JP2014012010A - 肺癌についての多重遺伝子予後診断アッセイ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】肺癌を有する対象の予後診断を提供する方法であって、生物学的サンプル中のrnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、il11、cdc6、cdk2ap1、bag1、emx2、six3およびbrca1からなる群から選択される少なくとも2のバイオマーカーの発現レベルを定量化することを含む方法であり、該生物学的サンプルは該対象に由来し、該発現レベルは予後の指標となるものである、方法。
【選択図】なし
Description
本出願は2007年6月1日出願の米国特許出願第60/941,550号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)の優先権を主張する。
適用されない
適用されない
一側面において、本発明は、対象における肺癌の予後診断を提供する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する:(a)対象からの生物学的サンプルを、ctnnb1、wnt3a、tp53、kras、erbb3、muc1、erbb2およびdusp6を含むバイオマーカーの一群に特異的に結合する試薬群と接触させる工程、および(b)そのサンプルを対照の非癌性細胞サンプルと比較することによって、そのマーカーがそのサンプルにおいて示差的に発現されるかどうかを決定する工程;これにより肺癌の予後診断が提供される。
イントロダクション
本発明は、初期段階の肺癌における長期死亡率の正確な予後診断を可能にする特定の遺伝子群の発現プロファイルの同定を特徴とする。一実施態様において、我々は、3つのマイクロアレイ研究の報告および2つのPCRに基づく研究の報告において初期段階の肺癌における長期死亡率についての予後として以前に同定された、65遺伝子を同定した。RNAは、完全に肺腺癌を摘出し、少なくとも3年の臨床経過観察を行っている治療継続患者からの124の新鮮凍結腫瘍サンプルから抽出した。無作為に80サンプルを試験グループに割り当て、残りを検証グループに割り当てた。その試験セットについて65の同定された遺伝子のリアルタイムPCRをTaq-manアッセイを用いて行った。後退的モデル選択法(backwards model selection)を用いて標準化された遺伝子発現レベルの比例ハザードモデルを用いて予測モデルを作製した。モデル係数および個々の遺伝子発現レベルを用いて、それぞれの患者についてモデルスコアを算出した。モデルスコアが中央値スコアより高い場合、患者を高リスクとした。
「肺癌」は一般に、悪性細胞のサイズおよび外観によって分類される肺癌の2つの主なタイプ、非小細胞(80%)および小細胞(およそ20%)肺癌を意味する。「非小細胞肺癌」(NSCLC)は肺癌のおおよそ29%を占める扁平上皮癌を含む。肺腺癌は、肺癌のおおよそ32%を占めるNSCLCの最も一般的なサブタイプである。肺腺癌のサブタイプ、細気管支肺胞上皮癌は、女性の喫煙未経験者においてより一般的である。大細胞癌は肺癌のおおよそ9%を占める。「小細胞肺癌」は、肺癌のそれほど多くない形態であるSCLC(「燕麦細胞癌」とも呼ばれる)を含む。他のタイプの肺癌は、カルチノイド、腺様嚢胞癌、円柱腫および粘表皮癌を含む。一実施態様において、肺癌はステージI-IVに沿って段階分けされ、Iは早期であり、IVは最も進行している。
本発明は、癌において示差的に発現されるマーカーの一群の発現を検出することにより、肺癌についての予後を予測する、または予後診断を提供する方法を提供する。かかる群の例は、ctnnb1、wnt3a、tp53、kras、erbb3、muc1、erbb2およびdusp6の遺伝子のいくつかまたは全て、あるいは遺伝子rnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、il11、cdc6、cdk2ap1、bag1、emx2、six3およびbrca1のいくつかまたは全て(例えばwnt3a、rnd3、lckおよびerbb3)を含み得る。予測および予後診断は、患者または患者サンプル中の肺癌バイオマーカーポリヌクレオチドまたは対応するポリペプチドの一群のレベルを測定し、次いでそのレベルとベースラインまたは範囲を比較することを包含する。典型的には、ベースライン値は、生物学的サンプル、例えば肺生検または体液サンプルを用いて測定した、肺癌に罹患していないまたは肺癌を発症する運命にない健康人におけるポリヌクレオチドまたは核酸のレベルからの代表である。ベースライン範囲からの本発明のポリヌクレオチドまたは対応するポリペプチドのレベルの変動(上方または下方)は、その患者が長期死亡率の増大したリスクを有することを示す。
別の態様において、本発明は、癌を有する対象の予後診断を示すレポートを特徴とする。レポートは、例えば、電子形態または紙形態であり得る。レポートは、基本的な患者情報(対象を確認するもの(例えば、対象の氏名、社会保障番号、医療保険番号またはランダムに作成された番号)を含む)、対象の身体的特性(例えば、年齢、体重または性別)、依頼した医師の氏名、予後診断がなされた日付およびサンプル採取日を含み得る。レポートされる予後診断は、特定期間の間の生存可能性、特定期間内の特定処置(例えば化学療法的または外科的処置)に対する反応の見込みおよび/または癌の再発の可能性に関係し得る。レポートされる予後診断は、特定期間の間の生存可能性のパーセンテージ、処置に対する好ましい反応の可能性のパーセンテージ(好ましい反応は、例えば、腫瘍の縮小または腫瘍成長の減速と定義され得る)または既定の期間にわたる再発可能性(例えば、5年にわたる生存の20%可能性)の形態であり得る。あるいは、レポートされる予後診断は、算出されたスコアの形態であり得る。より高いまたはより低いスコアが、例えば、好ましい予後の指標となるものであり得る。別の実施態様において、レポートされる予後診断は、一定期間にわたる生存可能性、処置に対する反応の可能性または再発可能性の一般的な記載(例えば、5年間の生存の可能性が非常に高い、おそらく生存するであろう、または生存の見込みがない)であり得る。別の実施態様において、レポートされる予後診断はグラフの形態であり得る。遺伝子発現レベルに加え、レポートされる予後診断は対象のさらなる特徴(例えば、年齢、癌のステージ、性別、先の処置、身体の健康(fitness)、心臓脈管の調子およびメンタルヘルス)も考慮に入れてもよい。
本発明は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体または本発明のポリヌクレオチドに特異的な核酸を用いて、本明細書に記載のアッセイを行うための、組成物、キットおよび組み込み系を提供する。
以下の実施例は例証のために提供するのであって、特許請求する本発明を限定するものではない。
患者
肺腺癌の完全な外科的切除を行い、新鮮な凍結組織をゲノム分析の間バンクした120人の患者を1997年1月〜2004年6月の間研究した。適格な患者は、治癒を目的とした外科的切除を行い、縦隔リンパ節の十分なステージ分けを行った患者である。純粋な予後診断ツールの開発を混乱させないために、手術前に化学療法を受けた患者は研究から除外した。バンクした組織が不十分であった、RNAの質が不十分であった、またはハウスキーピング遺伝子の発現が弱かったために、31人の患者を除外した。主要評価項目は全生存であった。無病生存期間(DFS)は、外科術時から、X線検査にて再発疾患が証明されるまで、または再発疾患が存在しなかった最後に記録した医師の経過観察訪問時までと定義した。患者はあらかじめ組織試料採取に同意しており、研究はUCSF治験審査委員会により承認されている(CHR番号H8714-28880-01)。
先に報告された、早期ステージの肺癌における予後のマイクロアレイおよびPCRに基づく研究から同定された217遺伝子のうち(例えば、Beer et al. Nat Med 8:816 (2002);Potti et al. N Engl J Med 355:570 (2006);Wigle et al. Cancer Res 62:3005 (2002);Garber et al. Proc Natl Acad Sci U S A 98:13784 (2001);Miura et al. Cancer Res 62:3244 (2002);およびSchneider et al. Br J Cancer 83:473 (2000)を参照)、76の癌関連遺伝子を内容の専門家または文献調査によって同定した。パイロット研究におけるRT-PCRによると非機能性のプライマーであった、または腫瘍組織において発現が非常に弱かったために、15遺伝子を除外した。残りの61の遺伝子を表5に列挙する。
全ての組織を操作時に液体窒素中において凍結させた。組織を1cm3切片に切り(macrodissect)、液体窒素中で粉砕した。RNAをTriZol(Invitrogen、Carlsbad、CA)抽出プロトコールを用いて抽出した。384ウェルプレート中のcDNA について7900HT装置(Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いてTaqman RT-PCRを行った。各遺伝子の発現を3回アッセイした。サンプルを市販のプールされた正常な肺RNA(Clontech、Mountain View、CA)と比較し、18SリボゾームrRNA(Applied Biosystems)に標準化した。
我々のデータ構造の顕著な特徴は、(i)適度の事象数(47−行方不明者を除外するサブ設定後)を用いて検閲された正しい生存終点(死亡);(ii)RT-QPCRから得られた(log)遺伝子発現値(上述のデルタ-デルタCt)によって構成される多数の(61)予測因子;および(iii)臨床的および人口統計的共変数を選択することである。これらの特性および規模を鑑みて、我々が用いた主なデータ分析ツールはL1罰則のCox比例ハザード回帰であった。この方法はL1罰則に備わっている同時収縮係数および予測因子選択を拡張し、それは生存データ設定に高度に効果的であることが証明された。マイクロアレイ遺伝子発現の適用によってかなり動機付けられた初期の拡張は、コンピューター的に禁止されるか、または概算に頼っていた。我々はモデルサイズ;すなわち選択された遺伝子数を決定するための交差検定を用いた。次いで、モデル係数に基づいて各対象についてリスクスコアを作成した。得られた予測されたリスクスコアを二分し(中央で)、対応するKaplan-Meier生存曲線を示し、ログランク統計値によって比較した。全ての分析は統計パッケージR(バージョン2.3.1、2006)を用いて行った。
Claims (41)
- 対象において肺癌の予後診断を提供する方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)対象からの生物学的サンプルを、ctnnb1、wnt3a、tp53、kras、erbb3、muc1、erbb2およびdusp6を含むバイオマーカーの一群の1つのメンバーにそれぞれ特異的に結合する試薬群と接触させる工程、および
(b)それらのマーカーがサンプル中において示差的に発現されているかどうかを決定する工程;これにより肺癌についての予後診断が提供される。 - 試薬が核酸である、請求項1に記載の方法。
- 試薬がオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 試薬がPCRプライマーセットである、請求項1に記載の方法。
- 試薬が抗体である、請求項1に記載の方法。
- 肺癌が肺腺癌である、請求項1に記載の方法。
- 肺腺癌がステージIである、請求項6に記載の方法。
- 肺腺癌がステージIIである、請求項6に記載の方法。
- 肺腺癌がステージIIIである、請求項6に記載の方法。
- 肺腺癌がステージIVである、請求項6に記載の方法。
- サンプルが外科的に摘出された腫瘍からのものである、請求項1に記載の方法。
- サンプルが肺組織または肺腫瘍生検からのものである、請求項1に記載の方法。
- 予後診断が、長期死亡率についての高リスクまたは低リスクの評価を提供する、請求項1に記載の方法。
- ctnnb1、wnt3a、tp53、kras、erbb3、muc1、erbb2およびduspを含むバイオマーカーの一群の1つのメンバーにそれぞれ特異的に結合する試薬を含むキット。
- 試薬がPCRプライマーセットである、請求項14に記載の方法。
- 肺癌を有する対象の予後診断を提供する方法であって、生物学的サンプル中のrnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、il11、cdc6、cdk2ap1、bag1、emx2、six3およびbrca1からなる群から選択される少なくとも2のバイオマーカーの発現レベルを定量化することを含む方法であり、該生物学的サンプルは該対象に由来し、該発現レベルは予後の指標となるものである、方法。
- 前記発現レベルがmRNA発現レベルである、請求項16に記載の方法。
- 前記定量化が定量的rtPCRを含む、請求項17に記載の方法。
- 前記発現レベルがタンパク質発現レベルである、請求項16に記載の方法。
- 前記発現レベルが抗体結合アッセイを用いて定量化される、請求項19に記載の方法。
- 抗体結合アッセイがELISAである、請求項20に記載の方法。
- 生物学的サンプル中の少なくとも3のバイオマーカーの発現レベルを定量化することを含む、請求項16に記載の方法。
- 生物学的サンプル中の少なくとも4のバイオマーカーの発現レベルを定量化することを含む、請求項16に記載の方法。
- 少なくとも4のバイオマーカーを含み、該少なくとも4のバイオマーカーがerbb3、lck、wnt3aおよびrdn3を含む、請求項16〜23のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも4のバイオマーカーを含み、該少なくとも4のバイオマーカーがerbb3、lck、wnt3aおよびrdn3を含む、請求項16〜23のいずれかに記載の方法。
- 生物学的サンプルが血液サンプルである、請求項16〜23のいずれかに記載の方法。
- 生物学的サンプルが腫瘍生検である、請求項16〜23のいずれかに記載の方法。
- 生物学的サンプルが肺生検である、請求項16〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記発現レベルがタンパク質発現レベルおよびmRNA発現レベルの組合せである、請求項16に記載の方法。
- 肺癌を有する対象の予後診断を提供する方法であって、生物学的サンプル中のrnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、il11、cdc6、cdk2ap1、bag1、emx2、six3およびbrca1からなる群から選択される少なくとも2のバイオマーカーのメチル化レベルを測定することを含む方法であり、該生物学的サンプルは該対象に由来し、該メチル化レベルは予後診断の指標となるものである、方法。
- 生物学的サンプル中の少なくとも3のバイオマーカーの発現レベルを定量化することを含む、請求項30に記載の方法。
- 生物学的サンプル中の少なくとも4のバイオマーカーの発現レベルを定量化することを含む、請求項30に記載の方法。
- 前記少なくとも4のバイオマーカーがerbb3、lck、wnt3aおよびrdn3を含む、請求項32に記載の方法。
- 肺癌を有する対象の予後診断を含むレポートであって、該予後診断は対象の生物学的サンプル中のrnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、il11、cdc6、cdk2ap1、bag1、emx2、six3およびbrca1からなる群から選択される少なくとも2のバイオマーカーの発現レベルを定量化することによって決定されたものであり、該発現レベルは該予後診断の指標となるものである、レポート。
- 生物学的サンプル中の少なくとも3のバイオマーカーの発現レベルの定量化を含む、請求項34に記載のレポート。
- 生物学的サンプル中の少なくとも4のバイオマーカーの発現レベルの定量化を含む、請求項34に記載のレポート。
- 該少なくとも4の遺伝子がerbb3、lck、wnt3aおよびrdn3を含む、請求項36に記載のレポート。
- 肺腺癌を有する対象から単離された生物学的サンプルの遺伝子発現プロファイルを含むレポートであって、該遺伝子発現プロファイルはrnd3、wnt3a、erbb3、lck、sh3bgr、fut3、il11、cdc6、cdk2ap1、bag1、emx2、six3およびbrca1からなる群から選択される少なくとも2のバイオマーカーの発現レベルを含む、レポート。
- 生物学的サンプル中の少なくとも3のバイオマーカーの発現レベルの定量化を含む、請求項38に記載のレポート。
- 生物学的サンプル中の少なくとも4のバイオマーカーの発現レベルの定量化を含む、請求項38に記載のレポート。
- 該少なくとも4の遺伝子がerbb3、lck、wnt3aおよびrdn3を含む、請求項40に記載のレポート。
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