JP2014054232A - 微生物検出装置の校正方法、及び微生物検出装置の校正キット - Google Patents
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Abstract
【課題】微生物検出装置の微生物を用いない校正方法を提供する。
【解決手段】光を照射されると微生物が発する蛍光の強度とほぼ同じ強度の蛍光を発する重量平均分子量が２５万以上８５万以下のポリスチレン粒子を微生物検出装置２０に取り込むことと、微生物検出装置２０の光源からポリスチレン粒子に光を照射し、ポリスチレン粒子から発せられた蛍光を微生物検出装置２０の蛍光検出器で検出することと、検出した蛍光の強度に基づき、微生物検出装置２０を校正することと、を含む、微生物検出装置の校正方法。
【選択図】図１
【解決手段】光を照射されると微生物が発する蛍光の強度とほぼ同じ強度の蛍光を発する重量平均分子量が２５万以上８５万以下のポリスチレン粒子を微生物検出装置２０に取り込むことと、微生物検出装置２０の光源からポリスチレン粒子に光を照射し、ポリスチレン粒子から発せられた蛍光を微生物検出装置２０の蛍光検出器で検出することと、検出した蛍光の強度に基づき、微生物検出装置２０を校正することと、を含む、微生物検出装置の校正方法。
【選択図】図１
Description
本発明は環境評価技術に関し、特に微生物検出装置の校正方法、及び微生物検出装置の校正キットに関する。
例えば医薬品製造工場のクリーンルームでは、室内の空気中に飛散する微生物の量が、微生物検出装置で監視されている。微生物検出装置の性能を評価し、精度を校正する際には、微生物検出装置に既知の微生物を取り込ませ、微生物検出装置の出力を評価している（例えば、特許文献１乃至３参照。）。
しかし、微生物検出装置を評価する際に用いられた微生物が、クリーンルームやチャンバ等の環境を汚染する可能性がある。そこで、本発明は、微生物検出装置の微生物を用いない校正方法、及び微生物検出装置の校正キットを提供することを目的の一つとする。
本発明の態様によれば、（ａ）光を照射されると微生物が発する蛍光の強度とほぼ同じ強度の蛍光を発する重量平均分子量が２５万以上８５万以下のポリスチレン粒子を微生物検出装置に取り込むことと、（ｂ）微生物検出装置の光源からポリスチレン粒子に光を照射し、ポリスチレン粒子から発せられた蛍光を微生物検出装置の蛍光検出器で検出することと、（ｃ）検出した蛍光の強度に基づき、微生物検出装置を校正することと、を含む、微生物検出装置の校正方法が提供される。
また、本発明の態様によれば、光を照射されると微生物が発する蛍光の強度とほぼ同じ強度の蛍光を発する重量平均分子量が２５万以上８５万以下のポリスチレン粒子を備える、微生物検出装置の校正キットが提供される。
本発明によれば、微生物検出装置の微生物を用いない校正方法、及び微生物検出装置の校正キットを提供可能である。
以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
実施の形態に係る微生物検出装置の校正方法は、光を照射されると微生物が発する蛍光の強度とほぼ同じ強度の蛍光を発する重量平均分子量が２５万以上８５万以下のポリスチレン粒子を微生物検出装置に取り込むことと、微生物検出装置の光源からポリスチレン粒子に光を照射し、ポリスチレン粒子から発せられた蛍光を微生物検出装置の蛍光検出器で検出することと、検出した蛍光の強度に基づいて、微生物検出装置の校正をすることと、を含む。
重量平均分子量Ｍｗは、下記式で定義される。下記式において、Ｎはポリマー分子の数、Ｍは分子量、Ｃは試料濃度を表す。試料濃度Ｃ（ｗｔ．／ｖｏｌ．）は、モノマーの単位数に比例するため、Ｃ＝Ｍ・Ｎとなる。
図１に示すように、校正方法の対象となる微生物検出装置２０は、例えば試験室１に設置されている。試験室１は、骨格をなす例えばアルミニウム製のフレームと、フレームにはめ込まれた、側壁をなすポリカーボネート製の透明パネルと、を備えるチャンバである。試験室１には、例えば給気装置１１Ａ、１１Ｂが設けられている。給気装置１１Ａ、１１Ｂは、ＨＥＰＡ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ａｉｒ Ｆｉｌｔｅｒ）及びＵＬＰＡ（Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ Ａｉｒ Ｆｉｌｔｅｒ）等の超高性能エアフィルタを通して、試験室１内部に清浄な空気を送り込む。試験室１の側壁には、扉が設けられていてもよい。
実施の形態に係るポリスチレン粒子は、試験室１に設けられた噴霧装置２から、試験室１内部に放出される。噴霧装置２は、例えばジェット式ネブライザであり、所定の濃度でポリスチレン粒子を含む流体を保管する。噴霧装置２は、所定の流量で圧縮ガス等の気流を供給され、気流を、ポリスチレン粒子を含む流体に吹きつけることによってエアロゾルを発生させ、試験室１内部にポリスチレン粒子を含む流体をミスト状にして噴霧する。なお、図１においては、噴霧装置２は試験室１内部に配置されているが、噴霧装置２を試験室１の外部に配置し、噴霧装置２が噴霧したエアロゾルを、配管等で試験室１内部に誘導してもよい。
試験室１内には、攪拌装置としての攪拌ファン１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄが配置されている。攪拌ファン１０Ａ−１０Ｄは、試験室１内部の空気を攪拌し、試験室１内部に散布されたポリスチレン粒子の自重による自然沈降を防止する。
また、試験室１内には、清浄化装置としてのエアクリーナ６が配置されている。エアクリーナ６は、試験室１内部の空気等の気体に含まれる微粒子や微生物を除去して、気体を清浄化する。例えば、噴霧装置２から試験室１内にポリスチレン粒子を含む流体を噴霧する前に、エアクリーナ６を運転することによって、噴霧装置２が噴霧するポリスチレン粒子以外の微粒子や微生物をあらかじめ試験室１内部から除去することが可能である。なお、図１においては、エアクリーナ６は試験室１内部底面に配置されているが、エアクリーナ６を試験室１の壁面または天井部に配置してもよい。
微生物検出装置２０は、例えば図２の模式的な断面図に示すように、筐体２１と、試験室１の内部から筐体２１の内部に、空気を吸引する第１の吸引装置２２と、を備える。第１の吸引装置２２で吸引された空気は、筐体２１内部のノズル２３の先端から放出される。ノズル２３の先端から放出された空気は、ノズル２３の先端と対向して筐体２１の内部に配置された第２の吸引装置２４で吸引される。微生物検出装置２０は、レーザ等の光源２５をさらに備える。光源２５は、ノズル２３の先端から放出され、第２の吸引装置２４で吸引される空気に向けて、レーザ光２６を照射する。レーザ光２６は、可視光であっても、紫外光であってもよい。レーザ光２６が可視光である場合、レーザ光２６の波長は、例えば４００乃至４１０ｎｍの範囲内であり、例えば４０５ｎｍである。レーザ光２６が紫外光である場合、レーザ光２６の波長は、例えば３１０乃至３８０ｎｍの範囲内であり、例えば３４０ｎｍである。
空気中に細菌等の微生物が含まれる場合、レーザ光２６を照射された細菌が、蛍光を発する。細菌の例としては、グラム陰性菌、グラム陽性菌、及びカビ胞子を含む真菌が挙げられる。グラム陰性菌の例としては、大腸菌が挙げられる。グラム陽性菌の例としては、表皮ブドウ球菌、枯草菌芽胞、マイクロコッカス、及びコリネバクテリウムが挙げられる。カビ胞子を含む真菌の例としては、アスペルギルスが挙げられる。微生物検出装置２０は、蛍光検出器２７をさらに備える。蛍光検出器２７は、微生物が発した蛍光を検出し、蛍光強度を計測する。微生物検出装置２０は、蛍光強度の大きさに基づき、空気中に含まれている微生物の濃度を測定することが可能である。
微生物検出装置２０を校正する際には、好ましくは、図１に示す試験室１内部の埃、チリ、微粒子、及び微生物等をエアクリーナ６で完全に除去し、噴霧装置２からポリスチレン粒子を放出する。放出されたポリスチレン粒子を含む空気は、微生物検出装置２０に取り込まれ、図２に示すレーザ光２６を照射される。一般的に、ポリスチレン粒子は、蛍光物質に分類されないが、レーザ光２６を照射されたポリスチレン粒子は、自家蛍光を発する。ここで、本発明者が初めて見出したことであるが、重量平均分子量が２５万以上８５万以下の１つのポリスチレン粒子が発する自家蛍光の強度は、１つの微生物が発する蛍光の強度に近い。そのため、微生物を用いることなく、重量平均分子量が２５万以上８５万以下のポリスチレン粒子を用いて、微生物検出装置２０の蛍光検出器２７の感度等を校正することが可能となる。
ポリスチレン粒子が発する蛍光の強度は、ポリスチレン粒子の材料の重量平均分子量及び粒径に依存して変化する。したがって、材料の重量平均分子量及び粒径が異なる複数のポリスチレン粒子のそれぞれを微生物検出装置２０に取り込み、材料の重量平均分子量及び粒径が異なる複数のポリスチレン粒子のそれぞれの蛍光強度の差を分離できる感度を、微生物検出装置２０の蛍光検出器２７が有するか否かを、評価してもよい。
ポリスチレン粒子は、例えばポリスチレンからなる。
本質的にポリスチレンからなるポリスチレン粒子の材料の重量平均分子量は２５万以上８５万以下であり、好ましくは３０万以上８０万以下であり、より好ましくは３０万以上７５万以下である。本質的にポリスチレンからなるポリスチレン粒子の材料の重量平均分子量が２５万より小さいと、１つのポリスチレン粒子が発する蛍光の強度が、１つの微生物が発する蛍光の強度より弱くなる傾向にある。また、本質的にポリスチレンからなるポリスチレン粒子の材料の重量平均分子量が８５万より大きいと、１つのポリスチレン粒子が発する蛍光の強度が、１つの微生物が発する蛍光の強度より強くなる傾向にある。
また、本質的にポリスチレンからなるポリスチレン粒子の粒径は、好ましくは０．７５μｍ以上１０μｍ未満であり、より好ましくは０．７５μｍ以上５μｍ未満である。本質的にポリスチレンからなるポリスチレン粒子の粒径が０．７５μｍより小さいと、１つのポリスチレン粒子が発する蛍光の強度が、１つの微生物が発する蛍光の強度より弱くなる傾向にある。また、本質的にポリスチレンからなるポリスチレン粒子の粒径が１０μｍ以上であると、１つのポリスチレン粒子が発する蛍光の強度が、１つの微生物が発する蛍光の強度より強くなる傾向にある。本質的にポリスチレンからなるポリスチレン粒子の粒径は、ポリスチレン粒子が光を照射されたときに発する蛍光の強度が、微生物が発する蛍光の強度とほぼ同じになるよう選択されれば、上記の範囲に限定されない。
従来、微生物検出装置を校正する際には、既知の濃度の微生物を微生物検出装置に取り込ませ、微生物検出装置が算出した微生物の濃度と、実際の微生物の濃度と、を比較する等していた。しかし、微生物は、培養設備や漏出防止用の安全設備が必要となるため、微生物検出装置の校正に要するコストが高いという問題がある。これに対し、微生物検出装置の校正にポリスチレン粒子を用いれば、培養設備や安全設備が不要となるため、微生物検出装置の校正に要するコストを大幅に低下させることが可能となる。
また、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．３０，５９−６６、及びＴｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．３４，Ｂ７−Ｂ１２に記載されているように、微生物が発する蛍光は、微生物の生育条件によって変化し得る。そのため、微生物を用いて微生物検出装置の校正を行おうとしても、微生物検出装置の蛍光検出器の感度の目標値（閾値）を設定するための指針が得られない場合がある。これに対し、微生物検出装置の校正にポリスチレン粒子を用いれば、ポリスチレン粒子が発する蛍光の強度は安定しているため、確実に微生物検出装置の校正を行うことが可能となる。
以下、実施例によって実施の形態をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
（ポリスチレン粒子の入手）
ポリスチレン粒子は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ ３０００シリーズ・サイズスタンダードの型番３５００Ａ、Ｌａｔｅｘ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ５０００シリーズの型番５１００Ａ、Ｄｕｋｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ４０００シリーズ Ｍｏｎｏｓｉｚｅｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓの型番４２０３Ａ及び４２０５Ａを入手した。
ポリスチレン粒子は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ ３０００シリーズ・サイズスタンダードの型番３５００Ａ、Ｌａｔｅｘ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ５０００シリーズの型番５１００Ａ、Ｄｕｋｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ４０００シリーズ Ｍｏｎｏｓｉｚｅｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓの型番４２０３Ａ及び４２０５Ａを入手した。
型番３５００Ａの粒子は、懸濁液として提供され、粒径は４９８ｎｍ±９ｎｍ（変動係数１．６％）、材料はポリスチレン、密度は１．０５ｇ／ｃｍ3、屈折率は１．５９である。型番３５００Ａの粒子は、粒径が０．５μｍの標準サンプルとして使用可能な粒径の均一性を有する。
型番５１００Ａの粒子は、懸濁液として提供され、粒径は１．０μｍ（変動係数３％以下）、材料はポリスチレン、密度は１．０５ｇ／ｃｍ3、屈折率は１．５９である。
型番４２０３Ａの粒子は、懸濁液として提供され、粒径は３．００２μｍ±０．０１９（変動係数１．１％）、材料はポリスチレンである。型番４２０３Ａの粒子は、粒径が３μｍの標準サンプルとして使用可能な粒径の均一性を有する。
型番４２０５Ａの粒子は、懸濁液として提供され、粒径は４．９９３μｍ±０．０４０（変動係数１．０％）、材料はポリスチレンである。型番４２０５Ａの粒子は、粒径が５μｍの標準サンプルとして使用可能な粒径の均一性を有する。
（ポリスチレン粒子の洗浄）
入手したポリスチレン粒子の懸濁液１ｍＬをマイクロ遠心チューブに移し、遠心機（日立工機株式会社、ＣＴ１３Ｒ）を用いて１３，０００ｇで５分間遠心し、上清を取り除いた。次に、ポリスチレン粒子を滅菌蒸留水に再懸濁した。その後、ポリスチレン粒子の懸濁液の遠心、及び再懸濁をさらに２回繰り返し、ポリスチレン粒子を洗浄した。最後に得られたポリスチレン粒子の懸濁液の溶媒である滅菌蒸留水の体積は０．５ｍＬであった。
入手したポリスチレン粒子の懸濁液１ｍＬをマイクロ遠心チューブに移し、遠心機（日立工機株式会社、ＣＴ１３Ｒ）を用いて１３，０００ｇで５分間遠心し、上清を取り除いた。次に、ポリスチレン粒子を滅菌蒸留水に再懸濁した。その後、ポリスチレン粒子の懸濁液の遠心、及び再懸濁をさらに２回繰り返し、ポリスチレン粒子を洗浄した。最後に得られたポリスチレン粒子の懸濁液の溶媒である滅菌蒸留水の体積は０．５ｍＬであった。
（ポリスチレン粒子の材料の重量平均分子量の測定）
用意したポリスチレン粒子のそれぞれをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。次に、ポリスチレン粒子の溶解液を０．４５μｍのメンブレンフィルタでろ過した。その後、ゲル浸透クロマトグラフィ法を用いて、ポリスチレン粒子の材料の重量平均分子量を測定した。具体的には、カラムに、２本のＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ（東ソー株式会社）と１本のＳｕｐｅｒＨ２５００（東ソー株式会社）を用いた。カラムの温度は４０℃に保った。当該カラムに、４０μＬのポリスチレン粒子の溶解液を０．６ｍＬ／分の流量で注入した。分子量標準としては、標準ポリスチレンを使用した。カラムからの溶離液に含まれる高分子の検出には、示差屈折率検出器を用いた。
用意したポリスチレン粒子のそれぞれをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。次に、ポリスチレン粒子の溶解液を０．４５μｍのメンブレンフィルタでろ過した。その後、ゲル浸透クロマトグラフィ法を用いて、ポリスチレン粒子の材料の重量平均分子量を測定した。具体的には、カラムに、２本のＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ（東ソー株式会社）と１本のＳｕｐｅｒＨ２５００（東ソー株式会社）を用いた。カラムの温度は４０℃に保った。当該カラムに、４０μＬのポリスチレン粒子の溶解液を０．６ｍＬ／分の流量で注入した。分子量標準としては、標準ポリスチレンを使用した。カラムからの溶離液に含まれる高分子の検出には、示差屈折率検出器を用いた。
その結果、型番３５００Ａの粒子の材料の重量平均分子量は、２３０，０００であった。型番５１００Ａの粒子の材料の重量平均分子量は、３４０，０００であった。型番４２０３Ａの粒子の材料の重量平均分子量は、６５０，０００であった。型番４２０５Ａの粒子の材料の重量平均分子量は、８２０，０００であった。
（微生物の入手）
入手した微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、略称Ｅ．ｃｏｌｉ、ＡＴＣＣ １３７０６）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １２２２８）、枯草菌芽胞（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、ＡＴＣＣ ９３７２）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｌａｅ、ＡＴＣＣ ２７５６６）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、ＡＴＣＣ ５１４０３）、及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、略称Ａ．ｎｉｇｅｒ、ＡＴＣＣ ９１４２）であった。なお、ＡＴＣＣは、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の略である。
入手した微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、略称Ｅ．ｃｏｌｉ、ＡＴＣＣ １３７０６）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １２２２８）、枯草菌芽胞（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、ＡＴＣＣ ９３７２）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｌａｅ、ＡＴＣＣ ２７５６６）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、ＡＴＣＣ ５１４０３）、及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、略称Ａ．ｎｉｇｅｒ、ＡＴＣＣ ９１４２）であった。なお、ＡＴＣＣは、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の略である。
大腸菌は、グラム陰性菌である。表皮ブドウ球菌、枯草菌芽胞、マイクロコッカス、及びコリネバクテリウムは、グラム陽性菌である。アスペルギルスは、コウジカビとも呼ばれ、カビ胞子の１種である。
（微生物の調製方法）
大腸菌、表皮ブドウ球菌、及びマイクロコッカスを３ｍＬのトリプトソイ液体培地（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｅｆ：２１１８２５）に植菌し、３２℃で一夜、好気的に培養した。大腸菌、表皮ブドウ球菌、及びマイクロコッカスをさらに寒天培地で培養する場合は、菌液をトリプトソイ寒天培地（栄研化学株式会社、Ｅ−ＭＰ２５）上に画線し、３２℃で一夜、好気的に培養した。
大腸菌、表皮ブドウ球菌、及びマイクロコッカスを３ｍＬのトリプトソイ液体培地（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｅｆ：２１１８２５）に植菌し、３２℃で一夜、好気的に培養した。大腸菌、表皮ブドウ球菌、及びマイクロコッカスをさらに寒天培地で培養する場合は、菌液をトリプトソイ寒天培地（栄研化学株式会社、Ｅ−ＭＰ２５）上に画線し、３２℃で一夜、好気的に培養した。
コリネバクテリウムを培養する際には、液体培地としてＲ培地（ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、麦芽エキス５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビーフエキス２ｇ、グリセリン２ｇ、ツイーン８０ ５０ｍｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．２）、寒天培地として羊血液寒天培地（栄研化学株式会社 Ｍ−５８）を使用した。
液体培地から微生物を調製する場合、遠心機（久保田商事株式会社、２４１０、あるいは日立工機株式会社、ＣＴ１３Ｒ）を用いて、２，１００ｇで３分間、培養液を遠心して集菌し、上清の培地を取り除いた後、微生物を滅菌蒸留水に再懸濁した。その後、微生物の懸濁液の遠心、及び再懸濁をさらに２回繰り返し、微生物を洗浄した。最後に得られた微生物の懸濁液の溶媒である滅菌蒸留水の体積は３ｍＬであった。
寒天培地から微生物を調製する場合、寒天培地上のコロニーをかきとり、それを５ｍＬの滅菌蒸留水中に懸濁した。次に、懸濁液を軽くボルテックスして微生物を分散させた後、２，１００ｇで３分間、懸濁液を遠心して集菌し、上清を取り除くことで微生物を洗浄した。その後、微生物を５ｍＬの滅菌蒸留水に再懸濁した。
枯草菌芽胞については、市販の芽胞液（ＮＯＲＴＨ ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＳ，Ｉｎｃ．，ＳＵＮ−０７）を使用した。
アスペルギルスについては、ポテトデキストロース寒天培地（株式会社アイサイエンス、ＰＭ０００２−１）上で生育させ４℃保存していたアスペルギルスを、同培地上に穿刺し、１週間２５℃で培養して胞子形成させた。次に、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム５０ｍｇ／Ｌの水溶液を胞子形成した培養プレート上に約１０ｍＬ注ぎ、ディスポーザブルループで胞子を軽く撫でてそぎ落とし、水溶液中に分散させた。胞子が分散した水溶液をピペットで回収し、８枚重ねた滅菌ガーゼでろ過して菌糸を取り除いた後、ろ液を１，４００ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた。沈殿した胞子に滅菌蒸留水を１０ｍＬ加え、洗浄した後、再び同条件で遠心した。これを３回繰り返した後、５ｍＬの滅菌蒸留水に懸濁して胞子液とした。
（蛍光顕微鏡による乾燥条件下における蛍光強度の測定）
ポリスチレン粒子あるいは微生物の懸濁液をスライドガラスに滴下し、暗所で乾燥させた後、蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社 ＢＸ５１）で観察した。波長３４０ｎｍ付近の光による励起にはＵ−ＭＷＵ２、波長４０５ｎｍ付近の光による励起にはＵ−ＭＮＶ２ミラーユニットを使用した。ＵＭＰｌａｎＦＬ ｘ１００対物レンズを使用することで、カバーガラスをスライドガラスに被せずにポリスチレン粒子あるいは微生物を観察した。暗視野光路からの迷光は、ＤＩＣスライダを用いてカットした。ポリスチレン粒子あるいは微生物の蛍光画像、及び同視野の明視野画像は、顕微鏡に接続したＤＰ−７０ ＣＣＤカメラ（オリンパス株式会社）で撮影した。
ポリスチレン粒子あるいは微生物の懸濁液をスライドガラスに滴下し、暗所で乾燥させた後、蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社 ＢＸ５１）で観察した。波長３４０ｎｍ付近の光による励起にはＵ−ＭＷＵ２、波長４０５ｎｍ付近の光による励起にはＵ−ＭＮＶ２ミラーユニットを使用した。ＵＭＰｌａｎＦＬ ｘ１００対物レンズを使用することで、カバーガラスをスライドガラスに被せずにポリスチレン粒子あるいは微生物を観察した。暗視野光路からの迷光は、ＤＩＣスライダを用いてカットした。ポリスチレン粒子あるいは微生物の蛍光画像、及び同視野の明視野画像は、顕微鏡に接続したＤＰ−７０ ＣＣＤカメラ（オリンパス株式会社）で撮影した。
撮影した蛍光画像は、画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ６．３Ｊ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）を使用して、８ビットグレースケール画像に変換し、蛍光画像内のポリスチレン粒子あるいは微生物を検出した。１つのポリスチレン粒子あたりの蛍光強度は、画像解析ソフトウェアが粒子と認識した範囲にある画素のグレースケール値を合計することで算出した。この際、画像内の、粒子を含まない任意の範囲の画素の平均グレースケール値を求め、これをバックグラウンド値とし、粒子と認識された範囲内のそれぞれの画素のグレースケール値からバックグランド値を引くことで、１つのポリスチレン粒子あたりの蛍光強度を補正した。また、複数のポリスチレン粒子の凝集体が一粒子と認識された場合は、明視野画像に基づいて粒子数を判別し、粒子の凝集体の蛍光強度を粒子数で割って、１つのポリスチレン粒子あたりの平均蛍光強度を求めた。１つの微生物あたりの蛍光強度も、同様の手法により求めた。
波長が４０５ｎｍ付近の励起光を用いた場合の、ポリスチレン粒子及び微生物の蛍光強度の分布を、図３に示す。また、型番４２０３Ａ及び型番４２０５Ａのポリスチレン粒子について、蛍光強度の分布から算出した９５％信頼区間のグラフを、図４に示す。図３に示すように、型番５１００Ａの粒子及び型番４２０３Ａの粒子の粒子は、微生物と同様の強度の蛍光を発した。型番５１００Ａの粒子が発した蛍光の強度は、コリネバクテリウム、マイクロコッカス、及び大腸菌が発した蛍光の強度に特に近かった。型番４２０３Ａの粒子が発した蛍光の強度は、枯草菌、及びアスペルギルスのそれぞれが発した蛍光の強度に特に近かった。
型番３５００Ａの粒子が発した蛍光の強度は、微生物が発した蛍光の強度より弱かった。型番４２０５Ａの粒子が発した蛍光の強度は、微生物が発した蛍光の強度より強かった。
また、波長が４０５ｎｍ付近の励起光、及び波長が３４０ｎｍ付近の励起光のそれぞれを用いた場合の、ポリスチレン粒子及び微生物の蛍光強度の分布を、図５に示す。図５に示すように、励起光の波長を変えても、ポリスチレン粒子及び微生物のそれぞれが発する蛍光の強度の変化は、顕著でなかった。
（ポリスチレン粒子の材料の重量平均分子量と、蛍光強度と、の関係）
図６に示すように、ポリスチレン粒子の材料の重量平均分子量に対してポリスチレン粒子が発した１画素あたりの蛍光の強度をプロットしたところ、ポリスチレン粒子の材料の重量平均分子量が大きくなるほど、ポリスチレン粒子が発した蛍光の強度が強くなった。なお、図６においては、１つのポリスチレン粒子あたりの蛍光の強度をプロットせず、１画素あたりの蛍光の強度をプロットすることにより、粒径が蛍光強度に与える影響を排除している。
図６に示すように、ポリスチレン粒子の材料の重量平均分子量に対してポリスチレン粒子が発した１画素あたりの蛍光の強度をプロットしたところ、ポリスチレン粒子の材料の重量平均分子量が大きくなるほど、ポリスチレン粒子が発した蛍光の強度が強くなった。なお、図６においては、１つのポリスチレン粒子あたりの蛍光の強度をプロットせず、１画素あたりの蛍光の強度をプロットすることにより、粒径が蛍光強度に与える影響を排除している。
（蛍光顕微鏡による蛍光強度の液中測定）
ポリスチレン粒子（型番４２０３Ａ、型番４２０５Ａ）の懸濁液をスライドガラスに滴下し、懸濁液上にカバーガラスを被せ、懸濁液を乾燥させることなく、蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社 ＢＸ５１）で観察した。波長４０５ｎｍ付近の光による励起にはＵ−ＭＮＶ２ミラーユニットを使用した。対物レンズにはＵＭＰｌａｎＦＬ ｘ１００を使用して、カバーガラスを被せたままポリスチレン粒子を観察した。暗視野光路からの迷光は、ＤＩＣスライダを用いてカットした。ポリスチレン粒子の蛍光画像、及び同視野の明視野画像は、顕微鏡に接続したＤＰ−７０ ＣＣＤカメラ（オリンパス株式会社）で撮影した。
ポリスチレン粒子（型番４２０３Ａ、型番４２０５Ａ）の懸濁液をスライドガラスに滴下し、懸濁液上にカバーガラスを被せ、懸濁液を乾燥させることなく、蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社 ＢＸ５１）で観察した。波長４０５ｎｍ付近の光による励起にはＵ−ＭＮＶ２ミラーユニットを使用した。対物レンズにはＵＭＰｌａｎＦＬ ｘ１００を使用して、カバーガラスを被せたままポリスチレン粒子を観察した。暗視野光路からの迷光は、ＤＩＣスライダを用いてカットした。ポリスチレン粒子の蛍光画像、及び同視野の明視野画像は、顕微鏡に接続したＤＰ−７０ ＣＣＤカメラ（オリンパス株式会社）で撮影した。
撮影した蛍光画像は、画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ６．３Ｊ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）を使用して、８ビットグレースケール画像に変換し、蛍光画像内のポリスチレン粒子を検出した。１つのポリスチレン粒子あたりの蛍光強度は、画像解析ソフトウェアが粒子と認識した範囲にある画素のグレースケール値を合計することで算出した。この際、画像内の、粒子を含まない任意の範囲の画素の平均グレースケール値を求め、これをバックグラウンド値とし、粒子と認識された範囲内のそれぞれの画素のグレースケール値からバックグランド値を引くことで、１つのポリスチレン粒子あたりの蛍光強度を補正した。また、複数のポリスチレン粒子の凝集体が一粒子と認識された場合は、明視野画像に基づいて粒子数を判別し、粒子の凝集体の蛍光強度を粒子数で割って、１つのポリスチレン粒子あたりの平均蛍光強度を求めた。
波長が４０５ｎｍ付近の励起光を用いた場合の、ポリスチレン粒子の蛍光強度の分布を、図７に示す。また、蛍光強度の分布から算出した９５％信頼区間のグラフを、図８に示す。液中で観察すると、ポリスチレン粒子が発する蛍光の強度は、乾燥条件下と比較して、全体的に低くなった。しかし、粒子の種類による蛍光強度の大小関係は、乾燥条件下であっても、液中条件下であってもほぼ一致した。例えば、図４に示したように、乾燥条件下では、型番４２０３Ａ、型番４２０５Ａの順に、蛍光強度が強くなる傾向にあった。これに対し、図８に示すように、液中においても、型番４２０３Ａ、型番４２０５Ａの順に、蛍光強度が強くなる傾向にあった。微生物が発する蛍光の強度も、乾燥条件下と比較して、液中では全体的に低下する。したがって、液中においても、ポリスチレン粒子の蛍光強度は、微生物の蛍光強度に近くなる。
（微生物検出装置による蛍光強度の測定）
微生物検出装置による蛍光強度の測定は、文献（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｅｒｏｓｏｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．４２，３９７−４０７，２０１１）に従った。すなわち、ＨＥＰＡフィルタユニットを設置した３ｍ3容量の密閉したチャンバ内で、ＨＥＰＡフィルタユニットを運転して、チャンバ内部の空気を清浄化した。その後、ポリスチレン粒子あるいは微生物の懸濁液を、ネブライザ（Ｓａｌｔｅｒ Ｌａｂｓ製 Ｒｅｆ８９００）を用いて、５Ｌ／ｍｉｎの流量で２０秒噴霧し、チャンバ内の空中に浮遊させた。その後、３０秒間内部の空気を攪拌し、水滴を乾燥させるとともにポリスチレン粒子あるいは微生物を均一に拡散させた。その後６０秒間、微生物検出装置として空中浮遊菌検出器（Ａｚｂｉｌ ＢｉｏＶｉｇｉｌａｎｔ社製ＩＭＤ−Ａ ３００）でチャンバ内の空気を測定し、空気に含まれるポリスチレン粒子あるいは微生物を検出した。検出したポリスチレン粒子あるいは微生物の蛍光強度は、空中浮遊菌検出器の蛍光検出器の検知電圧値として、得られた。
微生物検出装置による蛍光強度の測定は、文献（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｅｒｏｓｏｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．４２，３９７−４０７，２０１１）に従った。すなわち、ＨＥＰＡフィルタユニットを設置した３ｍ3容量の密閉したチャンバ内で、ＨＥＰＡフィルタユニットを運転して、チャンバ内部の空気を清浄化した。その後、ポリスチレン粒子あるいは微生物の懸濁液を、ネブライザ（Ｓａｌｔｅｒ Ｌａｂｓ製 Ｒｅｆ８９００）を用いて、５Ｌ／ｍｉｎの流量で２０秒噴霧し、チャンバ内の空中に浮遊させた。その後、３０秒間内部の空気を攪拌し、水滴を乾燥させるとともにポリスチレン粒子あるいは微生物を均一に拡散させた。その後６０秒間、微生物検出装置として空中浮遊菌検出器（Ａｚｂｉｌ ＢｉｏＶｉｇｉｌａｎｔ社製ＩＭＤ−Ａ ３００）でチャンバ内の空気を測定し、空気に含まれるポリスチレン粒子あるいは微生物を検出した。検出したポリスチレン粒子あるいは微生物の蛍光強度は、空中浮遊菌検出器の蛍光検出器の検知電圧値として、得られた。
空中浮遊菌検出器で測定した、ポリスチレン粒子及び微生物の蛍光強度の分布を、図９に示す。空中浮遊菌検出器で測定した場合も、ポリスチレン粒子の蛍光強度が、微生物の蛍光強度に近いことが示された。
１ 試験室
２ 噴霧装置
６ エアクリーナ
１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ 攪拌ファン
１１Ａ、１１Ｂ 給気装置
２０ 微生物検出装置
２１ 筐体
２２ 吸引装置
２３ ノズル
２４ 吸引装置
２５ 光源
２６ レーザ光
２７ 蛍光検出器
２ 噴霧装置
６ エアクリーナ
１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ 攪拌ファン
１１Ａ、１１Ｂ 給気装置
２０ 微生物検出装置
２１ 筐体
２２ 吸引装置
２３ ノズル
２４ 吸引装置
２５ 光源
２６ レーザ光
２７ 蛍光検出器
Claims (22)
- 光を照射されると微生物が発する蛍光の強度とほぼ同じ強度の蛍光を発する重量平均分子量が２５万以上８５万以下のポリスチレン粒子を微生物検出装置に取り込むことと、
前記微生物検出装置の光源から前記ポリスチレン粒子に光を照射し、前記ポリスチレン粒子から発せられた蛍光を前記微生物検出装置の蛍光検出器で検出することと、
前記検出した蛍光の強度に基づき、前記微生物検出装置を校正することと、
を含む、微生物検出装置の校正方法。 - 前記ポリスチレン粒子の直径が、０．７５μｍ以上１０μｍ未満である、請求項１に記載の微生物検出装置の校正方法。
- 前記ポリスチレン粒子が、本質的にポリスチレンからなる、請求項１又は２に記載の微生物検出装置の校正方法。
- 前記微生物が細菌を含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正方法。
- 前記細菌が、大腸菌を含むグラム陰性菌と、表皮ブドウ球菌、枯草菌芽胞、マイクロコッカス、及びコリネバクテリウムを含むグラム陽性菌と、カビ胞子を含む真菌と、からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項４に記載の微生物検出装置の校正方法。
- 前記光が可視光である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正方法。
- 前記光の波長が４００乃至４１０ｎｍである、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正方法。
- 前記光が紫外光である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正方法。
- 前記光の波長が３１０乃至３８０ｎｍの範囲内である、請求項１乃至５及び８のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正方法。
- 前記微生物検出装置の光源から前記ポリスチレン粒子に光を照射することにおいて、前記ポリスチレン粒子が乾燥している、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正方法。
- 前記微生物検出装置の光源から前記ポリスチレン粒子に光を照射することにおいて、前記ポリスチレン粒子が液体中に存在する、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正方法。
- 光を照射されると微生物が発する蛍光の強度とほぼ同じ強度の蛍光を発する重量平均分子量が２５万以上８５万以下のポリスチレン粒子を備える、微生物検出装置の校正キット。
- 前記ポリスチレン粒子の直径が、０．７５μｍ以上１０μｍ未満である、請求項１２に記載の微生物検出装置の校正キット。
- 前記ポリスチレン粒子が、本質的にポリスチレンからなる、請求項１２又は１３に記載の微生物検出装置の校正キット。
- 前記微生物が細菌を含む、請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正キット。
- 前記細菌が、大腸菌を含むグラム陰性菌と、表皮ブドウ球菌、枯草菌芽胞、マイクロコッカス、及びコリネバクテリウムを含むグラム陽性菌と、カビ胞子を含む真菌と、からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１５に記載の微生物検出装置の校正キット。
- 前記光が可視光である、請求項１２乃至１６のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正キット。
- 前記光の波長が４０５ｎｍである、請求項１２乃至１７のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正キット。
- 前記光が紫外光である、請求項１２乃至１６のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正キット。
- 前記光の波長が３１０乃至３８０ｎｍの範囲内である、請求項１２乃至１６及び１９のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正キット。
- 前記ポリスチレン粒子が、乾燥している状態で光を照射されると、乾燥している状態の微生物が発する蛍光の強度とほぼ同じ強度の蛍光を発する、請求項１２乃至２０のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正キット。
- 前記ポリスチレン粒子が、液体中で光を照射されると、液中の微生物が発する蛍光の強度とほぼ同じ強度の蛍光を発する、請求項１２乃至２０のいずれか１項に記載の微生物検出装置の校正キット。
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