JP2005532072A - サンプルから核酸を単離するための装置および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Defense Directorate of Research and EngineeringからLincoln Contract Number FI9628-95-C-0002によって全体的にまたは部分的に支援された。政府は本発明に所定の権利を有する。
核酸は、一般にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)手順によって解析される。医学的診断のために収集されたサンプル中で、法医学調査の間に、または防衛関連適用において頻繁に直面するPCRインヒビターの存在はPCR-増幅を妨げる。
本発明は、一般に増幅用にサンプルの核酸成分を調製するための方法および装置に関する。
本発明の好ましい態様が以下に記載される。
IsoCode(登録商標)ペーパーの通常の商業的使用方法は、以下の工程を含む。
・試料を直接IsoCode(登録商標)ペーパーに適用する;
・乾燥または焼成を介して乾燥させる;
・脱イオン水(dH2O)中でボルテックスすることによりすすぐ;
・すすいだIsoCodeをdH2O中に浸し、95℃で30分間加熱する;
・DNAをペーパーから外すためにパルスボルテックスする;
・DNAはPCR増幅に使用できる状態にある。
1. アルミニウム計量皿(または任意の疎水性、非シリカベースの計量コンテナ)中に50mgのマトリックスを計量する。
2. 別の清潔な計量皿へIsoCode(登録商標)ペーパーの三角形片を置く。
3. 試料から15μL取り出せるために必要な量の蒸留水をマトリックスへ添加する。これは通常、砂状土壌に対しては25〜30μL、細粒土壌または粘土含有土壌に対しては35〜40μL、他のマトリックスに対しては様々な量である。
4. ほぼ均質なスラリーが形成されるまで、水を試料へ添加するのに用いたピペットチップでマトリックスおよび水をよく混合する。可能であれば試料の混合度を増大させるためにぺピットで上げ下げする。ピペット汚染を最小化するためにフィルターチップを用いる。
5. 同じピペットチップで、スラリーから約15μLの液体を抽出する;その中に懸濁された土壌をある程度含んでいてもよい。
6. その液体をIsoCode(登録商標)へ適用する。
7. 真空下において60℃で最短で15分間(もしくは全体的に乾燥するまで)IsoCoe片を焼成する、または室温で密閉コンテナ内で乾燥剤と共に最短で4時間乾燥させる。
8. 乾燥したIsoCode片をオーブンから出し、各試料に対して500μLの蒸留水入りの1.5mLチューブ(洗浄チューブ)1個および50μLの蒸留水入りの0.5mLチューブ(溶出液チューブ)1個を準備する。溶出液チューブには試料番号を標識する必要があるが、洗浄チューブにはない。
9. IsoCode(登録商標)片を、それに触れることなく洗浄チューブ内に置く。蓋を閉め、ボルテックスを2〜3回、各1秒間行う。
10. チューブの蓋を開け、清潔なピペットチップを用いてIsoCode(登録商標)片を取り出し、溶出液チューブへ入れ、チューブを閉める。IsoCode(登録商標)が完全に水に浸っており、それに接触している気泡が無いことをことを確認する。洗浄チューブを廃棄する。各回ごとに新しいピペットチップを用いて残りの試料に対して再度行う。
11. サーモサイクラーまたはヒーティングブロックを用いて全ての溶出液チューブを95℃で30分間加熱する。この工程の後直ちにチューブを後処理できない場合は、4℃に冷やして保持する。
12. チューブが冷えたらサーモサイクラーから取り出し、IsoCode片を廃棄する前にそのペーパーからチューブ内へできるだけ多くの液体を抽出するようにピペットチップを用いてチューブから各ペーパーを取り出す。各試料に対して新しいピペットチップを使用する。
13. 溶出液はPCR解析に使用できる状態にある。
1. 液体試料を滴下するかまたはサンプリング対象の表面をぬぐうことにより多孔性支持体(IsoCode(登録商標)ペーパー)に試料を適用する。
2. 5分待つ。
3. アセンブリのハウジングを既に100〜200マイクロリットルの水またはバッファー含有水を含むコンテナ内へ挿入することにより、水またはバッファー含有水を多孔性支持体に押し通す。
4. 取り外し可能な蓋を外すことによりアセンブリのハウジングを開けた後、ピペットチップで溶出液(試料の核酸成分を含む水)を取り出す。
1. 液体試料を滴下するかまたはサンプリング対象の表面をぬぐうことにより多孔性支持体(IsoCode(登録商標)ペーパー)に試料を適用する。
2. 5分待つ。
3. アセンブリのハウジングを、既に100〜200マイクロリットルの水またはバッファー含有水を含むコンテナ内へ多孔性支持体がコンテナ内の液体と接触するまで押す。
4. 5〜10分待つ。
5. コンテナ内へアセンブリのハウジングを十分に押し込むことにより、水またはバッファー含有水を多孔性支持体に押し通す。
4. 取り外し可能な蓋を外すことによりアセンブリのハウジングを開けた後、ピペットチップで溶出液(試料の核酸成分を含む水)を取り出す。
PCR増幅操作およびデータ解析
ABI PRISM(登録商標)7700シーケンスデテクションシステム(パート♯7700-01-200/208、Applied Biosystems製、850 Lincoln Centre Drive、Foster City、California、94404)を用いて一連のDNA試料に対して行ったポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅操作(以後、「TaqMan」という)からデータを得た。
増殖期の微生物培養物は、微生物の冷凍ストックから微生物増殖培地中で調製する。培養物を対数増殖後期まで一晩培養し、典型的な培養物は増殖培地中に約108細胞/mLを含む。接種に用いられるストック培養液の希釈液を増殖培地である希釈液または試料が接種される液体中での容積測定希釈により調製する。典型的な一連の希釈は、10倍刻みで1:10(微生物培養物:希釈液)〜1:106の希釈からなる。ボルテックスで試料を混合する。
上記に説明し図1Aに図示したアセンブリ10などのアセンブリ中の多孔性支持体上に乾燥胞子を空気から回収した。
図1Aについて上記したようなアセンブリを、数個の試料の核酸成分を増幅用に調製するために使用した。様々な希釈度の微生物細胞培養物を含む埃で汚染された水を接種することで試料を調製した。比較プロトコルBおよびIsoCodeの製造業者により提供される一般的プロトコルを用いて試料を処理した。TaqMan増幅結果を図15に示す。結果から、一般的なプロトコルを用いて処理した同一の試料と比較して、図1Aに記載のアセンブリを用いた全ての試料においてサイクル域の低減が得られたことが示唆される。
試料中の核酸増幅化合物を不活性化する能力のある多孔性支持体と共に電場を使用する利点を証明するために、プロトコルCを開発した。プロトコルCは電気溶出デバイスを用いて行った。
1. 基本プロトコル(比較プロトコルAに記載のとおり)の工程1〜7のとおりにIsoCode(登録商標)試料を調製する。
2. 電気溶出ジグ140の下部(プレート150、148、146)を組立てる。DNAを電極152(陽極)へ通す。
3. IsoCode(登録商標)ペーパーを電気溶出ジグ140のサンプルウェル中に置く。
4. ウェルの上面までろ過した蒸留水を加える。
5. 100Daセルロースアセテート膜を加える。
6. ジグ140の上部(プレート144、142)を下部に組込む。ろ過した蒸留水をウェルに加える。
7. 上側電極152をジグ140に挿入する。
8. 電極148(陰極)および152(陽極)へ5分間電圧をかける。
9. 電圧源を外す(代替的に、電極152に付着し得る任意の核酸成分を払い落とすために上側電極に一瞬リバース‐バイアスをかけてもよい)。
10. 電極152を外す。核酸を含む溶出液をウェルから取り出し、0.5mLチューブ内に移す。
11. ペーパーおよび膜を廃棄する。
12. 溶出液はPCR解析に使用できる状態である。
本発明は、その好ましい態様を参考と共に詳細に示され、記載されているが、形式および詳細部分における種々の変化が、添付された特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが当業者によって理解されよう。
Claims (21)
- a)多孔性支持体に接触するサンプルの核酸増幅インヒビター成分を不活化する薬剤を含む多孔性支持体;
b)開口部を有し、内部を規定するハウジング、該内部は多孔性支持体と液体をやり取りし、それにより開口部を通過した液体の少なくとも一部は多孔性支持体の少なくとも一部を通過し、多孔性支持体から多孔性支持体に接触するサンプルの核酸成分の少なくとも一部を分離し、それにより増幅用核酸成分を調製する;および
c)サンプルの少なくとも一部から核酸成分を分離するため、および多孔性支持体に核酸成分を沈着させるための、磁性基材を含む分離手段
を含有してなる、増幅用にサンプルの核酸成分を調製するための装置。 - 前記分離手段が:
a)第1の末端に入り口を有し、該第1の末端の遠位にある第2の末端に出口を有する容器;
b)容器内に含まれる、磁性ビーズを含むアンプル;
c)容器の第2の末端上のバルブ;および
d)該バルブ上に磁石
を含有してなる請求項1記載の装置。 - 前記分離手段が前記アンプル中にバッファーを含んでなる請求項2記載の装置。
- バルブが回転でき、それによりバルブの一方の末端に保持された磁性ビーズをバルブの第2の末端に移動させることができ、それにより多孔性支持体に接触させる請求項2記載の装置。
- 磁石がバルブから移動することができ、それによりバルブが一方の位置にある間は、磁性ビーズが容器内の磁石に付着され得、バルブが第2の位置にある間は、磁石は移動することができ、磁性ビーズは放出され、多孔性支持体に接触する請求項4記載の装置。
- 容器の第1の末端に取り外し可能なキャップをさらに含んでなる請求項5記載の装置。
- 磁石が容器中の磁性ビーズを上方に引き寄せる位置にある請求項5記載の装置。
- ハウジングが取り外し可能である請求項1記載の装置。
- 磁性基材がストレプトアビジンで被覆されている請求項1記載の装置。
- a)未処理サンプル成分から、磁性基材を含む手段を介してサンプルを分離する工程;
b)サンプルと、サンプルの核酸増幅インヒビター成分を不活化する多孔性支持体とを接触させる工程;および
c)液体を多孔性支持体に通し、それによりサンプルの核酸成分が多孔性支持体の少なくとも一部を通過し、該多孔性支持体から分離され、それにより増幅用に核酸成分を調製する工程
を含む、増幅用にサンプルの核酸成分の調製方法。 - 磁性基材にサンプルを接触させることにより未処理サンプル成分からサンプルを分離し、それにより未処理サンプル成分を除去する請求項10記載の方法。
- 磁性基材が磁性ビーズの形態である請求項11記載の方法。
- 磁性基材が疎水性材料で被覆される請求項10記載の方法。
- 磁性基材が親水性材料で被覆される請求項10記載の方法。
- 磁性基材が二酸化ケイ素で被覆される請求項10記載の方法。
- 磁性基材がストレプトアビジンで被覆される請求項10記載の方法。
- 磁性基材が、スポア、増殖期の細菌細胞、DNAまたはその組み合わせを含むサンプルに接触する請求項10記載の方法。
- 多孔性支持体が、サンプルの核酸増幅インヒビター成分を不活化する不活化剤を含み、該不活化剤がカオトロピック塩である請求項10記載の方法。
- 未処理成分の少なくとも一部が重力により沈められる請求項10記載の方法。
- 核酸成分がハウジング内で保存される請求項10記載の方法。
- ハウジング内で核酸成分を保存する工程をさらに含む請求項20記載の方法。
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