JP2013520158A - タンパク質生産の増強のためのmRNAの一次構造の再操作 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、35U.S.C.§119(e)の下に、タイトル“Reengineering mRNA Primary Structure for Enhanced Protein Production”の2009年2月24日付け米国仮出願番号61/155,049の優先権の利益を主張する。上記出願の内容を、出典明示によりその全体を包含させる。
真核生物における翻訳開始は、5’キャップ構造または内部リボソーム侵入部位(IRES)のいずれかでの40Sリボソームサブユニットおよび翻訳機構の他の成分のmRNAによる動員に関連する。その動員後、40Sサブユニットは開始コドンへ移動する。翻訳開始の広く受け入れられた考えの1つは、40Sサブユニットが、良いヌクレオチドコンテキスト(context)に属する第1のAUGコドンに遭遇するまで、5’から3’方向において5’リーダーを介する走査により動員の部位から開始コドンへ移動すると主張する(Kozak “The Scanning Model for Translation: An Update” J. Cell Biol. 108:229-241 (1989))。最近、翻訳開始が走査と関連せず、キャップ構造またはIRESのいずれかでのリボソームサブユニットのテザーリング(tethering)、または内部部位でのリボソームサブユニットのクラスタリング(clustering)と関連し得るということが主張されている(Chappellら. “Ribosomal shunting mediated by a translational enhancer element that base pairs to 18S rRNA” PNAS USA 103(25):9488-9493 (2006); Chappellら., “Ribosomal tethering and clustering as mechanisms for translation initiation” PNAS USA 103(48):18077-82 (2006))。40Sサブユニットは、必ずしもmRNAにおける第1のAUGコドンではない利用可能なAUGコドンへ移動する。該サブユニットが何らかの機構により開始コドンに到達すると、該サブユニットと関連する開始メチオニン−tRNAが開始コドンと塩基対合し、大型(60S)リボソームサブユニットが結合し、ペプチド合成が始まる。
当該分野において、タンパク質翻訳の効率および安定性、ならびに、例えば、タンパク質薬物の産業生産におけるタンパク質収量および濃度の改善の必要性がある。
I.概観
コードされたタンパク質のレベルを増加させるために、天然mRNAを修飾するか、または合成mRNAを操作する方法が本明細書に開示される。これらの基準は、1)コード配列におけるAUGまたは非標準開始コドンを介するリボソームダイバージョンを減少させることにより、および/または2)コード配列におけるmiRNA結合部位を除去することによりmiRNA介在の下方制御を回避することにより、タンパク質合成を増強することが意図されるmRNAコーディングおよび3’UTR配列に対する修飾を表す。
本明細書は、記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されず、これらは変更してもよい。また、本明細書において使用される用語は、特定の態様を記載するだけの目的のためであり、特許請求の範囲に記載されている本方法の範囲を限定する意図はないことを理解すべきである。
上記のとおり、5’リーダー内に含まれる特徴が翻訳の効率に影響し得ることがよく知られている。例えば、上流AUGコドンと称される5’リーダーにおけるAUGコドンは、遺伝子、ヌクレオチドコンテキストおよび細胞状態に依存して、タンパク質合成において正または負の効果のいずれかを有し得る。上流AUGコドンは、真の開始コドンからリボソームをそらすことにより翻訳開始を阻害することができる(Meijerら., “Translational Control of the Xenopus laevis Connexin-41 5’-Untranslated Region by Three Upstream Open Reading Frames” J. Biol. Chem. 275(40):30787-30793 (2000))。例えば、Meijerらの図6および8は、5’リーダー配列における上流AUGコドンのリボソームダイバージョン(ribosomal diversion)効果を示す。
マイクロRNAは、一般的に負の遺伝子調節因子として機能する小さい非コーディングRNAの豊富なクラスである。1つの態様において、miRNA介在の下方制御を回避するように、5’リーダー、コード配列、および3’UTRを含むmRNA配列に対して修飾を施すことができる。このような修飾は、それにより、mRNAまたは新生ペプチドの安定性を改変し、タンパク質合成および翻訳の効率を増強することができる。
以下の実施例はさらなる説明を提供するが、その範囲に限定されない。他の変異体が当業者には容易に明らかであり、特許請求の範囲に包含される。
mRNA転写産物の5’−UTRおよびコーディング領域内の多重翻訳開始部位の存在は、例えば、真の、もしくは証明された翻訳開始コドンからリボソームをそらすことにより、翻訳の効率を減少させる。あるいは、または加えて、真の、もしくは証明された翻訳開始コドンの下流の多重翻訳開始部位の存在は、全長タンパク質の翻訳の効率を減少させる1つ以上のタンパク質アイソフォームの翻訳の開始を誘導する。商業的に価値のあるヒトタンパク質をコードするmRNA転写産物の翻訳の効率を改善するために、真の、もしくは証明された翻訳開始コドンの上流および下流のすべてのリーディングフレーム内の可能性のある翻訳開始部位を、これらの部位を除去するように変異させる。この方法の好ましい局面において、mRNA配列を改変するが、コードされる得られるアミノ酸は同じままである。あるいは、同様の物理的特性を有するアミノ酸を置換する保存的変化を誘導する。
クロラムフェニコールは、50Sリボソームサブユニットに結合し、ペプチド結合形成を防止することにより、細菌タンパク質合成を妨げる抗生物質である。耐性遺伝子(cat)は、該抗生物質をその2つのヒドロキシル基の1つまたは両方でアセチル化することにより、該薬物をアセチル化し、不活性化させるアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードする。CATの修飾されていないオープンリーディングフレームは、113個の可能性のある開始コドン(真の開始コドンを含む20個のATG、8個のATC、8個のACG、12個のGTG、8個のTTG、11個のCTG、6個のAGG、10個のAAG、16個のATAおよび14個のATTコドン)を含む(配列番号:120)。配列番号:121は、完全に修飾されたCATのORFであり、配列番号:122は、可能性のある修飾の一部だけを施した部分的に修飾されたCATのORFである。
該技術の実用性を、また、分泌タンパク質で研究した。哺乳動物の発現構築物を、ヒトCD5分子(CD5)mRNA内にコードされるシグナルペプチドに対して産生した。転写をCMVプロモーターにより駆動し、cd5シグナルペプチドをサイログロブリンタンパク質に対する抗体の軽鎖をコードするORFの5’末端に置いた哺乳動物の発現構築物を産生した(cd5−1、配列番号:123)。CD5シグナルペプチド配列は、3つのATG、1つのTTGおよび3つのCTGコドンを含む7つの可能性のある開始コドンを含む。一連の発現構築物を産生した。1つの変異体において、cd5シグナルペプチドにおけるATGコドンを、ATCコドンに変化させ、メチオニンからイソロイシン置換をもたらした(cd5−2、配列番号:124)。別の変異体において、cd5シグナルペプチドにおけるCTGコドンをCTCに変化させた(cd5−3、配列番号:125)。別の変異体において、ATGコドンをATCコドンに変異させて、メチオニン(M)からイソロイシン(I)へのアミノ酸置換をもたらし、CTGコドンをCTCに変化させた(cd5−4、配列番号:126)。別の変異体において、ATGコドンをATCコドンに変化させて、メチオニン(M)からイソロイシン(I)へのアミノ酸置換をもたらし、CTGコドンをCTCコドンに変化させ、開始AUGのコンテキストをそれのコドン3’をCCCからGCTに変化させて、プロリン(P)からアルギニン(R)へのアミノ酸置換をもたらすことにより改良した(cd5−5、配列番号:127)。
表1:酵母および哺乳動物細胞において機能するシグナルペプチドに対するDNA配列
HcRed1は、励起および発光最大がそれぞれ558nmおよび618nm+/−4nmで起こる遠赤色蛍光タンパク質をコードする。HcRed1は、珊瑚礁シライトイソギンチャク(Heteractis crispa)由来の非蛍光色素タンパク質の変異誘発により産生した。次に、HcRed1のコード配列を、哺乳動物細胞においてより高い発現のためにヒトコドンを最適化した。このORFは、真の開始コドンを含む9個のATG、8個のATC、12個のACG、16個のGTG、21個のCTG、18個のAGG、および15個のAAGコドンを含む99個の可能性のある開始コドンを含む(配列番号:134)。HcRed1のORFの完全および部分的修飾を行った(それぞれ配列番号:135および136)。
ヒトエリスロポエチン(EPO)は、重要な治療剤である。本明細書に記載されている方法を使用して、ヒトEPOタンパク質(以下で提供され、GenBank受入番号NM_000799として利用できる)をコードするmRNA配列を、このmRNA転写産物内の多重翻訳開始部位を除去するように最適化する。
標的mRNA転写産物に対するマイクロRNA(miRNA)結合は、標的mRNA転写産物の分解を誘導するか、または標的mRNA転写産物の翻訳を防止することのいずれかにより翻訳の効率を減少させる。商業的に価値のあるヒトタンパク質をコードするmRNA転写産物の翻訳の効率を改善するために、標的mRNAの5’リーダー配列、5’非翻訳領域(UTR)配列、コード配列、および3’非翻訳領域(UTR)配列内の全て既知または予測miRNA結合部位を第1に同定し、第2にmiRNA結合を阻害するために変異または改変させる。
Claims (23)
- 全長タンパク質発現の効率を改善する方法であって、
a)i)タンパク質に対するコード配列、
ii)コード配列の上流にある第1の開始コドン、および
iii)コード配列内に位置する1つ以上の第2の開始コドン
を含むポリヌクレオチドを提供し、
b)1つ以上の第2の開始コドンを変異し、該変異が、第1の開始コドンから離れてリボソームダイバージョンの減少をもたらす1つ以上の第2の開始コドンでのタンパク質合成の開始の減少をもたらし、
それにより、全長タンパク質発現の効率を増加させる
ことを含む方法。 - 1つ以上の第2の開始コドンの変異が、アミノ酸配列が改変されない1つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上の第2の開始コドンが、コード配列と同じリーディングフレーム内にある、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上の第2の開始コドンが、コード配列のフレーム外にある、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上の第2の開始コドンが、リボソーム動員部位から1つ以上のヌクレオチドの上流または下流に位置する、請求項1に記載の方法。
- リボソーム動員部位が、キャップまたはIRESを含む、請求項5に記載の方法。
- 1つ以上の第2の開始コドンが、AUG、ACG、GUG、UUG、CUG、AUA、AUC、およびAUUからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- コード配列内の2つ以上の第2の開始コドンを変異させる、請求項1に記載の方法。
- コード配列内のすべての第2の開始コドンを変異させる、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上の第2の開始コドンの変異が望ましくないヌクレオチドコンテキストへのフランキングヌクレオチドの変異を含む、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上の第2の開始コドンの変異が、新規開始コドンを導入しない、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上の第2の開始コドンの変異が変異コドンの利用バイアスを改変しない、請求項1に記載の方法。
- 全長をコードされたタンパク質以外の短縮タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの産生を減少させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上の第2の開始コドンの変異が、miRNAシード配列、スプライスドナー部位、スプライス受容部位、またはmRNA不安定化エレメントを導入しない、請求項1に記載の方法。
- 全長タンパク質発現の効率を改善する方法であって、
a)タンパク質に対するコード配列およびコード配列内に位置する1つ以上のmiRNA結合部位を含むポリヌクレオチド配列を提供し、
b)1つ以上のmiRNA結合部位を変異し、該変異が、タンパク質翻訳のmiRNA介在の下方制御の減少をもたらす1つ以上のmiRNA結合部位でのmiRNA結合の減少をもたらし、それにより、全長タンパク質発現の効率を増加させる
ことを含む方法。 - 1つ以上のmiRNA結合部位の変異が、アミノ酸配列が改変されない1つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項15に記載の方法。
- 1つ以上のmiRNA結合部位の変異が、miRNAのシード配列中の1つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項15に記載の方法。
- 1つ以上のmiRNA結合部位の変異が、開始コドンがポリヌクレオチド配列に導入されないような1つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項15に記載の方法。
- 1つ以上のmiRNA結合部位の変異が、希少コドンがポリヌクレオチド配列に導入されないような1つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項15に記載の方法。
- 1つ以上のmiRNA結合部位の変異が、さらなるmiRNAシード配列がポリヌクレオチド配列に導入されないような1つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項15に記載の方法。
- 1つ以上のmiRNA結合部位がコード配列内に位置する、請求項15に記載の方法。
- 1つ以上のmiRNA結合部位が3’非翻訳領域内に位置する、請求項15に記載の方法。
- 1つ以上のmiRNA結合部位が5’リーダー配列内に位置する、請求項15に記載の方法。
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