JP5637907B2 - v−セレンテラジン化合物の製造方法 - Google Patents
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Description
[1] 一般式(XIV)
(式中、R1は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換の炭化水素基、または置換もしくは非置換の複素環基である。)
で表されるv-セレンテラミン化合物の製造方法であって、
(1)一般式(VIII)
(式中、R1は、前記の通りであり、R4は、保護基である。)
で表される化合物とメチルトリフェニルホスホニウム塩とを塩基の存在下で反応させることにより一般式(IX)
(式中、R1およびR4は前記の通りである。)
で表される化合物を得る工程と、
(2)一般式(IX)で表される化合物、および一般式(IX)で表される化合物のアミノをR5で保護した一般式(X)
(式中、R1およびR4は前記の通りであり、R5は、保護基である。)
で表される化合物からなる群から選択されるいずれか1つを閉環メタセシス反応に供し、その後、R4および存在する場合にはR5を脱保護する工程を含む、方法。
[2] 一般式(II)
(式中、
R1は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換の炭化水素基、または置換もしくは非置換の複素環基であり、
R2およびR3は、それぞれ独立して、水素、水酸基、アルコキシル、ハロゲン、または置換もしくは非置換の炭化水素基である。)
で表されるv-セレンテラジン化合物の製造方法であって、
(1)一般式(VIII)
(式中、R1は、前記の通りであり、R4は、保護基である。)
で表される化合物とメチルトリフェニルホスホニウム塩とを塩基の存在下で反応させることにより一般式(IX)
(式中、R1およびR4は前記の通りである。)
で表される化合物を得る工程と、
(2) 一般式(IX)で表される化合物、および一般式(IX)で表される化合物のアミノをR5で保護した一般式(X)
(式中、R1およびR4は前記の通りであり、R5は保護基である。)
で表される化合物からなる群から選択されるいずれか1つを閉環メタセシス反応に供し、その後、R4および存在する場合にはR5を脱保護し一般式(XIV)
(式中、R1は前記の通りである。)で表されるv-セレンテラミン化合物を得る工程と、
(3)一般式(XIV)で表される化合物と一般式(XV)
(式中、R2´およびR3´は、それぞれ独立して、水素、水酸基、アルコキシル、ハロゲン、炭化水素基、または保護基によって保護された水酸基である。)で表される化合物とを反応させて一般式(II)で表される化合物を得る工程を含む、方法。
[3] 前記工程(1)において、塩基として、n−ブチルリチウム、カリウム−tert−ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、およびリチウムジイソプロピルアミドから選択される少なくとも1つの塩基を用いる、上記[1]または[2]に記載の方法。
[4] 前記工程(1)において、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、シクロプロピルメチルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、ジオキサン、およびトルエンから選択される少なくとも1つの溶媒を用いる、上記[1]〜[3]のいずれか1項に記載の方法。
[5] 前記工程(1)の反応温度および反応時間を、0 ℃〜40 ℃で1時間〜4時間とする、上記[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法。
[6] 前記工程(2)の閉環メタセシス反応の触媒として、第二世代Hoveyda-Grubbs触媒を用いる、上記[1]〜[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7] 前記工程(2)の閉環メタセシス反応の溶媒として、ジクロロエタン、ジクロロメタン、クロロホルム、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、およびジメトキシエタンから選択される少なくとも1つの溶媒を用いる、上記[1]〜[6]のいずれか1項に記載の方法。
[8] 前記工程(2)の閉環メタセシス反応の反応温度および反応時間を、25 ℃〜110 ℃で1時間〜48時間とする、上記[1]〜[7]のいずれか1項に記載の方法。
[9] 前記式中、R1は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリールアルケニル、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキル、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルケニル、脂肪族環基、複素環基、または脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキニルである、上記[1]〜[8]のいずれか1項に記載の方法。
[10] 前記式中、R2およびR3は、それぞれ独立して、水素、水酸基、ハロゲン、脂肪族環基によって置換されていてもよい炭素数1〜4のアルキル、トリフルオロメチル、またはアルコキシルである、上記[1]〜[9]のいずれか1項に記載の方法。
[11] 前記式中、R4は、メチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、4-メトキシベンジル、tert−ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、フェニルジメチルシリル、tert−ブチルジフェニルシリル、またはトリイソプロピルシリルである、上記[1]〜[10]のいずれか1項に記載の方法。
[12] 前記式中、R5は、アセチル、ベンゾイル、p-トシル、tert-ブトキシカルボニル、またはベンジルオキシカルボニルである、上記[1]〜[11]のいずれか1項に記載の方法。
[13] 前記式中、R2´およびR3´の水酸基を保護する保護基は、それぞれ独立して、tert−ブチルジメチルシリル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、トリメチルシリル、フェニルジメチルシリル、トリエチルシリル、フェニルジメチルシリル、tert−ブチルジフェニルシリル、またはトリイソプロピルシリルである、上記[2]〜[12]のいずれか1項に記載の方法。
[14] 前記一般式(VIII)で表される化合物が、
(1) 2-アミノ-3,5-ジブロモ-6クロロピラジンと、R1MgX(式R1は、前記の通りであり、Xは、ハロゲンである。)およびZnCl2とを、パラジウム触媒の存在下で反応させることにより一般式(V)
(式中、R1は前記の通りである。)
で表される化合物を得ることと、
(2) 一般式(V)で表される化合物と、式(VI)
(式中、R4は前記の通りである。)
で表される化合物とをパラジウム触媒と塩基の存在下で反応させることにより一般式(VII)
(式中、R1およびR4は前記の通りである。)
で表される化合物を得ることと、
(3) 一般式(VII)で表される化合物と、トリブチル(ビニル)スズとをパラジウム触媒の存在下で反応させること、
により得られる、上記[1]〜[13]のいずれか1項に記載の方法。
1. v-セレンテラジン化合物
本発明は、下記一般式(II)で表される化合物(本発明のv-セレンテラジン化合物)を提供する。
(式中、
R1は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換の炭化水素基、または置換もしくは非置換の複素環基であり、
R2およびR3は、それぞれ独立して、水素、水酸基、アルコキシル、ハロゲン、または置換もしくは非置換の炭化水素基である。)
R1は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリールアルケニル、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキル、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルケニル、脂肪族環基、複素環基、または脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキニルであり、
R2およびR3は、それぞれ独立して、水素、水酸基、ハロゲン、脂肪族環基によって置換されていてもよい炭素数1〜4のアルキル、トリフルオロメチル、またはアルコキシルである。
R1は、ベンジルであり、
R2は、水酸基、またはトリフルオロメチルであり、
R3は、水素である。
(式中、R1は、上記一般式(II)で説明した通りである。)
一般式(XIV)で表される化合物の製造方法(本発明のv-セレンテラミン化合物の製造方法)、および一般式(II)で表される化合物の製造方法(本発明のv-セレンテラジン化合物の製造方法)について説明する。
R2´およびR3´は、それぞれ独立して、水素、水酸基、アルコキシル、ハロゲン、置換もしくは非置換の炭化水素基、または保護された水酸基である。R2´およびR3´の「保護基によって保護された水酸基」における保護基は、例えば、tert−ブチルジメチルシリル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、フェニルジメチルシリル、tert−ブチルジフェニルシリル、またはトリイソプロピルシリルであり、好ましくは、tert−ブチルジメチルシリルである。
R2´は、好ましくは、tert−ブチルジメチルシリルオキシである。R3´は、好ましくは、水素である。
一般式(XIV)で表される化合物は、一般式(VIII)で表される化合物から、次のようにして製造することができる。
一般式(II)で表される化合物は、一般式(VIII)で表される化合物から、次のようにして製造することができる。
前記一般式(VIII)で表される化合物は、例えば、式(IV)で表される化合物から次のように製造することができる。
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、一般式(II)で表わされる化合物(本発明のv-セレンテラジン化合物)と、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを接触させて、カルシウム結合型発光蛋白質を得ることにより、製造または再生することができる。
(a)天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性もしくは機能を有する蛋白質、
(b)天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性もしくは機能を有する蛋白質、および
(c)天然型アポ蛋白質の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性もしくは機能を有する蛋白質。
(1)発光基質としての利用
本発明のいくつかの態様のv-セレンテラジン化合物は、発光触媒酵素の作用により発光するので、発光基質として利用できる。そこで、本発明は、本発明のv-セレンテラジン化合物に、発光触媒酵素を接触させることを含む、発光方法を提供する。ここで、「接触」とは、本発明のv-セレンテラジン化合物と発光触媒酵素とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、v-セレンテラジン化合物を収容した容器に発光触媒酵素を添加すること、発光触媒酵素を収容した容器にv-セレンテラジン化合物を添加すること、またはv-セレンテラジン化合物と発光触媒酵素とを混合すること、などが含まれる。
上記のようにして得た本発明の発光蛋白質は、アポ蛋白質と、v-セレンテラジン化合物および分子状酸素より生成するv-セレンテラジン化合物のペルオキシドとが非共有的な結合を形成したものであり、且つカルシウムイオンの作用によって発光する発光蛋白質(ホロ蛋白質)である。よって、本発明の発光蛋白質は、カルシウムイオンの検出または定量に使用することができる。
本発明の発光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列(例えば、エンハンサーなど)に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、さらに、これに、本発明のv-セレンテラジン化合物を接触させ、本発明の発光蛋白質に由来する発光を検出することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性を測定することができる。ここで、「接触」とは、宿主細胞とv-セレンテラジン化合物とを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば、宿主細胞の培養容器にv-セレンテラジン化合物を添加すること、宿主細胞とv-セレンテラジン化合物とを混合すること、宿主細胞をv-セレンテラジン化合物の存在下で培養することなどが含まれる。
本発明の発光蛋白質は、発光による検出マーカとして利用することができる。本発明の検出マーカは、例えば、イムノアッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。本発明の発光蛋白質を化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質(蛋白質或いは核酸など)と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。また、本発明の検出マーカは、例えば、アポ蛋白質と目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、さらに、これに、本発明のv-セレンテラジン化合物を接触させることによって、本発明の発光蛋白質を生成させて、前記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。ここで、「接触」とは、細胞と本発明のv-セレンテラジン化合物などとを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば、細胞の培養容器に本発明のv-セレンテラジン化合物などを添加すること、細胞と本発明のv-セレンテラジン化合物などとを混合すること、宿主細胞を本発明のv-セレンテラジン化合物などの存在下で培養することなどが含まれる。
アポ蛋白質と本発明のv-セレンテラジン化合物のペルオキシドとからなる複合体(本発明の発光蛋白質)は、微量のカルシウムイオンと結合するだけで発光する。よって、本発明の発光蛋白質は、アミューズメント用品の材料の発光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、発光シャボン玉、発光アイス、発光飴、発光絵の具などがあげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
本発明のいくつかの態様のv-セレンテラジン化合物は、前記のように、発光触媒酵素の作用により発光するので、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の解析(または測定) などの分析方法に利用することができる。また、本発明の発光蛋白質も、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定などの分析方法に利用することができる。
概要
本合成例に例示するv-セレンテラジン化合物の製造方法は、多様なv-セレンテラジン類縁体の製造に適用可能な柔軟性の高い高効率製造方法である。
(1)クロマトグラフィー
分析用薄層クロマトグラフィー(TLC)は、あらかじめシリカゲルが塗布されたガラスプレート(MERCK 5715、silica gel 60 F254)を用いて行った。スポット検出は、紫外線ランプ(254 nmまたは365 nm)、ヨウ素吸着、アニスアルデヒド水溶液に浸した後、ホットプレートで焼くことで行った。
分取用フラッシュカラムクロマトグラフィーには、シリカゲル(関東化学37563-85、silica gel 60N (spherical, neutral)、粒径45-50 μmまたは関東化学 37565-85、silica gel 60 N (spherical, neutral)、粒径 63-210 μm)を用いた。ただし、CTZ類縁体の精製の際には、シリカゲル(関東化学37562-79, silica gel 60N (spherical), 粒径 40-50 μmまたは関東化学37558-79, silica gel 60N (spherical), 粒径 100-210 μm)を用いた。
1H核磁気共鳴(NMR)スペクトル(400 MHz)は、Bruker社製、AVANCE 400またはAVANCE 500核磁気共鳴装置を用いて測定した。化学シフト(δ)は、tetramethylsilane((CH3)4Si)(CDCl3中での測定; 0 ppm)または測定溶媒の非重水素化体由来のピーク(CD3ODでの測定:3.31 ppm;DMSO-d6での測定:2.49 ppm)を内部標準として相対的値として表した。シグナル***線様式の略語s、d、mはそれぞれ単重線、二重線、多重線を表す。
13C核磁気共鳴スペクトル(100 MHz)は、Bruker社製、AVANCE400核磁気共鳴装置を用いて測定した。化学シフト(δ)は、測定溶媒の炭素由来のピーク(CDCl3中での測定:77.0 ppm;CD3ODでの測定:49.0 ppm)を内部標準として相対的値として表した。
IRスペクトルは、DRS-8000を装着した島津製作所社製、SHIMAZU IRPrestige-21 spectrophotometerを用い、拡散反射法により測定した。
高分解能質量分析スペクトル(HRMS)は、Bruker社製Bruker micrOTOFを用い、エレクトロスプレーイオン化法(ESI)により測定した。
すべての試薬は特に記さない限り、市販のものをそのまま使用した。反応、抽出、クロマトグラフィー用の溶媒には、アセトニトリル、酢酸エチル、n-ヘキサン、脱水テトラヒドロフラン(THF)、トルエン、脱水ピリジン、1,2-ジクロロエタン、脱水ジクロロメタン、メタノール、エタノールの市販品をそのまま用いた。なお、断りが無い場合は、使用した混合溶媒における混合比率は「v/v」である。
1) レニラルシフェラーゼ発現ベクター pCold-RLの構築
新規発現ベクター pCold-RLは、以下の手順で構築した。Inouyea& Shimomura, Biochem. Biophys. Res. Commun., 233(1997) 349-353記載のレニラルシフェラーゼを有するベクター pHis-RLを鋳型として2種のPCRプライマーRL-17N/SacI(5’ gcc GAG CTC ACT TCG AAA GTT TAT GAT CC 3’:配列番号:21)およびRL-18C/XhoI(5’ cgg CTC GAG TTA TTG TTC ATT TTT GAG AA 3’ :配列番号:22)を用いて、PCRキット(タカラバイオ社製)にてPCR(サイクル条件:25サイクル;1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃)を行った。得られた断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製し、制限酵素SacI/XhoIで消化した後、ベクター pCold-II (タカラ社製、GenBank: AB186389)の制限酵素SacI/XhoI部位に挿入する事によってレニラルシフェラーゼ発現ベクター pCold-RLを作製した。なお、インサートDNAの塩基配列は、DNA シークエンサー(ABI社製)にて確認した。
変異レニラルシフェラーゼ-547遺伝子(hRL-547)を有する新規発現ベクター pCold-hRL-547は、以下の手順で構築した。化学合成法とPCR法により作製した変異レニラルシフェラーゼ-547遺伝子を有するベクター pCR2.1-hRL-547プラスミドを構築した。変異レニラルシフェラーゼ-547遺伝子は、Nature Methods, 4(2007)641-643記載のRLuc8.6-547を元に設計し、常法の化学合成法とPCR法の組合せにより合成し(オペロン社)、pCR2.1(Invitrogen社)のAsp718/EcoRI制限酵素サイトにクローン化することによりpCR2.1-hRL-547を構築した。次いで、pCold-hRL-547ベクターを構築するため、pCR2.1-hRL-547を制限酵素Asp718/EcoRIで消化した後、ベクター pCold-IIの制限酵素Asp718/EcoRI部位に挿入してレニラルシフェラーゼ-547発現ベクター pCold-hRL-547を作製した。なお、インサートDNAの塩基配列は、DNA シークエンサー(ABI社製)にて確認した。
hRL-547をコードするDNAの塩基配列を、配列番号:19に示す。また、hRL-547のアミノ酸配列を配列番号:20に示す。
1) 組換え蛋白質の大腸菌での発現
大腸菌において組換え蛋白質を発現させるために、レニラルシフェラーゼ遺伝子発現ベクター pCold-RL、レニラルシフェラーゼ-547遺伝子発現ベクター pCold-hRL-547を用いた。常法により大腸菌BL21に導入し、得られた形質転換株をアンピシリン(50μg/mL)を含有する10 mLのLB液体培地(水1Lあたり、バクトトリプトン 10 g、イーストイクストラクト 5 g、塩化ナトリウム 5 g、pH7.2)に植菌し、37℃で16時間培養を行った。その培養物を新たなLB液体培地400 mL x 5本(総量2L)に添加して37℃で4.5時間培養を行い、1時間氷冷後、0.2 mMのIPTGを加えて15℃で17時間培養を行った。培養後、菌体を遠心回収(5,000 rpm、5分)し、蛋白質抽出の出発材料とした。
集菌した培養菌体を200 mLの50 mM Tris-HCl (pH7.6)で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理(ブランソン社製、Sonifier model cycle 250)を3分間、3回行い、その菌体破砕液を10,000 rpm(12,000×g)で4℃、20分間遠心した。得られた可溶画分を、ニッケルキレートカラム(アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ:直径2.5×6.5 cm)に供し、組換え蛋白質を吸着させた。500 mLの50 mM Tris-HCl (pH7.6)で洗浄後、0.1 Mイミダゾール(和光純薬工業社製)を含む50 mM Tris-HCl (pH7.6)により目的の組換え蛋白質を溶出した。蛋白質濃度は、Bradford法のもとづく市販のキット(バイオラッド社製)を用い、ウシ血清アルブミン(ピアス社製)を標準物質として用いて決定した。精製過程における収率を表1へ示した。
レニラルシフェラーゼ(2.94 ng)またはレニラルシフェラーゼ-547(14.3 ng)を96穴マイクロプレート(ヌンク社製)のウェルに10μL分注した後、発光プレートリーダーCentro LB960(ベルトール社製)を用いて、基質セレンテラジンまたはv-セレンテラジン 0.05μgを含む30 mM Tris-HCl (pH 7.6)-10 mM EDTAを0.1 mL注入することにより発光反応を開始させ、発光量を測定した。発光強度は0.1秒間隔で60秒間、3回測定し、最大発光強度(Imax)および60秒間の積算値の平均値(rlu)を相対活性(%)で示した(表2)。
発光反応は、エタノールに溶解した基質セレンテラジンまたはv-セレンテラジン5μg(1μg/μL)を含む1 mLの50 mM Tris-HCl(pH7.6)-10 mM EDTAに、各々ルシフェラーゼを加えることにより開始させた。使用したルシフェラーゼの蛋白量は、基質セレンテラジンではレニラルシフェラーゼ; 1.5μg、レニラルシフェラーゼ-547; 7.2μgである。一方、基質v-セレンテラジンではレニラルシフェラーゼ; 14.7μg、レニラルシフェラーゼ-547; 35.8μgである。発光スペクトルは、蛍光発光測定装置FP-6500(日本分光社製)にて、励起光源をオフにして、バンド幅; 20 nm、感度; Medium、スキャン速度; 2000 nm/分、22〜25℃の条件下、光路長10 mmの石英セルを用いて測定した。測定したスペクトルから、発光極大値(λmax, nm)と半値幅(nm)を求め、表3に示した。
[配列番号:2]天然型アポイクオリンのアミノ酸配列である。
[配列番号:3]天然型アポクライティン−Iの塩基配列である。
[配列番号:4]天然型アポクライティン−Iのアミノ酸配列である。
[配列番号:5]天然型アポクライティン−IIの塩基配列である。
[配列番号:6]天然型アポクライティン−IIのアミノ酸配列である。
[配列番号:7]天然型アポマイトロコミンの塩基配列である。
[配列番号:8]天然型アポマイトロコミンのアミノ酸配列である。
[配列番号:9]天然型アポオベリンの塩基配列である。
[配列番号:10]天然型アポオベリンのアミノ酸配列である。
[配列番号:11]天然型アポベルボインの塩基配列である。
[配列番号:12]天然型アポベルボインのアミノ酸配列である。
[配列番号:13]レニラ(Renilla)ルシフェラーゼの塩基配列である。
[配列番号:14]レニラ(Renilla)ルシフェラーゼのアミノ酸配列である。
[配列番号:15]エビ(Oplophorus)ルシフェラーゼの塩基配列である。
[配列番号:16]エビ(Oplophorus)ルシフェラーゼのアミノ酸配列である。
[配列番号:17]ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼの塩基配列である。
[配列番号:18]ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼのアミノ酸配列である。
[配列番号:19]レニラルシフェラーゼ変異体の塩基配列である。
[配列番号:20]レニラルシフェラーゼ変異体のアミノ酸配列である。
[配列番号:21] PCRプライマーRL-17N/SacIの塩基配列である。
[配列番号:22] PCRプライマーRL-18C/XhoIの塩基配列である。
Claims (14)
- 一般式(XIV)
(式中、R1は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換の炭化水素基、または置換もしくは非置換の複素環基である。)
で表されるv-セレンテラミン化合物の製造方法であって、
(1)一般式(VIII)
(式中、R1は、前記の通りであり、R4は、保護基である。)
で表される化合物とメチルトリフェニルホスホニウム塩とを塩基の存在下で反応させることにより一般式(IX)
(式中、R1およびR4は前記の通りである。)
で表される化合物を得る工程と、
(2)一般式(IX)で表される化合物、および一般式(IX)で表される化合物のアミノをR5で保護した一般式(X)
(式中、R1およびR4は前記の通りであり、R5は、保護基である。)
で表される化合物からなる群から選択されるいずれか1つを閉環メタセシス反応に供し、その後、R4および存在する場合にはR5を脱保護する工程を含む、方法。 - 一般式(II)
(式中、
R1は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換の炭化水素基、または置換もしくは非置換の複素環基であり、
R2およびR3は、それぞれ独立して、水素、水酸基、アルコキシル、ハロゲン、または置換もしくは非置換の炭化水素基である。)
で表されるv-セレンテラジン化合物の製造方法であって、
(1)一般式(VIII)
(式中、R1は、前記の通りであり、R4は、保護基である。)
で表される化合物とメチルトリフェニルホスホニウム塩とを塩基の存在下で反応させることにより一般式(IX)
(式中、R1およびR4は前記の通りである。)
で表される化合物を得る工程と、
(2) 一般式(IX)で表される化合物、および一般式(IX)で表される化合物のアミノをR5で保護した一般式(X)
(式中、R1およびR4は前記の通りであり、R5は保護基である。)
で表される化合物からなる群から選択されるいずれか1つを閉環メタセシス反応に供し、その後、R4および存在する場合にはR5を脱保護し一般式(XIV)
(式中、R1は前記の通りである。)で表されるv-セレンテラミン化合物を得る工程と、
(3)一般式(XIV)で表される化合物と一般式(XV)
(式中、R2´およびR3´は、それぞれ独立して、水素、水酸基、アルコキシル、ハロゲン、炭化水素基、または保護基によって保護された水酸基である。)で表される化合物とを反応させて一般式(II)で表される化合物を得る工程を含む、方法。 - 前記工程(1)において、塩基として、n−ブチルリチウム、カリウム−tert−ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、およびリチウムジイソプロピルアミドから選択される少なくとも1つの塩基を用いる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記工程(1)において、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、シクロプロピルメチルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、ジオキサン、およびトルエンから選択される少なくとも1つの溶媒を用いる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(1)の反応温度および反応時間を、0 ℃〜40 ℃で1時間〜4時間とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(2)の閉環メタセシス反応の触媒として、第二世代Hoveyda-Grubbs触媒を用いる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(2)の閉環メタセシス反応の溶媒として、ジクロロエタン、ジクロロメタン、クロロホルム、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、およびジメトキシエタンから選択される少なくとも1つの溶媒を用いる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(2)の閉環メタセシス反応の反応温度および反応時間を、25 ℃〜110 ℃で1時間〜48時間とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記式中、R1は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリールアルケニル、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキル、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルケニル、脂肪族環基、複素環基、または脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキニルである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記式中、R2およびR3は、それぞれ独立して、水素、水酸基、ハロゲン、脂肪族環基によって置換されていてもよい炭素数1〜4のアルキル、トリフルオロメチル、またはアルコキシルである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記式中、R4は、メチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、4-メトキシベンジル、tert−ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、フェニルジメチルシリル、tert−ブチルジフェニルシリル、またはトリイソプロピルシリルである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記式中、R5は、アセチル、ベンゾイル、p-トシル、tert-ブトキシカルボニル、またはベンジルオキシカルボニルである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記式中、R2´およびR3´の水酸基を保護する保護基は、それぞれ独立して、tert−ブチルジメチルシリル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、トリメチルシリル、フェニルジメチルシリル、トリエチルシリル、フェニルジメチルシリル、tert−ブチルジフェニルシリル、またはトリイソプロピルシリルである、請求項2〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記一般式(VIII)で表される化合物が、
(1) 2-アミノ-3,5-ジブロモ-6クロロピラジンと、R1MgX(式R1は、前記の通りであり、Xは、ハロゲンである。)およびZnCl2とを、パラジウム触媒の存在下で反応させることにより一般式(V)
(式中、R1は前記の通りである。)
で表される化合物を得ることと、
(2) 一般式(V)で表される化合物と、式(VI)
(式中、R4は前記の通りである。)
で表される化合物とをパラジウム触媒と塩基の存在下で反応させることにより一般式(VII)
(式中、R1およびR4は前記の通りである。)
で表される化合物を得ることと、
(3) 一般式(VII)で表される化合物と、トリブチル(ビニル)スズとをパラジウム触媒の存在下で反応させること、
により得られる、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
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