CN115896290B - Trim21基因检测在肿瘤诊断、治疗选择和预后评估中的应用 - Google Patents

Abstract

提供了三基序E3泛素连接酶21(TRIM21)基因检测在肿瘤诊断、治疗选择和预后评估中的应用。具体提供了TRIM21分子作为生物标志物在制备通过检测获自对象的样品中TRIM21水平来进行黑色素瘤免疫分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估的产品中的用途、以及相应的产品和方法。

Description

TRIM21基因检测在肿瘤诊断、治疗选择和预后评估中的应用

技术领域

本申请属于基因/蛋白质检测、疾病诊断和生物治疗领域。

本文具体涉及TRIM21分子检测在肿瘤分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估中的应用，尤其是肿瘤是否为免疫治疗敏感肿瘤的分型诊断、免疫治疗方案选择及其预后评估。本文还涉及与该应用对应的方法和试剂盒等产品。

背景技术

蛋白质的翻译后修饰是调控蛋白质功能及稳定性的重要因素，而泛素化修饰则是最主要的翻译后修饰形式之一，在蛋白质定位、代谢和功能中都发挥十分重要的作用。同时，泛素化修饰也参与细胞增殖、凋亡、分化、迁移以及基因表达、转录调控、信号传导、炎症免疫等几乎所有生命过程，同临床肿瘤、感染等疾病也密切相关。

泛素化是指泛素分子在特殊酶的作用下，对靶蛋白进行特异性结合修饰的过程。参与这一过程的主要是四种酶：E1泛素激活酶、E2泛素结合酶、E3泛素连接酶以及介导反向去泛素化的去泛素化酶(DUB)。生物体内E1泛素激活酶和E2泛素连接酶种类较少，通用性较强；而E3泛素连接酶则是决定被泛素化修饰特异性的关键酶，因而种类较多，约有600多种。三结构域蛋白(Tripartite motif，TRIM)家族是E3泛素连接酶中较大的亚家族。迄今为止，在人类基因组中已经发现了近80种TRIM家族蛋白，其中很多被证明具有泛素连接酶活性而参与机体的各种生命活动。

TRIM21是TRIM家族E3泛素酶，分子量为52kD，因而又名Ro52。最初TRIM21是在***性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)和干燥综合征(Sjogren’ssyndrome)中发现的自身抗原，表达在多种细胞，尤其是T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞中。

TRIM21从N端开始分别包含RING-finger、B-box和Coiled-coil结构域，以及C末端的PRYSPRY结构域。RING-finger结构域是TRIM21作为E3泛素连接酶泛素化活性基础，B-box结构域类似RING-finger结构域，以竞争方式参与TRIM21活性调节，Coiled-coil卷曲结构域主要介导TRIM分子的多聚化，而C端的PRYSPRY结构域则参与对特异性底物的识别，同时还含有抗体结合位点，是TRIM21特异性的决定结构域，也是抗病毒免疫的关键结构域。

TRIM21作为TRIM家族E3泛素连接酶，其泛素化功能研究主要集中在感染和炎症领域，尤其是调控机体抗病毒免疫应答。细胞抗病毒主要通过RIG-I和cGAS等模式识别受体(PRR)分别识别病毒核酸RNA或者DNA，进而介导下游MAVS/STING，最终通过IRF3和NFkB转录因子的激活，启动干扰素及炎症因子的表达，发挥抗病毒效应。据研究，TRIM21可以在多个层面调控机体抗病毒效应：

(1)在PRR水平，TRIM21可以通过抗体依赖的方式快速裂解病毒包壳，暴露核酸被RIG-I和cGAS识别(Watkinson RE等，“TRIM21 Promotes cGAS and RIG-ISensing ofViral Genomes during Infection by Antibody-Opsonized Virus”.PLoS Pathog.2015；11(10):e1005253)；

(2)TRIM21还能够直接结合DNA识别受体DDX41，通过K48泛素化DDX41促进其蛋白酶体途径的降解，抑制I型干扰素的产生，负向调控机体抗病毒免疫；

(3)在信号转导接头蛋白层面，TRIM21可以通过结合MAVS，催化MAVS的K27泛素化，促进MAVS对TBK1的招募，从而增强下游信号通路的激活和干扰素产生，增强抗病毒效应(Xue BB等，“TRIM21 promotes innate immune response to RNA viral infectionthrough Lys27-linked polyubiquitination of MAVS”.J Virol，2018，92(14):e00321)；

(4)在转录因子层面，TRIM21对IRF3、IRF5、IRF7和IRF8等都具有调控效应。TRIM21可以通过PRYSPRY结构域结合IRF3、IRF5和IRF7的IAD结构域，通过K48泛素化介导IRFs的降解，负向调节I型干扰素的产生。TRIM21的IRF8的作用有别于其他IRFs，其泛素化并不介导IRF8的降解，相反却通过增强其转录活性，促进抗病毒炎症因子的表达。

TRIM21的C末端PRYSPRY结构域结合抗体的特殊功能是TRIM21有别于其他TRIM家族成员的最重要特征。PRYSPRY含有PRY和SPRY两个子结构域，PRY结合IgG的CH2结构域，SPRY结合CH3结构域，单体TRIM21只结合一条重链，TRIM21二聚体正好结合抗体的两条重链。TRIM21通过PRYSPRY同抗体分子(IgG、IgM、IgA)的Fc段结合的能力赋予其独特的抗病毒免疫功能。

正常情况下，抗体的抗病毒能力是通过结合病毒的中和表位，阻止病毒入侵细胞，这就是通常所谓的病毒中和反应。然而病毒抗原优势表位通常为非中和表位，因此就会出现虽然有抗体结合了病毒，但并不能阻止病毒入侵宿主细胞。这种情况下，病毒带着非中和抗体入侵细胞内，是TRIM21发挥独特效应的特殊场景。进入细胞浆中的病毒和抗体复合物，在胞浆中被TRIM21的PRYSPRY结构域识别并结合，激活TRIM21酶活性介导自身泛素化后，通过蛋白酶体途径或者自噬途径降解，从而灭活病毒，保护机体免受感染。TRIM21的这一独特效应又被称为抗体依赖的细胞内中和效应(Antibody dependent intracellularneutralization，ADIN)。病毒颗粒降解后释放出的RNA、DNA等模式分子则能够进一步被RIG-I或者cGAS等识别，进而实现对病毒的彻底清除。

目前报道的能够被TRIM21清除的病毒主要是一些无壳病毒，包括***病毒(FMDV)、人V型腺病毒等。此外，TRIM21还可以以类似的机制参与机体抗沙门氏菌(salmonella enterica)等胞内菌感染。TRIM21介导的细胞内中和效应，不需要高浓度抗体，可以快速降解进入胞内的病毒，阻止其在胞浆内复制繁殖，并触发抗病毒免疫，可能在抗感染早期发挥重要作用。TRIM21的这一特性还衍生了TRIM-away技术的诞生，从而可以靶向降解胞内任意蛋白质，在制药业有着广泛应用前景。

肿瘤是威胁人类健康的最主要重大疾病之一。根据肿瘤学权威期刊《临床肿瘤杂志》(CA Cancer J Clin)发布的最新数据，2022年美国将有约237万例新发癌症和64万例癌症死亡；而我国的数据是约482万例新发癌症和321万例癌症死亡(陈万青等，“Cancerstatistics in China and United States,2022:profiles,trends,and determinants”,Chin Med J(Engl).2022Feb 9；135(5):584-590)。也就是说，我国癌症的新发病例数约为美国的2倍，死亡病例约为5倍。癌症在全球都是一个巨大的经济负担，且随着时间的推移，病程的发展，癌症负担将越来越大。因此，对于肿瘤进行有针对性的积极治疗具有重要的意义。

以黑色素瘤为例，这是一种恶性程度高的肿瘤，易发生转移，其发病率呈逐年上升趋势。临床研究发现，I、II、III、IV期黑色素瘤患者的平均5年生存率分别约为90％、70％、40％和不到10％，IV期患者的中位无进展生存期仅为1.7个月，转移是其死亡主要原因。近年来，随着靶向治疗和免疫治疗的发展，黑色素瘤治疗取得了突飞猛进的进展，尤其是免疫治疗的发展，给黑色素瘤患者提供了更广泛的选择和受益，极大延长了黑色素瘤患者生存期。

黑色素瘤的免疫疗法包括干扰素治疗、过继免疫疗法、肿瘤疫苗以及近年尤为热门的免疫检查点抑制剂。伊匹单抗(Ipilimumab)联合达卡巴嗪治疗的晚期患者中位生存期显著延长，其5年生存率提高到18.2％，高于对照组的8.8％。而另一项临床试验发现纳武单抗(nivolumab)治疗明显提高患者一年总生存率，客观缓解率为42％，远高于达卡巴嗪组的14％。

尽管针对CTLA4和PD-1的单克隆抗体作为免疫检查点抑制剂广泛用于黑色素瘤的免疫治疗，取得了优秀的疗效，但是由于肿瘤的高度异质性以及肿瘤微环境的复杂性，其有效率或者响应率依旧在20-30％之间，仍然有广大黑色素瘤患者不能从中获益，而且无法预测不同个体对治疗的响应性。

因此，鉴定和筛选与肿瘤(例如恶性黑色素瘤)的预后高特异、高选择性相关的标志物，筛选出免疫治疗能够获益群体，对改进肿瘤治疗至关重要，这也很可能有助于发现未来新药针对性研发的潜在靶点。

既往用临床指标(如TNM分级)预测肿瘤(例如恶性黑色素瘤)转移。但是，临床指标或者病理类型相似的患者却有截然不同的临床疗效以及结局，所以用临床指标或者单独的分子标志来预测或选择患者难以取得满意的效果。最近，基于切除肿瘤或者穿刺取样的生物标志物，如PD-L1、TMB(tumor mutation burden)等分子标志物在免疫治疗患者筛选中得到重视。然而，在临床应用中，这些分子指标仍然不能很好的预测潜在能够获益人群。

因此，深入理解临床分子病理学特征，对肿瘤实行个体化、预见性的治疗有助于改善对患者的临床处理，从而提高肿瘤患者的无瘤生存期及绝对生存期。此外，确定黑色素瘤相关基因及其参与肿瘤免疫的机理，既可为黑色素瘤个体化预见性治疗提供基础，也为新的治疗方案提供靶点，从而有利于提高整体治愈率。

TRIM家族分子在肿瘤发生发展中既往已有研究。TRIM11促进了卵巢癌和胃癌进展，TRIM22促进小胶质瘤进展，TRIM27促进了非小细胞肺癌进展，TRIM35和TRIM47促进乳腺癌进展，其机制都是通过调控肿瘤细胞增殖凋亡以及侵袭转移(YX Zhang等，“The rolesand targeting options of TRIM family proteins in tumor”.FrontPharmacol.2022Sep 30.DOI：10.3389/fphar.2022.999380)，提示某些TRIM家族分子参与了肿瘤生物学行为调控。然而，虽然TRIM家族分子在肿瘤预后中已有研究，但已知的TRIM功能各异，且不同肿瘤起源及发病机制各异，要从中筛选出与肿瘤相关且可作为发病、治疗方案选择和预后指标的特定TRIM分子仍然存在较大的难度。

目前，国内外尚无有关TRIM21在肿瘤(例如黑色素瘤)治疗及免疫治疗相关性中的研究报道。而本领域迫切需要寻找到可有效用于肿瘤诊断、肿瘤治疗方案选择、肿瘤预后评估的分子，并将其用于这些用途中。

发明内容

本文提供了TRIM21分子作为生物标志物在黑色素瘤免疫分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估中的应用、相关用途、产品和方法。本文的用途、产品和方法可用于对黑色素瘤进行分型、治疗方案选择和预后评估从而使得对黑色素瘤的免疫治疗更有针对性，事先对患者的个性化针对性治疗。

在本文的一些方面中，提供了TRIM21作为生物标志物在制备通过检测对象样品中TRIM21水平来进行黑色素瘤免疫分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估的产品中的用途。

在一些实施方式中，本文的黑色素瘤分型诊断是根据对象肿瘤样品中TRIM21水平将黑色素瘤分型为免疫治疗敏感型或免疫治疗非敏感型。

在一些实施方式中，本文的治疗方案选择是根据对象肿瘤样品中TRIM21水平选择是否对罹患黑色素瘤的所述对象施用免疫治疗或联用免疫治疗与免疫增强剂。

在一些实施方式中，本文的预后评估是根据对象肿瘤样品中TRIM21水平将罹患黑色素瘤的所述对象评估为预后良好或预后不良。

在一些实施方式中，本文的分型诊断包括：根据对象肿瘤样品中TRIM21水平将黑色素瘤分型为免疫治疗敏感型或免疫治疗非敏感型，其中TRIM21水平高于对照水平则将所述黑色素瘤分型诊断为免疫治疗敏感型黑色素瘤，而TRIM21水平低于对照水平则将所述黑色素瘤分型诊断为免疫治疗不敏感型黑色素瘤。在一些实施方式中，分型诊断的对照水平为通过统计学确定的群体标准水平。

在一些实施方式中，本文的治疗方案选择包括：根据对象肿瘤样品中TRIM21水平确定是否对罹患黑色素瘤的所述对象施用免疫治疗或联用免疫治疗与免疫增强剂，其中TRIM21水平高于对照水平则为所述对象选择免疫治疗，而TRIM21水平低于对照水平则不选择对所述对象施用免疫治疗或选择对所述对象联用免疫治疗与免疫增强剂。

在一些实施方式中，本文的预后评估包括：根据对象样品中TRIM21水平对罹患黑色素瘤的所述对象进行预后评估，其中TRIM21水平高于对照水平则评估所述对象预后良好，而TRIM21水平低于对照水平则评估所述对象预后不良。

在一些实施方式中，对照水平为：由非肿瘤的正常生物样品(例如获自该对象非肿瘤癌旁组织或正常组织的样品)中测得的TRIM21分子水平、同一对象不同时间点采集的样品(例如治疗前一段时间内、治疗前后、治疗后一段时间内)、通过统计学确定的群体标准水平(例如统计学样本中TRIM21水平的中位数或平均数)、或经标准化的水平。

在一些实施方式中，对照水平为经qRT-PCR检测，并使用T test计算得到的TRIM21水平。

在一些实施方式中，本文的黑色素瘤分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估中所用对照水平为通过统计学确定的群体标准水平。在一些实施方式中，群体为黑色素瘤患者群体、黑色素瘤高风险对象群体。例如，群体标准水平通过qRT-PCR检测群体成员肿瘤中的TRIM21水平并进行相对定量，且以其中位值为界。在一些实施方式中，参考本申请实施例2的方法来确定群体标准水平。在一些实施方式中，阈值范围为0.35±20％、0.35±15％、0.35±10％、0.35±5％、0.35±1％等。

在一些实施方式中，免疫治疗是选自下组中的一种或多种治疗：免疫检查点抑制治疗(例如PD-1抑制剂治疗、PD-L1抑制剂治疗、CTLA-4抑制剂治疗)、细胞免疫治疗(例如过继细胞治疗)、抗原嵌合受体(CAR)细胞治疗(例如CAR-T治疗、CAR-NK治疗)、T细胞受体(TCR)T细胞治疗、双特异性抗体治疗、肿瘤疫苗治疗、溶瘤病毒治疗。

在一些实施方式中，免疫治疗为采用选自下组的一种或多种活性成分的黑色素瘤免疫治疗：Ipilimumab、Nivolumab、Pembrolizumab、Tremelimumab、Spartalizuma、Dostarlima、Relatlim、Eftilagimod Alpha、LAG525、Enoblituzuma、Varlilumab、TRX518、Urelumab、LVGN6051、NY-ESO-1TCR、Mutanome、GEN-009、NEO-PV-01、Talimogenelaherparepvec、RIGVIR。

在一些实施方式中，所检测的TRIM21为选自下组的物质：Trim21基因、Trim21的mRNA、cDNA、TRIM21蛋白或前述任一种的活性或标志性片段。

在一些实施方式中，所检测的TRIM21来自哺乳动物，如人。

在一些实施方式中，所检测的TRIM 21为包括如下序列的分子：

(a)具有诸如Gene ID:6737(人)、Gene ID:20821(小鼠)、Gene ID:308901(大鼠)等所示序列的TRIM21分子；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的分子；

(c)与(a)或(b)中序列具有70％以上的序列同源性且编码TRIM21蛋白或其活性或标志性片段的TRIM21分子；

(d)上述任一所述TRIM21分子编码的TRIM21蛋白或其活性或标志性片段。

在一些实施方式中，TRIM21水平包括其核酸分子水平和/或其蛋白质分子水平。

在一些实施方式中，检测对象为哺乳动物，例如人、非人灵长类动物(例如猩猩、猿)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、宠物(例如猫、狗)、家畜(例如马、牛、羊、猪、兔)。

在一些实施方式中，检测对象选自下组：将接受、正在接受或已接受肿瘤免疫治疗的黑色素瘤患者；具有或疑似具有获得性免疫缺陷或受损的黑色素瘤患者；或具有前述两种情况的黑色素瘤患者。

在一些实施方式中，检测的样品选自：获自所述对象肿瘤的组织、细胞和/或体液样品。

在一些实施方式中，检测的样品选自：新鲜样品、冷冻样品、固定样品(如***固定样品、石蜡包埋样品)。

在一些实施方式中，本文的产品为试剂盒或试剂与检测设备的组合。

在一些实施方式中，本文的产品包含用于测定样品中TRIM21水平的试剂、器材和/或设备，例如所述测定样品中TRIM21水平的试剂包括选自下组中的一种或多种：对TRIM21具有检测特异性的探针、基因芯片、引物(例如SEQ ID NO:1和/或2所示的引物)、抗体、蛋白质芯片、化学小分子。

在一些实施方式中，本文的产品用于通过选自下组的方式来测定TRIM21水平：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印记法原位杂交法、免疫荧光法、免疫组织化学法、或RNA印迹法或原位杂交法。

在一些实施方式中，测定样品中TRIM21水平的试剂直接或间接被可检测标签标记。在一些实施方式中，可检测标记选自：放射性同位素、荧光基团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子或配体。

在本文的一些方面中，提供了检测获自对象的样品中三基序E3泛素连接酶21(TRIM21)水平的特异性试剂在制备通过检测所述样品中TRIM21水平来进行黑色素瘤免疫分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估的产品中的用途。在一些实施方式中，所述用途中的各特征如本文中所详细描述。

在本文的一些方面中，提供了用于通过检测对象样品中TRIM21水平来进行黑色素瘤免疫治疗分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估的产品。在一些实施方式中，所述用途中的各特征如本文中所详细描述。在一些实施方式中，所述产品包含用于检测所述样品中TRIM21水平的试剂、器材和/或设备。在一些实施方式中，所述用途中的各特征如本文中所详细描述。

在本文的一些方面中，提供了黑色素瘤免疫治疗分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估的方法，所述方法包括：检测获自对象的样品中TRIM21的水平；根据样品中TRIM21水平对所述对象进行黑色素瘤免疫治疗分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估。

在本文的一些方面中，提供了一种***，其包括：获得对象样品中TRIM21水平的模块；对所得TRIM21进行分析以对所述对象进行黑色素瘤免疫治疗分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估的分析模块；分析结果输出和/或存储模块。

在一些实施方式中，所述***还可任选地包括选自下组的一个或多个模块：对象样品采集或接收模块；样品TRIM21水平检测模块；TRIM21水平输入和/或存储模块；本地、远程或云数据存储、读取和/或分析模块。

本领域的技术人员可对本文所述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：TRIM21在黑色素瘤组织与癌旁组织中的表达情况的qRT-PCR检测；P值使用Ttest计算，P<0.01代表极显著性差异。

图2：黑色素瘤中TRIM21表达同T细胞相关趋化因子CXCL9及CXCL10的相关性分析。P值使用Pearson correlation计算。

图3：黑色素瘤中TRIM21高表达和低表达组肿瘤中CD4和CD8T细胞占淋巴细胞比例。P值使用T test计算。

图4：TRIM21高表达和低表达黑色素瘤患者总生存时间Kaplan-Meier生存曲线比较。

图5：TRIM21高表达和低表达患者接受免疫检查点抑制剂抗PD1治疗后Kaplan-Meier生存曲线比较，即PD1免疫治疗在TRIM21高表达和低表达患者中有效性比较。

具体实施方式

本文目的之一在于提供可有效用于黑色素瘤免疫治疗分型、治疗方案选择、预后评估的分子。本文的目的之一还在于提供以该分子为生物标志物的可临床应用的产品及其使用方法。

本发明人经过长期而深入的研究发现：TRIM21分子在黑色素瘤患者组织细胞中低表达，且其表达水平同肿瘤免疫细胞浸润相关，同肿瘤预后相关。发明人在此基础上进行进一步的研究发现：TRIM21分子可在体内促进免疫细胞进入肿瘤微环境，从而发挥抗肿瘤的作用。TRIM21高表达患者对PD-1等免疫治疗响应性极显著高于TRIM21低表达患者，且生存时间也极显著地长于低表达患者。由此，发明人发现了TRIM21分子在用于肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估中的新用途，从而在此基础上完成了本发明。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本文中的数值范围包括其端点以及该数值范围内的各具体数值点和子范围。例如，1～3包括端点1和3、其中的具体整数数值点2和非整数数值点(例如但不限于：1.2、1.5、1.8、2.1、2.3、2.4、2.8等，以及其子范围(例如但不限于：1～2、2～3、1～1.2、1.5～1.8等)。

TRIM21分子

根据本申请中的内容，TRIM21分子可作为生物标志物用于黑色素瘤免疫治疗分型诊断、治疗方案选择和预后评估，从而为患者提供更有针对性的个性化治疗，有效提高抗肿瘤免疫治疗的敏感性和效果。

如本文所用，术语“TRIM21”或“TRIM21分子”具有其广义的含义，包括存在于正常对象和黑色素瘤对象中的任何类型的TRIM21分子中可供检测的一种或多种，例如Trim21基因、Trim21的mRNA、cDNA、TRIM21前体、TRIM21蛋白、其修饰或剪切产物、或活性片段或标志性片段。该术语也包括为检测目的对天然TRIM21分子进行修饰后所得的分子，例如经过片段化、加标签、化学修饰、与特异性分子结合等所得的衍生分子。

本文所述的TRIM21分子可为例如：

(a)具有诸如Gene ID:6737(人，SEQ ID NO:10)、Gene ID:20821(小鼠)、Gene ID:308901(大鼠)等所示序列的TRIM21分子；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的分子；

(c)与(a)或(b)中序列具有70％以上(例如75％、80％、85％、90％、95％、98％、

99％、99.5％以上，或其间的任何数值或数值范围)的序列同源性且能指示样品中TRIM21分子水平的分子；

(d)上述任一所述TRIM21分子编码的多肽(例如NP_003132所示多肽，SEQID NO:11)，或所述特异性或特征性片段。

(e)为检测目的对上述任一所述TRIM21分子(例如经过片段化、加标签、化学修饰、与特异性分子结合等所得的衍生分子)进行修饰所得且能指示样品中TRIM21分子水平的分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同一性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

如本文所用，术语“生物样品”或“待测样品”可互换使用，均是指获自对象且用于TRIM21分子检测的样品。生物样品可以是获自对象的新鲜组织、***固定或石蜡包埋组织、体液、血液、或细胞等，优选为新鲜组织、***固定或石蜡包埋组织。这些样品可为切片、涂片、悬液、溶液、RNA提取物等适于检测的各种形式存在，例如可在检测前抽提组织或细胞中的总RNA。

检测产品和方法

本文中还提供了用于根据对象样品中TRIM21水平进行黑色素瘤免疫治疗分型诊断、治疗方案选择和预后评估的产品和方法。

本文的产品可为检测试剂盒和/或检测设备和/或检测***。可根据实际应用中的需求(例如所选检测方法、对象的具体情况等)对其中所包含的试剂、部件、模块等进行选择。

本文的产品中可包含：(i)检测有效量的检测TRIM21分子的一种或多种试剂、设备和/或模块；(ii)选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。

如本文所用，术语“检测试剂”或“检测TRIM21分子的试剂”或“检测生物样品中TRIM21水平/表达量的试剂”可互换使用，均是指特异性针对TRIM21分子，且可用于直接或间接检测出TRIM21分子的存在和/或含量的试剂。

由于TRIM21分子的序列在本领域中是已知的，本领域普通技术人员可基于常规手段制备或通过市售获得特异性针对TRIM21分子的试剂。例如，可用的检测试剂包括但不限于：对TRIM21分子具有检测特异性的探针、基因芯片、PCR引物，抗体、化学结合分子等，如TRIM21分子的反义序列、SEQ ID NO:1和/或2所示序列的引物等。

为了便于检测，检测试剂还可带有可检测标记，所述可检测标记包括但不限于：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)等。

检测试剂可存在于溶液中、固定于载体(如基片、吸附物)上或以其它本领域中常规的方式存在，只要该存在方式适于对生物样品中TRIM21分子的检测即可。例如，当检测试剂为核酸探针时，其可以生物芯片(或称“微阵列”)的形式存在。

本文的产品(如检测试剂盒)中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对黑色素瘤免疫治疗分型进行判断、对治疗方案进行选择和/或对预后进行评估。

可根据具体需要和条件，采用各种方法来检测样品中的TRIM21水平，例如可通过选自下组的一种或多种方法(包括但不限于)检测TRIM21分子水平：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、免疫组织化学、免疫荧光法，或RNA印迹法或原位杂交法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印迹法和原位杂交法可参考《分子印迹技术》刘朝奇等主编，化学工业出版社出版。

本文的产品还可包含临床上用于对象中肿瘤发展的判断、治疗方案的选择和/或预后评估的其它试剂，以辅助或验证通过检测TRIM21分子所得到的结果。本领域普通技术人员可根据具体需要进行常规选择。

在一些实施方式中，采用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检测生物样品中TRIM21水平，所用产品可包含：TRIM21特异性的反转录引物以及PCR引物。

在一些具体示例中，采用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检测生物样品中TRIM21水平，所用产品可包含：

(a)反转录酶；

(b)RNA酶抑制剂；

(c)反转录缓冲液；

(d)目的基因(Trim21)反转录引物和PCR上游引物和下游引物：

TRIM21反转录引物为：Oligo(dT)(例如，如SEQ ID NO:9所示)；

PCR上游引物(例如，如SEQ ID NO:1所示)；

PCR下游引物(例如，如SEQ ID NO:2所示)；

(e)可选地，内参反转录引物和PCR上游引物和下游引物：

内参β-actin的反转录反应引物：Oligo(dT)(例如，如SEQ ID NO:9所示)；

PCR上游引物(例如，如SEQ ID NO:3所示)；

PCR下游引物(例如，如SEQ ID NO:4所示)；

(f)PCR缓冲液；

(g)dNTP；

(h)Taq DNA聚合酶。

黑色素瘤免疫治疗分型、治疗方案选择和预后评估

本文中提供了用于黑色素瘤免疫治疗分型、治疗方案选择和预后评估的产品和方法，其中的生物标志物为TRIM21。

如本文所用，黑色素瘤免疫治疗分型诊断是指根据对象肿瘤样品中TRIM21水平将黑色素瘤分型为免疫治疗敏感型或免疫治疗非敏感型。本文中首次揭示了TRIM21水平高的黑色素瘤患者的肿瘤组织中具有比TRIM21水平低患者的肿瘤组织中更高的趋化因子水平以及更高的免疫细胞肿瘤浸润，从而使得TRIM21高水平患者对免疫治疗更为敏感，并由此被分型为“免疫治疗敏感型”黑色素瘤；反之，TRIM21低水平患者对免疫治疗较不敏感，并由此被分型为“免疫治疗非敏感型”黑色素瘤。

如本文所用，治疗方案选择是根据对象样品中TRIM21水平选择是否对罹患黑色素瘤的所述对象施用免疫治疗或调整已有治疗方案。对于TRIM21高水平黑色素瘤患者，可施用免疫治疗或保持原治疗方案；反之，对于TRIM21低水平患者，则需调整其治疗方案，例如施用非免疫治疗的其他治疗方法、提高免疫治疗剂量或频率、选择未施用过的其他免疫治疗剂等。

如本文所用，术语“预后”是指预测疾病的可能病程和结局，其包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡)。本发明中所述的预后不良包括但不限于：生存期缩短、肿瘤数量增加快、肿瘤变大加快、TNM分级上升等。本文中首次揭示了TRIM21水平高的黑色素瘤患者比TRIM21水平低患者具有更佳的预后。在预测了患者预后情况后，可结合提高TRIM21分子的量、及时调整治疗方案等措施来改善患者的预后。

可通过包含以下步骤的方法来进行黑色素瘤免疫治疗分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估：

(a)确定获自对象的肿瘤样品中的TRIM21水平；

(b)将(a)中的TRIM21水平与对照水平进行比较；

(c)根据比较结果进行黑色素瘤免疫治疗分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估，其中获自对象的样品中的TRIM21水平高于对照水平，则提示所述对象为免疫治疗敏感型、可选择免疫治疗或维持原有治疗方案、或预后良好；反之，获自对象的样品中的TRIM21水平低于对照水平，则提示所述对象为免疫治疗非敏感型、不宜选择免疫治疗或需要调整治疗方案、或预后不良。

如本文所用，术语“对照水平”是指用作参照的TRIM21分子的水平，其包括但不限于：由同一对象的非肿瘤正常生物样品(例如获自该对象非肿瘤癌旁组织或正常组织的样品)中测得的TRIM21分子水平、同一对象治疗前的TRIM21水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。在本文的一些实施方式中，通过qRT-PCR检测TRIM21水平，并使用T test计算得到的值来确定对照水平。

本文所用的对照水平可为数值点或阈值范围。本领域普通技术人员可根据本领域常识确定具体数值或数值范围。

本文揭示了TRIM21分子在黑色素瘤免疫治疗分型、治疗方案选择和/或预后评估中的新用途，为TRIM21乃至其它E3泛素连接酶的研究和开发利用提供了新的思路和途径。本文中首次公开了TRIM21分子可有效用于黑色素瘤分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估，从而为本领域提供了一种新颖的生物标志物，具有临床应用前景。

实施例

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Michael R.Green等人第四版，纽约，冷泉港实验室出版社《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2017)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：TRIM21检测试剂盒的制备

按如下组成制备TRIM21检测试剂盒，该试剂盒适于以实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检测生物样品中TRIM21的表达：

(a)装有反转录酶和RNA酶抑制剂的容器(Takara公司，货号RR037之一)；

(b)装有反转录5×缓冲液(75mM KCl，500mM Tris-Cl，pH 8.3，25℃，3mM MgCl₂，10mM DTT)的容器；

(c)装有目的基因反转录引物(10μM)的容器；

TRIM21反转录引物：

Oligo(dT)：5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO:9)；

(d)装有目的基因PCR上游引物和下游引物(各10μM)的容器：

定量PCR引物：

5'-TGCCTGGACCCCTTCGT-3'(上游，SEQ ID NO:1)；和

5'-GCCTCCTGGCTGATTTCTTTA-3'(下游，SEQ ID NO:2)；

(e)装有内参反转录引物和PCR上游引物和下游引物(10μM)的容器：

内参β-actin的反转录反应引物：

Oligo(dT)；5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO:9)；

定量PCR引物：

5'-CCATCGTCCACCGCAAAT-3'(上游，SEQ ID NO:3)；和

5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'(下游，SEQ ID NO:4)；

(f)装有Taq DNA聚合酶、dNTP、荧光染料TB Green及2×PCR缓冲液的容器(Takara公司，货号RR430)；

(g)使用说明书。

实施例2：TRIM21在黑色素瘤中的表达量

采用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法，用实施例1中的检测试剂盒对2016至2020年收集自上海长海医院的88例黑色素瘤患者的肿瘤组织与癌旁组织中TRIM21 mRNA水平的表达进行了分析。

采用TRIzol(Invitrogen公司)抽提组织总RNA。qRT-PCR采用实施例1的测试试剂盒在LightCycler1.5(Roche公司)实时定量PCR仪上完成。

TRIM21的相对定量使用2^-ΔΔCt法计算(β-actin为内参)(Livak，KJ.等，“Analysisof relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method”.Methods.2001；25:402-408)。

qRT-PCR分析结果发现，与癌旁非肿瘤组织相比，TRIM21在肿瘤组织中表达极显著降低(图1，p<0.01)。经计算，黑色素瘤组织中TRIM21表达的中位数为0.35，可据此将88例样本分为TRIM21高表达的44例，以及低表达的44例，用于后续分组比较研究。

实施例3：TRIM21表达量与T细胞相关趋化因子CXCL9/CXCL10的相关性

采用实时定量PCR方法，用实施例1中的检测试剂盒检测黑色素瘤组织中的TRIM21表达水平，同时对CXCL9和CXCL10的表达量进行检测，使用方法同实施例1，替换其中的引物序列为CXCL9及CXCL10特异性引物即可。分析TRIM21表达量与CXCL9/CXCL10表达之间的关系。

CXCL9定量PCR特异性引物：

5'-CCAGTAGTGAGAAAGGGTCGC-3'(上游，SEQ ID NO:5)；和

5'-AGGGCTTGGGGCAAATTGTT-3'(下游，SEQ ID NO:6)；

CXCL10定量PCR特异性引物：

5'-GTGGCATTCAAGGAGTACCTC-3'(上游，SEQ ID NO:7)；和

5'-TGATGGCCTTCGATTCTGGATT-3'(下游，SEQ ID NO:8)；

结果发现，TRIM21高表达的样本中，趋化因子CXCL9和CXCL10也高表达(图2)。该结果表明TRIM21表达量与T细胞相关趋化因子CXCL9/CXCL10呈现正相关性，而由于CXCL9和CXCL10这两个分子与T细胞应答正相关，该实施例的结果体现了TRIM21与T细胞免疫应答活性的正相关性。

实施例4：TRIM21表达量与黑色素瘤中CD4和CD8T细胞浸润比例的关系

收集14例黑色素瘤患者肿瘤组织，按TRIM21表达中位数分为高低两组，每组各7人。分离肿瘤组织，制备单细胞悬液，利用荧光抗体标记肿瘤浸润淋巴细胞(CD4-FITC，目录号300506100；CD8-BV421，目录号344748；CD45-Percp，目录号304026，均购自美国BioLegend公司)，并用BD Fortessa流式细胞仪上样检测，分析其中CD4和CD8 T细胞分别占CD45阳性总淋巴细胞的比例。

结果发现，TRIM21高表达患者肿瘤浸润淋巴细胞中CD4和CD8 T细胞的比例均显著高于TRIM21低表达组(图3)。该结果表明TRIM21表达量与T细胞的肿瘤浸润呈现正相关性，体现了TRIM21与T细胞免疫应答活性的正相关性。

实施例5：TRIM21表达量与黑色素瘤患者生存曲线的关系

对88例黑色素瘤患者采用实时定量PCR方法，按照实施例1中的试剂盒方法检测肿瘤组织中TRIM21的表达量，根据TRIM21表达中位数分为高低两组，各44人(参见实施例2)。两组患者年龄、性别、临床分期、肿瘤部位及免疫治疗间未见明显差异(表1)：

表1.黑色素瘤组织中TRIM21表达与患者临床因素的相关分析

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对TRIM21的表达与患者生存时间的相关性进行分析，P值使用log-rank test计算，结果如图4所示。

结果发现：TRIM21的低表达与患者更低的总体生存时间显著相关(图4)。

实施例6：TRIM21表达高低同PD-1抗体免疫治疗疗效的关系

采集接受免疫检查点抑制剂抗PD1抗体治疗(Pembrolizumab，治疗剂量为2mg/kgQ3W)的晚期黑色素瘤患者肿瘤组织样本，采用实施例1中的试剂盒检测TRIM21在肿瘤组织中的相对表达量，根据表达中位数分为高表达和低表达两组，分别对TRIM21的表达与患者生存时间的相关性进行分析，P值使用log-rank test计算。

结果发现：TRIM21的高表达与患者接受PD-1免疫治疗后更长的总体生存时间显著相关(图5)。

上述结果表明：TRIM21的表达在黑色素瘤患者中显著降低，并且TRIM21的表达同T细胞相关趋化因子以及肿瘤内T细胞浸润密切相关。临床上，TRIM21的低表达与患者较差的预后显著相关，且TRIM21低表达患者更难以从免疫治疗(诸如采用抗PD-1抗体的免疫治疗)中获益。该结果提示了TRIM21与肿瘤的发生和发展之间存在密切相关性，由此可作为肿瘤诊断、肿瘤治疗方案选择、肿瘤预后评估的标志物。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

附表.序列信息

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Claims (22)

1.检测TRIM21的试剂在制备通过检测获自对象的肿瘤样品中TRIM21水平来进行黑色素瘤免疫分型诊断、治疗方案选择和/或预后评估的产品中的用途，所述TRIM21作为生物标志物；其中，

所述黑色素瘤分型诊断是根据对象肿瘤样品中TRIM21水平将黑色素瘤分型为免疫治疗敏感型或免疫治疗非敏感型；

所述治疗方案选择是根据对象肿瘤样品中TRIM21水平选择是否对罹患黑色素瘤的所述对象施用免疫治疗或调整已有治疗方案；

所述预后评估是根据对象肿瘤样品中TRIM21水平将罹患黑色素瘤的所述对象评估为预后良好或预后不良。

2.如权利要求1所述的用途，其中，

所述分型诊断包括：根据对象样品中TRIM21水平将黑色素瘤分型为免疫治疗敏感型或免疫治疗非敏感型，其中TRIM21水平高于通过统计学确定的群体标准水平则将所述黑色素瘤分型诊断为免疫治疗敏感型黑色素瘤，而TRIM21水平低于标准水平则将所述黑色素瘤分型诊断为免疫治疗不敏感型黑色素瘤；和/或

所述治疗方案选择包括：根据对象样品中TRIM21水平确定是否对罹患黑色素瘤的所述对象施用免疫治疗或联用免疫治疗与免疫增强剂，其中TRIM21水平高于对照水平则为所述对象选择免疫治疗，而TRIM21水平低于对照水平则不选择对所述对象施用免疫治疗或选择对所述对象联用免疫治疗与免疫增强剂；

所述预后评估包括：根据对象样品中TRIM21水平对罹患黑色素瘤的所述对象进行预后评估，其中TRIM21水平高于对照水平则评估所述对象预后良好，而TRIM21水平低于对照水平则评估所述对象预后不良。

3.如权利要求2所述的用途，其中，所述对照水平为：由非肿瘤的正常生物样品中测得的TRIM21分子水平、同一对象不同时间点采集的肿瘤样品、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。

4.如权利要求3所述的用途，其中，所述对照水平为经qRT-PCR检测，并使用T test计算得到的TRIM21水平。

5.如权利要求1所述的用途，其中，所述免疫治疗是选自下组中的一种或多种治疗：免疫检查点抑制治疗、细胞免疫治疗、抗原嵌合受体细胞治疗、T细胞受体T细胞治疗、双特异性抗体治疗、肿瘤疫苗治疗、溶瘤病毒治疗。

6.如权利要求5所述的用途，其中，所述免疫检查点抑制治疗包括PD-1抑制剂治疗、PD-L1抑制剂治疗、CTLA-4抑制剂治疗。

7.如权利要求5所述的用途，其中，所述细胞免疫治疗包括过继细胞治疗。

8.如权利要求5所述的用途，其中，所述抗原嵌合受体细胞治疗包括CAR-T治疗和/或CAR-NK治疗。

9.如权利要求5所述的用途，其中，所述免疫治疗为采用选自下组的一种或多种活性成分的黑色素瘤免疫治疗：Ipilimumab、Nivolumab、Pembrolizumab、Tremelimumab、Spartalizuma、Dostarlima、Relatlim、Eftilagimod Alpha、LAG525、Enoblituzuma、Varlilumab、TRX518、Urelumab、LVGN6051、NY-ESO-1 TCR、Mutanome、GEN-009、NEO-PV-01、Talimogene laherparepvec、RIGVIR。

10.如权利要求1所述的用途，其中，所述TRIM21为选自下组的物质：Trim21基因、Trim21的mRNA、cDNA、TRIM21蛋白或前述任一种的活性或标志性片段。

11.如权利要求1所述的用途，其中，所述对象为哺乳动物。

12.如权利要求1所述的用途，其中，所述对象选自下组：将接受、正在接受或已接受肿瘤免疫治疗的黑色素瘤患者；具有或疑似具有获得性免疫缺陷或受损的黑色素瘤患者；或具有前述两种情况的黑色素瘤患者。

13.如权利要求1所述的用途，其中，所述样品为获自所述对象肿瘤的组织、细胞和/或体液样品。

14.如权利要求13所述的用途，其中，所述获自所述对象肿瘤的组织、细胞和/或体液样品包括新鲜样品、冷冻样品、固定样品。

15.如权利要求1所述的用途，其中，所述产品为试剂盒或试剂与检测设备的组合。

16.如权利要求1所述的用途，其中，所述产品包含用于测定样品中TRIM21水平的试剂、器材和/或设备。

17.如权利要求16所述的用途，其中，所述测定样品中TRIM21水平的试剂包括选自下组中的一种或多种：对TRIM21具有检测特异性的探针、基因芯片、引物、抗体、蛋白质芯片、化学小分子。

18.如权利要求17所述的用途，其中，所述引物具有序列SEQ ID NO: 1或2。

19.如权利要求1所述的用途，其中，所述产品用于通过选自下组的方式来测定TRIM21水平：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印记法原位杂交法、免疫荧光法、免疫组织化学法、或RNA印迹法或原位杂交法。

20.如权利要求16所述的用途，其中，所述测定样品中TRIM21水平的试剂直接或间接被可检测标签标记。

21.如权利要求20所述的用途，其中，所述可检测标签标记选自：放射性同位素、荧光基团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子或配体。

22.如权利要求1所述的用途，其中，所述TRIM21水平包括其核酸分子水平和/或其蛋白质分子水平。