JP2013010765A

JP2013010765A - Ｐｅｇ化されたｇ−ｃｓｆポリペプチドおよびその製造方法

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Publication number: JP2013010765A
Application number: JP2012173959A
Authority: JP
Inventors: Carsten Germansen; カルステン・ゲルマンセン; Bobby Soni; ボビー・ソニ; Grethe Rasmussen; グレテ・ラスムッセン
Original assignee: Maxygen Inc
Current assignee: Maxygen Inc
Priority date: 2005-06-01
Filing date: 2012-08-06
Publication date: 2013-01-17
Also published as: RU2007149238A; JP5137821B2; US7655766B2; US20070014762A1; US20080167218A1; CA2607844C; ZA200709704B; KR20080027291A; US20080090764A1; IL187009A0; WO2006128460A2; CN101193658A; BRPI0611221A2; US7381805B2; US20070014763A1; DE602006020562D1; EP1888119B1; AU2006254543A1; WO2006128460A3; ATE500847T1

Abstract

【課題】ＰＥＧ化顆粒球コロニー刺激因子の安定性および均一性を増加させる方法を提供する。
【解決手段】水酸基に結合したＰＥＧ部分を取り除くために十分な時間、ポリペプチドを８．０を超える高められたｐＨとし、そして、ｐＨを約８．０またはそれ以下に低下させることを含む、リジン残基のイプシロンアミノ基またはＮ末端アミノ基に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分、および水酸基に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分を有するＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの安定性および均一性を増加させる方法。
【選択図】図３

Description

発明の分野
本発明は、不安定なＰＥＧ部分（PEG moiety）をＰＥＧ化（PEGylated）Ｇ−ＣＳＦ蛋白質から除去し、安定性および均一性を増加させる方法、およびその結果得られるＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ蛋白質に関する。本発明は、また、該ＰＥＧ化蛋白質を含む医薬組成物および該医薬組成物を投与することによる治療方法に関する。

発明の背景
蛋白質またはポリペプチドへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共有結合（「ＰＥＧ化」）は、蛋白質またはポリペプチド、とりわけ医薬蛋白質の性質を改善するための、例えば、循環半減期を改善するため、および／または蛋白質エピトープを隠し、よって、望まれない免疫応答の可能性を低減するためのよく知られた技術である。活性化されたＰＥＧに基づく数多くの技術が、蛋白質上の１以上の基にＰＥＧ部分を結合させるために利用できる。たとえば、ｍＰＥＧ―スクシンイミジルプロピオネート（mPEG-SPA、Nektar Therapeuticsより入手可能）は、通常、アミド結合を介して、Ｎ末端およびリジン残基のイプシロン−アミノ基に特異的に結合するものとして考えられている。しかしながら、実際には、mPEG-SPAは、必ずしも排他的にこれらの基に結合しないだけでなく、エステル結合を介して、セリン、チロシンまたはスレオニン残基の水酸基にも結合し得る。この技術を用いて調製されたＰＥＧ化蛋白質は十分な程度の均一性を有しない可能性があり、意図したもの以外の数多くの異なるＰＥＧ異性体を含み得る。このことは、かかる蛋白質の特徴づけをより複雑にするという事実を含む、さまざまな理由により望まれない。さらに、意図したもの以外の基に結合したＰＥＧ部分は、相対的に不安定であり得る。例えば、mPEG-SPAのようなアミン特異的ＰＥＧの場合、エステル結合を介して水酸基に結合したＰＥＧ部分は、アミド結合を介してＮ末端またはリジン残基に結合した部分に比較して相対的に不安定である傾向がある。製剤化および貯蔵条件によって、このことは、これらの不安定なＰＥＧ基の望まれない損失を導き得、よって、時間経過と共にＰＥＧ化蛋白質の性質が変化する可能性がある。さらに、１以上のＰＥＧ部分が、患者に投与された後に体内で蛋白質から離れる危険があり、ＰＥＧ化蛋白質医薬の潜在的な制度上または安全上の問題であり得る。
本発明は、かかる不安定なＰＥＧ基を簡単に除き、それによって、より均一で安定なＰＥＧ化蛋白質生産物となる方法を提供することにより、これらの問題を解決する。

発明の簡単な開示
本発明は、一般的に、リジン残基またはＮ末端に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分および水酸基に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分を有するＰＥＧかポリペプチドの安定性および均一性を増加させる方法であって、水酸基に結合したＰＥＧ部分を除去するために好適な時間、変化されたｐＨに該ポリペプチドを置き、その後ｐＨを本件ポリペプチドの長期間保管に好適なｐＨに調整することを含む方法に関する。

ある態様において、本発明は、リジン残基のイプシロンアミノ基またはＮ末端アミノ基に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分および水酸基に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分を有するＰＥＧ化顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ポリペプチドの安定性および均一性を増加させる方法であって、水酸基に結合したＰＥＧ部分を取り除くために適した時間８．０を超える上昇されたｐＨにポリペプチドを置き、そのｐＨを約８．０またはそれ以下に低下させることを含む方法に関する。

本発明の他の態様は、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドをアミン特異的活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とＰＥＧ化反応させ、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド中間体を製造し、その後、該ＰＥＧ化ポリペプチド中間体を水酸基に結合したＰＥＧ部分を取り除くために好適な時間、少なくとも約９．０の高められたｐＨとし、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを製造することを含む、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを製造する方法に関する。

本発明の他の態様は、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドのＰＥＧ位置異性体（positional PEG isomer）の均質な混合物を含む組成物に関し、ここで、混合物のＰＥＧ位置異性体の少なくとも約８０％は、２つのＰＥＧ位置異性体からなり、それぞれは、リシンのイプシロンアミノ基に結合した２つのＰＥＧ部分およびＮ末端アミノ基に結合した１つのＰＥＧ部分からなるＰＥＧ部分を有する。

更なる本発明の態様は、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドのＰＥＧ位置異性体の混合物を含む組成物に関し、ここで、該ポリペプチドは、野生型ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号：１）に比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含み、該ポリペプチドのＰＥＧ位置異性体の少なくとも約８０％が、３つの結合されたＰＥＧ部分を有するリジン／Ｎ末端ＰＥＧ異性体である。

更なる態様において、本発明は、野生型ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号：１）に比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含む組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドのリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体（lysine/N-terminal positional PEG isomer）の混合物を製造する方法であって、a)宿主細胞において組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドを発現し；b)組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドを単離し；c)単離された組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドをアミン特異的活性化ＰＥＧと反応させ、組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドの複数のＰＥＧ位置異性体を製造し；d)複数のＰＥＧ位置異性体をｐＨ８．５から１０．５で反応させ、組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドの部分的に脱ＰＥＧ化（dePEGylated）された複数のリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体を製造することを含む、方法に関する。

本発明の更なる態様は、本明細書で記載される方法を使用して製造されるＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド、並びに、それらのＰＥＧ位置異性体分布により特徴付けられるＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド、そして、係るＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを含む組成物、そして、不十分な好中球のレベルを患っている、またはそのリスクのある患者において、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドまたは本発明の組成物の投与により、好中球のレベルを増加させる方法に関する。本発明の更なる態様および好ましい態様は、以下の記載および特許請求の範囲から明らかである。

本明細書で記載されているＰＥＧ化、部分的脱ＰＥＧ化、そして精製されたＧ−ＣＳＦ改変体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンを示す。本明細書で記載されているＰＥＧ化、そして部分的脱ＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンを示す。本発明によって調製された部分的脱ＰＥＧ化生成物プールのカチオン交換クロマトグラムを示す。本発明による脱ＰＥＧ化されなかった精製されたＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ改変体のカチオン交換クロマトグラムを示す。

説明
定義
本明細書および特許請求の範囲の文脈において、以下の定義が適用される：
用語「ポリペプチド」または「蛋白質」は、本明細書において互換して用いられ得、いずれの特定の長さのアミノ酸配列に限定されないで、アミノ酸のポリマーをいう。これらの用語は、完全長の蛋白質だけでなく、いずれの与えられた蛋白質またはポリペプチドの、例えば、断片、短縮バージョン、改変体、ドメインも含むことが意図される。

Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、配列番号：１で示されるヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）の配列を有するポリペプチド、またはＧ−ＣＳＦ活性を示すｈＧ−ＣＳＦの改変体である。「Ｇ−ＣＳＦ活性」は、Ｇ−ＣＳＦ受容体(Fukunaga et al., J. Bio. Chem., 265:14008, 1990)に結合する能力であり得るが、好ましくは、とりわけ、マウス細胞株NFS-60 (ATCC Number: CRL-1838)を用いたインビトロ活性試験で測定されるＧ−ＣＳＦ細胞増殖活性である。NFS-60細胞株を用いた好適なインビトロＧ−ＣＳＦ活性の試験は、Hammerling等により、J. Pharm. Biomed. Anal. 13(1):9-20, 1995に記載されている。Ｇ−ＣＳＦ活性を「示す」ポリペプチドは、測定可能な機能、例えばインビトロ試験における測定可能な増殖活性を示すとき、かかる活性を有すると考えられる。

「改変体」は、親（parent）ポリペプチドから１またはそれ以上のアミノ酸残基が相違するポリペプチドであり、ここで、親ポリペプチドは、一般的に、天然の、野生型のアミノ酸配列を有するものであり、典型的には、天然の哺乳類ポリペプチドであり、そして、より典型的には、天然のヒトポリペプチドである。よって、改変体は、天然のポリペプチドに比較して１またはそれ以上の置換、挿入または欠失を含む。例えば、これらには、１またはそれ以上のアミノ酸残基短くなった、Ｎおよび／またはＣ末端の欠失体、または、Ｎおよび／またはＣ末端で、１またはそれ以上の余分な残基の付加体、例えばＮ末端でのメチオニン残基の付加体を含む。改変体は、ほとんどの場合には、親ポリペプチドより１５アミノ酸残基までで相違し、例えば、１２、１０、８または６アミノ酸残基である。

「アミン特異的活性化ＰＥＧ（amine-specific activated PEG）」は、Ｎ末端アミノ基またはリジン残基のε-アミノ基に、アミド結合を介して、好ましく結合する、活性化ＰＥＧ誘導体である。アミン特異的活性化ＰＥＧ誘導体の例には以下を含む：
mPEG-スクシンイミジルプロピオネート(mPEG-SPA):

mPEG-スクシンイミジルブタノネート(mPEG-SBA)：

mPEG-スクシンイミジルα-メチルブタノネート(mPEG-SMB)：

mPEG-SPA、mPEG-SBAおよびmPEG-SMBは、Nektar Therapeuticsから入手可能である；「the Nektar Advanced PEGylation Catalogs 2004 and 2005-2006, 「Polyethylene and Derivatives for Advanced PEGylation」参照。他のアミン特異的活性化ＰＥＧ誘導体には、SunBio Corporationから入手可能な、PEG-SS (スクシンイミジルスクシネート)、PEG-SG (スクシンイミジルグルタレート), PEG-NPC (ｐ-ニトロフェニルカルボネート)、およびPEG-イソシアネート；およびNOF Corporation から入手可能なPEG-SCMを含む。

「不安定な」ＰＥＧ部分は、本明細書において、ポリペプチドの水酸基、とりわけ、セリン、チロシンまたはスレオニン残基の水酸基にエステル結合を介して結合したＰＲＧ部分をいう。上記に説明されるように、水酸基を介するかかるＰＥＧ部分の結合は不安定な傾向があり、これらのＰＥＧ部分は、エステル結合の加水分解を介して、例えばかかる部分を含むポリペプチドが水溶液形態で保存されるとき、時間と共に、ポリペプチドから脱離する傾向がある。

本明細書で使用される「安定性」は、ポリペプチドに結合するＰＥＧ部分の結合の安定性、例えば、かかるＰＥＧ部分が長期、例えば水溶液中の保存の間、ポリペプチドに結合しているか否か、またはそれらが、例えばエステル結合の加水分解の結果として脱離する傾向があるか否か、を言う。

本明細書で使用される、蛋白質の「ＰＥＧ位置異性体」なる用語は、蛋白質の相違するＰＥＧ化形態であって、ここで、ＰＥＧ基は、蛋白質の相違するアミノ酸位置で存在する。蛋白質の「リジン／Ｎ末端ＰＥＧ異性体」なる用語は、ＰＥＧ基が、蛋白質のアミノ末端および／または蛋白質におけるリジン残基のイプシロンアミノ基に結合されることを意味する。例えば、「３つの結合されたＰＥＧ部分を有するリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体」は、Ｇ−ＣＳＦに適用されるとき、３つのＰＥＧ基が、リジン残基のイプシロンアミノ基および／または蛋白質のＮ末端に結合するＧ−ＣＳＦＰＥＧ位置異性体の混合物を意味する。典型的には、「３つの結合されたＰＥＧ部分を有するリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体」は、リジン残基に結合した２つのＰＥＧ部分とＮ末端に結合した１つのＰＥＧ部分を有し得る。ＰＥＧ位置異性体の分析は、以下の実施例に記載されるようなカチオン交換ＨＰＬＣを用いて実施され得る。

ポリペプチドの「リジン／Ｎ末端のＰＥＧ位置異性体の実質的に精製された混合物」とは、例えばリジン／Ｎ末端でないＰＥＧ位置異性体等の不純物を排除するためにクロマトグラフィーまたは他の精製手段にかけられた、リジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体の混合物をいう。「リジン／Ｎ末端のＰＥＧ位置異性体の実質的に精製された混合物」は、例えば、もし、本明細書で記載されるような部分的な脱ＰＥＧ化工程およびそれに続く精製がなければ、存在したであろう水酸基に結合した不安定なＰＥＧ部分のほとんどが存在しなく、そして、典型的には、水酸基に結合した不安定なＰＥＧ部分を含むポリペプチドを約２０％未満、より典型的には、約１５％未満含み得る。好ましくは、水酸基に結合した不安定なＰＥＧ部分を、約１０％未満、例えば、約５％未満含み得る。

用語「ポリペプチド改変体のＰＥＧ位置異性体の均質な混合物」は、相違するＰＥＧ位置異性体のポリペプチド部分が同じであることを意味する。これは、混合物の相違するＰＥＧ位置異性体が、全て単一のポリペプチド改変体配列に基づくことを意味する。例えば、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド改変体のＰＥＧ位置異性体の均質な混合物は、相違する混合物のＰＥＧ位置異性体が単一のＧ−ＣＳＦポリペプチド改変体に基づくことを意味する。

本明細書で使用される「均一性」は、相違する位置異性体、つまり相違する位置で結合した相違する数のＰＥＧ部分を含む相違する位置異性体、の数、並びに、これら位置異性体の相対的な分布の観点からの、ＰＥＧ化ポリペプチドの均質性を言う。例えば、ヒトまたは動物における治療的用途を意図した医薬ポリペプチドに対しては、異なるＰＥＧ位置異性体の数は最小であることが一般的に望まれる。

「部分的脱ＰＥＧ化」は、本発明の方法が、水酸基に結合した不安定なＰＥＧ部分を取り除き、Ｎ末端またはリジン残基のアミノ基により安定に結合したＰＥＧ部分はそのまま残るという事実を言う。以下に説明されるように、脱ＰＥＧ化工程の進行は、特定の高められたｐＨ値および高められたｐＨ値での持続時間に依存する。したがって、特定の場合に選択された状況によって、脱ＰＥＧ化の工程の最後で、ポリペプチドの小部分が、依然として、水酸基に結合したＰＥＧ部分を有し得る可能性がある。しかしながら、本明細書および蛋白質解析の分野での技術常識に基づいて、当業者は、実質的に全ての不安定なＰＥＧ部分が除かれ、いずれの残ったＰＥＧ部分が、最終産物の所望の性質に重要であるように、方法を調整することができる。本明細書において「脱ＰＥＧ化」の言及は、「部分的脱ＰＥＧ化」の言及と理解でき得る。

詳細な説明
上記のように、本発明の一態様は、リジン残基のイプシロンアミノ基またはＮ末端アミノ基に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分および水酸基に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分を有するＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの安定性および均質性を高める方法であって、該ポリペプチドを、約８．０を超える高められたｐＨに、水酸基に結合したＰＥＧ部分を取り除くために好適な時間置き、そして、約８．０またはそれ以下にｐＨを低下させることを含む方法に関する。本発明の方法は、いずれの哺乳類Ｇ−ＣＳＦポリペプチドにも適しているが、ポリペプチドは、好ましくは、ヒトＧ−ＣＳＦポリペプチド、つまり、配列番号：１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、場合によりＮ末端にメチオニン残基を有するもの、またはそれらの改変体である。Ｇ−ＣＳＦ改変体の場合、これらは、天然、野生型のＧ−ＣＳＦポリペプチド、典型的には、ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号：１）に比較して、１またはそれ以上の置換、挿入または欠損、および／または、１またはそれ以上のアミノ酸残基のＮ末端および／またはＣ末端の欠失体、例えば１から１５の置換、例えば６、８、１０または１２までの置換を有し得る。好ましいＧ−ＣＳＦ改変体は、WO 01/51510およびWO 03/006501に開示されるものを含む。

例えばWO 03/006501に記載されるように、ｈＧ−ＣＳＦは、16、23、34および40の位置に４つのリジン残基を含み、Ｇ−ＣＳＦをリジン残基またはＮ末端により好んで結合する活性化ＰＥＧを用いたＰＥＧ化するときは、これらのリジン残基の少なくとも１つ、例えばこれらの残基の２、３または全てを、例えば欠失、好ましくは置換により、除くことが、しばしば望ましいこともある。本発明の方法で使用されるＧ−ＣＳＦポリペプチドは、したがって、K16、K23、K34およびK40から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失された、または他のアミノ酸残基に置換された改変体であり得る。典型的には、リジン残基の除去は、置換、一般的にはＲまたはＱ残基、好ましくはＲ残基での置換、によることができる。したがって、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、K16R/Q、K23R/Q、K34R/Q、K40R/Q（ここで、例えば、「K16R/Q」は、位置１６のリジンがアルギニンまたはグルタミン残基で置換されることを意味する）からなる群から選択される、１、２、３または４つの置換であり得る。好ましくは、ポリペプチドは、置換K16R+K34R+K40Rを含むが、位置２３のリジンを変わらず残している。

ＰＥＧ化が望まれないリジン残基を取り除くことと共に、WO 03/006501は、また、ＰＥＧ化部位を作成するためのリジン残基の付加を記載する。これらは挿入により付加され得るが、好ましくは、置換により付加され得る。ＰＥＧ化部位を導入するための好ましいアミノ酸置換の例には、Q70K、Q90K、T105K、Q120K、T133K、S159KおよびH170Kの１またはそれ以上、例えばこれらの置換の２、３、４、または５を含み、好ましい置換は、T105K+S159Kである。好ましい実施態様において、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含む。ある実施態様において、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、ｈＧ−ＣＳＦに比較して、これら５つの置換のみを含む。

Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの産生
本発明によるＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦポリペプチドは、本分野で知られた、例えば、WO 03/006501（引用により本明細書に組み込まれる）に記載されたような、いずれの好適な方法によっても製造され得る。かかる方法は、該ポリペプチドをコードする核酸配列の構築および好適な形質転換された、または遺伝子導入された宿主における該配列の発現を含む。しかしながら、本発明のポリペプチドは、相対的に非効率ではあるが、化学合成または化学合成および組換えＤＮＡ技術によって製造され得る。本発明のポリペプチドまたは本発明の結合体のポリペプチド部分をコードする核酸配列は、配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦ等の、親Ｇ−ＣＳＦをコードする核酸配列を単離し、または合成し、そして、核酸配列を変化させ、関連アミノ酸残基の導入（つまり、挿入または置換）または欠失（つまり、削除または置換）に影響させる、ことによって構築され得る。

核酸配列は、従来法に従った、部位特異的突然変異により従来通りに修飾される。あるいは、核酸配列は、化学合成、例えばオリゴヌクレオチド合成機を用いて製造され、ここで、オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計され、そして、好ましくは、組換えポリペプチドが生成される宿主細胞に好まれるコドンを選択する。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ、ライゲーションまたはライゲーションチェインリアクション（ＬＣＲ）(Barany, PNAS 88:189-193, 1991)によって、合成され、集められ得る。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的な集合のために５’または３’オーバーハングを含む。

一度集められると（合成、部位特異的突然変異または他の方法により）、ポリペプチドをコードする核酸配列は、組換えベクターに組み込まれ、所望の形質転換された宿主細胞において、Ｇ−ＣＳＦの発現に必要なコントロール配列に操作可能に結合される。

当業者は、好適なベクター、発現コントロール配列およびポリペプチドの発現するための宿主を選択することができる。組換えベクターは、自己複製ベクター、例えば、染色体外の実体として存在するベクターで、その複製が染色体の複製より独立しているもの、例えば、プラスミド、であり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製するものである。

ベクターは、好ましくは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列が、核酸配列の転写に必要な付加部分と操作可能に結合した、発現ベクターである。ベクターは、典型的には、プラスミドまたはウイルスＤＮＡ由来である。本明細書で述べられる、宿主細胞での発現用の多くの好適な発現ベクターは、商業的に入手可能か、または文献に記載されている。Ｇ−ＣＳＦを発現する好適なベクターについての詳細な情報は、WO 03/006501に見出され得る。

用語「コントロール配列（control sequence）」は、本明細書では、本発明のポリペプチドの発現に対して必要または有利である全ての成分を含むものと定義される。各コントロール配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来の、または外来のものであってよい。かかるコントロール配列には、限定はされないが、リーダー配列、ポリアデニル化配列、シグナルペプチド配列、合成イントロン、および転写ターミネーターを含む。最小限で、コントロール配列は、プロモーターを含む。多様な発現コントロール配列、例えば、WO 03/006501で記載されたコントロール配列のいずれかが、本発明に使用され得る。

Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドをコードする本発明の核酸配列は、部位特異的突然変異、合成、ＰＣＲまたは他の方法で製造され得、所望により、また、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含み得る。シグナルペプチドは、ポリペプチドが、発現する細胞から分泌されるときに存在する。かかるシグナルペプチドは、もし存在すれば、ポリペプチドの発現のために選択された細胞によって、認識されるものであるべきである。シグナルペプチドは、ポリペプチドに対し、同種（例えば、通常ｈＧ−ＣＳＦと結びつけられ）、または異種（ｈＧ−ＣＳＦ以外の他の起源に由来する）であり得、または、宿主細胞に対して同種または異種、つまり、シグナルペプチドは、宿主細胞から通常発現されるか、または、宿主細胞からは通常発現されない、であり得る。したがって、シグナルペプチドは、原核生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌由来の、または、真核生物、例えば、哺乳動物、または、昆虫または酵母由来であり得る。好適なシグナルペプチドについての更なる情報は、WO 03/006501を参照。

いずれの好適な宿主も、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを製造するために使用され得、細菌（特に好ましくはないが）、真菌（酵母を含む）、植物、昆虫、哺乳類、または他の適当な動物細胞または細胞株、並びにトランスジェニック動物または植物が含まれる。哺乳類の細胞が好ましい。細菌宿主細胞の例には、バチラス（Bacillus）、例えば、Ｂ．ブレビス（B. brevis）またはＢ．ズブチリス（B. subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）またはストレプトマイセス（Streptomyces）種等のグラム陽性細菌、または、Ｅ．ｃｏｌｉ種等のグラム陰性細菌を含む。好適な糸状菌宿主細胞の例には、アスペルギウス（Aspergillus）、例えば、Ａ．オリザエ（A. oryzae）、Ａ.ニガー（A. niger）、またはＡ．ニデュランス（A. nidulans）、フサリウム（Fusarium）またはトリコダーマ（Trichoderma）種を含む。好適な酵母宿主細胞の例には、サッカロマイセス（Saccharomyces）、例えば、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、スキゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、クリベロマイセス（Klyveromyces）、ピチア（Pichia）、例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）またはＰ．メタノリカ（P. methanolica）、ハンセニューラ（Hansenula）、例えば、Ｈ．ポリモルファ（H. Polymorpha）またはヤロウィア（Yarrowia）種を含む。好適な昆虫宿主細胞の例には、鱗翅目細胞株、例えば、Spodoptera frugiperda (Sf9またはSf21)またはTrichoplusioa ni細胞(High Five) (US 5,077,214)を含む。好適な哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株 (例えば、CHO-K1; ATCC CCL-61)、グリーンモンキー細胞株 (COS) (例えば、COS 1 (ATCC CRL-1650)、COS 7 (ATCC CRL-1651))；マウス細胞 (例えば、NS/O)、新生児ハムスター腎臓(BHK)細胞株(例えば、ATCC CRL-1632またはATCC CCL-10)、およびヒト細胞(例えば、HEK 293 (ATCC CRL-1573))を含む。更なる好適な細胞株は、本分野で知られ、American Type Culture Collection（ロックビル、メリーランド）のような公的寄託機関から入手可能である。

本発明の製造方法において、細胞は、本分野で知られている方法を使用して、ポリペプチドを製造するために適した栄養培地で培養される。例えば、細胞は、実験室または工業的培養機の中で、ポリペプチドが発現され、および／または単離されるに好適な培地中および条件下で実施される、震盪フラスコ培養、小スケールまたは大スケールの培養（連続、バッチ、フェドバッチ、または固体状態培養を含む）によって、培養される。培養は、本分野で知られた手法を用いて、炭素および窒素源を含む好適な栄養培地で実施される。好適な培地は、商業的供給者により入手可能であり、または、刊行された組成（例えば、American Type Culture Collectionカタログ）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地へ分泌されるとき、ポリペプチドは培地から直接回収され得る。ポリペプチドが分泌されないとき、それは、細胞溶解物から回収され得る。

得られるポリペプチドは、本分野で知られる方法によって回収され得る。例えば、ポリペプチドは、栄養培地より、限定はされないが、遠心、ろ過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーション、または沈殿を含む従来の手段により回収され得る。

ポリペプチドは、本分野で知られている多様な手段で精製され得、これらの手段には、限定はされないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動の手段（例えば、分取等電点電気泳動法）、相違する溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989参照）を含む。Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドを生成する特有の方法は、D. MetcalfおよびN. A. Nicolaにより、The hemopoietic colony-stimulating factors, p. 50 51, Cambridge University Press (1995)に、C. S. Bae等により、Appl. Microbiol. Biotechnol, 52:338-344 (1999) and in US 4,810,643に記載されている。

ＰＥＧ化
生成されたＧ−ＣＳＦポリペプチドは、それから、当業者に知られた様々な方法によりＰＥＧ化され得る。例えば、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、アミン特異的活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＧ化されることができる。

アミン特異的活性化ポリエチレングリコールは、上述したいずれでもよいが、例えば、mPEG-スクシンイミジルプロピオネート(mPEG-SPA)、mPEG-スクシンイミジルブタノエート(mPEG-SBA)、またはmPEG-スクシンイミジルα-メチルブタノエート(mPEG-SMB)である。ＰＥＧ部分の分子量は、例えば、ポリペプチドに結合するＰＥＧ部分の数に基づいて、選択されることができ、しばしば、約１ｋＤａから約２０ｋＤａの範囲、例えば、約１ｋＤａから約１２ｋＤａ、例えば、約２ｋＤａから約１０ｋＤａ、例えば、約４ｋＤａから約６ｋＤａ、例えば、約５ｋＤａであり得る。例えば、活性化ＰＥＧは、分子量約５ｋＤａのmPEG-SPAであり得る。例えば、ＰＥＧ化は、約７．５−９．０、例えば約８．０−８．５のｐＨで実施され得る。本明細書において、ＰＥＧ部分について用いられるとき、用語「約」は、およその平均分子量を示し、通常、ポリマーの調製にある分子量分布が存在するという事実を反映する。更なるＰＥＧ化方法の一般情報のために、例えば、Nektar Advanced PEGylation Catalogs 2004および2005-2006、並びにそれらに引用されている参考文献を参照できる。Ｇ−ＣＳＦポリペプチドのためのより詳細なＰＥＧ化方法の記載は、また、WO 03/006501にある。

部分的脱ＰＥＧ化
脱ＰＥＧ化工程のための高められたｐＨの選択は、脱ＰＥＧ化が起こる温度、脱ＰＥＧ化工程の時間、およびＰＥＧ化工程が実施されたｐＨを含む、ＰＥＧ化に用いられた条件等の因子に基づく。一般的に、脱ＰＥＧ化の間に使用されたｐＨが高いほど、脱ＰＥＧ化工程は早い。したがって、当業者は、ｐＨ、時間および温度等の脱ＰＥＧ化条件が、与えられ等状況で所望の結果を得るように各々調整され得ることを認識できる。例えば、比較的低い、高められたｐＨ、例えば８および９の間を使用することが可能であるが、例えば、９および１１の間、例えば９および１０の間のより高いｐＨの使用は、早い脱ＰＥＧ化をもたらす。典型的には、したがって、高められたｐＨは、約８．５から約１１．０、例えば、約８．５から約１０．５、例えば、約９．０から約１０．０の範囲であり得る。高められたｐＨは、例えば、約９．２から約９．８、例えば約９．５の範囲であり得る。

通常、脱ＰＥＧ化工程は、一般的に最も効率的で、より処理時間が短く、より高い収率なので、ＰＥＧ化の直ぐ後に行われる。したがって、発明は、この基本的なやり方において、ＰＥＧ化バルク中間体の部分的脱ＰＥＧ化工程化、それに続く、以下に記載するような、例えば、クロマトグラフィー精製のような従来の分離により特徴付けられる。しかしながら、いくつかの理由により望まれるのであれば、ＰＥＧ化工程は、脱ＰＥＧ化の前に、中間精製工程が続き得る。中間精製工程は、例えば、限外ろ過および／またはジアフィルトレーション(diafiltration)が続く、下記に記載するようなクロマトグラフィー精製を含む。かかる中間精製工程から得られる中間体生産物は、所望ならば、脱ＰＥＧ化およびその後の生成段階の前に貯蔵され得る。この場合、中間ＰＥＧ化工程化生産物は、例えば、当業者に一般的に知られる方法を用いて、凍結または凍結乾燥によって、例えば、貯蔵され得る。

脱ＰＥＧ化は、他の面では、対象となるポリペプチドに好適な温度で実施され、例えば、約５℃から約４０℃、例えば、約１０℃から約３５℃で実施される。脱ＰＥＧ化は、しばしば、約１５℃から約２５℃、例えば、約２０−２２℃の大気温度で実施され得る。

上記で説明したように、所望の結果を得るために高められたｐＨでの脱ＰＥＧ化工程の時間は、ｐＨおよび温度等の他の因子に依存し得るが、一般的に、約２時間から約１００時間、典型的には、約４時間から約７２時間、より典型的には、約８時間から約４８時間の範囲であり得る。通常、脱ＰＥＧ化の工程を可能な限り短い時間で実施することが望まれるので、ポリペプチドは、しばしば、約２４時間を超えない期間で、例えば、約１２時間から約３０時間、例えば、約１８時間から約２４時間、高められたｐＨで置かれ得る。上記に示したように、高められたｐＨでの相対的に短い時間は、一般的に、相対的に高いｐＨ、例えば、約９−１０を伴い得る。

高められたｐＨでの脱ＰＥＧ化に続いて、ｐＨは、約８．０またはそれ以下、とりわけ、ポリペプチドに対して意図された貯蔵条件に従って、選択されたｐＨに低下される。例えば、Ｇ−ＣＳＦに対して、長期貯蔵のための好適なｐＨは、しばしば、約２．０から約５．０の間、例えば、約２．５から約４．５、例えば約４．０であり得る。いくつかの場合において、例えば、使用される特定の製剤に依存して、幾分高いｐＨ、例えば、約５．０−８．０、例えば、約６．０−７．５、例えば、約７．０−７．５が選択され得る。Ｇ−ＣＳＦの多様な医薬製剤が、例えば、US 5,104,651、US 5,919,757、US 6,497,869およびUS 6,776,983に記載されている。

本発明におけるｐＨの調整のために、いずれの好適な酸または塩基、有機または無機酸および塩基が使用され得る。同様に、いずれの好適な緩衝液が、ｐＨを所望のレベルに維持するために使用され得る。当業者は、例えば、対象となるポリペプチド及び所望のｐＨに依存して、いずれの与えられた状況に適する、酸、塩基および緩衝液をよく知っている。

ｐＨの低下に引き続き、所望の数のＰＥＧ基が結合したポリペプチドを分離するために、ポリペプチドは、通常、少なくとも１つのクロマトグラフィー精製工程、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲルろ過クロマトグラフィーにかけられる。クロマトグラフィー精製は、当業者に一般的に知られた方法を用いて実施され得る。例えば、脱ＰＥＧ化に続く低下されたｐＨが約７．０より下の場合、カチオン交換クロマトグラフィーが使用され得る。あるいは、または付け加えて、高められたｐＨ値で、ｐＨの低下の前に、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて、クロマトグラフィーが実施され得る。生成物の更なる精製並びに分析は、同様に、当業者に知られた標準的な方法を用いて実施され得る。例えば、クロマトグラフィー精製工程に続く更なる精製は、例えば、限外ろ過またはジアフィルトレーションを用いて、実施され得る。

上記したように、本発明の更なる態様は、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを、アミン特異的活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてＰＥＧ化し、その後、水酸基に結合したＰＥＧ部分を取り除くために好適な時間、ＰＥＧ化ポリペプチドを、少なくとも約９．０の高められたｐＨに置くことを含む、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの製造方法に関する。
この方法は、リジン残基のイプシロンアミノ基またはＮ末端のアミノ基に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分を有し、そして、水酸基に結合したＰＥＧ部分が実質的にないＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドをもたらす。ある実施態様において、本発明のこの実施態様は、約７．０−９．０のｐＨでのＰＥＧ化、その後、ｐＨを不安定なＰＥＧ部分を取り除くために高めることを用いて、実施される。他の実施態様において、ＰＥＧ化は、９．０以上、例えば、９−１１の範囲のｐＨ、例えば、９．２から１０．０で、例えば、約９．５の比較的高いｐＨで実施され得る。この場合、ＰＥＧ化および脱ＰＥＧ化は、単一工程で、単一ｐＨ値で、Ｎ末端およびリジン残基で所望のＰＥＧ化が起こり、一方、望まれない水酸基へのＰＥＧ部分の結合を回避するために十分な時間実施され得る。

アミン特異的活性化ＰＥＧは、上記したいずれでもよく、例えば、mPEG-スクシンイミジルプロピオネート(mPEG-SPA)、mPEG-スクシンイミジルブタノエート(mPEG-SBA)またはmPEG-スクシンイミジルα-メチルブタノエート(mPEG-SMB)であり得る。ＰＥＧ部分の分子量は、同様に上記した通りであり、例えば、約１ｋＤａから約２０ｋＤａの範囲、例えば、約１ｋＤａから約１２ｋＤａ、例えば、約２ｋＤａから約１０ｋＤａ、例えば、約４ｋＤａから約６ｋＤａ、例えば約５ｋＤａであり得る。例えば、活性化されたＰＥＧは、約５ｋＤａの分子量を有するｍＰＥＧ−ＳＰＡであり得る。例えば、ＰＥＧ化は、約７．５−９．０、例えば、約８．０−８．５のｐＨで実施され得る。ＰＥＧ化の間に使用されるｐＨに基づいて、選択される高められたｐＨは、また、一般的に上記された範囲と同様であり得、例えば、約９．２から１１．０の範囲、約９．２から１０．０の範囲であり得る。同様に、高められたｐＨでの時間は、また、上記のように選択され得、そして、同じことが、その後の精製等にも当てはまる。

本明細書で記載される方法は、均質な、および安定なＰＥＧ化蛋白質を製造することを目的とした製造方法に対して、多くの利点を与え、それらには、それが、単純および迅速で、限定された時間の間、変化されたｐＨの余分な１つの工程のみを要求するものであり、そして、他に、製造方法に使用されるＰＥＧ化または精製方法を変化させる必要が無い、という事実を含むものである。この理由のために、不安定なＰＥＧ基を取り除くために十分な時間、ｐＨを変化させる同じ一般的な手法は、いずれのＰＥＧ化蛋白質の製造に使用され得る。一般的に、塩基性または酸性ｐＨが、水酸基に結合した不安定なＰＥＧ部分を取り除くために使用され得、不安定ＰＥＧ部分の脱離が、ｐＨがより酸性（酸性ｐＨ）またはより塩基性（塩基性ｐＨ）のとき起こる。不安定なＰＥＧの脱離を得るための条件の選択は、例えば、ＰＥＧ部分の結合部位の微視的環境を含む、特定蛋白質の構造特性に基づいてなされ得る。

ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド
上記に示したように、本発明の方法は、相違するＰＥＧ位置異性体の数の観点から、ＰＥＧ化ポリペプチドの均一性が高められることに利点がある。結合基の数および使用される特定のＰＥＧ化化学に依存して、本発明は、別なやり方で可能である以上に、より均質で、より安定なＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの単離を可能にする。例えば、野生型ヒトＧ−ＣＳＦに比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを有するＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドが見出されてきており、少なくとも約９０−９５％のポリペプチドのＰＥＧ位置異性体が、３つの結合されたＰＥＧ部分を有する、生産物を得ることが可能である。

本発明の他の実施態様は、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド改変体のＰＥＧ位置異性体の均質な混合物を含む組成物に関し、ここで、混合物の少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％のＰＥＧ位置異性体が、２つのＰＥＧ位置異性体からなり、各々は、リジン残基のイプシロンアミノ基に結合した２つのＰＥＧ部分およびＮ末端アミノ基に結合した１つのＰＥＧ部分を有する。

したがって、本発明の他の実施態様は、野生型ヒトＧ−ＣＳＦに比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含む、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドに関し、ここで、ポリペプチドの少なくとも約８０％のＰＥＧ位置異性体が、３つの結合されたＰＥＧ部分を有する。典型的には、３つの結合されたＰＥＧ部分を有するＰＥＧ位置異性体の割合は、８０％より大きく、例えば少なくとも約８５％または少なくとも約９０％であり得、そして、より高く、例えば、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％であり得る。更なる他の実施態様において、本発明は、野生型ヒトＧ−ＣＳＦに比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kのみを含むＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドに関し、ここで、ポリペプチドのＰＥＧ位置異性体の少なくとも約８０％が、３つの結合されたＰＥＧ部分を有する。典型的には、３つの結合されたＰＥＧ部分を有するＰＥＧ位置異性体の割合は、８０％より大きく、例えば、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％であり得、そして、それより高く、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％または少なくとも約９５％であり得る。

更なる実施態様において、本発明は、野生型ヒトＧ−ＣＳＦに比較して置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含むＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの混合物を含む組成物に関し、ここで、混合物中のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、少なくとも約９５％が、２つのＰＥＧ位置異性体からなり、各々は３つのＰＥＧ基を含み、異性体の１つは、Ｎ末端、Lys23およびLys159で結合したＰＥＧ基を有し、他の異性体は、Ｎ末端、Lys105およびLys159で結合したＰＥＧ基を有する。他の実施態様において、本発明は、野生型ヒトＧ−ＣＳＦに比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kのみを含むＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの混合物を含む組成物に関し、ここで、混合物中のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％は、各々が３つのＰＥＧ基を含む、２つのＰＥＧＧ−ＣＳＦ異性体からなり、ここで、異性体の１つは、Ｎ末端、Lys23およびLys159で結合したＰＥＧ基を有し、そして、他の異性体は、Ｎ末端、Lys105およびLys159で結合したＰＥＧ基を有する。

本発明により製造されるＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、ＰＥＧ化の程度において高度に貯蔵安定的であることが見出されてきた。下記の実施例に示されるように、かかるＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの水性製剤は、ＰＥＧ化パターンの大きな変更がなく、長期間貯蔵可能である。このことは、とりわけ、組成物が５℃で貯蔵されたときに事実であるが、驚くことに、組成物が２５℃または３５℃の高い温度で貯蔵されるときにさえ、比較的に安定であることが見出されてきた。

したがって、本発明の更なる態様は、野生型ヒトＧ−ＣＳＦに比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含む、貯蔵安定なＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドに関し、ここで、ポリペプチドのＰＥＧ位置異性体の少なくとも約８０％が、５℃の温度で、３月間、水性の参照組成物（aqueous reference composition）中で貯蔵した後、３つの付加ＰＥＧ部分を有する。典型的には、５℃の温度で３月間貯蔵後の３つの結合されたＰＥＧ部分を有するＰＥＧ位置異性体の割合は、８０％より大きく、例えば、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％であり得る。いくつかの場合に置いて、この割合はさらに高く、例えば、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％または少なくとも約９５％であり得る。本発明に従って製造されるＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの安定性の測定の目的のために、安定性は実施例４に記載されたように、例えば、参照組成物としてそこで記載されているＡ、Ｂ、ＣまたはＤ製剤の一つ、とりわけ製剤Ｄを用いて、試験され得る。

医薬的組成物
本発明の他の態様は、本発明に従ったＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを含む医薬組成物に関する。したがって、本発明の一実施態様は、医薬的に許容される担体およびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを含む組成物に関し、ここで、ポリペプチドは、野生型ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号：１）に比較して置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含み、そして、ここで、ポリペプチドのＰＥＧ位置異性体の少なくとも８０％は、３つの結合されたＰＥＧ部分を有する。典型的には、３つの結合されたＰＥＧ部分を有するＰＥＧ位置異性体の割合は、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、であり得、そして、さらに高く、例えば少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％であり得る。更なる他の実施態様において、本発明は、医薬的に許容され得る担体およびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを含む医薬組成物に関し、ここで、ポリペプチドは、野生型ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号：１）に比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kのみを含み、ポリペプチドの少なくとも約８０％のＰＥＧ位置異性体は、３つの付加ＰＥＧ部分を有する。典型的には、３つの付加ＰＥＧ部分を有するＰＥＧ位置異性体の割合は、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、であり得、そして、さらに高く、例えば、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％であり得る。

本発明の他の実施態様は、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド改変体のＰＥＧ位置異性体の均一な混合物を含む医薬組成物に関し、ここで、混合物のＰＥＧ位置異性体の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％が、２つのＰＥＧ位置異性体からなり、それぞれは、リジン残基のイプシロンアミノ基に結合した２つのＰＥＧ部分およびＮ末端アミノ基に結合した１つのＰＥＧ部分からなるＰＥＧ部分を有する。

更なる実施態様において、本発明は、医薬的に許容可能な担体および野生型ヒトＧ−ＣＳＦに比較して置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含むＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの混合物を含む、医薬組成物に関し、ここで、混合物中のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％が、２つのＰＥＧ位置異性体からなり、それぞれは、３つのＰＥＧ基を有し、ここで、異性体の一つは、Ｎ末端、Lys23およびLys159で結合したＰＥＧ基を有し、他の異性体は、Ｎ末端、Lys105およびLys159に結合するＰＥＧ基を有する。更なる実施態様において、本発明は、医薬的に許容可能な担体および野生型ヒトＧ−ＣＳＦに比較して置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kのみを含むＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの混合物を含む、医薬組成物に関し、ここで、混合物中のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％が、２つのＰＥＧ位置異性体からなり、それぞれは、３つのＰＥＧ基を有し、ここで、異性体の一つは、Ｎ末端、Lys23およびLys159で結合したＰＥＧ基を有し、他の異性体は、Ｎ末端、Lys105およびLys159に結合するＰＥＧ基を有する。

本発明のＧ−ＣＳＦポリペプチドを含む医薬組成物は、あらゆる形態で、例えば、凍結乾燥形態、または、好ましくは、安定な液体製剤で、典型的には水性製剤として、製剤化され得る。かかる組成物は、典型的には、緩衝剤、防腐剤、等張剤（isotonicifier）、安定化剤、非イオン性界面活性剤または洗剤、および増量剤または充填剤、キレート剤、抗酸化剤および共溶媒のような付加的な種々の賦形剤から選択される、１またはそれ以上の成分を含む。Ｇ−ＣＳＦの好適な製剤の一例は、ｐＨ４．０の水溶液中で供給され、０．６ｍｌ当たり、0.35mg酢酸、30.0mgソルビトール、0.02mgポリソルベート20、および0.02mgナトリウムを含む、ニューラスタ（登録商標）（ペグフィルグラスチム）のために用いられているものである。

医薬組成物の一例は、非経腸投与のために設計された溶液である。多くの場合で、医薬液体製剤は、直ぐに使用するのに適した。液体形態で提供されるが、かかる非経腸製剤は、また、凍結または凍結乾燥形態で提供され得る。前者の場合、組成物は、使用前に解凍されなければならない。後者の形態は、凍結乾燥製剤が一般的に対応する液体よりもより安定であると、当業者により認識されているので、多様な貯蔵条件下で、組成物中に含まれる活性化合物の安定性を増強するために、しばしば用いられる。かかる凍結乾燥製剤は、使用前に、注射用滅菌水または滅菌生理食塩水等の１またはそれ以上の好適な医薬的に許容可能な希釈剤の添加により、再構成される。しかしながら、本発明の組成物は、好ましくは、水溶液の形態である。

非経口剤において、それらは、適切なときは、所望の純度を有するポリペプチドと、１以上の医薬的に許容可能な担体、典型的に本分野で採用される賦形剤または安定化剤（それら全てが「賦形剤」と呼ばれ得る）、例えば、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤および／または他の多様な添加剤と混合して、凍結乾燥製剤または水溶液としての貯蔵のために製造される。

緩衝剤は、所望の範囲でｐＨを維持するのを助ける。それらは、典型的には、約２ｍＭから約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。好適な緩衝剤は、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸１ナトリウム−クエン酸２ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸３ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸１ナトリウム混合物等）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸１ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸２ナトリウム混合物等）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物等）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸１ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸２ナトリウム混合物、フマル酸１ナトリウム−フマル酸２ナトリウム混合物等）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物等）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物等）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物等）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物等）のような、有機および無機の酸およびそれらの塩の両方を含む。更なる可能性は、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリスのようなトリメチルアミン塩である。

防腐剤は、微生物の成長を遅らせるために添加され、存在するときは、約０．２％−１％（w/v）の量で、典型的に添加される。好適な保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンザルコニウムハライド類（例えば、塩化、臭化またはヨウ化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン類、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールを含む。

等張剤は、液体組成物の等張性を確保するために添加され、多価糖アルコール類、好ましくは３価またはそれ以上の価の糖アルコール類、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール等を含む。多価アルコールは、他の成分の相対量を考慮し、０．１重量％および２５重量％の間の量で、典型的には、１％から５％で存在することができる。

安定化剤は、増量剤から、治療成分を溶解させ、または、変性や容器壁への吸着を防ぐことを助ける添加剤までの機能であり得る、広範なカテゴリーの賦形剤を言う。典型的な安定化剤は、多価糖アルコール類（上記で列挙した）；アミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン（omithine）、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等；有機糖類または糖アルコール類、例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール（myoinisitol）、ガラクチトール、グリセロール等、イノシトール等のシクリトールを含む;ポリエチレングリコール;アミノ酸ポリマー類;硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（つまり、＜１０残基）；蛋白質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン類；親水性ポリマー類、例えば、ポリビニルピロリドン；単糖類、例えば、キシロース、マンノース、フルクトースおよびグルコース；二糖類、例えば、ラクトース、マルトースおよびスクロース；３糖類、例えば、ラフィノース、および多糖類、例えば、デキストランであり得る。安定化剤は、例えば、活性な蛋白質重量に基づいて、０．１から１００００重量部の範囲で存在し得る。

非イオン性界面活性剤または洗剤（または、湿潤剤として知られる）は、治療的成分の溶解を助け、並びに、治療的ポリペプチドを、攪拌惹起凝集から保護するために存在し得、それは、また、ポリペプチドを変性させることなく、表面応力をそぎ取るために、製剤に暴露させられることができる。好適な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート類（２０、８０等）、ポリオキサマー類（１８４、１８８等）、プルロニック（登録商標）ポリオール類、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル類（トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）−２０、トゥイーン−８０等）を含む。

添加され得る様々な付加的な賦形剤には、増量剤または充填剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および共溶媒が含まれる。

活性成分は、また、例えば、コアサーべーション（coascervation）技術、または界面重合によって、例えば、コロイド薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム類、アルブミンミクロスフェア類、ミクロエマルジョン類、ナノ粒子類およびナノカプセル類）またはマクロエマルジョンにおける、ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ−メチルメタシレートマイクロカプセルによって、調製されたミクロカプセルに取り込まれ得る。

インビボ投与に使用される非経腸製剤は、滅菌であるべきである。これは、当分野でよく知られた方法、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過により、容易になされる。

治療方法
本発明の他の態様は、治療方法および本発明のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを用いた医薬の製造方法に関する。白血球減少症（白血球の低下したレベル）および好中球減少症（好中球の低下したレベル）は、あらゆるタイプの感染症に罹患しやすくなる。好中球減少症は、例えば、ＨＩＶに罹患した患者で慢性であり、化学療法または放射線療法を受ける癌患者で急性である。重篤な好中球減少症の患者にとっては、例えば、化学療法の結果として、相対的に少ない感染症でさえも重大であり得、好中球減少症は、しばしば、化学療法プロトコールの中断を要求する。本発明のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、ある種の化学療法、放射線治療および骨髄移植を受ける癌患者の感染症の予防または治療、末梢血液前駆細胞移植のための前駆細胞銀行のための輸送、重篤で慢性的な、または相対的な白血球減少症の治療、急性骨髄性白血病を有する患者の治療、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全疾患の治療、および抗真菌治療、とりわけ全身性または侵襲性カンジダ症にとりわけ好適である。本発明の目的のための「患者」は、本発明の治療方法がヒト患者の治療を主たる目的としているが、ヒトおよび他の哺乳類の両方を含む。

したがって、本発明の態様は、不十分な好中球レベルに罹患したまたはその危険のある患者における、好中球レベルを増加する方法に関し、該患者に、上記ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの有効量またはＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを含む上記医薬組成物を投与することを含む。本発明のこの実施態様において、不十分な好中球レベルに罹患またはその危険のある患者は癌患者であり、とりわけ化学療法または放射線療法、特に化学療法で処置される癌患者である。

本発明のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、乳癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、子宮癌、卵巣癌、非ホジキンリンパ腫 (NHL)およびホジキン病を含む、あらゆる相違するタイプの癌に罹患した患者において、好中球の生産を刺激するのに有用であることが意図される。同様に、本発明のポリペプチドは、以下を含むあらゆる相違する化学療法剤を受ける患者に投与することが意図される：
・アルキル化剤、例えばマスタードガス誘導体、例えば、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド、メクロレタミンまたはメルファラン；エチレンイミン類、例えば、ヘキサメチルメラミンまたはチオテパ；アルキルスルホネート類、例えば、ブスルファン；ヒドラジン類およびトリアジン類、例えば、アルトレタミン、デカルバジン、プロカルバジンまたはテモゾロミド；ニトロソウレア類、例えば、カルムスチン、ロムスチンまたはストレプトゾシン；および無機金属錯体試薬、例えば、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチン；
・植物アルカロイド類、例えば、タキサン類（例えば、ドセタキセルまたはパクリタキセル）、ビンカ・アルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビノレルビン）、カンプトテカン（camptothecan）誘導体（例えば、イリノテカンまたはトポテカン）およびポドフィロトキシン類（エトポシドまたはテニソピド）；
・抗腫瘍抗生物質、例えば、アンスラサイクリン類、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、またはミトキサントロン；クロモマイシン類、例えば、ダクチノマイシンまたはプリカマイシン；および他の抗腫瘍抗生物質、例えば、ブレオマイシンまたはマイトマイシン；
・代謝拮抗物質、例えば、葉酸拮抗剤、例えば、メトトレキサート；ピリミジン拮抗剤、例えば、カペシタビン、シタラビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ホキシウリジン（Foxuridine）またはゲムシタビン；プリン拮抗薬、例えば、６−メルカプトプリンまたは６−チオグアニン；アデノシンデアミナーゼ阻害剤、例えば、クラドリビン（Cladribine）、フルダラビン、ネララビンまたはペントスタチン；およびリボヌクレアーゼレダクターゼ阻害剤、例えばヒドロキシウレア；
・トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、イロノテカン（Ironotecan）またはトポテカン；およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェートまたはテニポシド。

本発明のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、有効または治療有効量、例えば、投与される状態に関連した所望の効果を奏するのに十分な量、とりわけ、与えられた状況下で、好中球の所望の刺激を得るのに十分な量で、投与され得る。正確な用量は、例えば、個人患者および処置される疾患等の因子に依存し得、当業者、典型的には医者により決定され得る。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの用量は、例えば、ペグフィルグラスチン（pegfilgrastim）（Neulasta（登録商標））で現在推奨されている用量、成人患者当たり６ｍｇ、とほぼ同じ規模であり得る。したがって、本発明のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの適切な用量は、約１ｍｇから約１５ｍｇの範囲、例えば、約２ｍｇから約１５ｍｇ、例えば、約３ｍｇから約１２ｍｇであることが意図される。したがって、好適な用量は、例えば、約３ｍｇ、約６ｍｇ、または約９ｍｇであり得る。それぞれの場合、投与量は、患者当たりの標準用量として表され、ここで、患者は成人またはさもなければ少なくとも４５ｋｇの体重の患者である。場合により、用量は、患者の体重によって決定され得、本発明のＧ−ＣＳＦポリペプチドの適切な用量は、約１０μｇ／ｋｇから約２００μｇ／ｋｇの範囲、例えば、約２５μｇ／ｋｇから約１５０μｇ／ｋｇ、例えば、約３０μｇ／ｋｇから約１２０μｇ／ｋｇである。したがって、好適な用量は、約３０μｇ／ｋｇ、約６０μｇ／ｋｇ、約９０μｇ／ｋｇまたは約１２０μｇ／ｋｇである。

本発明はさらに以下の非限定的な実施例によって記載される。

実施例１
部分的に脱ＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦ改変体の製造および分析
サンプルの調製および脱ＰＥＧ化
野生型ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号：１）に比較した置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを有するＧ−ＣＳＦを、WO 03/006501に実質的に記載されたＣＨＯ−Ｋ１細胞より製造した。４．５ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ改変体２００ｍｌ（９００ｍｇＧ−ＣＳＦ）を、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ５０００（Nektar Therapeutics）を用いてＰＥＧ化した。簡単には、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ５０００の１３．２％（ｗ／ｗ）溶液１００ｍＬを、Ｇ−ＣＳＦ溶液の２００ｍＬに１０分に渡って添加し、ゆっくり攪拌し十分な混合を確保した。サンプルを２１±３℃、ｐＨ８．５で４４分インキュベートし、ゆっくり攪拌した。サンプル混合物を、その後、８００ｍＭホウ酸、ｐＨ１０．０のストック溶液を用いてｐＨ９．５に調整した。そして、サンプルを２１±３℃で２４時間、攪拌せずにインキュベーションした。その後、サンプルを100 mmol/kg クエン酸、20 mmol/kg NaOH、pH 2.5を用いて、約２．５倍に濃縮し、最終ｐＨを３．５とした。

部分的に脱ＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦの単離
ｐＨを３．５に低下させた後、直ぐに、サンプルを、20 mmol/kg クエン酸、15 mmol/kg NaOH、pH 3.4で平衡化させた約225 mLのSP-Sepharose HP (Amersham, GE Healthcare)を充填したVL44(Millipore)カラムに載せた。物質を載せた後、遊離のｍＰＥＧ−酸等の非結合物質を取り除くために、カラムを洗浄した。２５−１００％溶出緩衝液(20 mmol/kg クエン酸、20 mmol/kg NaOH、200 mmol/kg NaCl、pH 3.5)の直線グラジエントを用い、カラムよりＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを溶出した。グラジエントを25 CV（カラム体積）に対して展開した。カラム工程を２１±３℃で実施し。使用した全ての緩衝液を同じ温度に調整した。カラムの搭載は４．１ｍｇ蛋白質／ｍｌレジンであり、流速は８ＣＶ／時間であった。

４０ｍＬのサンプルサイズを有するフラクションを集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて、約６．５ＣＶに対応し、Ｇ−ＳＣＦ分子当たり主に３つの結合されたＰＥＧ基を有する単離されたＧ−ＣＳＦを含む、１４４０ｍＬの生成物プールを作成した。生成物プールの体積は、溶出グラジエントの傾斜を増加させることにより減らすことができることが、予想される。

生成物プールをジアフィルトレーションして、約２００ｍＬとし、その後、10 mM 酢酸ナトリウム、43 mg/mL、pH 4.0でジアフィルトレーション
し、３０ｋＤａの分子量カットオフ(MWCO)の２つの50 cm² Millipore Pellicon XL membraneを備えたMillipore LabScale TFF系を用いて、4.9 mg/mLに濃縮した。

結果
生成物プールを10 mM 酢酸ナトリウム、43 mg/ml マンニトール、pH 4.0中で限外ろ過およびジアフィルトレーションを行い、物理化学的特徴付けを行った。図１は、上記したＰＥＧ化、部分的脱ＰＥＧ化、および精製したＧ−ＣＳＦ改変体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンを示し、７つのレーンは、以下を示す：
１．分子量マーカー
２．ＰＥＧ化後
３．ｐＨ９．５、Ｔ＝０ｈ
４．ｐＨ９．５、Ｔ＝２４ｈ
５．カチオン交換カラムへの添加物
６．カチオン交換カラムからの流出物
７．精製産物

レーン７に、ポリペプチド分子当たり３つのｍＰＥＧ−ＳＰＡ５０００基を有するＧ−ＣＳＦ改変体に相当する、単一の大きなバンドが認められる。さらに、４つのｍＰＥＧ−ＳＰＡ５０００基を有するＧ−ＣＳＦ改変体に相当する小さいバンドが、また、レーン７で見られる。所望により、本分野で一般的に知られる方法により、精製手段の最適化または調整を行うことにより、要求される純度により収量が僅かに減り得るが、４ＰＥＧ基に相当する小さなバンドを、減少させ、または実質的に取り除くことができる。
この手順の収量は、精製、ポリペプチド分子当たり主に３ＰＥＧ基を有する部分的脱ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの４５０ｍｇであり、これは、全体の５０％の収量であった。

実施例２
部分的脱ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの製造および解析
サンプル調製、脱ＰＥＧ化および精製
野生型ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号：１）に比較した、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを有するＧ−ＣＳＦ改変体を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞から製造し、その後、実質的に上記実施例１に記載したように、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ５０００を用いてＰＥＧ化した。これを、10 kDa MWCOフィルターを備えたVivaspinろ過装置を用い、150mMホウ酸ナトリウム、ｐH9.5にジアフィルトレーションした。最終サンプルの濃度は４．７ｍｇ／ｍＬであった。そして、サンプルを２１±３℃、４２時間インキュベーションした。

インキュベーション後、サンプルを30 mM クエン酸、10 mM NaOH、pH 2.9で希釈することによって、カチオン交換クロマトグラフィーのために調製した。そして、サンプルを２８ｍＬのSP-Sepharose HP resinで充填されたＸＫ１６／２０カラム（Amersham Biosciences）上に置いた。カラムを、サンプルを載せる前に、20 mM クエン酸、15 mM NaCl、pH 3.5の平衡化緩衝液で平衡化した。カラムに載せた後、カラムを同じ緩衝液で洗浄し、20 mM クエン酸、pH 3.5中、15 mMから200 mM NaClの直線グラジエントを用いて溶出し、相違するＰＥＧ化種を分離した。

フラクションを集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分析した。３個のＰＥＧ部分を主に含むＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ改変体を含む生成物プールを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づき作成した。この生成物プールを、１０ｋＤａのＭＷＣＯを有するVivaspinろ過装置を用いてジアフィルトレーションし、緩衝液を交換した。サンプルを10mMコハク酸ナトリウム、43 mg/mL、pH 4.0にジアフィルトレーションし、最終的に3.0mg/mlに濃縮した。

位置異性体解析
シアリダーゼ前処理と組み合わせたカチオン交換HPLC(CIEX-HPLC)を用いて、多様なＰＥＧ化種を含む生成物プール中の異なる位置異性体の組成について、データを得た。相違する位置異性体の存在によるＰＥＧ化後の不均一性に加えて、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、また、０、１または２個のシアル酸基を有する、１つのＯ-グリコシレーション部位(Thr133)を含むという点で、不均一である。シアル酸基の相違する数の結果として、クロマトグラムにおけるピークの数を減少させるために、分析前に、シアリダーゼ酵素前処理工程が含まれる。シアリダーゼ処理は、最初に、必要であれば、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.0で1mg/mlに希釈し、その後、μｇ蛋白質当たり0.05μl（0.25m単位）のシアリダーゼを添加し、サンプルを３７℃で１８時間インキュベーションし、シアル酸を除くことによって、実施される。そして、サンプルを同日に解析するか、または解析の日まで４℃で保存する。ＨＰＬＣを、PolySULFOETHYL A（登録商標）カチオン交換ＨＰＬＣカラム(PolyLC Inc.)を用いて、214nmのUV検出で実施する。異なるピークの特徴付けをPolySULFOETHYL A（登録商標）CIEXカラムから手動のコレクションの後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により実施した。

結果−ＰＥＧ損失
緩衝液を交換したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により解析し、時間の関数としての、ＰＥＧ損失の程度を評価した。結果（図２参照）は、実施例１に対する図１に示されるものと同様であり、２４または４２時間インキュベーションしたサンプル間に認められた全体的なＰＥＧ化の程度における僅かな変化のみが存在した（図２、レーン４および５）。

結果−生成物プール中の位置異性体の評価
図３は、上記に記載されたような、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により判断される主に３個のＰＥＧ５０００基を含む、本発明の部分的脱ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ化生成物プールのカチオン交換クロマトグラムを示す。２つの大きなピークは、それぞれ、３個のＰＥＧ５００基を有するメジャーな位置異性体を示す。３つの小さなピークは、４個のＰＥＧ基を有する２つの位置異性体および２個のＰＥＧ基を有する１つの位置異性体を示す。

２つの大きなピークを回収し、ＰＥＧ基が結合された位置を決定するためにネイティブペプチドマップ解析を行った。２つのメジャーな位置異性体は、以下のアミノ酸残基上でＰＥＧ化されていることが見出された：
異性体Ａ：Ｎ末端、Lys23およびLys159
異性体Ｂ：Ｎ末端、Lys105およびLys159
これら２つのメジャーな異性体は、サンプルに存在する位置異性体の９５％より多いことが示された。

実施例３
比較例
比較する目的のために、図４は、本発明の脱ＰＥＧ化を行わなかった精製、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ改変体のカチオン交換クロマトグラムの結果を示す。この場合、Ｇ−ＣＳＦ改変体は、実施例１および２で上記に示されたのと同じ、天然ヒトＧ−ＣＳＦに比較した５つの置換、つまり、K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを有した。それは、製造され、不安定なＰＥＧ部分を取り除くためにｐＨ９．５でインキュベーションしたことを除いて、実施例１で実質的に記載されたようにｍＰＥＧ−ＳＰＡ５０００でＰＥＧ化された。結果として、ＰＥＧ化改変体は、２−６付加ＰＥＧ部分を有する多くの相違するＰＥＧ異性体の混合物を含んだ。この位置異性体の混合物を、実施例１に実質的に記載されたようなカチオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。主に４−５付加ＰＥＧ部分を含むフラクションを単離し、実質的に実施例１に記載されたような限外ろ過およびジアフィルトレーションの後、上記に記載したようなCIEX-HPLC分析にかけた。このフラクションは、実施例１および２に記載した３−ＰＥＧフラクションに相当するが、部分的に脱ＰＥＧ化された３−ＰＥＧ生成物に比較して１または２の位置で付加された（不安定な）ＰＥＧ基が結合されており、つまり、この場合は、精製産物は、主として４−５付加ＰＥＧ基を含む。

図３に組成が示されている、本発明により調製された部分的に脱ＰＥＧ化された生成物に比較して、図４に示された生成物は、明らかに、より複雑で、不均一な混合物である。図３に示された本発明により調製された生成物は、それぞれが３つのＰＥＧ部分を含む２つのメジャーな位置異性体を９５％より多く含むが、図４に示された生成物は、それぞれ４または５の結合されたＰＥＧ部分を有する６つのメジャーな位置異性体を含む。これらの６つの４−５ＰＥＧ位置異性体は、Ｎ末端および位置K23、K105およびK159の１または２で安定なＰＥＧ部分を、そして、Ser66またはTyr165（データは示さず）の１または両方で不安定なＰＥＧ部分を含む。立体的障害のために、単一のＧ−ＣＳＦポリペプチドのこれらの位置の全てが、ＰＥＧ部分によって占められるわけではない。したがって、図４に示される生成物は、以下の６つのメジャーなＰＥＧ位置異性体の不均一な混合物を含む：
Ｎ末端、K23、S66、K159、Y165 (5-PEG)
Ｎ末端、S66、K105、K159、Y165 (5-PEG)
Ｎ末端、K23、S66、K159 (4-PEG)
Ｎ末端、K23、S66、Y165 (4-PEG)
Ｎ末端、S66、K105、K159 (4-PEG)
Ｎ末端、S66、K105、Y165 (4-PEG)。

実施例４
安定性データ
結合されたＰＥＧ部分の安定性を、４つの相違する温度で保存された相違する水性製剤において試験した。ポリペプチドは、実施例１で記載されたように、製造された後、ＰＥＧ化され、部分的に脱ＰＥＧ化され、そしてまた精製された、実施例１で挙げられた５つの置換を有するＧ−ＣＳＦ改変体であった。試験された製剤は以下のようである：

各製剤のｐＨは４．０であった。
CIEX-HPLCを用いて、各サンプルのＰＥＧ異性体の分布を、２６日、５６日および８９日後測定し、ＰＥＧ化の安定性を検討した。結果を以下の表に示す。

上記結果は、製剤および貯蔵温度にかかわらず、ＰＥＧ化が高度の安定であり、３ＰＥＧ異性体の割合は、２６、５６または８９日でサンプリングしたとき、全ての温度で９５％に大変近似する。表から容易に見受けられる違いは、-80℃のデータを対照に用いて、その他/特徴付けされないの割合において、主に25℃または35℃で貯蔵されたサンプルでの、時間に渡る僅かな相違であり、対応する、これらのサンプルの２ＰＥＧ異性体の割合の増加である。

比較して、下記の表は、上記に記載されたのと同様の製剤における同じＧ−ＣＳＦ改変体、ただし、本発明の脱ＰＥＧ化工程をしないで製造された、つまり、上記比較実施例３に記載された生成物に対応するものに対する、20、83日の貯蔵後に測定されたデータを示す。この場合の製剤は4.0のｐＨを有し、15 mM 酢酸ナトリウム、45 mg/mlマンニトール、および5 mg/mlＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ改変体からなり、ここで、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ改変体は、実験の開始時には、主に(98-99%）４−５個の結合されたＰＥＧ部分を含む。下記の表は、示された４つの温度での83日後、並びにそれらの温度のうち２つの20日後に測定されたＰＥＧ異性体の分布を示す。5℃で貯蔵されたとき、83日後、４−５ＰＥＧ部分を含むＧ−ＣＳＦポリペプチドの割合が、わずかにだけ減少する一方、25℃で貯蔵されたとき、４−５ＰＥＧ異性体の実質的な損失とそれに応じた３ＰＥＧ異性体の増加、そして、35℃での４−５ＰＥＧ異性体の更なる大きな損失と、それに応じた３ＰＥＧ異性体の増加が認められる。これは、本発明の脱ＰＥＧ化方法がなければ、上記に記載されたように製造されたＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、水性製剤で貯蔵されるとき、時間に渡り、そして温度に依存して、ポリペプチドから脱離する、不安定なＰＥＧ基を含むことを示す。

上記発明は、明確性および理解の目的で、いくらか詳しく記載されているが、当業者は、この開示を読むことにより、形態および詳細の多様な変化を、本発明の真の範囲から離れないで、することができることは明確である。本明細書で記載された実施例および実施態様が例示的な目的のみであること、そして、その観点から、多様な調整または変化が当業者に示唆され、そして、本出願の精神および範囲および添付する特許請求の範囲に含まれることは、理解される。本明細書で引用した、全ての刊行物、特許、特許出願および／または他の書類は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の書類が、それぞれ、全ての目的で、その全体が、引用により本明細書に組み込まれることが示されているかのように、同じ程度に全ての目的に、その全体が、引用により、本明細書に組み込まれる。

Claims

リジン残基のイプシロンアミノ基またはＮ末端アミノ基に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分、およびヒドロキシル基に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分を有するＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの安定性および均一性を増加させる方法であって、該ポリペプチドを、ヒドロキシル基に結合したＰＥＧ部分を取り除くために十分な時間、８．０を越える高められたｐＨとし、そして、該ｐＨを低下させて約８．０またはそれ以下とすることを含む方法。
高められたｐＨが、約８．５から約１０．５の範囲にある、請求項１に記載の方法。
高められたｐＨが、約９．０から約１０．０の範囲にある、請求項２に記載の方法。
高められたｐＨが、約９．２から約９．８の範囲、例えば９．５である、請求項３に記載の方法。
ポリペプチドを、約２時間から約１００時間の期間、高められたｐＨとする、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
ポリペプチドを、約４時間から約７２時間の期間、高められたｐＨとする、請求項５に記載の方法。
ポリペプチドを、約８時間から約４８時間の期間、高められたｐＨとする、請求項６に記載の方法。
ポリペプチドを、約１２時間から約３０時間の期間、高められたｐＨとする、請求項７に記載の方法。
さらに、ポリペプチドを、低下させたｐＨで、少なくとも１つのクロマトグラフィー精製工程にかけることを含む、請求項１−８のいずれかに記載の方法。
クロマトグラフィー精製工程が、イオン交換クロマトグラフィーである、請求項９に記載の方法。
ｐＨを、約７．０より下に低下させ、そして、クロマトグラフィー精製工程が、カチオン交換クロマトグラフィーである、請求項１０に記載の方法。
クロマトグラフィー精製工程が、ゲルろ過クロマトグラフィーである、請求項９に記載の方法。
低下させたｐＨが、約２．０から約５．０の範囲である、請求項１−１１のいずれかに記載の方法。
低下させたｐＨが、約２．５から約４．５の範囲である、請求項１３に記載の方法。
Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを、アミン特異的活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とＰＥＧ化反応させ、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド中間体を製造し、そして、その後、該ＰＥＧ化ポリペプチド中間体を、ヒドロキシル基に結合したＰＥＧ部分を取り除くために十分な時間、少なくとも約９．０の高められたｐＨとし、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを製造することを含む、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの製造方法。
ＰＥＧ化反応が、約７．０−９．０の範囲のｐＨで実施される、請求項１５に記載の方法。
ＰＥＧ化反応が、９．０を超えるｐＨで実施される、請求項１５に記載の方法。
ＰＥＧ化反応およびその後のヒドロキシル基に結合したＰＥＧ部分の除去が、単一ｐＨ値で、単一工程で実施される、請求項１７に記載の方法。
アミン特異的活性化ＰＥＧが、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）、またはｍＰＥＧ−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）である、請求項１５に記載の方法。
アミン特異的活性化ＰＥＧが、約５ｋＤａの分子量を有するｍＰＥＧ−ＳＰＡである、請求項１５に記載の方法。
高められたｐＨが、約９．２から１１．０の範囲である、請求項１５に記載の方法。
高められたｐＨが、約９．２から１０．０の範囲である、請求項２１に記載の方法。
請求項１−２２のいずれかに記載の方法で製造される、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド。
ポリペプチドが、野生型ヒトＧ−ＣＳＦに比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含む、Ｇ−ＣＳＦ改変体である、請求項２３に記載のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド。
ポリペプチドが、野生型ヒトＧ−ＣＳＦに比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含み、ポリペプチドのＰＥＧ位置異性体の少なくとも約８０％が、３つの結合したＰＥＧ部分を有するリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体である、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドのＰＥＧ位置異性体の混合物を含む、組成物。
ポリペプチドのＰＥＧ位置異性体の少なくとも約８５％が、３つの結合したＰＥＧ部分を有するリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体である、請求項２５に記載の組成物。
ポリペプチドのＰＥＧ位置異性体の少なくとも約９０％が、３つの結合したＰＥＧ部分を有するリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体である、請求項２５に記載の組成物。
３つの結合したＰＥＧ部分を有するＰＥＧ位置異性体の少なくとも約８０％が、２つのＰＥＧ位置異性体からなり、該異性体の一つが、Ｎ末端、Lys23およびLys159で結合しているＰＥＧ部分を有し、そして、他の異性体が、Ｎ末端、Lys105およびLys159で結合しているＰＥＧ部分を有する、請求項２５に記載の組成物。
３つの結合したＰＥＧ部分を有するＰＥＧ位置異性体の少なくとも約８５％が、２つのＰＥＧ位置異性体からなり、該異性体の一つが、Ｎ末端、Lys23およびLys159で結合しているＰＥＧ部分を有し、そして、他の異性体が、Ｎ末端、Lys105およびLys159で結合しているＰＥＧ部分を有する、請求項２６に記載の組成物。
３つの結合したＰＥＧ部分を有するＰＥＧ位置異性体の少なくとも約９０％が、２つのＰＥＧ位置異性体からなり、該異性体の一つが、Ｎ末端、Lys23およびLys159で結合しているＰＥＧ部分を有し、そして、他の異性体が、Ｎ末端、Lys105およびLys159で結合しているＰＥＧ部分を有する、請求項２７に記載の組成物。
ポリペプチドが、野生型ヒトＧ−ＣＳＦに比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含み、そして、ポリペプチドのＰＥＧ位置異性体の少なくとも約８０％が、５℃の温度で、３ヶ月間、水性参照組成物中の貯蔵後に、３つの結合されたＰＥＧ部分を有するリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体である、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドのＰＥＧ位置異性体の混合物を含む、組成物。
医薬的に許容される担体、および請求項２３または２４に記載のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチドまたは請求項２５−３１のいずれかに記載の組成物を含む、組成物。
野生型ヒトＧ−ＣＳＦに比較して置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含む、組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドの、リジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体の混合物を製造する方法であって、
ａ）宿主細胞に組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドを発現させ；
ｂ）組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドを単離し；
ｃ）単離された組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドとアミン特異的活性化ＰＥＧを反応させ、複数の組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドのＰＥＧ位置異性体を製造し；そして、
ｄ）ｐＨ８．５から１０．５で複数のＰＥＧ位置異性体を反応させ、複数の部分的に脱ＰＥＧ化された組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドのリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体を製造する、
ことを含む方法。
アミン特異的活性化ＰＥＧが、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）、またはｍＰＥＧ−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
さらに、複数の組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドのリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体を、１以上のクロマトグラフィー精製工程にかけ、実質的に精製されたＧ−ＣＳＦポリペプチドのリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体の混合物を製造することを含む、請求項３３または３４に記載の方法。
さらに、組換えＧ−ＣＳＦポリペプチドのリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体の実質的に精製された混合物の有効用量を、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤と混合し、医薬組成物を製造することを含む、請求項３５に記載の方法。
請求項３３に記載の方法により製造される、複数の部分的に脱ＰＥＧ化されたリジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体。
請求項３５に記載の方法により製造される、リジン／Ｎ末端ＰＥＧ位置異性体の実質的に精製された混合物。
請求項３６に記載の方法により製造される、医薬組成物。
不十分な好中球レベルに罹患している、またはその危険性のある、患者における、好中球のレベルを増加させる方法であって、該患者に、請求項２３または２４に記載のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド、または請求項２５−３２または３６−３９のいずれかに記載の組成物の有効量を該患者に投与することを含む、方法。
不十分な好中球レベルが、化学療法または放射線療法の結果である、請求項４０に記載の方法。
不十分な好中球レベルに罹患している、またはその危険性のある患者における好中球のレベルを増加させる医薬の製造のための、請求項２３または２４に記載のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド、または請求項２５−３２または３６−３９のいずれかに記載の組成物の使用。
不十分な好中球レベルが、化学療法または放射線療法の結果である、請求項４２に記載の使用。
混合物のＰＥＧ位置異性体の少なくとも約８０％が、２つのＰＥＧ位置異性体からなり、それぞれが、リジンのイプシロンアミノ基に結合した２個のＰＥＧ部分およびＮ末端アミノ基に結合した１個のＰＥＧ部分からなるＰＥＧ部分を有する、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦポリペプチド改変体のＰＥＧ位置異性体の均一な混合物を含む、組成物。
均一な混合物のＰＥＧ位置異性体の少なくとも約８５％が、２つのＰＥＧ位置異性体からなり、それぞれが、リジンのイプシロンアミノ基に結合した２個のＰＥＧ部分およびＮ末端アミノ基に結合した１個のＰＥＧ部分からなるＰＥＧ部分を有する、請求項４４に記載の組成物。
均一な混合物のＰＥＧ位置異性体の少なくとも約９０％が、２つのＰＥＧ位置異性体からなり、それぞれが、リジンのイプシロンアミノ基に結合した２個のＰＥＧ部分およびＮ末端アミノ基に結合した１個のＰＥＧ部分からなるＰＥＧ部分を有する、請求項４４に記載の組成物。
医薬的に許容される担体および請求項４４−４６のいずれかに記載の組成物を含む、組成物。
不十分な好中球レベルに罹患しているか、またはその危険性のある患者において、好中球のレベルを増加させる方法であって、該患者に請求項４４−４６のいずれかに記載の組成物の有効量を投与することを含む、方法。
不十分な好中球レベルに罹患しているか、またはその危険性のある患者において、好中球のレベルを増加させる医薬の製造のための、請求項４４−４６のいずれかに記載の組成物の使用。