WO2004074474A1 - 新規rnaポリメラーゼiiiプロモーター及びその製造方法並びにその使用方法 - Google Patents

新規rnaポリメラーゼiiiプロモーター及びその製造方法並びにその使用方法 Download PDF

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WO2004074474A1
WO2004074474A1 PCT/JP2004/001665 JP2004001665W WO2004074474A1 WO 2004074474 A1 WO2004074474 A1 WO 2004074474A1 JP 2004001665 W JP2004001665 W JP 2004001665W WO 2004074474 A1 WO2004074474 A1 WO 2004074474A1
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promoter
rna polymerase
gene
polymerase iii
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PCT/JP2004/001665
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Shigeki Higashiyama
Hiroyuki Ueno
Koichi Yokota
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Shigeki Higashiyama
Hiroyuki Ueno
Koichi Yokota
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    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Definitions

  • the present invention relates to a novel RNA polymerase III promoter, a method for producing the same, and a method for using the same. More specifically, in order not to impair the function of the proximal sequence element (hereinafter referred to as “PSE”) and the TATA box, some of the sequences are sequences that cause specific DNA recombination by Cre recombinase.
  • PSE proximal sequence element
  • the present invention relates to an RNA polymerase II I promoter characterized by being replaced, a method for producing the same, and a method for using the same. Background art
  • RNA polymerases there are commonly three types of RNA polymerases, type I to type II, but type III polymerase is a transfer RNA (hereinafter referred to as “tRNA”) or in the nucleus. It synthesizes small RNA genes such as small RNA (small nuclear RNA; hereinafter referred to as “snRNA”).
  • tRNA transfer RNA
  • snRNA small RNA
  • RNA synthesis by type III polymerase the transcription start site is strictly defined, and transcription is terminated by five consecutive thymidine sequences on DNA.
  • two to three bases of adenyl are added at the end of transcription.
  • type III polymerase promoters there are two types, one with a TATA box and one without. The type III polymerase promoter with a TATA box is used for gene function analysis as shown below.
  • gene interference can be analyzed if the nucleotide sequence of the gene is known.
  • RNAi RNAinterference; hereafter referred to as “RNAi”)
  • RNAi is a double-stranded RNA consisting of sense RNA and antisense RNA homologous to a specific region of the gene whose function is to be inhibited. Described as “dsRNA”.
  • dsRNA Interferes with the homologous part of the mRNA that is the transcript of the target gene.
  • RNA short interfering RNA
  • sRNA short interfering RNA
  • mRNA having a homologous sequence is degraded.
  • a DNA vector that expresses the sense strand and antisense strand RNA simultaneously or in the opposite direction to a hairpin RNA molecule is introduced into mammalian cells and RNAi is introduced. It was found that can be induced. At this time, a method using an RNA polymerase III promoter has been developed.
  • RNA synthesis method using the RNA polymerase III promoter has made it possible to isolate cells that constantly cause RNAi and to create transgenic (TG) mice that cause RNAi for the purpose of gene function analysis.
  • TG transgenic mice
  • RNAi suppresses gene expression, depending on the target gene that suppresses gene expression, it has a significant effect on cell growth, and it is not possible to clone cells that cause RNAi, or TG that induces RNAi. It is expected that mice will show embryonic death. In addition, in order to more rigorously prove the association between a suppressor gene and a phenotypic abnormality, it is necessary to conduct RNAi only at the developmental stage or in specific tissues (organs) and analyze the function of the gene.
  • a Cre- ⁇ system has been developed as a method capable of controlling a target gene to be deleted only under a certain condition or in a certain tissue, and is used, for example, for producing a knockout mouse.
  • JP-A-11-112 JP-A-11-112
  • Cre recombinase of Pacteriophage di PI recognizes a 34-base ⁇ sequence, initiates DNA recombination, and performs loop-gating of the ⁇ inter-sequence region.
  • the Cre- ⁇ system is also known to work in mammalian cells, a system in which a stuffer surrounded by an ⁇ sequence (hereinafter “stuffer”) is placed between the promoter and the target gene.
  • shuffer a stuffer surrounded by an ⁇ sequence
  • When a configuration with) is used usually only the gene in the stuffer is expressed, and the expression of the target gene is completely suppressed.
  • the Cre recombination enzyme acts, homologous recombination occurs between the two ⁇ sequences. As a result, the stafer gene is removed and the target gene expression is induced.
  • RNAi which was the original purpose, could not be caused.
  • RNAi which was the original purpose, could not be caused.
  • the inventors of the present application have replaced the RNA polymerase III promoter with a ⁇ sequence so as not to destroy the sequence required for transcription, so that the ⁇ sequence is inserted into the RNAi molecule by transcription. It has been found that RNAi can occur, and the present invention has been completed.
  • the purpose of the present invention is to use RNAi molecules used for analysis of gene function at any time or in a specific tissue
  • the present invention provides a novel RNA polymerase III promoter that can be used in a conditional RNAi induction method, which can be induced only with a DNA polymerase III.
  • Another object of the present invention is to provide a novel RNA polymerase II I promoter which is suitably used for producing transgenic animals.
  • the objective described above is characterized in that some of the sequences have been replaced by sequences that cause specific DNA recombination by Cre recombinase so as not to impair the function of the PSE and TATA boxes. This is achieved by the RNA polymerase III promoter.
  • RNA polymerase III promoter of the present invention is prepared by replacing a part of the sequence with a sequence that causes specific DNA recombination by Cre recombinase so as not to impair the functions of PSE and TATA pottus. be able to.
  • the sequence to be replaced with a sequence that causes specific DNA recombination by Cre recombinase is preferably any one of the sequences 150 to 11 from the transcription start point.
  • Sequences in which specific DNA recombination can occur by the Cre recombinase used in the present invention include, for example, ⁇ sequences and variants thereof.
  • the ⁇ sequence consists of 34 base pairs of a sequence-specific 13 base (ATAACTTCGTATA) inverted repeat sequence and a non-sequenced 8-base spacer sequence (Fig. 1 (B)). .
  • variants include those in which the spacer sequence is substituted or those in which the spacer sequence and a part of the invert repeat sequence are substituted.
  • specific examples include, for example, JP-A-11-196880. And the like. It is preferable to replace the ⁇ sequence at a position that functions as a TATA box in the promoter after replacement by 10 to 25 forces of the ⁇ sequence.
  • the RNA polymerase II I promoter used in the present invention is a sequence to which RNA polymerase III that synthesizes hpRNA and siRNA binds at the start of transcription.
  • H1 has a transcription control region upstream from the transcription start site.
  • An RNA gene promoter and a U6 RNA gene promoter are used.
  • any promoter derived from human or mouse can be used. +
  • RNA polymerase III promoters of the present invention include the following RH-loxP promoters (RNAi inducible HI RNA gene promoter-loxP sequence fusion promoter).
  • RNA polymerase III promoter is suitable for the synthesis of small RNA genes such as tRNA and snRNA. It is known that the type II promoter having a TATA box has a defined transcription start point and transcription end point (see Background Art). In RNAi induction, which requires precise RNA molecule synthesis, the above-described transcription properties of RNA polymerase III are suitable for the synthesis of siRNA and hpRNA molecules.
  • RNA polymerase III promoter HI RNA gene promoter scratch, the structure of the promoter and are well studied, (hereinafter referred to "0ctamer”.) Okutama one sequence (- 97 from - 9 0), staff ( This is referred to as “Staf” below.) It was shown that the binding sequence (-88 to -69), PSE sequence (-68 to -51), and TATA box (-30 to -26) are important sequences for transcription. (Fig. 1 (A)). In particular, for the TATA box and the PSE, the presence of both sequences and their distance from the transcription initiation site are essential for RNA polymerase II I transcription.
  • the loxP sequence is composed of a sequence-specific 13-base (ATAACTTCGTATA) inverted repeat sequence and a non-sequence-specific 8-salt-base spacer sequence of 34 base pairs (first sequence).
  • Figure (B) ).
  • the loxP sequence is a 34 base pair DNA sequence consisting of a 13-base impert repeat structure and an 8-base spacer sequence. Compared with the immobilized repeat member structure, the spacer sequence can be easily replaced with a base.
  • the replacement with the loxP sequence uses the TATA sequence (10 to 14) in the loxP sequence, without destroying the TATA sequence (-30 to -26) of the HI promoter. It goes from -39 to -6 from the transcription start point of the HI promoter.
  • the distance from the transcription start point of the TATA box sequence of the promoter can be changed by converting the sequence of the spacer or by using another TATA promoter in the loxP sequence (22, 25). It is possible to perform substitution with the loxP sequence without changing the expression.
  • Such a promoter can function similarly to the RH_loxP promoter.
  • RNA polymerase III promoter of the present invention has deletions and additions of gene sequences so as not to impair the functions of the specific DNA recombination by Cre recombinase and the functions of PSE and TATA box. , Replacement, and insertion are also included.
  • RNA polymerase III promoter of the present invention can be used as follows.
  • a structure in which a stuffer sequence and another fusion sequence of a loxP sequence and an RNAi-inducing sequence are arranged downstream of an RNA polymerase III promoter containing a loxP sequence of the present invention is created.
  • Such a structure transcribes only in the stuffer and does not induce RNAi-inducing RNA molecules.
  • Cre enzyme a Cre recombinase
  • RNAi-inducing sequence downstream of the RNA polymerase III promoter containing the loxP sequence of the present invention, and insert another loxP sequence further downstream.
  • Such a structure can originally induce RNAi, but RNAi can be released by reacting the Cre enzyme and removing the RNAi-inducing sequence sandwiched between the two ⁇ sequences.
  • a TG mouse or a cell line can be prepared using a system capable of controlling the expression of a transcript by using an RNA polymerase II I promoter containing the " ⁇ " sequence of the present invention and another " ⁇ " sequence.
  • the resulting TG mouse and cell line can control the expression of the transcript in a Cre enzyme-dependent manner.
  • the RNA polymerase III promoter containing the sequence of the present invention can induce the expression of an RNA gene. That is, the RNA polymerase III promoter of the present invention can transcribe not only a transcript having an RNAi-inducing sequence, but also any transcript. In addition, transcription can be induced and released by introducing the target transcript gene between the RNA polymerase III promoter containing the “ ⁇ sequence” of the present invention and another “ ⁇ ” sequence.
  • FIG. 1 is a diagram showing a promoter sequence and a ⁇ sequence.
  • FIG. 2 pcDNA 3. 1 plasmid, in the case of introducing each pUN0126, pUN0137, a diagram illustrating a cell observation results by bright field.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of cell observation in a fluorescence field when pcDNA3.1 plasmid, pUN0126, and pUN0137 were introduced.
  • FIG. 4 is a diagram in which FIG. 2 and FIG. 3 are superimposed.
  • An asterisk (*) indicates cells with no fluorescence.
  • Figure 5 shows an outline of the reaction of the RH-loxP promoter by the Cre enzyme.
  • FIG. 6 is an electropherogram of a recombinant (pUN0149 and ⁇ ⁇ ) generated by the Cre enzyme of pUN0147 and pUN0148.
  • ori is the combination of Cre enzyme This is the full-length plasmid before recombination
  • recombinant is the plasmid after recombination with Cre enzyme.
  • FIG. 7 is a diagram showing a DNA sequence near the transcription start point of the RH- ⁇ ⁇ UN promoter of pUN0147 and pUN0149, and pUN0148 and pUN0150.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of cell observation in a fluorescence field when pUN0148 alone and a certain plasmid were simultaneously introduced with pUN0148 and pMC-Cre plasmid.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of bright field observation of cells when pUN0148 alone or pUN0148 and pMC-Cre plasmid were introduced simultaneously.
  • FIG. 10 is a diagram in which FIG. 8 and FIG. 9 are superimposed.
  • An asterisk (*) indicates cells where no fluorescence is observed.
  • FIG. 11 shows a liver in which only Ringer's solution was injected into a C57BL mouse (WT mouse).
  • Fig. 12 shows transgenic mice that constantly express EGFP protein.
  • FIG. 13 shows a liver obtained by injecting 100 ⁇ g of pUN0129 into an eGFP mouse.
  • FIG. 14 is a diagram showing a liver obtained by injecting pMC-Cre plasmid (80 micrograms) and pUN0148 (20 micrograms) into an eGFP mouse.
  • Fig. 15 shows the relative amount of EGFP expression in the living body of a mouse with respect to Figs. 11 to 14 when the fluorescence intensity when only Ringer's solution was injected was set to 100. It is. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples.
  • HT1080 / HB-EGF to YFP cells expressing the HB-EGF gene and YFP (ye low fluorescent protein in) fusion protein were provided by Ehime University.
  • EGFP (enhanced green fluorescent protein) expression C57BL / 6-TgN (ACTbEGFP) 10sb; hereinafter referred to as “eGFP mouse” was purchased from Charles River Japan Inc.
  • Example 1 '
  • the human HI promoter uses the following DNA primers (hHl / # 3 D -ggaattcttatagggagctgaagggaagg ⁇ hHl / # 2
  • the PCR was increased by using 5-gggatccgaagactatgggaaagagtggtctcatacag.
  • the amplified fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI, and cloned into EcoRI and BamHI sites of pZErOI (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) (pUN0115).
  • the plasmid PUN0147 which depends on the Cre enzyme and causes RNAi to the HB-EGF gene, was prepared as follows. First, using DNA primer (L / H5,- ⁇ cctgcaggggaaataacttcgtataac ⁇ hHl / # 55, -gctcgagttatagggagctgaagggaagg) and pUN0137, only the promoter region of pUN0137 was PCR-amplified and cloned into the EcoRV site of pZErOI. did. Read the nucleotide sequence, sequence of L / H primer isolate clones position next to the Pst I site of pZErO I (pUN014 2). '.
  • pUN0147 cuts pUN0142 with restriction enzymes PstI and PvuII, and ligated the sequence containing the RH-loxP promoter with PstI of pSV40 / Zeo2 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA.). It was cloned into the PvuII site (pUN0143), and a fragment containing the loxP sequence obtained by cutting pUN0144 with restriction enzymes BamHI and XbaI was inserted into the NheI and BglII sites of pUN0143.
  • the plasmid PUN0148 which causes RNAi to the YFP gene depending on the Cre enzyme, is a DNA oligomer (EGLX_ (AS)
  • a fragment containing the loxP sequence obtained by cutting pUN0145 with restriction enzymes BamHI and XbaI was inserted into the NheI and BglII sites of PUN0143.
  • the mouse U6 promoter consists of mouse genomic DNA and the following DNA primers (DNA primer, mU6 / # l5 -ggaattcatccgacgccgccatctcta mU6 / # 2 5, PCR amplification was performed using -gggatccgaagaccacaaacaaggcttttctccaa). The amplified fragment was cut with the restriction enzymes Eco RI and Bam HI, and cloned into the Eco RI and Bam HI sites of pZErO I (pUN0117).
  • DNA primer (EGFP_K01) was used to produce plasmid PUN0129, which causes RNAi to YFP gene depending on U6 promoter.
  • HT1080 / HB-EGF to YFP cells express and express a fusion protein of HB-EGF gene and YFP gene.
  • Various plasmids were transfected into HT1080 / HB-EGF-YFP cells with Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA.).
  • Lipofectamine 2000 (3.0 microliters) was diluted in 100 microliters of Opti-MEM (Gibco) and left at room temperature for 5 minutes. DNA (1.6 micrograms) was diluted into 100 microliters Opti-MEM. These solutions were mixed and left at room temperature for 20 minutes. The mixture was then added to 1 ml of Opti-MEM and 12-well plates. Four hours later, the DNA / Lipofectamine mixture was removed and replaced with the culture solution.
  • the Cre recombination reaction of PUN0147 or pUN0148 was performed using Cre recombination enzyme purchased from Clontech Laboratories, Inc. Add 200 ng of plasmid at room temperature in a 20 microliter reaction solution containing 1 microliter of Cre enzyme, 2 microliters of 10x buffer, and 2 microliters of BSA (lmg / ml). The reaction was performed for 15 minutes. After the reaction, the mixture was kept at 70 ° C. for 5 minutes to inactivate the enzyme.
  • RNAi-inducing sequence for human HB-EGF was inserted downstream of the RH-loxP promoter or HI promoter.
  • P hpRNA than HI promoter was designed to be transcribed UN0126, and RH-Iotaomikuronkairo promoter than hpRNA is designed to be photographed rolling PUN0137, and as a control, pcDNA3.
  • 1 plasmid, respectively HB EGF-YFP The fusion protein was introduced into HT1080 / HB_EGF ⁇ YFP expressing the fusion protein.
  • Fig. 2 shows the results of bright field observation of cells when pcDNA3.1 plasmid, pUN0126, and pUN0137 were introduced.
  • FIG. 3 shows the results of cell observation in a fluorescent field when pcDNA3.1 plasmid, pUN0126, and pUN0137 were introduced.
  • FIG. 4 is a superposition of FIG. 2 and FIG.
  • hpRNA transcribed from the HI promoter causes RNAi.
  • the introduction of the plasmid pUN0150 designed to transcribe the hpRNA molecule for the YFP gene from the RH-loxP promoter into HT1080 / HB-EGF to YFP cells was performed by transferring the hpRNA molecule for the YFP gene to the mouse U6 RNA gene promoter.
  • the amount of HB-EGF-YFP was reduced and the RNAi effect was shown, as in the case of transfection of the plasmid pUN0129 designed to be transcribed into HT1080 / HB-EGF-YFP cells.
  • RH-loxP promoter to rely, Ri by the gene transfer into HT1080 / HB-EGF ⁇ YFP cells of the designed-flops Rasumi de (P UN0137 and pUN0150) so as to transfer the hpRNA molecule, RNAi effect of target gene product
  • the RH_loxP promoter like the RNA polymerase III promoters (HI and U6 promoters), works effectively for inducing RNAi, indicating that it is suitable for transcription and synthesis of hpRNA molecules.
  • PUN0147 and pUN0148 plasmids were prepared to confirm whether the designed RH-10 xP promoter performs a 1 oxP sequence-specific recombination reaction with the Cre enzyme.
  • PUN0147 inserts the RH-loxP promoter from the restriction enzyme site Pvu I of SV40 / Zeo2 toward the restriction enzyme site Pst I, and further, RH- ⁇ from the restriction enzyme site Nhe I to the restriction enzyme site Bgl II.
  • a fusion sequence was prepared by inserting a fusion sequence of a sequence ( ⁇ sequence + ttccc) corresponding to -39 to -1 of the promoter sequence and an hpRNA sequence for the HB-EGF gene (FIG. 5).
  • pUN0148 was prepared by inserting hpRNA for the YFP gene instead of hpRNA for the HB-EGF gene of pUN0147.
  • PUN0147 and 148 were reacted with purified Cre enzyme. After the reaction, in order to reduce the amount of unreacted plasmid, it was reacted with restriction enzymes Sal I and Bam HI and then transformed into E. coli to obtain a single clone.
  • the obtained clones were screened by spreading them on an ampicillin medium and a zeocin medium with a toothpick.
  • PUN0148 and pUN0147 have an ampicillin resistance gene and a zeocin resistance gene, and these clones are resistant to both antibiotics. But recombination The body has only the ampicillin resistance gene and cannot grow on Zeocin medium.
  • Plasmids were extracted in order to confirm that the clones that had lost zeocin resistance underwent recombination reaction specific for the loxP sequence, and that the clones were the result of looping the loxP sequence region (1.Ikbp) containing the zeocin resistance gene. And analyzed.
  • Fig. 6 shows the results of extracting and analyzing plasmids from clones that have lost zeocin resistance due to the recombination reaction. Clones that had lost zeocin resistance had shorter plasmid lengths than the plasmid length before the recombination reaction. This is expected to be the result of looping out between loxP sequences using the Cre enzyme.
  • the DNA sequence of the recombinant obtained by the Cre reaction was prepared (FIG. 7).
  • a sequence derived from pSV40 / Zeo2 is recognized at the transcription start site.
  • a new RNAi-inducing sequence was inserted at the transcription start site.
  • no DNA sequence in the region containing the zeocin resistance gene between the loxP sequences was found. Therefore, it can be said that the region between the loxP sequences containing the zeocin resistance gene depends on the Cre enzyme, and the RNAi-inducing sequence is located at the transcription start site.
  • FIG. 8 shows the results of the cell exclusion using the fluorescence visual field when pUN0148 alone or pUN0148 and pMC-Cre Plasmid 'were simultaneously introduced.
  • Fig. 9 shows the results of brightfield cell observation when pUN0148 alone or pUN0148 and pMC_Cre plasmid were introduced simultaneously.
  • FIG. 10 is a superposition of FIG. 8 and FIG.
  • the number of cells that had lost fluorescence due to the introduction of plasmid was significantly higher in the cells into which pUN0148 and pMC-cre were simultaneously introduced than in the cells into which pUN0148 had been introduced.
  • pUN0148 was converted to an RNAi-induced recombinant by the Cre enzyme expressed from pMC-Cre, as shown in Fig. 5. Is shown.
  • RNAi effect could be induced from pUN0148 by Cre enzyme in cells.
  • Transgenic EGFP TG; hereafter referred to as “eGFP”
  • eGFP Transgenic
  • 3 ml of Ringer's solution containing 100 micrograms of plasmid is injected into the tail vein of a mouse, and 72 hours later, it is injected into the liver. Ultraviolet light was applied to observe the presence of the EGFP protein.
  • liver was excised, and the amount of EGFP protein was quantified by the following method.
  • Each liver was homogenized in a PBS solution, centrifuged at 100 rpm, and the supernatant was separated to obtain an extract.
  • the amount of protein was measured, and the protein concentration in the extract obtained from each liver was matched.
  • the amount of EGFP contained in the protein is POLARstar
  • the fluorescence intensity was measured using (Biotechnology & Life Sciences), and expressed as the relative value of the fluorescence intensity of each sample when the fluorescence intensity of the sample from the liver in which only the Ringer solution was injected into the eGFP mouse was 100. '
  • mice injected with Ringer solution only in eGFP mice were compared with C57BL (wild type; hereinafter referred to as “WT type”) livers injected with Ringer solution alone in mice (Fig. 11). 'The presence of EGFP was clearly confirmed (Fig. 12).
  • pUN0129 plasmid is a plasmid that induces the RNAi effect on the YFP gene, and the sequence recognized upon its induction is also present in the transcript of the EGFP gene.
  • pUN0129 plasmid was injected into eGFP mice, a decrease in EGFP expression could be observed in the liver (middle lobe) (Fig. 13).
  • the amount of EGFP in the liver of eGFP mice injected with pUN0129 was 49% lower than the amount of EGFP in the liver of eGFP mice injected with Ringer's solution alone.
  • PUN0148 is a plasmid that induces the RNAi effect on the YFP gene when used together with pMC-Cre plasmid, but the sequence recognized during the induction is also a transcription factor of the EGFP gene. Present in the product. Therefore, pUN0148 and pMC-Cre plasmid were co-injected into eGFP mice. In this case, the liver loses luminescence due to the EGFP protein in a dot form (FIG. 14), and the amount of EGFP is 67 ° /. ( Figure 15).
  • -97 force indicates Octamer sequence
  • -88 to -69 indicates Staf binding region
  • -68 force and -51 indicate PSE sequence
  • -30 to -26 indicates TATA-box
  • +1 indicates transcription initiation site.
  • the numbers indicate the number of bases from the transcription start point
  • the underline indicates a variable spacer sequence consisting of 8 bases in the sequence.
  • the numbers indicate the number of bases.
  • the RH_loxP promoter was modified based on the HI RNA gene promoter.
  • the -39 to -6 positions of the HI promoter were replaced with the ⁇ sequence shown in (B).
  • the ⁇ array is shown in uppercase letters, and the underline corresponds to the variable spacers in the ⁇ array.
  • Octamer sequence from -97 to -90
  • Staf binding region from -88 to -69
  • PSE sequence from -68 to -51
  • TATA-box from -30 to -26
  • FIGs. 2 to 4 Suppression of HB-EGF gene expression by hpRNA synthesized from RH-loxP promoter
  • pcDNA3.1 plasmid (Fig. 2 (A), Fig. 3 (B), Fig. 4 (C)), plasmid pUN0126 (Fig. 2), which synthesizes hpRNA, an RNAi-inducing sequence for HB-EGF gene, from HI promoter Fig. (D), Fig. 3 (E), Fig. 4 (F)), or the plasmid pUN0137 that expresses the RNAi-inducing sequence hpRNA for the HB-EGF gene from the RH_loxP promoter (Fig. 2 (G) , Fig. 3 (H) and Fig.
  • pUN0147 is composed of the RH-loxP promoter, a stuffer sequence (a 1.lkbp sequence containing a Zeocine resistance gene), a sequence ( ⁇ sequence + ttccc) corresponding to -39 to -1 of the RH-loxP promoter sequence and HB-EGF It has a fusion sequence of the hpRNA synthesis sequence for the gene.
  • PUN0148 is composed of the RH-loxP promoter, a stuffer sequence (a 1.lkbp sequence containing the Zeocine resistance gene), a sequence matching the -39 to -1 of the RH-loxP promoter sequence ( ⁇ sequence + ttccc) and YFP (or It has a fusion sequence of the hpRNA synthesis sequence for the EGFP) gene.
  • PUN0147 and pUN0148 have no hpRNA synthesis sequence at the transcription start site of the RH-loxP promoter.
  • the stuffer sequence is looped out by the Cre enzyme reaction, and the plasmids PUN0149 and pUN0150 have hpRNA synthesis sequences at the transcription start site of the RH-RH ⁇ promoter, respectively.
  • PUN0147 and pUN0148 have resistance genes to the antibiotics ampicillin and zeocin, while pUN0149 and pUN0150 have only ampicillin resistance genes.
  • restriction enzyme sites Pvu II, Pst I, Sal I, BamHI, Nhe I and Bgl II are shown.
  • the arrow in the figure indicates the direction of transcription of the RH-loxP promoter.
  • FIG. 6 Electropherogram of recombinants (pUN0149 and PUN0150) generated by Cre enzymes of pUN0147 and pUN0148
  • PUN0147 and pUN0148 were each reacted with Cre enzyme in a test tube. After reacting with the restriction enzymes Sal I and Bam HI, they were transformed into E. coli and clones were obtained. By screening, clones resistant to the antibiotic ampicillin and susceptible to the antibiotic zeocin were obtained. Plasmid was extracted from each clone and analyzed by electrophoresis using 0.8% agarose gel. Lane 1 shows pUN0147 not reacted with Cre enzyme, lane 2 shows recombinant pUN0149 obtained by reacting pUN0147 with Cre enzyme, and lane 3 shows recombinant ⁇ ⁇ ”obtained by reacting pUN0148 with Cre enzyme.
  • Fig. 7 DNA sequences of pUN0147 and pUN0149, pUN0148 and pUN0150 near the transcription start point of the RH-loxP promoter
  • the DNA sequence was analyzed using DNA Pfima 1 to (M13 (-20) Forward primer; 5-gtaaaacgacggccagt).
  • the transcription start point was +1.
  • a boxed portion indicates a homologous sequence in hpRNA
  • an underlined portion indicates a loop structure in hpRNA
  • a double underlined portion indicates a transcription termination sequence.
  • pUN0148 (A to C), or pUN0148 and pMC—Cre (Cell, 1993, 73, 1155 to 1164) (DF) constitutively express fusion protein of HB-EGF gene and YFP gene
  • the gene was transfected into HT1080 / HB-EGF-YFP cells, and observed 48 hours later in a fluorescent field (A, D) or bright field ( ⁇ , ⁇ ).
  • Panels (C, F) show the same field of view observed in the visual field and the fluorescence field, and cells with no fluorescence are indicated by asterisks (*).
  • Plasmid adjusted with Ringer's solution was injected into the tail vein of the mouse, and the liver was observed 72 hours later.
  • FIG. 11 shows a liver obtained by injecting only Ringer's solution into a C57BL mouse (WT mouse). '
  • FIG. 12 shows a liver in which Ringer's solution was injected into a transgenic mouse (eGFP mouse) which constantly expresses the EGFP protein.
  • FIG. 13 shows a liver obtained by injecting 100 ⁇ g of pUN0129 into an eGFP mouse.
  • FIG. 14 shows a liver obtained by injecting pMC-Cre plasmid (80 micrograms) and pUN0148 (20 micrograms) into an eGFP mouse.
  • the bottom is a bright-field observation, and the top is an ultraviolet lamp irradiation.
  • RNAi can be induced or released as appropriate.
  • a TG mouse or cell line can be appropriately prepared, and the prepared TG mouse or cell line controls the transcription product synthesis in a Cre enzyme-dependent manner. can do.
  • expression of an RNA gene can be appropriately induced.

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Abstract

PSEとTATAボックスの機能を損なわないように、一部の配列が、Cre組換え酵素によって特異的DNA組換えが起こるような配列で置換されていることを特徴とする、RNAポリメラーゼIIIプロモーターである。このRNAポリメラーゼIIIプロモーターは、遺伝子機能の解析に用いられるRNAi分子を、任意の時期に、あるいはある特定の組織（臓器）のみで誘導し得るような、条件付きRNAi誘導方法に使用することができる。

Description

明 細 書 新規 RNAポリメラーゼ IIIプロモーター及ぴその製造方法並びにその使用方 法 技術分野 本発明は、 新規 RNAポリメラーゼ IIIプロモーター及びその製造方法並び にその使用方法に関する。 更に詳しくは、 proximal sequence element (以下 「PSE」 と記載する。 ） と TATAボックスの機能を損なわないように、 一部の 配列が、 Cre組換え酵素によって特異的 DNA組換えが起こるような配列で置 換されていることを特徴とする、 RNAポリメラーゼ II Iプロモーター及びそ の製造方法並びにその使用方法に関する。 背景技術
φ、）
真核生物においては、 共通的に I型から I II型の 3種類の RNAポリメラー ゼが存在するが、 III型ポリメラーゼは、運搬 RNA (transfer RNA ;以下「tRNA」 と記載する。 ）や核内低分子 RNA ( small nuclear RNA；以下 「snRNA」 と記載 する。 ）といった低分子の RNA遺伝子の合成を行う。 III型ポリメラーゼによ る RNA合成は、 転写開始点が厳密に定まっており、 DNA上の 5つの連続した チミジン配列により転写を終結する。 加えて、 転写終結時に、 2から 3塩基 のアデニル付加を行う。 また、 III型ポリメラーゼのプロモーターは、 TATA ボックスを持つプロモーターと持たないプロモーターの 2種類がある。 TATA ボックスを持つ III型ポリメラーゼのプロモーターは、 以下に示す通り遺伝 子機能の解析などに利用されている。
ポストゲノムシークェンス時代においては、 遺伝子機能解析法として、 遺 伝子の塩基配列がわかればその機能を解析できる RNA干渉
(RNAinterference ; 以下 「RNAi」 と記載する。 ） などの逆遺伝学の手法が注 目されてきている。 RNAiは、 機能阻害したい遺伝子の特定領域と相同なセン ス RNAとアンチセンス RNAからなる二重鎖 RNA (double-stranded RNA ; 以下 「dsRNA」 と記載する。 ） が標的遺伝子の転写産物である mRNAの相同部分を 干渉破壊するという現象である。 ·
例えば、 合成した 3 0塩基対未満の dsRNA からなる短鎖インターフェア RNA分子 （small interfering RNA ; 以下 「s iRNA」 と記载する。 ） を哺乳類 細胞へ導入すると、 相同配列を持つ mRNAが分解され、 その結果、標的とされ た mRNAが翻訳される蛋白質の発現が著.しく低下する。 同様に、センス鎖とァ ンチセンス鎖 RNAを同時に、又は逆方.向反復配列のヘアピン RNA分子（hairpin RNA ; 以下 「hpRNA」 と記載する。 ） を発現する DNAベクターを哺乳類細胞へ 導入して RNAiを誘導できることが明らかとなった。 このとき、 RNAポリメラ ーゼ IIIプロモーターを用いた方法が開発されてきている。
Nature Biotech (2002) 20 : 446 - 448
Nature Biotech (2002) 19 : 497-500
RNAポリメラーゼ IIIプロモーターを用いた RNA合成方法により、 RNAiを 恒常的に起こす細胞を単離したり、 RNAiを起こすトランスジエニック （TG) マウスの作製が遺伝子機能解析の目的で試みることができるようになった。
Proc Natl Acad Sci U S A. (2002) 99 (8) : 5515- 20.
. FEBS Lett. (2002) 532 (1-2) : 227- 30
しかし、 RNAiは遺伝子発現を抑制する仕組みのため、 遺伝子発現を抑制す る標的遺伝子によっては、 細胞の生育に大きな影響を与え、 RNAiを起こす細 胞のクローニングができなかったり、 RNAiを誘導する TGマウスが胎生期死 亡を示すことが予測される。 また、 抑制遺伝子と表現型の異常の関連をより 厳密に証明するために、発生段階や特定の組織（臓器）でのみ RNAiを起こし、 遺伝子の機能解析を行う必要が生ずる。
これらのことから、 RNAiを任意の時期において誘導したり、 ある特定の組 織 （臓器） のみで RNAiを誘導し得るような条件付き RNAi誘導方法の確立が 期待されている。
一方、 ある条件下又はある組織の中でのみ標的遺伝子が欠損するように制 御できる方法として Cre - ΙοχΡシステムが開発され、例えばノックアウトマウ スなどの作製に用いられている。 特開平 1一 1 1 2 9 8 6号
このシステムは、 パクテリオフ'ァ"ジ PIの Cre組換え酵素が、 34塩基か らなる ΙοχΡ配列を認識し、 DNA組換えを起こして、 ΙοχΡ配列間領域のループ ァゥ トを行うことを利用している力 この Cre - ΙοχΡシステムは哺乳類動物細 胞においても働くことが知られている。 このシステムは、 プロモーターと目 的遺伝子の間に、 ΙοχΡ配列で囲まれたスタッファー （以下 「stuffer」 と記 載する。 ） を配した構成を用いると、 通常ではスタッファー内の遺伝子のみ が発現し、 目的の遺伝子は完全に発現が抑制される。 しかし、 Cre組換え酵 素を作用させると、 2つの ΙοχΡ配列間で相同組換えを起こし、 その結果、 ス タツファー遺伝子が除去されて、 目的の遺伝子発現が誘導される。
(別冊実験医学 ザ ·プロ トコールシリーズ 遺伝子の機能阻害実験法， P. 33-37, 田辺， 2001)
そこで、 本発明者等は、 これらの RNAi法と Cre- ΙοχΡシステムを組み合わ せることを試みたが、目的の遺伝子が RNAiを誘導する分子を転写する遺伝子 である場合、プロモーターと目的遺伝子の間に、 ΙοχΡ配列で囲まれた stuff er 配列を導入する上記の Cre- ΙοχΡシステムでは、 一方の ΙοχΡ配列が残される ため、これが目的遺伝子と同時に転写され、 RNAi分子内に挿入されてしまい、 RNAi分子として不適切な構造を取ってしまう。 その結果本来の目的である RNAiを起こすことができなかった。 発明の開示 本願発明者等は、 RNAポリメラーゼ IIIプロモーター内の一部を、 転写.に 必要な配列を崩さぬように ΙοχΡ配列で置換することにより、転写によっても ΙοχΡ配列が RNAi分子内に挿入されず、 RNAiを起こしうることを見いだし、 本願発明を完成したものであって、 その目的とするところは、 遺伝子機能の 解析に用いられる RNAi分子を、 任意の時期に、 あるいはある特定の組織 （臓 器） のみで誘導し得るような、条件付き RNAi誘導方法に使用することができ る新規 RNAポリメラーゼ IIIプロモーターを提供することにある。 また、 本発明の他の目的は、 トランスジエニック動物の作製に好適に使用 される新規 RNAポリメラーゼ II Iプロモーターを提供することである。
以下、 本発明を詳細に説明する。' ·
上述の目的は、 PSEと TATAボックスの機能を損なわないように、 一部の配列 が、 Cre組換え酵素によつて特異的 DNA組換えが起こるような配列で置換さ れていることを特徴とする、 RNAポリメラーゼ IIIプロモーターによって達 成される。
本発明の RNAポリメラーゼ IIIプロモーターは、 PSEと TATAポッタスの機 能を損なわないように、 一部の配列を、 Cre組換え酵素によって特異的 DNA 組換えが起こるような配列で置換することにより作製することができる。
Cre組換え酵素によって特異的 DNA組換えが起こるような配列で置換され る配列は、 転写開始点より一 5 0〜一 1の配列の何れかであることが好まし レ、。
本発明において用いられる Cre組換え酵素によって特異的 DNA組換えが起 I こるような配列としては、 例えば ΙοχΡ配列やその改変体等が挙げられる。
ΙοχΡ配列とは、 配列特異的な 13塩基 （ATAACTTCGTATA) のィンバートリピ ート配列と、 配列非特定な 8塩基のスぺーサー配列の、 34塩基対からなるも のである （第 1図 （B ) ) 。
その改変体としては、 スぺーサー配列を置換したもの， あるいは、 スぺー サー配列とインバートリピート配列の一部を置換したもの等が挙げられ、 具 体例としては、 例えば特開平 11-196880号公報において示されているような ものが挙げられる。 ΙοχΡ配列は、 ΙοχΡ配列の 1 0〜2 5力 、 置換後のプロモ 一ターにおいて、 TATAボックスとして機能するような位置に、 置換すること が好ましい。
本発明において用いられる RNAポリメラーゼ II I プロモーターとは、 hpRNA や s iRNAを合成する RNAポリメラーゼ IIIが、 転写開始時に結合する配列で あるが、 例えば、 転写開始点より上流に転写制御領域を持つ、 H1 RNA遺伝子 のプロモーター及び U6 RNA遺伝子のプロモーターなどが用いられる。 また、 本発明の RNAポリメラーゼ II Iプロモーターとしては、 ヒ ト由来又 はマウス由来などのプロモーターの何れもが使用できる。 +
特に好ましい本発明の RNAポリメラーゼ IIIプロモーターと .して、 以下に 示す RH - loxPプロモーター（RNAi inducible HI RNA gene promoter - loxP sequence fusion promoter)力 S挙けり る。
以下に、 RH_loxPプロモーターを具体例として更に本発明を詳細に説明す る。
RH-loxPプロモーターの作製：
RNAポリメラーゼ IIIプロモーターは、 tRNAや snRNAといった低分子 RNA 遺伝子の合成に適する。 TATAボックスを持つ I II型プロモーターは、 転写開 始点と転写終結点が定まっていることが知られる （背景技術の項、 参照） 。 的確な RNA分子の合成が要求される RNAi誘導において、上述の RNAポリメ ラーゼ IIIの転写特性は、 s iRNA及び hpRNA分子の合成に適切である。
この RNAポリメラーゼ IIIプロモーターの 1つ、 HI RNA遺伝子プロモータ 一は、プロモーターの構造が良く調べられており、ォクタマ一（以下「0ctamer」 と記載する。 ） 配列 （-97から - 90) 、 スタッフ （以下 「Staf」 と記載する。 ） 結合配列 （-88 から -69)、 PSE配列 （- 68 から- 51) 、 TATAボックス（-30 から - 26)が転写に重要な配列であることが示されている （第 1図 （A ) ) 。 特に、 TATAボックスと PSEは、 この両配列の存在とその転写開始点'からの 距離が、 RNAポリメラーゼ II Iの転写を行う際に必須となる。
loxP配列は、 上述したように、 配列特異的な 13塩基 （ATAACTTCGTATA) のィ ンバートリピート配列と配列非特定な 8塩 '基のスぺーサー配列の 34塩基対よ り構成される （第 1図 （B ) ) 。
従って、 この loxP配列を、 HIプロモーターの一 3 9から一 6に置換する ことによって、転写に必要な上記 4つの配列（Octamer配列， Staf 結合配列， PSE配列， TATAボックス配列） を崩さぬように、 しかも loxP配列内の TATA 配列（10から 14)が、 HIプロモーター内の TATAボックス配列と同位置に置き 換えられるため、 TATAボックスの機能も損なわずに、 RH-loxPプロモーター を作製することができる。 上記 loxP配列について更に説明を加える。
loxP配列の変換と位置： .
loxP配列は、上述の通り、 13塩基のィンパートリピート構造と 8塩基のス ぺーサ一配列からなる 34塩基対 DNA配列である。固定化されているィンバー トリピート構造に比べて、 スぺーサー配列は塩基置換が容易である。 上述の 例では RH- loxPプロモーターの作成に際し、 loxP配列による置換は、 loxP 配列内の TATA配列（10から 14) を利用し、 HIプロモーターの TATA配列（-30 から - 26) を崩さずに、 HIプロモーターの転写開始点より- 39から- 6の位置 へ行っている。 しかし、 スぺーサ一の配列を変換させたり、 loxP配列内の他 の TATA酉己歹 IJ (22力、ら 25) を利用することにより、 プロモーターの TATAボッ クス配列の転写開始点からの距離を変えずに、 loxP配列による置換を行うこ とが可能である。 このようなプロモーターは、 RH_loxPプロモーターと同様 に機能し得る。
尚、 本発明の RNAポリメラーゼ IIIプロモーターは、 Cre組換え酵素によ つて特異的 DNA組換えが起こるような配列， PSE， 及ぴ TATAボックスの機能 を損なわないように、 遺伝子配列が欠失， 付加， 置換， 挿入されているもの も含まれる。
本発明の RNAポリメラーゼ IIIプロモーターは、 以下のように使用するこ とができる。
( 1 )本発明の loxP配列を含む RNAポリメラーゼ IIIプロモーターの下流に、 スタツファー配列、 もう一つの loxP配列と RNAi誘導配列の融合配列の順に 配した構成を作る。 このような構造は、 スタッファー内のみを転写し、 RNAi を誘導する RNA分子は誘導されない。 しかし、 Cre組換え酵素 （以下 「Cre 酵素」 と記載する。 ） を作用させると、 スタッファー配列が除去され、 RNAi 分子を誘導することができる。
( 2 ) また、本発明の loxP配列を含む RNAポリメラーゼ IIIプロモーターの 下流に目的の RNAi誘導配列を揷入し、 更に下流にもう 1つ.の loxP配列を挿 このような構造は、 もともと RNAiを誘導することができるが、 Cre酵素を 反応させ、 2つの ΙοχΡ配列に挟まれた RNAi誘導配列を除去することによつ て、 RNAiを解除することができる。
( 3 )更に、本発明の ΙοχΡ配列を含む RNAポリメラーゼ II Iプロモーターと もう 1つの ΙοχΡ配列により転写産物発現を制御できる系を利用して、 TGマ ウスや細胞株を作製することができる。 作製した TGマウスや細胞株は、 Cre 酵素依存的に転写産物の発現を制御することができる。
( 4 )更に、本発明の ΙοχΡ配列を含む RNAポリメラーゼ IIIプロモーターは、 RNA遺伝子の発現を誘導することができる。 即ち、 本発明の RNAポリメラー ゼ IIIプロモーターは、 RNAi誘導配列を持つ転写産物に限らず、 いかなる転 写産物も転写可能である。 しかも、本発明の ΙοχΡ配列を含む RNAポリメラー ゼ I IIプロモーターと、,もう 1つの ΙοχΡ配列との間に目的とする転写産物遺 伝子を導入することにより、 転写の誘導及び解除ができる。 図面の簡単な説明 ' 第 1図は、 プロモーター配列と ΙοχΡ配列を表す図である。
( A ) ： ヒ ト HI RNA遺伝子プロモーター
( B ) ： ΙοχΡ配列
( C ) ： RH-loxPプロモーター
第 2図は、 pcDNA3. 1 プラスミ ド， pUN0126, pUN0137の各々を導入した場合の、 明視野による細胞観察結果を表す図である。
第 3図は、 pcDNA3. 1プラスミ ド， pUN0126，pUN0137の各々を導入した場合の、 蛍光視野による細胞観察結果を表す図である。
第 4図は、第 2図と第 3図を重ね合わせた図である。 アスタ リスク （* ) は、 蛍光が認められない細胞を表す。
第 5図は、 Cre酵素による RH-loxPプロモーターの反応の概略
第 6図は、 pUN0147と pUN0148の Cre酵素により生じた組換え体 （pUN0149 と ρΙ ΟΙδΟ) の電気泳動図である。 図中、 「ori」 とは、 Cre酵素による組み 換え前の全長プラスミ ドであり、 「recombinant」 とは、 Cre酵素による組み 換え後のプラスミ ドである。
第 7図は、 pUN0147と pUN0149、 pUN0148と pUN0150の RH - ΙοχΡプロモーター 転写開始点近傍の DNA配列を表す図である。
第 8図は、 pUN0148のみ， あるレ、は pUN0148と pMC- Creプラスミ ドを同時に 導入した場合の、 蛍光視野による細胞観察結果を表す図である。
第 9図は、 pUN0148のみ， あるいは pUN0148と pMC - Creプラスミ ドを同時に 導入した場合の、 明視野による細胞観察結果を表す図である。
第 1 0図は、 第 8図と第 9図を重ね合わせた図である。 アスタ リスク （ * ) は、 蛍光が認められない細胞を表す。
第 1 1図は、 C57BLマウス （WT型マウス） へ、 リンゲル溶液のみを注入した 肝臓を示す図である。
第 1 2図は、 EGFP蛋白質を恒常的に発現する トランスジエニックマウス
(eGFPマウス） へ、 リンゲル溶液を注入した肝臓を示す図である。
第 1 3図は、 eGFPマウスへ、 pUN0129を 100 マイクログラム注入した肝臓 を示す図である。
第 1 4図は、 eGFPマウスへ、 pMC- Creプラスミ ド（80 マイクログラム） と pUN0148 (20 マイクログラム） を注入した肝臓を示す図である。
第 1 5図は、 第 1 1 〜 1 4図に関する、 マウス生体に'おける EGFP発現量を、 リンゲル溶液のみを注入した時の蛍光強度を 1 0 0とした場合の、 相対値で 表した図である。 発明を実施するための最良の形態 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
本発明に用いた細胞とマウスは以下のようにして入手した。
HB- EGF遺伝子と YFP (ye l low fluorescent prote in)融合蛋白質を発現してい る HT1080/HB- EGF~YFP細胞は、 愛媛大学より供与を受けた。 EGFP (enhanced green fluorescent protein) 発現卜フンスンエニックマウス (C57BL/6-TgN (ACTbEGFP) 10sb；以下「eGFPマウス」 と記載する。）は、 Charles River Japan Inc.より購入した。 実施例 1 '
( 1 ) プラスミ ドの作製：
(ヒ ト HIプロモーターの作製）
ヒ ト HIプロモーターは、 ヒ トゲノム DNAより、 次の DNAプライマー （hHl/#3 D -ggaattcttatagggagctgaagggaagg^ hHl/#2
5 -gggatccgaagactatgggaaagagtggtctcatacag を用レヽて、 PCR tこて増 ||¾し た。増幅した断片は、制限酵素 Eco RI と Bam HIで切断し、 pZErO I (Invitrogen Corp. , Carl sbad, CA， USA)の Eco RI と Bam HI部位へクローユングした (pUN0115) 。
(プラスミ ド pUN0126の作製）
HIプロモーターに依存し、 HB-EGF遺伝子に対する RNAiを起こすプラスミ ド pUN0126を作製するために、 以下の DNAプライマー （HB- EGF— K02 5， - cagggcccaaaaaagctctttctggctgcagttctcttgaaactgcagccagaaagagctgggaaaga gtggtctc、hHl/#5 5 -gctcgagttatagggagctgaagggaagg と pUN0115を用レヽて、 PCRを行い、 pZErO Iの Eco RV部位へクローニングした。 · (プラスミ ド PUN0137の作製）
RH-loxPプロモーターに依存し、 HB-EGF遺伝子に対する RNAiを起こすプラス ミ ド pUN0137を作製するために、 DNAプライマー （HLX
5-gggatccaaaaaagctctttctggctgcagtttctcttgaaaactgcagccagaaagagctgggaa ataacttcgtataacagaacttatacgaagttataatccaaagacatttcac hHl/ff4
5 ' -gactagtttatagggagctgaagggaagg) と pUN0115を用いて、 PCRを行い、 制 限酵素 Spe I と Bam HIで切断し、 pZErO 2 (Invitrogen Corp. , Carl sbad, CA, USA. )の Spe Iと Bam HI部位へクローニングした。
(プラスミ ド pUN0147の作製）
Cre酵素に依存し、 HB-EGF遺伝子に対する RNAiを起こすプラスミ ド PUN0147は、 次のように作製した。 はじめに、 DNAプライマ一 (L/H 5， -^cctgcaggggaaataacttcgtataac^ hHl/#5 5， -gctcgagttatagggagctgaagggaagg) と pUN0137を用レヽて、 pUN0137のプロ モーター部位のみを PCR増幅し、 pZErO Iの Eco RV部位へクローニングした。 塩基配列を読み、 L/Hプライマーの配列が pZErO Iの Pst I部位の隣に位 置するクローンを単離した （pUN0142) 。 '.
更に、 DNAフライマー (L-Sp 5 ' -actagtcatgataacttcgtataagttctg^ M13 r 5 ' -caggaaacagctatgac)と pUN0137を用いて、 pUN0137の loxP配列と HB - EGF 遺伝子に対する RNAi誘導配列を PCR増幅し、 制限酵素 Bam HI と Spe Iで切 断し、 pZErO Iの Bam HI と Spe I部位へクローユングした （pUN0144) 。 最終的に、 pUN0147は、 pUN0142を制限酵素 Pst Iと Pvu IIで切断し、 RH- loxP プロモーターを含む配列を、 pSV40/Zeo 2 (Invi trogen Corp. , Carlsbad, CA， USA. )の Pst Iと Pvu II部位へクローニングし （pUN0143) 、 更に、 pUN0144 を制限酵素 Bam HI と Xba Iで切断した loxP配列を含む断片を、 pUN0143の Nhe I と Bgl II部位へ挿入した。
(プラスミ ド pUNO 8の作製）
また、 Cre酵素に依存して、 YFP遺伝子に対する RNAiを起こすプラスミ ド PUN0148は、 DNAオリゴマー (EGLX_ (AS)
5 -cgagatctaaaaaacggccacaagttcagcgtgtctcttgaacacgctgaacttgtggccgtgg g、 EGLX— (S)
5 ' -Ggtcatgaataacttcgtataagttctgttatacgaagttatttcccacggccacaagttcagc ) を合成、 アニーリング、 PCR増幅し.、 pZErO Iの制限酵素部位 Eco RVへク ローニングした。 塩基配列を読み、 EGLX— (AS)プライマーの配列が pZErO I の Bam HI部位の隣に位置するクローンを単離した （pUN0145) 。
pUN0145を制限酵素 Bam HIと Xba Iで切断した loxP配列を含む断片を、 PUN0143の Nhe I と Bgl II部位へ挿入した。
(マウス U6プロモーターの作製）
マウス U6プロモーターは、 マウスゲノム DNAと次の DNAプライマー （DNA プラ マー 、mU6/#l 5 -ggaattcatccgacgccgccatctcta mU6/#2 5， -gggatccgaagaccacaaacaaggcttttctccaa) を用いて PCR増幅した。 増幅 した断片は、 制限酵素 Eco RIと Bam HIで切断し、 pZErO Iの Eco RI と Bam HI部位へクロ ニングした （pUN0117)
(プラスミ ド PUN0129の作製）
U6プロモーターに依存して、 YFP遺伝子に対する RNAiを起こすプラスミ ド PUN0129を作製するために、 DNAプライマー （EGFP_K01
5 -cggatccaaaaacggccacaagttcagcgtgtctcttgaacacgctgaacttgtggccgaaaca aggcttttctc, mU6/ぉ丄 5 —ggaattcatccgacgccgccatctctaリ と pUN0117を用レヽ て、 PCR増幅した。 増幅した断片は、 制限酵素 Eco RI と Bam HIで切断し、 pZErO I の Eco RIと Bam HI部位へクローニングした。
( 2 ) トランスフエクシヨン ：
HT1080/HB- EGF~YFP細胞は、 HB- EGF遺伝子と YFP遺伝子の融合蛋白質を発 現してレヽる。 様々なプラスミ ドは、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA, USA. )で、 HT1080/HB- EGF~YFP細胞へ遺伝子導入された。
Lipofectamine 2000 (3. 0 マイクロリッ トノレ） ίま、 100 マイクロリ ッ トノレの Opt i-MEM (Gibco)へ希釈し、 5分間室温に置いた。 DNA (1. 6 マイクログラム） を、 100 マイクロリ ットル Opti - MEMへ希釈した。 これらの溶液を混合し、 20分間室温に置いた。 そして、 混合液を 1 mlの Opti- MEMと 12 wel lプレー トの細胞へ加えた。 4時間後、 DNA/Lipofectamine混合液は除き、 培養液へ 置き換えた。
( 3 ) Cre-loxP組換え反応：
PUN0147あるいは pUN0148の Cre組換え反応は、 Clontech Laboratories, Inc.より購入した Cre組換え酵素を用いて行った。 200 ngのプラスミ ドを、 1 マイクロリ ッ トル Cre酵素、 2 マイクロリ ッ トル 10xノ ッファー、 2 マイ クロリ ッ トル BSA ( lmg/ml) の加わった 20 マイクロリ ッ トル反応溶液中で、 室温で 15分間反応させた。 反応後、 70°Cで、 酵素を失活させるために、 5分 間保温した。
( 4 ) マウスへの遺伝子導入： 100 マイク口グラムのプラスミ ド DNAを 3 mlのリンゲノレ溶液（147 mM NaCl, 4mM KC1, 1. 13 mM CaC12) へ希釈した。 尾静脈注入を、 27- gauge針を通して、 7秒で行った。
以下に RH- ΙοχΡプロモーターを使用して行った試験結果を例示する。
( 1 ) RH-loxPプロモーターによる RNAi誘導：
設計した RH-loxPプロモーターが RNAiを誘導するか否かを確かめるために、 RH-loxPプロモーターあるいは HIプロモーターの下流に、 ヒ ト HB- EGFに対 する RNAi誘導配列 （hpRNA) を挿入した。 HIプロモーターより hpRNAが転写 されるように設計した PUN0126， 及び RH- ΙοχΡプロモーターより hpRNAが転 写されるように設計した pUN0137， そして対照として、 pcDNA3. 1プラスミ ド を、各々 HB- EGF- YFP融合蛋白質を発現している HT1080/HB_EGF~YFPへ導入し た。
そして、 48時間後に、 HB- EGF遺伝子の発現抑制効果を、 YFP蛋白質の発光 の蛍光顕微鏡観察により確認した。
第 2図は、 pcDNA3. 1プラスミ ド， pUN0126, pUN0137の各々を導入した場合 の、 明視野による細胞観察結果である。
第 3図は、 pcDNA3. 1プラスミ ド， pUN0126, pUN0137の各々を導入した場合 の、 蛍光視野による細胞観察結果である。
HB- EGF〜YFP 融合蛋白質の存在が緑色の発光によって観察された。
第 4図は、 第 2図と第 3図を重ね合わせたものである。
( C ) では、 ほぼすベての細胞が HB - EGF~YFP 蛋白質を発現していることが 確認された。
( F ) では、 アスタリスク （* ) で示した細胞において、 HT1080/HB- EGF~YFP 由来の緑色の発光が認められなかった。
( I ) においても、 アスタリスク （* ) で示す様に、 HB- EGF~YFP由来の緑色 の発光が認められない細胞が観察された。
これは、 pUN0126によって、 HB - EGF遺伝子発現が抑制されたことを示す。 したがって、 HIプロモーターより転写される hpRNAは、 RNAiを引き起こすこ とが確認、された。 また、 YFP遺伝子に対する hpRNA分子を RH-loxPプロモーターより転写す るように設計したプラスミ ド pUN0150の HT1080/HB- EGF~YFP細胞への遺伝子 導入は、 YFP遺伝子に対する hpRNA分子をマウス U6 RNA 遺伝子プロモ^"ター より転写するように設計したプラスミ ド pUN0129の HT1080/HB- EGF~YFP細胞 への遺伝子導入と同様に HB - EGF~YFPの存在量を減少させ、 RNAi効果を示し た。
RH-loxPプロモーターに依存して、 hpRNA分子を転写するように設計したプ ラスミ ド（PUN0137と pUN0150)の HT1080/HB-EGF~YFP細胞への遺伝子導入によ り、目的遺伝子産物の RNAi効果が認められたので、 RH_loxPプロモーターは、 RNAポリメラーゼ IIIプロモーター（HIプロモーターと U6プロモーター） 同 様に、 RNAiの誘導に有効に働き、 hpRNA分子の転写合成に適切であることを 示している。
( 2 ) RH-loxPプロモーターの Cre酵素による組換え反応：
設計した RH- 10 xPプロモーターが Cr e酵素による 1 oxP配列特異的組換え反応 を行うかを確かめるために、 pUN0147及び pUN0148プラスミ ドを作製した。
PUN0147は、 SV40/Zeo2の制限酵素部位 Pvu Iから制限酵素部位 Pst Iの 方向へ RH-loxPプロモーターを揷入し、 更に、 制限酵素部位 Nhe I から 制 限酵素部位 Bgl IIの方向へ RH- ΙοχΡプロモーター配列の- 39から- 1に一致す る配列 （ΙοχΡ配列 + ttccc) と HB - EGF遺伝子に対する hpRNA配列との融合配 列を挿入し作製した（第 5図）。
尚、 pUN0148は、 pUN0147の HB- EGF遺伝子に対する hpRNAの代わりに、 YFP 遺伝子に対する hpRNAを揷入することによって作製した。
PUN0147と 148を精製 Cre酵素と反応させた。 反応後、 未反応プラスミ ド を減らすため、 制限酵素 Sal I と Bam HIにより反応させた後に、 大腸菌へ形 質転換し、 シングルクローンを得た。
得られたクローンは、 アンピシリ ン培地とゼォシン培地へ、 爪楊枝で広げ ることにより、 スクリーニングを行った。
PUN0148と pUN0147は、 アンピシリ ン耐性遺伝子とゼォシン耐性遺伝子を 持ち、 これらのクローンは両抗生物質に対して耐性である。 しかし、 組換え 体は、 アンピシリ ン耐性遺伝子しか持たず、 ゼォシン培地での増殖は行えな レ、。
スクリ一エングの結果、 83%のクローンがアンピシリン而性かつゼォシン感 受性であった。 したがって、 このようなクローンは、 PUN0149や pUN0150に 示すようなゼォシン耐性遺伝子を失った組換え体であることが期待される (第 5図） 。
ゼォシン耐性を失ったクローンが、 loxP配列特異的に組換え反応を起こし、 ゼォシン耐性遺伝子を含む loxP配列間領域（1. Ikbp) をループァゥトした結 果であるかを確かめるために、 プラスミ ドを抽出し解析した。
第 6図は、 組換え反応により、 ゼォシン耐性を失ったクローンよりプラス ミ ドを抽出し解析した結果である。 ゼォシン耐性を失ったクローンは、 組換 え反応前のプラスミ ドの長さに比べて、プラスミ ドの長さが短くなつていた。 これは、 Cre酵素により、 loxP配列間でループアウ トを行った結果であるこ とが期待される。
最終的に、 Cre反応により得られた組換え体の DNA配列を調'ベた（第 7図）。 Cre酵素反応前、 転写開始点には pSV40/Zeo2由来の配列が認められる。 しか し、 Cre酵素反応後、 転写開始点には、 新 に RNAi誘導配列が挿入されてい た。 また、 loxP配列間のゼォシン耐性遺伝子を含む領域の DNA配列は認めら れなかった。 したがって、 Cre酵素に依存し、ゼォシン耐性遺伝子を含む loxP 配列間領域は、 ループァゥトし、 RNAi誘導配列が転写開始点に配置されたと いえる。
これらの結果は、 RH-loxPプロモーターが、 Cre酵素により、 loxP配列特 異的組換え反応を起こすことができることを示している。
( 3 ) Cre_loxP組換え反応による RNAi誘導：
pUN0148が、 細胞内で Cre酵素に依存して組換え反応を起こし、 RNAiを誘 導するかを確かめるために、 HT1080/HB- EGF~YFP細胞へ、 pUN0148と Cre酵素 を発現する pMC- Creプラスミ ドを同時導入し、 48時間後に、 YFPの発光を蛍 光顕微鏡で観察することにより、 RNAi効果を確かめた。 第 8図は、 pUN0148のみ， あるいは pUN0148と pMC- Creプラスミ ド'を同時 に導入した場合の、 蛍光視野による細胞緝察結果である。
第 9図は、 pUN0148のみ， あるいは pUN0148と pMC_Creプラスミ ドを同時 に導入した場合の、 明視野による細胞観察結果である。
第 1 0図は、 第 8図と第 9図を重ね合わせたものである。
PUN0148を導入した細胞は、 ほぼすべてに蛍光が認められたので、 YFP蛋白質 はほぼすベての細胞に存在している。 一方、 pUN0148 と pMC- Creプラスミ ド を同時導入した細胞は、 明視野で確認した細胞の 80%は蛍光が観察されたが、 その 20%は蛍光が観察されなかった （第 8図 （D ) , 第 9図 （E ) , 第 1 0 図 （F ) ) 。
プラスミ ド導入により蛍光を失った細胞は、 pUN0148を導入した細胞に比 ベ、 pUN0148と pMC- Creを同時導入した細胞において明らかに多かった。
この結果は、 pUN0148導入細胞は RNAi効果を起こさないが、 pUN0148と pMC-Creの同時導入細胞は RNAi効果を起こすことを示している。
従って、 pUN0148と pMC_Creの同時導入細胞において、 pUN0148は、 pMC- Cre より発現する Cre酵素により、第 5図で示したような Cre- loxP組換え反応が 起こり、 RNAi誘導組換体へ変化したことを示している。
( 4 ) マウス生体における RNAi効果：
上述の通り、 細胞内では、 Cre酵素により pUN0148から RNAi効果を誘導でき た。
次に、 同様のことが、 マウス生体においても観察できるかを確かめた。 EGFP遺伝子を発現する トランスジエニック （EGFP TG；以下 「eGFP」 と記載 する。 ） マウスの尾の静脈より、 100マイクログラムのプラスミ ドを含む 3ml のリンゲル溶液を注入し、 72時間後に、 肝臓に紫外線を当て、 EGFP蛋白質の 存在を観察した。
更に、 肝臓を摘出し、 以下の方法で、 EGFP蛋白質量を定量した。
それぞれの肝臓を、 PBS溶液中でホモジ工ナイズし、 lOOOrpmで遠心し、 上 清を分離し、 抽出液を得た。 蛋白質量を測定し、 それぞれの肝臓から得た抽 出液中の蛋白濃度を合わせた。 蛋白質中に含まれる EGFP量は、 POLARstar (Biotechnology&Life Sciences) を用いて、 蛍光強度を測定し、 eGFPマウ スへ、 リンゲル溶液のみを注入した肝臓からの試料の蛍光強度を 100 とし 場合の、 各資料の蛍光強度の相対値で表した。 '
対照として、 eGFPマウスにリンゲル溶液のみを注入したマウスでは、 C57BL (野生型；以下 「WT型」 と記載する。 ） マウスにリンゲル溶液のみを注入し た肝臓 （第 1 1図） と比較して、'明らかに EGFPの存在が確認できた （第 1 2 図） 。
次に、 pUN0129プラスミ ドは、 前述の如く、 YFP遺伝子に対する RNAi効果 を誘導するプラスミ ドであるが、 その誘導に際して認識する配列は、 EGFP遺 伝子の転写産物内にも存在する。 そこで、 pUN0129プラスミ ドを、 eGFPマウ スに注入したところ、 EGFPの発現の低下を肝臓（中間葉）にて観察できた（第 1 3図） 。
また、 EGFP量を定量した時、 pUN0129を注入した eGFPマウスの肝臓におけ る EGFP量は、 リンゲル溶液のみを注入した eGFPマウスの肝臓における EGFP 量と比べて、 49%低下していた （第 1 5図） 。
同様に、 PUN0148は、前述の如く、pMC- Creプラスミ ドと共に用いた場合に、 YFP遺伝子に対する RNAi効果を誘導するプラスミ ドであるが、その誘導に際 して認識する配列も、 EGFP遺伝子の転写産物内に存在する。 そこで、 pUN0148 と pMC- Creプラスミ ドを eGFPマウスに同時注入した。 この場合の肝臓は、 ド ッ ト状に、 EGFP蛋白質による発光が失われ （第 1 4図） 、 EGFP量は 67°/。低下 した （第 1 5図） 。
この結果は、 HT1080/HB- EGF~YFP培養細胞において、 UN0148が Cre酵素に より RNAi誘導プラスミ ドへ組換えられた結果 （第 8〜 1 0図） と同様に、 マ ウス肝臓において発現した Cre酵素が、 pUN0148プラスミ ドを RNAi誘導プラ スミ ドへ組換え、 EGFP遺伝子の発現抑制を行ったことを示すものと考えられ る。
これらの結果は、 ΙοχΡ配列を含む RH- ΙοχΡプロモーターは、 マウス生体にお いても、 Cre酵素に依存して、 RNAi効果を誘導できることを示している。 以下、 図面について説明する。 (第 1図 ： プロモーター配列と ΙοχΡ配列） .
(A) ヒ ト HI RNA遺伝子プロモーター '
- 97力、ら- 90は Octamer配列、 -88から- 69は Staf 結合領域、 -68力 ら -51 は PSE配列、 -30から -26は TATA- box、 +1は転写開始点を示す。 数字は、 転 写開始点からの塩基数を示す
(B) ΙοχΡ配列
1から 13 と 22から 34に対応する 13塩基のィンパートリピート構造を持 つ。下線は ΙοχΡ配列内の 8塩基からなる可変スぺーサー配列を示す。数字は、 塩基数を示す。
(C) RH—loxPプロモーター
RH_loxPプロモーターは、 HI RNA遺伝子プロモーターを基盤として改変し た。 HIプロモーターの- 39から- 6番目を、 （B) で示した ΙοχΡ配列と置換 した。 ΙοχΡ配列は大文字で示し、 下線は ΙοχΡ配列の可変スぺーサ一に一致 する。 Octamer配列 （-97から - 90) 、 Staf 結合領域 （- 88から - 69) 、 PSE配 列 （-68から- 51) 、 TATA-box (-30から- 26) 、 +1の転写開始点は （A) と 同じである。
(第 1図 （C) の配列中、 大文字は ΙοχΡ配列を表す。 下線部は、 1'oxP配列 の可変スぺーサーを表す。 + 1は、 転写開始点を表す。 ）
(第 2〜 4図： RH-loxPプロモーターから合成された hpRNAによる HB - EGF遺 伝子発現抑制）
pcDNA3.1プラスミ ド （第 2図 （A) , 第 3図 （B) , 第 4図 （C) ) 、 HB-EGF 遺伝子に対する RNAi誘導配列 hpRNAを HIプロモーターから合成するプラス ミ ド pUN0126(第 2図 （D) , 第 3図 （E) ， 第 4図 （F) )、 又は HB-EGF遺 伝子に対する RNAi誘導配列 hpRNAを RH_loxPプロモーターから発現するプラ ス ミ ド pUN0137(第 2図 （G) ， 第 3図 （H) , 第 4図 （ I ) )を、 HB- EGF遣 伝子と YFP遺伝子の融合蛋白質を恒常発現する HT1080/HB- EGF~YFP細胞へ 各々遺伝子導入し、 48時間後に明視野 （第 2図） あるいは蛍光視野 （第 3図） で観察した。 第 4図は、 第 2図と第 3図を重ね合わせ、 蛍光が認められない 細胞をアスタ リスク （*) で示したものである。 (第 5〜 7図 ： RH- ΙοχΡプロモーターの Cre.酵素による反応） 第 5図 ： Cre酵素による RH-loxPプロモーターの反応の概略
pUN0147は、 RH-loxPプロモーター、 スタッファー配列 （Zeocine耐性遺 伝子を含む 1. lkbpの配列） 、 RH-loxPプロモーター配列の- 39から- 1に一致 する配列 （ΙοχΡ配列 +ttccc) と HB- EGF遺伝子に対する hpRNA合成配列の融 合配列を持つ。
PUN0148は、 RH-loxPプロモーター、 スタッファー配列 （Zeocine耐性遺伝 子を含む 1. lkbpの配列） 、 RH-loxPプロモーター配列の- 39から- 1に一致す る配列 （ΙοχΡ配列 +ttccc) と YFP (又は EGFP)遺伝子に対する hpRNA合成配 列の融合配列を持つ。
PUN0147と pUN0148は、 RH-loxPプロモーターの転写開始点に、 hpRNA合成 配列を持たない。
PUN0147と pUN0148は、 Cre酵素反応により、スタッファー配列がループア ゥトし、 RH- ΙοχΡプロモーターの転写開始点に、 hpRNA合成配列を持つプラス ミ ド PUN0149と pUN0150にそれぞれが変化する。
PUN0147と pUN0148は抗生物質アンピシリンとゼォシンに対する耐性遺伝 子を持つが、 pUN0149と pUN0150はアンピシリ ン耐性遺伝子しか持たない。 図中には、 制限酵素部位、 Pvu II， Pst I, Sal I， BamHI, Nhe I と Bgl II を示した。 また、 図中の矢印は、 RH-loxPプロモーターの転写の方向性を示 す。
第 6図 ： pUN0147 と pUN0148の Cre酵素により生じた組換え体 （pUN0149と PUN0150) の電気泳動図
PUN0147と pUN0148を、 各々試験管内で Cre酵素と反応させた。 制限酵素 Sal I と Bam HIを用いて反応した後に'、 大腸菌へ形質転換し、 クローンを得 た。 スクリーニングにより、 抗生物質アンピシリン耐性かつ抗生物質ゼオシ ン感受性のクローンを得て、 それぞれのクローンよりプラスミ ドを抽出し、 0. 8%ァガロースゲルを用いて、 電気泳動解析した。 レーン 1は Cre酵素未反応の pUN0147、 レーン 2は pUN0147を Cre酵素反 応して得た組換え体 pUN0149、 そして、 レーン 3は pUN0148を Cre酵素反応 して得た組換え体 ρΙ ΟΙδΟを示す。
第 7図： pUN0147と pUN0149、 pUN0148 と pUN0150の RH- loxPプロモーター転 写開始点近傍の DNA配列
DNAプフィマ1 ~ (M13 (- 20) Forward primer； 5 -gtaaaacgacggccagt) を 用いて、 DNA配列を解析した。 転写開始点には +1を示した。 また、 四角で囲 つた部分は hpRNA内の相同配列、 下線部は hpRNA内のループ構造、 二重下線 部は転写終結配列を示す。
(第 8 〜 1 0図： Cre酵素で誘導される hpRNAによる HB- EGF~YFP遺伝子発現 抑制）
pUN0148 (A〜C)， 又は pUN0148と pMC— Cre (Cel l , 1993, 73， 1155—1164) (D〜F) を HB- EGF遺伝子と YFP遺伝子の融合蛋白質を恒常発現する
HT1080/HB- EGF~YFP細胞へ遺伝子導入し、 48時間後に蛍光視野（A, D)あるいは 明視野（Β, Ε)で観察した。 （C， F)は、 朋視野と蛍光視野にて観察した同一視野 の図を重ね合わせ、 蛍光が認められない細胞をアスタリスク （* ) で示した ものである。
(第 1 1 〜 1 4図 ： マウス生体における Cre酵素で誘導される hpRNA発現に よる EGFP遺伝子発現抑制）
マウスの尾静脈より リンゲル溶液で調節したプラスミ ドを注入し、 72時間 後に肝臓を観察した。
第 1 1図は、 C57BLマウス （WT型マウス） へ、 リンゲル溶液のみを注入した 肝臓を示す。 '
第 1 2図は、 EGFP蛋白質を恒常的に発現する トランスジエニックマウス ( eGFPマウス） へ、 リンゲル溶液を注入した肝臓を示す。
第 1 3図は、 eGFPマウスへ、 pUN0129を 100 マイク口グラム注入した肝臓を 示す。
第 1 4図は、 eGFPマウスへ、 pMC- Creプラスミ ド（80 マイク口グラム） と pUN0148 (20マイクログラム） を注入した肝臓を示す。 下は明視野による観察、 上は紫外線ランプ照射による観察である。
産業上の利用可能性 本発明の RNAポリメラーゼ II Iプロモーターを使用することにより、 適 宜、 RNAi を誘導あるいは解除することができる。 また、 本発明の RNAポリメ ラーゼ IIIプロモーターを使用することにより、 適宜、 TGマウスや細胞株を 作製することができ、 作製した TGマウスや細胞株は、 Cre酵素依存的に転写 産物の合成を制御することができる。 更に、 本発明の RNAポリメラーゼ II I プロモーターを使用することにより、 適宜、 RNA遺伝子の発現を誘導するこ とができる。

Claims

請 求.. の 範 囲
I . PSEと TATAボックスの機能を損なわないように、 一部の配列が、 Cre組換 え酵素によって特異的 DNA組換えが起こるような配列で置換されていることを 特徴とする、 RNAポリメラーゼ IIIプロモーター。 .
2 . 一部の配列が、 転写開始点より一 5 0〜一 1の配列の何れかであることを 特徴とする、 請求項 1に記載の RNAポリメラーゼ IIIプロモーター。
3 . Cre組換え酵素によって特異的 DNA組換えが起こるような配列が、 ΙοχΡ配 列であることを特徴とする、 請求項 1又は 2に記載の RNAポリメラーゼ IIIプ ロモ1 ~タ ' ~。
4 . ΙοχΡ配列の 1 0〜 2 5の配列が TATAボッタスとして機能するような位置 にあることを特徴とする、 請求項 3に記載の RNAポリメラーゼ IIIプロモータ
5 . プロモーターが HI RNA遺伝子又は U6 RNA遺伝子のプロモーターであるこ とを特徴とする、 請求項 1乃至 4の何れかに記載の RNAポリメラーゼ IIIプロ セ、 "タ ^ ~~
6 . プロモーターがマウス又はヒ ト由来であることを特徴とする、 請求項 1乃 至 5の何れかに記載の RNAポリメラーゼ IIIプロモーター。
7 . 請求項 1乃至 6のいずれかのプロモーターにおいて、 Cre組換え酵素によ つて特異的 DNA組換えが起こるような配列， PSE， 及び TATAボックスの機能を 損なわないように、 遺伝子配列が欠失， 付加， 置換， 挿入されていることを特 徴とする、 RNAポリメラーゼ IIIプロモーター
8 . 配列番号' 1で表される RH - ΙοχΡプロモーター。
9 . 請求項 1乃至 8の何れかに記載の RNAポリメラーゼ IIIプロモーターを使 用することを特徴とする、 RNA干渉法を利用した遺伝子発現制御方法。
1 0 . 請求項 1乃至 8の何れかに記載の RNAポリメラーゼ IIIプロモーターを 使用することを特徴とする、 トランスジエニック動物の作製方法。
I I . 請求項 1乃至 8の何れかに記載の RNAポリメラーゼ IIIプロモーターを 使用することを特徴とする、 RNA遺伝子の発現を制御する方法。
1 2 . PSEと TATAボックスの機能を損なわな.いように、 一部の配列を、 Cre組 換え酵素によって特異的 DNA組換えが起こるような配列で置換することを特徴 とする、 RNAポリメラーゼ IIIプロモーターの製造方法。 ·
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022514088A (ja) * 2018-12-19 2022-02-09 アンスティテュー・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル・（イ・エヌ・エス・ウ・エール・エム） ハイブリッドプロモーターおよび療法における使用、特にｉｉ型コラーゲン異常症を治療するための使用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013220083A (ja) * 2012-04-18 2013-10-28 Kanazawa Univ 肝糖産生モニターマウス
CN111394350B (zh) * 2019-01-03 2022-06-28 中国科学院大连化学物理研究所 圆红冬孢酵母rna聚合酶iii型启动子及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001011058A1 (en) * 1999-08-09 2001-02-15 Monsanto Technology Llc Novel cloning methods and vectors
WO2002083897A1 (en) * 2001-04-18 2002-10-24 Gene Stream Pty Ltd Transgenic non-human animals for pharmacological and toxicological studies

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6632980B1 (en) * 1997-10-24 2003-10-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
AU2002343792A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-10 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. siRNA EXPRESSION SYSTEM AND PROCESS FOR PRODUCING FUNCTIONAL GENE-KNOCKDOWN CELLS AND THE LIKE USING THE SAME

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001011058A1 (en) * 1999-08-09 2001-02-15 Monsanto Technology Llc Novel cloning methods and vectors
WO2002083897A1 (en) * 2001-04-18 2002-10-24 Gene Stream Pty Ltd Transgenic non-human animals for pharmacological and toxicological studies

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HASUWA H. ET AL: "Small interfering RNA and gene silencing in transgenic mice and rats", FEBS LETTERS, vol. 532, no. 1-2, 2002, pages 227 - 230, XP004395375 *
PADDISON PJ ET AL: "Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells", GENES DEV., vol. 16, no. 8, 2002, pages 948 - 958, XP002204653 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022514088A (ja) * 2018-12-19 2022-02-09 アンスティテュー・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル・（イ・エヌ・エス・ウ・エール・エム） ハイブリッドプロモーターおよび療法における使用、特にｉｉ型コラーゲン異常症を治療するための使用

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