JP2013021959A - 核酸抽出方法及び核酸抽出用カートリッジ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、吸着担体により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を同一セル内で行う核酸抽出方法を提供する。この核酸抽出方法では、同一セル内で、超音波処理、吸着、及び電気泳動を行うことができ、操作毎にセル内からサンプルを移し換えたりする作業を省略することが可能である。
【選択図】図1
Description
また、上記吸着担体としては、好ましくは、陽イオン交換樹脂又はゼオライトを用いる。また、上記陽イオン交換樹脂としては、強酸性陽イオン交換樹脂を用いることが好ましい。
また、上記超音波処理は、上記サンプルにビーズ粒子を混合してから行うことが好ましい。また、上記物質は、上記核酸以外の夾雑物であることが好ましい。
また、上記サンプルの超音波処理をする手順は、上記サンプルを緩衝液で希釈し、該サンプルの超音波処理をする手順であり、上記緩衝液のpHは、4.0〜8.0であることが好ましい。また、上記緩衝液には増粘剤が含まれることが好ましい。また、上記増粘剤にはポリエチレングリコール及び/又はヒドロキシエチルセルロースが含まれることが好ましい。なお、上記セルとは、後述する核酸抽出用カートリッジを主に指す。また、夾雑物とは、サンプル中の核酸の分析において、不要な種々のタンパク質、ペプチド、糖、塩、金属イオン等の物質を主に指す。
1.本技術の第1実施形態に係る核酸抽出用カートリッジ、核酸抽出方法、及び核酸抽出用カートリッジの製造方法
(1)核酸抽出用カートリッジ
(2)核酸抽出方法
(3)核酸抽出用カートリッジの製造方法
2.本技術の第1実施形態の変形例に係る核酸抽出用カートリッジ、核酸抽出方法、及び核酸抽出用カートリッジの製造方法
(1)核酸抽出用カートリッジ
図1は、本技術の第1実施形態に係る核酸抽出用カートリッジの構成を説明するための模式図である。
次に、本技術に係る核酸抽出方法の手順について、図2(A)〜(D)を参照しながら説明する。
本技術の第1実施形態に係る核酸抽出用カートリッジ1は、基材中に形成されたチャネル11内に透析膜14を挿入し、チャネル11を正極側領域112と負極側領域113とに区分けし、負極側領域113内に吸着担体を収容し、超音波ホーン15を設置することによって製造することができる。
次に、ここで、図3を参照しながら、本技術の第1実施形態の変形例に係る核酸抽出用カートリッジ101について説明する。図3は、本技術の第1実施形態の変形例に係る核酸抽出用カートリッジ101の構成を説明するための模式図である。なお、本変形例において、本実施形態と実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、重複説明を省略する。
(1)核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、吸着担体により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を同一セル内で行う核酸抽出方法。
(2)前記吸着担体としては、陽イオン交換樹脂又はゼオライトを用いる、前記(1)記載の核酸抽出方法。
(3)前記陽イオン交換樹脂としては、強酸性陽イオン交換樹脂を用いる、前記(2)記載の核酸抽出方法。
(4)前記サンプルにビーズ粒子を混合し、前記超音波処理をする、前記(1)〜(3)のいずれか1つに記載の核酸抽出方法。
(5)前記物質は、前記核酸以外の夾雑物である、前記(1)〜(4)のいずれか1つに記載の核酸抽出方法。
(6)前記サンプルの超音波処理をする手順は、前記サンプルを緩衝液で希釈し、該サンプルの超音波処理をする手順であり、前記緩衝液のpHは、4.0〜8.0である、前記(1)〜(5)のいずれか1つに記載の核酸抽出方法
(7)前記緩衝液には増粘剤が含まれる、前記(1)〜(6)のいずれか1つに記載の核酸抽出方法。
(8)前記増粘剤にはポリエチレングリコール及び/又はヒドロキシエチルセルロースが含まれる、前記(1)〜(7)記載の核酸抽出方法。
(9)核酸を含有するサンプルを導入可能なチャネルと、前記チャネルの両端に電極と、前記チャネルを負極側領域と正極側領域とに区分けし、前記核酸を堰き止める堰止部と、前記負極側領域に、前記サンプルに含まれる物質を吸着する吸着担体と、前記サンプルを超音波処理する超音波発生部と、からなる核酸抽出用カートリッジ。
(10)前記超音波発生部は、前記電極と同一部材で構成されている、前記(9)記載の核酸抽出用カートリッジ。
(11)前記堰止部は、透析膜又は高分子ゲルである、前記(9)又は(10)記載の核酸抽出用カートリッジ。
(12)前記超音波発生部は、超音波プローブ又は超音波ホーンである、前記(9)〜(11)のいずれか1つに記載の核酸抽出用カートリッジ。
(1−1.ゼオライトによる核酸精製能)
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)にプロトン型ゼオライトを100mg計量して入れた。次いで、0.5%SDSを含む50mM MESバッファー(pH5)を調整し、BSAを0.5%となるように加え、さらにCy3修飾した20merオリゴDNAを5μMとなるように加えた。このタンパク質と核酸の混合液を、常温にて十分に攪拌させた後、ゼオライト封入スピンカラムに200ul滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。スピンダウンした液をNanodropにて吸光度測定し、ゼオライト処理前後の吸光度の違いから、核酸精製能を評価した。BSAの吸光度はProtein A280モードで評価し、核酸の吸光度はmicro arrayモードでCy3の吸光度で評価した。評価結果を図4に示す。
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S(Bio Rad社製))を100mg計量して入れた。次いで、50mM MESバッファー(pH5)を調整し、BSAを0.5%となるように加え、さらにCy3修飾した20merオリゴDNAを5μMとなるように加えた。このタンパク質と核酸の混合液を、常温にて十分に攪拌させた後、強酸性陽イオン交換樹脂封入スピンカラムに200ul滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。スピンダウンした液をNanodropにて吸光度測定し、強酸性陽イオン交換樹脂処理前後の吸光度の違いから、核酸精製能を評価した。BSAの吸光度はProtein A280モードで評価し、核酸の吸光度はmicro arrayモードでCy3の吸光度で評価した。評価結果を図5に示す。
(実施例1)
<超音波処理>
EDTA採血ウシ全血にビフィズス菌を濃度が1000個/uLになるように添加し、2mLのポリプロピレンチューブに1mL分注して、超音波ホーンを浸漬し振動数40kHzで2分間破砕処理を行った。
次に、スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)にプロトン型ゼオライトを100mg計量して入れた。上記のタンパク質と核酸の混合液を、常温にて十分に攪拌させた後、ゼオライト封入スピンカラムに200ul滴下し、十分に攪拌させた。
次に、核酸抽出用カートリッジの電極に電圧をDC100Vで20分間印加し、サンプルの電気泳動を行った。
次に、サンプル、酵素、蛍光色素、核酸モノマー、バッファー、ターゲット核酸鎖増幅用のプライマーセット、リアルタイム測定用のプローブを混合し、LAMP反応液を調製した。LAMP反応は、リアルタイム計測が可能なサーマルサイクラーChromo4(バイオラッド、米国)を用いて測定を行った。プローブは、消光プローブのQPプローブ(J-bio21, 日本: http://www.j-bio21.co.jp/tech/qpmethod.htm([平成23年7月19日]、題目:QP法))を使用しているので、核酸の増幅と共に蛍光強度の低下が観察される。
図6に、前処理の各工程から抜き出してLAMP反応を評価した結果を示す。図中、「超音波」と記した結果は、超音波破砕処理のみを行ったサンプルを用いた場合の標的核酸鎖の増幅量をリアルタイムで測定したものである。また、「超音波+ゼオライト」と記した結果は、超音波破砕処理及び吸着処理を行ったサンプルを用いた場合の標的核酸鎖の増幅量をリアルタイムで測定したものである。また、「超音波+ゼオライト+電気泳動濃縮」と記した結果は、超音波破砕処理、吸着処理、及び電気泳動濃縮を行ったサンプルを用いた場合の標的核酸鎖の増幅量をリアルタイムで測定したものである。
Claims (12)
- 核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、
吸着担体により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び
電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を同一セル内で行う核酸抽出方法。 - 前記吸着担体としては、陽イオン交換樹脂又はゼオライトを用いる、請求項1記載の核酸抽出方法。
- 前記陽イオン交換樹脂としては、強酸性陽イオン交換樹脂を用いる、請求項2記載の核酸抽出方法。
- 前記サンプルにビーズ粒子を混合し、前記超音波処理をする、請求項3記載の核酸抽出方法。
- 前記物質は、前記核酸以外の夾雑物である、請求項4記載の核酸抽出方法。
- 前記サンプルの超音波処理をする手順は、
前記サンプルを緩衝液で希釈し、該サンプルの超音波処理をする手順であり、
前記緩衝液のpHは、4.0〜8.0である、請求項5記載の核酸抽出方法。 - 前記緩衝液には、増粘剤が含まれる、請求項6記載の核酸抽出方法。
- 前記増粘剤には、ポリエチレングリコール及び/又はヒドロキシエチルセルロースが含まれる、請求項7記載の核酸抽出方法。
- 核酸を含有するサンプルを導入可能なチャネルと、
前記チャネルの両端に電極と、
前記チャネルを負極側領域と正極側領域とに区分けし、前記核酸を堰き止める堰止部と、
前記負極側領域に、前記サンプルに含まれる物質を吸着する吸着担体と、
前記サンプルを超音波処理する超音波発生部と、からなる核酸抽出用カートリッジ。 - 前記超音波発生部は、前記電極と同一部材で構成されている、請求項9記載の核酸抽出用カートリッジ。
- 前記堰止部は、透析膜又は高分子ゲルである、請求項10記載の核酸抽出用カートリッジ。
- 前記超音波発生部は、超音波プローブ又は超音波ホーンである、請求項11記載の核酸抽出用カートリッジ。
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