JP2012533311A - ニワトリ胚消化のための酵素組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ウイルス生産のための細胞の調製を意図した、ニワトリ胚消化のための酵素組成物に関する。本発明はまた、本発明の酵素組成物を用いてニワトリ胚から細胞を調製する工程を含んでなる野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび／または組換えウイルスを生産する方法にも関する。本発明は、得られた野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび／または組換えウイルスに関し、癌、感染症および／または自己免疫疾患の処置および／または予防のための前記ウイルスを含んでなる医薬組成物、好ましくは、ワクチン、並びにその使用に関する。

Description

本発明は、ウイルス産生の分野に属する。特に、本発明は、ウイルス産生のために用いられる細胞の調製を意図したニワトリ胚消化のための酵素組成物に関する。

発明の背景

弱毒化ウイルスまたは組換えウイルスなどの多くのウイルスワクチンが、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、ニワトリ胚腎臓細胞（ＣＥＫＣ）またはニワトリ胚肝細胞（ＣＥＬＣ）などの初代または二次ニワトリ細胞から製造される。初代ＣＥＦは、日本脳炎ウイルスワクチン（例えば、Pasteur Marieux社により製造される）、黄熱ウイルスワクチン（例えば、Arilvax社により製造される）、インフルエンザウイルスワクチン（例えば、Medeva Pharmaceuticals社により製造される）、麻疹および風疹ウイルスワクチン（例えば、メルク社により製造される）並びに改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ワクチンの生産のために特に用いられている。

初代組織からの細胞調製物を産生する様々な方法が開発されてきた。これらの方法としては、機械的な分離、酵素的な分離または両方の組み合わせの使用が挙げられる。機械的な分離は、例えば、胚にメスを擦り付けること、胚を細かく刻むこと、または胚を物理的に切り離すことからなる。過剰な機械的分離はしばしば、大量の細胞死および細胞損傷の結果を伴う。さらに、ある機械的な分離のプロトコル（例えば、手動による粉砕）の手動の性質のために、分離効率が個体間で変動し、異なる供給源からの測定値（細胞生存率など）を比較することが困難である。実際、この手順の手動の性質は、２つの異なった同一サンプル間での物理的特性（例えば、細胞濃度、細胞生存率、細胞サイズ分布）の差異に寄与し得る。機械的な分離の負の結果を防ぐ試みとして、ウシ膵臓のトリプシンが用いられた。不運なことに、ウシ膵臓のトリプシンは、ウイルスなどの病原体を含み得る。従って、これらの病原体がワクチンを用いて処置し、予防接種を受けた動物またはヒトに移る潜在的リスクが存在した。通常用いられるウシ膵臓のトリプシンに付随する多くの主要な潜在的問題の一つは、細胞培養物から製造した製品と接触させた動物またはヒトに、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を引き起こす病原体を移す可能性である。結果として、組換えトリプシンが初代または二次細胞からのワクチンの生産のために開発されてきた。

ＷＯ２００４／０２２７２９号公報には、初代ＣＥＦにおけるポックスウイルスの増幅方法が記載されており、前記ＣＥＦは、血清フリーの培地存在下で事前に温めた（３７℃）トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて室温で１５分間処理したニワトリ胚から得られる。

ＷＯ２００６／１１６８０３号公報には、哺乳類胚から幹細胞を製造する方法であって、胚が、事前に温めたトリプシン溶液中に、胚のサイズにより５〜６０分間浸し得る方法が記載されている。

初代ニワトリ細胞からのワクチン生産の一つの主要な問題は、十分な量の胚の提供である。必要な胚の数を減らすために、胚当り最大数の細胞が得られることにその本質がある細胞調製物の取得をもたらす酵素組成物が必要である。本発明は、そのような組成物を提供する。本発明は、より具体的には、胚当り５００ １０^６を超える細胞が得られることにその本質がある細胞調製物の取得をもたらすニワトリ胚消化のための酵素組成物を提供する。本発明の酵素組成物は、さらに、切開されていないニワトリ胚を消化することができる。

発明の詳細な説明

本明細書全体を通して用いられる「ａ」および「ａｎ」はと特段の明示の無い限り、参照される成分または工程の「少なくとも一つ」、「少なくとも最初の」、「１以上の」または「複数」を意味することを意図して用いられる。

本明細書全体を通して用いられる「および／または」は、本明細書のどこで用いられたとしても、「および」、「または」および「前記用語により連結される要素のすべてのまたはあらゆる他の組み合わせ」を含む。

本明細書全体を通して用いられる「含んでなること」および「含んでなる」は、製品、組成物および方法が、他を排除することなく、参照される成分または工程を含むことを意味することを意図している。「から本質的になる」は、製品、組成物および方法を定義するために用いられるときは、いかなる本質的な重要を持つ他の成分または工程が除外されることを意味する。従って、説明される成分から本質的になる組成物は、微量の夾雑物や医薬上許容される担体を排除しないであろう。「からなる」は、他の成分や工程の微量を超える要素を排除することを意味する。

本明細書全体を通して用いられるように、本明細書で用いられる「約」または「およそ」は、特定された値または範囲の２０％以内、好ましくは、１０％以内、より好ましくは、５％以内であることを意味する。

本発明は、細胞の調製を意図したニワトリ胚消化のための酵素組成物に関する。一つの特定の態様によれば、前記細胞は、ウイルスの生産のために用いられ得る。

本発明は、より具体的には、ニワトリ細胞調製物の取得をもたらすニワトリ胚消化のための、酵素組成物の使用に関する。

本発明の酵素組成物は、驚くべきことに、１胚当りから５００ １０^６を超えて得られる細胞からなるニワトリ細胞調製物の取得をもたらす。この観点で、本発明は、より具体的には、１胚当りから５００ １０^６を超えて得られる細胞からなるニワトリ細胞調製物の取得をもたらすニワトリ胚消化のための酵素組成物に関する。

本発明の酵素組成物は、少なくとも２つの酵素を含んでなる。本発明の組成物に含まれる酵素は、トリプシン、キモトリプシン、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、アキュターゼ、サーモリシン、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、パパイン、ノイラミニダーゼおよびパンクレアチンからなる群から選択される。本発明の組成物に含まれる酵素は、好ましくは、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼおよびアキュターゼからなる群から選択される。この観点で、本発明は、より具体的には、ニワトリ胚消化のための酵素組成物であって、前記酵素組成物は、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼおよびアキュターゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素を含んでなる酵素組成物に関する。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の酵素組成物は、
−トリプシン、ディスパーゼおよびコラゲナーゼ；
−トリプシン、ディスパーゼおよびアキュターゼ；
−トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼおよびアキュターゼ；
−トリプシンおよびディスパーゼ；並びに
−ディスパーゼおよびアキュターゼ
からなる群から選択される。

本発明の一つの特定の態様によれば、本発明の酵素組成物は、
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の３０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、および１０ｍＬ／胚のコラゲナーゼ２０ｍｇ／ｍＬ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、および１０ｍＬ／胚のコラゲナーゼ２０ｍｇ／ｍＬ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１５ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼと等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１５ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ／胚のコラゲナーゼ２０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼと等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の３０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼと等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、および５ｍＬ／胚のコラゲナーゼ２０ｍｇ／ｍＬ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の３０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ／胚のコラゲナーゼ２０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼと等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼと等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１５ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、および５ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の３０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、および１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、および１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ；
−１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ／胚のアキュターゼ；並びに
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の５ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、および１５ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ
からなる群から選択される。

本発明の一つのより特定の態様によれば、本発明の酵素組成物は、
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の３０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ （商標）Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、インビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびギブコインビトロジェン社のカタログ番号１７１０２の１０ｍＬ／胚のコラゲナーゼIII２０ｍｇ／ｍＬ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ （商標）Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、インビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびギブコインビトロジェン社のカタログ番号１７１０２の１０ｍＬ／胚のコラゲナーゼIII２０ｍｇ／ｍＬ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１５ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ （商標）Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、インビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼ（商標）と等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１５ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ （商標）Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、インビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、ギブコインビトロジェン社のカタログ番号１７１０２の１０ｍＬ／胚のコラゲナーゼIII２０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼ（商標）と等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の３０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ （商標）Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、インビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼ（商標）と等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ （商標）Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、インビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびギブコインビトロジェン社のカタログ番号１７１０２の５ｍＬ／胚のコラゲナーゼIII２０ｍｇ／ｍＬ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の３０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ （商標）Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、インビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、ギブコインビトロジェン社のカタログ番号１７１０２の１０ｍＬ／胚のコラゲナーゼIII２０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼ（商標）と等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ （商標）Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、インビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼ（商標）と等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１５ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ （商標）Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、およびインビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の５ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の３０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ （商標）Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、およびインビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ （商標）Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、およびインビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ；
−インビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびアキュターゼ１０ｍＬ／胚；
−インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の５ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ （商標）Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、およびインビトロジェン社のカタログ番号１７１０５−０４１の１５ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ
からなる群から選択される。

本発明によれば、酵素組成物は、動物産物フリーである。本明細書全体で用いられる「動物産物」とは、生物の動物細胞中で産生される、若しくは生物の動物細胞により産生されるあらゆる化合物または化合物の集まりを意味する。この観点では、本発明の組成物に含まれる酵素は、組換え酵素である。

トリプシンは、多くの脊椎動物の膵臓中で産生されるセリンプロテアーゼである。トリプシンは、塩基性アミノ酸アルギニンおよびリジンのカルボキシル基で、ペプチドの加水分解性の開裂を触媒する。例えば、ピキア・パストリス（Pishia pastoris）からの組換えトリプシン（Roche Applied Science社、２００３年９月）などの多くの組換えトリプシンが記載され、例えばＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン社製、カタログ番号１２５６３−０１１；１２５６３−０２９）またはＴｒｙｐＺｅａｎ（シグマ社製、例えば、カタログ番号Ｔ−３４４９）など、そのうちのいくつかは、商業的に入手可能である。本発明により用いられる好ましい組換えトリプシンは、実施例に記載されるＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン社製、カタログ番号１２５６３−０２９）である。

ディスパーゼは、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymyxa）細菌から産生される中性プロテアーゼである（Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase, STENN K.S., LINK R., MOELLMANN G., MADRI J., KUKLINSKA E., J. Invest Dermatol. 1989 Aug;93(2):287-90）。例えば、組換えディスパーゼI、組換えディスパーゼII（Roche Applied Science社、２００４年８月）またはＢＤディスパーゼ（ＢＤサイエンシズ社製）などの多くの組換えディスパーゼが既に記載されており、例えば、ディスパーゼ（インビトロジェン社製、例えば、カタログ番号１７１０５−０４１）、ディスパーゼＩ（シグマ社製、例えばカタログ番号Ｄ４８１８）またはディスパーゼ（StemCell Technologies社製、例えば、カタログ番号０７９１３；０７９２３）など、そのうちのいくつかは、商業的に入手可能である。本発明により用いられる好ましい組換えディスパーゼは、実施例で記載されるディスパーゼ（インビトロジェン社製、カタログ番号１７１０５−０４１）である。

コラゲナーゼは、コラーゲン内のペプチド結合を切断するクロストリジウム・ヒストリチカム（Clostridium histolyticum）細菌から産生されるプロテアーゼである（Isolation and characterization of proteinase and collagenase from Cl. Histolyticum, MANDL I., MACLENNAN J. D., HOWES E.L, J Clin Invest. 1953 Dec;32(12): 1323-9）。例えば、組換えコラゲナーゼIII（Collagenase III: A superior enzyme for complete disaggregation and improved viability of normal and malignant human breast tissue, SPEIRS V., WHITE M.C. and GREEN A.R., In vitro Cell. Dev. Biol. - Animal, 32:72-74, February 1996）などの多くのコラゲナーゼが既に記載されており、コラゲナーゼI型（シグマ社製、例えば、カタログ番号Ｃ０１３０；Ｃ１６３９）、コラゲナーゼII型（シグマ社製、例えば、Ｃ０１３０；Ｃ１７６４；Ｃ６８８５）、コラゲナーゼIII型（例えば、ギブコインビトロジェン社のカタログ番号１７１０２；シグマ社製、例えば、カタログ番号Ｃ０２５５）、コラゲナーゼIV型（シグマ社製、例えば、カタログ番号Ｃ１８８９）、コラゲナーゼV型（シグマ社製、例えば、カタログ番号Ｃ２０１４；Ｃ９２６３）、コラゲナーゼVII型（シグマ社製、例えば、カタログ番号Ｃ０７７３；Ｃ２３９９）またはコラゲナーゼXI型（シグマ社製、例えばＣ４７８５；Ｃ７６５７）など、いくつかの組換えコラゲナーゼが商業的に入手可能である。本発明により用いられる好ましい組換えコラゲナーゼは、実施例に記載されたコラゲナーゼIII型（ギブコインビトロジェン社のカタログ番号１７１０２）である。

アキュターゼは、甲殻類起源のプロテアーゼである。例えば、アキュターゼ（PAA社製、例えば、カタログ番号Ｌ１１−００７）、アキュターゼ（Thermo社製、例えば、２１−２０１−０１００Ｖ）、アキュターゼ（InterChim社製、例えば、カタログ番号ＵＰＮ６８０８１）、アキュターゼ（シグマ社製、例えば、カタログ番号Ａ６９６４）、アキュターゼ（eBioscience社製、例えば、カタログ番号００−４５５５）またはアキュターゼ（ミリポア社製、例えば、カタログ番号ＳＣＲ００５）などの組換えアキュターゼが商業的に入手可能である。本発明により用いられる好ましい組換えアキュターゼは、実施例に記載されたアキュターゼ（シグマ社製、カタログ番号Ａ６９６４）である。

本発明の酵素組成物を用いたニワトリ胚の消化により調製される「細胞」としては、特に限定されないが、線維芽細胞、腎臓細胞、肝細胞、心細胞、筋細胞、上皮細胞、血球および内皮細胞を挙げることができる。

本発明の一つの特定の態様によれば、本発明の酵素組成物は、単離されたニワトリ細胞からなるニワトリ細胞調製物の取得をもたらすニワトリ胚の消化に用いられる。本発明によれば、前記単離されたニワトリ細胞は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、ニワトリ胚腎臓細胞（ＣＥＫＣ）、またはニワトリ胚肝細胞（ＣＥＬＣ）であり、好ましくはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）である。

本発明の他の特定の態様によれば、本発明の酵素組成物は、ニワトリ細胞の混合物からなるニワトリ細胞調製物の取得をもたらすニワトリ胚の消化に用いられる。本発明によれば、前記ニワトリ細胞の混合物は、ＣＥＦ、ＣＥＫＣ、ＣＥＬＣ、心細胞、筋細胞、上皮細胞、血球および／または内皮細胞である。

細胞は、好ましくは、特定病原体未感染（ＳＰＦ）卵から得られる。ＳＰＦ卵は、例えば、Charles River Laboratories社（ウィルミントン、ＭＡ、米国）から商業的に入手可能である。前記卵は、好ましくは、９日齢を超えたものであり、より好ましくは、１０〜１４日齢のものであり、さらに好ましくは、１２日齢のものである。胚から採取する前に、卵は、好ましくは、殺菌される。卵の殺菌のための多くの方法および製品が、先行技術から入手可能である。ホルマリン溶液中でのインキュベーション（例えば、２％ホルマリン中で、例えば、１分間）し、その後、エタノール中での洗浄（例えば、７０％エタノール）することが特に好ましい。その後、卵は開かれ、胚が取り出され、頭と足が切断される。

従って、切開されていない胚が、本発明の酵素組成物により直接消化される。本発明によれば、細胞の解離は、以下の条件下で得られる：
○ インキュベーションの温度が、３５℃〜３９℃であり、好ましくは、３６℃〜３７℃であり、より好ましくは、３６℃、３６．５℃または３７℃であり、さらにより好ましくは、３７℃であり；かつ
○ インキュベーションの継続時間が、１〜３時間、好ましくは２時間である。

本発明の酵素組成物は、驚くべきことに、切開されていないニワトリ胚を消化することができる。

本発明の特定の態様によれば、酵素組成物の酵素は、異なる時間に胚に添加されてもよい。例えば、トリプシン、ディスパーゼおよびコラゲナーゼを含んでなる酵素組成物では、胚はまず、ディスパーゼとコラゲナーゼの存在下で消化して、その後、時間間隔を空けてトリプシンの存在下で消化してもよい。他の例としては、トリプシン、ディスパーゼおよびアキュターゼを含んでなる酵素組成物では、胚はまず、トリプシン存在下で消化して、その後、時間間隔を空けてディスパーゼの存在下で消化し、最後に時間間隔を空けて（前の時間間隔と同じでもよく、異なっていてもよい）アキュターゼの存在下で消化してもよい。本発明によれば、前記時間間隔は１５分〜９０分であり、好ましくは、２０〜８０分であり、より好ましくは、３０〜６０分であり、より好ましくは、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、または６０分であり、さらにより好ましくは６０分である。

得られる混合物は、その後濾過して（例えば、Fischer Bioblock社のカタログ番号Ａ３７５３２から商業的に入手可能なｉｎｏｘ製ｓｅａｖｅを用いて）未消化の組織を除去する。細胞（例えば、ＣＥＦ；ＣＥＫＣ；ＣＥＬＣ）は、その後、遠心分離（例えば、２３００ｒｐｍ、１５分間）により回収する。前記遠心分離は、酵素（すなわち、酵素は上清中にあるであろう）を除去することを可能にもする。実施例１に記載の方法および条件が、好ましく用いられる。

本発明によれば、得られる初代細胞は、直接用いることもでき、１回のさらなる継代の後に二次細胞として用いることもできる。

細胞（すなわち、初代または二次）は、その後、適切な細胞培地中で培養する。本発明により用いられる細胞培地は、好ましくは、動物産物フリーである。動物産物フリーの多くの培地が既に記載されており、例えば、２９３ ＳＦＭ II；２９３−Ｆ Ｃｅｌｌ、ＳＦＭ−適用；２９３−Ｈ Ｃｅｌｌ、ＳＦＭ−適用；２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）トランスフェクション試薬；ＣＤ２９３ＡＧＴ（商標）；ＣＤ２９３培地；ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現システム；ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培地；ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ Ｃｅｌｌ、ＳＦＭ−適用；ＶＰ−ＳＦＭ；ＶＰ−ＳＦＭ ＡＧＴ（商標）；ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞用アデノウイルス発現培地（ＡＥＭ）成長培地；ＣＤ２９３ＡＧＴ（商標）；ＣＤ２９３培地；ＣＯＳ−７Ｌ細胞、ＳＦＭ−適用；ＥＰＩＳＥＲＦ（商標）培地；ＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭ（すべてインビトロジェン社から入手可能）などのそのうちのいくつかは商業的に入手可能である。細胞は、好ましくは、感染前１〜５日間、より好ましくは、感染前１〜２日間、さらにより好ましくは、感染前２日間培養する。細胞は、好ましくは、３０〜３７℃の温度で培養する。

本発明は、野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび／または組換えウイルスを生産する方法であって、前記の酵素組成物を用いてニワトリ胚から細胞を調製する工程を含んでなる方法にも関する。

野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび／または組換えウイルスを生産する方法であって、本発明の酵素組成物を用いてニワトリ胚から細胞を調製する工程を含んでなる方法は、前記細胞にウイルスを感染させる工程を含んでいてもよい。細胞にウイルスを感染させる工程は、当業者に周知である。本明細書全体を通して用いられる「感染」は、細胞へのウイルスの核酸の移動に関し、細胞内でウイルスの核酸は複製され、ウイルスタンパク質が合成され、または新しいウイルス粒子が組み立てられる。当業者は、特定のウイルスの産生に最も適した細胞を選ぶことができる。例えば、産生されるウイルスがポックスウイルスである特定の態様では、用いる細胞は、好ましくは、ＣＥＦである。細胞にウイルスを感染させる工程は、前記細胞の調製に用いられる細胞培地と同じであっても、異なっていてもよい、適切な細胞培地中で行われる。本発明による用いられる細胞培地は、好ましくは、動物産物フリーである。動物産物フリーの多くの培地が既に記載され、そのいくつかは前記の通り商業的に入手可能である。感染の工程に用いられる好ましい細胞培地は、イーグル基礎培地細胞培地（インビトロジェン社製）である。細胞培地は、好ましくは、０．５〜１．５胚／Ｌ、より好ましくは１．１〜１．３胚／Ｌ、さらにより好ましくは、約１．２胚／Ｌの細胞培地でまかれる。産生されるウイルスがＭＶＡである特定の態様では、ＭＶＡは、好ましくは、０．００１〜０．１、より好ましくは、０．０３〜０．０７、さらにより好ましくは約０．０５のＭＯＩで細胞培養容器に播種される。

野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび／または組換えウイルスを生産する方法であって、本発明の酵素組成物を用いてニワトリ胚から細胞を調製する工程を含んでなる方法は、感染細胞の培養の工程を含んでいてもよい。ウイルスの子孫が産生されるまでの感染細胞の培養の工程は、当業者に周知である。前記工程は、表面に接着しての増殖、（微小）担体の存在下若しくは非存在下の懸濁液中での増殖、またはそれらの組み合わせを含んでなることができる。培養は、例えば、培養皿中で、ローラーボトル中で、または、バッチ、フェドバッチ、連続系および中空糸などを用いたバイオリアクター中で行うことができる。細胞培養によりウイルスの大量生産を達成するために、（微小）担体の存在下または非存在下の懸濁液中で増殖することができる細胞を有することが技術上好ましく、動物産物フリーの培地内で培養することができる細胞を有することが好ましい。本発明により用いられる細胞培地は、好ましくは、動物産物フリーである。動物産物フリーの多くの培地が既に記載されており、そのうちのいくつかは、前記の通り商業的に入手可能である。感染細胞の培養の工程は、前記細胞の調製に用いる細胞培地およびウイルスによる前記細胞の感染に用いる細胞培地と同じでも異なっていてもよい。感染細胞の培養に用いられる好適な細胞培地は、イーグル基礎培地（インビトロジェン社製）である。感染細胞は、好ましくは１〜６日間培養され、より好ましくは２〜４日間培養され、さらにより好ましくは、３日間培養される。感染細胞は、好ましくは、３０℃〜３７℃の範囲の温度で培養される。

野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび／または組換えウイルスを生産する方法であって、本発明の酵素組成物を用いてニワトリ胚から細胞を調製する工程を含んでなる方法は、上清および／または細胞から産生されたウイルスを回収する工程を含んでいてもよい。ウイルスが細胞から回収されるとき（すなわち、細胞のみから、あるいは、細胞からおよび上清から）、産生されたウイルスを回収する工程の前に、細胞膜の破壊する工程を行うことができる。この工程は、細胞からのウイルスの遊離をもたらす。細胞膜の破壊は、当業者に周知の様々な技術により誘発させることができる。このような技術としては、特に限定されないが、凍結／融解、低張溶解、超音波処理（超音波処理機を用いることにより）および顕微溶液化（顕微溶液化装置を用いることにより）が挙げられる。超音波処理機は、例えば、Ｈｅｒａｅｕｓ ＰＳＰ社、Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社、Ｍｉｓｏｎｉｘ社またはＧｌｅｎＭｉｌｌｓ社から商業的に入手可能である。本発明により用いられる好ましい超音波処理機は、ＳＯＮＩＴＵＢＥ ２０ｋＨｚタイプＳＭ２０−１２０−３およびＳＯＮＩＴＵＢＥ ３５ｋＨｚタイプＳＭ３５−４００−３（Ｈｅｒａｅｕｓ ＰＳＰ社製）である。顕微溶液化装置は、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社から商業的に入手可能である。パッケージング細胞の膜は、ＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏフレンチプレスを用いて破壊することもできる。パッケージング細胞の膜は、高速ホモジェナイザーを用いて破壊することもできる。高速ホモジェナイザーは、例えば、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社またはＩｋａ−Ｌａｂｏｔｅｃｈｎｉｋ社から商業的に入手可能である。本発明により用いられる好ましい高速ホモジェナイザーは、ＳＩＬＶＥＲＳＯＮ Ｌ４Ｒ（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社製）である。

野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび／または組換えウイルスを生産する方法であって、本発明の酵素組成物を用いてニワトリ胚から細胞を調製する工程を含んでなる方法は、回収されたウイルスを精製する１以上の工程を含んでいてもよい。精製工程は、特に限定されないが、例えば、以下の通りである。

○ 好適な条件下での、細胞残屑の除去を可能とする清澄化。前記清澄化は、例えば、深層濾過により行うことができる。深層濾過としては、特に限定されないが、ザルトリウス社製のＳａｒｔｏｐｕｒｅ（商標）フィルター（例えば、Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ（商標）ＰＰ２）、ＣＵＮＯ社製ＡＰシリーズデプスフィルター（例えば、ＡＰ０１）、ＣＵＮＯ社製ＣＰシリーズデプスフィルター（例えば、ＣＰ１０、ＣＰ３０、ＣＰ５０、ＣＰ６０、ＣＰ７０、ＣＰ９０）、ＣＵＮＯ社製ＨＰシリーズデプスフィルター（例えば、ＨＰ１０、ＨＰ３０、ＨＰ５０、ＨＰ６０、ＨＰ７０、ＨＰ９０）、ＣＵＮＯ社製Ｃａｌｉｆシリーズデプスフィルター（例えば、ＣＡ１０、ＣＡ３０、ＣＡ５０、ＣＡ６０、ＣＡ７０、ＣＡ９０）、ＣＵＮＯ社製ＳＰシリーズデプスフィルター（例えば、ＳＰ１０、ＳＰ３０、ＳＰ５０、ＳＰ６０、ＳＰ７０、ＳＰ９０）、ＣＵＮＯ社製Ｄｅｌｉｐｉｄ ａｎｄ Ｄｅｌｉｐｉｄ Ｐｌｕｓフィルター、ミリポア社製ＣＥシリーズデプスフィルター（例えばＣＥ１５、ＣＥ２０、ＣＥ２５、ＣＥ３０、ＣＥ３５、ＣＥ４０、ＣＥ４５、ＣＥ５０、ＣＥ７０、ＣＥ７５）、ミリポア社製ＤＥシリーズデプスフィルター（例えば、ＤＥ２５、ＤＥ３０、ＤＥ３５、ＤＥ４０、ＤＥ４５、ＤＥ５０、ＤＥ５５、ＤＥ５６０、ＤＥ６５、ＤＥ７０、ＤＥ７５）、ミリポア社製ＨＣフィルター（例えば、Ａ１ＨＣ、Ｂ１ＨＣ、ＣＯＨＣ）、ＣＵＮＯ社製ＰｏｌｙＮｅｔ（商標）フィルター（例えば、ＰｏｌｙＮｅｔ（商標）ＰＢ Ｐ０５０、Ｐ１００、Ｐ２００、Ｐ３００、Ｐ４００、Ｐ５００、Ｐ７００）、ミリポア社製Ｃｌａｒｉｇａｒｄ ａｎｄ Ｐｏｌｙｇａｒｄフィルター、ＣＵＮＯ社製Ｌｉｆｅ Ａｓｓｕｒｅフィルター、ＭａｎＣｅｌ社製デプスフィルター（例えば、ＰＲ１２ＵＰ、ＰＲ１２、ＰＲ５ＵＰ）；およびＰＡＬＬ社製またはＳｅｉｔｚＳｃｈｅｎｋ社製フィルターなどの１以上の商業的に入手可能な製品の使用が挙げられる。入手可能な深層濾過ユニットの清澄化能力を改善するために、徐々にポアサイズが減少する２以上のユニットを連結させることが有用であり得る。この態様では、清澄化する混合物は、最大の夾雑物が保持される第一の深層濾過ユニットを通過し、その後、第二の深層濾過ユニットを通過する。この観点では、本発明の好ましい態様によれば、清澄化は、深層濾過により、好ましくは、５μｍのポアサイズを有するフィルターに連結した８μｍのポアサイズを有するフィルターを通して行われる。本発明により用いられる８μｍおよび５μｍのポアサイズを有する好ましいフィルターは、ザルトリウス社から商業的に入手することができるＳａｒｔｏｐｕｒｅ（商標）フィルター（Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ（商標）ＰＰ２）である。本発明によれば、深層濾過は、好ましくは、１Ｌ／分の流速で行われる。

○ 例えば、精密濾過または限外濾過により行うことができる濃縮。精密濾過は、巨大分子を濃縮し、かつ、精製する圧力駆動の膜工程である。より具体的には、溶液は、濃縮水にウイルスを跳ね返し、かつ、フィルターを介して透過液中に低分子（例えば、タンパク質）を通過させることができるように選ばれたポアサイズを有するフィルターを通過させる。精密濾過は、抽出溶液の体積を減らす。従って、この観点では、精密濾過は、０．２μｍ未満のポアサイズ、好ましくは、０．０１〜０．１５μｍのポアサイズ、より好ましくは、０．０９〜０．１５μｍ、さらにより好ましくは、０．１μｍのポアサイズを有するフィルターを用いることにより行うことができる。本発明により用いられるフィルターは、好ましくは、例えば、Ｐｒｏｓｔａｋ精密濾過モジュール（ミリポア社製）などのオートクレーブ可能で商業的に入手可能なフィルターが好ましく、Ｐｒｏｓｔａｋ精密濾過モジュールＰＳＶＶＡＧ０２１、ＰＳＶＶＡＧ０４１およびＳＫ２Ｐ１２Ｅ１が好ましい。

○ 精密濾過（前記の通り）の改良型であり、ウイルスを含んでなる前記フラクションを前記画分の不純物濃度に減少をもたらす溶液で希釈することを含む、透析濾過。ウイルスを含んでなるフラクションの希釈は、前記フラクションからより多くの不純物を洗い出すことを可能とする。透析濾過は、バッチ様式、半連続様式または連続様式で行うことができると理解される。透析濾過は、ウイルスが含まれる緩衝液の交換に有利に用いることができる。例えば、それは、精製工程に用いられる緩衝液を薬学上許容可能な緩衝液に交換するために有用である。本発明によれば、精密濾過は、０．２μｍ未満のポアサイズ、好ましくは０．０１〜０．１５μｍのポアサイズ、より好ましくは、０．０９〜０．１５μｍ、さらにより好ましくは、０．１μｍのポアサイズを有するフィルターを用いて行われる。本発明により用いられるフィルターは、例えば、Ｐｒｏｓｔａｋ精密濾過モジュール（ミリポア社製）などのオートクレーブ可能で商業的に入手可能なフィルターが好ましく、Ｐｒｏｓｔａｋ精密濾過モジュールＰＳＶＶＡＧ０２１、ＰＳＶＶＡＧ０４１およびＳＫ２Ｐ１２Ｅ１が好ましい。

○ 陽イオンまたは陰イオン交換吸着剤、好ましくは、陰イオン交換吸着剤を用いたクロマトグラフィー。本発明によれば、陰イオン交換吸着剤の官能基は、例えば、ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）、基 −Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−Ｎ＋−（ＣＨ_３）_３（Ｑ基とも名付けられている；Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）レジン、ファルマシア社製を参照）などの第１級、第２級、第３級、第４級アミノ基、または、例えば、既に正規の正電荷を有しているか、７．０〜９．０のｐＨ内で正規の正電荷を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの他の基であってもよい。陰イオン交換吸着剤の好ましい官能基は、ジメチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）およびトリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）からなる群から選択され、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）がより好ましい。陰イオン交換吸着剤は、特に限定されないが、例えば、ビーズ形成マトリックスまたは膜から構成される。
− 本発明の好ましい態様によれば、陰イオン交換吸着剤はビーズ形成マトリックスから構成される。マトリックスは、例えば、アガロース、親水性ポリマー、セルロース、デキストランまたはシリカとすることができる。鎖（例えば、デキストラン鎖）がマトリックスと結合していてもよい。前記の官能基は、化学的に安定な結合（例えば、エーテル結合）により鎖と結合している。ビーズ形成マトリックスの好ましい官能基は、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）である。本発明により用いられるビーズ形成マトリックスから構成される陰イオン交換吸着剤は、例えば、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑ（バイオラッド社製）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ（バイオラッド社製）、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（商標）Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ（アマーシャムバイオサイエンシズ社製）、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（商標）ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ（アマーシャムバイオサイエンシズ社製）またはＢｉｏＳｅｐｒａ（商標）Ｑ ｈｙｐｅｒＺ（Ｐａｌｌ社製）など、オートクレーブ可能であることが好ましい。本発明によるビーズ形成マトリックスから構成されるオートクレーブ可能な好ましい陰イオン交換吸着剤は、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑ（バイオラッド社製）である。ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑ（バイオラッド社製）は、１２０μｍの直径を有し、かつトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）官能基を有する、親水性で球状の重合体ビーズから構成される。
− 本発明の他の好ましい態様によれば、陰イオン交換吸着剤は、膜から構成される。膜の官能基は、前記の通りであり得る。膜の好ましい官能基は、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）である。本発明の好ましい態様によれば、用いられる膜は、ウイルスのサイズよりも小さいポアサイズを有する。この観点では、ウイルスがポックスウイルス（２００ｎｍのサイズを有する）である場合には、膜は、１〜５μｍのポアサイズ、より好ましくは、３μｍのポアサイズを有する。本発明により用いられる膜から構成される陰イオン交換吸着剤は、例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）７５Ｑ（ザルトリウス社製）など、オートクレーブ可能なものであることが好ましい。

○ ゲル濾過：本発明によれば、ウイルスを含むサンプルは、３〜１６０μｍ、有利には８０〜１６０μｍ、好ましくは、４０〜１０５μｍ、より好ましくは、２５〜７５μｍ、より好ましくは、２０〜８０μｍ、さらにより好ましくは、２０〜６０μｍの直径を有するビーズを含んでなる固体支持体上で処理される。本発明によれば、前記支持体は、後者がビーズを通り抜けないように、ウイルスの直径（例えば、ポックスウイルスでは２００〜３００ｎｍ）に近い多孔度を有する。他方で、より小さいサイズの分子は、ビーズを通り抜け、その移動は遅くなる。ゲル濾過に用いられる支持体は、例えば、アガロース、デキストラン、アクリルアミド、シリカ、エチレングリコール／メタクリレート共重合体、または、例えば、アガロースとデキストランとの混合物などのこれらの組み合わせに基づき得る。本発明によれば、支持体は、官能基なしでも好ましく用いられる。ゲル濾過クロマトグラフィー支持体は、例えば、
− エチレングリコール／メタクリレート共重合体ゲル濾過クロマトグラフィー支持体（例えば、２０〜６０μｍのビーズ直径を有する、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＨＷ５５、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＨＷ６５およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＨＷ７５、Ｔｏｓｏｈａａｓ社製）；
− アリルデキストラン／メチレンビスアクリルアミドゲル濾過クロマトグラフィー支持体（例えば、２５〜７５μｍのビーズ直径を有するＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ３００ＨＲ；２５〜７５μｍのビーズ直径を有するＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ４００ＨＲ；２５〜７５μｍのビーズ直径を有するＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ５００ＨＲ；４０〜１０５μｍのビーズ直径を有するＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ１０００ＳＦ、すべてファルマシア社製）；
− Ｎ−アクリルアミノヒドロキシプロパンジオールゲル濾過クロマトグラフィー支持体（例えば、８０〜１６０μｍのビーズ直径を有するＴｒｉｓａｃｒｙｌ、Ｂｉｏｓｅｐｒａ社製）；
− アガロースゲル濾過クロマトグラフィー支持体（例えば、２０〜８０μｍのビーズ直径を有するＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＳＥ、バイオラッド社製）などの、商業的に入手可能なものである。エチレングリコール／メタクリレートゲル濾過クロマトグラフィー支持体（例えば、２０〜６０μｍのビーズ直径を有する、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＨＷ５５、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＨＷ６５およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＨＷ７５、Ｔｏｓｏｈａａｓ社製）が好ましい。

野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび／または組換えウイルスを生産する方法であって、本発明の酵素組成物を用いてニワトリ胚から細胞を調製する工程を含んでなる方法はまた、１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートする工程を含んでいてもよい。１以上のヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）の存在下でインキュベートする工程は、溶液中に存在する核酸（例えば、ＤＮＡ；ＲＮＡ）を分解するために行われる。本発明により好ましく用いられるヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、その基質に基づいて、以下のように分類することができる：ＤＮＡを分解するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）；ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）；並びにＤＮＡおよびＲＮＡを分解するエンドヌクレアーゼ。エンドヌクレアーゼＤＮａｓｅとしては、特に限定されないが、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ ＩＩ、およびエンドデオキシリボヌクレアーゼＩＶが挙げられる。エンドヌクレアーゼＲＮａｓｅとしては、特に限定されないが、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｅ、ＲＮａｓｅ ＦおよびＲＮａｓｅ Ｐが挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡを分解するエンドヌクレアーゼとしては、特に限定されないが、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）が挙げられる。本発明の好ましい態様では、産生されるウイルスをインキュベートする工程は、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）の存在下で行われる。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）は、特定塩基間に内在するリン酸ジエステル結合を加水分解することにより核酸（例えば、ＤＮＡ：ＲＮＡ）を分解する。完全に消化すると、溶液中に存在するすべての遊離核酸（例えば、ＤＮＡ；ＲＮＡ）は、３〜８塩基長の、５’−モノリン酸で終端するオリゴヌクレオチドに変わる。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）はタンパク質分解活性を有さない。本発明により用いられるＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）は、好ましくは、薬学上許容可能である。薬学上許容可能なＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）は、商業的に入手可能である（例えば、参照番号ＭＥ−０２８０−１０の下でＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製、例えば、参照番号１．０１６５３．０００１の下でメルク社製）。本発明によれば、用いられるヌクレアーゼの濃度は、５〜１００Ｕ／ｍＬの範囲、好ましくは、５〜５０Ｕ／ｍＬの範囲、より好ましくは、１０Ｕ／ｍＬである。

本発明による野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび／または組換えウイルスを生産する方法は、無菌の工業規模の製造工程に適しており、ワクチンの滅菌性に関する法的規制の完全な遵守を確かにする。

本出願全体を通して用いられる「ウイルス」としては、特に限定されないが、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、フォーミーウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザウイルスなど）、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、または西ナイルウイルスなど）、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、アルファウイルス（例えば、ロスリバーウイルス、チクングニヤウイルス）、肝炎ウイルス、リノウイルス（例えば、コロラドダニ熱）またはフォーミーウイルスが挙げられる。

本発明の好ましい態様では、ウイルスはポックスウイルスである。ポックスウイルスは、主に、その特異な形態学、その巨大なＤＮＡゲノムおよびその細胞内の複製部位により識別できる２００〜３００ｎｍの直径を有する複雑なエンベロープウイルスである。本発明によれば、ポックスウイルスは、偏り無く、未成熟ウイルス（ＩＶ）、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープウイルス（ＩＥＶ）、細胞関連エンベロープウイルス（ＣＥＶ）または細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）（SMITH et al. (2002), J. Gen. Virol., 83, 2915-2931）とすることができる。本発明で用いられるポックスウイルスは、好ましくは、チョルドポックスウイルス亜科（脊椎動物ポックスウイルス）（Fields Virology/eds. : FIELDS, B. N., KNIPE, D. M., HOWLEY, P. M.; 3rd ed/ISBN 0-7817-0253-4; Chapter 83）のポックスウイルスを意味する。チョルドポックスウイルスとしては、特に限定されないが、オルトポックスウイルス属、パラポックスウイルス属、アビポックスウイルス属、カプリポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属、スイポックスウイルス属、モルシポックスウイルス属、またはヤタポックスウイルス属のポックスウイルスが挙げられる。本発明による好ましいチョルドポックスウイルスは、オルトポックスウイルスである。オルトポックスウイルスとしては、特に限定されないが、天然痘ウイルス、例えば、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株、Ｗｙｅｔｈ株、ＮＹＶＡＣ株、ＮＹＣＢＯＨ株、パリ株、コペンハーゲン株（GOEBLE et al. (1990); Genbank accession number M35027.1）などのワクシニアウイルス（ＶＶ）、または、例えば、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、特にＭＶＡ５７５（ＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７）およびＭＶＡ−ＢＮ（ＥＣＡＣＣ Ｖ００８３００８）などのそれらの誘導体が挙げられる。コペンハーゲンワクシニアウイルス（ＶＶ）株（GOEBEL et al., 1990, Virol. 179, 247-266および 517-563; JOHNSON et al., 1993, Virol. 196, 381-401）および改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）株（ANTOINE et al., 1998, Virol. 244, 365-396）を含むポックスウイルスのいくつかのメンバーのゲノムは、マッピングされ、シークエンスされている。ＶＶは、約２００のタンパク質（そのうちの約１００はウイルスの組み立てに関与する）をコードする約１９２ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞上でワクシニアウイルスのアンカラ株を５００回以上逐次的に継代して生み出された、高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株である（MAYR et al., 1975, Infection 3, 6-16）。ＭＶＡウイルスは、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM）に寄託番号Ｎ^６０２ Ｉ−７２１として寄託された。ＭＶＡゲノムの完全な配列が決定され、コペンハーゲンＶＶゲノムと比較することにより、ウイルスゲノムに生じた変異の正確な同定および７つの欠失（Ｉ〜ＩＩＶ）並びにＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の断片化を引き起こす多くの変異の定義が可能となった（ANTOINE et al., 1998, Virology 244, 365-396）。

本発明の好ましい態様では、ウイルスはポックスウイルス、好ましくは、オルトポックスウイルスである。

本発明の好ましい態様では、オルトポックスウイルスは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）である。本発明による好ましいＶＶは、例えば、それぞれ、機能不全のＩ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子を含んでなるＶＶ並びに機能不全のＦ２Ｌ遺伝子を含んでなるＶＶを開示する、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７２０号またはＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７２１号に記載されるＶＶである。

本発明の他の好ましい態様では、オルトポックスウイルスは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である。本発明による好ましいＭＶＡは、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM）に寄託番号Ｎ^６０２ Ｉ−７２１として寄託されたＭＶＡ、ＭＶＡ５７５（ＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７）およびＭＶＡ−ＢＮ（ＥＣＡＣＣ Ｖ００８３００８）である。

好ましい態様では、本発明は、野生型ポックスウイルス、弱毒化ポックスウイルスおよび／または組換えポックスウイルスを生産する方法であって、前記の酵素組成物を用いて胚から細胞を調製する工程と、引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ０７／１４７５２８号公報に記載されるさらなる工程とを含んでなる方法に関する。従って、この観点では、本発明は、野生型ポックスウイルス、弱毒化ポックスウイルスおよび／または組換えポックスウイルスを生産する方法であって、
ａ）前記酵素組成物を用いて胚から細胞を調製する工程；
ｂ）前記細胞培養を感染させる工程（引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ第０７／１４７５２８号公報に記載された）；
ｃ）前記感染細胞を適切な期間培養する工程（引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ第０７／１４７５２８号公報に記載された）；
ｄ）培養上清および／またはパッケージング細胞から、産生されたポックスウイルス粒子を回収する工程（引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ第０７／１４７５２８号公報に記載された）；
ｅ）深層濾過により、好ましくは、５μｍのポアサイズを有するフィルターに連結した８μｍのポアサイズを有するフィルターを通すことにより、得られた混合物を清澄化する工程（引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ第０７／１４７５２８号公報に記載された）；
ｆ）精密濾過により、好ましくは、０．０１μｍ〜０．１５μｍのポアサイズを有するフィルターを通すことにより、好ましくは、０．１μｍのポアサイズを有するフィルターを通すことにより、得られた混合物を濃縮する工程（引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ第０７／１４７５２８号公報に記載された）；並びに
ｇ）好ましくは、０．０１μｍ〜０．１５μｍのポアサイズを有するフィルターを通すことにより、好ましくは、０．１μｍのポアサイズを有するフィルターを通すことにより、得られた混合物を透析濾過する工程（引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ第０７／１４７５２８号公報に記載された）
を含んでなる方法に関する。

他の好ましい態様では、本発明は、野生型オルトポックスウイルス、弱毒化オルトポックスウイルスおよび／または組換えオルトポックスウイルスを生産する方法であって、前記酵素組成物を用いて胚から細胞を調製する工程と、引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許出願第０９３０５４２２．９号の方法Ａ（Ｍｅｔｈｏｄ Ａ）に記載されたさらなる工程とを含んでなる方法に関する。従って、この観点では、本発明は、野生型オルトポックスウイルス、弱毒化オルトポックスウイルスおよび／または組換えオルトポックスウイルスを生産する方法であって、
ａ）前記酵素組成物を用いて胚から細胞を調製する工程；
ｂ）細胞にオルトポックスウイルスを感染させる工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ａに記載された）；
ｃ）オルトポックスウイルスの子孫が産生されるまで前記感染細胞を培養する工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ａに記載された）；
ｄ）１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートする工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ａに記載された）；
ｅ）培養上清および／または細胞からオルトポックスウイルスを回収する工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ａに記載された）；
ｆ）ヌクレアーゼ活性を阻害し、かつ、工程（ｇ）において前記オルトポックスウイルスの陰イオン交換吸着剤への吸着を防ぐために好適な条件下で、工程（ｅ）で回収されたオルトポックスウイルスに一価の塩（例えば、ＮａＣｌ；ＫＣｌ）を加える工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ａに記載された）；
ｇ）工程（ｆ）で得られた混合物を、陰イオン交換吸着剤（例えば、ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）、基 −Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−Ｎ＋−（ＣＨ_３）_３（Ｑ基とも名付けられている；Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）レジン、ファルマシア社製を参照）などの第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミノ基、または、例えば、既に正規の正電荷を有しているか、７．０〜９．０のｐＨ内で正規の正電荷を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの他の基である官能基を有するビーズ形成マトリックスまたは膜）と、核酸を捕捉することを可能とする好適な条件下で接触させる工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ａに記載された）；
ｈ）工程（ｇ）で得られた混合物を、細胞残屑の除去を可能とする好適な条件下で清澄化する工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ａに記載された）；
ｉ）保持されたオルトポックスウイルスをフロースルー中に回収するために好適な条件下で一価の塩（例えば、ＮａＣｌ；ＫＣｌ）を含んでなる溶液で陰イオン交換吸着剤を洗浄する工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ａに記載された）；
ｊ）工程（ｈ）で得られたフロースルーおよび工程（ｉ）で得られたフロースルーを濃縮する工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ａに記載された）；
ｋ）工程（ｊ）で得られたオルトポックスウイルスを含んでなるフラクションを透析濾過する工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ａに記載された）；
ｌ）ゲル濾過工程とその後に続く透析濾過の工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ａに記載された）
を含んでなる方法に関する。

他の好ましい態様では、本発明は、野生型オルトポックスウイルス、弱毒化オルトポックスウイルスおよび／または組換えオルトポックスウイルスを生産する方法であって、前記酵素組成物を用いて胚から細胞を調製する工程と、引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ｂ（Ｍｅｔｈｏｄ Ｂ）に記載されたさらなる工程とを含んでなる方法に関する。従って、この観点では、本発明は、野生型オルトポックスウイルス、弱毒化オルトポックスウイルスおよび／または組換えオルトポックスウイルスを生産する方法であって、
ａ’）前記酵素組成物を用いて胚から細胞を調製する工程；
ｂ’）細胞にオルトポックスウイルスを感染させる工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ｂに記載された）；
ｃ’）オルトポックスウイルスの子孫が産生されるまで前記感染細胞を培養する工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ｂに記載された）；
ｄ’）１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートする工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ｂに記載された）；
ｅ’）培養上清および／またはパッケージング細胞からオルトポックスウイルスを回収する工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ｂに記載された）；
ｆ’）工程（ｅ’）で回収されたオルトポックスウイルスを、
１．ヌクレアーゼ活性を阻害することができる１以上の薬剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌなどの一価の塩）；および、場合によって、
２．１以上の安定化剤（例えば、スクロースまたはトレハロースなどの糖類；アミノ酸；Ｔｗｅｅｎなどの界面活性剤；例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌなどの塩）
の存在下でインキュベートする工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ｂに記載された）；
ｇ’）工程（ｆ’）で得られた混合物を、陰イオン交換吸着剤（例えば、ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）、基 −Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−Ｎ＋−（ＣＨ_３）_３（Ｑ基とも名付けられている；Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）レジン、ファルマシア社製を参照）などの第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミノ基、または、例えば、既に正規の正電荷を有しているか、７．０〜９．０のｐＨ内で正規の正電荷を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの他の基である官能基を有するビーズ形成マトリックスまたは膜）と、前記オルトポックスウイルスおよび核酸を捕捉することを可能とする好適な条件下で接触させる工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ｂに記載された）；
ｈ’）工程（ｇ’）で得られた混合物を、細胞残屑を除去することのできる好適な条件下で清澄化する工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ｂに記載された）；
ｉ’）オルトポックスウイルスを一価の塩を含んでなる溶液で溶出する工程；
ｊ’）工程（ｉ’）で得られた混合物を濃縮する工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ｂに記載された）；
ｋ’）工程（ｊ’）で得られたオルトポックスウイルスを含んでなるフラクションを透析濾過する工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ｂに記載された）；および場合によって
ｌ’）ゲル濾過の工程およびそれに続く透析濾過の工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ｂに記載された）
を含んでなる方法に関する。

他の好ましい態様では、本発明は、野生型オルトポックスウイルス、弱毒化オルトポックスウイルスおよび／または組換えオルトポックスウイルスを生産する方法であって、前記酵素組成物を用いて胚から細胞を調製する工程と、引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃ（Ｍｅｔｈｏｄ Ｃ）に記載されたさらなる工程とを含んでなる方法に関する。従って、この観点では、本発明は、野生型オルトポックスウイルス、弱毒化オルトポックスウイルスおよび／または組換えオルトポックスウイルスを生産する方法であって、
ａ’’）前記酵素組成物を用いて胚から細胞を調製する工程；
ｂ’’）パッケージング細胞培養物にオルトポックスウイルスを感染させる工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）；
ｃ’’）オルトポックスウイルスの子孫が産生されるまで前記感染パッケージング細胞を培養する工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）；
ｄ’’）１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートする工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）；
ｅ’’）培養上清および／またはパッケージング細胞からオルトポックスウイルスを回収する工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）；
ｆ’’）工程（ｅ’’）で回収されたオルトポックスウイルスを、
１．ヌクレアーゼ活性を阻害することができる１以上の薬剤；および、場合によって、
２．１以上の安定化剤
の存在下でインキュベートする工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）；
ｇ’’）工程（ｆ’’）で得られた混合物を、陰イオン交換吸着剤（例えば、ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）、基 −Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−Ｎ＋−（ＣＨ_３）_３（Ｑ基とも名付けられている；Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）レジン、ファルマシア社製を参照）などの第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミノ基、または、例えば、既に正規の正電荷を有しているか、７．０〜９．０のｐＨ内で正規の正電荷を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの他の基である官能基を有するビーズ形成マトリックスまたは膜）と、前記オルトポックスウイルスおよび核酸を捕捉することを可能とする好適な条件下で接触させる工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）；
ｈ’’）工程（ｇ’’）で得られた混合物を、細胞残屑を除去することのできる好適な条件下で清澄化する工程（引用することにより本明細書の一部とされる欧州特許第０９３０５４２２．９号公報の方法Ｂに記載された）；
ｉ’’）オルトポックスウイルスを一価の塩を含んでなる溶液で溶出する工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）；
ｊ’’）工程（ｋ’’）において前記オルトポックスウイルスの陰イオン交換吸着剤への吸着を防ぐために、工程（ｉ’’）で溶出させたオルトポックスウイルスに一価の塩を加える工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）；
ｋ’’）工程（ｊ’’）で得られた混合物を、陰イオン交換吸着剤（例えば、ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）、基 −Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−Ｎ＋−（ＣＨ_３）_３（Ｑ基とも名付けられている；Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）レジン、ファルマシア社製を参照）などの第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミノ基、または、例えば、既に正規の正電荷を有しているか、７．０〜９．０のｐＨ内で正規の正電荷を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの他の基である官能基を有するビーズ形成マトリックスまたは膜）と、核酸を捕捉することを可能とする好適な条件下で接触させる工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）；
ｌ’’）保持されたオルトポックスウイルスをフロースルー中に回収するために好適な条件下で一価の塩を含んでなる溶液で陰イオン交換吸着剤を洗浄する工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）；
ｍ’’）工程（ｌ’’）で得られたフロースルーを濃縮する工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）；
ｎ’’）工程（ｍ’’）で得られたオルトポックスウイルスを含んでなるフラクションを透析濾過する工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）；および場合によって
ｏ’’）ゲル濾過の工程およびそれに続く透析濾過の工程（引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６４９１号の方法Ｃに記載された）
を含んでなる方法に関する。

本明細書全体を通して用いられる「弱毒化ウイルス」とは、意図する対象内でのその病原性が実質的に低減するように改変されたあらゆるウイルスを意味する。好ましくは、ウイルスは、臨床学的見地から非病原性である、すなわち、ウイルスに暴露された対象が対照の対象と比較して統計的に有意に増大したレベルの病原性を示さない程度に弱毒化される。

本明細書全体を通して用いられる「組換えウイルス」とは、そのゲノムに挿入した外来性配列を含んでなるウイルスを意味する。本明細書で用いられる外来性配列とは、親ウイルスには天然には存在しない核酸を意味する。

一つの態様では、外来性配列は、直接的または間接的な細胞毒性機能を有する分子をコードする。「直接的または間接的な」細胞毒性とは、外来性配列によりコードされる分子それ自体が毒性（例えば、リシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−２（ＩＬ２）、インターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、シュードモナスエキソトキシンＡ）であり得るか、または代謝されて毒性産物を形成し得るか、または他のものに作用して毒性産物を形成し得ることを意味する。リシンｃＤＮＡの配列はＬａｍｂら（Eur. J. Biochem., 1985, 148, 265-270）により開示されている。

本発明の好ましい態様では、外来性配列は、自殺遺伝子である。自殺遺伝子は、比較的非毒性のプロドラッグを毒性の薬物に変換することができるタンパク質をコードする。例えば、酵素シトシンデアミナーゼは、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に変換し（Mullen et al (1922) PNAS 89, 33）；単純ヘルペスの酵素チミジンキナーゼは、抗ウイルス剤ガンシクロビル（ＧＣＶ）またはアシクロビルによる処理に対して細胞を敏感にする（Moolten (1986) Cancer Res. 46, 5276; Ezzedine et al (1991) New Biol 3, 608）。あらゆる生物、例えば、E. coliまたはSaccharomyces cerevisiaeのシトシンデアミナーゼを用いることができる。従って、本発明の好ましい態様では、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ活性を有するタンパク質、より好ましくは、引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ第９９／５４４８１号公報、ＷＯ第０５／０７８５７号公報、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７２０号およびＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７２１号によりカバーされるＦＣＵ１タンパク質またはＦＣＵ１−８タンパク質をコードする。

この観点では、本発明の方法により生産される好ましい組換えウイルスは、
○ ＴＧ４０２３とも呼ばれるＭＶＡ−ＦＣＵ１（ＷＯ第９９／５４４８１号公報を参照）；
○ ＭＶＡ−ＦＣＵ１−８（ＷＯ第０５／０７８５７号公報を参照）；
○ ＶＶ−ＦＣＵ１（ここで、前記ＶＶは、より好ましくは、機能不全のＩ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子並びにＪ２Ｒ遺伝子を含んでなる（ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７２０号およびＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７２１号を参照））
である。

プロドラッグ／酵素組成物の他の例としては、Ｂａｇｓｈａｗｅら（ＷＯ第８８／０７３７８号公報）により開示されたもの、すなわち、様々なアルキル化剤およびシュードモナスｓｐｐのＣＰＧ２酵素、並びに、ＥｐｅｎｔｏｓおよびＲｏｗｌｉｎｓｏｎ−Ｂｕｓｚａ（ＷＯ第９１／１１２０１号公報）により開示されたもの、すなわち、シアン発生プロドラッグ（例えば、アミグダリン）および植物由来のβ−グリコシダーゼが挙げられる。本発明のこの態様に有用な酵素としては、特に限定されないが、リン酸エステル含有プロドラッグをフリーの薬剤に変換するために有用なアルカリフォスファターゼ；硫酸エステル含有プロドラッグをフリーの薬剤に変換するために有用なアリールスルファターゼ；ペプチド含有プロドラッグをフリーの薬剤に変換するために有用な、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（カテプシンＢおよびＬ）などのプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を有するプロドラッグを変換するために有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化されたプロドラッグをフリーの薬剤に変換するために有用なβ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなどの炭化水素切断酵素；β−ラクタムで誘導化された薬剤をフリーの薬剤に変換するために有用なβ−ラクタマーゼ；それぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基でそのアミノ窒素を誘導化された薬剤をフリーの薬剤に変換するために有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが挙げられる。代わりに、アブザイムとして当技術分野で知られる酵素活性を有する抗体を、本発明のプロドラッグをフリーの薬剤に変換するために用いることができる（Massey R. et al., Nature, 1987, 328, 457-458）。同様に、プロドラッグは、特に限定されないが、上でリストしたプロドラッグ、例えば、リン酸エステル含有プロドラッグ、チオリン酸エステル含有プロドラッグ、硫酸エステル含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、置換されていてもよいフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ若しくは置換されていてもよいフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび変換可能な他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられる。本発明で用いるためのプロドラッグ形態に誘導化され得る細胞毒性薬剤の例としては、特に限定されないが、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、シスプラチンおよびシスプラチン類似体、ブレオマイシン、エスペラマイシン（例えば、米国特許第４，６７５，１８７号公報を参照）、５−フルオロウラシル、メルファラン並びに他の関連ナイトロジェンマスタードが挙げられる。

さらなる態様では、外来性遺伝子は、標的ＲＮＡまたはＤＮＡを分解することができるリボザイムをコードする。分解される標的ＲＮＡまたはＤＮＡは、細胞機能に必須のＲＮＡまたはＤＮＡであり得、それらの分解は、細胞死を引き起こすか、または、分解されるＲＮＡ若しくはＤＮＡは、望まれないタンパク質、例えば、癌遺伝子産物をコードするＲＮＡ若しくはＤＮＡであり得、このＲＮＡ若しくはＤＮＡの分解は、細胞が癌化することを防ぎ得る。

なおいっそうさらなる態様では、外来性遺伝子は、アンチセンスＲＮＡをコードする。「アンチセンスＲＮＡ」とは、タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子にハイブリダイズしてその発現を妨げるか、プレｍＲＮＡ若しくはｔＲＮＡ若しくはｒＲＮＡなどの細胞内の他のＲＮＡ分子とハイブリダイズするか、またはハイブリダイズして遺伝子からの発現を妨げるＲＮＡ分子を意味する。

本発明の他の態様では、外来性遺伝子は、標的細胞内で、機能不全の遺伝子に置き換わってもよい。欠陥遺伝子により引き起こされる、ヒトを含む哺乳類の、幾千もの遺伝性疾患がある。そのような遺伝性疾患の例としては、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ遺伝子に変異があることが知られている）；デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ジストロフィン遺伝子に変異があることが知られている）；鎌状赤血球症（ＨｂＡ遺伝子に変異があることが知られている）が挙げられる。多くのタイプの癌は、欠陥遺伝子、特に、変異した原癌遺伝子および癌抑制遺伝子により引き起こされる。原癌遺伝子の例は、ｒａｓ、ｓｒｃ、ｂｃｌなどであり；癌抑制遺伝子の例は、ｐ５３およびＲｂである。

本発明のさらなる態様では、外来性配列は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする。ＴＡＡは、同一組織型の非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞においてより高い頻度および密度で検出される分子に関係する。ＴＡＡの例としては、特に限定されないが、ＣＥＡ、ＭＡＲＴ１、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＧＰ−１００、ＭＵＣ１（引用することにより本明細書の一部とされる、ＷＯ第９２／０７０００号公報、ＷＯ第９５／０９２４１号公報およびRochlitz et al. J Gene Med. 2003 Aug;5(8):690-9）、ＭＵＣ２、点変異型ｒａｓ癌遺伝子、正常型または点変異型ｐ５３、過剰発現型ｐ５３、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、Ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２、ＢＲＣＡ Ｉ、ＢＲＣＡ ＩＩ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ｓｕｒｖｉｖｉｎｇおよびＬＲＰが挙げられる。より好ましい態様によれば、ＴＡＡはＭＵＣ１である。

本発明の他の態様では、外来性遺伝子は、抗原をコードする。本明細書で用いられる「抗原」とは、抗体と結合することができるリガンドであり、それ自体が免疫原性である必要はない。抗原は、好ましくは、例えば、ＨＩＶ−１、（ｇｐ１２０またはｇｐ１６０など）、いずれかのネコ免疫不全ウイルス、ｇＤ若しくはその誘導体またはＨＳＶ１若しくはＨＳＶ２からのＩＣＰ２７などの前初期タンパク質などのヒトまたは動物ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ｇＢまたはその誘導体など）、水疱帯状疱疹ウイルス（ｇｐＩ、ＩＩまたはＩＩＩなど）などのウイルスに由来し、またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原またはその誘導体、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ；ＷＯ第０４／１１１０８２号公報を参照；好ましくは、遺伝子型１ｂ系統ｊａ由来の非構造ＨＣＶタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）などの肝炎ウイルスに由来し、または、呼吸器多核体ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ；ＷＯ第９０／１０４５９号公報、ＷＯ第９５／０９２４１号公報、ＷＯ第９８／０４７０５号公報、ＷＯ第９９／０３８８５号公報、ＷＯ第０７／１２１８９４号公報、ＷＯ第０７／１２１８９４号公報を参照；ＨＰＶ１６系統由来のＥ６およびＥ７タンパク質が好ましい；Liu et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Oct 5;101 Suppl 2:14567-71を参照）、若しくはインフルエンザウイルスなどのその他のウイルス性病原体に由来し、または、サルモネラ、ナイセリア、ボレリア（例えば、ＯｓｐＡ若しくはＯｓｐＢまたはそれらの誘導体）、若しくは、クラミジア、若しくは、ボルデテラ、例えば、Ｐ．６９、ＰＴおよびＦＨＡ、などの細菌性病原体に由来し、または、マラリア原虫若しくはトキソプラズマなどの寄生体に由来する。より好ましい態様によれば、抗原は、ＨＣＶまたはＨＰＶから選択される。

この観点で、本発明に方法により生産される好ましい組換えウイルスは、ＴＧ４０４０とも呼ばれるＭＶＡ−ＨＣＶ（ＷＯ第０４／１１１０８２号公報を参照）である。

組換えウイルスは、１以上の外来性配列を含んでなることができ、各外来性配列は、１以上の分子をコードすることができる。例えば、同一の組換えウイルス内で、例えば、ＴＡＡ（前記の通り）または抗原（前記の通り）をコードする外来性配列と、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ２としてＩＬ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；インターフェロン−（ＩＦＮ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ））をコードする外来性配列を関連させることは、有用であり得る。

この観点で、本発明の方法により生産される好ましい組換えウイルスは、
○ ＴＧ４０１０とも呼ばれるＭＶＡ−［ＭＵＣ１−ＩＬ２］（ＷＯ第９２／０７０００号公報およびＷＯ第９５／０９２４１号公報を参照）；および
○ ＴＧ４００１とも呼ばれるＭＶＡ−［ＨＰＶ−ＩＬ２］（ＷＯ第９０／１０４５９号公報、ＷＯ第９５／０９２４１号公報、ＷＯ第９８／０４７０５号公報、ＷＯ第９９／０３８８５号公報、ＷＯ第０７／１２１８９４号公報およびＷＯ第０７／１２１８９４号公報を参照）
である。

有利には、組換えウイルスは、外来性配列の発現に必要な要素をさらに含んでなる。発現に必要な要素は、ヌクレオチド配列のＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能にする要素のセットを含んでなり、特に、本発明の組換えウイルスが感染する細胞中で有効なプロモーター配列および／または調節配列、並びに、場合により、前記ペプチドの分泌もしくは細胞表面への発現を可能とするために必要な配列を含んでなる。これらの要素は、誘導性または構成性であり得る。当然、プロモーターは、選択される組換えウイルスおよび宿主細胞に適合させられる。ワクシニアウイルスプロモーターｐ７．５ｋ ｐＨ５Ｒ、ｐＫ１Ｌ、ｐ２８、ｐ１１または前記プロモーターの組み合わせが例示的に挙げられる。文献は、そのようなプロモーター配列に関連する大量の情報を提供する。加えて、必要とされる要素は、宿主細胞での外来性配列の発現またはその維持を改善する、追加の要素を含むことができる。特に、イントロン配列（ＷＯ第９４／２９４７１号公報）、分泌シグナル配列、核局在化配列、ＩＲＥＳ型の翻訳再開のための内部配列、転写の終結のためのポリＡ配列が挙げられ得る。

本発明は、医薬組成物としての使用、特に、ワクチンとしての使用のための、前記方法により得られる、精製された野生型ウイルス、弱毒化ウイルス、および／または組換えウイルスにも関する。

本明細書で用いられる「医薬組成物」とは、薬学上許容可能な担体を含んでなる組成物をいう。前記薬学上許容可能な担体は、好ましくは、等張、低張または弱高張であり、例えば、スクロース溶液など、比較的低いイオン強度を有する。さらに、そのような担体は、非発熱原性の滅菌水などの、いずれの溶媒、または水性液体若しくは部分的に水性の液体を含んでいてもよい。加えて、医薬組成物のｐＨは、イン・ビボでの使用の要求を満たすように調整され、バッファーされる。医薬組成物は、薬学上許容可能な希釈剤、アジュバントまたは賦形剤を、可溶化剤、安定化剤および保存剤同様に含んでもよい。注射可能な投与のためには、水性、非水性または等張溶液中の製剤が好ましい。それは、単一用量または複数回用量で、液体でまたは使用時に適切な希釈剤で再構成できる乾燥形態（粉末、凍結乾燥物など）で提供され得る。

本発明は、癌、感染症および／または自己免疫疾患の処置および／または予防のための、上記の方法により得られる精製された野生型ウイルス、弱毒化ウイルス、および／または組換えウイルスにも関する。

本明細書で用いられる「癌」は、特に限定されないが、肺癌（例えば、小細胞肺癌腫および非小細胞肺）、気管支癌、食道癌、咽頭癌（pharyngeal cancer）、頭頚部癌（例えば、喉頭癌、***癌、鼻腔癌および副鼻腔癌、ならびに咽頭癌（throat cancer））、口腔癌（例えば、舌癌）、胃癌（gastric cancer）（例えば、胃癌（stomach cancer））、腸癌、消化器癌、結腸癌、直腸癌、直腸結腸癌、肛門癌、肝臓癌、膵臓癌、尿路癌、膀胱癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、腺癌、皮膚癌（例えば、メラノーマ）、眼癌（例えば、網膜芽細胞腫）、脳癌（例えば、神経膠腫、髄芽細胞腫および脳の星状細胞腫）、中枢神経系癌、リンパ腫（例えば、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキン症候群および非ホジキンリンパ腫）、骨癌、白血病、乳癌、生殖器管癌、子宮頚癌（例えば、子宮頚部上皮内腫瘍）、子宮癌（例えば、子宮体癌）、卵巣癌、膣癌、外陰癌、前立腺癌、精巣癌をいう。「癌」はまた、特に限定されないが、パピローマウイルス誘発性癌、ヘルペスウイルス誘発性癌、ＥＢＶ誘発性Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ型肝炎誘発性癌、ＨＴＬＶ−１誘発性リンパ腫およびＨＴＬＶ−２誘発性リンパ腫を含む、ウイルス誘発性癌をいう。

本明細書で用いられる「感染症」とは、感染性生物により引き起こされるあらゆる疾患をいう。感染性生物としては、特に限定されないが、ウイルス（例えば、一本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、寄生体（例えば、マラリア原虫種、リーシュマニア種、住血吸虫属種またはトリパノゾーマ種などの原生動物および後生動物の病原体）、細菌（例えば、マイコバクテリア、特に、M. tuberculosis、サルモネラ、連鎖球菌、E. coliまたはブドウ球菌）、真菌（例えば、カンジダ種またはアスペルギルス種）、Pneumocystis carinii、およびプリオンが挙げられる。

本明細書で用いられる「自己免疫疾患」とは、２つの一般的な型：「全身性自己免疫疾患」（すなわち、多くの臓器または組織を傷害する疾患）と「局所性自己免疫疾患」（すなわち、単一の臓器または組織のみを傷害する疾患）をいう。しかし、「局所性自己免疫疾患」の効果は、間接的に体の他の臓器およびシステムに影響することにより全身性であり得る。「全身性自己免疫疾患」としては、特に限定されないが、関節並びにおそらく肺および皮膚に影響することができる関節リュウマチ；皮膚、関節、腎臓、心臓、脳、赤血球に、他の組織および臓器同様に影響することができる、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）を含むループス；強皮症（皮膚、腸および肺に影響することができる）；シェーグレン症候群（唾液腺、涙腺および関節に影響することができる）；グッドパスチャー症候群（肺および腎臓に影響することができる）；ウェゲナー肉芽腫（洞、肺および腎臓に影響することができる）；リュウマチ性多筋痛（大型の筋群に影響することができる）および側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎（頭頚部の動脈に影響することができる）が挙げられる。「局所性自己免疫疾患」としては、特に限定されないが、１型糖尿病（ランゲルハンス島に影響する）；橋本甲状腺炎およびグレーブス病（甲状腺に影響する）；セリアック病、クローン病および潰瘍性大腸炎（消化管に影響する）；多発性硬化症（ＭＳ）およびギラン−バレー症候群（中枢神経に影響する）；アジソン病（副腎に影響する）；原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎および自己免疫性肝炎（肝臓に影響する）；およびレイノー現象（指、つま先、鼻、耳に影響する）が挙げられる。

本発明はまた、前記の方法により得られる、精製した野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび／または組換えウイルスを含んでなる医薬組成物、好ましくは、ワクチンに関する。本発明によれば、前記医薬組成物は、癌、感染症および／または自己免疫疾患の処置および／または予防を意図している。

本発明はまた、癌、感染症および／または自己免疫疾患の処置および／または予防のため医薬組成物、好ましくは、ワクチンの調製のための、前記方法により得られる、精製された野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび／または組換えウイルスの使用に関する。

医薬組成物、および特にワクチンは、局所経路、非経口経路または消化経路により投与されるために従来法により製造してもよい。投与経路は、例えば、胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、鼻腔内、肺内または気管内経路とすることができる。後者の３つの態様では、エアゾールまたは点滴による投与が有利である。投与は、単一用量として行われてよく、または一定の時間間隔を空けて１回若しくは数回繰り返してもよい。適切な投与経路および用量は、様々なパラメータ、例えば、個々の、処置する疾患の、または導入する対象遺伝子の様々なパラメータの関数として変動する。第一の可能性によれば、医薬組成物および特にワクチンは、生体内に直接投与してもよい（例えば、治療的または予防的ワクチン接種のために、静脈内注射により、到達可能な癌内に若しくはその周囲に、または、皮下に）。これは、患者から細胞を回収すること（骨髄幹細胞、末梢血リンパ球、筋細胞など）、先行技術に従ってイン・ビトロでそれらにトランスフェクション、または、感染させること、およびそれらを患者に再投与することから構成される、エクス・ビボ（ex vivo）の方法に適用することもできる。さらに、適切な場合に、かつ本発明の範囲を外れずに、医薬組成物および特にワクチン中に含まれる様々な成分を、様々な経路で、同時に、または逐次的に投与することを想起することもできる。

本発明を説明するために、下記実施例が提供される。実施例は、いかなる意味においても発明の範囲を制限することを意図するものではない。

ＣＥＦの調製
６６個のＳＰＦ卵を、２％ホルマリン溶液中で１分間インキュベートした。７０％エタノールで洗浄した後に、卵を割って胚を取り出し、頭部と足を切断した。

胚（未切開）は、その後、表１（以下参照）に記載された酵素組成物の一つにより３７℃で２時間消化した。得られた混合物は、ｉｎｏｘで作られたｓｅａｖｅ（Fischer Bioblock社、カタログ番号Ａ３７５３２）を用いて濾過し、未消化の組織を取り除き、ＣＥＦは、遠心分離（２３００ｒｐｍ、１５分）により回収した。

得られた結果は、下記表１に記載される。

調製したＣＥＦを用いたウイルスの生産
ＣＥＦ（ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン社製、カタログ番号１２５６３−０２９）１５ｍＬ／胚、およびディスパーゼ（インビトロジェン社製、カタログ番号１７１０５−０４１；ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬ）５ｍＬ／胚からなる酵素組成物を用いて前記のように調製した）は、その後、湿潤雰囲気中で血清フリーの細胞培地中で３７℃で２日間培養した。血清フリーの細胞培地は、その後、捨てられ、ＣＥＦは、ＭＵＣ１−ＩＬ−２を発現するＭＶＡウイルス（寄託番号Ｎ^６０２Ｉ−７２１の下にCollection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM)）を用いてＭＯＩ ０．０５にて感染させた。感染させたＣＥＦは、その後、３６．５℃で３日間インキュベートした。感染力価は、ＢＨＫ２１細胞上でのプラークアッセイにより測定した。簡潔には、ＭＶＡサンプルの希釈液を、６ウェルプレート中で調製された単層のＢＨＫ２１細胞上でインキュベートした。２４時間後、ウイルスのプラークは、ワクシニアウイルスに対するウサギ抗体で免疫ペルオキシダーゼ反応を用いて染色し、計数した。力価測定は、３回の独立した系列で３回繰り返して行われた。得られたウイルス力価は、６．３ １０^７プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬであった。

上記明細書で引用されたすべての文書（例えば、特許、特許出願、特許公報）は、引用することで本明細書の一部とされる。本発明の様々な改変や変更が、本発明の範囲および精神と離れることなく、当業者に明らかであろう。発明は、特定の好ましい態様と関連して記載されているが、特許請求の範囲に記載された発明は、そのような特定の態様に不当に限定されると理解されるべきではない。実際、当業者に自明な本発明を実施するための記載された様式の様々な改変が、添付された特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。

○ 陽イオンまたは陰イオン交換吸着剤、好ましくは、陰イオン交換吸着剤を用いたクロマトグラフィー。本発明によれば、陰イオン交換吸着剤の官能基は、例えば、ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）、基 −Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−Ｎ＋−（ＣＨ_３）_３（Ｑ基とも名付けられている；Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）レジン、ファルマシア社製を参照）などの第１級、第２級、第３級、第４級アミノ基、または、例えば、既に正規の正電荷を有しているか、７．０〜９．０のｐＨ内で正規の正電荷を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの他の基であってもよい。陰イオン交換吸着剤の好ましい官能基は、ジメチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）およびトリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）からなる群から選択され、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）がより好ましい。陰イオン交換吸着剤は、特に限定されないが、例えば、ビーズ形成マトリックスまたは膜から構成される。
− 本発明の好ましい態様によれば、陰イオン交換吸着剤はビーズ形成マトリックスから構成される。マトリックスは、例えば、アガロース、親水性ポリマー、セルロース、デキストランまたはシリカとすることができる。鎖（例えば、デキストラン鎖）がマトリックスと結合していてもよい。前記の官能基は、化学的に安定な結合（例えば、エーテル結合）により鎖と結合している。ビーズ形成マトリックスの好ましい官能基は、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）である。本発明により用いられるビーズ形成マトリックスから構成される陰イオン交換吸着剤は、例えば、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑ（バイオラッド社製）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ（バイオラッド社製）、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（商標）Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ（アマーシャムバイオサイエンシズ社製）、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（商標）ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ（アマーシャムバイオサイエンシズ社製）またはＢｉｏＳｅｐｒａ（商標）Ｑ ｈｙｐｅｒＺ（Ｐａｌｌ社製）など、オートクレーブ可能であることが好ましい。本発明によるビーズ形成マトリックスから構成されるオートクレーブ可能な好ましい陰イオン交換吸着剤は、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑ（バイオラッド社製）である。ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑ（バイオラッド社製）は、１２０μｍの直径を有し、かつトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）官能基を有する、親水性で球状の重合体ビーズから構成される。
− 本発明の他の好ましい態様によれば、陰イオン交換吸着剤は、膜から構成される。膜の官能基は、前記の通りであり得る。膜の好ましい官能基は、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）である。本発明の好ましい態様によれば、用いられる膜は、ウイルスのサイズよりも大きいポアサイズを有する。この観点では、ウイルスがポックスウイルス（２００ｎｍのサイズを有する）である場合には、膜は、１〜５μｍのポアサイズ、より好ましくは、３μｍのポアサイズを有する。本発明により用いられる膜から構成される陰イオン交換吸着剤は、例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）７５Ｑ（ザルトリウス社製）など、オートクレーブ可能なものであることが好ましい。

Claims (21)

1. ニワトリ細胞調製物の取得をもたらすニワトリ胚消化のための、酵素組成物の使用。
2. 前記ニワトリ細胞調製物が、１胚当たり５００ １０^６を超えて得られる細胞からなる、請求項１に記載の使用。
3. 前記ニワトリ胚が切開されない、請求項１に記載の使用。
4. 前記組成物が少なくとも２つの酵素を含んでなる、請求項１に記載の使用。
5. 前記酵素が、トリプシン、キモトリプシン、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、アキュターゼ、サーモリシン、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、パパイン、ノイラミニダーゼおよびパンクレアチンからなる群から選択され、好ましくは、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼおよびアキュターゼからなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
6. 前記酵素組成物が、
   −トリプシン、ディスパーゼおよびコラゲナーゼ；
   −トリプシン、ディスパーゼおよびアキュターゼ；
   −トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼおよびアキュターゼ；
   −トリプシンおよびディスパーゼ；並びに
   −ディスパーゼおよびアキュターゼ
   からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
7. 前記酵素組成物が、
   −インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の３０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、および１０ｍＬ／胚のコラゲナーゼ２０ｍｇ／ｍＬ；
   −インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、および１０ｍＬ／胚のコラゲナーゼ２０ｍｇ／ｍＬ；
   −インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１５ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼと等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
   −インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１５ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ／胚のコラゲナーゼ２０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼ（商標）と等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
   −インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の３０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼと等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
   −インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、および５ｍＬ／胚のコラゲナーゼ２０ｍｇ／ｍＬ；
   −インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の３０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ／胚のコラゲナーゼ２０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼと等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
   −インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、およびシグマ社のカタログ番号Ａ−６９６４の１０ｍＬ／胚のアキュターゼと等量の濃度で添加されたアキュターゼ；
   −インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１５ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、および５ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ；
   −インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の３０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、および１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ；
   −インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の１０ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、および１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ；
   −１０ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ／胚のアキュターゼ；並びに
   −インビトロジェン社のカタログ番号１２５６３−０２９の５ｍＬ／胚のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと等量の濃度で添加されたトリプシン、および１５ｍＬ／胚のディスパーゼ１０ｍｇ／ｍＬ
   からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
8. 前記ニワトリ細胞調製物が、単離されたニワトリ細胞からなる、請求項１に記載の使用。
9. 前記単離されたニワトリ細胞が、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、ニワトリ胚腎臓細胞（ＣＥＫＣ）またはニワトリ胚肝細胞（ＣＥＬＣ）であり、好ましくはＣＥＦである、請求項８に記載の使用。
10. 前記ニワトリ細胞調製物が、ニワトリ細胞の混合物からなる、請求項１に記載の使用。
11. 前記ニワトリ細胞の混合物が、ＣＥＦ、ＣＥＫＣ、ＣＥＬＣ、心細胞、筋細胞、上皮細胞、血球、および／または内皮細胞を含んでなる、請求項１０に記載の使用。
12. 前記ニワトリ胚の消化が、下記の条件下で行われる、請求項１に記載の使用：
    −インキュベーションの温度が、３５℃〜３９℃であり、好ましくは、３６℃〜３７℃であり、より好ましくは、３６℃、３６．５℃または３７℃であり、さらにより好ましくは、３７℃であり；かつ
    −インキュベーションの継続時間が、１〜３時間であり、好ましくは、２時間である。
13. 野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび／または組換えウイルスを生産する方法であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵素組成物を用いてニワトリ胚から細胞を調製する工程を含んでなる、方法。
14. 前記ウイルスが、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、フォーミーウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、アルファウイルス、肝炎ウイルス、ライノウイルス、レオウイルスおよびフォーミーウイルスからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ポックスウイルスが、オルトポックスウイルス、パラポッスクウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスイウルスおよびヤタポックスウイルスからなる群から選択されるチョルドポックスウイルスである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記オルトポックスウイルスが、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス（ＶＶ）および改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記組換えウイルスが、シトシンデアミナーゼ活性を有するタンパク質、好ましくは、ＦＣＵ１タンパク質またはＦＣＵ１−８タンパク質をコードする自殺遺伝子である外来性配列を含んでなる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記組換えウイルスが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、好ましくは、ＭＵＣ１をコードする外来性配列を含んでなる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記組換えウイルスが、抗原、好ましくは、ＨＣＶまたはＨＰＶをコードする外来性配列を含んでなる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記組換えウイルスが、サイトカイン、好ましくはＩＬ２をコードする外来性配列をさらに含んでなる、請求項１８または１９に記載の方法。
21. 前記組換えウイルスが、外来性配列の発現に必要な要素をさらに含んでなる、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。