JP2013209431A - セレンテラミド又はその類縁体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】O−メチルセレンテラミン又はその類縁体を、4−メトキシフェニルアセチ
ルハライド又はその類縁体に反応させることを含む、ジ−O−メチルセレンテラミド又は
その類縁体の製造方法。及び、ジ−O−メチルセレンテラミド又はその類縁体を脱メチル
化することを含む、セレンテラミド又はその類縁体の製造方法。
【選択図】なし
Description
造方法などに関する。
白質は、Ca2+と特異的に結合し瞬間的に発光する。カルシウム結合型発光蛋白質は、酸素
添加機能をもつ蛋白質と発光基質であるルシフェリンのペルオキシドを含む複合体である
。カルシウム結合型発光蛋白質において、酸素添加機能をもつ蛋白質はアポ蛋白質とよば
れる。また、ルシフェリンのペルオキシドは、セレンテラジンペルオキシド(2-hydrope
roxycoelenterazine)である。このようなカルシウム結合型蛋白質としては、具体的には
、イクオリン(aequorin)、クライティン−I(clytin-I)、クライティン−II(clyt
in-II)、マイトロコミン(mitrocomin)、及びオベリン(obelin)などの腔腸動物由来
のものが知られている。
単離された発光蛋白質である(非特許文献1:Shimomura, In: Bioluminescence, Chemic
al principles and methods (2006) pp90-158, World Scientific Pub. Co.; 非特許文
献2:Shimomura et al., (1962) J. Cell. Comp. Physiol. 59, pp223-240)。このイク
オリンは、アポ蛋白質であるアポイクオリン(21.4kDa)とセレンテラジンのヒドロペル
オキシドとの非共有結合性複合体である(非特許文献3: Head et al., (2000) Nature,
405 372-376)。アポイクオリンは、189のアミノ酸残基から構成される単純ポリペプチ
ドであり、Ca2+結合部位に特徴的な3つのEFハンドモチーフを有する(非特許文献4:Ino
uye et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 3154-3158)。Ca2+の存在下で、
イクオリンは、分子内反応によって青い光を発し(λmax = 〜460 nm)、アポイクオリ
ンとセレンテラミドとCO2とに分解する(非特許文献5: Shimomura & Johnson (1972) B
iochemistry 11, 1602-1608.; 非特許文献6: Shimomura & Johnson (1973) Tetrahedro
n Lett. 2963-2966)。この分解により得られたCa2+結合アポイクオリンとセレンテラミ
ドの複合体は、青色蛍光蛋白質(BFP)として知られている(非特許文献7: Shimomura &
Johnson (1975) Nature 256, 236-238)。
特許文献8:Shimomura, Biochem. J. 306 (1995) 537-543; 非特許文献9: Inouye, F
EBS Lett. 577 (2004) 105-110)。大腸菌より調製した組換えアポイクオリンは、EDTA
及び還元試薬の存在下、セレンテラジン及び酸素と共にインキュベートすることにより、
組換えイクオリンを再生することができる(非特許文献10:Inouye et al., (1986) Bi
ochemistry 25: 8425-8429;非特許文献11: Inouye et al., (1989) J. Biochem., 1
05, 473-477)。この組換えイクオリンは、高度に精製されている(非特許文献12:Shi
momura & Inouye (1999) Protein Express. Purif. 16, 91-95)。組換えイクオリン
の発光特性は、天然のイクオリンの特性と一致している(非特許文献13:Shimomura et
al., (1990) Biochem. J. 270 309-312)。イクオリン及び半合成イクオリンの結晶構造
が解析され(非特許文献3:Head et al., Nature, 405 (2000) 372-376;非特許文献1
4:Toma et al., (2005) Protein Science 14:409-416)、イクオリンのEFハンドモチ
ーフに対するMg2+の結合特性も、NMR分析によって調べられている(非特許文献15:Oha
shi et al., (2005) J. Biochem. 138: 613-620)。
e, FEBS Lett. 577 (2004) 105-110;非特許文献16:Inouye & Sasaki, FEBS Lett. 5
80 (2006) 1977-1982)、このBFPが実質的な発光活性を有し、ルシフェラーゼのようにセ
レンテラジンの酸化を触媒するということが明らかとなった。このBFPの発光強度は、Ca2
+結合アポイクオリンの発光強度の約10倍である(非特許文献9:Inouye, FEBS Lett. 57
7 (2004) 105-110)。すなわちこのBFPは、蛍光活性及びルシフェラーゼ活性を有する新
規の二機能性蛋白質である。更に、BFPは、EDTAの処理により蛍光発光最大ピーク約470nm
を有する緑色蛍光蛋白質(gFP)に変換される。gFPは、アポイクオリンとセレンテラミドと
の非共有結合性複合体であり、還元試薬の非存在下25℃で、セレンテラジンのインキュベ
ーションにより、イクオリンを再生することができる(非特許文献9:Inouye, FEBS Let
t. 577 (2004) 105-110)。EDTA及びジチオスレイトール(DTT)の存在下、様々なセレンテ
ラジンのアナログをBFP又はgFPと共にインキュベートすることにより、半合成イクオリン
も調製可能である(非特許文献16:Inouye et al. & Sasaki, FEBS Lett. 580 (2006)
1977-1982)。更に、BFPのルシフェラーゼとしての発光活性は、セレンテラジン及びその
アナログを基質として、30〜300mMの濃度のイミダゾール添加によって活性化される(非
特許文献17:Inouye & Sasaki (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 354: 650-65
5)。しかし、BFP及びgFPの用途開発において、重要な基礎情報であるセレンテラジンへ
の酸素添加のための蛋白質触媒領域又はアミノ残基は解決されていない。これらの問題解
決および用途開発において、容易に数十ミリグラムの量のBFP及びgFPを調製する必要があ
る。すなわち、アポイクオリンとセレンテラミドより高純度gFPを調製し、BFPへ変換する
方法の確立が必須である。
記式
方法が知られている(非特許文献6:Shimomura & Johnson, Tetrahedron Lett. (1973)
2963-2966)。この方法における、セレンテラミドの収率は約50%である。
ていた。
O−メチルセレンテラミンからジ−O−メチルセレンテラミドを経由して合成する新しい
合成経路を確立するなどし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に示す、セレンテラミド又はその類縁体の製造方法などを提
供する。
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R2は、アミノであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
を、
下記一般式(2)
(式中、
Xは、脱離基であり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
に反応させることを含む、
下記一般式(3)
(式中、R1、R3、及びR4は、前記の通りである。)
の製造方法。
(2)一般式(1)において、
R1が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、
フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、上記(1)に記載
の方法。
(3)一般式(1)において、
R3が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、s−ブチル、
t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル
、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル
メチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、α−メチル
ベンジル、フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、上記(
1)又は(2)に記載の方法。
(4)一般式(2)において、
Xが、塩素、臭素、ヨウ素、メタンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、ト
ルエンスルホニルオキシ、又は(4−R4O)C6H4CCOO−(式中、R4は前記の通り
である。)である、上記(1)〜(3)のいずれか1項に記載の方法。
(5)一般式(2)において、
R4が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、
フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、上記(1)〜(4
)のいずれか1項に記載の方法。
(6)一般式(1)で表わされる化合物が、下記化合物
法。
(7)一般式(2)で表わされる化合物が、下記化合物
法。
(8)下記式
(9)下記一般式(3)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
(10)下記式
(11)下記一般式(3)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
よりR1で示す基及びR4で示す基を脱離させることを含む、
下記一般式(4)
(式中、R3は前記の通りである。)
の製造方法。
(12)一般式(3)において、
R1が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、
フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、上記(11)に記
載の方法。
(13)一般式(3)において、
R3が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、s−ブチル、
t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル
、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル
メチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、α−メチル
ベンジル、フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、上記(
11)又は(12)に記載の方法。
(14)一般式(3)において、
R4が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、
フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、上記(11)〜(
13)のいずれか1項に記載の方法。
(15)一般式(3)で表わされる化合物が、下記化合物
の方法。
(16)下記式
(17)カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオン
を除去するためのキレート剤の存在下において、
下記一般式(4)
(式中、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
を、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反応させることを含む、緑色蛍光蛋白質
(gFP)の製造方法。
(18)カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオン
を除去するためのキレート剤の存在下において、下記式
P)の製造方法。
(19)前記反応を、還元剤の存在下において行う、上記(17)又は(18)に記載の
方法。
(20)下記一般式(1)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R2は、アミノであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
を、
下記一般式(2)
(式中、
Xは、脱離基であり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
に反応させて、
下記一般式(3)
(式中、R1、R3、及びR4は、前記の通りである。)
を生成する工程と、
カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンの存在
下、一般式(3)で表わされる化合物を、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反
応させることを含む、青色蛍光蛋白質(BFP)の製造方法。
比較してセレンテラミド又はその類縁体を高収率で製造することができる。本発明の別の
態様によれば、簡易にgFPをアポイクオリンより直接調製可能となる。
1.セレンテラミド又はその類縁体の製造方法
本発明では、セレンテラミド又はその類縁体を、O−メチルセレンテラミン又はその類
縁体からジ−O−メチルセレンテラミド又はその類縁体を経由して製造する。本発明のセ
レンテラミド又はその類縁体の製造方法のいくつかの態様では、O−メチルセレンテラミ
ン又はその類縁体からのセレンテラミド又はその類縁体の精製前の収率は、従来の製造方
法よりも高く、例えば、55%以上、60%、65%以上、又は70%以上である。
本発明は、ジ−O−メチルセレンテラミド又はその類縁体(一般式(3)で表わされる
化合物)を提供する。すなわち、本発明は、下記一般式(3)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
を提供する。
エチル、プロピル、又はイソプロピルが挙げられる。R1で示される炭素数7〜10のア
リールアルキルとしては、例えば、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチル、3−フ
ェニルプロピル、又は4−フェニルブチルが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、
R1は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、フ
ェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである。好ましくは、R1は
、メチル、エチル、イソプロピル、又はベンジルである。
1〜7のアルキルとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル
、イソブチル、s−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペ
ンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペン
チルメチル、又はシクロヘキシルメチルが挙げられる。R3で示される脂肪族環式基とし
ては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、又はシクロヘキシルが
挙げられる。R3で示される炭素数7〜10のアリールアルキルとしては、例えば、ベン
ジル、α−メチルベンジル、フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチ
ルが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、R3は、メチル、エチル、プロピル、イ
ソプロピル、ブチル、イソブチル、s−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネ
オペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロプロピルメチル、シクロブチル
メチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロプロピル、シクロブチル
、シクロペンチル、シクロヘキシル、α−メチルベンジル、フェネチル、3−フェニルプ
ロピル、又は4−フェニルブチルである。好ましくは、R3は、シクロヘキシルメチル、
シクロペンチルメチル、又はベンジルである。
エチル、プロピル、又はイソプロピルが挙げられる。R4で示される炭素数7〜10のア
リールアルキルとしては、例えば、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチル、3−フ
ェニルプロピル、又は4−フェニルブチルが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、
R4は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、フ
ェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである。好ましくは、R4は
、メチル、エチル、イソプロピル、又はベンジルである。
ラミド又はその類縁体は、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
類縁体は、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
ラミド類縁体は、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
ラミド類縁体は、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
ラミド類縁体は、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物である。
しくは、下記に示す化合物からなる群から選択される化合物である。
示す化合物からなる群から選択される化合物である。
下記に示す化合物からなる群から選択される化合物である。
下記に示す化合物からなる群から選択される化合物である。
下記に示す化合物からなる群から選択される化合物である。
すジ−O−メチルセレンテラミドである。
する。より具体的には、本発明は、O−メチルセレンテラミン又はその類縁体(一般式(
1)で表わされる化合物)を、4−メトキシフェニルアセチルハライド又はその類縁体(
一般式(2)で表わされる化合物)に反応させることを含む、上記ジ−O−メチルセレン
テラミド又はその類縁体(一般式(3)で表わされる化合物)の製造方法を提供する。す
なわち、本発明は、下記一般式(1)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R2は、アミノであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
を、
下記一般式(2)
(式中、
Xは、脱離基であり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
に反応させることを含む、
下記一般式(3)
(式中、
R1、R3、及びR4は、前記の通りである。)
の製造方法を提供する。
明の通りである。
素、若しくはヨウ素)、スルホン酸の反応性残基(例えば、メタンスルホニルオキシ、ベ
ンゼンスルホニルオキシ、若しくはトルエンスルホニルオキシ)、又は酸無水物を形成せ
しめるアシルオキシ(例えば、(4-R4O)C6H4CH2COO-(式中、R4は前記の通
りである。))が挙げられる。なかでもハロゲンが好ましく、特に塩素がより好ましい。
ば、下記化合物からなる群から選択される化合物を挙げることができる。
選択される化合物である。
ある。
法で製造することができ、或いは、市販のものを入手することができる。例えば、Kishi
et al., Tetrahedron Lett., 13, 2747-2748 (1972)、又はAdamczyk et al., Org. Prep.
Proced. Int., 33, 477-485 (2001)に記載の方法又はそれに準ずる方法で一般式(1)
で表わされるO−メチルセレンテラミン又はその類縁体を製造することができる。
類縁体として、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物を挙げることができ
る。
らなる群から選択される化合物である。
下記に示す4−メトキシフェニルアセチルクロリドである。
公知の製造方法で製造することができ、或いは、市販のものを入手することができる。具
体的には、いずれの化合物も、対応するカルボン酸に対して過剰の塩化チオニルを作用さ
せて加熱還流した後、減圧濃縮するか、又は、ジクロロメタン溶媒中、触媒量のN、N-
ジメチルホルムアミド(DMF)存在下、対応するカルボン酸に対して二塩化オキサリル
を反応させた後、減圧濃縮するか、のいずれかの方法で製造することができる。また、4
-メトキシフェニルアセチルクロリドはAldrich社から、4-ベンジルオキシフェニルアセ
チルクロリド、及び4-メトキシフェニル酢酸無水物は東京化成工業から、購入すること
ができる。
)で表わされるO-メチルセレンテラミン又はその類縁体と、一般式(2)で表わされる
4-メトキシフェニルアセチルハライド又はその類縁体とを、例えば、有機溶媒中、塩基
の存在下、又は塩基性有機溶媒中で反応させることで製造することができる。より具体的
には、ジ-O-メチルセレンテラミドは、後述の実施例に記載の方法又はそれに準ずる方法
を用いて製造することができる。
用される有機溶媒又は塩基性有機溶媒は、種々のものを使用できるが、水系、又はアルコ
ール類以外の有機溶媒又は塩基性有機溶媒が特に好ましい。有機溶媒又は塩基性有機溶媒
は、例えば、ピリジン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロ
フラン、酢酸エチル、アセトン、トルエン、ジオキサン、又はエーテル等であり、これら
は単独で又は混合して使用することができる。
基は、特に限定されず、種々のものを使用できる。例えば、ピリジン、トリエチルアミン
、ジイソプロピルエチルアミン、4-ジメチルアミノピリジン、ルチジン、又はコリジン
等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。
応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、−20℃〜200℃で、1時間〜
72時間、好ましくは、0℃〜100℃で、6時間〜36時間、より好ましくは、室温〜
50℃で、12時間〜24時間である。
本発明は、さらに、ジ−O−メチルセレンテラミド又はその類縁体(一般式(3)で表
わされる化合物)よりR1で示す基及びR4で示す基を脱離させることを含む、セレンテラ
ミド又はその類縁体(一般式(4)で表わされる化合物)の製造方法を提供する。すなわ
ち、本発明は、下記一般式(3)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
よりR1で示す基及びR4で示す基を脱離させることを含む、
下記一般式(4)
(式中、R3は、前述の通りである。)
の製造方法を提供する。
るジ−O−メチルセレンテラミド又はその類縁体は、前記で説明した通りである。ジ−O
−メチルセレンテラミド又はその類縁体として、例えば、前記本発明のジ−O−メチルセ
レンテラミド又はその類縁体の製造方法により製造した化合物を挙げることができる。
す基の脱離は通常の方法を用いて行うことができ、その脱離の方法は特に限定されない。
例えば、メチルの脱離は、実施例に記載の方法又はそれに準ずる方法を用いて行うことが
できる。
種々のものを使用でき、非極性溶媒であるのが特に好ましい。溶媒は、例えば、ジクロロ
メタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエン、ジオキサン又はエーテル等であ
り、これらは単独で又は混合して使用することができる。
、特に限定されないが、例えば、−100℃〜200℃で、1時間〜72時間、好ましく
は、−20℃〜100℃で、6時間〜36時間、より好ましくは、0℃〜50℃で、12
時間〜24時間である。
類縁体として、例えば、下記化合物からなる群から選択される化合物を挙げることができ
る。
化合物である。
ドである。
下記式
図6に示すように、緑色蛍光蛋白質(gFP)は、EDTA等のカルシウムイオン又はカルシ
ウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下
、セレンテラミド又はその類縁体(一般式(4)で表わされる化合物)に、アポイクオリ
ン等のアポ蛋白質を反応させることにより製造することができる。また、gFPにカルシウ
ムイオンを加えることにより、青色蛍光蛋白質(BFP)を製造することができる。
な2価若しくは3価のイオンの存在下、セレンテラミド又はその類縁体にアポイクオリン
等のアポ蛋白質を反応させることによっても製造することができる。また、EDTA等のカル
シウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを除去するた
めのキレート剤の存在下、gFPに、セレンテラジン又はその類縁体を反応させることで、
イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質を製造することも出来る。
2.1.1.緑色蛍光蛋白質(gFP)の製造方法
本発明の緑色蛍光蛋白質(gFP)の製造方法において製造する緑色蛍光蛋白質(gFP)は
、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に、セレンテラミド又はその類縁体が配位し
た複合体である。gFPは、光の励起を受けて蛍光を発生することができる。
ち、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを除
去するためのキレート剤の存在下において、セレンテラミド又はその類縁体(例えば、一
般式(4)で表わされる化合物)を、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反応さ
せることで、gFPを製造する。
前記一般式(4)で表わされる化合物である。一般式(4)で表わされる化合物は前記で
説明した通りである。セレンテラミド又はその類縁体として、例えば、前記本発明のセレ
ンテラミド又はその類縁体の製造方法により製造した化合物を挙げることができる。
ウムイオンと置換可能な2若しくは3価のイオンと強く結合するものであれば良く、特に
制限されない。キレート剤の例として、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレン
グリコールビス(β−アミノエチルエーテル)N,N,N′,N′−四酢酸(EGTA)
、trans−1,2−ジアミノシクロヘキサンN,N,N′,N′−四酢酸(CyDT
A)、又はN−(2−ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸(HIDA)等を挙げることがで
きる。ここで、カルシウムイオンと置換可能な2価又は3価のイオンとは、カルシウムイ
オンに代えてカルシウム結合型発光蛋白質と反応させた場合に、発光反応を起こす2価又
は3価のイオンのことである。つまり、カルシウム結合型発光蛋白質に対して、カルシウ
ムイオンと同等の作用をするものである。カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換
可能な2価又は3価のイオンは、例えば、カルシウムイオン(Ca2+)、マグネシウムイ
オン(Mg2+)、ストロンチウムイオン(Sr2+)、バリウムイオン(Ba2+)、鉛イオ
ン(Pb2+)、コバルトイオン(Co2+)、ニッケルイオン(Ni2+)、カドミウムイオ
ン(Cd2+)、イットリウムイオン(Y3+)、ランタンイオン(La3+)、サマリウムイ
オン(Sm3+)、ユウロピウムイオン(Eu3+)、ジスプロシウムイオン(Dy3+)、ツ
リウムイオン(Tm3+)、又はイットリビウムイオン(Yb3+)等を挙げることができる
。これらのうち、2価の金属イオンが好ましい。より好ましくは遷移金属以外の2価の金
属イオン、例えばCa2+、Sr2+、又はPb2+等である。
に制限されない。イオンアポイクオリン1molには、3molのカルシウムイオンが結合するこ
とが示されていることより、例えば、3mol 以上が好ましい。
、例えば、アポイクオリン、アポクライティン−I、アポクライティン−II、アポオベ
リン、アポマイトロコミン、アポミネオプシン又はアポベルボイン等である。本発明のあ
る態様では、アポ蛋白質は、アポイクオリン、アポクライティン−I、アポクライティン
−II、アポオベリン、又はアポマイトロコミン等であり、例えば、アポイクオリンであ
る。アポ蛋白質は、天然から採取したものであっても、遺伝子工学的に製造したものであ
ってよい。さらに、アポ蛋白質は、gFPを形成できるものであれば、そのアミノ酸配列を
天然のものから遺伝子組換え技術によって変異させたものであってもよい。
酸配列は、次の通りである。すなわち、天然型アポイクオリンの塩基配列を配列番号1に
、アミノ酸配列を配列番号2に示す。天然型アポクライティン−Iの塩基配列を配列番号
3に、アミノ酸配列を配列番号4に示す。天然型アポクライティン−IIの塩基配列を配
列番号5に、アミノ酸配列を配列番号6に示す。天然型アポマイトロコミンの塩基配列を
配列番号7に、アミノ酸配列を配列番号8に示す。天然型天然型アポオベリンの塩基配列
を配列番号9に、アミノ酸配列を配列番号10に示す。天然型アポベルボインの塩基配列
を配列番号11に、アミノ酸配列を配列番号12に示す。
群から選択される蛋白質である。
入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ
蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質、
(b)天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配
列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する
蛋白質、及び
(c)天然型アポ蛋白質の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミ
ノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を
有する蛋白質。
クライティン−II、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシン、又はアポ
ベルボイン等である。本発明のある態様では、アポ蛋白質は、アポイクオリン、アポクラ
イティン−I、アポクライティン−II、アポオベリン、又はアポマイトロコミン等であ
り、好ましくは、アポイクオリンである。これらの天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列又は
塩基配列は、前記の通りである。
白質がセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結
合してカルシウム結合型発光蛋白質を形成する活性又は機能を意味する。「蛋白質がセレ
ンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合してカル
シウム結合型発光蛋白質を形成する」とは、具体的には、(1)蛋白質が、セレンテラジ
ンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合して発光蛋白質を
形成すること、だけではなく(2)蛋白質が、酸素存在下に、セレンテラジン若しくはそ
の誘導体と接触することにより、蛋白質とセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレン
テラジン類縁体のペルオキシドとを含有する発光蛋白質(複合体)を形成すること、をも
意味する。ここで、「接触」とは、蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを同一の反
応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容した容器
に蛋白質を添加すること、蛋白質を収容した容器にセレンテラジン又はその類縁体を添加
すること、又は蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれ
る。また、「セレンテラジン類縁体」は、セレンテラジンと同様に、アポ蛋白質として、
イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質を構成しうる化合物を指す。セレンテラジン
又はその類縁体は、例えば、セレンテラジン、h−セレンテラジン、f−セレンテラジン
、cl−セレンテラジン、n−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、ch−セレンテ
ラジン、hch−セレンテラジン、fch−セレンテラジン、e−セレンテラジン、ef
−セレンテラジン、ech−セレンテラジン、又はhcp−セレンテラジン等である。こ
れらのセレンテラジン又はその類縁体の入手方法は、後に記載する。
おける「1〜複数個」の範囲は、例えば、1〜20個、1〜15個、1〜10個、1〜9
個、1〜8個、1〜7個、1〜6個(1〜数個)、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜
2個、1個である。欠失、置換、挿入若しくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ない
ほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生
じてもよい。このような領域は、"Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)"、 "Ausbel
F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wil
ey and Sons (1987-1997)"、"Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)"、"Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 79, 6409 (1982)"、"Gene, 34, 315 (1985)"、"Nuc. Acids. Res., 13, 443
1 (1985)"、又は"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)"等に記載の部位特異的
変異導入法を用いて、取得することができる。
囲は、例えば、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%
以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%
以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%
以上、99.8%以上、又は99.9%以上である。上記同一性の数値は、一般的に大き
いほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、BLAST(例えば、Altz
shul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照)等の解析プログラムを
用いて決定できる。BLASTを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーター
を用いる。
、天然型アポ蛋白質の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は天然型
アポ蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとし
て、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザン
ハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド(例えば、
DNA)をいう。具体的には、コロニー或いはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化
したフィルターを用いて、0.7〜1.0mol/LのNaCl存在下、65℃でハイブ
リダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC(Saline-sodium citrate)溶
液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mmol/L塩化ナトリウム、15mmol
/Lクエン酸ナトリウムよりなる)を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することに
より同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、Ausbel F. M.
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and
Sons (1987-1997)、又はGlover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniq
ues, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実
験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
ェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな
条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%(w/v)SDS、50%(v/v)ホルムアミ
ド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×
デンハルト溶液、0.5%(w/v)SDS、50%(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高スト
リンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)%SDS、50%(v
/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする
相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い
相同性を有するポリヌクレオチド(例えば、DNA)が効率的に得られることが期待でき
る。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度
、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ
、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現する
ことが可能である。
Labelling Reagents(アマシャムファルマシア社製)を用いることができる。この場合
は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーション
を一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファー
で洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
ムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、アポ蛋白質のアミノ酸配列
をコードするポリヌクレオチドと約60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上
、85%以上、88%以上、90%以上、92%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上
、99.3%以上、99.5%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するDNA
をあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用い
て決定できる。
で置換したものである。gFPは、アポ蛋白質中のシステイン残基の遊離SH基が酸化され
てS−S結合を生成すると、化学発光活性を失う。したがって、システイン残基がセリン
残基で置換されS−S結合を生じることができなくなったアポ蛋白質は、化学発光活性を
ほとんど失わず、S−S結合を生じないため活性が持続する。
、アポ蛋白質1molに対して、例えば、1mol〜5mol、好ましくは、1mol〜2mol、さらに好ま
しくは、1mol〜1.2molである。
の存在下で行うのが好ましい。ここで用いる還元剤としては、例えば、ジチオトレイトー
ル(DTT)、又はメルカプトエタノール等を挙げることができる。gFP再生に影響しなければ
、gFPの製造のために用いる還元剤の量は、特に制限されないが、アポイクオリンには、
3カ所のシステイン残基が存在することより、S-S 結合形成を防ぐ濃度であるのが好まし
い。例えば、最終濃度が、1 mMジチオトレイトールや0.1%メルカプエタノールである。
℃で、0.1時間〜2時間、4℃〜37℃で、0.1時間〜2時間、又は4℃〜15℃で、0.1時間〜24
時間である。
製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム
沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で
、又は適宜組み合わせて用いることができる。
若しくは3価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下において、下記式
)の製造方法を提供する。本発明の一つの態様では、図5に示すように、EDTAの存在下、
セレンテラミドをアポイクオリンに反応させることにより、gFPを製造する。
(1)レポーター蛋白質としての利用
gFPは、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することが
できる。例えば、アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーター又は
他の発現制御配列(例えば、エンハンサーなど)に融合したベクターを構築する。前記ベ
クターを宿主細胞に導入し、さらに、これに、セレンテラミド又はその類縁体を、カルシ
ウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを除去するため
のキレート剤の存在下で接触させることで、gFPを生成させ、gFPに由来する蛍光を検出す
ることにより、目的のプロモーター又は他の発現制御配列の活性を測定することができる
。
gFPは、蛍光による検出マーカとして利用することができる。検出マーカは、例えば、
イムノアッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用
することができる。gFPを化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質(蛋白質或
いは核酸など)と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出
方法は、通常の方法によって行うことができる。また、本発明の検出マーカは、例えば、
アポ蛋白質と目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法など
の手法により細胞内に導入し、さらに、これに、セレンテラミド又はその類縁体を、カル
シウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを除去するた
めのキレート剤の存在下で接触させることでgFPを生成させること等によって、前記目的
物質の分布を測定するために利用することもできる。このような目的物質などの分布の測
定は、蛍光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、アポ蛋白質
は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発
現させて用いることもできる。
gFPは、アミューズメント用品の材料の蛍光材として好適に使用することができる。ア
ミューズメント用品としては、たとえば、蛍光シャボン玉、蛍光アイス、蛍光飴、蛍光絵
の具等があげられる。アミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができ
る。
2.2.1.青色蛍光蛋白質(BFP)の製造方法
前記本発明の製造方法により製造したgFPに、カルシウムイオン又はカルシウムイオン
と置換可能な2価若しくは3価のイオンを加えることにより、青色蛍光蛋白質(BFP)を製
造することができる。或いは、青色蛍光蛋白質(BFP)は、カルシウムイオン又はカルシウ
ムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンの存在下、前記本発明の方法により製造
したセレンテラミド又はその類縁体(一般式(4)で表わされる化合物)に、カルシウム
結合型アポ蛋白質を反応させることによっても製造することができる。本発明において製
造する青色蛍光蛋白質(BFP)は、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に、セレン
テラミド又はその類縁体が配位した複合体である。BFPは、光の励起を受けて蛍光を発生
することができるとともに、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若
しくは3価のイオンと反応して発光することもできる。
、前記の説明と同様である。BFPの製造のために用いるカルシウムイオン又はカルシウム
イオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンの量は、特に制限されないが、BFPの製造
のために用いるキレート剤の量は、BFP再生に影響しなければ、その濃度は特に制限され
ない。イオンアポイクオリン1molには、3molのカルシウムイオンが結合することが示され
ていることより、3mol 以上が好ましい。
の存在下で行うのが好ましい。ここで用いる還元剤としては、例えば、ジチオトレイトー
ル(DTT)、又はメルカプトエタノール等を挙げることができる。
BFP再生に影響しなければ、BFPの製造のために用いる還元剤の量は、特に制限されない
が、アポイクオリンには、3カ所のシステイン残基が存在することより、S-S 結合形成を
防ぐ濃度であるのが好ましい。例えば、最終濃度が、1 mMジチオトレイトール や0.1%メ
ルカプエタノールである。
で、0.1時間〜2時間、4℃〜37℃で、0.1時間〜2時間、又は4℃〜15℃で、0.1時間〜24時
間である。
製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム
沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で
、又は適宜組み合わせて用いることができる。
(1)発光触媒としての利用
本発明のBFPは、発光基質に作用しそれを発光させるので、発光触媒として利用できる
。そこで、本発明は、BFPに、セレンテラジン又はその類縁体を接触させることを含む、
発光方法を提供する。ここで、「接触」とは、BFPとセレンテラジン又はその類縁体とを
同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容
した容器にBFPを添加すること、BFPを収容した容器にセレンテラジン又はその類縁体を添
加すること、又はBFPとセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれ
る。
「セレンテラジンの類縁体」とは、セレンテラジンと同様に、アポ蛋白質として、イクオ
リン等のカルシウム結合型発光蛋白質を構成しうる化合物を指す。発光基質として用いる
セレンテラジン又はその類縁体は、例えば、セレンテラジン、h−セレンテラジン、f−
セレンテラジン、cl−セレンテラジン、n−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、
ch−セレンテラジン、hch−セレンテラジン、fch−セレンテラジン、e−セレン
テラジン、ef−セレンテラジン、ech−セレンテラジン、又はhcp−セレンテラジ
ン等であり、好ましくは、セレンテラジン、h−セレンテラジン、又はe−セレンテラジ
ンである。これらのセレンテラジン又はその類縁体は、例えば、Shimomura et al. (1988
) Biochem.J. 251, 405-410、Shimomura et al. (1989) Biochem.J. 261, 913-920、又は
Shimomura et al. (1990) Biochem.J. 270,309-312に記載の方法又はそれに準ずる方法で
製造することができる。或いは、チッソ株式会社、和光純薬社、又はプロメガ社等から各
種市販されているので、これらの市販のものを、本発明の発光方法に用いても良い。
よって、セレンテラジン又はその類縁体が対応するセレンテラミド又はその類縁体に酸化
される際(この時、二酸化炭素が放出される)、発光が生じる。通常発光時間は、0.5
〜3時間であるが、条件の選択により、発光時間を更に長時間とすることも、又は発光時
間を更に短時間とすることも可能である。
BFPは、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することも
できる。アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーター又は他の発現
制御配列(例えば、エンハンサーなど)に融合したベクターを構築する。前記ベクターを
宿主細胞に導入し、さらに、これに、本発明の方法で製造したセレンテラミド又はその類
縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオン
を接触させ、本発明の蛍光蛋白質に由来する蛍光を検出することにより、目的のプロモー
ター又は他の発現制御配列の活性を測定することができる。ここで、「接触」とは、宿主
細胞とセレンテラミド又はその類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可
能な2価若しくは3価のイオンとを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例
えば、宿主細胞の培養容器にセレンテラミド又はその類縁体及びカルシウムイオン又はカ
ルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを添加すること、宿主細胞とセレ
ンテラミド又はその類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若
しくは3価のイオンとを混合すること、宿主細胞をセレンテラミド又はその類縁体及びカ
ルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンの存在下で
培養することなどが含まれる。
BFPは、蛍光による検出マーカとして利用することができる。本発明の検出マーカは、
例えば、イムノアッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検
出に利用することができる。BFPを化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質(
蛋白質或いは核酸など)と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用
いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。
現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、さらに、これに
本発明の方法により製造したセレンテラミド又はその類縁体及びカルシウムイオン又はカ
ルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを接触させること等によって、前
記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。ここで、「接触」とは、細胞
とセレンテラミド又はその類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な
2価若しくは3価のイオンとを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば
、細胞の培養容器にセレンテラミド又はその類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウム
イオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを添加すること、細胞とセレンテラミド又
はその類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価の
イオンとを混合すること、宿主細胞をセレンテラミド又はその類縁体及びカルシウムイオ
ン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンの存在下で培養すること
などが含まれる。
行うこともできる。なお、アポ蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により
細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。
BFPは、光の励起をうけて蛍光を生じる。よって、BFPは、アミューズメント用品の材料
の蛍光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえ
ば、蛍光シャボン玉、蛍光アイス、蛍光飴、蛍光絵の具等があげられる。本発明のアミュ
ーズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
図6に示すように、イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質は、EDTA等のカルシウ
ムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを除去するための
キレート剤の存在下、gFPに、セレンテラジン又はその類縁体を反応させることで、製造
することが出来る。
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、本発明のgFPから製造することができる。す
なわち、本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、gFPに、発光基質であるセレンテラジ
ン又はその類縁体を反応させることによって、得ることができる。
接触させることにより行う。「接触」とは、本発明のgFPとセレンテラジン又はその類縁
体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体
を収容した容器に本発明のgFPを添加すること、本発明のgFPを収容した容器に本発明のセ
レンテラジン又はその類縁体を添加すること、又は本発明のgFPとセレンテラジン又はそ
の類縁体とを混合すること、などが含まれる。
、例えば、セレンテラジン、h−セレンテラジン、f−セレンテラジン、cl−セレンテ
ラジン、n−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、ch−セレンテラジン、hch−
セレンテラジン、fch−セレンテラジン、e−セレンテラジン、ef−セレンテラジン
、ech−セレンテラジン、又はhcp−セレンテラジン等であり、好ましくは、セレン
テラジン、h−セレンテラジン、又はe−セレンテラジンである。これらのセレンテラジ
ン又はその類縁体の入手方法は、前記の通りである。
は、特に制限されないが、gFP 1molに対して、例えば、1.2 mol 以上である。
いが、例えば、0℃〜42℃で、0.1時間〜2時間、4℃〜37℃で、0.1時間〜2時間、又は4℃
〜15℃で、0.1時間〜24時間である。
還元剤の存在下において行う。このとき用いる還元剤は、例えば、ジチオトレイトール(
DTT)、又はメルカプトエタノール等である。カルシウム結合型発光蛋白質の製造のため
に用いる還元剤の量は、再生に影響しなければ、特に制限されないが、アポイクオリンに
は、3カ所のシステイン残基が存在することより、S-S 結合形成を防ぐ濃度であるのが好
ましい。例えば、最終濃度が、1 mMジチオトレイトールや0.1%メルカプエタノールであ
る。
(1)カルシウムイオンの検出又は定量
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、カルシウムイオンの作用によって発光する発
光蛋白質(ホロ蛋白質)である。よって、本発明の発光蛋白質は、カルシウムイオンの検
出又は定量に使用することができる。
のペルオキシドとからなる発光蛋白質を使用する。発光蛋白質は、前述した方法に従って
製造することができる。カルシウムイオンの検出又は定量は、検体溶液を直接発光蛋白質
溶液に添加し、発生する発光を測定することにより行うことができる。或いは、検体溶液
に発光蛋白質溶液を添加し、発生する発光を測定することにより、カルシウムイオンを検
出又は定量することもできる。カルシウムイオンの検出は、例えば、検体溶液を直接発光
蛋白質溶液に添加し、発生する発光を測定することにより行うことができる。或いは、検
体溶液に発光蛋白質溶液を添加し、発生する発光を測定することによりカルシウムイオン
を検出することもできる。
光を、発光測定装置を用いて測定することにより行うことができる。発光測定装置として
は、市販されている装置、例えば、Centro LB 960(ベルトールド社製)など
を使用することができる。カルシウムイオン濃度の定量は、発光蛋白質を用いて、既知の
カルシウムイオン濃度に対する発光標準曲線を作成することにより、測定可能である。
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法
による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定等の分析方法に
利用することができる。
をアクセプター蛋白質として使用して、両者の間で生物発光共鳴エネルギー移動(BRE
T)を起こすことにより蛋白質間の相互作用を検出することができる。本発明のある態様
では、アクセプター蛋白質として使用する有機化合物は、Hoechist3342、Indo-1又はDAP1
などである。本発明の別の態様では、アクセプター蛋白質として使用する蛍光蛋白質は、
緑色蛍光蛋白質(GFP)、青色蛍光蛋白質(BFP)、変異GFP蛍光蛋白質又はフィコビリン
などである。本発明の好ましい態様において、解析する生理機能は、オーファン受容体(
特にG蛋白質共役受容体)、アポトーシス、又は遺伝子発現による転写調節などである。
また、本発明の好ましい態様において、分析する酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼ又
はリン酸化酵素などである。
J. 2005, 385, 625-637、又はExpert Opin. Ther Tarets, 2007 11: 541-556などに記載
の方法に準じて行うことができる。また、酵素活性の測定も、公知の方法で行うことがで
き、例えば、Nat Methods 2006, 3:165-174、又はBiotechnol J. 2008, 3:311-324などに
記載の方法に準じて行うことができる。
その全体を本明細書に組み込むものとする。
者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる
。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態
様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに
限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明
細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
セレンテラミドの合成
l2溶液(Aldrich社)、及びその他のすべての化学試薬は市販のものであり、そのまま使用
した。
分析用薄層クロマトグラフィー(TLC)には、あらかじめシリカゲルが塗布された(0.2
5mm)シリカゲルプレート(MERCK社、シリカゲル60 F254、カタログ番号1.05715.0009)を
用いた。
分取カラムクロマトグラフィーには、シリカゲル(関東化学社、シリカゲル60N、球状
、中性、カタログ番号37563-84)を使用した。
融点(Mp.)は、YANACO MP-J3を使用して測定した(未補正)。1H(300 MHz)核磁気共鳴
スペクトル(NMRスペクトル)、および13C(75.5 MHz)NMRスペクトルは、Varian社製Gem
ini-300を用いてDMSO-d6(CIL社)中で測定した。1H NMRの化学シフトの基準には、測定溶
媒であるDMSO-d 6中の残存非重水素化ジメチルスルホキシドのピークをδ2.49とした。13
C NMRの化学シフトの基準には、測定溶媒であるDMSO-d6のピークをδ 39.7とし、それぞ
れ単位ppmで示した。また、結合定数(J)は単位Hzで示した。略号s、m及びbrはそれぞれ
、singlet、multiplet及びbroadを表す。赤外分光(IR)スペクトルは、DRS-8000Aを備え
た分光計SHIMADZU IRPrestige-21を用い、拡散反射法により測定し、吸収帯は単位cm-1で
示した。高分解能質量分析(HRMS)は、電子衝撃イオン化(EI)法の条件下で、質量分析計JE
OL JMS-700を用いて行った。
アルゴン雰囲気下、ピリジン中の2-アミノ-3-ベンジル-5-(4-メトキシフェニル)ピラ
ジン(II)(セレンテラミンメチルエーテルともいう)(Kishi et al., Tetrahedron Le
tt., 13, 2747-2748(1972);Adamczyk et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477-48
5(2001))(502 mg、1.72 mmol)の溶液(5 mL)に対し、4-(ジメチルアミノ)ピリジ
ン(DMAP)(21.1 mg、172 μmol)及び4-メトキシフェニルアセチルクロリド(III)(527
μL、3.45 mmol)を続けて室温で加え、混合物を同じ温度で22.5時間攪拌した。これに
対し炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(100 mL)を加え、ジクロロメタン(50 mL×3)を用
いて混合物の抽出を行った。有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下
で濃縮した。トルエン(20 mL×3)を用い、残留ピリジンを共沸して除去した。残渣をシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー(85 g、ジクロロメタン/酢酸エチル=9/1)により精
製し、淡黄色固体であるとしてセレンテラミドジメチルエーテル(IV)(617 mg、81.5%
)を得た。酢酸エチルからの再結晶によって分析的に純粋なサンプルとして無色の固体を
得た(全部で2回の再結晶により、458 mg、60.5%を得た)。
(s, 3H), 4.03 (s, 2H), 6.88-6.93 (AA'BB', 2H), 7.02-7.07 (2 ( AA'BB', 4H), 7.12
-7.30 (m, 5H), 8.00-8.05 (AA'BB', 2H), 8.87 (s, 1H), 10.43 (s, 1H); 13C NMR (75.
5 MHz, DMSO-d6) δ 41.6, 55.1, 55.3, 113.9 (2C), 114.5 (2C), 126.2, 127.5, 128.0
(2C), 128.1, 128.2 (2C), 129.0 (2C), 130.2 (2C), 137.1, 138.3, 143.7, 148.2, 15
0.5, 158.2, 160.7, 170.3; IR (KBr, cm-1) 698, 833, 1034, 1177, 1256, 1495, 1514,
1543, 1672, 2833, 2957, 3265; HRMS (EI) m/z 439.1898 (M+, C27H25N3O3 requires 4
39.1896)。
アルゴン雰囲気下、無水ジクロロメタン中、セレンテラミドジメチルエーテル(IV)(6
60 mg、1.50 mmol)の溶液(20 mL)を、0 ℃で10分かけて三臭化ホウ素(6.01 mL、6.01
mmol)の1.0 Mジクロロメタン溶液に加え、同じ温度で15分間、混合物を攪拌した。混合
物を室温になるまで暖め、21時間攪拌し続けた。これに対し炭酸水素ナトリウム飽和水溶
液(100 mL)を加え、混合物を減圧下で濃縮してジクロロメタンを除去した。残留懸濁水
溶液をろ過し、回収した固体を真空で乾燥させ、淡黄色固体としてセレンテラミド(I)(
570 mg、92.3))%)を得た。この純度のサンプルは、gFP及びBFPなどの製造において十
分に利用することができる。
エタノールからの再結晶によって分析的に純粋なサンプルとして無色の固体を得た(10
3 mg、16.7%)。
, 6.69-6.75 (AA'BB', 2H), 6.84-6.90 (AA'BB', 2H), 7.00-7.06 (AA'BB', 2H), 7.11-7
.24 (m, 5H), 7.89-7.95 (AA'BB', 2H), 8.80 (s, 1H), 9.28 (br s, 1H), 9.85 (br s,
1H), 10.35 (s, 1H); 13C NMR (75.5 MHz, DMSO-d6) δ41.7, 115.2 (2C), 115.8 (2C),
125.7, 126.2, 126.6, 128.0 (2C), 128.2 (2C), 129.0 (2C), 130.2 (2C), 136.8, 138.
4, 143.4, 148.6, 150.5, 156.2, 159.1, 170.5; IR (KBr, cm-1) 704, 1157, 1229, 126
7, 1364, 1450, 1493, 1516, 1545, 1593, 1611, 1673, 3022, 3285, 3385; HRMS (EI) m
/z 411.1582 (M+, C25H21N3O3 requires 411.1583)。
細菌細胞由来の組換えヒスチジン標識アポイクオリンの発現及び精製
組換えヒスチジン標識アポイクオリンは、大腸菌のペリプラズムに発現させた。使用し
た宿主株は、大腸菌WA802株(CGSC 5610)である。大腸菌WA802株に導入した組換えヒス
チジン標識アポイクオリン発現ベクターpiP-His-HEを、piP-HEΔ2Eから構築した(Inouye
& Sahara, Protein Express. Purifi. (2007) 53: 384-389 参照)。
ndIII部位に、6つのヒスチジン残基を含むヒスチジンタグリンカーセット(配列番号13
:5'AAT TCC CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGT A 3' 及び配列番号14:5'AG CTT ACC ATG
GTG ATG GTG ATG GTG GG 3')を挿入した。これにより、プラスミドpiP-His-HEを作成し
た。このプラスミドは、リポ蛋白質(lpp)プロモーター及びlacオペレーターの制御下に、
外膜蛋白質A (OmpA)のシグナルペプチド配列及び6個のヒスチジン残基を有する。
μg/ml)を含む10mlのLB培地中で、30℃で16時間増殖させ、これを、3Lの坂口フラスコ中
の50μlの消泡剤(Disform CE475、日本油脂東京)を含有する400mlのLB培地に加えた。
往復式振盪(170rpm/分)を行いながら37℃で18時間培養した後、5,000gで5分間の遠心分
離を行い、1Lの培養液から細胞を回収した。回収した細胞を、90mlの50mM Tris-HCl(pH7.
6)に懸濁した後、Branson社(コネチカット州ダンベリー)のモデル250 Sonifierを使用
して超音波処理を行った。4℃、12,000gで20分間の遠心分離で得られた上清を、50mM Tri
s-HCl(pH7.6)でカラムを平衡化したニッケルキレートカラム(ファルマ社、1.5×4.0cm)
に供した。140mlの50mM Tris-HCl(pH7.6)でカラムを洗浄し、0.1Mイミダゾールを含む50m
M Tris-HCl (pH7.6) 100mlを用いて、吸着アポイクオリン蛋白質を溶出した。
ら溶出したアポイクオリン(26mg)を、10mM EDTA及び5mM ジチオスレイトールを含む30mM
Tris-HCl(pH7.6) (TED緩衝液) 5mlに溶解し、4℃で18時間放置した。この混合液に100μl
の0.1M酢酸を加えることにより、白色のアポイクオリンを含む沈殿物を生成させる。この
白色沈殿物を、10,000 x gで10分間遠心分離を行うことによって回収した。得られた沈殿
物を5mlのTED緩衝液に加え、されに8μlの25%アンモニウア溶液を加え溶解した後、不溶
性の沈殿物を遠心分離によって除去し、その上清を精製アポイクオリンとした。
蛋白質分析
市販のキット(Bio-Rad社、カリフォルニア州リッチモンド)及び基準としてのウシ血
清アルブミン(Pierce社、イリノイ州ロックフォード)を用い、Bradfordの色素結合法(
Anal. Biochem. (1976)72, 248-254)によって、蛋白質の濃度を決定した。
また、Laemmli(Nature (1970) 227, 680-685)の記載の通りに、12%分離ゲル(テフ
コ株式会社、東京)を用い、還元性条件下でSDS-PAGE分析を行った。その結果、図1に示
すように、本精製法によって得られた精製アポイクオリンの純度は95%以上であることが
明らかとなった。
セレンテラミド及びアポイクオリンからの合成BFPの調製
10mM CaCl2及び1mM DTTを含む1mlの50mM Tris-HCl(pH 7.6)中、アポイクオリン(0.5mg
、22nmol)及び10μlのセレンテラミド(無水メタノール中1.2μg/μl、29nmol)を混合
し、この混合物を4℃で16時間静置することにより、合成BFP(syn-BFP)を調製した。続い
て、遠心濃縮器Vivaspin 2(10,000 MWCO、Sartorius AG、ドイツ)を用いて4℃、5,000 x
gで20分間処理し、混合物を0.1 mlまで濃縮した。濃縮された溶液は、長波UVランプ(366
nm)の下で強い青色発光を示した。
アポイクオリン及びセレンテラミドからの合成gFP (syn-gFP)の調製に関しては、10mM
EDTA及び 1mM DTTを含む1mlの50mM Tris-HCl(pH 7.6)中、アポイクオリン(0.5mg、22nmo
l)及び10μlのセレンテラミド(無水メタノール中1.2μg/μl、29nmol)を混合し、この
混合物を4℃で16時間静置することにより、合成gFP(syn-gFP)を調製した。335nmで励起す
ることにより、図2に示す蛍光発光スペクトルを得た。アポイクオリンとセレンテラミド
により、蛍光能を有するsyn-gFP の生成が確認された。
一方、syn-gFP及びsyn-BFP 調製溶液に、還元剤であるDTTが添加することにより、表2
にまとめたように、syn-gFP及びsyn-BFPを短時間に、効率良く調製することができること
が明らかとなった。
吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの測定
Jasco(日本分光株式会社、東京)のV-560分光光度計(帯域幅:0.5nm、レスポンス:
中程度、スキャン速度:100 nm/分)により、石英セル(光路長10mm)を用いて25℃で吸
収スペクトルを測定した。また、JascoのFP-6500蛍光分光光度計(発光/励起帯域幅: 3
nm、レスポンス:0.5 sec、スキャン速度:1000nm/分)を用いて蛍光スペクトルを測定し
た。
得られたsyn-gFPの蛍光スペクトルは、図3に示すように、イクオリンより調製したgFP
のスペクトルと一致した。また、表3に示すように、調製したsyn-BFPの吸収スペクトル
における280 nmと330 nm の比率は、イクオリンより調製したBFPとほぼ同じかそれ以上の
比を示すことから、同等物が作ることが可能となった。
発光活性のアッセイ
反応混合物(100μl)は、50mM Tris-HCl(pH7.6)-10mM CaCl2中にセレンテラジン(0.5μ
g、1μlのエタノール中に溶解)を含有していた。蛋白質溶液を加えることにより反応を
開始させ(1μgのBFP及びsyn-BFP)、浜松ホトニクス社製のR4220P光電子増倍管を備えた
アトー株式会社(東京)製のAB2200照度計を用いて、発光強度を1分間記録した。1ngの精
製組換えイクオリンの最大強度(Imax)は、8.8×105 rlu(relative light units:相対発
光量)を示した。
合成セレンテラミドを用いて調製したsyn-BFPは、図4に示すように、イクオリンより
調製したBFPと同等の発光活性を有していた。
〔配列番号:1〕天然型アポイクオリンの塩基配列である。
〔配列番号:2〕天然型アポイクオリンのアミノ酸配列である。
〔配列番号:3〕天然型アポクライティン−Iの塩基配列である。
〔配列番号:4〕天然型アポクライティン−Iのアミノ酸配列である。
〔配列番号:5〕天然型アポクライティン−IIの塩基配列である。
〔配列番号:6〕天然型アポクライティン−IIのアミノ酸配列である。
〔配列番号:7〕天然型アポマイトロコミンの塩基配列である。
〔配列番号:8〕天然型アポマイトロコミンのアミノ酸配列である。
〔配列番号:9〕天然型アポオベリンの塩基配列である。
〔配列番号:10〕天然型アポオベリンのアミノ酸配列である。
〔配列番号:11〕天然型アポベルボインの塩基配列である。
〔配列番号:12〕天然型アポベルボインのアミノ酸配列である。
〔配列番号:13〕実施例で用いたヒスチジンタグリンカーセットの塩基配列である。
〔配列番号:14〕実施例で用いたヒスチジンタグリンカーセットの塩基配列である。
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R2は、アミノであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
を、
下記一般式(2)
(式中、
Xは、脱離基であり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
に反応させることを含む、
下記一般式(3)
(式中、R1、R3、及びR4は、前記の通りである。)
の製造方法。
(2)一般式(1)において、
R1が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、上記(1)に記載の方法。
(3)一般式(1)において、
R3が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、s−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、α−メチルベンジル、フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、上記(1)又は(2)に記載の方法。
(4)一般式(2)において、
Xが、塩素、臭素、ヨウ素、メタンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、トルエンスルホニルオキシ、又は(4−R4O)C6H4CCOO−(式中、R4は前記の通りである。)である、上記(1)〜(3)のいずれか1項に記載の方法。
(5)一般式(2)において、
R4が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、上記(1)〜(4)のいずれか1項に記載の方法。
(6)一般式(1)で表わされる化合物が、下記化合物
(7)一般式(2)で表わされる化合物が、下記化合物
(8)下記式
(9)下記一般式(3)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
(10)下記式
(11)下記一般式(3)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
よりR1で示す基及びR4で示す基を脱離させることを含む、
下記一般式(4)
(式中、R3は前記の通りである。)
の製造方法。
(12)一般式(3)において、
R1が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、上記(11)に記載の方法。
(13)一般式(3)において、
R3が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、s−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、α−メチルベンジル、フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、上記(11)又は(12)に記載の方法。
(14)一般式(3)において、
R4が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、上記(11)〜(13)のいずれか1項に記載の方法。
(15)一般式(3)で表わされる化合物が、下記化合物
(16)下記式
(17)カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下において、
下記一般式(4)
(式中、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
を、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反応させることを含む、緑色蛍光蛋白質(gFP)の製造方法。
(18)カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下において、下記式
(19)前記反応を、還元剤の存在下において行う、上記(17)又は(18)に記載の方法。
(20)下記一般式(1)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R2は、アミノであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
を、
下記一般式(2)
(式中、
Xは、脱離基であり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
に反応させて、
下記一般式(3)
(式中、R1、R3、及びR4は、前記の通りである。)
を生成する工程と、
一般式(3)で表わされる化合物よりR 1 で示す基及びR 4 で示す基を脱離させて、
下記一般式(4)
(式中、R 3 は前記の通りである。)
を生成する工程と、
カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンの存在下、一般式(4)で表わされる化合物を、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反応させることを含む、青色蛍光蛋白質(BFP)の製造方法。
Claims (20)
- 下記一般式(1)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R2は、アミノであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
を、
下記一般式(2)
(式中、
Xは、脱離基であり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
に反応させることを含む、
下記一般式(3)
(式中、R1、R3、及びR4は、前記の通りである。)
の製造方法。 - 一般式(1)において、
R1が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、
フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、請求項1に記載の
方法。 - 一般式(1)において、
R3が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、s−ブチル、
t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル
、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル
メチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、α−メチル
ベンジル、フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、請求項
1又は2に記載の方法。 - 一般式(2)において、
Xが、塩素、臭素、ヨウ素、メタンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、ト
ルエンスルホニルオキシ、又は(4−R4O)C6H4CCOO−(式中、R4は前記の通り
である。)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 一般式(2)において、
R4が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、
フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、請求項1〜4のい
ずれか1項に記載の方法。 - 一般式(1)で表わされる化合物が、下記化合物
- 一般式(2)で表わされる化合物が、下記化合物
- 下記式
- 下記一般式(3)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。) - 下記式
- 下記一般式(3)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
よりR1で示す基及びR4で示す基を脱離させることを含む、
下記一般式(4)
(式中、R3は前記の通りである。)
の製造方法。 - 一般式(3)において、
R1が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、
フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、請求項11に記載
の方法。 - 一般式(3)において、
R3が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、s−ブチル、
t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル
、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル
メチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、α−メチル
ベンジル、フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、請求項
11又は12に記載の方法。 - 一般式(3)において、
R4が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、
フェネチル、3−フェニルプロピル、又は4−フェニルブチルである、請求項11〜13
のいずれか1項に記載の方法。 - 一般式(3)で表わされる化合物が、下記化合物
。 - 下記式
- カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを除去
するためのキレート剤の存在下において、
下記一般式(4)
(式中、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
を、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反応させることを含む、緑色蛍光蛋白質
(gFP)の製造方法。 - カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを除去
するためのキレート剤の存在下において、下記式
P)の製造方法。 - 前記反応を、還元剤の存在下において行う、請求項17又は18に記載の方法。
- 下記一般式(1)
(式中、
R1は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルであり、
R2は、アミノであり、
R3は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい炭素数1〜7のアルキル、脂肪族環
式基、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
を、
下記一般式(2)
(式中、
Xは、脱離基であり、
R4は、炭素数1〜3のアルキル、又は炭素数7〜10のアリールアルキルである。)
に反応させて、
下記一般式(3)
(式中、R1、R3、及びR4は、前記の通りである。)
を生成する工程と、
カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンの存在
下、一般式(3)で表わされる化合物を、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反
応させることを含む、青色蛍光蛋白質(BFP)の製造方法。
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JPN6014045079; FEBS Lett., 2004, 577(1-2), pp.105-110 * |
JPN6014045081; 化学と生物、1993年、31巻、3号、195〜200頁 * |
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