 18
<210> 185
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 185
gcgcatggga cgtgtgaa 18
<210> 186
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 186
cggcgcatgg gacgtgtg 18
<210> 187
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 187
acggcgcatg ggacgtgt 18
<210> 188
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 188
cacggcgcat gggacgtg 18
<210> 189
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 189
agcacggcgc atgggacg 18
<210> 190
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 190
cagcacggcg catgggac 18
<210> 191
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 191
acagcacggc gcatggga 18
<210> 192
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 192
atcctgagag cccaagaa 18
<210> 193
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 193
gatcctgaga gcccaaga 18
<210> 194
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 194
agatcctgag agcccaag 18
<210> 195
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 195
ccagatcctg agagccca 18
<210> 196
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 196
gccagatcct gagagccc 18
<210> 197
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 197
agccagatcc tgagagcc 18
<210> 198
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 198
ugaagguacu cacacugccg c 21
<210> 199
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 199
uaucugcacc uuugguag 18
<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 200
tcttattaat tatctgcacc 20
<210> 201
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 201
acgcactcac accacttc 18
<210> 202
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 202
cgcctacttg ctcgcaag 18
<210> 203
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 203
gacccgccta cttgctcg 18
<210> 204
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 204
gacccgcctg cttgctcg 18
<210> 205
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 205
cctggacccg cctgcttg 18
<210> 206
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 206
cgccuacuug cucgcaag 18
<210> 207
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 这些位置上的碱基为DNA
<400> 207
ccuggacccg ccugcutg 18
<210> 208
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 这些位置上的碱基为DNA
<400> 208
tgauauuauc cuuugagc 18
<210> 209
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 这些位置上的碱基为DNA
<400> 209
ttgauauuau ccuuugag 18
<210> 210
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 这些位置上的碱基为DNA
<400> 210
ttugauauua uccuuuga 18
<210> 211
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 211
cacuuccuaa uaauucaa 18
<210> 212
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 这些位置上的碱基为DNA
<400> 212
acaccacuuc cuaauaat 18
<210> 213
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 213
acucacacca cuuccuaa 18
<210> 214
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 214
cccgccuacu ugcucgca 18
<210> 215
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 215
gacccgccua cuugcucg 18
<210> 216
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 216
gacccgccug cuugcucg 18
<210> 217
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 这些位置上的碱基为DNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 这些位置上的碱基为DNA
<400> 217
tggacccgcc ugcuugct 18
<210> 218
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 218
ucuuauuaau uaucugcacc 20
<210> 219
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 219
cactgagaac ctgaagcacc 20
<210> 220
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 220
gttgctaaga tccagcttct t 21
<210> 221
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Probe
<400> 221
ttaattatct gcaccttccc gcctcc 26
<210> 222
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 222
aatatcaaac acgtcccggg ag 22
<210> 223
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 223
tgcctaatga gccacacttg 20
<210> 224
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Probe
<400> 224
gtctacaaac cagttgacct gagc 24
<210> 225
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 225
aagattgggt ccctggacaa t 21
<210> 226
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 226
agcttgtggg tttcaatctt tttatt 26
<210> 227
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Probe
<400> 227
cacccacgtc cctggcgga 19
<210> 228
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 228
ggcaaattca acggcacagt 20
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 229
gggtctcgct cctggaagat 20
<210> 230
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Probe
<400> 230
aaggccgaga atgggaagct tgtcatc 27
<210> 231
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 231
ccagcttctt attaattatc 20
<210> 232
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 232
taagatccag cttcttatta 20

Claims (1)

1.一种包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸是由8至30个连接核苷组成且具有包含含有至少8个连续核碱基的互补区域的核碱基序列，所述互补区域与Tau转录物的等长度靶区域互补。
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