JP2014055121A

JP2014055121A - チロシナーゼ発現抑制剤

Info

Publication number: JP2014055121A
Application number: JP2012201791A
Authority: JP
Inventors: Kenji Oguchi; 健司大口; Toshiki Mori; 俊樹森
Original assignee: Dai Ichi Kogyo Seiyaku Co Ltd
Current assignee: DKS Co Ltd
Priority date: 2012-09-13
Filing date: 2012-09-13
Publication date: 2014-03-27

Abstract

【課題】シミやソバカス等の原因となるメラニンの産生に関与するチロシナーゼの発現を抑制することができるチロシナーゼ発現抑制剤を提供する。
【解決手段】ユウガオ種子の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするチロシナーゼ発現抑制剤である。
【選択図】図１

Description

本発明は、メラニンの生成に関与するチロシナーゼの発現を抑制することができるチロシナーゼ発現抑制剤に関する。

シミやそばかす等の色素の沈着は、皮膚細胞内でメラニンが生成し、蓄積することによって生じることが知られている。メラニンは色素細胞の中でチロシンの酸化反応により生成することが知られおり、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンへの反応が律速段階であるといわれている。そのため、この反応に関与する酵素であるチロシナーゼに着目し、チロシナーゼの活性及び作用を阻害して皮膚のメラニン生成を抑制するアルブチン、コウジ酸、エラグ酸等が美白剤として使用されてきた。

また、メラニン生成抑制に関する研究は多様化し、メラノサイト活性化因子の制御、メラニンの移送抑制、チロシナーゼの成熟阻害などに基づいたカモミラエキス、マグノリグナンなどの美白剤も開発されている（非特許文献１）。一方、チロシナーゼ自体の生成を抑制させて皮膚のメラニン生成量を低減させる美白剤については、タケノコ及び／又はカンゾウ根の抽出物（特許文献１）等が知られているが、十分な効果を示すものではなかった。

特開２００４−３５２６９７号公報

「化粧品の有用性 −評価技術の進歩と将来展望−」薬事日報社、Ｐ．１４４−

本発明は、植物抽出物を有効成分とした新規なチロシナーゼ発現抑制剤を提供することを目的とする。

本発明に係るチロシナーゼ発現抑制剤は、ユウガオ種子の抽出物を有効成分として含有するものである。

本発明によれば、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着等の原因となるメラニンの産生に関与するチロシナーゼの発現を抑制することによって美白作用を発揮することができ、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着症等の予防・治療に有効であるチロシナーゼ発現抑制剤を提供することができる。

試験例１におけるユウガオ種子抽出物のメラニン生成抑制作用を示すグラフ。試験例２におけるウエスタンブロット法による解析結果を示す図。試験例３におけるチロシナーゼ遺伝子発現に対するユウガオ種子抽出物の影響を示すグラフ。

以下、本発明の実施に関連する事項について詳細に説明する。

ユウガオは、ウリ科ユウガオ属の植物であり、その果実を乾燥させたものはカンピョウとして食用に用いられている。ユウガオを利用した抽出物としては、全草、果実、花、葉、蔓、根などの抽出物も考えられるが、本発明では、種子の抽出物を用いる。ユウガオ種子の抽出物としては、ユウガオの種子を抽出原料として得られる抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。

抽出原料として使用するユウガオ種子は、粉砕したものが適当である。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、極性溶媒を用いた抽出処理を効率よく行うことができる。

抽出処理の際には、抽出溶媒として極性溶媒を使用することが好ましい。ユウガオ種子に含まれるチロシナーゼ発現抑制作用を示す成分は、極性溶媒を抽出溶媒とする抽出処理によって容易に抽出することができる。

極性溶媒の具体例としては、水、水溶性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これら極性溶媒のうち、含水水溶性有機溶媒を使用することが好ましい。

抽出溶媒として使用し得る水溶性有機溶媒としては、低級脂肪族アルコール、アセトン等が挙げられる。低級脂肪族アルコールとしては、例えば炭素数１〜５の脂肪族アルコールを用いることができ、その具体例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の１価アルコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール等の多価アルコール等が挙げられる。抽出溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルセロソルブ等の中間極性溶媒を使用することもできる。２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、含水水溶性有機溶媒を使用する場合、一価アルコール、多価アルコール、アセトン等の水溶性有機溶媒の含有量が５０体積％以上であることが好ましく、より好ましくは５０〜９０体積％である。更に、好ましい抽出溶媒は、炭素数１〜４の脂肪族１価アルコールを５０体積％以上（より好ましくは５０〜９０体積％）含有する含水１価アルコールである。

抽出処理は、ユウガオ種子に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り、特に限定されず、常法に従って行うことができる。抽出処理の際には、特殊な抽出方法を用いる必要はなく、室温又は還流加熱下において任意の装置を使用することができる。抽出方法としては、例えば、抽出溶媒中に抽出原料を長時間常温で浸漬して抽出する方法、抽出溶媒の沸点以下の温度に加熱し攪拌しながら抽出する方法、抽出溶媒の沸点付近の温度で加熱還流下にて抽出する方法等が挙げられる。

抽出処理により可溶性成分を溶出させた後、ろ過、遠心分離等の処理を施して抽出残渣を除くことにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、そのまま抽出物として用いることもできるが、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。精製は、具体的には活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができ、これらの処理は、生理活性、すなわちチロシナーゼ発現抑制作用の低下を招かない範囲で行うことができる。

以上のようにして得られるユウガオ種子抽出物は、チロシナーゼ発現抑制作用を有しており、この作用を利用してチロシナーゼ発現抑制剤の有効成分として使用することができる。また、チロシナーゼ発現抑制作用を通じて美白作用を発揮し得るので、美白剤として使用することもできる。

ユウガオ種子抽出物は、そのままでもチロシナーゼ発現抑制剤として使用することができるが、常法に従って製剤化して使用することもできる。製剤化する場合、保存や取扱いを容易にするために、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容され得るキャリアーその他任意の助剤を添加することができる。ユウガオ種子抽出物は、製剤化により粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形とすることができる。

本発明のチロシナーゼ発現抑制剤は、チロシナーゼｍＲＮＡ発現抑制作用等を通じて、チロシナーゼの発現を阻害することができる。したがって、本発明のチロシナーゼ発現抑制剤によれば、メラニン産生に関与するチロシナーゼの発現を抑制することにより、メラニンの産生を抑制することができるとともに、メラニンの産生の抑制を通じて美白効果を得ることができる。

本発明のチロシナーゼ発現抑制剤は、チロシナーゼ発現抑制作用を通じて美白作用を発揮することができるとともに、皮膚に適用した場合の安全性に優れているので、皮膚外用剤に配合するのに好適である。ここで、「皮膚外用剤」とは、皮膚に適用される各種薬剤を意味し、例えば、化粧料、医薬部外品、医薬品等が含まれる。皮膚外用剤の具体例としては、肌に対するものとして、軟膏、クリーム、乳液、化粧水、ローション、パック、ジェル等が挙げられる。

皮膚外用剤におけるユウガオ種子抽出物の配合量は、皮膚外用剤の種類や抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、好適な配合量は、乾燥物に換算して通常０．００１〜５質量％、好ましくは０．０１〜１質量％である。配合量が０．００１質量％以上であることにより、チロシナーゼ発現抑制作用及び美白作用を十分に発揮されやすくすることができる。なお、配合量が５質量％を超えても、増加分に見合ったチロシナーゼ発現抑制作用及び美白作用が得られ難いことから、配合量は５質量％以下であることが好ましい。

以下、製造例及び試験例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

［製造例１］
ユウガオ種子の粉砕物２００ｇをヘキサン６００ｍｌに投入し、攪拌しながら１時間、室温で保った後、ろ過した。同様に残渣にヘキサンを加え、脱脂操作を繰り返した。残渣を乾燥後、乾燥物の１０倍量（ｍｌ／ｇ）の抽出溶媒（エタノール／水＝７０体積％／３０体積％からなる含水エタノール）を加え、攪拌しながら２時間、５０℃に保った後、ろ過した。同様に残渣に抽出溶媒を加え、上記操作をもう一度繰り返した。ろ液を合わせて５０℃で減圧下にて濃縮し、さらに凍結乾燥機で乾燥して粗抽出物（粉末状）を得た。得られた粗抽出物の質量は５．６ｇ（収率：２．８質量％）であった。次いで、粗抽出物を水に溶解し、得られた水溶液を、合成吸着剤（スチレン−ジビニルベンゼン系、「ダイヤイオンＨＰ−２０」三菱化学株式会社製）１００ｍｌを充填したカラムに注入した。その後、水で未吸着物質を洗浄・除去した後、含水エタノール（エタノール／水＝７０体積％／３０体積％）で溶出される画分を分画した。分画物を５０℃で減圧下にて濃縮し、さらに凍結乾燥機で乾燥して、ユウガオ種子抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の質量は２．５ｇ（収率：１．２５質量％）であった。

［試験例１］ユウガオ種子抽出物のメラニン生成抑制作用
マウスＢ１６メラノーマ細胞５×１０^４（細胞／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地を、２４穴プレートの各穴に１ｍｌずつ注入して、ＣＯ_２／Ｏ_２混合ガスの下で、３７℃、２４時間培養した。培養後の細胞に、αＭＳＨ（α−メラノサイト刺激ホルモン）を１μＭと、製造例１で得られたユウガオ種子抽出物を終濃度が１〜２５μｇ／ｍｌになるように、試料溶液を添加し、ＣＯ_２／Ｏ_２混合ガスの下で、３７℃、３日間培養した。ユウガオ種子抽出物で処理した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、２ＮのＮａＯＨを１５０μｌ加えて、６５℃で６０分間加熱処理を行って、細胞を溶解した。溶解液を４７０ｎｍの吸光度で測定した。メラニン量（％）は、αＭＳＨとユウガオ種子抽出物を未添加で培養した細胞の溶解液の吸光度をコントロール（１００％）として、該コントロールに対する吸光度の比により算出した。

結果は図１に示す通りであり、αＭＳＨ添加かつユウガオ種子抽出物未添加の場合のメラニン量が約５７０％であったのに対し、ユウガオ種子抽出物を１μｇ／ｍｌ添加したものではメラニン量が約４３０％であり、ユウガオ種子抽出物の添加量を増やすほどメラニン量が少なくなっていた。そして、ユウガオ種子抽出物の添加量が２５μｇ／ｍｌで、コントロールと略同等のメラニン量となっており、ユウガオ種子抽出物による優れたメラニン生成抑制作用が示されていた。

［試験例２］メラニン生成関連タンパク質の発現に対するユウガオ種子抽出物の影響
マウスＢ１６メラノーマ細胞５×１０^４（細胞／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地を、２４穴プレートの各穴に１ｍｌずつ注入して、ＣＯ_２／Ｏ_２混合ガスの下で、３７℃、２４時間培養した。培養後の細胞に、αＭＳＨ（α−メラノサイト刺激ホルモン）を１μＭと、製造例１で得られたユウガオ種子抽出物を終濃度が２５μｇ／ｍｌになるように、試料溶液を添加し、ＣＯ_２／Ｏ_２混合ガスの下で、３７℃、３日間培養した。ユウガオ種子抽出物で処理した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＲＩＰＡバッファーを用いて細胞を可溶化した。得られた可溶化画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりタンパク質を分離した後、抗体を用いたウエスタンブロット法により、チロシナーゼとβ−アクチンの細胞内タンパク質発現量を調べた。

ウエスタンブロット法は次のように行った。ポリアクリルアミドゲル上で分離したタンパク質を、ＰＶＤＦ（polyvinylidene difluoride）膜に転写（６０Ｖ、９０分間）した。続いて５％スキムミルクと０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーに膜を浸し、ブロッキング（室温，１時間）した。その後、一次抗体（抗チロシナーゼ抗体、抗β−アクチン抗体）と反応（４℃，１５時間）させた．次いで二次抗体（抗マウスIgG HRP-conjugated抗体）と反応（室温，１時間）させた後、ECL plus Western Blotting Detectionキットを用いて目的のタンパク質を検出した。

結果は図２に示す通りである。αＭＳＨを添加せずに培養した細胞を可溶化したものでは（「αＭＳＨ（−）」）、ユウガオ種子抽出物の未添加（０μｇ／ｍｌ）及び添加（２５μｇ／ｍｌ）ともに、チロシナーゼの発現は、概ね検出限界以下であった。これに対し、αＭＳＨを添加して培養した細胞を可溶化した場合（「αＭＳＨ（＋）」）、ユウガオ種子抽出物が未添加のもの（０μｇ／ｍｌ）では、チロシナーゼの発現が顕著に見られたのに対し、ユウガオ種子抽出物を添加したもの（２５μｇ／ｍｌ）では、チロシナーゼの発現が大幅に抑えられていた。

［試験例３］チロシナーゼ遺伝子発現に対するユウガオ種子抽出物の影響
細胞内のチロシナーゼ遺伝子発現量は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。細胞からのトータルＲＮＡの抽出には、ＲＮＡキットNucleoSpin（登録商標）RNA IIを用い、方法はプロトコールに従って行った。得られたトータルＲＮＡをGene Quant proを用いてＲＮＡ定量した後、０．２μｇ相当のトータルＲＮＡをPrimeScript（登録商標） RT reagent Kitを用いて、逆転写反応（ＲＴ）（３７℃１５分間、８５℃５秒間）した。得られたｃＤＮＡを、Power SYBR（登録商標） Green PCR Master Mixおよび特異的プライマー（tyrosinase、GAPDH）と混和し、リアルタイムＰＣＲを行った。なお、遺伝子発現量はΔΔＣｔ法により解析した。

結果は図３に示す通りであり、αＭＳＨとユウガオ種子抽出物を未添加としたコントロールに対し、αＭＳＨを添加することで高まったチロシナーゼ遺伝子の発現レベルが、ユウガオ種子抽出物を添加することにより、顕著に抑制されていた。

以上の結果から、ユウガオ種子抽出物が、チロシナーゼ発現抑制作用を有し、メラニンの生成を抑制する作用を有することが確認された。

本発明に係るチロシナーゼ発現抑制剤は、チロシナーゼ発現抑制作用を通じて美白作用を発揮することができるとともに、皮膚に適用した場合の安全性に優れているので、軟膏、クリーム、乳液、化粧水、ローション、パック、ジェル等の化粧料、医薬部外品等に配合して用いることができる。

Claims

ユウガオ種子の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするチロシナーゼ発現抑制剤。