JP2014003917A - サトウキビ花成制御技術 - Google Patents

Abstract

【課題】植物、特にサトウキビ及びその近縁属種、の効率的な交配育種を可能とする技術を提供する。
【解決手段】（ａ）特定の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）特定の塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列からなり、かつ成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有するＤＮＡ、（ｃ）特定の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有するＤＮＡ、（ｄ）特定の塩基配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有するＤＮＡ、から選択されるいずれか１つのＤＮＡ。
【選択図】なし

Description

本発明は、成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有する遺伝子発現制御ＤＮＡと花成誘導遺伝子とを含む、植物の花成若しくは出穂を促進する機能、及び／又は、植物の分げつを促進する機能を有するＤＮＡ、並びにその利用に関する。

サトウキビはブラジル、インドなど約２０００万ｈａで生産され、製糖用・エタノール生産用に利用される資源作物であり、今後バイオ燃料の普及により継続した需要拡大が見込まれ、その増産が期待されている。

原料作物であるサトウキビの安価かつ安定な供給を目的として、サトウキビの品種改良及び育種が盛んに行われている。従来的に、サトウキビの品種改良及び育種は交配により行われている（非特許文献１）。

しかしながら、サトウキビは熱帯地方を起源とする植物であることから、国土のほとんどが温帯に属する日本国内では出穂・開花が不可能であることに加え、ゲノム構成が複雑であることから、効果的な品種改良及び育種は非常に困難であった。

また、従来の交配育種は、経験や勘に頼った組み合わせで交配し、多数の後代を網羅的に評価して選抜を行っていた。一般に、交配を行うためには、花成誘導、開花・受粉、結実促進・採種のプロセスを経る必要があり、サトウキビの場合、生育適地においてでさえ、１年に１回しかこのプロセスを組むことはできない。そのため、一つの品種を開発するために非常に長い時間を必要としていた。

さらに、交配したい品種が開花しにくい品種である場合や、交配したい品種同志の開花時期が合わない場合には、所望する交配を行うことは非常に困難であった。
そのため、当該分野においては、サトウキビの効率的な交配育種方法が切望されていた。

これまでに、シロイヌナズナやイネにおいて、ＦＴ遺伝子又はＯｓＨｄ３ａ遺伝子といった花成誘導遺伝子を過剰発現させることにより、花成（出穂）を誘導できたことが報告されている（特許文献１−３、非特許文献２−３）。また今日、ＦＴ遺伝子又はＯｓＨｄ３ａ遺伝子が多くの植物種で、同様の効果を発揮することが確認されている。
しかしながら、サトウキビにおいて、これら遺伝子を過剰発現させた組換え体の報告はない。

特開２０００−１３９２５０号公報 特表２００２−５１１２７０号公報 特開２００２−１５３２８３号公報

宮里清松、サトウキビとその栽培、１９８６年、日本分蜜糖工業会発行 Ｋａｒｄａｉｌｓｋｙ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９ Ｄｅｃ ３；２８６（５４４６）：１９６２−５． Ｋｏｊｉｍａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００２ Ｏｃｔ；４３（１０）：１０９６−１０５．

本発明は、植物、特にサトウキビ及びその近縁属種、の効率的な交配育種を可能とする技術の提供を目的とする。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行なったところ、成葉特異的に遺伝子発現を促進する活性を有する遺伝子発現制御ＤＮＡの制御下において、花成誘導遺伝子を発現させることによって、植物体に花成（出穂）を促すことができ、交配可能な植物体を効率的に得ることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下［１］〜［５］の特徴を包含する。
［１］ 以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に表される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列からなり、かつ成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１に表わされる塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有するＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１に表される塩基配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有するＤＮＡ、
から選択されるいずれか１つのＤＮＡと、以下の(ｅ)〜（ｇ）：
（ｅ）配列番号７に表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｆ）配列番号７に表されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ花成若しくは出穂を促進する活性を有するポリペプチド、
（ｇ）配列番号７に表わされるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ花成若しくは出穂を促進する活性を有するポリペプチド、
から選択されるいずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡとを含み、植物の花成若しくは出穂を促進する機能、及び／又は、植物の分げつを促進する機能を有するＤＮＡ。
［２］ ［１］のＤＮＡを含む、組換えベクター。
［３］ ［１］のＤＮＡ又は［２］の組換えベクターが導入されている、形質転換植物体。
［４］ イネ科に属する、［３］の形質転換植物体。
［５］ サトウキビ属、ソルガム属又はミスカンサス属に属する、［４］の形質転換植物体。

本発明によれば、植物、特にサトウキビ及びその近縁属種、の効率的な交配育種を可能とする技術を提供することができる。

図１は、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍに由来するｅｃｃ０００２ ＥＳＴの塩基配列（配列番号４）を示す（ＤＦＣＩ Ｓｕｇａｒｃａｎｅ Ｇｅｎｅ Ｉｎｄｅｘで検索）。 図２は、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ． ｃｖ． ＮｉＦ８の各組織におけるｅｃｃ０００２ ＥＳＴの発現量の解析結果を示す。最も発現の強い成葉の発現量を１００％として示す。 図３は、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列及び３’末端にＢｌｎＩ制限酵素認識配列を導入したｅｃｃ０００２遺伝子の遺伝子発現制御領域の塩基配列（配列番号５）を示す。 図４は、（Ａ）Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｊａｐｏｎｉｃａ Ｇｒｏｕｐに由来するＨｄ３ａ遺伝子の塩基配列（ＣＤＳ：１５３−６９２）（配列番号６）及び（Ｂ）当該遺伝子にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。 図５は、ｅｃｃ０００２遺伝子の遺伝子発現制御領域とβ−グルクロニダーゼ遺伝子を連結して含む遺伝子発現ベクターの模式図を示す。 図６は、β−グルクロニダーゼ遺伝子の発現をｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御ＤＮＡによって制御する遺伝子組換えサトウキビの各組織におけるＧＵＳ遺伝子の発現量の解析結果を示す。最も強い発現量が観察された当該遺伝子組換えサトウキビの成葉の発現量を１００％として示す。 図７は、遺伝子発現ベクターに挿入したｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御ＤＮＡとイネＨｄ３ａ遺伝子とを含むＤＮＡの塩基配列（配列番号３）を示す。大文字：ｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御ＤＮＡ；小文字：イネＨｄ３ａ遺伝子。 図８は、ｅｃｃ０００２遺伝子の遺伝子発現制御領域とイネＨｄ３ａ遺伝子を連結して含む遺伝子発現ベクターの模式図を示す。 図９は、イネＨｄ３ａ遺伝子をｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御ＤＮＡによって制御する遺伝子組換えサトウキビ、イネＨｄ３ａ遺伝子の発現をＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーターによって制御する遺伝子組換えサトウキビおよび野生型サトウキビの各組織におけるイネＨｄ３ａ遺伝子の発現量の解析結果を示す。表中、「遺伝子組換え体 ｅｃｃ０００２ ｐｒｏ．」とは、イネＨｄ３ａ遺伝子の発現をｅｃｃ０００２遺伝子の遺伝子発現制御領域によって制御する遺伝子組換えサトウキビを示す。また、「遺伝子組換え体 ３５ＳＣａＭＶ ｐｒｏ．」とは、イネＨｄ３ａ遺伝子の発現をＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーターによって制御する遺伝子組換えサトウキビを示す。 図１０は、イネＨｄ３ａ遺伝子をｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御ＤＮＡによって制御する遺伝子組換えサトウキビの分げつ誘導能の解析結果を示す。分げつ数は遺伝子組換えサトウキビ（ｎ＝５）及び野生型（ｎ＝３）の平均値。 図１１は、イネＨｄ３ａ遺伝子をｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御ＤＮＡによって制御する遺伝子組換えサトウキビの出穂誘導能の解析結果を示す。出穂数は遺伝子組換えサトウキビ（ｎ＝５）及び野生型（ｎ＝３）の平均値。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明に係る植物の花成若しくは出穂を促進する機能、及び／又は、植物の分げつを促進する機能を有するＤＮＡは、成葉特異的に遺伝子発現を促進する活性を有する遺伝子発現制御ＤＮＡと花成誘導遺伝子と含む。

本発明において、「植物の花成若しくは出穂を促進する」とは、当該機能を有するＤＮＡが導入された植物体において、花芽や花器官の分化・形成を促進する、並びに／或いは、出穂及び／又は開花を促進する（出穂及び／又は開花までの時期を短縮する）ことを意味する。

また、本発明において、「植物の分げつを促進する」とは、当該機能を有するＤＮＡが導入された植物体において、根元付近からの側枝の形成を促進する、当該側枝の形成開始時期を短縮する、並びに／或いは、当該側枝の数を増大させることを意味する。

先ず、成葉特異的に遺伝子発現を促進する活性を有する遺伝子発現制御ＤＮＡについて説明する。なお、以下「成葉特異的に遺伝子発現を促進する活性を有する遺伝子発現制御ＤＮＡ」を「遺伝子発現制御ＤＮＡ」と記載するが、本明細書においてこれらの用語は相互互換的に使用される。

本発明に係る遺伝子発現制御ＤＮＡは、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含む。
（ａ）配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に表される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列からなり、かつ成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１に表わされる塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有するＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１に表される塩基配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有するＤＮＡ。

本発明に係る遺伝子発現制御ＤＮＡは、サトウキビの各組織（例えば、茎、成葉、幼葉）に由来する総ＲＮＡ又はそれに由来するｃＤＮＡを利用した遺伝子発現解析により、成葉特異的に発現している候補遺伝子を取得し、当該候補遺伝子について発現特性を評価し、これにより成葉特異的に発現していると評価された遺伝子を特定し、特定した遺伝子のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡをもとに当該候補遺伝子の５’上流領域の塩基配列を同定することによって取得することができる。ここで遺伝子発現解析は、ＤＮＡチップ、ディファレンシャルディスプレイ法など、当業者に公知である遺伝子発現の網羅的な解析手法を利用することができる。

具体的に、配列番号１の塩基配列は、サトウキビの成葉において、特異的に発現している遺伝子（以下、「ｅｃｃ０００２」と記載する）の５’上流領域に存在する。本明細書において「サトウキビ」には、サトウキビ属に属する植物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｉｎｅｎｓｅ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｂａｒｂｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｒｏｂｕｓｔｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｅｄｕｌｅ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ． ｈｙｂｒｉｄｓ ｃｖ． ＮｉＦ８など（特にこれらに限定されない）、及びその近縁属種、例えば、ソルガム等が含まれる。好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ． ｈｙｂｒｉｄｓ ｃｖ． ＮｉＦ８である。

５’上流領域のＤＮＡを単離する方法は特に限定されず、当業者に公知の一般的な手法を用いて行うことができる。例えば、上記ｅｃｃ０００２遺伝子の塩基配列（配列番号４）に基づいて、未知の領域（この場合、５’上流領域）をクローニングする公知方法を用いて単離することができる。例えば、その一つとして、ｅｃｃ０００２遺伝子の５’上流領域を含むゲノムＤＮＡを制限酵素処理をして所定の塩基配列からなるアダプターを結合させ、ｅｃｃ０００２遺伝子の塩基配列とアダプターにプライマーを設定してＰＣＲを行う。これにより、ｅｃｃ０００２遺伝子の塩基配列に５’上流で隣接する未知の塩基配列を増幅することができる。そして増幅した塩基配列の配列決定を行った後、決定した塩基配列に基づいて、さらに一対のプライマーを設計し、決定した塩基配列に隣接するさらなる未知の塩基配列を同様にして増幅することができる。当該方法においては、市販のクローニングキット、例えば、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ（登録商標）キット（ベックス）を用いて行うことができる。また、上記以外の方法としては、インバースＰＣＲによる方法が挙げられる。この場合、ｅｃｃ０００２遺伝子の塩基配列情報に基づいて一対のプライマーを設計し、これら一対のプライマーと、所定の制限酵素で処理した後にセルフライゲーションさせたゲノムＤＮＡ断片とを用いてＰＣＲを行うことによって、ｅｃｃ０００２遺伝子の上流領域を増幅することができる。さらに別の方法として、ｅｃｃ０００２遺伝子の上流領域をゲノムＤＮＡライブラリーから単離する方法が挙げられる。この場合には、ｅｃｃ０００２遺伝子を含むｃＤＮＡをプローブとして、定法に従って調製したゲノムＤＮＡライブラリーからｅｃｃ０００２遺伝子を含むゲノムＤＮＡをスクリーニングする。その後、スクリーニングしたゲノムＤＮＡの塩基配列を決定することによってｅｃｃ０００２遺伝子の上流領域に存在する５’上流領域を特定することができ、さらに、５’上流領域のみをＰＣＲ等によって増幅することができる。

このように、ｅｃｃ０００２遺伝子の上流に位置する未知の塩基配列を順次増幅又はスクリーニングし、定法に従って塩基配列を決定することによって、配列番号１で表される塩基配列を得ることができる。一旦、配列番号１で表される塩基配列が決定されると、その後は、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、サトウキビから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、配列番号１に表される塩基配列を得ることができる。

配列番号１に表される塩基配列は、成葉において特異的に遺伝子発現を誘導する遺伝子発現制御領域として機能する。遺伝子発現制御領域には、プロモーター領域、エンハンサー領域、ＴＡＴＡボックス及び／又はＣＡＴボックスなど（特にこれらに限定されない）、遺伝子の転写調節に関与する塩基配列が含まれる。

本明細書において「特異的」とは、植物体を構成する各種組織のなかで成葉においてのみ遺伝子発現誘導機能を有することに加えて、成葉における遺伝子発現誘導機能が成葉以外の組織（例えば、幼葉、茎ずい、茎皮、根、メリステムなど）における遺伝子発現誘導機能と比較して顕著に高いこと、又は統計的に有意に高いこと（例えば、およそ２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又はそれ以上）を意味する。

本明細書において「成葉」とは、光合成を行うために葉緑体を細胞内に蓄積し、緑色を帯びた葉を意味し、光合成のための葉緑体を有さない葉である幼葉以外の葉組織を意味する。

遺伝子発現誘導機能は、当業者に公知であるレポーターアッセイ等によって確認することができる。レポーターアッセイは、種々のレポーター遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）、グリーンフルオレッセントプロテイン遺伝子（ＧＦＰ）等）を遺伝子発現誘導機能を検討する塩基配列の制御下（下流域）に連結したベクターを作製し、当該ベクターを用いて宿主のゲノムに導入又は一過的に導入した後、当該レポーター遺伝子の発現レベルを測定することにより確認することができる。当該レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子（以下、ＬＵＣ）、β−グルクロニダーゼ（以下、ＧＵＳ）遺伝子、及びグリーンフルオレッセントプロテイン（以下、ＧＦＰ）遺伝子等を挙げることができる。

レポーター遺伝子の発現レベルは、当該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、当該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。各レポーター遺伝子の発現レベルは以下の手法で測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、当該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出する。ＬＵＣ遺伝子である場合には、当該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出する。ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出する。例えば、レポーター遺伝子がＧＵＳの場合には、宿主細胞内でのプロモーター活性は、（ｉ）ヒストケミカルなＧＵＳ染色による方法（ＥＭＢＯ Ｊ． ６， ３９０１−３９０７ （１９８７））により、及び／又は（ｉｉ）蛍光基質を用いるＣａｓｔｌｅ ＆ Ｍｏｒｒｉｓの方法（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｂ５， １−１６ （１９９４）； Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ ＆ Ｒ．Ａ．Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に従ってＧＵＳ活性を測定し、さらにＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２， ２４８−２５４（１９７６））に従ってタンパク質量を測定して、ＧＵＳ活性をタンパク量当たりに換算する（ｎｍｏｌｅ ４−ＭＵ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎとして算出する）ことにより、それぞれ確認することができる。

また、上記以外の遺伝子をレポーターとして使用する場合には、当該遺伝子の転写レベルをノーザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ技術などを用いて測定することによって、又は当該遺伝子にコードされるタンパク質の発現量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法、ウェスタンブロッティング法などを用いて測定することによって行うことができる。

本発明に係る遺伝子発現制御ＤＮＡは、配列番号１に表される塩基配列からなるものに限定されず、上記（ｂ）に記載したように、成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有する限り、配列番号１に表される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であってもよい。

例えば、配列番号１に表される塩基配列において、１〜１００個の塩基、好ましくは１〜５０個の塩基、より好ましくは１〜１０個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であっても、成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を示す限り本発明に係る遺伝子発現制御ＤＮＡに含まれる。

また、本発明に係る遺伝子発現制御ＤＮＡは、配列番号１に表される塩基配列からなるものに限定されず、上記（ｃ）に記載したように、成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を示す限り、配列番号１に表わされる塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であってもよい。塩基配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。

さらに、本発明に係る遺伝子発現制御ＤＮＡは、配列番号１に表される塩基配列からなるものに限定されず、上記（ｄ）に記載したように、成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を示す限り、配列番号１で表される塩基配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であってもよい。

本発明において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、２〜６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）及び０．１〜０．５％ＳＤＳを含有する溶液中４２〜５５℃にてハイブリダイズを行い、０．１〜０．２×ＳＳＣ及び０．１〜０．５％ＳＤＳを含有する溶液中５５〜６５℃にて洗浄を行う条件をいう。

さらに、本発明に係る遺伝子発現制御ＤＮＡは、成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を示す限り、配列番号１に表わされる塩基配列において５’末端及び／又は３’末端より、連続する１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１１００個、１２００個、１３００個、１４００個、１５００個、又はそれ以上の塩基が欠失されたＤＮＡ断片であってもよい。塩基の欠失は当業者に公知の一般的な手法（例えば、ＰＣＲ法、制限酵素処理など）によって行うことができる。当該ＤＮＡ断片は、本発明に係る遺伝子発現制御ＤＮＡにおけるプロモーター領域であっても良い。所定の遺伝子発現制御ＤＮＡにおけるプロモーター領域は当業者に公知のプロモーター解析ツール（例えば、ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｐｒｏｓｃａｎ／）；Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ， Ｄ．Ｓ． （１９９５）． Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｐｏｌ ＩＩ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４９： ９２３−３２）を使用して検索することができる。このような配列番号１に表わされる塩基配列の断片として、配列番号１の８６９〜１１１９番目の塩基からなるＤＮＡが挙げられる。得られた当該断片は、上記レポーターアッセイ等によって、その遺伝子発現誘導機能について確認することができる。

一旦、本発明に係る遺伝子発現制御ＤＮＡの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、或いは当該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明に係る遺伝子発現制御ＤＮＡを得ることができる。さらに、部位特定変異誘発等によって、変異を有する配列番号１に表される塩基配列を合成することもできる。なお、配列番号１に表される塩基配列に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、或いは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。

次に、花成誘導遺伝子について説明する。
本明細書において「花成誘導遺伝子」とは、植物の花成又は出穂を促進する活性を有するタンパク質をコードしており、植物における花成又は出穂に関与する遺伝子を意味する。

花成誘導遺伝子は公知であり、シロイヌナズナやイネにおいて、ＦＴ遺伝子、ＯｓＨｄ３ａ遺伝子などとして既に同定されており（特開２０００−１３９２５０号公報、特表２００２−５１１２７０号公報、特開２００２−１５３２８３号公報、Ｋａｒｄａｉｌｓｋｙ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，上掲、Ｋｏｊｉｍａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，上掲）、本発明においてはこれらを利用することができる。花成誘導遺伝子は公開されたデータベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）より検索可能であり、例えば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｊａｐｏｎｉｃａ Ｇｒｏｕｐに由来するＨｄ３ａ遺伝子の塩基配列（図４、配列番号６）及びアミノ酸配列（図４、配列番号７）はＧｅｎＢａｎｋにＡＢ０５２９４４．１として登録されている。

花成誘導遺伝子は、分子生物学の分野において周知であるクローニング方法により取得することができる。例えば、公知の遺伝子配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＡＢ０５２９４４．１として登録されている）に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて、植物由来のゲノムライブラリ又はｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる。配列情報未知の植物に由来する遺伝子は、配列が既知の植物の遺伝子情報を利用して設計されたプローブ又はプライマーを用いて、当該植物に由来するゲノムライブラリ又はｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような標準的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、形質転換（遺伝子導入）に適した量の遺伝子（ＤＮＡ）を得ることができる。

好ましくは、花成誘導遺伝子は以下の(ｅ)〜（ｇ）から選択されるいずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡを含む：
（ｅ）配列番号７に表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｆ）配列番号７に表されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ花成若しくは出穂を促進する活性を有するポリペプチド、
（ｇ）配列番号７に表わされるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ花成若しくは出穂を促進する活性を有するポリペプチド。

配列番号７に表されるアミノ酸配列は、イネ由来のＨｄ３ａタンパク質のアミノ酸配列を示す。

本発明において花成誘導遺伝子にコードされるポリペプチドは、配列番号７に表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されず、上記（ｆ）に記載したように、配列番号７に表されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ花成若しくは出穂を促進する活性を有するポリペプチドであってもよい。

例えば、配列番号７に表されるアミノ酸配列において、１〜２０個の塩基、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列であっても、花成を促進する活性を有する限り、本発明において利用することができる。

また、本発明において花成誘導遺伝子にコードされるポリペプチドは、配列番号７に表されるアミノ酸配列からなるものに限定されず、上記（ｇ）に記載したように、花成を促進する活性を有する限り、配列番号７に表わされるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。塩基配列の比較は、上記の通り、例えば、ＢＬＡＳＴ等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。

このような花成誘導遺伝子としては、配列番号２に表される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。当該配列番号２に表される塩基配列からなるＤＮＡは、イネ由来のＨｄ３ａタンパク質をコードする。

また、本発明に係る花成誘導遺伝子としては、配列番号２に表される塩基配列からなるものに限定されず、花成若しくは出穂を促進する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号２に表される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を利用することができる。

例えば、配列番号２に表される塩基配列において、１〜５０個の塩基、より好ましくは１〜１０個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列であっても、花成を促進する活性を有するタンパク質をコードする限り、本発明において利用することができる。

さらに、本発明に係る花成誘導遺伝子としては、配列番号２に表される塩基配列からなるものに限定されず、花成若しくは出穂を促進する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号２に表わされる塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であってもよい。塩基配列の比較は、上記の通り、例えば、ＢＬＡＳＴ等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。

またさらに、本発明に係る花成誘導遺伝子としては、配列番号２に表される塩基配列からなるものに限定されず、花成若しくは出穂を促進する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号２で表される塩基配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であってもよい。
「ストリンジェントな条件」とは、上記したとおりである。

続いて、上述した遺伝子発現制御ＤＮＡと花成誘導遺伝子とを用いた組換えベクターについて説明する。

本発明の組換えベクターは、上述した遺伝子発現制御ＤＮＡに花成誘導遺伝子を機能しうるかたちで連結したＤＮＡを適当なベクターに導入することにより構築することができる。本明細書において、「機能しうるかたちで連結した」、「機能しうるかたちで連結された」とは、当該ベクターが導入された宿主細胞内において、当該遺伝子発現制御ＤＮＡの制御の下、花成誘導遺伝子が正確に発現されるように、遺伝子発現制御ＤＮＡと花成誘導遺伝子とを連結して含むことを意味する。ここで「連結」は直接連結されても良いし、適当な長さ及び配列のスペーサーを介して間接的に連結されても良い。好ましくは、配列番号１に表わされる塩基配列の３’末端に存在する「ＡＴＧ」を、花成誘導遺伝子においてファーストメチオニンをコードする「ＡＴＧ」として利用する形で連結する。このようなＤＮＡとしては、配列番号１に表わされる塩基配列の３’末端に存在する「ＡＴＧ」を、配列番号２の５’末端に存在する「ＡＴＧ」として利用する形で連結された、配列番号３に表される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。

本発明に用いるベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物に機能性遺伝子を導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＢＩＩ系、ｐＰＺＰ系（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ Ｐ，Ｓｖａｂ Ｚ，Ｍａｌｉｇａ Ｐ．：Ｔｈｅ ｓｍａｌｌ，ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐＰＺＰ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２５：９８９−９４，１９９４）、ｐＣＡＭＢＩＡ系（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｍｂｉａ．ｏｒｇ／ｍａｉｎ／ｒ＿ｅｔ＿ｃａｍｖｅｃ．ｈｔｍ）、ｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられる。特にｐＢＩＩ系及びｐＢＩ系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、ｐＢＩＩ２２１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＩＧ１２１などが挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを植物核ＤＮＡに組み込むことが可能である（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１０（３），６９７−７０４（１９９１））。一方、ｐＵＣ系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９などが挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）などの植物ウイルスベクターも用いることができる。

連結及び／又はベクターへの挿入を容易にするべく、上述した遺伝子発現制御ＤＮＡ及び／又は花成誘導遺伝子には制限酵素認識配列を適宜、置換、挿入又は付加することができる。ベクターへの挿入に際しては、まず、上述した遺伝子発現制御ＤＮＡ及び花成誘導遺伝子を含む精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素認識部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができる。

ベクターにはさらに、必要に応じて、遺伝子発現制御ＤＮＡ及び／又は花成誘導遺伝子の上流、内部、或いは下流に、エンハンサー、イントロン、ポリＡ付加シグナル、５’−ＵＴＲ配列、選択マーカー遺伝子などを連結することができる。

エンハンサーとしては、例えば、花成誘導遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域などが挙げられる。

ターミネーターとしては、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のターミネーターなどが挙げられる。

選択マーカー遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、アセト乳酸合成酵素（Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子などが挙げられる。選択マーカー遺伝子は、上述のように花成誘導遺伝子とともに同一のプラスミドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、或いは、選択マーカー遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターと、花成誘導遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合は、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。
このように作製された組換えベクターを用いて形質転換体を作製することができる。

形質転換植物体を調製する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、及び植物体そのものを用いる場合（ｉｎ ｐｌａｎｔａ法）がある。プロトプラストを用いる場合は、Ｔｉプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルスに感染させる等により行うことができる。また種子或いは植物体を用いるｉｎ ｐｌａｎｔａ法を適用する場合、すなわち植物ホルモン添加の組織培養を介さない系では、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物などへのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。

上記遺伝子発現制御ＤＮＡと花成誘導遺伝子とを含むＤＮＡが植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法等により行うことができる。例えば、形質転換植物体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。

本発明において形質転換に用いられる植物としては、例えば、イネ科、ナス科、アブラナ科、マメ科、バラ科、キク科、ユリ科、セリ科、ナデシコ科、ウリ科、ヒルガオ科、アカザ科などに属する植物が挙げられるが、特にこれらの植物に限定されない。好ましくは、イネ科の植物、例えば、サトウキビ、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、シバ、ソルガム、アワ、ヒエ、ネピアグラス及びスイッチグラスなどの植物が挙げられる。

本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂（植物の芽の先端の生長点）、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、それを酵素処置して細胞壁を除いたプロプラスト等の植物培養細胞が挙げられる。またｉｎ ｐｌａｎｔａ法適用の場合、吸水種子や植物体全体を利用し得る。

また、本発明において形質転換植物体とは、植物体全体、植物器官（例えば根、茎、葉、花弁、種子、種子、実等）植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）、植物培養細胞のいずれをも意味するものである。

植物培養細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換植物体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、以下のように行うことができる。

まず、形質転換の対象とする植物材料して植物組織又はプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。

カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシンやサイトカイニン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、更に完全な植物体へと育成させる。或いは、完全な植物体になる前の状態（例えばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞及び組織等）で貯蔵等を行ってもよい。

本発明において「形質転換植物体」には、形質転換を施した再分化当代である「Ｔ１世代」のほか、その植物の種子から得られた後代である「Ｔ２世代」、薬剤選抜或いはサザン法等による解析によりトランスジェニックであることが判明した「Ｔ２世代」植物の花を自家受粉して得られる次世代（Ｔ３世代）などの後代植物をも含む。

このようにして作出された形質転換植物体は、導入された花成誘導遺伝子を成葉特異的に発現する。

本発明に係る形質転換植物体においては、花成又は出穂が促進され、野生型と比較して早期に、花芽や花器官の分化・形成、並びに／或いは、出穂及び／又は開花を生じる。すなわち、本発明に係る形質転換植物体は、野生型と比較して、播種されてから出穂及び／又は開花までの期間が短い。

また、本発明に係る形質転換植物体においては、分げつが促進され、野生型と比較して、早期に分げつを生じる、及び／又は、分げつ数の増大を生じる。

本発明に係る成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有する遺伝子発現制御ＤＮＡと花成誘導遺伝子とを含むＤＮＡは、植物、特にサトウキビ及びサトウキビ近縁属種、の出穂を促進する機能、及び／又は、分げつを促進する機能を有する。本発明に係る当該ＤＮＡは、出穂しない品種においても出穂を誘導することができる、出穂時期を早めることができる、分げつ時期を早めることができる、及び／又は分げつ数を増大させることができる。これらの特徴から、本発明に係る当該ＤＮＡを導入された形質転換植物体においては、出穂可能な分げつ数、すなわち有効分げつ数を増加させることができ、系統による出穂時期及び出穂能力に左右されることなく、効率的に系統間交配を行うことができる。また、本発明に係る当該ＤＮＡを導入された形質転換植物体の世代時間は、野生型と比べて１/２〜１/５、好ましくは１/３と短く、交配育種の効率を高めることができる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕成葉特異的遺伝子のクローニング
サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．ｃｖ．ＮｉＦ８）の成葉、幼葉及び茎の各組織からＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて総ＲＮＡを抽出精製し、定法に従ってｃＤＮＡライブラリーを構築して遺伝子発現解析に用いた。遺伝子発現解析は、Ｓｕｇａｒｃａｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ）を利用して、製造元の指示書に従って行った。

遺伝子発現解析の結果、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．ｃｖ．ＮｉＦ８の成葉において特に発現量の高い遺伝子を見出し、当該遺伝子を「ｅｃｃ０００２」とした。なお、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．ｃｖ．ＮｉＦ８に由来するｅｃｃ０００２遺伝子の塩基配列は、図１に示すＳａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍに由来するｅｃｃ０００２ ＥＳＴの塩基配列に一致する。Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．ｃｖ．ＮｉＦ８の成葉、幼葉、茎ずい、茎皮、根及びメリステムから総ＲＮＡを抽出精製し、定法に従ってｃＤＮＡを作製し、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオシステムズ）を使用したＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法によって各組織におけるｅｃｃ０００２遺伝子の発現量を解析した。

結果を図２に示す（最も発現の強い成葉の発現量を１００％として示す）。この結果より、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．ｃｖ．ＮｉＦ８においてｅｃｃ０００２遺伝子が成葉において、強く遺伝子発現が誘導されていることが明らかとなった。

〔実施例２〕成葉特異的プロモーターの取得
サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．ｃｖ．ＮｉＦ８）の成葉組織（０．５ｇ）から、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを約３００ｎｇ抽出精製した。実施例１で得たｅｃｃ０００２遺伝子の塩基配列をベースに、ＲｉｇｈｔＷａｌｌｋ（登録商標）Ｋｉｔ（ＢＥＸ）を用いて、上記ゲノムＤＮＡよりｅｃｃ０００２遺伝子の５’上流に存在する遺伝子発現制御領域を得た。取得した遺伝子発現制御領域の５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列（ＡＡＧＣＴＴ）を、３’末端に存在するｅｃｃ０００２遺伝子の翻訳開始点（ＡＴＧ）の３’側にＢｌｎＩ制限酵素認識配列（ＣＣＴＡＧＧ）をリンカー配列として、それぞれ導入してｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御領域をコードするＤＮＡとして調製した（図３）（配列番号５）。

上記ＤＮＡの配列について、公知のプロモーター解析ツール（ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｐｒｏｓｃａｎ／）を利用して解析した結果、配列番号５における８７５〜１１２５番目の塩基領域にプロモーターとして機能する領域が推定された。

〔実施例３〕β−グルクロニダーゼ遺伝子発現ベクターの構築
実施例２で得た遺伝子発現制御領域をコードするＤＮＡを、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子をコードするＵｉｄＡｃＤＮＡと連結して含む、遺伝子発現ベクターを構築した。当該遺伝子発現ベクターには、植物形質転換用ベクター（ｐＢＩＩ２２１）を用いた。遺伝子発現制御領域をコードするＤＮＡとＵｉｄＡｃＤＮＡとの連結に際しては、ＵｉｄＡｃＤＮＡの５’末端側に存在するファーストメチオニンをコードするＡＴＧ配列と遺伝子発現制御領域をコードするＤＮＡの３’末端側に存在するｅｃｃ０００２遺伝子のファーストメチオニンをコードするＡＴＧ配列を一致させて連結した（翻訳融合型）。当該遺伝子発現ベクターの模式図を図５に示す。

〔実施例４〕ＧＵＳ発現遺伝子組換え植物の作出
実施例３で作製した遺伝子発現ベクターを、アグロバクテリウム法を用いて宿主植物体（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．ｃｖ．ＮｉＦ８）に導入し、ＧＵＳ遺伝子の発現をｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御ＤＮＡによって制御する遺伝子組換えサトウキビを作出した。

当該遺伝子組換えサトウキビの成葉、幼葉、茎ずい、茎皮、根及びメリステムから総ＲＮＡを抽出精製し、定法に従ってｃＤＮＡを作製し、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオシステムズ）を使用したＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法によって各組織におけるＧＵＳ遺伝子の発現量を解析した。

比較として、非遺伝子組換えサトウキビのメリステム（対照）、並びにＧＵＳ遺伝子の発現をカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ プロモーターによって制御する遺伝子組換えサトウキビに由来する成葉及び幼葉における、ＧＵＳ遺伝子の発現量を上記と同様に解析した。

結果を図６に示す。各組織の発現量は、解析した組織の中で最も高い発現を示した、ＧＵＳ遺伝子の発現をｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御ＤＮＡによって制御する遺伝子組換えサトウキビの成葉におけるＧＵＳ遺伝子の発現量を１００％とする相対値で示した。

この結果より、ｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御ＤＮＡが成葉において、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって制御するＧＵＳ遺伝子の発現量と比較して約１７倍と、特異的に遺伝子発現を誘導できることが明らかとなった。

〔実施例５〕イネＨｄ３ａ遺伝子発現ベクターの構築
実施例２で得た遺伝子発現制御領域をコードするＤＮＡを、イネＨｄ３ａをコードするｃＤＮＡ（「Ｈｄ３ａｃＤＮＡ」と記載）と連結して含む、遺伝子発現ベクターを構築した。当該遺伝子発現ベクターには、植物形質転換用ベクター（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）を用いた。遺伝子発現制御領域をコードするＤＮＡとＨｄ３ａｃＤＮＡとの連結に際しては、Ｈｄ３ａｃＤＮＡの５’末端側に存在するファーストメチオニンをコードするＡＴＧ配列と遺伝子発現制御領域をコードするＤＮＡの３’末端側に存在するｅｃｃ０００２遺伝子のファーストメチオニンをコードするＡＴＧ配列を一致させて連結した（翻訳融合型）。連結した遺伝子発現制御領域をコードするＤＮＡとＨｄ３ａｃＤＮＡの配列（配列番号３）を図７に示す。また、当該遺伝子発現ベクターの模式図を図８に示す。

〔実施例６〕イネＨｄ３ａ発現遺伝子組換え植物の作出
実施例５で作製した遺伝子発現ベクターを、アグロバクテリウム法を用いて宿主植物体（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．ｃｖ．ＮｉＦ８）に導入し、イネＨｄ３ａ遺伝子の発現をｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御ＤＮＡによって制御する遺伝子組換えサトウキビを作出した。

比較として、野生型、及びイネＨｄ３ａ遺伝子の発現をＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーターによって制御する遺伝子組換えサトウキビを作出し、使用した。

各遺伝子組換えサトウキビのカルス、再分化組織及び成葉から総ＲＮＡを抽出精製し、定法に従ってｃＤＮＡを作製し、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオシステムズ）を使用したＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法によって各組織におけるイネＨｄ３ａ遺伝子の発現量を解析した。なお、「再分化組織」とは、カルスに再分化を誘導して得られた組織であって、完全に再生した植物の組織又は器官を示すものではない。内部標準としてアクチン遺伝子の発現量を同様に解析した。

結果を図９に示す。
イネＨｄ３ａ遺伝子の発現をｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御ＤＮＡによって制御する遺伝子組換えサトウキビの各系統において、導入されたイネＨｄ３ａ遺伝子は再分化後の成葉組織において特異的に発現していた。

なお、イネＨｄ３ａ遺伝子の発現をＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーターによって制御する遺伝子組換えサトウキビについては、組換えカルスを再分化させるための再分化培地に置床したところ、２週間程度でカルスが褐変色をおび、その後全ての組換えカルスが枯死した。Ｈｄ３ａ遺伝子はイネやシロイヌナズナなどの他の植物と異なり、サトウキビの再分化段階において致死的影響を及ぼすことが示された。

〔実施例７〕イネＨｄ３ａ発現遺伝子組換え植物における出穂及び分げつの誘導能
上記実施例６において作製したイネＨｄ３ａ発現遺伝子組換え体における、出穂及び分げつの誘導能について調べた。

結果を図１０及び１１に示す。
イネＨｄ３ａ発現遺伝子組換え体においては、腋芽苗を播種してから約２０日程度の生育初期段階から分げつが確認され（図１０）、そして腋芽苗を播種してから約２ヵ月後には出穂が確認された（図１１）。

一方、野生株においては、腋芽苗を播種してから分げつが確認されるまでの期間は、イネＨｄ３ａ発現遺伝子組換え体よりも長く（図１０）、また、腋芽苗を播種してから３ヶ月を経ても出穂はみられなかった（図１１）。

これらの結果より、イネＨｄ３ａ遺伝子の発現をｅｃｃ０００２遺伝子の発現制御ＤＮＡによって制御する遺伝子組換えサトウキビは、分げつ及び出穂の高い誘導能を持ち、また分げつ茎からのさらなる出穂を可能としており、それによって数ヶ月間の長期にわたって出穂茎を維持できることが確認された。

本発明により、植物、特にサトウキビ及びサトウキビ近縁属種、において出穂を促進、及び／又は、分げつを促進することができる。これによって、系統による出穂時期及び出穂の能力に左右されることなく、効率的に系統間交配を行うことができ、また、植物の世代時間を短縮することができるために、交配育種の効率を顕著に高めることができる。本発明は、植物、特にサトウキビ及びサトウキビ近縁属種、の交配育種において大いに貢献することが期待される。

Claims (5)

1. 以下の（ａ）〜（ｄ）：
   （ａ）配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ、
   （ｂ）配列番号１に表される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列からなり、かつ成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有するＤＮＡ、
   （ｃ）配列番号１に表わされる塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有するＤＮＡ、
   （ｄ）配列番号１に表される塩基配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有するＤＮＡ、
   から選択されるいずれか１つのＤＮＡと、以下の(ｅ)〜（ｇ）：
   （ｅ）配列番号７に表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （ｆ）配列番号７に表されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ花成若しくは出穂を促進する活性を有するポリペプチド、
   （ｇ）配列番号７に表わされるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ花成若しくは出穂を促進する活性を有するポリペプチド、
   から選択されるいずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡとを含み、植物の花成若しくは出穂を促進する機能、及び／又は、植物の分げつを促進する機能を有するＤＮＡ。
2. 請求項１に記載のＤＮＡを含む、組換えベクター。
3. 請求項１に記載のＤＮＡ又は請求項２に記載の組換えベクターが導入されている、形質転換植物体。
4. イネ科に属する、請求項３に記載の形質転換植物体。
5. サトウキビ属、ソルガム属又はミスカンサス属に属する、請求項４に記載の形質転換植物体。

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