BRPI0611221A2 - polipeptÍdeos de g-csf peguilados e mÉtodos de produÇço dos mesmos - Google Patents

Abstract

Método para aumento da estabilidade e uniformidade de um polipeptideo de G-CSF PEGuilado tendo pelo menos uma porção de PEG presa ao grupo epsilon amino de um resíduo de lisina ou ao grupo amino N-terminal e pelo menos uma porção de PEG presa a um grupo hidroxila, compreendendo sujeição do polipeptídeo a um pH elevado de acima de 8,0 durante um período de tempo adequado para remover as porções de PEG presas a um grupo hidroxila e redução do pH para cerca de 8,0 ou menos; bem como polipeptideos e composições de G-CSF PEGuilado produzidas de acordo com o método e métodos para aumento dos níveis de neutrófilo em um paciente usando os polipeptídeos e composições de G-CSF PEGuilado.

Description

POLIPEPTÍDEOS DE G-CSF PEGUILADOS E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DOSMESMOS

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um método para remoçãode porções de PEG lábeis de proteínas de G-CSF PEGuiladaspara aumentar a estabilidade e uniformidade e à proteínasde G-CSF PEGuiladas resultantes. A invenção também serefere à composições farmacêuticas compreendendo asproteínas PEGuiladas e métodos de tratamento através deadministração das composições farmacêuticas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A fixação covalente de porções de polietileno glicol(PEG) à proteínas ou polipeptídeos ("PEGuilação") é umatécnica bem conhecida para aperfeiçoamento das propriedadesde tais proteínas ou polipeptídeos, em particular proteínasfarmacêuticas, por exemplo, de forma a melhorar a meia-vidaem circulação e/ou proteger epítopos potenciais é, assimreduzir o potencial de uma resposta imunogênica indesejada.Numerosas tecnologias baseadas em PEG ativo estãodisponíveis para proporcionar fixação da porção de PEG a umou mais grupos sobre a proteína. Por exemplo, propionato demPEG-succinimidila (mPEG-SPA, disponível da NektarTherapeutics) é geralmente considerado como sendo seletivopara fixação ao N-terminal e grupos epsilon-amino deresíduos de lisina via uma ligação de amida. Contudo, naprática, o mPEG-SPA nem sempre se fica exclusivamente aesses grupos, mas também pode se fixar ao grupo hidroxilade um resíduo de serina, tirosina ou treonina via umaligação de éster. Como um resultado, proteínas PEGuiladaspreparadas usando essa tecnologia podem não ter um grausuficiente de uniformidade e podem conter uma série deoutros diferentes isômeros de PEG que não aqueles que erampretendidos. Isso é indesejado por várias razões, incluindoo fato de que isso torna a caracterização de tais proteínasmais complicada. Ainda, porções de PEG ligadas a outrosgrupos que não aqueles pretendidos podem ser relativamenteinstáveis. Por exemplo, porções de PEG ligadas a um grupohidroxila via uma ligação de éster no caso de um PEG amina-específico, tal como mPEG-SPA, tendem a ser relativamenteinstáveis comparado com aquelas porções que são ligadas viauma ligação de amida ao resíduo N-terminal ou uma lisina.Dependendo da formulação e condições de armazenamento, issopode levar a uma perda indesejada desses grupos de PEGlábeis e, assim, potencialmente, a uma alteração naspropriedades da proteína PEGuilada com o tempo. Ainda,podem haver problemas regulatórios ou de segurançapotenciais para uma proteína PEGuilada farmacêutica na qualhá um risco de que uma ou mais porções de PEG possam sedesprender da proteína no corpo após ela ser administrada aum paciente.

A presente invenção se dirige a esses problemasproporcionando um método pelo qual tais grupos de PEGlábeis podem ser facilmente removidos, desse modo,resultando em um produto de proteína PEGuilado mais estávele uniforme.

BREVE DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere, em geral, a um métodopara aumento da estabilidade e uniformidade de umpolipeptídeo PEGuilado tendo pelo menos uma porção de PEGpresa a um resíduo de lisina ou ao N-terminal e pelo menosuma porção de PEG presa a um grupo hidroxila, compreendendosujeição do polipeptídeo a um pH alterado durante umperíodo de tempo adequado para remover porções de PEGpresas a um grupo hidroxila, após o que o pH é ajustadopara um pH adequado para armazenamento a longo prazo dopolipeptídeo em questão.

Em um aspecto particular, a invenção se refere a ummétodo para aumento da estabilidade e uniformidade de umpolipeptídeo de fator de estimulação de colônia degranulócito (G-CSF) PEGuilado tendo pelo menos uma porçãode PEG presa ao grupo epsilon amino de um resíduo de lisinaou ao grupo amino N-terminal e pelo menos uma porção de PEGpresa a um grupo hidroxila compreendendo sujeição dopolipeptídeo a um pH elevado de acima de 8,0 durante umperíodo de tempo adequado para remover porções de PEGpresas a um grupo hidroxila e redução do pH para cerca de8,0 ou menos.

Outro aspecto da invenção se refere a um método paraprodução de um polipeptídeo de G-CSF PEGuiladocompreendendo sujeição de um polipeptídeo de G-CSF a umareação de PEGuilação com um polietileno glicol (PEG)ativado amina-específico para produzir um intermediário depolipeptídeo de G-CSF PEGuilado e, subseqüentemente,sujeição do intermediário de polipeptídeo PEGuilado a um pHelevado de pelo menos cerca de 9,0 durante um período detempo adequado para remover porções de PEG presas a umgrupo hidroxila para produzir o polipeptídeo de G-CSFPEGuilado.

Outro aspecto da invenção se refere a uma composiçãocompreendendo uma mistura homogênea de isômeros de PEGposicionais de uma variante de polipeptídeo de G-CSFPEGuilado, em que pelo menos cerca de 80% dos isômeros dePEG posicionais da mistura consistem de dois isômeros dePEG posicionais tendo, cada um, porções de PEG consistindode duas porções de PEG ligadas a grupos epsilon amino delisina e uma porção de PEG ligada ao grupo amino N-terminal.

Um aspecto adicional da invenção se refere a umacomposição compreendendo uma mistura de isômeros de PEGposicionais de um polipeptídeo de G-CSF PEGuilado, em que opolipeptídeo compreende a substituição K16R, K34R, K4 0R,TlO5K e S159K com relação ao G-CSF humano do tipo selvagem(SEQ ID NO: 1) e em que pelo menos cerca de 80% dosisômeros de PEG posicionais do polipeptídeo são isômeros dePEG posicionais de lisina/N-terminais tendo três porções dePEG presas.

Em ainda outro aspecto, a invenção se refere a ummétodo de produção de uma mistura de isômeros de PEGposicionais de lisina/N-terminais de um polipeptídeo de G-CSF recombinante compreendendo as substituições K16R, K34R,K4 0R, T105K e S 159K com relação ao G-CSF humano do tiposelvagem, compreendendo: a) expressão do polipeptídeo de G-CSF recombinante em uma célula hospedeira; b) isolamento dopolipeptídeo de G-CSF recombinante; c) reação dopolipeptídeo de G-CSF recombinante isolado com um PEGativado amina-específico para produzir uma pluralidade deisômeros de PEG posicionais do polipeptídeo de G-CSFrecombinante; d) reação da pluralidade de isômeros de PEGposicionais em um pH de 8,5 a 10,5 para produzir umapluralidade de isômeros de PEG posicionais de lisina/N-terminais parcialmente PEGuilados do polipeptídeo de G-CSFrecombinante.

Outros aspectos da invenção se referem a polipeptídeosde G-CSF PEGuilados produzidos usando os métodos descritosaqui, bem como polipeptídeos de G-CSF PEGuiladoscaracterizados por sua distribuição de isômero de PEGposicionai e composições compreendendo tais polipeptídeosde G-CSF PEGuilados e métodos para aumento do nível deneutrófilos em um paciente sofrendo de ou em risco de umnível insuficiente de neutrófilos através de administraçãode um polipeptídeo de G-CSF PEGuilado ou uma composição dainvenção. Aspectos adicionais da invenção e modalidadespreferidas serão evidentes a partir da descrição abaixo,bem como das reivindicações em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra uma exploração de uma análise porSDS-PAGE de uma variante de G-CSF que foi PEGuilada,parcialmente des-PEGuilada e purificada conforme descritoacima.

A Figura 2 mostra uma exploração de uma análise porSDS-PAGE de um G-CSF que foi PEGuilado e parcialmente des-PEGuilado conforme descrito aqui.

A Figura 3 mostra um cromatograma de troca de cátionsdo reservatório de produto parcialmente des-PEGuiladopreparado de acordo com a invenção.

A Figura 4 mostra um cromatograma de troca de cátionsde uma variante de G-CSF PEGuilada purificada que não foisubmetida à des-PEGuilação de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO

DefiniçõesNo contexto da presente descrição e reivindicações, asseguintes definições se aplicam: os termos "polipeptídeo"ou "proteína" podem ser usados permutavelmente aqui para sereferir a polímeros de aminoácidos, sem estar limitado auma seqüência de aminoácido de qualquer comprimento emparticular. Esses termos se destinam a incluir não apenasproteínas de comprimento total, mas também, por exemplo,fragmentos ou versões truncadas, variantes, domínios, etc.de qualquer determinada proteína ou polipeptídeo.

Um polipeptídeo de "G-CSF" é um polipeptídeo tendo aseqüência do fator de estimulação de colônia de granulócitohumano (hG-CSF), conforme mostrado em SEQ ID NO: 1, ou umavariante de hG-CSF que exibe atividade de G-CSF. A"atividade de G-CSF" pode ser a capacidade de se ligar a umreceptor de G-CSF (Fukunaga e colaboradores, J. Bio. Chem.,265: 14008, 1990), mas é, de preferência, atividade deproliferação de células de G-CSF, em particular determinadaem um ensaio de atividade in vitro usando a linhagem decélulas de murino NFS-60 (ATCC Número: CRL-1838). Um ensaioin vitro adequado para atividade de G-CSF usando a linhagemde células NFS-60 é descrita em Hammerling e colaboradoresem J. Pharm. Biomed. Anal. 13(1): 9-20, 1995. Umpolipeptídeo "exibindo" atividade de G-CSF é consideradocomo tendo tal atividade quando ele mostra uma funçãomensurável, por exemplo, uma atividade proliferativamensurável no ensaio in vitro.

Uma "variante" é um polipeptídeo o qual difere quantoa um ou mais resíduos de aminoácido de um polipeptídeoprecursor, onde o polipeptídeo precursor geralmente é umcom uma seqüência de aminoácido nativa, do tipo selvagem,tipicamente um polipeptídeo de mamífero nativo e, maistipicamente, um polipeptídeo humano nativo. A variante,assim, contém uma ou mais substituições, inserções oudeleções comparado com o polipeptídeo nativo. Esse pode,por exémplo, incluir truncamento do N- e/ou C-término em umou mais resíduos de aminoácido ou a adição de um ou maisresíduos extra no N- e/ou C-término, por exemplo, adição deum resíduo de metionina no N-terminal. A variante, maisfreqüentemente, irá diferir em até 15 resíduos deaminoácido do polipeptídeo precursor, tal como em até 12,10, 8 ou 6 resíduos de aminoácido.

Um "PEG ativado amina-específico" é qualquer derivadode PEG que se prende, de preferência, ao grupo amino N-terminal ou a grupos ε-amino de resíduos de lisina via umaligação de amida. Exemplos de derivados de PEG ativadosamina-específicos incluem:

mPEG-propionato de succinimidila (mPEG-SPA):

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mPEG-butanoato de succinimidila (mPEG-SBA):

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e mPEG-a-metilbutanoato de succinimidila (mPEG-SMB):

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mPEG-SPA, mPEG-SBA e mPEG-SMB estão disponíveis da NektarTherapeutics; veja os Catálogos 2004 e 2005-2006 da NektarAdvanced PEGylation, "Polyethylene Glycol and Derivativesfor Advanced PEGylation". Outros derivados de PEG ativadoamina-específicos incluem PEG-SS (succinato desuccinimidila) , PEG-SG (glutarato de succinimidila) , PEG-NPC (carbonato de p-nitrofenila) e PEG-isocianato,disponíveis da SunBio Corporation; e PEG-SCM, disponível daNOF Corporation.

Uma porção de PEG "lábil" se refere, no presentecontexto, a uma porção de PEG presa a um grupo hidroxila deum polipeptídeo, em particular via uma ligação de estar aogrupo hidroxila de um resíduo de serina, tirosina outreonina. Conforme explicado acima, a fixação de taisporções de PEG via um grupo hidroxila tende a ser instável,de modo que essas porções de PEG tendem a se desprender dopolipeptídeo com o tempo através de hidrólise das ligaçõesde estar, por exemplo, quando um polipeptídeo contendo taisporções é armazenado na forma de uma solução aquosa.

Conforme usado aqui, "estabilidade" se refere àfixação de porções de PEG ligadas a um polipeptídeo, istoé, quer tais porções de PEG permaneçam ligadas aopolipeptídeo durante o tempo, por exemplo, durantearmazenamento em uma solução aquosa ou quer eles venham atender a se desprender, por exemplo, como um resultado dehidrólise da ligação de éster;

Conforme usado aqui, o termo "isômero de PEGposicionai" de uma proteína se refere à diferentes formasPEGuiladas da proteína onde grupos de PEG estão localizadosem diferentes posições de aminoácido da proteína. 0 termo"isômero de PEG de lisina/N-terminal" de uma proteínasignifica que os grupos de PEG estão presos ao amino-término da proteína e/ou a grupos epsilon amino de resíduosde lisina na proteína. Por exemplo, a expressão "isômerosde PEG posicionais de lisina/N-terminais tendo 3 porções dePEG presas", conforme aplicado ao G-CSF, significa umamistura de isômeros de PEG posicionais de G-CSF nos quaistrês grupos de PEG são presos a grupos epsilon amino deresíduos de lisina e/ou ao N-terminal da proteína.Tipicamente, um "isômero de PEG posicionai de lisina/N-terminal tendo 3 porções de PEG presas" terá duas porçõesde PEG presas aos resíduos de lisina e uma porção de PEGpresa ao N-terminal. Análise dos isômeros de PEGposicionais pode ser realizada usando HPLC por troca dacátions, conforme descrito nos exemplos abaixo.

Uma "mistura substancialmente purificada de isômerosde PEG de lisina/N-terminais" de um polipeptídeo se refereà mistura de isômeros de PEG posicionais de lisina/N-terminais a qual foi submetida a um procedimentocromatográfico ou outro de purificação de forma a removerimpurezas tais como isômeros de PEG posicionais de não-lisina/N-terminais. A "mistura substancialmente purificadade isômeros de PEG posicionais de lisina/N-terminais" será,por exemplo, isenta da maioria das porções de PEG lábeispresas a um grupo hidroxila que, de outro modo, estariapresente na ausência de uma etapa de des-PEGuilação parciale subseqüente purificação, conforme descrito aqui, econterá, tipicamente, menos do que cerca de 20% depolipeptídeos contendo uma porção de PEG lábil presa a umgrupo hidroxila, mais tipicamente menos de cerca de 15%. Depreferência, existirão menos do que cerca de 10% depolipeptídeos contendo uma porção de PEG lábil presa a umgrupo hidroxila, por exemplo, menos do que cerca de 5%.

O termo "mistura homogênea de isômeros de PEGposicionais de uma variante de polipeptídeo" significa quea porção de polipeptídeo da diferentes isômeros de PEGposicionais é a mesma. Isso significa que os diferentesisômeros de PEG posicionais da mistura são todos baseadosem uma única seqüência de variante de polipeptídeo. Porexemplo, uma mistura homogênea de isômeros de PEGposicionais de uma variante de polipeptídeo de G-CSFPEGuilada significa que diferentes isômeros de PEGposicionais da mistura são baseados em uma única variantede polipeptídeo de G-CSF.

Conforme usado aqui, "uniformidade" se refere àhomogeneidade de um polipeptídeo PEGuilado em termos donúmero de diferentes isômeros posicionais, isto é,diferentes isômeros de polipeptídeo contendo diferentesnúmeros de porções de PEG presas em diferentes posições,bem como à distribuição relativa desses isômerosposicionais. Para polipeptídeos farmacêuticos destinados auso terapêutico em seres humanos ou animais, geralmente édesejável que o número de diferentes isômeros de PEGposicionais seja minimizado.

"Des-PEGuilação parcial" se refere ao fato de que osmétodos da invenção servem para remover porções de PEGlábeis presas a um grupo hidroxila, enquanto que porções dePEG que são mais estavelmente presas ao N-terminal ou grupoamino de um resíduo de lisina permanecem intactos. Conformeexplicado abaixo, o progresso do processo de des-PEGuilaçãoé dependente do valor de pH elevado em particular e daduração do pH elevado. Portanto, dependendo das condiçõesescolhidas em qualquer caso em particular, é possível queuma pequena proporção dos polipeptídeos ainda possa ter umaporção de PEG presa a um grupo hidroxila no final de umaetapa de des-PEGuilação. Baseado na informação fornecidaaqui e no conhecimento geral comum na técnica de análise deproteína, contudo, aqueles habilitados na técnica serãocapazes de adaptar o processo de modo que substancialmentetodas as porções de PEG lábeis sejam removidas e quaisquerporções de PEG lábeis restantes sejam insignificantes paraas propriedades desejadas do produto final. Qualquerreferência à "des-PEGuilação" aqui deverá ser compreendidacomo se referindo à "des-PEGuilação parcial".

Descrição Detalhada

Conforme indicado acima, um aspecto particular dainvenção se refere a um método para aumento da estabilidadee uniformidade de um polipeptídeo de G-CSF PEGuilado tendopelo menos uma porção de PEG presa ao grupo epsilon aminode um resíduo de lisina ou ao grupo amino N-terminal e pelomenos uma porção de PEG presa a um grupo hidroxila,compreendendo sujeição do polipeptídeo a um pH elevadoacima de 8,0 durante um período de tempo adequado pararemover as porções de PEG presas a um grupo hidroxila eredução do pH para cerca de 8,0 ou menos. Embora essemétodo seja adequado para qualquer polipeptídeo de G-CSF demamífero, o polipeptídeo é, de preferência, um polipeptídeode G-CSF, isto é, com a seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 1, opcionalmente com um resíduo de metionina preso aoN-terminal ou uma variante do mesmo. No caso de variantesde G-CSF, essas podem ter uma ou mais substituições,inserções ou deleções e/ou truncamento do N- e/ou C-términoem um ou mais resíduos de aminoãcido, comparado com umpolipeptídeo de G-CSF nativo do tipo selvagem, tipicamentecomparado com o G-CSF humano (SEQ ID NO: 1) , por exemplo,de 1 a 15 substituições, tal como até 6, 8, 10 ou 12substituições. Variantes de G-CSF preferidas incluemaquelas divulgadas no WO 01/51510 e WO 03/006501.

Conforme é descrito, por exemplo, no WO 03/006501, hG-CSF contém quatro resíduos de lisina nas posições 16, 23,34 e 4 0 e, quando de sujeição de G-CSF à PEGuilação usandoPEG ativado que, de preferência, se liga a resíduos delisina ou ao N-terminal, freqüentemente será desejávelremover pelo menos um desses resíduos de lisina, porexemplo, dois, três ou todos esses resíduos de lisina, porexemplo, através de deleção mas, de preferência, através desubstituição. 0 polipeptídeo de G-CSF usado no método dainvenção pode, portanto, ser uma variante na qual pelomenos um dos resíduos de aminoácido selecionados do grupoconsistindo de K16, K23, K34 e K4 0 tenha sido deletado ousubstituído, geralmente através de substituição por umresíduo de R ou Q, de preferência um resíduo de R. Opolipeptídeo de G-CSF pode, assim, ter uma, duas, três ouquatro substituições selecionadas do grupo consistindo deK16R/Q, K23R/Q, K34R/Q, K40R/Q (onde, por exemplo, "K16R/Q"denota que a lisina na posição 16 é substituída por umresíduo de arginina ou glutamina). De preferência, opolipeptídeo inclui as substituições K16R+K34R+K40R,enquanto que a lisina na posição 23 é deixada inalterada.

Além da remoção de resíduos de lisina onde PEGuilaçãonão é desejada, o WO 03/006501 também descreve a adição de13/52resíduos de lisina de forma a criar sítios para PEGuilação.Esses podem ser adicionados através de inserção, mas são,de preferência, adicionados através de substituição.Exemplos de substituições de aminoácido preferidas de formaa introduzir um sítio para PEGuilação incluem uma ou maisde Q70K, Q90K, T105K, Q120K, T133K, S159K e H170K, taiscomo duas, três, quatro ou cinco dessas substituições, comsubstituições preferidas sendo T105K+S159K. Em umamodalidade preferida, o polipeptídeo de G-CSF inclui assubstituições K16R, K34R, K40R, T105K e S159K. Em umamodalidade particular, o polipeptídeo de G-CSF tem apenasessas cinco substituições com relação ao hG-CSF.

Produção de polipeptídeos de G-CSF

Os polipeptídeos de G-CSF a serem PEGuilados de acordocom a invenção podem ser produzidos através de qualquermétodo adequado conhecido na técnica, por exemplo, conformedescrito no WO 03/006501, o qual é aqui incorporado porreferência. Tais métodos incluem construção de umaseqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo eexpressão da seqüência em um hospedeiro transformado outransfectado. Contudo, os polipeptídeos da invenção podemser produzidos, talvez menos eficazmente, através desíntese química ou uma combinação de síntese química etecnologia de DNA recombinante. Uma seqüência denucleotídeo que codifica um polipeptídeo ou a parte depolipeptídeo de um conjugado da invenção pode serconstruída através de isolamento ou síntese de umaseqüência de nucleotídeo que codifica o G-CSF precursor,tal como hG-CSF, com a seqüência de aminoácido mostrada emSEQ ID NO: 1 e, então, alteração da seqüência denucleotídeo de modo a realizar a introdução (isto é,inserção ou substituição) ou deleção (isto é, remoção ousubstituição) do(s) resíduo(s) de aminoácido relevante(s).

A seqüência de nucleotídeo é, convenientemente,modificada através de mutagênese sítio-dirigida de acordocom métodos convencionais. Alternativamente, a seqüência denucleotídeo é preparada através de síntese química, porexemplo, através de uso de um sintetizador deoligonucleotídeo, em que oligonucleotídeos são projetadosbaseado na seqüência de aminoácido do polipeptídeo desejadoe, de preferência, seleção daqueles códons que sãofavorecidos na célula hospedeira na qual o polipeptídeorecombinante será produzido. Por exemplo, vários pequenosoligonucleotídeos que codificam porções do polipeptídeodesejado podem ser sintetizados e montados através de PCR,ligação ou reação em cadeia de ligação (LCR) (Barany, PNAS88: 189-193, 1991). Os oligonucleotídeos individuaisconterão, tipicamente, saliências 5' ou 3 ' para montagemcomplementar.

Uma vez montada (através de síntese, mutagênese sítio-dirigida ou outro método), a seqüência de nucleotídeo quecodifica o polipeptídeo é inserida em um vetor recombinantee operavelmente ligada à seqüências de controle necessáriaspara expressão do G-CSF na célula hospedeira transformadadesejada.

Aqueles habilitados na técnica serão capazes deselecionar vetores, seqüências de controle de expressão ehospedeiros adequados para expressão do polipeptídeo. 0vetor recombinante pode ser um vetor de replicaçãoautônoma, isto é, um vetor o qual existe como uma entidadeextracromossômica, a replicação do qual é independente dereplicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo.Alternativamente, o vetor é um o qual, quando introduzidoem uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célulahospedeira e replicado junto com o(s) cromossoma(s) no(s)qual(is) ele foi integrado.

0 vetor é, de preferência, um vetor de expressão noqual a seqüência de nucleotideo que codifica o polipeptídeoda invenção é operavelmente ligado a segmentos adicionaisrequeridos para transcrição da seqüência de nucleotideo. 0vetor é, tipicamente, derivado de DNA de plasmídeo ouviral. Uma série de vetores de expressão adequados paraexpressão nas células hospedeiras mencionadas aqui estãocomercialmente disponíveis ou descritos na literatura.Informação detalhada sobre vetores adequados para expressãode G-CSF pode ser encontrada no WO 03/006501.

O termo "seqüências de controle" é definido aqui comoincluindo todos os componentes os quais são necessários ouvantajosos para a expressão do polipeptídeo da invenção.Cada seqüência de controle pode ser nativa ou estranha àseqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo.Tais seqüências de controle incluem, mas não estãolimitadas a, uma seqüência líder, uma seqüência depoliadenilação, seqüência de pró-peptídeo, promotor,intensificador ou uma seqüência de ativação a montante,seqüência de peptídeo sinalizador, íntron sintético eterminador de transcrição. No mínimo, as seqüências decontrole incluem um promotor. Uma ampla variedade deseqüências de controle de expressão pode ser usada napresente invenção, por exemplo, qualquer uma das seqüênciasde controle listadas no WO 03/006501.

A seqüência de nucleotídeo da invenção que codifica umpolipeptídeo exibindo atividade de G-CSF, quer preparadaatravés de mutagênese sítio-dirigida, síntese, PCR ououtros métodos, pode também opcionalmente incluir umaseqüência de nucleotídeo que codifica um peptídeosinalizador. O peptídeo sinalizador está presente quando opolipeptídeo tem de ser secretado das células nas quais eleé expresso. Tal peptídeo sinalizador, se presente, deveráser um reconhecido pela célula escolhida para expressão dopolipeptídeo. 0 peptídeo sinalizador pode ser homólogo (porexemplo, ser aquele que normalmente se associa com hG-CFS)ou heterólogo (isto é, originário de outra fonte que nãohG-CSF) ao polipeptídeo ou pode ser homólogo ou heterólogoà célula hospedeira, isto é, ser um peptídeo sinalizadornormalmente expresso a partir da célula hospedeira ou um oqual normalmente não é expresso a partir da célulahospedeira. Conseqüentemente, o peptídeo sinalizador podeser procariota, por exemplo, derivado de uma bactéria, talcomo E. coli, ou eucariota, por exemplo, derivado de umacélula de mamífero, inseto ou levedo. Para informaçãoadicional sobre peptídeos sinalizadores adequados veja WO03/006501.

Qualquer hospedeiro adequado pode ser usadò paraproduzir o polipeptídeo de G-CSF, incluindo bactérias(embora não particularmente preferido), fungos (incluindolevedos), planta, inseto, mamífero ou outras células deanimal ou linhagens de células apropriadas, bem comoanimais ou plantas transgênicas. Células de mamífero sãopreferidas. Exemplos de células hospedeiras bacterianasincluem bactérias gram-positivas, tais como cepas deBacillus, por exemplo, B. brevis ou B. subtilis,Pseudomonas ou Streptomyces, ou bactérias gram-negativas,tais como cepas de E. coli. Exemplos de células hospedeirasde fungos filamentosos adequadas incluem cepas deArpergillus, por exemplo, A. oryzae, A. niger ou A.nidulans, Fusarium ou Trichoderma. Exemplos de célulashospedeiras de levedo adequadas incluem cepas deSaccharomyces, por exemplo, S. eerevisiae,

Schizosaccharomyces, Klyveromyees, Piehia, tais como P.pastoris ou P. methanolica, Hansenulal tal como H.Polymorpha ou Yarrowia. Exemplos de células hospedeiras deinseto adequadas incluem uma linha de células deLepidõptero, tais como células de Spodoptera frugiperda (Sf9 ou Sf21) ou Trichoplusioa ni (High Five) (US 5.077.214).Exemplos de células hospedeiras de mamífero adequadasincluem linhagens de células de ovário de hâmster Chinês(CHO) (por exemplo, CHO-Kl; ATCC CCL-61), linhagens decélulas de Green Monkey (COS) (por exemplo, COS 1 (ATCCCRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de camundongo(por exemplo, NS/0), linhagens de células de Rim de HâmsterBebê (por exemplo, ATCC CRL- 1632 ou ATCC CCL-10) e célulashumanas (por exemplo, HEK 293 (ATCC CRL-1573)). Linhagensde células adicionais adequadas são conhecidas na técnica edisponíveis de depositários públicos, tal como a AmericanType Culture Collection, Rockville, Maryland.

Nos métodos de produção da presente invenção, ascélulas são cultivadas em um meio nutriente adequado para aprodução do polipeptídeo usando métodos conhecidos natécnica.Por exemplo, a célula pode ser cultivada através decultura em um frasco de agitação, fermentação em pequenaescala ou larga escala (incluindo fermentações contínua, embatelada, alimentada-em batelada ou em estado sólido) emfermentadores de laboratório ou industriais realizada em ummeio adequado e sob condições que permitam que opolipeptídeo seja expresso e/ou isolado. A cultura ocorreem um meio nutriente adequado compreendendo fontes decarbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usandoprocedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estãodisponíveis de fornecedores comerciais ou podem serpreparados de acordo com composições publicadas (porexemplo, em catálogos da American Type Culture Collection).Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, opolipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se opolipeptídeo não é secretado, ele pode ser recuperado delisatos de células.

0 polipeptídeo resultante pode ser recuperado atravésde métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, opolipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente atravésde procedimentos convencionais incluindo, mas não limitadoa, centrifugação, filtração, extração, Iiofilização,evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos podem ser purificados através de umavariedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo,mas não limitado a, cromatografia (por exemplo, troca deíons, afinidade, hidrofóbica, cromotofocalização e exclusãode tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo,focalização isoelétrica preparativa), solubilidadediferencial (por exemplo, precipitação com sulfato deamônio), SDS-PAGE ou extração (veja, por exemplo, ProteinPurification, J.-C. Janson e Lars Ryden editores, VCHPublishers, New York, 1989). Métodos específicos parapurificação de polipeptídeo exibindo atividade de G-CSF sãodescritos por D. Metcalf e N. A. Nicola em The hemopoieticcolony-stimulating factors, páginas 50-51, CambridgeUniversity Press (1995), por C. S. Bae e colaboradores,Appl. Microbiol. Biotechnol, 52: 33 8-344 (1999) e na US4.810.643.

PEGuilação

Os polipeptideos de G-CSF purificados podem, então,ser PEGuilados através de uma variedade de métodosconhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo,um polipeptídeo de G-CSF pode ser submetido à PEGuilaçãocom um polietileno glicol (PEG) ativado amina-específico.

O PEG ativado amina-específico pode ser qualquer umdaqueles mencionados acima, por exemplo, mPEG-propionato desuccinimidila (mPEG-SPA), mPEG-butanoato de succinimidila(mPEG-SBA) ou mPEG-a-metilbutanoato de succinimidila (PEG-SMB) . 0 peso molecular das porções de PEG pode serselecionado baseado, por exemplo, no número de porções dePEG a ser preso ao polipeptídeo e, freqüentemente, estarána faixa de cerca de 1 kDa a cerca de 20 kDa, tal como decerca de 1 kDa a cerca de 12 kDa, por exemplo, de cerca de2 kDa a cerca de 10 kDa, tal como de cerca de 4 kDa a cercade 6 kDa, por exemplo, cerca de 5 kDa. Por exemplo, o PEGativado pode ser mPEG-SPA com um peso molecular de cerca de5 kDa. PEGuilação pode ser realizada, por exemplo, em um pHde cerca de 7,5-9,0, por exemplo, cerca de 8,0-8,5. Quandousado sobre porções de PEG aqui, a palavra "cerca de"indica um peso molecular médio aproximado e reflete o fatode que normalmente haverá uma determinada distribuição depeso molecular em um determinado preparado polimérico. Parainformação geral adicional a respeito de métodos dePEGuilação veja, por exemplo, os Catálogos 2004 e 2005-2006da Nektar Advanced, bem como as referência citadas nomesmo. Uma descrição mais detalhada de métodos dePEGuilação para polipeptideos de G-CSF também éproporcionada no WO 03/006501.

Des-PEGuilação parcial

A escolha de um pH elevado para a etapa de des-PEGuilação é feita baseado em fatores tais como atemperatura na qual a etapa de des-PEGuilação ocorre, aduração da etapa de des-PEGuilação e as condições que foramusadas para PEGuilação, incluindo o pH no qual PEGuilaçãofoi realizada. Geralmente, quanto maior o pH usado durantea des-PEGuilação, mais rápida a des-PEGuilação ocorre.

Aqueles habilitados na técnica, assim, reconhecerão quecondições de des-PEGuilação, tais como pH, tempo etemperatura, podem ser ajustadas umas às outras para obtero resultado desejado em qualquer determinada situação. Porexemplo, embora seja possível usar um pH elevadorelativamente baixo de, por exemplo, entre 8 e 9, uso de umpH maior, por exemplo, de entre 9 e 11, tal como entre 9 e10, resultará em uma des-PEGuilação mais rápida.

Tipicamente, o pH elevado, portanto, estará na faixa decerca de 8,5 a cerca de 11,0 por exemplo, de cerca de 8,5 acerca de 10,5, tal como de cerca de 9,0 a cerca de 10,0. OpH elevado pode, por exemplo, estar em uma faixa de cercade 9,2 a cerca de 9,8, por exemplo, cerca de 9,5.Normalmente, a etapa de des-PEGuilação ocorreráimediatamente após PEGuilação, uma vez que isso normalmenteserá mais eficaz e resultará em tempos de processamentomais curtos e maiores rendimentos. Em sua versão básica, ainvenção é, assim, caracterizada por des-PEGuilação parcialde um intermediário denso PEGuilado, seguido por separaçãoconvencional usando, por exemplo, purificaçãocromatográfica, conforme descrito abaixo. Se desejado porqualquer razão, contudo, o procedimento de PEGuilação podeser seguido por uma etapa de purificação intermediáriaantes de des-PEGuilação. A etapa de purificaçãointermediária pode, por exemplo, compreender purificaçãocromatográfica conforme descrito abaixo, seguido porultrafiltração e/ou diafiltração. O produto intermediárioobtido a partir de qualquer procedimento de purificaçãointermediário pode, se desejado, ser armazenado antes dedes-PEGuilação e quaisquer etapas subseqüentes depurificação. Nesse caso, o produto PEGuilado intermediáriopode, por exemplo, ser armazenado através de congelamentoou liofilização usando métodos geralmente conhecidos natécnica.

A des-PEGuilação pode ser realizada em qualquertemperatura a qual, de outro modo, é adequada para opolipeptídeo em questão, por exemplo, de cerca de 50C acerca de 40°C, tal como de cerca de IO0C a cerca de 35°C. Ades-PEGuilação, freqüentemente, será realizada em umatemperatura de cerca de 150C a cerca de 25°C, por exemplo,em uma temperatura ambiente de cerca de 20-22°C.

Conforme explicado acima, a duração da etapa de des-PEGuilação em um pH elevado para obter um resultadodesejado dependerá de outros fatores, tais como o pH etemperatura, mas geralmente estará na faixa de cerca de 2horas a cerca de 100 horas, tipicamente de cerca de 4 horasa cerca de 72 horas, mais tipicamente de cerca de 8 horas acerca de 48 horas. Uma vez que normalmente é desejávelrealizar a etapa de des-PEGuilação em um tempo tão curtoquanto possível, o polipeptídeo freqüentemente serásubmetido ao pH elevado durante um período de não mais doque cerca de 24 horas, por exemplo, dentro de cerca de 12horas a cerca de 3 0 horas, tal como de cerca de 18 a cercade 24 horas. Conforme indicado acima, um período de des-PEGuilação relativamente curto no pH elevado geralmenteserá acompanhado por um pH relativamente alto, por exemplo,cerca de 9-10.

Após a des-PEGuilação em um pH elevado, o pH éreduzido para cerca de 8,0 ou menos, o pH em particularsendo escolhido de acordo com as condições de armazenamentopretendidas para o polipeptídeo. Para G-CSF, um pH adequadopara armazenamento a longo prazo freqüentemente estará nafaixa de cerca de 2,0 a cerca de 5,0, por exemplo, de cercade 2,5 a cerca de 4,5, tal como cerca de 4,0. Em algunscasos, dependendo, por exemplo, da formulação usada emparticular, um pH um pouco maior pode ser escolhido, istoé, um pH de cerca de 5,0-8,0, por exemplo, cerca de 6,0-7,5, tal como cerca de 7,0-7,5. Várias formulaçõesfarmacêuticas de G-CSF são descritas, por exemplo, na US5.104.651. US 5.919.757. US 6.497.869 e US 6.776.983.

Para ajuste do pH no contexto da presente invenção,qualquer ácido ou base adequada pode ser usado, ácidos ebases orgânicas e inorgânicas. Similarmente, qualquertampão adequado pode ser usado para manutenção do pH em umnível desejado. Aqueles habilitados na técnica estarãofamiliarizados com ácidos, bases e tampões adequados parauso em qualquer determinada situação dependendo, porexemplo, do polipeptídeo em questão e do pH desejado.

Subseqüente à redução do pH, o polipeptídeo geralmenteserá submetido a pelo menos uma etapa de purificaçãocromatográfica, por exemplo, cromatografia de troca de íonsou cromatograf ia de filtração em gel, de forma a separarpolipeptídeos tendo um número desejado de grupos de PEGpresos. A purificação cromatográfica pode ser realizadausando métodos geralmente conhecidos na técnica. Porexemplo, onde o pH reduzido após des-PEGuilação está abaixode cerca de 7,0, cromatograf ia de troca de cátions pode serusada. Alternativa ou adicionalmente, cromatografia podeser realizada antes de redução do pH, usando cromatografiade troca de ânions no valor de pH elevado. Purificaçãoadicional, bem como qualquer análise desejada do produto,podem ser similarmente realizadas usando métodos padrõesconhecidos na técnica. Por exemplo, purificação adicionalsubseqüente à etapa de purificação cromatográfica pode serrealizada usando, por exemplo, ultrafiltração oudiafiltração.

Conforme mencionado acima, outro aspecto da invençãose refere a um método para produção de um polipeptídeo deG-CSF PEGuilado compreendendo sujeição de um polipeptídeode G-CSF à PEGuilação com um polietileno glicol (PEG)ativado amina-específico e, subseqüentemente, sujeição dopolipeptídeo PEGuilado a um pH elevado de pelo menos cercade 9,0 durante um período de tempo adequado para remover asporções de PEG presas a um grupo hidroxila. Esse métodoresulta em um polipeptídeo de G-CSF PEGuilado tendo pelomenos uma porção de PEG presa ao grupo epsilon amino de umresíduo de lisina ou ao grupo amino N-terminal esubseqüentemente nenhuma porção de PEG presa a um grupohidroxila. Em uma modalidade, esse aspecto da invenção érealizado usando uma PEGuilação em um pH de cerca de 7,0-9,0, após o que o pH é aumentado para remover as porções dePEG lábeis. Em outra modalidade, PEGuilação pode serrealizada em um pH maior de acima de 9,0, tal como um pH nafaixa de 9-11, tal como de cerca de 9,2 a 10,0, porexemplo, cerca de 9,5. Nesse caso, PEGuilação e des-PEGuilação podem ser realizadas como uma única etapa em umúnico valor de pH durante um período de tempo suficientepara resultar na PEGuilação desejada no N-terminal eresíduos de lisina enquanto se evita ligação indesejada deporções de PEG a grupos hidroxila.

0 PEG ativado amina-específico pode ser qualquer umdaqueles mencionados acima, por exemplo, mPEG-propionato desuccinimidila (mPEG-SPA), mPEG-butanoato de succinimidila(mPEG-SBA) ou mPEG-a-metilbutanoato de succinimidila (mPEG-SMB) . 0 peso molecular das porções de PEG será,similarmente, conforme descrito acima, por exemplo, nafaixa de cerca de 1 kDa a cerca de 20 kDa, tal como decerca de 1 kDa a cerca de 12 kDa, por exemplo, de cerca de2kDa a cerca de 10 kDa, tal como de cerca de 4 kDa a cercade 6 kDa, por exemplo, cerca de 5 kDa. Por exemplo, o PEGativado pode ser um mPEG-SPA com um peso molecular de cercade 5 kDa. PEGuilação pode, por exemplo, ser realizada em umpH de cerca de 7,5-9,0, por exemplo, cerca de 8,0-8,5.Dependendo do pH usado durante PEGuilação, o pH elevadoescolhido também será similar às faixas geralmentedescritas acima, por exemplo, na faixa de cerca de 9,2 a11,0, tal como de cerca de 9,2 a 10,0. Similarmente, operíodo de tempo no pH elevado também pode ser escolhidoconforme descrito acima e o mesmo se aplica à subseqüentepurificação, etc.

O método descrito aqui proporciona uma série devantagens com relação a processos de produção objetivados àprodução de uma proteína PEGuilada uniforme e estável,incluindo o fato de que é simples e rápido, necessitandoapenas de uma única etapa extra de pH alterado por umperíodo de tempo limitado, e não há necessidade de, deoutro modo, alterar os procedimentos de PEGuilação oupurificação usados em um determinado processo de produção.Por essa razão, o mesmo procedimento geral de um pHalterado durante um período de tempo suficiente pararemover grupos de PEG lábeis pode ser usado para a produçãode qualquer proteína PEGuilada. Em geral, um pH ácido oubásico pode ser usado para remover porções de PEG lábeispresas a um grupo hidroxila, com o desprendimento dasporções de PEG lábeis ocorrendo mais rápido quando o pH émais ácido (para um pH ácido) ou mais básico (para um pHbásico). A escolha das condições para obtenção dedesprendimento de PEG lábil será feita com base, porexemplo, nas características estruturais da proteína emparticular, incluindo o microambiente de sítios de fixaçãopara as porções de PEG.

Polipeptideos de G-CSF PEGuilados

Conforme indicado acima, o método da presente invençãoé vantajoso pelo fato de que ele resulta em umahomogeneidade aumentada do polipeptídeo PEGuilado em termosdo número de diferentes isômeros de PEG posicionais.Dependendo do número de grupos de fixação e da química dePEGuilação que está sendo usada em particular, os métodospermitem o isolamento de G-CSF PEGuilado que é maisuniforme e mais estável durante armazenamento do que seriade outro modo possível. Por exemplo, descobriu-se que, paraum polipeptídeo de G-CSF PEGuilado tendo as substituiçõesK16R, K34R, K40R, T105K e S159K com relação ao G-CSF humanodo tipo selvagem, é possível obter um produto em que pelomenos cerca de 90-95% dos isômeros de PEG posicionais dopolipeptídeo têm 3 porções de PEG presas.

Outra modalidade da invenção se refere a umacomposição compreendendo uma mistura homogênea de isômerosde PEG posicionais de uma variante de polipeptídeo de G-CSFPEGuiIada, em que pelo menos cerca de 80%, de preferênciapelo menos cerca de 85%, mais preferivelmente pelo menoscerca de 90%, por exemplo, pelo menos cerca de 95%, dosisômeros de PEG posicionais da mistura consistem de doisisômeros de PEG posicionais tendo, cada um porções de PEGconsistindo de duas porções de PEG ligadas a grupos epsilonamino de resíduos de lisina e uma porção de PEG ligada aogrupo amino N-terminal.

Outra modalidade da invenção, assim, se refere a umpolipeptídeo de G-CSF PEGuilado compreendendo assubstituições K16R, K34R, K40R, T105K e S159K com relaçãoao G-CSF humano do tipo selvagem, em que pelo menos cercade 80% dos isômeros de PEG posicionais da polipeptídeo têm3 porções de PEG presas. Tipicamente, a proporção dosisômeros de PEG posicionais tendo 3 porções de PEG presasserá maior do que 8 0%, tal como pelo menos cerca de 85% oupelo menos cerca de 90% e pode mesmo ser maior, tal comopelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelomenos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94% ou pelo menoscerca de 95%. Em ainda outra modalidade, a invenção serefere a um polipeptídeo de G-CSF PEGuilado contendo apenasas substituições K16R, K34R, K40R, T105K e S159K comrelação ao G-CSF humano do tipo selvagem, em que pelo menoscerca de 80% dos isômeros de PEG posicionais dapolipeptídeo têm 3 porções de PEG presas. Tipicamente, aproporção dos isômeros de PEG posicionais tendo 3 porçõesde PEG presas será maior do que 80%, tal como pelo menoscerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% e pode mesmo sermaior, tal como pelo menos cerca de 91%, pelo menos cercade 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94% oupelo menos cerca de 95%.

Em ainda uma outra modalidade, a invenção se refere auma composição compreendendo uma mistura de polipeptídeosde G-CSF PEGuilados compreendendo as substituições K16R,K34R, K4 0R, T105K e S159K com relação ao G-CSF humano dotipo selvagem, em que pelo menos cerca de 8 0%, depreferência pelo menos cerca de 85%, mais preferivelmentepelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95%dos polipeptídeos de G-CSF PEGuilados na mistura sãocompostos de dois isômeros de PEG posicionais, cada umcontendo três grupos de PEG, em que um dos isômeros temgrupos de PEG presos ao N-terminal, Lys23 e Lysl59, e ooutro isômero tem grupos de PEG presos no N-terminal,Lysl05 e Lysl59. Em ainda outra modalidade, a invenção serefere a uma composição compreendendo uma mistura depolipeptídeos de G-CSF PEGuilados contendo apenas assubstituições K16R, K34R, K40R, T105K e S159K com relaçãoao G-CSF humano do tipo selvagem, em que pelo menos cercade 80%, de preferência, pelo menos cerca de 85%, maispreferivelmente cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de95% dos polipeptídeos de G-CSF PEGuilados na mistura sãocompostos de dois isômeros de PEG posicionais, cada umcontendo três grupos de PEG, em que um dos isômeros temgrupos de PEG presos ao N-terminal, Lys23 e Lysl59, e ooutro isômero tem grupos de PEG presos no N-terminal,Lysl05 e Lysl5 9.

Descobriu-se que os polipeptídeos de G-CSF PEGuiladosproduzidos de acordo com a invenção são altamente estáveisao armazenamento com relação a seu grau de PEGuilação.Conforme é mostrado nos exemplos abaixo, formulaçõesaquosas de tais polipeptídeos de G-CSF PEGuilados sãocapazes de ser armazenadas durante um período de tempoprolongado com um padrão de PEGuilação grandementeinalterado. Esse foi, em particular, o caso quando ascomposições foram armazenadas em uma temperatura de 5°Cmas, surpreendentemente, descobriu-se que as composiçõeseram relativamente estáveis mesmo quando armazenadas em umatemperatura elevada de 25°C ou 35°C.

Um outro aspecto da invenção, portanto, se refere a umpolipeptídeo de G-CSF PEGuilado estável ao armazenamentocompreendendo as substituições K16R, K34R, K4 0R, T105K eS159K com relação ao G-CSF humano do tipo selvagem, em quepelo menos cerca de 8 0% dos isômeros de PEG posicionais dopolipeptídeo têm 3 porções de PEG presas após armazenamentoem uma composição de referência aquosa durante 3 meses emuma temperatura de 5 °C. Tipicamente, a proporção dosisômeros de PEG posicionais tendo 3 porções de PEG presasapós armazenamento durante 3 meses em uma temperatura de50C será maior do que 80%, tal como pelo menos cerca de 85%ou pelo menos cerca de 90%. Em alguns casos, essa proporçãopode mesmo ser maior, tal- como pelo menos cerca de 91%,pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelomenos cerca de 94% ou pelo menos cerca de 95%. Para fins dedeterminação da estabilidade de um polipeptídeo de G-CSFPEGuilado produzido de acordo com a invenção, aestabilidade pode ser testada conforme descrito no Exemplo4, por exemplo, usando uma das formulações A, B, C ou Ddescritas no mesmo como a composição de referência, emparticular a formulação D.Composições farmacêuticas

Outro aspecto da invenção se refere à composiçõesfarmacêuticas compreendendo um polipeptídeo de G-CSFPEGuilado de acordo com a invenção. Uma modalidades dainvenção, assim, se refere a uma composição compreendendoum veículo farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo deG-CSF PEGuilado, em que o polipeptídeo compreende assubstituições K16R, K34R, K40R, T105K e S159K com relaçãoao G-CSF humano do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) e em quepelo menos cerca de 8 0% dos isômeros de PEG posicionais dopolipeptídeo têm 3 porções de PEG presas. Tipicamente, aproporção dos isômeros de PEG posicionais tendo 3 porçõesde PEG presas será de pelo menos 85%, de preferência pelomenos cerca de 90% e pode mesmo ser maior, tal como pelomenos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menoscerca de 93%, pelo menos cerca de 94% ou pelo menos cercade 95%. Em ainda outra modalidade, a invenção se refere auma composição farmacêutica compreendendo um veiculofarmaceuticamente aceitável e um polipeptideo de G-CSFPEGuilado, em que o polipeptideo contém apenas assubstituições K16R, K34R, K40R, T105K e S159K com relaçãoao G-CSF humano do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) e em quepelo menos cerca de 8 0% dos isômeros de PEG posicionais dopolipeptideo têm 3 porções de PEG presas. Tipicamente, aproporção dos isômeros de PEG posicionais tendo 3 porçõesde PEG presas será de pelo menos cerca de 85%, depreferência pelo menos cerca de 90% e pode mesmo ser maior,tal como pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%,pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94% ou pelomenos cerca de 95%.

Outra modalidade da invenção se refere a umacomposição farmacêutica compreendendo uma mistura homogêneade isômeros de PEG posicionais de uma variante depolipeptideo de G-CSF PEGuilada, em que pelo menos cerca de80%, de preferência, pelo menos cerca de 85%, maispreferivelmente cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de95% dos polipeptideos de G-CSF PEGuilados na mistura sãocompostos de dois isômeros de PEG posicionais, cada umcontendo porções de PEG consistindo de duas porções de PEGligada a grupos epsilon amino de resíduos de lisina e umaporção de PEG ligada ao grupo amino N-terminal.

Em ainda outra modalidade, a invenção se refere àcomposições farmacêuticas compreendendo um veículofarmaceuticamente aceitável e uma mistura de polipeptideosde G-CSF PEGuilados compreendendo as substituições K16R,K34R, K40R, Τ105Κ e S159K com relação ao G-CSF humano dotipo selvagem, em que pelo menos cerca de 80%, depreferência, pelo menos cerca de 85%, mais preferivelmentecerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95% dospolipeptídeos de G-CSF PEGuilados na mistura são compostosde dois isômeros de PEG posicionais, cada um contendo trêsgrupos de PEG, em que um dos isômeros tem grupos de PEGpresos ao N-terminal, Lys23 e Lysl59, e o outro isômero temgrupos de PEG presos no N-terminal, Lysl05 e Lysl59. Emainda outra modalidade, a invenção se refere à composiçõesfarmacêuticas compreendendo um veículo farmaceuticamenteaceitável e uma mistura de polipeptídeos de G-CSFPEGuilados contendo apenas as substituições K16R, K34R,K40R, T105K e S159K com relação ao G-CSF humano do tiposelvagem, em que pelo menos cerca de 80%, de preferência,pelo menos cerca de 85%, mais preferivelmente cerca de 90%,tal como pelo menos cerca de 95% dos polipeptídeos de G-CSFPEGuilados na mistura são compostos de dois isômeros de PEGposicionais, cada um contendo três grupos de PEG, em que umdos isômeros tem grupos de PEG presos ao N-terminal, Lys23e Lysl59, e o outro isômero tem grupos de PEG presos no N-terminal, Lysl05 e Lysl59.

Composições farmacêuticas compreendendo o polipeptídeode G-CSF da invenção podem ser formuladas de várias formas,por exemplo, na forma liofilizada ou, de preferência, emuma formulação líquida estável, tipicamente como umaformulação aquosa. Tais composições compreendem,tipicamente, um ou mais componentes selecionados de agentesde tamponamento, conservantes, isotonificantes,estabilizantes, tensoativos ou detergentes não-iônicos eexcipientes diversos adicionais, tais como agentes decomposição de volume ou enchedores, agentes de quelação,antioxidantes e co-solventes. Um exemplo de uma formulaçãoadequada para G-CSF é aquela usada para Neulasta®(pegfilgrastim), a qual é fornecida em uma solução aquosacom um pH de 4,0 contendo, por 0,6 ml, 0,35 mg de acetato,30,0 mg de sorbitol, 0,02 mg de polisorbato 20 e 0,02 mg desódio.

Um exemplo de uma composição farmacêutica é umasolução projetada para administração parenteral. Embora emmuitos casos formulações em solução farmacêutica sejamproporcionadas na forma líquida apropriadas para usoimediato, tais formulações parenterais também podem serfornecidas em uma forma congelada ou liofilizada. Noprimeiro caso, a composição deve ser descongelada antes deuso. A última forma é, freqüentemente, usada paraintensificar a estabilidade do composto ativo contido nacomposição sob uma variedade maior de condições dearmazenamento, uma vez que é reconhecido por aqueleshabilitados na técnica que preparados liofilizados são, emgeral, mais estáveis do que suas contra-partes líquidas.Tais preparados liofilizados são reconstituídos antes deuso através da adição de um ou mais diluentesfarmaceuticamente aceitáveis adequados, tais como águaestéril para injeção ou solução salina fisiológica estéril.Entretanto, as composições da invenção estão, depreferência, na forma de uma solução aquosa.

No caso de parenterais, eles são preparados paraarmazenamento como formulações liofilizadas ou soluçõesaquosas através de mistura, conforme apropriado, dopolipeptídeo tendo o grau desejado de pureza com um ou maisveículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamenteaceitáveis tipicamente empregados na técnica (todos osquais podem ser denominados "excipientes"), por exemplo,agentes de tamponamento, agentes de estabilização,conservantes, isotonificantes, detergentes não-iônicos,antioxidantes e/ou outros aditivos diversos.

Agentes de tamponamento ajudam a manter o pH em umafaixa desejada. Eles estão, tipicamente, presentes em umaconcentração oscilando de cerca de 2 mM a cerca de 50 mM.Agentes de tamponamento adequados incluem ácidos orgânicose inorgânicos e sais dos mesmos, tais como tampões decitrato (por exemplo, mistura de citrato monossódico-citrato dissõdico, mistura de ácido cítrico-citratotrissódico, mistura de ácido cítrico-citrato monossódico,etc.), tampões de succinato (mistura de ácido succínico-succinato monossódico, mistura de ácido succínico-hidróxidode sódio, mistura de ácido succínico-succinato dissódico,etc.), tampões de tartrato (por exemplo, mistura de ácidotartárico-tartrato de sódio, mistura de ácido tartárico-tartrato de potássio, mistura de ácido tartárico-hidróxidode sódio, etc.), tampões de fumarato (por exemplo, misturade ácido fumárico-fumarato monossódico, mistura de ácidofumárico-fumarato dissódico, mistura de fumaratomonossódico-fumarato dissódico, etc.), tampões de gluconato(por exemplo, mistura de ácido glucônico-gliconato desódio, mistura de ácido glucônico-hidróxido de sódio,mistura de ácido glucônico-gluconato de potássio, etc.),tampões de oxalato (por exemplo, mistura de ácido oxálico-oxalato de sódio, mistura de ácido oxálico-hidróxido desódio, mistura de ácido oxálico-oxalato de potássio, etc.),tampões de lactato (por exemplo, mistura de ácido láctico-lactato de sódio, mistura de ácido láctico-hidróxido desódio, mistura de ácido láctico-lactato de potássio, etc.)e tampões de acetato (por exemplo, mistura de ácidoacético-acetato de sódio, mistura de ácido acético-hidróxido de sódio, etc.). Possibilidades adicionais sãotampões de fosfato, tampões de histidina e sais detrimetilamina, tal como Tris.

Conservantes são adicionados para retardar ocrescimento microbiano e, quando presentes, são,tipicamente, adicionados em quantidades de cerca de 0,2%-l%(peso/v). Conservantes adicionados incluem fenol, álcoolbenzílico, meta-cresol, metil parabeno, propil parabeno,cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, haletos debenzalcônio (por exemplo, cloreto, brometo ou iodeto debenzalcônio), cloreto de hexametônio, alquil parabenos,tais como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol,ciclohexanol e 3-pentanol.

Isotonificantes são adicionados para assegurarisotonicidade de composições líquidas e incluem álcooispoliídricos de açúcar, de preferência álcoois de açúcartriídricos ou superiores, tais como glicerina, eritritol,arabitol, xilitol, sorbitol e manitol. Álcoois poliídricospodem estar presentes em uma quantidade entre 0,1% e 25% empeso, tipicamente 1% a 5%, levando-se em conta asquantidades relativas dos outros ingredientes.

Estabilizantes se refere a uma ampla categoria deexcipientes os quais podem oscilar, quanto à função, de umagente de composição de volume a um aditivo, o qualsolubiliza o agente terapêutico ou ajuda a prevenirdesnaturação ou aderência à parede do recipiente.Estabilizantes típicos podem ser álcoois de açúcarpoliídricos (enumerados acima); aminoácidos, tais comoarginina, Iisinaf glicina, glutamina, asparagina,histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina,ácido glutâmico, treonina, etc., açúcares orgânicos ouálcoois de anticorpo, tais como lactose, trealose,estaquiose, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol,mioinositol, galactitol, glicerol e semelhantes, incluindociclitóis, tal como inositol; polietileno glicol; polímerosde aminoácido; agentes de redução contendo enxofre, taiscomo uréia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato desódio, tioglicerol, α-monotioglicerol e tiossulfato desódio; polipeptídeos de baixo peso molecular (isto é, <10resíduos); proteínas, tais como albumina de soro humano,albumina de soro bovino, gelatina ou imunoglobulinas ;polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona;monossacarídeos, tais como xilose, manose, frutose eglicose,· dissacarídeos, tais como lactose, maltose esacarose; trissacarídeos, tal como rafinose epolissacarídeos, tal como dextrana. Estabilizantes podem,por exemplo, estar presentes na faixa de 0,1 a 10.000partes em peso baseado no peso da proteína ativa.

Tensoativos ou detergentes não-iônicos (tambémconhecidos como "agentes de umedecimento") podem estarpresentes para ajudar a solubilizar o agente terapêutico,bem como proteger o polipeptídeo terapêutico contraagregação agitação-induzida, o que também permite que aformulação seja exposta ã tensão de superfície decisalhamento sem causar desnaturação do polipeptídeo.Tensoativos não-iônicos exemplificativos incluempolisorbatos (20, 80, etc.), polioxâmeros (184, 188 etc.),polióis Pluronic®, polioxietileno sorbitan monoéteres(Tween®-20, Tween®-80, etc.).

Excipientes diversos adicionais que podem seradicionados incluem agentes de composição de volume ouenchedores (por exemplo, amido), agentes de quelação (porexemplo, EDTA), antioxidantes (por exemplo, ácidoascórbico, metionina, vitamina E) e co-solventes.

O ingrediente ativo também pode estar encerrado emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicasde coacervação ou através de polimerização interfacial, porexemplo, microcápsulas de hidróximetilcelulose, gelatina oupoli-(metilmetacrilato), em sistemas de distribuição defármaco coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas dealbumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ouem macroemulsões.

Formulações parenterais a serem usadas paraadministração in vivo devem ser estéreis. Isso éprontamente realizado através de métodos bem conhecidos natécnica, por exemplo, por meio de filtração através demembranas de filtração estéreis.

Métodos terapêuticos

Outro aspecto da invenção se refere a métodosterapêuticos e métodos para a fabricação de um medicamentousando o polipeptídeo de G-CSF PEGuilado da invenção.Leucopenia (um nível reduzido de células sangüíneasbrancas) e neutropenia (um nível reduzido de neutrófilos)são distúrbios que resultam em uma suscetibilidadeaumentada a vários tipos de infecções. Neutropenia pode sercrônica, por exemplo, em pacientes infectados com HIV, ouaguda, por exemplo, em pacientes com câncer sofrendoquimioterapia ou terapia de radiação. Para pacientes comneutropenia grave, por exemplo, como um resultado dequimioterapia, mesmo infecções relativamente pequenas podemser graves e neutropenia freqüentemente requererá umainterrupção no protocolo de quimioterapia. Os polipeptideosde G-CSF PEGuilados da invenção são particularmenteadequados para a prevenção ou tratamento de infecção empacientes com câncer sofrendo determinados tipos dequimioterapia, terapia de radiação e transplantes de medulaóssea, mobilização de células progenitoras para coleta emtransplantes de células progenitoras de sangue periférico,tratamento de leucopenia crônica grave ou relativa,tratamento de pacientes com leucemia mielóide aguda, emparticular, tratamento de AIDS ou outras doenças deimunodeficiência, e para terapia antifúngica, em particularpara o tratamento de candidíase sistêmica ou invasiva. Um"paciente", para as finalidades da presente invenção,inclui seres humanos e outros mamíferos, embora os métodosterapêuticos da invenção sejam primariamente objetivados aotratamento de pacientes humanos.

Esse aspecto da invenção, assim, se refere a um métodopara aumento do nível de neutrófilos em um pacientesofrendo de ou em risco de um nível insuficiente deneutrófilos compreendendo administração, ao referidopaciente, de uma dose eficaz de um polipeptídeo de G-CSFPEGuilado conforme descrito acima ou uma composiçãofarmacêutica conforme descrito acima compreendendo opolipeptídeo de G-CSF PEGuilado. Em uma modalidade desseaspecto da invenção, o paciente sofrendo de ou em risco deum nível insuficiente de neutrófilos é um paciente comcâncer, em particular um paciente com câncer sendo tratadocom quimioterapia ou terapia de radiação, especialmentequimioterapia.

Os polipeptídeos de G-CSF PEGuilados da invenção sãoconsiderados como sendo úteis para estimulação da produçãode neutrófilos em pacientes sofrendo de uma variedade dediferentes tipos de câncer, incluindo câncer de mama,câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de pulmãode células pequenas, câncer cólon-retal, câncer uterino,câncer ovariano, linfoma não-Hodgkin (NHL) e doença deHodgkin. Similarmente, os polipeptídeos da invenção sãoconsiderados para administração a pacientes recebendoqualquer um de uma variedade de diferentes tipos de agentesquimioterapêuticos, incluindo:

• Agentes de alquilação, por exemplo, derivados de gásde mostarda, tais como a Ciclofosfamida, Clorambucil,Ifosfamida, Mecloretamina ou Melphalan; etilenoiminas, taiscomo Hexametilmelamina ou Tiotepa; alquil-sulfonatos, talcomo Busulfan; hidrazinas e triazinas, tais comoAltretamina, Dacarbazina, Procarbazina ou Temozolomida;nitrosuréias, tais como Carmustina, Lomustina ouEstreptozocina; e agentes de complexo de metal inorgânico,tais como Cisplatina, Carboplatina ou Oxaliplatina;

• Alcalóides vegetais, por exemplo, taxanos (porexemplo, Docetaxel ou Paclitaxel), vinca alcalóides (porexemplo, Vinblastina, Vincristina ou Vinorelbina), análogosde camptotecan (por exemplo, Irinotecan ou Topotecan) epodofilotoxinas (por exemplo, Etoposídeo ou Tenoposídeo);

• Antibióticos anti-tumor, por exemplo, antraciclinas,tais como Daunorubicina, Doxorubicina, Epirubicina,Idarubicina ou Mitoxantrona; cromomicinas, tais comoDactinomicina ou Plicamicina; e outros antibióticos anti-tumor, tais como Bleomicina ou Mitomicina,·

• Anti-metabólitos, por exemplo, antagonistas de ácidofólico, tal como Metotrexato; antagonistas de pirimidina,tais como as Capecitabina, Citarabina, 5-Fluorouracila (5-FU) , Foxuridina ou Gemcitabina; antagonistas de purina,tais como 6-Mercaptopurina ou 6-Tioguanina; inibidores dedeaminase de adenosina, tais como Cladribina, Fludarabina,Nelarabina ou Pentostatina; e inibidores de reductase deribonucleotídeo, tal como Hidróxuréia;

• Inibidores de topoisomerase, por exemplo, inibidoresde topoisomerase I, tais como Ironotecan ou Topotecan; einibidores de topoisomerase II, tais como Amsacrine,Etoposídeo, Fosfato de Etoposideo ou Teniposideo.

Os polipeptídeos de G-CSF PEGuilados da invenção serãoadministrados a pacientes em uma dose "eficaz" ou" terapeuticamente eficaz", isto é, uma dose que ésuficiente para produzir os efeitos desejados com relação àcondição para a qual eles são administrados, em particularuma dose que, dadas as condições, é suficiente pararesultar na estimulação desejada de neutrófilos. A doseexata pode depender de fatores tais como o pacienteindividual e o distúrbio que está sendo tratado e serácapaz de ser determinada por aqueles habilitados natécnica, tipicamente por um médico. A dosagem dopolipeptídeo de G-CSF PEGuilado pode, por exemplo, seraproximadamente da mesma ordem de magnitude que a dosagematual recomendada para pegfilgrastim (Neulasta®) , a qual éde 6 mg por paciente adulto. Uma dose apropriada dopolipeptídeo de G-CSF PEGuilado da invenção é, portanto,considerada como estando na faixa de cerca de 1 mg a cercade 15 mg, tal como de cerca de 2 mg a cerca de 15 mg, porexemplo, de cerca de 3 mg a cerca de 12 mg. Uma doseapropriada pode, assim, ser, por exemplo, cerca de 3 mg,cerca de 6 mg ou cerca de 9 mg. Em cada caso, as dosagenssão expressas como uma dose padrão por paciente, onde opaciente é um adulto ou, de outro modo, pesa pelo menos 4 5kg. Alternativamente, a dosagem pode ser determinada deacordo com o peso do paciente, de modo que uma dose dopolipeptídeo de G-CSF da invenção esteja na faixa de cercade 10 pg/kg a cerca de 200 pg/kg, tal como de cerca de 25Pí?/kg a cerca de 150 pg/kg, por exemplo, de cerca de 30pg/kg a cerca de 120 pg/kg. Uma dose adequada pode ser,assim, por exemplo, cerca de 30 pg/kg, cerca de 60 pg/kg,cerca de 90 pg/kg ou cerca de 120 pg/kg.

A invenção é ainda descrita por meio dos exemplos nãolimitativos a seguir.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação e análise de uma variante de G-CSF parcialmentede s-PEGuilado

Preparo da amostra e des-PEGuilação

Uma variante de G-CSF tendo as substituições K16R,K34R, K40R, T105K e S159K comparado com G-CSF humano dotipo selvagem (SEQ ID NO: 1) foi produzida a partir decélulas CHO-Kl substancialmente conforme descrito no WO03/006501. 200 mL de variante de G-CSF a 4,5 mg/mL (900 mgde G-CSF) foram PEGuilados usando mPEG-SPA 5000 (NektarTherapeutics). Resumidamente, 100 mL de uma solução a 13,2%(peso/peso) de mPEG-SPA foram adicionados durante umperíodo de 10 minutos a 200 mL da solução de G-CSF egentilmente agitados para assegurar mistura suficiente. Aamostra foi deixada incubar durante 44 minutos a 21 ± 3 °C,pH de 8,5, com ligeira agitação. A mistura de amostra foisubseqüentemente ajustada para um pH de 9,5 usando umasolução de estoque de ácido bórico a 800 mM, pH de 10,0. Aamostra foi, então, incubada a 21 ± 3 0C durante 24 horassem agitação. A amostra foi, então, diluída aproximadamente2,5 vezes com ácido cítrico a 100 mmoles/kg, NaOH a 20mmoles/kg, pH de 2,5, para um pH final de 3,5.

Isolamento de G-CSF parcialmente des-PEGuilado

Após redução do pH para 3,5, a amostra foi carregadaimediatamente sobre uma coluna VL44 (Millipore)acondicionada com aproximadamente 225 mL de SP-Sepharose HP(Amersham, GE Healthcare) equilibrada com ácido cítrico a20 mmoles/kg, NaOH a 15 mmoles/kg, pH de 3,4. Apóscarregamento do material, a coluna foi lavada para removero material não ligado, tal como mPEG-ácido livre. Umgradiente linear de tampão de eluição a 25-100% (ácidocítrico a 20 mmoles/kg, NaOH a 20 mmoles/kg, NaCl a 200mmoles/kg, pH de 3,5) foi usado para eluir o G-CSFPEGuilado da coluna. O gradiente foi desenvolvido para 2 5CV (volumes de coluna). A etapa na coluna foi realizada a21 ± 3 0C e todos os tampões usados foram ajustados para amesma temperatura. A carga na coluna era de 4,1 mg deproteína/ml de resina e a taxa de fluxo era de 8 CV/hora.Frações tendo um tamanho de amostra de 4 0 mL foramcoletadas analisadas através de SDS-PAGE. Baseado naanálise de SDS-PAGE, um reservatório de produto de 144 0 mL,correspondendo a cerca de 6,5 CV, contendo G-CSF isoladotendo primariamente 3 grupos de PEG presos por molécula deG-CSF foi feito. Considera-se que o volume do reservatóriode produto pode ser reduzido através de aumento das etapasdo gradiente de eluição.

O reservatório de produto foi diafiltrado paraaproximadamente 200 mL e substancialmente diafiltrado emacetato de sódio a 10 mM, 43 mg/mL, pH de 4,0 e concentradopara 4,9 mg/mL usando um sistema Millipore LabScale TFFequipado com duas membranas Millipore Pellicon XL de 50 cm2com um corte de peso molecular (MWCO) de 30 kDa.Resultados

O reservatório de produto foi ultrafiltrado ediafiltrado em Na-acetato a 10 mM, 43 mg/ml de manitol, pHde 4,0 e submetido à caracterização físico-quimica. AFigura 1 mostra uma exploração da análise de SDS-PAGE davariante de G-CSF que foi PEGuilada, parcialmente des-PEGuilada e purificada conforme descrito acima, as setefileiras mostradas sendo como segue:

1 Marcador de peso molecular

2 Após PEGuilação

3 pH de 9,5,T=Oh

4 pH de 9,5, T = 24 h

5 Quando de aplicação sobre coluna de troca de cátions

6 Escoamento da troca de cátions

7 Produto purificado

Uma única banda principal na fileira 7 foi observada,correspondendo à variante de G-CSF trazendo 3 grupos demPEG-SPA 5000 por molécula de polipeptídeo. Além disso, umabanda menor, correspondendo ao G-CSF trazendo 4 grupos demPEG-SPA 5000 também é observada na fileira 7. Se desejado,otimização ou ajuste do procedimento de purificação atravésde métodos geralmente conhecidos na técnica permitirá queessa banda menor correspondendo a 4 grupos PEG sejareduzida ou substancialmente eliminada, embora isso leve auma ligeira redução no rendimento, dependendo do grau depureza requerido.

0 rendimento desse procedimento foi de 45Omg de G-CSFparcialmente des-PEGuilado purificado trazendo

primariamente 3 grupos PEG por molécula de polipeptídeo,correspondendo a um rendimento global de 50%.

Exemplo 2

Preparo e análise de variante de G-CSF parcialmente des-PEGuilada

Preparo de amostra, des-PEGuilação e purificação

Uma variante de G-CSF tendo as substituições K16R,K34R, K40R, T105K e S159K comparado com o G-CSF do tiposelvagem (SEQ ID NO:l) foi produzida a partir de célulasCHO-Kl e subseqüentemente PEGuilada usando mPEG-SPA 5000substancialmente conforme descrito no Exemplo 1 acima,resultando em 29 mL de variante de G-CSF PEGuilada a 3,5mg/mL. Isto foi diafiltrado em borato de sódio 150 mM, pH9,5, usando um dispositivo de filtro Vivaspin equipado comum filtro MWCO de 10 kDa. A concentração da amostra finalfoi de 4,7 mg/mL. A amostra foi, então, incubada a 21 ± 3 0Cdurante 4 2 horas.

Após incubação, a amostra foi preparada paracromatografia de troca de cátions através de diluição comácido cítrico a 30 mM; NaOH a 10 mM, pH de 2,9. A amostrafoi, então, aplicada sobre uma coluna XK 16/20 (AmershamBiosciences) acondicionada com 28 mL de resina SP-SepharoseHP. A coluna foi equilibrada com um tampão de equilíbrio deácido cítrico a 20 mM, NaCl a 15 mM, pH de 3,5, antes decarregamento da amostra. Após carregamento, a coluna foilavada com o mesmo tampão e eluída usando um gradientelinear de NaCl a 15 mM a 200 mM em ácido cítrico a 20 mM,pH de 3,5, para separar as diferentes espécies de PEG.

Frações foram coletadas em tubos e analisadas atravésde análise por SDS-PAGE. Um reservatório de produtocontendo da variante de G-CSF PEGuilada contendoprimariamente 3 porções de PEG presas foi feito baseado noSDS-PAGE. Esse reservatório de produto foi diafiltrado e otampão trocado usando um dispositivo de filtro Vivaspin comum MWCO de 10 kDa. A amostra foi diafiltrada em succinatode sódio a 10 mM, 43 mg/mL, pH de 4,3 e finalmenteconcentrada para 3,0 mg/mL.

Análise de isômero posicionai

Usando HPLC de troca de cátions (CIEX-HPLC) combinadocom um pré-tratamento com sialidase, dados foram obtidossobre a composição de diferentes isômeros posicionais emreservatórios de produto contendo múltiplas espéciesPEGuiladas. Além de heterogeneidade apos PEGuilação emvirtude da presença de diferentes isômeros posicionais, G-CSF PEGuilado também é heterogêneo pelo fato de que elecontém um sitio de O-glicosilação (Thrl33) que pode terzero, um ou dois grupos ácido siálico presos. De forma areduzir o número de picos no cromatograma como um resultadode diferentes números de grupos ácido siálico, uma etapa detratamento com enzima sialidase é incluída antes deanálise. 0 tratamento com sialidase é realizado primeiroatravés de diluição da solução de G-CSF, se necessário,para 1 mg/ml com um tampão de acetato de sódio a 50 mM, pHde 5,0, após o que, 0,05 μΐ (0,25 mUnidades) de sialidasesão adicionados por μg de proteína e a amostra é incubada a370C durante 18 horas para remover os ácidos siálicos. Aamostra é, então, analisada no mesmo dia ou mantida a 4°Caté o dia de análise. HPLC foi realizada usando uma colunade HPLC de troca de cátions PolySULFOETHYL A™ (PolyLCInc.), com detecção por UV a 214 nm. Caracterização dosdiferentes picos foi realizada através de análise por SDS-PAGE após coleta manual da coluna de CIEX PolySULFOETHYLA™.

Resultados - Perda de PEG

A amostra permutada com tampão foi analisada atravésde SDS-PAGE para estimar o grau de perda de PEG como umafunção do tempo. Os resultados (veja Figura 2) eramsimilares àqueles ilustrados na Figura 1 para o Exemplo 1,com apenas alterações mínimas no grau global de PEGuilaçãosendo observadas entre as amostras incubadas durante 24 ou42 horas (Figura 2, fileiras 4 e 5).

Resultados - Avaliação de isômeros posicionais emreservatórios de produto

A Figura 3 mostra um cromatograma de troca de cátionsdo reservatório de produto parcialmente des-PEGuilado deacordo com a invenção obtido conforme descrito acimacontendo primariamente três grupos de PEG 5000, conformejulgado através de análise por SDS-PAGe. Os dois picosprincipais representam, cada um, um isômero posicionaiprincipal trazendo três grupos de PEG 5000. Os três picosmenores representam dois isômeros posicionais trazendoquatro grupos de PEG e um isômero posicionai trazendo doisgrupos de PEG.

Os dois picos principais foram coletados e submetidosà análise por mapeamento de peptídeo nativo para determinara posição dos grupos de PEG presos. Descobriu-se que osdois principais isômeros posicionais são PEGuilados nosseguintes resíduos de aminoãcido:

Isômero A: N-terminal, Lys23 e Lysl59

iIsômero B: N-terminal, Lysl05 e Lysl59

Esses dois isômeros principais representavam mais de95% dos isômeros posicionais presentes na amostra.

Exemplo 3

Exemplo Comparativo

Para fins comparativos, a Figura 4 mostra umcroraatograma de troca de cátions de uma variante de G-CSFPEGuilada purificada que não foi submetida à des-PEGuilaçãode acordo com a presente invenção. A variante de G-CSF,nesse caso, tinha as mesmas cinco substituições comparadocom o G-CSF humano nativo, conforme indicado acima nosExemplos 1 e 2, isto é, K16R, K34R, K40R, T105K e S159K.Ela foi preparada e PEGuilada com mPEG-SPA 5000substancialmente conforme descrito no Exemplo 1, excetoquanto ao fato de que ela não foi submetida à incubação emum pH de 9,5 para remoção das porções de PEG lábeis. Comoum resultado, a variante PEGuilada compreendia uma misturade uma série de diferentes isômeros de PEG tendo 2-6porções de PEG presas. Essa mistura de isômeros posicionaisfoi purificada usando cromatografia de troca de cátionssubstancialmente conforme descrito no Exemplo 1. Uma fraçãocontendo primariamente 4-5 porções de PEG presas foiisolada e, após ultrafiltração e diafiltraçãosubstancialmente conforme descrito no Exemplo Ii foisubmetida à análise por CIEX-HPLC conforme descrito acima.

Essa fração corresponde à fração de 3-PEG descrita nosExemplos 1 e 2, mas com grupos de PEG adicionais (lábeis)sendo presos em uma ou duas posições com relação ao produto3-PEG parcialmente des-PEGuilado, isto é, o produtopurificado nesse caso contém, primariamente, 4-5 grupos dePEG presos.

Comparado com o produto parcialmente des-PEGuiladopreparado de acordo com a invenção, cuja composição émostrada na Figura 3, o produto mostrado na Figura 4 éclaramente uma mistura muito mais complexa e heterogênea.Enquanto que o produto preparado de acordo com a invençãomostrado na Figura 3 contém mais de 95% dos dois principaisisômeros posicionais, cada um tendo 3 porções de PEG, oproduto mostrado na Figura 4 compreende seis isômerosposicionais principais, cada um 4 ou 5 porções de PEGpresas. Esses isômeros posicionais de 4-5 PEG compreendemporções de PEG lábeis em um ou ambos de of Ser66 ou Tyrl65(dados não mostrados), bem como porções de PEG estáveis noN-terminal e em 1 ou 2 posições K23, K105 e K159. Emvirtude de impedimento estérico, nem todas essas posiçõessobre um único polipeptídeo de G-CSF podem ser ocupadas porporções de G-CSF. O produto mostrado na Figura 4, assim,contém uma mistura heterogênea dos seis principais isômerosde PEG a seguir:N-terminal, K23, S66, K159, Y165 (5-PEG)

N-terminal, S66, K105, K159, Y165 (5-PEG)

N-terminal, K23, S66, K159 (4-PEG)

N-terminal, K23, S66, Y165 (4-PEG)

N-terminal, S66, K105, K159 (4-PEG)

N-terminal, S66, K105, Y165 (4-PEG)

Exemplo 4

Dados de estabilidade

A estabilidade das porções de PEG presas foi testadaem diferentes formulações aquosas armazenadas em quatrotemperaturas diferentes. 0 polipeptídeo era uma variante deG-CSF tendo as cinco substituições listadas no Exemplo 1 eo qual foi preparado, PEGuilado e submetido à des-PEGuilação parcial e, então, purificado também conformedescrito no Exemplo 1. As formulações testadas eram comosegue:

<table>table see original document page 49</column></row><table>

0 pH de cada uma das formulações era de 4,0.Usando CIEX-HPLC, a distribuição de isômeros de PEG emcada amostra foi determinada apos 26 dias, 56 dias e 89dias para investigar a estabilidade da PEGuilação. Osresultados são mostrados na tabela abaixo.

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table>diminuição ao longo do tempo, usando os dados a -800C comouma referência, na proporção das outras formas/nãocaracterizadas, principalmente para amostras armazenadas a25 °C ou 35 cC e um aumento correspondente na proporção deisômeros de 2 PEG para essas amostras.

Por comparação, a tabela abaixo mostra dadossimilares, determinados após 20 e 83 dias de armazenamento,para a mesma variante de G-CSF em uma formulação similaràquela descrita acima, mas preparada sem a etapa de des-PEGuilação da presente invenção, isto é, correspondendo aoproduto descrito no Exemplo comparativo 3 acima. Aformulação, nesse caso, tinha um pH de 4,0 e consistia deacetato de sódio a 15 mM, 4 5 mg/ml de manitol e 5 mg/ml deexperimento, continha primariamente (98-99%) porções de 4-5PEG presas. A tabela abaixo mostra a distribuição dasisoformas de PEG, conforme determinado após 83 dias nasquatro temperaturas indicadas, bem como após 20 dias emduas dessas temperaturas. Deve ser observado que aproporção dos polipeptideos de G-CSF contendo porções de 4-5 PEG diminui apenas ligeiramente após 83 dias quandoarmazenados a 5°C, enquanto que há uma perda substancial deisoformas de 4-5 PEG e um aumento correspondente nasisoformas de 3 PEG a 25 0C e uma perda ainda maior deisoformas 4-5 PEG e um aumento correspondente nas isoformas3 PEG a 35°C. Isso ilustra que, na ausência do método dedes-PEGuilação da presente invenção, um polipeptídeo de G-CSF PEGuilado preparado conforme descrito acima contémgrupos de PEG lábeis que, ao longo do tempo e dependendo datemperatura, se desprenderão do polipeptídeo quandoarmazenado em uma formulação aquosa.

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Embora a invenção precedente tenha sido descrita emalguns detalhes para fins de clareza e compreensão, seráclaro para aqueles habilitados na técnica, a partir de umaleitura da presente divulgação, que várias alterações naforma e detalhes podem ser feitas sem se desviar doverdadeiro escopo da invenção. Deve ser compreendido que osexemplos e modalidades descritos aqui são para finsilustrativos apenas e que várias modificações ou alteraçõesà luz dos mesmos serão sugeridos para aqueles habilitadosna técnica e deverão ser incluídos dentro do conceitoinventivo e visão do presente pedido e escopo dasreivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes,pedidos de patente e/ou outros documentos mencionados nopresente pedido são incorporados por referência aqui em suatotalidade para todas as finalidades até o mesmo ponto comose cada publicação, patente, pedido de patente e/ou outrodocumento individual fosse individualmente indicado comosendo incorporado aqui por referência em sua totalidadepara todas as finalidades.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

SEQ ID NO: G-CSF humano

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Lèu Lys1 5 10 15

Cys Leo Gla Qln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30

Glu Lys Leu Cys Ala Thr =Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35 40 45

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Prõ Leu Ser Ser Cys

50 SS 60

Pro Ser GIp Ma Iseu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His See65 70 75 80

GIy Leti Phe Leia. Tyr Gln Gly Lea Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85 90 95

Pro Glu Le-J Gly Pró Thr Leu Asp flir Le1O Gln heü Asp Val Ala Asp

100 1.05 210

Pbe Ala Tfcr Thr Ile Trp Gln Glra Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro115 120 125

Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro A,la Phe Ma Ser Ala Phe

130 13S 140

Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Lau Val Ala Ser His Leu GIn Ser Phe145 150 155 160

Lesi Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Als Gln Pro165 170

Claims (49)

1. Método para aumento da estabilidade e uniformidadede um polipeptídeo de G-CSF PEGuilado tendo pelo menos umaporção de PEG presa ao grupo epsilon amino de um resíduo delisina ou ao grupo amino N-terminal e pelo menos uma porçãode PEG presa a um grupo hidroxila caracterizado porcompreender a sujeição do polipeptídeo a um pH elevado deacima de 8,0 durante um período de tempo suficiente pararemover porções de PEG presas a um grupo hidroxila eredução do pH para cerca de 8,0 ou menos.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do pH elevado estar na faixa decerca de 8,5 a cerca de 10,5.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato do pH elevado estar na faixa decerca de 9,0 a cerca de 10,0.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato do pH elevado estar na faixa decerca de 9,2 a cerca de 9,8, por exemplo de 9,5.

5. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato dopolipeptídeo ser submetido ao pH elevado durante um períodode cerca de 2 horas a cerca de 100 horas.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato do polipeptídeo ser submetido ao pHelevado durante um período de cerca de 4 horas a cerca de 72 horas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato do polipeptídeo ser submetido ao pHelevado durante um período de cerca de 8 horas a cerca de-48 horas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato do polipeptídeo ser submetido ao pHelevado durante um período de cerca de 12 horas a cerca de 30 horas.

9. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelofato de ainda compreender sujeição do polipeptídeo em um pHreduzido a pelo menos uma etapa de purificaçãocromatográfica.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato da etapa de purificaçãocromatográfica ser cromatografia de troca de íons.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato do pH ser reduzido para abaixo de 7,0 e a etapa de purificação cromatográf ica sercromatografia de troca de cátions.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato da etapa de purificaçãocromatográfica ser cromatografia de filtração em gel.

13. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, ou 12,caracterizado pelo fato do pH reduzido estar na faixa decerca de 2,0 a cerca de 5,0.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato do pH reduzido estar na faixa decerca de 2,5 a cerca de 4,5.

15. Método para produção de polipeptídeo de G-CSFPEGuilado caracterizado pelo fato de compreender sujeiçãode um polipeptídeo de G-CSF a uma reação de PEGuilação comum polietileno glicol (PEG) ativado amina-específico paraproduzir um intermediário de polipeptídeo de G-CSFPEGuilado e, subseqüentemente, sujeição do intermediário depolipeptídeo PEGuilado a um pH elevado de pelo menos cercade 9,0 durante um período de tempo adequado para removerporções de PEG presas a um grupo hidroxila para produzir opolipeptídeo de G-CSF PEGuilado.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato da reação de PEGuilação serrealizada em um pH na faixa de cerca de 7,0-9,0.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato da reação de PEGuilação serrealizada em um pH acima de 9.0.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato da reação de PEGuilação esubseqüente remoção de porções de PEG presas a ura grupohidroxila serem realizadas como uma única etapa em um únicovalor de pH.

19. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato do PEG ativado amina-específico sermPEG-propionato de succinimidila (mPEG-SPA), mPEG-butanoatode succinimidila (mPEG-SBA) ou mPEG-a-metilbutanoato desuccinimidila (mPEG-SMB).

20. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato do PEG ativado amina-específico sermPEG-SPA com um peso molecular de cerca de 5 kDa.

21. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato do pH elevado estar na faixa decerca de 9,2 a 11,0.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato do pH elevado estar na faixa decerca de 9,2 a 10,0.

23. Polipeptídeo de G-CSF PEGuilado caracterizado pelofato de ser produzido através do método das reivindicações 1 a 22.

24. Polipeptídeo de G-CSF PEGuilado, de acordo com areivindicação 23, caracterizado pelo fato do polipeptídeoser uma variante de G-CSF compreendendo as substituiçõesK16R, K34R, K40R, T105K e S159K com relação ao G-CSF humanodo tipo selvagem.

25. Composição caracterizada por compreender umamistura de isômeros de PEG posicionais de um polipeptídeode G-CSF PEGuilado, em que o polipeptídeo compreende assubstituições K16R, K34R, K40R, T105K e S159K com relaçãoao G-CSF humano do tipo selvagem e pelo menos cerca de 8 0%dos isômeros de PEG posicionais do polipeptídeo seremisômeros de PEG posicionais de lisina/N-terminais tendotrês porções de PEG presas.

26. Composição, de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato de pelo menos cerca de 85% dosisômeros de PEG posicionais do polipeptídeo serem isômerosde PEG posicionais de lisina/N-terminais tendo três porçõesde PEG presas.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato de pelo menos cerca de 90% dosisômeros de PEG posicionais do polipeptídeo serem isômerosde PEG posicionais de lisina/N-terminais tendo três porçõesde PEG presas.

28. Composição, de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato de pelo menos cerca de 80% dosisômeros de PEG posicionais tendo três porções de PEGpresas serem compostos de dois isômeros de PEG posicionaisem que um dos isômeros tem porções de PEG presas ao N-terminal, Lys23 e Lysl59 e o outro isômero tem porções dePEG presas ao N-terminal, Lysl05 e Lysl59.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 26,caracterizada pelo fato de pelo menos cerca de 85% dosisômeros de PEG posicionais tendo três porções de PEGpresas serem compostos de dois isômeros de PEG posicionaisem que um dos isômeros tem porções de PEG presas ao N-terminal, Lys23 e Lysl59 e o outro isômero tem porções dePEG presas ao N-terminal, Lysl05 e Lysl59.

30. Composição, de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de pelo menos cerca de 90% dosisômeros de PEG posicionais tendo três porções de PEGpresas serem compostos de dois isômeros de PEG posicionaisem que um dos isômeros tem porções de PEG presas ao N-terminal, Lys23 e Lysl59 e o outro isômero tem porções dePEG presas ao N-terminal, Lysl05 e Lysl59.

31. Composição caracterizada por compreender umamistura de isômeros de PEG posicionais de um polipeptídeode G-CSF PEGuilado, em que o polipeptídeo compreende assubstituições K16R, K34R, K40R, T105K e S159K com relaçãoao G-CSF humano do tipo selvagem e pelo menos cerca de 80%dos isômeros de PEG posicionais do polipeptídeo seremisômeros de PEG posicionais de lisina/N-terminais tendo 3porções de PEG presas após armazenamento em uma composiçãode referencia aquosa durante 3 meses em uma temperatura de 5 ° C.

32. Composição caracterizada pelo fato de compreenderum veículo farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo deG-CSF PEGuilado da reivindicação 23 ou 24 ou uma composiçãodas reivindicações 25 a 31.

33. Método de produção de uma mistura de isômeros dePEG posicionais de lisina/N-terminais de um polipeptídeo deG-CSF recombinante compreendendo as substituições Kl 6R,K34R, K40R, T105K e S159K com relação ao G-CSF do tiposelvagem caracterizado pelo fato de compreender:a) expressão do polipeptídeo de G-CSF recombinante emuma célula hospedeira;b) isolamento do polipeptídeo de G-CSF recombinante;c) reação do polipeptídeo de G-CSF recombinanteisolado com um PEG ativado amina-específico para produziruma pluralidade de isômeros de PEG posicionais dopolipeptídeo de G-CSF recombinante; ed) reação da pluralidade de isômeros de PEGposicionais em um pH de 8,5 a 10,5 para produzir umapluralidade de isômeros de PEG posicionais de lisina/N-terminais parcialmente des-PEGuilados do polipeptídeo de G-CSF recombinante.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33,caracterizado pelo fato do PEG ativado amina-específ ico serselecionado do grupo consistindo de mPEG-propionato desuccinimidila (mPEG-SPA), mPEG-butanoato de succinimidila(mPEG-SBA ou mPEG-a-metilbutanoato de succinimidila (mPEG-SMB).

35. Método, de acordo com a reivindicação 33 ou 34,caracterizado pelo fato de ainda compreender sujeição dapluralidade de isômeros de PEG posicionais de lisina/N-terminais do polipeptídeo de G-CSF recombinante a uma oumais etapas de purificação cromatográfica par produzir umamistura substancialmente purificada de isômeros de PEG delisina/N-terminais do polipeptídeo de G-CSF.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de ainda compreender combinação deuma dose eficaz da mistura substancialmente purificada deisômeros de PEG posicionais de lisina/N-terminais dopolipeptídeo de G-CSF recombinante com pelo menos umexcipiente farmaceuticamente aceitável para produzir umacomposição farmacêutica.

37. Pluralidade de isômeros de PEG posicionais delisina/N-terminais parcialmente des-PEGuiladoscaracterizada pelo fato de ser produzida através do métododa reivindicação 33.

38. Mistura substancialmente purificada de isômeros dePEG posicionais de lisina/N-terminais caracterizada pelofato de ser produzida através do método de acordo com areivindicação 35.

39. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato deser produzida através do método da reivindicação 36.

40. Método para aumento do nível de neutrófilos em umpaciente sofrendo de ou em risco de um nível insuficientede neutrófilos caracterizado pelo fato de compreenderadministração, ao referido paciente, de uma dose eficaz deum polipeptídeo de G-CSF PEGuilado da reivindicação 23 ou 24 ou uma composição das reivindicações 25 a 32 ou 36 a 39.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato do nível insuficiente de neutrófiloser um resultado de quimioterapia ou terapia de radiação.

42. Uso de um polipeptídeo de G-CSF PEGuilado, dareivindicação 23 ou 24 ou uma composição das reivindicações 25 a 32 ou 36 a 39 caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um medicamento para aumento do nível deneutrófilos em um paciente sofrendo de ou em risco de umnível insuficiente de neutrófilos.

43. Uso, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado pelo fato do nível insuficiente de neutrófiloser um resultado de quimioterapia ou terapia de radiação.

44. Composição compreendendo uma mistura homogênea deisômeros de PEG posicionais de uma variante de polipeptídeode G-CSF PEGuilada caracterizada pelo fato de pelo menoscerca de 8 0% dos isômeros de PEG posicionais da misturaconsistirem de dois isômeros de PEG posicionais, cada umtendo porções de PEG consistindo de duas porções de PEGligadas a grupos epsilon amino da lisina e uma porção dePEG ligada ao grupo amino N-terminal.

45. Composição, de acordo com a reivindicação 44,caracterizada pelo fato de pelo menos cerca de 85% dosisômeros de PEG posicionais da mistura homogêneaconsistirem de dois isômeros de PEG posicionais tendo, cadaum porções de PEG consistindo de duas porções de PEGligadas a grupos epsilon amino da lisina e uma porção dePEG ligada ao grupo amino N-terminal.

46. Composição, de acordo com a reivindicação 44,caracterizada pelo fato de pelo menos cerca de 90% dosisômeros de PEG posicionais da mistura homogêneaconsistirem de dois isômeros de PEG posicionais, cada umtendo porções de PEG consistindo de duas porções de PEGligadas a grupos epsilon amino da lisina e uma porção dePEG ligada ao grupo amino N-terminal.

47. Composição caracterizada pelo fato de compreenderum veículo farmaceuticamente aceitável e uma composição dasreivindicações 44 a 46.

48. Método para aumento do nível de neutrófilos em umpaciente sofrendo de ou em risco de um nível de neutrófiloinsuficiente caracterizado pelo fato de compreenderadministração, ao referido paciente, de uma dose eficaz deuma composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 44 a 46.

49. Uso de uma composição das reivindicações 44 a 46caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de ummedicamento para aumento do nível de neutrófilos em umpaciente sofrendo ou em risco de um nível insuficiente deneutrófilos.