KR20120014920A

KR20120014920A - 오르토폭스바이러스의 생산 및 정제 방법

Info

Publication number: KR20120014920A
Application number: KR1020117029010A
Authority: KR
Inventors: 끌로드 쌍; 씰비 깡푸르씨; 이베 꼬르디에르
Original assignee: 트랜스진 에스.에이.
Priority date: 2009-06-12
Filing date: 2010-05-11
Publication date: 2012-02-20

Abstract

본 발명은 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스를 생산하고 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스, 또한 암, 감염성 질환 및/또는 자가면역 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 상기 정제된 오르토폭스바이러스를 포함하는 약제학적 조성물, 바람직하게는 백신 및 그의 용도들에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 방법에 따른 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 생산에 사용되는, 아나티대 과 (Anatidae family)에 속하는 조류 세포로부터 획득된 불멸화 조류 세포주, 상세하게는 텔로머라제 역전사효소 (TERT)를 코딩하는 핵산 서열 및 임의적으로 E1A 핵산 서열을 포함하는 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주의 용도에 관한 것이다.

Description

오르토폭스바이러스의 생산 및 정제 방법 {Method for Orthopoxvirus production and purification}

본 발명은 바이러스 생산 및 정제의 분야에 속한 것이다. 상세하게, 본 발명은 야생형, 약독화 (attenuated) 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스 (Orthopoxvirus)를 생산하고 정제하는 방법에 관한 것이다.

오르토폭스바이러스 (Orthopoxviruses)는 기본적으로 그들의 평범하지 않은 형태, 큰 DNA 게놈 및 세포질 부위에서의 복제로 구별되는 직경이 200 및 300 nm 사이의 범위에 드는 복합적 외투보유 (complex enveloped) 바이러스이다. 코펜하겐 백시니아 바이러스 (Copenhagen Vaccinia virus, VV) 균주 (GOEBEL et al., 1990, Virol. 179: 247-266 및 517-563; JOHNSON et al., 1993, Virol. 196: 381-401) 및 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (modified Vaccinia virus Ankara, MVA) 균주 (ANTOINE et al., 1998, 196: 381-401)를 포함하는, 오르토폭스바이러스의 다수의 구성원들의 게놈은 지도가 작성되었고 서열도 결정되었다. VV는 이들 중 100개는 바이러스 조립 (virus assembly)에 관여하는 약 200개의 단백질을 코딩하는 약 192 kb의 이중가닥 DNA 게놈을 가진다. MVA는 닭 배아 섬유모세포 (chicken embryo fibroblasts) 상에서 백시니아 바이러스 앙카라 균주의 500번 이상 일련의 계대로 생성된 매우 약독화된 (highly attenuated) 백시니아 바이러스이다 (MAYR et al., 1975, Infection 3: 6-16). MVA 바이러스는 국립 미생물배양 기탁기관 (CNCM)에 기탁번호 제 N⁶⁰² I-721호 하로 기탁되었다. MVA 게놈의 완전한 서열 결정 및 코펜하겐 VV 게놈과의 비교는 바이러스 게놈에서 일어나는 변화의 정확한 동정 (identification) 또한 단편화된 ORFs (오픈 리딩 프레임)을 유발하는 7가지 결실들 (I 내지 VII) 및 무수한 돌연변이들의 정의가 가능하게 한다 (ANTOINE et al., 1998, Virology 244: 365-396).

재조합 생백신 (recombinant live vaccines)의 개발을 위한 벡터로서 오르토폭스바이러스의 사용은 안전성 문제 및 법규들에 의해 영향을 받아왔다. 오르토폭스바이러스를 백신접종 (vaccination)에 사용하기 이전에 바이러스를 정제하는 것이 필요하다. 사용가능한 오르토폭스바이러스의 생산 방법은 세포주 (예로, HelaS3)에서, 부화란 (embryonated eggs)에서 또는 닭 배아 섬유모세포 (CEFs)에서의 바이러스 복제를 포함하고 있다. 바이러스의 복제 이후에, 배양 배지는 제거되고 세포는 용출되며 세포로부터 방출된 오르토폭스바이러스는 슈크로스 큐션 원심분리법 (sucrose cushion centrifugation)에 의해 정제된다 (KOTWAL 및 ABRAHAM; 폭스바이러스 성장, 백시니아 바이러스에서의 정제와 역가측정 및 폭스바이러스학, 2004, 101-108, 휴머나 출판사 (Humana Press Inc.), 미국 뉴저지 토토와).

국제특허출원 제 WO 07/147529호는 패키징 세포 (예로, CEFs; 세포주)의 배양을 준비하고, 상기 세포 배양을 감염시키고, 상기 감염된 세포를 배양하고, 상기 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 생산된 MVAs를 회수하고; 또한 더 나아가 심층 여과 (depth filtration), 미세여과 (microfiltration) 및 투과여과 (diafiltration)에 의해 상기 바이러스를 정제하는 것을 포함하는, 표적이 되는 감염 특이성이 전혀 없이 야생형, 약독화 및/또는 재조합 MVA를 생산하는 방법을 기술하고 있다. 국제특허출원 제 WO 07/147528호는 심층 여과, 미세여과 및 투과여과가 수행될 때 핵산분해효소들의 사용, 보다 상세하게는 핵산분해효소로서 벤조나제

(Benzonase

)의 사용이 필요하지 않은 점을 특정하고 있다.

국제특허출원 제 WO 08/138533호는 리간드가 부착된 고체상 매트릭스를 액상 배양으로 자란 백시니아 바이러스와 함께 로딩하고, 상기 매트릭스를 세척하여 상기 바이러스를 용출하는 것을 포함하는, 생물학적으로 활성을 가진 백시니아 바이러스의 정제 방법을 기술하고 있다.

오르토폭스바이러스 생산 및 정제를 위한 다수의 방법들이 기술되었음에도 불구하고, 여전히 대안은 필요하다. 본 발명은 이러한 방법들을 제공한다.

본 출원 전부를 통하여 사용되는 바, "오르토폭스바이러스 (Orthopoxvirus)"는 배리올라 바이러스 (variola virus); 예를 들어 백시니아 바이러스 균주: 엘스트리 (Elstree), 웨스턴 리저브 (Western Reserve), 웨스 (Wyeth), NYVAC, NYCBOH, 파리, 코펜하겐과 같은 백시니아 바이러스 (VV); 및 예를 들어 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA) 상세하게는 MVA 575 (ECACC 제 V00120707호) 및 MVA-BN (ECACC 제 V00083008호)와 같은 그들의 유도체들을 말한다. 본 발명에 따르면, 오르토폭스바이러스는 구별되지 않고 미성숙 바이러스 (IV), 세포내 성숙 바이러스 (IMV), 세포내 외투보유 바이러스 (IEV), 세포-관련 외투보유 바이러스 (CEV) 또는 세포외 외투보유 바이러스 (EEV)일 수 있다 (SMITH et al. 2002, J. Gen. Virol., 83: 2915-2931).

본 출원 전부를 통하여 사용되는 바, "하나 (a)" 및 "하나 (an)"라는 용어는 문맥 상에서 명백하게 달리 언급되지 않는 경우라면, 그들은 언급된 구성성분들 또는 단계들의 "적어도 하나 (at least one)", "적어도 첫 번째 (at least a first)", "하나 이상 (one or more)" 또는 "다수 (a plurality)"를 의미하는 것으로 사용된다.

본 출원 전부를 통하여 사용되는 바, "및/또는 (and/or)"이라는 용어는 본 명세서에서 사용되는 경우라면 "및", "또는" 또한 "상기 용어와 연결된 요소들의 모두 또는 기타 조합"의 의미를 포함한다.

본 출원 전부를 통하여 사용되는 바, "포함하는 (comprising)" 또는 "포함하다 (comprise)"라는 용어는 산물들, 조성물들 및 방법들이 다른 것을 배제하는 것은 아니지만, 언급된 구성성분들 또는 단계들을 포함하는 것을 의미하도록 의도된다. "필수적으로 구성된 (consisting essentially of)"는 산물들, 조성물들 및 방법들을 정의하려고 사용될 때, 기타 필수적으로 중요한 다른 구성성분들 또는 단계들을 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 재인용된 (recited) 구성성분들로 필수적으로 구성된 조성물은 극소량 오염물질 (trace contaminants) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 제외하려는 것은 아니다. "구성된 (consisting of)"은 다른 구성성분들 또는 단계들의 극소량 요소 (trace elements) 이상을 배제하는 것을 의미한다.

본 출원 전부를 통하여 사용되는 바, "약 (about)" 또는 "대략 (approximately)"는 본 명세서에서 사용될 때 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 야생형 (wild type), 약독화 (attenuated) 및/또는 재조합 (recombinant) 오르토폭스바이러스를 생산하고 정제하는 방법 (예로, 방법 A)에 관한 것이다:

a) 패키징 세포 (packaging cells)의 배양을 준비하고;

b) 상기 패키징 세포 배양을 오르토폭스바이러스로 감염시키고;

c) 상기 감염된 패키징 세포를 자손 오르토폭스바이러스가 생산될 때까지 배양하고;

d) 하나 이상의 핵산분해효소 (nucleases)의 존재 시 배양하고;

e) 상기 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 오르토폭스바이러스를 회수하고;

f) 단계 e)에서 회수된 상기 오르토폭스바이러스에 핵산분해효소(들) 활성을 저해하고 단계 g)에서 음이온 교환 흡착제에 상기 오르토폭스바이러스의 흡착을 피하도록 적합한 조건 하에서 단가 염 (monovalent salts)을 첨가하고;

g) 단계 f)에서 획득된 상기 혼합물을 핵산의 포획을 허용하는 적합한 조건 하에서 음이온 교환 흡착제와 접촉시키고;

h) 단계 g)에서 획득된 상기 혼합물을 세포성 잔재물의 배출을 허용하도록 적합한 조건 하에서 정화하고;

i) 상기 음이온 교환 흡착제를 상기 유동물 (flow through)에 남아있는 오르토폭스바이러스를 회수하도록 적합한 조건 하에서 단가 염을 포함하는 용액으로 세척하고;

j) 단계 h)에서 획득된 유동물 및 단계 i)에서 획득된 유동물을 농축하고;

k) 단계 j)에서 획득된 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획을 투과여과한다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 동물 산물이 전혀 없다 (패키징 세포를 제외함). 본 출원 전부를 통하여 사용되는 바와 같이, ？동물 산물 (animal products)？은 살아있는 생물에 있는 동물 세포에서 또는 이에 의해 생산되었던 화합물 또는 화합물의 집합이라면 모두를 말한다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 백신의 무균도 (sterility of vaccines)에 관한 법규상의 요구사항을 전적으로 따르도록 규제되는 무균 산업적 규모 (aseptic industrial-scale)의 제조 공정에 적합하다.

본 출원 전부를 통해 사용되는 바, "약독화 오르토폭스바이러스 (attenuated Orthopoxvirus)"는 의도된 개체에서 그의 병원성이 실질적으로 감소되도록 변형되었던 오르토폭스바이러스라면 모두를 말한다. 바람직하게, 오르토폭스바이러스는 예로 바이러스에 노출된 개체가 대조군 개체와 비교하여 통계적으로 유의한 병원성의 증가 수준을 나타내는, 임상적 측면에서 비병원성이 되는 시점까지 약독화된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 약독화 오르토폭스바이러스는 약독화 VV 또는 약독화 MVA이다.

본 출원 전부를 통해 사용되는 바, "재조합 오르토폭스바이러스 (recombinant Orthopoxvirus)"는 그의 게놈 내에 삽입된 외인성 서열을 포함하는 오르토폭스바이러스를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "외인성 서열 (exogenous sequence)"는 자연적으로 부모 바이러스에 존재하지 않는 핵산을 말한다.

본 출원 전부를 통해 사용되는 바, "패키징 세포 (packaging cells)"는 생산될 오르토폭스바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포를 말한다. 패키징 세포는 일차 세포, 재조합 세포 및/또는 세포주이다. 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터에는 결여되어 있는 재조합 바이러스의 생산에 필요한 요소 (elements)를 포함하는 재조합 세포가 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 패키징 세포는 불멸화 세포주이다. 본 출원 전부를 통하여 사용되는 바, "불멸화 세포주 (immortalized cell line)"는 배양으로 헤이플릭 한계 (HayFlick limit)를 초과하여 증식하는 세포주를 말한다.

본 발명에 따르면, 불멸화 세포주는 바람직하게 아나티대 과 (Anatidae family) 또는 파시아니대 과 (Phasianidae family)에 속하는 조류 세포로부터 획득된다. 상세하게는, 아나티대과 중에서, 카이리나 (Cairina) 또는 아나스 (Anas) 속에 속하는 세포가 바람직하다. 보다 더 바람직하게는 카이리나 모스카타 (Cairina moschata)에 또는 아나스 플라티린코스 (Anas platyrhynchos) 종에 속하는 불멸화 조류 세포주이다.

본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 패키징 세포는 아나티대 과에 속하는 조류 세포로부터, 바람직하게는 카이리나 모스카타 종으로부터 획득된 불멸화 조류 세포주이다.

본 발명에 따른 바람직한 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주는 국제특허출원 제 WO 2007/077256호에 의해 기재된 텔로머라제 역전사효소 (TERT)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주이다. 상세하게는, 다음의 불멸화 조류 세포주가 바람직하다:

- 유럽 세포배양 기탁기관 (ECACC)에 기탁번호 제 08060502호 하로 기탁된 바와 같은 T3-17490 또는 그의 유도체 (도 2, 3 및 4를 참조하라);

- 유럽 세포배양 기탁기관 (ECACC)에 기탁번호 제 08060501호 하로 기탁된 바와 같은 T6-17490 또는 그의 유도체 (도 5, 6 및 7을 참조하라).

본 발명에 따른 다른 바람직한 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주는 E1A 핵산 서열 및 국제특허출원 제 WO 2009/004016호에 의해 기재된 텔로머라제 역전사효소 (TERT)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주이다.

본 출원 전부를 통해 사용되는 바, 기탁된 불멸화 조류 세포주의 "유도체 (derivative)"는 "관심 있는 물질 (substance of interest)"을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 불멸화 조류 세포주를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "관심 있는 물질"은 이에 제한되는 것은 아니지만, 약제학적으로 활성을 가진 단백질 예로 성장인자 (growth factors), 성장조절인자 (growth regulators), 항체 (antibodies), 항원 (antigens), 면역접종 (immunization) 또는 백신접종 (vaccination)에 유용한 그들의 유도체들 등, 인터루킨 (interleukins), 인슐린 (insulin), 에리트로포이에틴 (erythropoietin), G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, 인터페론 (interferons; 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마), 혈액응고인자 (blood clotting factors; 예로, 인자 VIII; 인자 IX; tPA) 또는 그의 조합들을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다른 불멸화 세포주들은:

- 미국 특허 제 US 5,879,924호에 의해 기재된 DF1 세포주, 이는 10일 된 이스트 랜싱 품종 (East Lansing Line, ELL-0) 달걀로부터 유래된 자발적으로 불멸화된 닭 세포주이다;

- 국제특허출원 제 WO 2005/007840호에 의해 기재된 Ebx 닭 세포주, 이는 성장인자 및 사료층 (feeder layer)을 점진적인 단절 (severance)시켜서 배아 줄기세포로부터 유래한다.

- DEC 99 세포주 (Ivanove et al., Experimental Pathology and Parasitology, 4/2000 불가리아 과학 아카데미), 이는 오리 배아 영구적 세포주이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 패키징 세포는 일차 세포이다. 본 출원 전부를 통해 사용되는 바, "일차 세포 (primary cells)"은 계속적으로 또한 무한하게 복제하고 분열할 수 없는, 동물 또는 인간 조직으로부터 새로이 분리되었던 세포를 말한다. 일반적으로, 일차 세포는 세포 배양 시 100회 이하로, 종종 50회 이하로, 종종 25회 이하로 분열한다. 따라서 일차 세포는 불멸화되는 사건을 경험한 적이 없었던 것이다. 일차 세포로는 이에 제한되는 것은 아니지만 섬유모세포 (fibroblasts) 또는 제대혈 림프구 (cord blood lymphocytes)를 포함한다.

본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 패키징 세포는 일차 또는 이차 조류 세포, 바람직하게는 닭 배아 섬유모세포 (chicken embryo fibroblasts, CEFs)이다.

본 발명에 따르면, 패키징 세포의 배양 준비에 사용되는 배양 배지 (예로, 단계 a) 동안), 오르토폭스바이러스로 상기 세포 배양의 감염에 사용되는 배양 배지 (예로, 단계 b) 동안) 및 상기 감염된 패키징 세포의 배양에 사용되는 배양 배지 (예로, 단계 c) 동안)는 동일하거나 다를 수 있다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따라 사용되는 세포 배양 배지는 동물 산물이 없는 배지이다. 동물 산물이 없는 많은 배지가 이미 기술되어 왔으며 이들의 일부는 시판되고 있다. 예를 들어 293 SFM II; SFM 적응된 293-F 세포; SFM 적응된 293-H 세포; 293펙틴^TM 형질전환 시약; CD 293 AGT^TM; CD 293 배지; 프리스타일^TM 293 발현 시스템; 프리스타일^TM 293 배지; SFM 적응된 프리스타일^TM 293-F 세포; 아데노바이러스 발현 배지 (AEM) PER.C6

세포를 위한 성장 배지; CD 293 AGT^TM; CD 293 배지; SFM 적응된 COS-7L 세포; 에피설프

(EPISERF

) 배지; 옵티프로^TM SFM (OptiPro^TM SFM); VP-SFM; VP-SFM AGT^TM (인비트로겐사로부터 모두 입수가능함)가 본 발명에 따른 방법에서 세포 배양 배지로서 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 따라 사용되는 동물 산물이 없는 세포 배양 배지는 손수 만든 배지 (home-made media)일 수도 있다.

단계 a)의 패키징 세포의 배양의 준비는 당업자에게 잘 알려져 있다.

패키징 세포가 불멸화 세포주일 때, 상기 불멸화 세포주는 적절한 배양 배지에서 배양된다. 본 방법은 표면에 부착하는 성장, (마이크로)담체의 존재 시 또는 부재 시 현탁배양으로의 성장 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 배양하는 것은 예를 들어 접시 (dishes), 회전 병 (roller bottles)에서 또는 회분식 (batch), 사료첨가-회분식 (fed-batch), 연속식 (continuous) 시스템, 빈공간 섬유 (hollow fiber) 등을 사용하는 생물반응기에서 시행될 수 있다. 세포 배양을 통한 바이러스의 대량 생산을 달성하기 위하여, 기술분야로는 (마이크로)담체의 존재 시 또는 부재 시 현탁배양으로 성장할 수 있는 세포를 가지는 것이 바람직하고, 또한 동물 산물이 없는 배지에서 배양될 수 있는 세포를 가지는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 사용되는 세포 배양 배지는 동물 산물이 없는 것이 바람직하다. 동물 산물이 없는 많은 배지가 이미 기술되어 왔으며 이들의 일부는 앞서 기술된 바와 같이 시판되고 있다.

패키징 세포가 CEFs일 때, 상기 CEFs는 특정한 병원균 없는 (Specific Pathogen Free, SPF) 달걀로부터 추출되는 것이 바람직하다. SPF 달걀은 예를 들어 챨스 리버 연구소 (Charles River Laboratories, 윌밍튼, 미국 메사추세스)로부터 시판되고 있다. 상기 달걀은 바람직하게 9일 된 것, 더욱 바람직하게는 10일 및 14일 사이가 된 것, 보다 더 바람직하게는 12일 된 것이다. 바람직하게 달걀은 배아를 추출하기 이전에 소독된다. 달걀의 소독에 관한 많은 방법들과 제품들이 선행 기술들에서 입수가능하다. 상세하게는 포몰 용액 (formol solution, 예로, 2% 포몰, 1분)으로 배양하고 이어서 70% 에탄올로 헹구는 것이 바람직하다. 다음으로 배아의 세포는 해체되고 정제된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 배아의 세포는 세포간 기질 (intercellular matrix)의 파괴를 허용하는 효소적 소화 단계에 들어간다. 이러한 목적으로 세포간 기질을 소화시킬 수 있는 효소의 사용이 특히 유용하다. 본 발명에 따른 바람직한 효소는 이에 제한되는 것은 아니지만, 트립신 (Trypsin), 콜라게나제 (Collagenase), 프로나제 (Pronase), 디스파제 (Dispase), 하이알루로니다제 (Hyaluronidase) 및 뉴로아미다제 (Neuroamidase)를 포함한다. 본 발명에 따른 CEFs의 제조에 사용되는 효소는 바람직하게 재조합 기원을 가진다. 효소는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 디스파제 및 트립신 (예로, 집코^TM사로부터 나온 TrypLE 셀렉트)이 조합하여 사용된다. 당업자라면 효과적인 세포 분리를 허용하는 효소 농도, 배양 온도 및 기간을 결정할 수 있다. CEFs 배양의 준비는 더 나아가 오염물을 제거하도록 여과 단계 및/또는 원심분리 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 획득된 일차 CEFs도 역시 직접적으로 사용되거나 한 번 더 세포 계대한 이후에 이차 CEFs로서 사용될 수 있다. 다음으로, CEFs (예로, 일차 또는 이차)는 적절한 세포 배양 배지에서 배양된다. 본 발명에 따라 사용되는 세포 배양 배지는 동물 산물이 없는 것이 바람직하다. 동물 산물이 없는 많은 배지가 이미 기술되어 왔으며 이들의 일부는 앞서 기술된 바와 같이 시판되고 있다. 본 발명에 따르면, CEFs는 바람직하게 VP-SFM 세포 배양 배지 (인비트로겐사)에서 배양된다. CEFs는 감염 이전에 바람직하게 1 및 5일 사이, 더욱 바람직하게는 1 및 2일 사이의 범위 또한 보다 더 바람직하게는 2일 동안 배양된다. CEFs는 바람직하게 30℃ 및 36.5℃ 사이에 포함되는 온도에서 배양된다.

단계 b)의 오르토폭스바이러스로 패키징 세포 배양의 감염 (단계 a)에서 제조됨)은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 출원 전부를 통해 사용되는 바, "감염 (infection)"은 복제되거나, 바이러스 단백질을 합성하거나 새로운 바이러스 입자로 조립되는 바이러스 핵산을 세포에게 전달하는 것을 말한다. 당업자라면 특정한 바이러스의 생산을 위한 가장 적절한 패키징 세포를 선택할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 오르토폭스바이러스, 바람직하게는 MVA 또는 VV의 생산을 위한, 국제특허출원 제 WO 2007/077256호 또는 제 WO 2009/004016호에 의해 기재되어 있는 CEFs 또는 불멸화 조류 세포주의 사용을 포함한다. 단계 b)의 오르토폭스바이러스로 패키징 세포 배양의 감염 (단계 a)에서 제조됨)은 상기 패키징 세포 배양의 준비에 사용되는 (예로, 단계 a) 동안) 세포 배양 배지와 동일하거나 다를 수 있는 적절한 세포 배양 배지에서 수행된다. 본 발명에 따라 사용되는 세포 배양 배지는 동물 산물이 없는 것이 바람직하다. 동물 산물이 없는 많은 배지가 이미 기술되어 왔으며 이들의 일부는 앞서 기술된 바와 같이 시판되고 있다. 패키징 세포가 CEFs일 때는, 단계 b)의 CEFs 배양의 감염은 기본 이글 배지 (Basal Medium Eagle) 세포 배양 배지 (인비트로겐사)에서 수행된다. 세포 배양 배지는 바람직하게 0.5 내지 1.5개의 배아/L 세포 배양 배지 사이, 더욱 바람직하게는 1.1 내지 1.3개의 사이의 범위, 보다 더 바람직하게는 약 1.2개의 배아/L 세포 배양 배지로 접종된다. 생산될 오르토폭스바이러스가 MVA인 특정한 구현예에서는 MVA가 바람직하게 MOI 0.001 및 0.1 사이, 더욱 바람직하게는 0.03 및 0.07 사이에 포함되고, 보다 더 바람직하게는 약 0.05의 MOI로 세포 배양 용기에 접종된다. 생산될 오르토폭스바이러스가 VV인 특정한 구현예에서, VV는 바람직하게 MOI 0.0001 및 0.1 사이에 포함되고, 더욱 바람직하게는 약 0.0001의 MOI로 세포 배양 용기에 접종된다.

단계 c)의 자손 오르토폭스바이러스가 생산될 때까지 감염된 패키징 세포의 배양은 당업자라면 잘 알고 있다.

패키징 세포가 CEFs일 때, 단계 c)의 감염된 CEFs의 배양은 상기 CEFs 세포 배양의 준비에 사용되는 (예로, 단계 a) 동안) 세포 배양 배지 및 오르토폭스바이러스로 상기 CEFs 배양의 감염에 사용되는 (예로, 단계 b) 동안) 세포 배양 배지와 동일하거나 다를 수 있는 적절한 세포 배양 배지에서 수행된다. 본 발명에 따라 사용되는 세포 배양 배지는 동물 산물이 없는 것이 바람직하다. 동물 산물이 없는 많은 배지가 이미 기술되어 왔으며 이들의 일부는 앞서 기술된 바와 같이 시판되고 있다. 본 발명에 따르면, 감염된 CEFs의 배양은 기본 이글 배지 세포 배양 배지 (인비트로겐사)에서 수행된다. 감염된 CEFs는 바람직하게 1 및 6일 사이, 더욱 바람직하게는 2 및 4일 사이 또한 보다 더 바람직하게는 3일 동안 배양된다. 감염된 CEFs는 37℃보다 낮은 온도, 바람직하게 30℃ 및 36.5℃ 사이의 온도에서 배양된다.

단계 d)의 하나 이상의 핵산분해효소 (예로, 엔도뉴클레아제 (endonuclease)또는 엑소뉴클레아제 (exonuclease))의 존재 시 배양은 용액에 존재하는 핵산 (예로, DNA; RNA)을 분해하기 위하여 수행된다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 핵산분해효소는 엔도뉴클레아제이다. 엔도뉴클레아제는 그들의 기질 (substrates)을 근거하여 다음과 같이 분류될 수 있다: DNA를 분해하는 데옥시리보뉴클레아제 (DNases); RNA를 분해하는 리보뉴클레아제 (RNases); DNA 및 RNA를 분해하는 엔도뉴클레아제. 엔도뉴클레아제 DNase로는 이에 제한되는 것은 아니지만, DNase I, DNase II 및 엔도데옥시리보뉴클라제 IV를 포함한다. 엔도뉴클레아제 RNase로는 이에 제한되는 것은 아니지만, RNase I, RNase III, RNase E, RNase F 및 RNase P를 포함한다. DNA 및 RNA를 분해하는 엔도뉴클레아제로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 벤조나제

을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 단계 d)의 단계 c)에서 생산된 오르토폭스바이러스를 배양하는 것은 벤조나제

의 존재 시 수행된다. 벤조나제

은 특정한 뉴클레오타이드 간의 내부 포스포디에스테르 결합을 가수분해하여 핵산(예로, DNA; RNA)을 분해한다. 완전히 소화되고 나면, 용액에 존재하는 자유 핵산 모두 (예로, DNA; RNA)는 5'-모노포스페이트 말단을 가지는 3 내지 8개의 염기 길이로 된 올리고뉴클레오타이드로 환원된다. 벤조나제

은 단백질분해 활성이 전혀 없다. 본 발명에 따라 사용되는 벤조나제

은 약제학적으로 허용가능한 것이 바람직하다. 약제학적으로 허용가능한 벤조나제

는 시판되고 있다 (예로, 제품번호 ME-0280-10 하로 유로젠텍사 (Eurogentec); 예로 제품번호 1.01653.0001 하로 머크사).

본 발명에 따른 핵산분해효소(들)의 작용을 위한 바람직한 조건은 (실시예 1에서 기술된 바와 같음):

- pH는 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되고, 더욱 바람직하게는 pH 8.0이며;

- Mg² ⁺ 및 Mn² ⁺으로부터 선택된 보조인자 (cofactors), 바람직하게는 Mg² ⁺이고 농도는 1 내지 2 mM의 범위이며, 바람직하게는 2 mM이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 핵산분해효소(들)은 22℃ 및 28℃ 사이에 포함되는 온도에서, 바람직하게는 23℃ 및 27℃ 사이에 포함되는 온도에서, 더욱 바람직하게는 24℃ 및 26℃ 사이에 포함되는 온도에서, 보다 더 바람직하게는 25℃의 온도에서 배양된다 (실시예 1에서 기술된 바와 같음). 본 구현예에서, 단계 d)의 지속시간 (duration)은 바람직하게 1 및 5시간 사이의 범위에 포함되고, 더욱 바람직하게는 2시간이다 (실시예 1에서 기술된 바와 같음).

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 핵산분해효소(들)은 2℃ 및 8℃ 사이에 포함되는 온도에서, 바람직하게는 3℃ 및 7℃ 사이에 포함되는 온도에서, 더욱 바람직하게는 4℃ 및 6℃ 사이에 포함되는 온도에서, 보다 더 바람직하게는 5℃의 온도에서 배양된다. 본 구현예에서, 단계 d)의 지속시간은 바람직하게 10 및 20시간 사이의 범위에 포함되고, 더욱 바람직하게 18시간이다.

본 발명에 따르면, 단계 d)에서 사용되는 핵산분해효소(들)의 농도는 5 내지 100 U/ml의 범위이고, 바람직하게는 5 내지 50 U/ml의 범위이며, 더욱 바람직하게는 10 U/ml이다. 도 1에서 나타난 바와 같이 놀랍게도, 50 U/ml 벤조나제

의 사용과 대비하여 10 U/ml 벤조나제

의 사용은 동일한 조건 하에서도 처리 2시간 이후에 DNA 농도의 동등한 감소를 유도한다 (온도 25℃; 2 mM Mg² ⁺; pH 8).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 d)는 더 나아가 하나 이상의 계면활성제 (detergents)의 첨가를 포함한다. 계면활성제로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 트윈, 트리톤 X-100 (노나에틸렌 글리콜 옥틸 페놀 에테르), 사포닌, SDS, 브리즈 96 (Brij 96), 폴리도-카놀 (Plido-canol), N-옥틸 β-D-글루코피라노사이드 및 소듐 카보네이트를 포함한다. 트윈은 이에 제한되는 것은 아니지만 트윈 20 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노로레이트), 트윈 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트) 및 트윈 85 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레이트)를 포함한다. 단계 d)에 사용되는 바람직한 트윈은 트윈 80이다. 본 발명에 따르면, 단계 d)에 사용되는 계면활성제의 농도는 10 내지 100 μg/L의 범위이고, 바람직하게는 10 내지 55 μg/L의 범위이다.

다음으로, 상기 생산되고 핵산분해효소(들)에 의해 미리 처리된 오르토폭스바이러스는 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 회수된다.

오르토폭스바이러스가 패키징 세포로부터 (예로, 패키징 세포로부터만, 또는 패키징 세포와 상청액으로부터) 회수될 때, 단계 e)에서는 패키징 세포의 막을 파괴하는 단계가 선행될 수 있다. 본 단계는 패키징 세포로부터 바이러스의 방출 (liberation)를 유발한다. 패키징 세포의 막 파괴는 당업자가 잘 숙지하고 있는 다양한 기법들에 의해 유도될 수 있다. 이들 기법으로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 냉동/해동 (freezing/thawing), 저장성 용해 (hypotonic lysis), 파쇄 (sonication) (파쇄기 (sonicator)를 사용하는 것에 의함) 및 미세액화 (microfluidization) (미세액화기 (microfluidizer)를 사용하는 것에 의함)을 포함한다. 파쇄기는 예로 헤레우스 PSP사 (Heraeus PSP), 바이올로직스사 (Biologics), 미소닉스사 (Misonix) 또는 글렌밀스사 (GlenMills)로부터 시판되고 있다. 본 발명에 따라 사용되는 바람직한 파쇄기는 소니튜브 (SONITUBE) 20 kHz 타입 SM 20-120-3, 소니튜브 36 kHz 타입 SM 35/3WU, 및 소니튜브 35 kHz 타입 SM 35-400-3 (헤레우스사 PSP)이다. 미세액화기는 예로 마이크로플루이딕스사 (Microfluidics Corporation)로부터 시판되고 있다. 또한 패키징 세포의 막은 SLM 아민코 프렌치 프레스기 (SLM Aminco French press)를 사용하여 파괴될 수 있다. 또한 패키징 세포의 막은 고속 균질화기 (high speed homogenizer)를 사용하여 파괴될 수 있다. 고속 균질화기는 예로 실버슨 머신사 (Siverson Machines) 또는 이카-라보테크닉사 (Ika-Labotechnik)로부터 시판되고 있다. 본 발명에 따라 사용되는 바람직한 고속 균질화기는 실버슨 L4R (SILVERSON L4R, 실버슨 머신사)이다. 패키징 세포의 막 파괴 이후에 획득된 혼합물은 더 나아가 패키징 세포로부터 방출된 핵산 (예로, DNA)이 미리 첨가된 핵산분해효소(들)에 의해 분해되도록 (단계 d)에서) 교반 (agitation)하면서 적어도 1시간 동안 배양될 수 있다. 따라서 본 발명의 특정한 구현예에서, 단계 e)에는:

1) 패키징 세포의 막을, 바람직하게는 고속 균질화기를 사용하여 또는 음파 파쇄 (sonication)에 의해 파괴하는 단계; 또한

2) 단계 1)에서 획득된 상기 혼합물을 단계 d)에서 먼저 첨가된 핵산분해효소(들)에 의해 패키징 세포로부터 방출된 핵산이 분해되도록 적어도 1시간 동안 배양하는 단계:가 선행된다.

본 발명에 따르면, 단계 2)의 지속시간은 바람직하게 1 및 5시간 사이에 포함되고, 더욱 바람직하게 2시간이다 (실시예 1에서 기술된 바와 같음).

본 발명에 따르면, 핵산분해효소(들) ((단계 d)에서 미리 첨가됨)은 단계 2) 동안 22℃ 및 28℃ 사이에 포함되는 온도에서, 바람직하게는 23℃ 및 27℃ 사이에 포함되는 온도에서, 더욱 바람직하게는 24℃ 및 26℃ 사이에 포함되는 온도에서, 보다 더 바람직하게는 25℃의 온도에서 배양된다 (실시예 1에서 기술된 바와 같음).

단계 f)의 단계 e)에서 회수된 오르토폭스바이러스에 단가 염의 첨가는 적합한 조건 하에서:

1) 핵산분해효소(들) 활성을 저해하고; 또한

2) 상기 오르토폭스바이러스가 단계 g)에서 음이온 교환 흡착제에 흡착되지 않도록, 예로 10% 이상의 오르토폭스바이러스가 음이온 교환 흡착제에 흡착되지 않도록; 허용한다. 결과적으로, 핵산 (예로, DNA)만이 단계 g)에서 음이온 교환 흡착제에 흡착될 것이다.

단가 염으로는 이에 제한되는 것은 아니지만, NaCl 및 KCl을 포함한다. 단계 f)에서 사용되는 바람직한 단가 염은 NaCl이다. 본 발명에 따르면, 단계 f)에서의 단가 염의 농도는 200 내지 300 mM의 범위이고, 바람직하게는 250 내지 300 mM의 범위이다. 본 발명에 따르면, 단계 f)는 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0에서 수행된다. 본 발명에 따르면, 단계 f)의 단계 e)에서 회수된 오르토폭스바이러스에 단가 염의 첨가는 pH 8.0에서 NaCl 250 mM 또는 더욱 바람직하게 300 mM 농도를 사용하는 실시예 1에 기술된 조건에 따라 수행된다.

단계 g)의 단계 f)에서 획득된 혼합물을 음이온 교환 흡착제와 접촉시키는 것은 적합한 조건 하에서 상기 혼합물에 포함된 핵산 (예로, DNA)의 포획을 허용한다. 오르토폭스바이러스는 단계 f)에서 수행된 처리로 인해 음이온 교환 흡착제에 포획되지 않는다.

본 발명에 따르면, 단계 g)는 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0에서 수행된다 (실시예 1에 기술된 바와 같음).

본 발명에 따르면, 단계 g)의 지속시간은 바람직하게 1 및 3시간 사이에 포함되고, 더욱 바람직하게 1시간이다 (실시예 1에서 기술된 바와 같음).

본 발명에 따르면, 단계 g)에서 사용되는 음이온 교환 흡착제의 기능적 그룹은 예를 들어 디메틸아미노에틸 (DMAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 트리메틸아미노에틸(TMAE), 트리에틸아미노에틸 (TEAE), 그룹 R-CH(OH)-CH2-N+-(CH₃)₃ (Q 그룹이라고도 명명됨; 스트림라인

레진 (Streamline

resins),파마시아사를 참고하라)와 같은 일차, 이차, 삼차 또는 사차 아미노 그룹 또한 pH 7.0 내지 9.0의 범위 이내에서 정식의 양전하를 이미 가지거나 가질 예를 들어 폴리에틸이민 (PEI)와 같은 기타 그룹이다. 단계 g)에서 사용되는 바람직한 음이온 교환 흡착제의 기능적 그룹은 예를 들어 디메틸아미노에틸 (DMAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 트리메틸아미노에틸(TMAE), 트리에틸아미노에틸 (TEAE)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 트리에틸아미노에틸 (TEAE)이다.

단계 g)에서 사용되는 음이온 교환 흡착제는 예로 비드-형성 매트릭스 또는 막으로 구성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 g)에서 사용되는 음이온 교환 흡착제는 비드-형성 매트릭스 (beads-formed matrix)로 구성된다. 매트릭스는 예로 아가로스, 친수성 고분자, 셀룰로스, 덱스트란 또는 실리카일 수 있다. 사슬 (예로, 덱스트란 사슬)은 결합되어 매트릭스로 된다. 기능적 그룹은 이전에 기술된 바와 같이 화학적으로 안정한 결합 (예로, 에스테르 결합)을 통하여 매트릭스에 결합된다. 바람직한 비드-형성 매트릭스의 기능적 그룹은 트리에틸아미노에틸 (TEAE)이다. 본 발명에 따르면, 비드-형성 매트릭스의 비드는 정화 단계 h)에 사용되는 필터의 공극 크기보다 큰 직경을 가진다. 따라서, 비드-형성 매트릭스의 비드는 바람직하게는 8 μm 이상의 직경, 더욱 바람직하게는 50 μm 및 150 μm 사이에 포함되는 직경, 더욱 바람직하게는 90 μm 및 120 μm 사이에 포함되는 직경, 보다 더 바람직하게는 120 μm의 직경을 가진다. 본 발명의 특징을 기초로 하여, 오르토폭스바이러스 (200 내지 300 nm의 직경을 가짐)는 정화 단계 h) 동안 필터의 공극 크기를 넘어 통과될 것이다 (예로, 오르토폭스바이러스는 유동물에서 회수될 것이다). 본 발명에 따라 사용되는 비드-형성 매트릭스로 구성된 음이온 교환 흡착제는 고압멸균 가능한 것 (autoclavable)이 바람직하다. 비드-형성 매트릭스로 구성된 고압멸균 가능한 음이온 교환 흡착제는 이미 기술되어 왔으며 이들의 일부는 예를 들어 우노스피어

Q (UNOsphere

Q, 바이오래드사), 우노스피어

S (UNOsphere

S, 바이오래드사), 스트림라인^TM Q 세파로스

XL (STREAMLINE^TM Q Sepharose

XL, 에머샴 바이오사이언스사), 스트림라인^TM SP 세파로스

XL (STREAMLINE^TM SP Sepharose

XL, 에머샴 바이오사이언스사) 또는 바이오세프라

Q 하이퍼Z (BioSepra

Q hyperZ, 팰사 (Pall Corporation))와 같이 시판되고 있다. 본 발명에 따라 비드-형성 매트릭스로 구성된 바람직한 고압멸균 가능한 음이온 교환 흡착제는 우노스피어

Q (바이오래드사)이다. 우노스피어

Q (바이오래드사)는 120 μm의 직경을 가지고 트리에틸아미노에틸 (TEAE)의 기능적 그룹을 보호하는 친수성 구형의 중합체로 된 비드로 구성된다. 단계 g)의 단계 f)에서 획득된 혼합물을 비드-형성 매트릭스로 구성된 음이온 교환 흡착제와 접촉시키는 것은 우노스피어

Q (바이오래드사)가 사용되는 실시예 1에 기술된 조건에 따라 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 단계 g)에서 사용되는 음이온 교환 흡착제는 막으로 구성된다. 막의 기능적 그룹은 앞서 기술된 바와 같을 수 있다. 바람직한 막의 기능적 그룹은 트리에틸아미노에틸 (TEAE)이다. 본 발명에 따르면, 막은 오르토폭스바이러스의 직경 (예로, 200 nm)보다 큰 공극 크기를 가진다. 따라서, 오르토바이러스는 유동물에서 회수될 것이다. 이러한 관점으로, 본 발명에 따른 막은 바람직하게 1 μm 및 5 μm 사이에 포함되는 공극 크기, 더욱 바람직하게는 3 μm의 공극 크기를 가진다. 본 발명에 따라 사용되는 막으로 구성된 음이온 교환 흡착제는 고압멸균 가능한 것이 바람직하다. 고압멸균 가능한 막으로 구성된 음이온 교환 흡착제는 이미 기술되어 왔으며 이들의 일부는 예를 들어 사토바인드

75 Q (Sartobind

75 Q, 사토리우스사), 쿠노 폴리넷^TM (CUNO PolyNet^TM) 필터들 (예로, 폴리넷^TM PB P010, P020, P030, P050), 쿠노 베타퓨어^TM (CUNO Betapure^TM) 필터들 (예로, 베타퓨어^TM Z13-020, Z13-030, Z13-050)과 같이 시판되고 있다. 본 발명에 따른 막으로 구성된 바람직한 고압멸균 가능한 음이온 교환 흡착제는 사토바인드

75 Q (사토리우스사)이다.

단계 g)가 막으로 된 음이온 교환 흡착제를 사용하여 수행될 때, 다음의 단계 h)의 정화 과정 (세포성 잔재물의 제거를 허용함)은 요구되지 않는다. 세포성 잔재물은 1 μm 및 5 μm 사이에 포함되는 공극 크기, 더욱 바람직하게는 3 μm의 공극 크기를 가지는 막에 의해 보유되었다.

단계 h)의 단계 g)에서 획득된 혼합물의 정화는 적합한 조건 하에서 세포성 잔재물의 제거를 허용한다. 본 발명에 따르면, 단계 h)의 정화 과정은 예로 심층 여과 (depth filtration)에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 심층 여과는 이에 제한되는 것은 아니지만, 사토리우스사 (Sartorius)로부터 나온 사토퓨어

(Sartopure

) 필터들 (예로, 사토퓨어

PP2), 쿠노사 (CUNO)가 만든 AP 시리즈 심층 필터들 (예로, AP01), 쿠노가 만든 CP 시리즈 심층 필터들 (예로, CP10, CP30, CP50, CP60, CP70, CP90), 쿠노사가 만든 HP 시리즈 심층 필터들 (예로, HP10, HP30, HP50, HP60, HP70, HP90), 쿠노사가 만든 칼리프. (Calif.) 시리즈 심층 필터들 (예로, CA10, CA30, CA50, CA60, CA70, CA90), 쿠노사가 만든 SP 시리즈 심층 필터들 (예로, SP10, SP30, SP50, SP60, SP70, SP90), 쿠노 드리피드 (CUNO Delipid) 및 드리피드 플러스 (Delipid Plus) 필터들, 밀리포어사가 만든 CE 시리즈 심층 필터들 (예로, CE15, CE20, CE25, CE30, CE35, CE40, CE45, CE50, CE70, CE75), 밀리포어사가 만든 DE 시리즈 심층 필터들 (예로, DE25, DE30, DE35, DE40, DE45, DE50, DE55, DE60, DE65, DE70, DE75), 밀리포어사가 만든 HC 필터들 (예로, A1HC, B1HC, COHC), 쿠노 폴리넷^TM (PolyNet^TM) 필터들 (예로, 폴리넷^TM PB P050, P100, P200, P300, P400, P500, P700), 밀리포어 클라리가드 (Clarigard) 및 폴리가드 (Polygard) 필터들, 쿠노 라이프 어슈어 (CUNO Life Assure) 필터들, 만셀 어소시에이트사 (ManCel Associates) 심층 필터들 (예로, PR 12 UP, PR12, PR5 UP); 및 필사 (PALL) 또는 세이츠쉔크사 (SeitzSchenk)가 만든 필터와 같은 하나 이상의 시판되는 제품들의 사용을 포함한다. 입수가능한 심층 여과 유닛의 정화 능력을 향상시키기 위하여, 공극 크기를 감소시키면서 둘 이상의 유닛을 결합하는 것이 유용할 수 있다. 본 구현예에서, 정화될 혼합물은 가장 큰 오염물을 보유하는 첫 번째의 심층 여과 유닛을 통해 통과하고 이어서 두 번째의 심층 여과 유닛을 통해 통과한다. 본 관점으로 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 h)의 정화는 심층 여과에 의해 수행되고, 5 μm의 공극 크기를 가지는 필터와 결합된 8 μm의 공극 크기를 가지는 필터를 통하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 사용되는 8 μm 및 5 μm의 공극 크기들을 가지는 바람직한 필터는 사토리우스사로부터 시판되는 사토퓨어

필터 (Sartopure

PP2)이다. 심층 여과는 적어도 1 L/분의 유속으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 1 L/분의 유속으로 수행된다. 본 발명에 따르면, 단계 h)는 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0에서 수행된다. 단계 h)의 단계 g)에서 획득된 혼합물의 정화는 정화 과정이 5 μm의 공극 크기를 가지는 필터와 결합된 8 μm의 공극 크기를 가지는 필터를 통하는 심층 여과에 의해 1 L/분의 유속으로 수행되는 실시예 1에 기술된 조건에 따라 수행되는 것이 바람직하다.

오르토폭스바이러스 (200 내지 300 nm의 직경을 가짐)은 정화 단계 h) 동안 필터의 공극 크기를 통해 통과될 것이다. 결과적으로, 오르토폭스바이러스는 유동물에서 회수된다.

단계 i)의 음이온 교환 흡착제를 단가 염을 포함하는 용액으로 세척하는 것은 적합한 조건 하에서 유동물에 남아있는 오르토폭스바이러스를 회수하는 것을 허용한다. 단가 염으로는 이에 제한되는 것은 아니지만, NaCl 및 KCl을 포함한다. 단계 i)에서 사용되는 바람직한 단가 염은 NaCl이다. 본 발명에 따르면, 단계 i)에서 사용되는 단가 염의 농도는 200 내지 300 mM의 범위이고, 바람직하게는 250 내지 300 mM의 범위이다. 본 발명에 따르면, 단계 i)는 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0에서 수행된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 i)에서의 단가 염을 포함하는 용액은 생리학적 삼투압 농도 (osmolarity) (290 mOsm/kg)(예로, SO8 완충용액)로 100 mM 트리스-HCl, 슈크로스 5% (w/v), 10 mM 소듐 글루타메이트 및 50 mM NaCl, pH 8.0을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 용액이다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 단계 i)에서의 단가 염을 포함하는 용액은 예를 들어 트리스 완충용액, 트리에탄올아민 완충용액 또는 포스페이트 완충용액을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 용액이다. 단계 i)의 음이온 교환 흡착제를 단가 염을 포함하는 용액으로 세척하는 것은 NaCl 250 mM, 또는 더욱 바람직하게 300 mM을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 완충용액 S08으로 세척 과정이 수행되는 실시예 1에서 기술된 조건에 따라 수행되는 것이 바람직하다.

단계 j)의 단계 h)에서 획득된 유동물 및 단계 i)에서 획득된 유동물의 농축은 상기 유동물 분획들에 존재하는 단백질의 제거를 허용한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 농축 단계 j)는 미세여과 (microfiltration)에 의해 수행된다. 미세여과는 큰 분자를 농축하고 정제하는, 압력으로 추진되는 막 공정 (membrane process)이다. 보다 상세하게, 용액은 공극 크기가 보유물 (retentate)에서 오르토폭스바이러스를 거부하도록 선택되었던 공극 크기를 가지는 필터를 통해 통과하고 작은 분자 (예로, 단백질)가 필터를 넘어 투과물 (permeate) 내로 통과되도록 한다. 미세여과는 추출 용액의 부피를 감소시킨다. 따라서 본 관점으로, 미세여과는 0.2 μm 이하의 공극 크기, 바람직하게는 0.09 및 0.15 μm 사이에 포함되는 공극 크기, 더욱 바람직하게는 0.1 μm의 공극 크기를 가지는 필터들을 사용하여 수행된다. 본 발명에 따라 사용된 필터로는 고압멸균 가능한 것이 바람직하다. 단계 j)에서 사용되는 고압멸균가능한 필터는 예를 들어 프로스탁 미세여과 모듈 (Prostak Microfiltration Modules, 밀리포어사)과 같이 시판되고 있고, 프로스탁 미세여과 모듈로는 PSVVAG021, PSVVAG041, 및 SK2P12E1이 바람직하다. 단계 j)의 단계 h)에서 획득된 유동물 및 단계 i)에서 획득된 유동물의 농축은 0.1 μm의 공극 크기를 가지는 필터를 넘어 농축 과정이 수행되는 실시예 1에서 기술된 조건에 따라 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 농축 단계 j)는 초여과 (ultrafiltration)에 의해 수행된다. 본 발명에 따르면, 초여과는 교차-유동 여과 (cross-flow filtration)인 것이 바람직하다. 교차-유동 여과의 원리는 당업자에게 알려져 있다 (예로, Richards, G. P. and Goldmintz, D., J. Virol. Methods (1982) 4(3), 페이지 147-153. "접종된 굴 조직의 균질물로부터 폴리오바이러스의 추출을 위한 교차-유동 여과 기법의 평가"를 참조하라).

단계 k)의 단계 j)에서 획득된 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획 (예로, 농축 단계 k)가 미세여과 또는 초여과에 의해 수행되었을 때의 보유물)의 투과여과(diafiltration)는 미세여과를 개선시킨 것이고 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획을 용액으로 희석하여 상기 분획에서 불순물의 농도를 감소시키도록 작용한다. 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획의 희석은 상기 분획으로부터 불순물을 세척해내도록 한다. 투석여과는 회분식 양식 (batch mode), 반-연속식 양식 (semi-continuous mode), 또는 연속식 양식 (continuous mode)으로 수행될 수 있는 것으로 이해된다. 유익하게는, 투석여과 단계 k)는 바이러스가 포함되는 완충용액을 교환하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 정제 과정에 사용되는 완충용액을 약제학적으로 허용가능한 완충용액으로 교환하는 것이 유용할 수 있다. 본 발명에 따라, 미세여과는 0.2 μm 이하의 공극 크기, 바람직하게는 0.09 및 0.15 μm 사이에 포함되는 공극 크기, 더욱 바람직하게는 0.1 μm의 공극 크기를 가지는 필터들을 사용하여 수행된다. 본 발명에 따라 사용된 필터로는 고압멸균 가능한 것이 바람직하다. 단계 k)에서 사용되는 고압멸균가능한 필터는 예를 들어 프로스탁 미세여과 모듈 (Prostak Microfiltration Modules, 밀리포어사)과 같이 시판되고 있고, 프로스탁 미세여과 모듈로는 PSVVAG021, PSVVAG041, 및 SK2P12E1이 바람직하다. 단계 k)의 단계 j)에서 획득된 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획의 투과여과는 0.1 μm의 공극 크기를 가지는 필터를 넘어 수행되는 실시예 1에서 기술된 조건에 따라 수행되는 것이 바람직하다.

유익하게는, 단계 j)의 농축 및 단계 k)의 투과여과는 동일한 유형의 필터들을 사용하여 시행될 수 있다.

본 발명의 본 방법 A는 상기에 더하여:

1) 젤 여과의 단계 (예로, 단계 l)); 또한

2) 투과여과의 단계 (예로, 단계 m));를 포함할 수 있다.

젤 여과 단계 (예로, 단계 l)): 본 발명에 따르면, 단계 k)에서 획득된 시료는 3 및 160 μm 사이, 유익하게는 80 및 160 μm 사이, 바람직하게는 40 및 105 μm 사이, 더욱 바람직하게는 25 및 75 μm 사이, 더욱 바람직하게는 20 및 80 μm 사이, 보다 더 바람직하게는 20 및 60 μm 사이에 포함되는 직경을 가지는 비드를 포함하는 고체 지지체 (solid support) 상에서 처리된다. 본 발명에 따르면, 상기 지지체는 오르토폭스바이러스의 직경 (예로 200 내지 300 nm)에 근접한 공극도 (porosity)를 가지고, 그 결과 후자는 비드 내로 침투하지 못한다. 한편, 크기가 더 작은 분자는 비드 내로 침투하고 그의 이동이 느려진다. 단계 l)의 젤 여과에서 사용되는 지지체로는 예로 아가로스, 덱스트란, 아크릴아마이드, 실리카, 에틸렌 글리콜/메타아크릴레이트 공중합체, 또는 예를 들어 아가로스 및 덱스트란의 혼합물과 같은 그들의 혼합물을 기초로 할 수 있다. 본 발명에 따르면, 지지체는 기능적 그룹이 없이 사용되는 것이 바람직하다. 젤 여과 크로마토그래피 지지체는 예를 들어:

- 에틸렌 글리콜/메타아크릴레이트 젤 여과 크로마토그래피 지지체 (예로, 20 및 60 μm 사이에 포함되는 비드 직경을 가지는 토요펄

HW 55 (Toyopearl

HW 55), 토요펄

HW 65 및 토요펄

HW 75, 토소하스 (Tosohaas));

- 아릴 덱스트란/메틸렌 비스아크릴아마이드 젤 여과 크로마토그래피 지지체 (예로, 25 및 75 μm 사이에 포함되는 비드 직경을 가지는 세파크릴^TM S300 HR; 25 및 75 μm 사이에 포함되는 비드 직경을 가지는 세파크릴^TM S400 HR; 25 및 75 μm 사이에 포함되는 비드 직경을 가지는 세파크릴^TM S500 HR; 40 및 105 μm 사이에 포함되는 비드 직경을 가지는 세파크릴^TM S1000 SF, 모두 파마시아사로부터 나옴);

- N-아크릴아미노하이드록시프로판디올 젤 여과 크로마토그래피 지지체 (예로, 80 및 160 μm 사이에 포함되는 비드 직경을 가지는 트리스아크릴 (Trisacryl), 바이오세프라 (Biosepra));

- 아가로스 젤 여과 크로마토그래피 지지체 (예로, 20 및 80 μm 사이에 포함되는 비드 직경을 가지는 마크로-프렙 SE (Macro-Prep SE);와 같이 시판되고 있다.

에틸렌 글리콜/메타아크릴레이트 젤 여과 크로마토그래피 지지체 (예로, 20 및 60 μm 사이에 포함되는 비드 직경을 가지는 토요펄

HW 55, 토요펄

HW 65 및 토요펄

HW 75, 토소하스)가 바람직하다.

본 발명에 따른 단계 l)의 젤 여과를 위한 바람직한 조건은:

- NaCl 및 KCl로부터 선택되는 단가 염, 바람직하게는 단가 염 NaCl의 농도는 200 mM 내지 2 M의 범위이고, 바람직하게는 200 mM 내지 1 M의 범위이고, 더욱 바람직하게는 500 mM이고;

- pH는 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0이다.

단계 m)의 투과여과는 단계 k)의 투과여과에서 앞서 기술된 바와 같은 수단 및 조건에 의해 수행된다.

본 발명에 따르면, 앞서 기술된 방법 A의 단계 f)로부터 단계 l)까지의 각 단계는 하나 이상의 안정화제의 존재 시 오르토폭스바이러스를 포함하는 시료를 배양하는 단계보다 선행될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, "안정화제 (stabilizers)"는 오르토폭스바이러스의 보존 (preservation)을 허용하는 제제를 말한다. 안정화제는 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카라이드류 (예로, 슈크로스 (sucrose), 트레할로스 (trehalose), 소르보스 (sorbose), 멜레지토스 (melezitose), 소비톨 (sorbitol), 스타키오스 (stachyose), 라피노스(raffinose), 과당 (fructose), 만노스 (mannose), 말토스 (maltose), 락토스 (lactose), 아라비스 (arabinose), 자일로스 (xylose), 리보스 (ribose), 람노스 (rhamnose), 갈락토스 (galactose), 포도당 (glucose), 만니톨 (manntol), 자일리톨 (xylitol), 에리트리톨 (erythritol), 트레이톨 (threitol), 소비톨 (sorbitol), 글리세롤 (glycerol)), 아미노산들 (예로, 글리신; 루이신; 라이신; 아스파라진; 발린; 글루타민), 계면활성제들 (예로, 트리톤 X-100; 예를 들어 트윈 20, 트윈 80 또는 트윈 85와 같은 트윈) 및 염들 (예로, NaCl; KCl)을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 단계의 배양에 사용되는 안정화제는 사카라이드류이고 더욱 바람직하게는 사카로스 (saccharose)이다. 본 발명에 따르면, 본 단계의 배양에서 사용되는 사카로스의 농도는 25 내지 100 g/L의 범위이고, 바람직하게는 50 g/L이다. 본 발명에 따르면, 안정화제(들)은 생리학적 삼투압 농도 (osmolarity) (290 mOsm/kg)(예로, SO8 완충용액)로 100 mM 트리스-HCl, 슈크로스 5% (w/v), 10 mM 소듐 글루타메이트 및 50 mM NaCl, pH 8.0을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 용액으로 구성되는 용액에 포함될 수 있다. 본 발명에 따르면, 안정화제(들)은 예를 들어 트리스 완충용액, 트리에탄올아민 완충용액 또는 포스페이트 완충용액을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 용액으로 구성되는 용액에 포함될 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 단계의 안정화제 존재 시의 배양은 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0에서 수행된다. 본 발명에 따르면, 본 단계의 안정화제 존재 시의 배양의 지속시간은 1시간 및 20시간 사이에 포함되고 더욱 바람직하게는 18시간이다. 본 발명에 따르면, 본 단계의 안정화제 존재 시의 배양은 온도 2 및 8℃ 사이, 바람직하게 3℃ 및 7℃ 사이, 더욱 바람직하게 4℃ 및 6℃ 사이에 포함되는 온도에서, 보다 더 바람직하게는 온도 5℃에서 수행된다. 본 단계의 안정화제 존재 시의 배양은 실시예 1에 기술된 바와 같이 50 g/L 사카로스의 존재 시 18시간 동안 온도 5℃에서 수행되는 것이 바람직하다.

앞서 기술된 바와 같이 본 발명의 방법 A의 또 다른 구현예에 따르면, 정화 단계 (단계 h))가 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 나온 오르토폭스바이러스를 회수하는 단계 e) 이후에 수행된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 단계 f)의 단계 e)에서 회수된 오르토폭스바이러스에 핵산분해효소(들) 활성을 저해하고 단계 g)에서 음이온 교환 흡착제에 상기 오르토폭스바이러스의 흡착을 피하는 적합한 조건 하에서 단가 염의 첨가 과정이 수행되지 않는다.

따라서 본 관점으로, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스를 생산하고 정제하는 방법 (예로, 방법 B)에 관한 것이다:

a') 패키징 세포의 배양을 준비하고;

b') 상기 패키징 세포 배양을 오르토폭스바이러스로 감염시키고;

c') 상기 감염된 패키징 세포를 자손 오르토폭스바이러스가 생산될 때까지 배양하고;

d') 하나 이상의 핵산분해효소의 존재 시 배양하고;

e') 상기 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 오르토폭스바이러스를 회수하고;

f') 단계 e')에서 회수된 상기 오르토폭스바이러스를 1) 핵산분해효소(들) 활성을 저해할 수 있는 하나 이상의 제제, 및 임의적으로 2) 하나 이상의 안정화제 (stabilizers)의 존재 시 배양하고;

g') 단계 f')에서 획득된 상기 혼합물을 상기 오르토폭스바이러스 및 핵산의 포획을 허용하도록 적합한 조건 하에서 음이온 교환 흡착제와 접촉시키고;

h') 단계 g')에서 획득된 상기 혼합물을 세포성 잔재물의 배출을 허용하는 적합한 조건 하에서 정화하고;

i') 상기 오르토폭스바이러스를 단가 염을 포함하는 용액으로 용출시키고;

j') 단계 i')에서 획득된 상기 혼합물을 농축하고;

k') 단계 j')에서 획득된 상기 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획을 투과 여과한다.

단계 a')의 패키징 세포의 배양 준비는 앞서 기술된 바와 같이 단계 a)의 패키징 세포의 배양 준비를 말한다.

단계 b')의 오르토폭스바이러스로 패키징 세포 배양의 감염은 앞서 기술된 바와 같이 단계 b)의 오르토폭스바이러스로 패키징 세포 배양의 감염을 말한다.

단계 c')의 자손 오르토폭스바이러스가 생산될 때까지 감염된 패키징 세포의 배양은 앞서 기술된 바와 같이 단계 c)의 자손 오르토폭스바이러스가 생산될 때까지 감염된 세포의 배양을 말한다.

단계 d')의 하나 이상의 핵산분해효소의 존재 시의 배양은 앞서 기술된 바와 같이 단계 d)의 하나 이상의 핵산분해효소의 존재 시의 배양을 말한다.

단계 e')의 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 오르토폭스바이러스를 회수하는 것은 앞서 기술된 바와 같이 단계 e)의 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 오르토폭스바이러스를 회수하는 것을 말한다.

다음으로 단계 e')에서 회수된 오르토폭스바이러스는:

1) 핵산분해효소(들) 활성을 저해할 수 있는 하나 이상의 제제, 및 임의적으로 2) 하나 이상의 안정화제 존재 시 배양된다.

핵산분해효소 활성을 저해할 수 있는 제제들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 킬레이팅 제제들 (예로, 에틸렌디아민 테트라아세테이트 (EDTA); 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트 (DTPA); 니트릴로트리아세테이트 (NTA)), 단가 염들 (예로, NaCl 또는 KCl), 단백질분해효소, 포스페이트, 단가 양이온들 (예로, Na⁺, Li⁺, K⁺, Ag⁺), 구아니딘 하이드로클로라이드 및 암모니움 설페이트를 포함한다. 예로, EDTA, DTPA 또는 NTA와 같은 킬레이팅 제제는 이전에 기술된 바와 같이 핵산분해효소(들) 활성을 위한 필수적 보조인자 (cofactors)를 구성하는 금속 이온들 (예로, Mg²⁺; Mn² ⁺)을 제거한다. 단가 염들 (예로, NaCl 또는 KCl)은 50 및 150 mM 사이에 포함되는 농도, 바람직하게는 약 100 nM에서 핵산분해효소의 불활성화 (inactivation)를 유발한다. 포스페이트 및/또는 단가 양이온들 (예로, Na⁺, Li⁺, K⁺, Ag⁺)은 약 100 mM 또는 그 초과의 농도에서 핵산분해효소의 불활성화를 유발한다. 구아니딘 하이드로클로라이드 및 암모니움 설페이트는 100 mM 초과의 농도에서 핵산분해효소의 불활성화를 유발한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 f')에서 핵산분해효소를 저해할 수 있는 제제는 킬레이팅 제제이고, 더욱 바람직하게는 에틸렌디아민 테트라아세테이트 (EDTA)이다. 본 발명에 따르면, 단계 f')에서 사용된 EDTA의 농도는 5 내지 20 mM의 범위이고 바람직하게는 10 mM이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 단계 f')에서 핵산분해효소를 저해할 수 있는 제제는 단가 염이고, 바람직하게는 NaCl이며, 더욱 바람직하게는 100 mM의 NaCl이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 단계 f')에서 핵산분해효소를 저해할 수 있는 제제는 단가 염 및 킬레이팅 제제이고, 바람직하게는 NaCl 및 EDTA 이며, 더욱 바람직하게는 100 mM NaCl 및 10 mM EDTA이다 (실시예 4에 기술된 바와 같음).

본 발명에 따르면, 단계 f')는 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0에서 수행된다.

본 발명에 따르면, 단계 f')은 온도 2 및 8℃ 사이, 바람직하게 3 및 7℃ 사이, 더욱 바람직하게 4 및 6℃ 사이에 포함되는 온도에서, 보다 더 바람직하게는 온도 5℃에서 수행된다. 본 발명에 따르면, 단계 f')의 지속시간은 5분 및 20시간 사이에 포함된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 f')의 지속시간은 2 및 20시간 사이에 포함되고 더욱 바람직하게는 18시간이다. 본 구현예에서, 단계 e')에서 획득된 오르토폭스바이러스도 역시 핵산분해효소(들) 활성을 제해할 수 있는 제제에 추가하여 (앞서 기술된 바와 같음) 하나 이상의 안정화제 존재 시 배양된다. "안정화제 (stabilizers)"는 상기 단계 f')에서 핵산분해효소(들) 활성을 저해할 수 있는 제제(들)로 처리하는 동안 오르토폭스바이러스의 보존을 허용하는 단계 f)에서의 제제를 말한다. 안정화제는 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카라이드류 (예로, 슈크로스, 트레할로스, 소르보스, 멜레지토스, 소비톨, 스타키오스, 라피노스, 과당, 만노스, 말토스, 락토스, 아라비스, 자일로스, 리보스, 람노스, 갈락토스, 포도당, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 소비톨, 글리세롤), 아미노산들 (예로, 글리신; 루이신; 라이신; 아스파라진; 발린; 글루타민), 계면활성제들 (예로, 트리톤 X-100; 예를 들어 트윈 20, 트윈 80 또는 트윈 85와 같은 트윈) 및 염들 (예로, NaCl; KCl)을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 f')에서 사용되는 안정화제는 사카라이드류이고 더욱 바람직하게는 사카로스이다. 본 발명에 따르면, 단계 f')에서 사용되는 사카로스의 농도는 25 내지 100 g/L의 범위이고, 바람직하게는 50 g/L이다. 본 발명에 따르면, 안정화제(들)은 생리학적 삼투압 농도 (290 mOsm/kg)(예로, SO8 완충용액)로 100 mM 트리스-HCl, 슈크로스 5% (w/v), 10 mM 소듐 글루타메이트 및 50 mM NaCl, pH 8.0을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 용액으로 구성되는 용액에 포함될 수 있다. 본 발명에 따르면, 안정화제(들)은 예를 들어 트리스 완충용액, 트리에탄올아민 완충용액 또는 포스페이트 완충용액을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 용액으로 구성되는 용액에 포함될 수 있다.

단계 g')의 음이온 교환 흡착제로 단계 f')에서 획득된 혼합물의 접촉은 적합한 조건 하에서 상기 혼합물에 포함된 상기 오르토폭스바이러스 및 핵산 (예로, DNA)의 포획을 허용한다.

본 발명에 따르면, 단계 g')는 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0에서 수행된다 (실시예 4에서 기술된 바와 같음).

본 발명에 따르면, 단계 g')의 지속시간은 바람직하게 1 및 3시간 사이에 포함되고 더욱 바람직하게는 1시간이다 (실시예 4에서 기술된 바와 같음).

본 발명에 따르면, 단계 g')에서 사용되는 음이온 교환 흡착제의 기능적 그룹은 예를 들어 디메틸아미노에틸 (DMAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 트리메틸아미노에틸(TMAE), 트리에틸아미노에틸 (TEAE), 그룹 R-CH(OH)-CH2-N+-(CH₃)₃ (Q 그룹이라고도 명명됨; 스트림라인

레진, 파마시아사를 참고하라)와 같은 일차, 이차, 삼차 또는 사차 아미노 그룹 또한 pH 7.0 내지 9.0의 범위 이내에서 정식의 양전하를 이미 가지거나 가질 예를 들어 폴리에틸이민 (PEI)와 같은 기타 그룹이다. 단계 g')에서 사용되는 바람직한 음이온 교환 흡착제의 기능적 그룹은 예를 들어 디메틸아미노에틸 (DMAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 트리메틸아미노에틸(TMAE), 트리에틸아미노에틸 (TEAE)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 트리에틸아미노에틸 (TEAE)이다.

단계 g')에서 사용되는 음이온 교환 흡착제는 예로 비드-형성 매트릭스 또는 막 (membrane)으로 구성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 g')에서 사용되는 음이온 교환 흡착제는 비드-형성 매트릭스로 구성된다. 매트릭스는 예로 아가로스, 친수성 고분자, 셀룰로스, 덱스트란 또는 실리카일 수 있다. 사슬 (예로, 덱스트란 사슬)은 결합하여 매트릭스로 된다. 기능적 그룹은 이전에 기술된 바와 같이 화학적으로 안정한 결합 (예로, 에스테르 결합)을 통하여 매트릭스에 결합된다. 바람직한 비드-형성 매트릭스의 기능적 그룹은 트리에틸아미노에틸 (TEAE)이다. 본 발명에 따르면, 비드-형성 매트릭스의 비드는 정화 단계 h')에 사용되는 필터의 공극 크기보다 큰 직경을 가진다. 따라서, 비드-형성 매트릭스의 비드는 바람직하게 8 μm 이상의 직경, 더욱 바람직하게는 50 μm 및 150 μm 사이에 포함되는 직경, 더욱 바람직하게는 90 μm 및 120 μm 사이에 포함되는 직경, 보다 더 바람직하게는 120 μm의 직경을 가진다. 본 발명의 특징을 기초로 하여, 오르토폭스바이러스를 보호하는 비드-형성 매트릭스의 비드는 정화 단계 h') 동안 필터뿐만 아니라 세포성 잔재물에 의해 보호될 것이다. 본 발명에 따라 사용되는 비드-형성 매트릭스로 구성된 음이온 교환 흡착제는 고압멸균 가능한 것이 바람직하다. 비드-형성 매트릭스로 구성된 고압멸균 가능한 음이온 교환 흡착제는 이미 기술되어 왔으며 이들의 일부는 예를 들어 우노스피어

Q (바이오래드사), 우노스피어

S (바이오래드사), 스트림라인^TM Q 세파로스

XL (에머샴 바이오사이언스사), 스트림라인^TM SP 세파로스

XL (에머샴 바이오사이언스사) 또는 바이오세프라

Q 하이퍼Z (팰사)와 같이 시판되고 있다. 본 발명에 따라 비드-형성 매트릭스로 구성된 바람직한 고압멸균 가능한 음이온 교환 흡착제는 우노스피어

Q (바이오래드사) 및 바이오세프라

Q 하이퍼Z (팰사)이다. 우노스피어

Q (바이오래드사)는 120 μm의 직경을 가지고 트리에틸아미노에틸 (TEAE) 기능적 그룹을 보호하는 친수성 구형의 중합체로 된 비드로 구성된다. 바이오세프라

Q 하이퍼Z (팰사)는 약 75 μm의 직경을 가지고 사차 아민 Q 기능적 그룹을 보호하는 매우 진한 공극성 (highly dense and porous) 지르코늄 디옥사이드 비드로 구성된다. 단계 g')의 단계 f')에서 획득된 혼합물을 비드-형성 매트릭스로 구성된 음이온 교환 흡착제와 접촉시키는 것은 바이오세프라

Q 하이퍼Z (팰사, Pall corporation)가 사용되는 실시예 4에 기술된 조건에 따라 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 단계 g')에서 사용되는 음이온 교환 흡착제는 막으로 구성된다. 막의 기능적 그룹은 앞서 기술된 바와 같을 수 있다. 바람직한 막의 기능적 그룹은 트리에틸아미노에틸 (TEAE)이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 g')에서 사용되는 막은 1 및 5 μm 사이에 포함되는 공극 크기, 바람직하게는 3 μm의 공극 크기를 가진다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 g')에서 사용되는 막은 오르토폭스바이러스의 직경 (예로, 200 nm)보다 작은 공극 크기를 가지고 더욱 바람직하게는 0.1 μm의 공극 크기를 가진다. 막으로 구성된 많은 음이온 교환 흡착제들이 이미 기술되어 왔으며 이들의 일부는 예를 들어 사토바인드

75 Q (사토리우스사)와 같이 시판되고 있다. 본 발명에 따라 사용되는 막으로 구성된 음이온 교환 흡착제는 고압멸균 가능한 것이 바람직하다. 고압멸균 가능한 음이온 교환 흡착제들이 이미 기술되어 왔으며 이들의 일부는 예를 들어 사토바인드

75 Q (사토리우스사)와 같이 시판되고 있다. 본 발명에 따라 막으로 구성된 바람직한 고압멸균 가능한 음이온 교환 흡착제는 사토바인드

75 Q (사토리우스사)이다.

단계 g')가 음이온 교환 막으로 된 음이온 교환 흡착제를 사용하여 수행될 때, 다음의 단계 h')의 정화 (세포성 잔재물의 제거를 허용함)는 요구되지 않는다. 세포성 잔재물은 단계 f')에서 사용되는 음이온 교환 막 (앞서 기술된 바와 같음)에 의해 보유되었다.

단계 h')의 단계 g)에서 획득된 혼합물의 정화는 앞서 기술된 바와 같이 단계 g)에서 획득된 혼합물의 정화를 말한다.

본 발명에 따른 바람직한 구현예에 따르면, 단계 g')가 비드-형성 매트릭스가 되는 음이온 교환 흡착제를 사용하여 수행될 때, 단계 h')는 오르토폭스바이러스를 보호하는 상기 비드-형성 매트릭스의 제거를 허용하는 단계보다 선행될 수 있다. 따라서 본 관점으로, 상기 단계는 예로 비드-형성 매트릭스의 비드 크기보다 작은 공극 크기를 가지는 필터 백 (filter bags)을 사용하여 수행된다. 본 발명에 따르면, 필터 백의 공극 크기는 10 및 100 μm 사이, 바람직하게는 25 및 100 μm 사이에 포함되고, 더욱 바람직하게는 50 μm이다. 본 발명에 따라 사용되는 필터 백은 고압멸균 가능한 것이 바람직하다. 고압멸균 가능한 필터 백은 이미 기술되어 왔고 이들의 일부는 예를 들어 쿠노^TM 펠트 필터 백 (CUNO^TM Felt Filter Bags, 쿠노사)와 같이 시판되고 있으며, 폴리에스테르 펠트 필터 백 (예로, NB EES 0010, 0025, 0050, 0100), 폴리에스테르/폴리프로필렌 펠트 필터 백 (예로, NB PES 0010, 0025, 0050, 0100) 및 나일론 모노필라멘트 펠트 필터 백 (예로, NB NYS 0025, 0050, 0100)이 바람직하다.

단계 i')의 단가 염을 포함하는 용액으로 오르토폭스바이러스의 용출은 음이온 교환 흡착제로부터 포획된 오르토폭스바이러스를 회수하는 것을 허용한다. 사용되는 단가 염으로는 이에 제한되는 것은 아니지만, NaCl 및 KCl을 포함한다. 단계 i')에서 사용되는 바람직한 단가 염은 NaCl이다. 본 발명의 한 가지 구현예에 따르면, 용출은 바람직하게 0으로부터 2.5 M까지의 범위, 더욱 바람직하게는 0으로부터 2 M까지, 보다 더 바람직하게는 0으로부터 1.5 M까지의 범위를 가지는 단가 염 농도 구배의 증가에 의해 수행된다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 용출과정은 단일 염의 농도가 1 M 미만, 바람직하게는 300 내지 750 mM의 범위에 포함되고 더욱 바람직하게는 500 mM인 단가 염의 농도에서 단일-단계 용출에 의해 수행된다. 본 발명에 따르면, 단계 i')는 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0에서 수행된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 i')에서 단가 염을 포함하는 용액은 생리학적 삼투압 농도 (290 mOsm/kg)(예로, SO8 완충용액)로 100 mM 트리스-HCl, 슈크로스 5% (w/v), 10 mM 소듐 글루타메이트 및 50 mM NaCl, pH 8.0을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 용액이다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 단계 i')에서 단가 염을 포함하는 용액은 예를 들어 트리스 완충용액, 트리에탄올아민 완충용액 또는 포스페이트 완충용액을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 용액이다. 단계 i')의 단가 염을 포함하는 용액으로 오르토폭스바이러스의 용출은 S08 완충용액에 녹인 NaCl 농도 구배의 증가 (300 mM; 400 mM; 500 mM)에 의해 시행되는 실시예 4에서 기술된 조건에 따라 수행되는 것이 바람직하다.

단계 j')의 단계 i')에서 획득된 혼합물의 농축은 상기 유동물 분획들에 존재하는 단백질의 제거를 허용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 농축 단계 j)는 미세여과 (microfiltration)에 의해 수행된다 (단계 j)에서 앞서 기술된 바와 같음).

본 발명의 바람직한 구현예에서, 농축 단계 j)는 초여과 (ultrafiltration)에 의해 수행된다 (단계 j)에서 앞서 기술된 바와 같음).

단계 k')의 단계 j')에서 획득된 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획의 투과여과 (diafiltration)는 앞서 기술된 바와 같이 단계 k)의 단계 j)에서 획득된 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획을 투과여과하는 것을 말한다.

본 발명의 본 방법 B는 상기에 더하여:

1) 젤 여과의 단계 (예로, 단계 l')); 및

2) 투과여과의 단계 (예로, 단계 m'));를 포함할 수 있다.

단계 l')의 젤 여과는 단계 l)의 젤 여과를 말한다.

단계 m')의 투과여과는 단계 m')의 투과여과를 말한다.

본 발명에 따르면, 앞서 기술된 방법 B의 단계 f')로부터 단계 l')까지의 각 단계는 하나 이상의 안정화제의 존재 시 오르토폭스바이러스를 포함하는 시료를 배양하는 단계보다 선행될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, "안정화제"는 오르토폭스바이러스의 보존을 허용하는 제제를 말한다. 안정화제로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카라이드류 (예로, 슈크로스, 트레할로스, 소르보스, 멜레지토스, 소비톨, 스타키오스, 라피노스, 과당, 만노스, 말토스, 락토스, 아라비스, 자일로스, 리보스, 람노스, 갈락토스, 포도당, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 소비톨, 글리세롤), 아미노산들 (예로, 글리신; 루이신; 라이신; 아스파라진; 발린; 글루타민), 계면활성제들 (예로, 트리톤 X-100; 예를 들어 트윈 20, 트윈 80 또는 트윈 85와 같은 트윈) 및 염들 (예로, NaCl; KCl)을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 단계의 배양에 사용되는 안정화제는 사카라이드류이고 더욱 바람직하게는 사카로스이다. 본 발명에 따르면, 본 단계의 배양에서 사용되는 사카로스의 농도는 25 내지 100 g/L의 범위이고, 바람직하게는 50 g/L이다. 본 발명에 따르면, 안정화제(들)은 생리학적 삼투압 농도 (290 mOsm/kg)(예로, SO8 완충용액)로 100 mM 트리스-HCl, 슈크로스 5% (w/v), 10 mM 소듐 글루타메이트 및 50 mM NaCl, pH 8.0을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 용액으로 구성되는 용액에 포함될 수 있다. 본 발명에 따르면, 안정화제(들)은 예를 들어 트리스 완충용액, 트리에탄올아민 완충용액 또는 포스페이트 완충용액을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 용액으로 구성되는 용액에 포함될 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 단계의 안정화제 존재 시의 배양은 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0에서 수행된다. 본 발명에 따르면, 본 단계의 안정화제 존재 시의 배양의 지속시간은 1시간 및 20시간 사이에 포함되고 더욱 바람직하게는 18시간이다. 본 발명에 따르면, 본 단계의 안정화제 존재 시의 배양은 온도 2℃ 및 8℃ 사이, 바람직하게 3℃ 및 7℃ 사이, 더욱 바람직하게 4℃ 및 6℃ 사이에 포함되는 온도에서, 보다 더 바람직하게는 온도 5℃에서 수행된다. 본 단계의 안정화제 존재 시의 배양은 50 g/L 사카로스의 존재 시 18시간 동안 온도 5℃에서 수행되는 것이 바람직하다.

앞서 기술된 바와 같이 본 발명의 방법 B의 또 다른 구현예에 따르면, 정화 단계 (단계 h'))는 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 나온 오르토폭스바이러스를 회수하는 단계 e') 이후에 수행된다.

또한 본 발명은 앞서 기술될 바와 같은 방법 A의 단계(들) 및 방법 B의 단계(들)을 조합시키는 방법에 관한 것이다.

상세하게는 본 관점으로, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스를 생산하고 정제하는 방법 (예로, 방법 C)에 관한 것이다:

a") 패키징 세포의 배양을 준비하고;

b") 상기 패키징 세포 배양을 오르토폭스바이러스로 감염시키고;

c") 상기 감염된 패키징 세포를 자손 오르토폭스바이러스가 생산될 때까지 배양시키고;

d") 하나 이상의 핵산분해효소의 존재 시 배양하고;

e") 상기 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 오르토폭스바이러스를 회수하고;

f") 단계 e")에서 회수된 상기 오르토폭스바이러스를 1) 핵산분해효소(들) 활성을 저해할 수 있는 하나 이상의 제제, 및 임의적으로 2) 하나 이상의 안정화제의 존재 시 배양하고;

g") 단계 f")에서 획득된 상기 혼합물을 상기 오르토폭스바이러스 및 핵산의 포획을 허용하도록 적합한 조건 하에서 음이온 교환 흡착제와 접촉시키고;

h") 단계 g")에서 획득된 상기 혼합물을 세포성 잔재물의 배출을 허용하는 적합한 조건 하에서 정화하고;

i") 상기 오르토폭스바이러스를 단가 염을 포함하는 용액으로 용출시키고;

j") 단계 k")에서 상기 오르토폭스바이러스의 음이온 교환 흡착제에 흡착을 피하도록 단계 i")에서 획득된 상기 혼합물을 농축하고;

k") 단계 j")에서 획득된 상기 혼합물을 핵산의 포획을 허용하도록 적합한 조건 하에서 음이온 교환 흡착제와 접촉시키고;

l") 상기 음이온 교환 흡착제를 상기 유동물에 남아있는 오르토폭스바이러스를 회수하도록 적합한 조건 하에서 단가 염을 포함하는 용액으로 세척하고;

m") 단계 l")에서 획득된 상기 유동물을 농축하고;

n") 단계 m")에서 획득된 상기 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획을 투과 여과한다.

단계 a")의 패키징 세포의 배양 준비는 앞서 기술된 바와 같이 단계 a)의 패키징 세포의 배양 준비를 말한다.

단계 b")의 오르토폭스바이러스로 패키징 세포 배양의 감염은 앞서 기술된 바와 같이 단계 b)의 오르토폭스바이러스로 패키징 세포 배양의 감염을 말한다.

단계 c")의 자손 오르토폭스바이러스가 생산될 때까지 감염된 패키징 세포의 배양은 앞서 기술된 바와 같이 단계 c)의 자손 오르토폭스바이러스가 생산될 때까지 감염된 세포의 배양을 말한다.

단계 d")의 하나 이상의 핵산분해효소 존재 시의 배양은 앞서 기술된 바와 같이 단계 d)의 하나 이상의 핵산분해효소의 존재 시의 배양을 말한다.

단계 e")의 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 오르토폭스바이러스를 회수하는 것은 앞서 기술된 바와 같이 단계 e)의 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 오르토폭스바이러스를 회수하는 것을 말한다.

단계 f")의 단계 e")에서 회수된 상기 오르토폭스바이러스의 1) 핵산분해효소(들) 활성을 저해할 수 있는 하나 이상의 제제, 및 임의적으로 2) 하나 이상의 안정화제의 존재 시 배양은 앞서 기술된 바와 같이 단계 f')의 단계 e')에서 회수된 상기 오르토폭스바이러스의 1) 핵산분해효소(들) 활성을 저해할 수 있는 하나 이상의 제제, 및 임의적으로 2) 하나 이상의 안정화제의 존재 시 배양을 말한다.

단계 g")의 단계 f")에서 획득된 혼합물을 상기 오르토폭스바이러스 및 핵산의 포획을 허용하도록 적합한 조건 하에서 음이온 교환 흡착제와 접촉시키는 것은 상기에서 기술된 바와 같이 단계 g')의 단계 f')에서 획득된 혼합물을 상기 오르토폭스바이러스 및 핵산의 포획을 허용하도록 적합한 조건 하에서 음이온 교환 흡착제와 접촉시키는 것을 말한다.

단계 h")의 단계 g")에서 획득된 혼합물의 정화는 앞서 기술된 바와 같이 단계 h)의 단계 g)에서 획득된 혼합물의 정화를 말한다.

단계 i")의 단가 염을 포함하는 용액으로 오르토폭스바이러스의 용출은 앞서 기술된 바와 같이 단계 i')의 단가 염을 포함하는 용액으로 오르토폭스바이러스의 용출을 말한다.

단계 j")의 단계 i")에서 먼저 용출된 오르토폭스바이러스에 단가 염의 첨가는 적합한 조건 하에서 단계 k")에서 음이온 교환 흡착제에 상기 오르토폭스바이러스의 흡착을 피하도록 (예로, 음이온 교환 흡착제에 10% 이상의 오르토폭스바이러스의 흡착을 피하도록) 허용한다. 따라서, 단계 k")에서 핵산 (예로, DNA)만이 음이온 교환 흡착제에 흡착될 것이다. 단가 염으로는 이에 제한되는 것은 아니지만, NaCl 및 KCl을 포함한다. 단계 j')에서 사용되는 바람직한 단가 염은 NaCl이다. 본 발명에 따르면, 단계 j")에서 단가 염의 농도는 200 내지 300 mM, 바람직하게는 250 내지 300 mM의 범위에 포함된다. 본 발명에 따르면, 단계 j")는 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0에서 수행된다.

단계 k")의 단계 j")에서 획득된 혼합물의 핵산의 포획을 허용하도록 적합한 조건 하에서 음이온 교환 흡착제와 접촉은 앞서 기술된 바와 같이 단계 g)의 단계 f)에서 획득된 혼합물의 핵산의 포획을 허용하도록 적합한 조건 하에서 음이온 교환 흡착제와 접촉을 말한다.

단계 l")의 음이온 교환 흡착제를 유동물에 남아있는 오르토폭스바이러스를 회수하도록 적합한 조건 하에서 단가 염을 포함하는 용액으로 세척하는 것은 앞서 기술된 바와 같이 단계 i)의 음이온 교환 흡착제를 유동물에 남아있는 오르토폭스바이러스를 회수하도록 적합한 조건 하에서 단가 염을 포함하는 용액으로 세척하는 것을 말한다.

단계 m")의 단계 l")에서 획득된 유동물의 농축은 상기 유동물 분획들에 존재하는 단백질의 제거를 허용한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 농축 단계 j)는 미세여과에 의해 수행된다 (단계 j)에서 앞서 기술된 바와 같음). 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 농축 단계 j)는 초여과에 의해 수행된다 (단계 j)에서 앞서 기술된 바와 같음).

단계 n")의 단계 m")에서 획득된 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획의 투과여과는 앞서 기술된 바와 같이 단계 k)의 단계 j)에서 획득된 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획을 투과여과하는 것을 말한다.

본 발명의 본 방법 C는 상기에 더하여:

1) 젤 여과의 단계 (예로, 단계 o")); 및

2) 투과여과의 단계 (예로, 단계 p"));를 포함할 수 있다.

단계 o") 젤 여과는 단계 l)의 젤 여과를 말한다.

단계 p") 투과여과는 단계 m')의 투과여과를 말한다.

본 발명에 따르면, 앞서 기술된 방법 C의 단계 f")로부터 단계 p")까지의 각 단계 (또한 바람직하게는 단계 k")로부터 단계 p")까지의 각 단계)는 하나 이상의 안정화제의 존재 시 오르토폭스바이러스를 포함하는 시료를 배양하는 단계보다 선행될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, "안정화제"는 오르토폭스바이러스의 보존을 허용하는 제제를 말한다. 안정화제로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카라이드류 (예로, 슈크로스, 트레할로스, 소르보스, 멜레지토스, 소비톨, 스타키오스, 라피노스, 과당, 만노스, 말토스, 락토스, 아라비스, 자일로스, 리보스, 람노스, 갈락토스, 포도당, 만니톨, 자일리톨, 에리트리올, 트레이톨, 소비톨, 글리세롤), 아미노산들 (예로, 글리신; 루이신; 라이신; 아스파라진; 발린; 글루타민), 계면활성제들 (예로, 트리톤 X-100; 예를 들어 트윈 20, 트윈 80 또는 트윈 85와 같은 트윈) 및 염들 (예로, NaCl; KCl)을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 단계의 배양에 사용되는 안정화제는 사카라이드류이고 더욱 바람직하게는 사카로스이다. 본 발명에 따르면, 본 단계의 배양에서 사용되는 사카로스의 농도는 25 내지 100 g/L의 범위이고, 바람직하게는 50 g/L이다. 본 발명에 따르면, 안정화제(들)은 생리학적 삼투압 농도 (290 mOsm/kg)(예로, SO8 완충용액)로 100 mM 트리스-HCl, 슈크로스 5% (w/v), 10 mM 소듐 글루타메이트 및 50 mM NaCl, pH 8.0을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 용액으로 구성되는 용액에 포함될 수 있다. 본 발명에 따르면, 안정화제(들)은 예를 들어 트리스 완충용액, 트리에탄올아민 완충용액 또는 포스페이트 완충용액을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 용액으로 구성되는 용액에 포함될 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 단계의 안정화제 존재 시의 배양은 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0에서 수행된다. 본 발명에 따르면, 본 단계의 안정화제 존재 시의 배양의 지속시간은 1시간 및 20시간 사이에 포함되고 더욱 바람직하게는 18시간이다. 본 발명에 따르면, 본 단계의 안정화제 존재 시의 배양은 온도 2℃ 및 8℃ 사이, 바람직하게 3℃ 및 7℃ 사이, 더욱 바람직하게 4℃ 및 6℃ 사이에 포함되는 온도에서, 보다 더 바람직하게는 온도 5℃에서 수행된다. 본 단계의 안정화제 존재 시의 배양은 50 g/L 사카로스의 존재 시 18시간 동안 온도 5℃에서 수행되는 것이 바람직하다.

앞서 기술된 바와 같은 본 발명의 방법 C의 또 다른 구현예에 따르면, 정화 단계 (단계 h"))는 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 나온 오르토폭스바이러스를 회수하는 단계 e") 이후에 수행된다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 방법의 각 단계 이후에 획득되는 오르토폭스바이러스를 포함하는 시료는 당업자에게 잘 알려진 냉동 (freezing)에 의해 보존될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 방법은 pH 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되는 pH, 더욱 바람직하게는 pH 8.0에서 수행된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 오르토폭스바이러스는 백시니아 바이러스 (VV)이다. 본 발명에 따른 바람직한 VV는 예를 들어 특허출원 제 PCT/EP2008/009720호 (결함성 I4L 및/또는 F4L 유전자(들)을 포함하는 VV를 기술하고 있는 국제특허출원 제 WO2009/065546호) 또는 특허출원 제 PCT/EP2008/009721호 (결함성 F2L 유전자를 포함하는 VV를 기술하고 있는 국제특허출원 제 WO2009/065547호)에 기술된 바와 같은 VV이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 오르토폭스바이러스는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)이다. 본 발명에 따른 바람직한 MVA는 국립 미생물 배양 기탁기관 (CNCM)에 기탁번호 제 N^O I-721호, MVA 575 (ECACC 제 V00120707호) 및 제 MVA-BN호 (ECACC 제 V0083008호)하로 기탁된 바와 같은 MVA이다.

용어 "재조합 오르토폭스바이러스 (recombinant Orthopoxvirus)"는 그의 게놈 내에 삽입된 외인성 서열을 포함하는 오르토폭스바이러스를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 외인성 서열 (exogenous sequence)은 부모 오르토폭스바이러스에는 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 말한다.

한 가지 구현예에서, 외인성 서열은 직접적 또는 간접적 세포독성 (cytotoxic) 기능을 가지는 분자를 인코드한다. "직접적 또는 간접적인 (directly or indirectly)" 세포독성에 의하여, 우리는 외인성 서열에 의해 인코드되는 분자 자체가 독성일 수 있고 (예를 들어 리신 (ricin), 종양괴사인자 (TNF), 인터루킨-2 (IL-2), 인터페론-감마 (IFNγ), 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 슈도모나스 엑소톡신 A) 또는 이것이 대사되어 독성 산물을 형성할 수 있거나, 이것이 독성 산물을 형성하는 그 외 다른 것에 작용할 수 있는 점을 의미한다. 리신 cDNA의 서열은 램 등에 기재되어 있다 (Lamb et al., Eur J. Biochem., 1985, 148: 265-270).

본 발명의 바람직한 구현예에서, 외인성 서열은 자살 유전자 (suicide gene)이다. 자살 유전자는 비교적 비-독성인 프로드러그 (prodrug)을 독성 약물로 전환시킬 수 있는 단백질을 인코드한다. 예를 들어, 효소 사이토신 디아미나제 (cytosine deaminase)는 5-플루오로사이토신 (5FC)를 5-플루오로우라실 (5FU)로 전환시킨다 (Mullen et al. (1922) PNAS 89, 33); 허피스 심플렉스 효소 티미딘 키나제는 세포를 항바이러스제 갱시클로비르 (gangciclovir, GCV) 또는 아시클로비르 (aciclovir)로의 처리에 대해 민감해지도록 만든다 (Moolten (1986) Cancer Res. 46, 5276; Ezzedine et al. (1991) New Biol. 3, 608). 또한 생물체라면 모두의, 예를 들어 대장균 (E. coli) 또는 사카로마이세스 세레비시아애 (Saccharomyces cerevisiae)의 사이토신 디아미나제가 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, 자살 유전자는 사이토신 디아미나제 활성을 가지는 단백질, 더욱 바람직하게는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있는 국제특허출원들 제 WO 99/54481호, 제 WO 05/07857호, 제 PCT/EP2008/009720호 및 제 PCT/EP2008/009721호에 기재된 FCU1 단백질 또는 FCU1-8 단백질을 인코드한다.

본 관점으로, 본 발명의 방법에 따라 생산된 바람직한 재조합 오르토폭스바이러스는:

- TG4023이라고도 불리는 MVA-FCU1 (국제특허출원 제 WO 99/54481호를 참조하라);

- MVA-FCU1-8 (국제특허출원 제 WO 05/07857호를 참조하라); 및

- 상기 VV가 보다 상세하게는 결함성 I4L 및/또는 F4L 유전자를 포함하는 VV-FCU1 (국제특허출원 제 PCT/EP2008/009720호, 제 WO2009/065546호 및 국제특허출원 제 PCT/EP2008/009721/WO2009/065547호를 참조하라);이다.

프로-드러그/효소 조합들의 다른 예로는 백쇼우 등에 의해 기재된 것들 (Bagshowe et al., 국제특허출원 제 WO 88/07378호), 즉 다양한 알킬화제들 및 슈도모나스 종 (Pseudomonas spp.)의 CPG2 효소, 또한 에페네토스 등에 의해 기재된 것들 (Epenetos & Rowlinson-Busza, 국제특허출원 제 WO 91/11201호), 즉 시안생성 (cyanogenic) 프로-드러그들 (예를 들어 아미그달린 (amygdalin)) 및 식물-유래 베타-글루코시다제를 포함한다. 본 발명의 구현예에서 유용한 효소는 이에 제한되는 것은 아니지만, 포스페이트-포함하는 프로드러그를 자유 약물로 전환하는 데 유용한 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatae); 설페이트-포함하는 프로드러그를 자유 약물로 전환하는 데 유용한 아릴설파타제 (arylsulfatase); 펩타이드-포함하는 프로드러그를 자유 약물로 전환하는 데 유용한 세라티아 단백질분해효소 (serratia protease), 써모라이신 (thermolysin), 섭틸리신 (subtilisin), 카복시펩티다제 (carboxypeptidase) 및 카텝신 (cathepsins)(카텝신 B 및 L과 같음)과 같은 단백질분해효소; D-아미노산 치환물을 포함하는 프로드러그를 전환하는 데 유용한 D-알라닐카복시펩티다제 (D-alanylcarboxypeptidases); 당화된 프로드러그를 자유 약물로 전환하는 데 유용한 베타-갈락토시다제 (beta-galactosidase) 및 뉴라미다제 (neuramidase)와 같은 탄수화물-절단하는 효소; 베타-락탐으로 유도체화된 약물을 자유 약물로 전환하는 데 유용한 베타-락타마제 (beta-lactamase); 또한 아민 질소들이 페노옥시아세틸 또는 페닐아세틸 그룹으로 각각 유도체화된 약물을 자유 약물로 전환하는 데 유용한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제 (penicillin amidase);를 포함한다. 대안으로, 당업자에게 어브자임 (abzymes)이라고도 알려진 효소적 활성을 가진 항체들이 본 발명의 프로드러그를 활성을 가진 자유 약물로 전환시키는 데 사용될 수 있다 (Massey R. et al., Nature 1987 328: 457-458). 유사하게, 프로드러그는 이에 제한되는 것은 아니지만, 상기-나열된 프로드러그류, 예로 포스페이트-포함하는 프로드러그, 티오포스페이트-포함하는 프로드러그, 설페이트-포함하는 프로드러그, 펩타이드-포함하는 프로드러그, D-아미노산-변형된 프로드러그, 당화 프로드러그, 베타-락탐-포함하는 프로드러그, 임의적으로 치환된 페노옥시아세트아마이드-포함하는 프로드러그 또는 임의적으로 치환된 페닐아세트아마이드-포함하는 프로드러그, 5-플루오로사이토신 및 기타 전환될 수 있는 5-플루오로우리딘 프로드러그를 포함한다. 본 발명에서사용되는, 프로드러그로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 에토포사이드 (etoposide), 테니포사이드 (teniposide), 아드리아마이신 (adriamycin), 다우노마이신 (daunomycin), 카미노마이신 (carminomycin), 아미노프테린 (aminopterin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 미토마이신 (mitomycin), 시스-플라티넘 (cis-platinum) 및 시스-플라티넘 유사체, 블레오마이신 (bleomycins), 에스페라미신 (esperamicins) (예를 들어 미국 특허 제 US 4,675,187호를 참조하라), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 멜팔란 (melphalan) 및 기타 관련 질소 머스타드류를 포함한다.

또한 다른 구현예에서, 외인성 유전자는 표적이 된 RNA 또는 DNA를 절단할 수 있는 리보자임 (ribozyme)을 인코드한다. 절단되는 표적이 된 RNA 또는 DNA는 세포의 기능에 필수적인 RNA 또는 DNA가 될 수 있고 그의 절단은 세포 사망을 초래하며, 또는 절단되는 RNA 또는 DNA는 원치 않는 단백질 예를 들어 종양원 유전자 (oncogene) 산물을 인코드하는 RNA 또는 DNA가 될 수 있고, 본 RNA 또는 DNA의 절단은 세포가 암화 (cancerous)되는 것을 막을 수 있다.

또한 보다 다른 구현예에서, 외인성 유전자는 안티센스 RNA를 인코드한다. "안티센스 RNA (antisense RNA)"에 의하여, 우리는 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자와 혼성화하여 이로부터의 발현을 간섭하거나, 세포 내에서 프리-mRNA, tRNA 또는 rRNA와 같은 또 다른 RNA와 혼성화하거나, 혼성화하여 유전자로부터 발현을 간섭하는 RNA 분자를 의미한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 외인성 서열은 표적 세포에서 결함성 유전자 (defective gene)의 기능을 대체한다. 인간을 포함하여 포유동물의 수천 가지의 유전되는 유전적 질환들이 존재하고, 이들은 결함성 유전자에 의해 유발된다. 이러한 유전적 질환들의 예로는 CFTR 유전자에 있는 돌연변이라고 알려진 낭포성 섬유종 (cystic fibrosis); 디스트로핀 (dystrophin) 유전자에 있는 돌연변이라고 알려진 듀첸 근육 위축증 (Duchenne muscular dystrophy); HbA 유전자에 있는 돌연변이라고 알려진 겸상 적혈구 빈혈 (sickle cell disease)을 포함한다. 많은 유형의 암들은 결함성 유전자들, 특히 원시종양원 유전자 (protooncogenes) 및 돌연변이 현상을 겪었던 종양-억제 유전자 (tumor-suppressor genes)에 의해 유발된다. 원시종양원 유전자의 예로는 ras, src, bcl 등을 들 수 있고; 종양-억제 유전자의 예로는 p53 및 Rb를 들 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 외인성 서열은 종양 관련 항원 (Tumor Associated Antigen, TAA)을 인코드한다. TAA는 동일한 조직 유형의 비-종양 세포들에서보다 종양 세포들에서 더 높은 빈도 또는 밀도로 검출되는 분자를 말한다. TAA의 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만, CEA, MART1, MAGE1, MAGE3, GP-100, MUC-1 (본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있는 국제특허출원 제 WO 92/07000호, 제 WO 95/09241호 및 Rochlitz et al., J. Gene Med. 2003 Aug; 5(8): 690-9를 참조하라), MUC-2, 점 돌연변이된 (point mutated) ras 종양원 유전자, 정상 또는 점 돌연변이된 p53, 과다발현된 p53, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, 티로시나제 (tyrosinase), TRP1, TRP2, NY-ESO-1, TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, 서바이빙 (surviving) 및 LRP를 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에 따르면, TAA는 MUC1이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 외인성 유전자는 항원을 인코드한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "항원 (antigen)"은 항체에 의해 결합될 수 있는 리간드를 말하고; 항원은 스스로 면역원성을 가질 (immunogenic) 필요는 없다. 바람직하게, 항원은 예를 들어 HIV-1, (gp 120 또는 gp160와 같음), 고양이 면역결핍 바이러스라면 모두, gD 또는 그의 유도체와 같은 인간 또는 동물 허피스 바이러스 또는 HSV1 또는 HSV2로부터 나온 ICP27와 같은 초기 단백질 (Immediate Early Protein), 사이토메갈로바이러스 (gB 또는 그의 유도체들과 같음), 배리셀라 조스터 바이러스 (Varicella Zoster Virus)(gpI, II 또는 III와 같음)와 같은 바이러스로부터 유래하거나, B형 간염 표면 항원 또는 그의 유도체와 같은 B형 간염 바이러스 (HBV), A형 간염 바이러스 (HAV), C형 간염 바이러스 (HCV; 국제특허출원 제 WO 04/111082호를 참조하라; 바람직하게는 유전형 1b ja 균주로부터 나온 비-구조적 HCV 단백질), 또한 E형 간염 바이러스 (HEV)와 같은 간염 바이러스로부터 유래하거나, 호흡기 합포체 바이러스 (Respiratory Syncytium Virus), 인간 파필로마 바이러스 (HPV; 국제특허출원 제 WO 90/10459호, 제 WO 95/09241호, 제 WO 98/04705호, 제 WO 99/03885호, 제 WO 07/21894호 및 제 WO 07/121894호를 참조하라; HPV16 균주로부터 나온 E6 및 E7 단백질이 바람직함; 또한 Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004 Oct 5; 101 Suppl. 2: 14567-71을 참조하라) 또는 인플루엔자 바이러스와 같은 다른 바이러스성 병원균들로부터 유래하거나, 살모넬라 (Salmonella), 나이세리아 (Neisseria), 보렐리아 (Borellia) (예를 들어, OspA 또는 OspB 또는 그들의 유도체들) 또는 클라미디아 (Chlamydia)와 같은 박테리아성 병원균들로부터 유래하거나, 보르드텔라 (Bordetella) 예를 들어 P.69, PT 및 FHA로부터 유래하거나, 플라스모듐 (Plasmodium) 또는 톡소플라스마 (Toxoplasma)와 같은 기생충들로부터 유래한다.

본 관점으로, 본 발명의 방법에 따라 생산된 바람직한 재조합 오르토폭스바이러스는 TG4040이라고도 불리는 MVA-HCV (국제특허출원 제 WO 04/111082호를 참조하라)이다.

재조합 오르토폭스바이러스는 하나 이상의 외인성 서열을 포함할 수 있고 각 외인성 서열은 하나 이상의 분자를 인코드할 수 있다. 예를 들어, 동일한 재조합 오르토폭스바이러스에서 예로 TAA (앞서 기술된 바와 같음) 또는 항원 (앞서 기술된 바와 같음)을 코딩하는 외인성 서열을 사이토카인 (예로, 인터루킨 (예를 들어 IL2와 같은 IL); 종양괴사인자 (TNF); 인터페론 (IFN); 콜로니 자극인자 (CSF))을 인코딩하는 외인성 서열과 연결하는 것이 유용할 수 있다.

본 관점으로, 본 발명에 따라 생산된 바람직한 재조합 오르토폭스바이러스는

- TG4040이라고도 불리는 MVA-[MUC1-IL2] (국제특허출원 제 WO 92/07000호 및 제 WO 95/09241호를 참조하라); 또한

- TG4001이라고도 불리는 MVA-[HPV-IL2] (국제특허출원 제 WO 90/10459호, 제 WO 95/09241호, 제 WO 98/04705호, 제 WO 99/03885호, 제 WO 07/121894호 및 제 WO 07/121894호를 참조하라):이다.

유익하게, 재조합 오르토폭스바이러스는 더 나아가 외인성 서열(들)의 발현에 필요한 요소 (elements)를 포함한다. 발현에 필요한 요소는 RNA로의 뉴클레오타이드 서열의 전사 및 폴리펩타이드로의 mRNA의 해독을 허용하는 한 벌의 요소, 상세하게는 세포가 본 발명의 재조합 오르토폭스바이러스에 의해 감염되는 데 효과적인 프로모터 서열 (promoter sequences) 및/또는 조절 서열 (regulatory sequences), 또한 임의적으로 세포의 표면에서 상기 폴리펩타이드의 분비 (excretion) 또는 발현을 허용하는 데 필요한 서열을 포함한다. 이들 요소는 유도가능 (inducible)하거나 전신 발현 (constitutive)될 수 있다. 물론, 프로모터는 선택되는 재조합 오르토폭스바이러스 및 숙주 세포에 따라 적용된다. 예로서, 백시니아 바이러스 프로모터 p7.5K pH5R, pK1L, p28, p11 또는 상기 프로모터들의 조합이 언급될 수 있다. 문헌은 이러한 프로모터 서열들에 관한 많은 양의 정보를 제공하고 있다. 또한, 필요한 요소로는 숙주세포에서 외인성 서열의 발현 또는 그의 유지 (maintenance)를 향상시키는 추가적인 요소들을 포함할 수 있다. 상세하게는, 인트론 서열 (intron sequences) (국제특허출원 제 WO 94/29471호), 분비 신호 서열 (secretion signal sequences), 핵 정착 서열 (nuclear localization sequences), IRES 타입의 해독 재개시 (reinitiation of translation)를 위한 내부 부위, 전사 종결을 위한 폴리 A 서열이 언급될 수 있다.

또한 본 발명은 약제학적 조성물로서, 바람직하게는 백신으로서 사용되는, 본 발명의 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바, "약제학적 조성물 (pharmaceutical composition)"은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 말한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 바람직하게는 등장성 (isotonic), 저장성 (hypotonic) 또는 약하게 고장성 (weakly hypertonic)이고, 예를 들어 슈크로스 용액과 같은 비교적 낮은 이온 강도를 가진다. 게다가, 이러한 담체는 용매, 또는 비발열성 (nonpyrogenic) 무균 물과 같은 수성 또는 부분적으로 수성 액체라면 모두를 포함할 수 있다. 또한, 약제학적 조성물의 pH는 생체내 (in vivo) 사용의 요구사항을 만족시키도록 조절되고 완충화된다. 또한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제, 아쥬반트 또는 부형제 뿐만 아니라 수용화, 안정화 및 보존 제제를 포함할 수 있다. 주사가능한 투여의 경우, 수성, 비수성 또는 저장성 용액에 녹인 제형물이 바람직하다. 적절한 희석제로 사용 시 재구성될 수 있는 액체 또는 건조 (파우더, 냉동저장물 (lyophilisate) 등) 형태로 단일 용량으로 또는 다중 용량으로 제공될 수 있다.

본 발명은 또한 암, 감염성 질환 및/또는 자가면역 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명의 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바, "암 (cancer)"은 이에 제한되는 것은 아니지만 폐암 (예로, 소세포 폐암종 및 비-소세포 폐암종), 기관지암, 식도암, 인두암, 머리와 목의 암 (예로, 후두암, 입술 암, 비강 및 부비동 암 (nasal cavity and paranasal sinus cancer) 및 목구멍 암), 구강암 (예로, 설암), 위장관 암 (예로, 위암), 소장암, 위창자 암, 결장암, 직장암, 결장직장 암, 항문 암, 간암, 췌장암, 뇨관 암, 방광암, 갑상샘암, 신장암, 암종 (carcinoma), 샘암종 (adenocarcinoma), 피부암 (예로, 멜라노마), 눈암 (예로, 망막모세포종), 뇌암 (예로, 신경교아종 (glioma), 속질모세포종 (medulloblastoma) 및 대뇌 별교아세포종 (cerebral astrocytoma)), 중추신경계 암, 림프종 (예로, 표피 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 호지킨 증후군 및 비-호지킨 림프종), 골암, 백혈병, 유방암, 생식관 암, 자궁경부 암 (예로, 자궁경부 내피 신생물종양), 자궁암 (예로, 자궁내막 암), 난소암, 질암, 외음부 암, 전립선암, 정소암을 말한다. 또한 "암 (cancers)"은 이에 제한되는 것은 아니지만 파필로마 바이러스-유도성 암종, 허피스 바이러스-유도성 종양, EBV-유도성 B-세포 림프종, B형 간염-유도성 종양, HTLV-1-유도성 림프종 및 HTLV-2-유도성 림프종을 포함하는 바이러스-유도성 종양들도 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "감염성 질환 (infectious disease)"은 감염성 생물에 의해 유발되는 질환이라면 모두를 말한다. 감염성 생물로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 바이러스 (예로, 단일가닥 RNA 바이러스, 단일가닥 DNA 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), A형, B형 및 C형 간염 바이러스, 허피스 심플렉스 바이러스 (HSV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 호흡기 합포체 바이러스 (RSV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 또는 인간 파필로마 바이러스 (HPV), 기생충 (예로, 플라스미디아 종, 리슈마니아 종, 스키그토조마 종 또는 트리파노조마 종과 같은 원생동물 및 후생동물 병원균), 박테리아 (예로, 마이코박테리아 상세하게는 M. 튜버쿨로시스, 살모넬라, 스트렙토코커스, 대장균 또는 스태필로코커스), 곰팡이 (예로, 칸디다 종 또는 아스퍼질러스 종), 뉴모시스티스 카리니, 및 프리온 (prions)을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "자가면역 장애 (autoimmune disorder)"는 두 가지의 일반적인 유형을 말한다: '전신성 자가면역 질환 (systemic autoimmune diseases)' (예로, 많은 기관들 또는 조직들에 손상을 주는 장애들), 및 '국소적 자가면역 질환 (localized autoimmune diseases)'. 그러나, '국소적 자가면역 질환'의 효과는 다른 몸의 기관들 및 계통들에 간접적으로 영향을 주는 것에 의해 전신적일 수 있다. '전신성 자가면역 질환'으로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 관절, 가능하게는 폐와 피부를 해칠 수 있는 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis); 피부, 관절, 신장, 심장, 뇌 적혈구뿐만 아니라 다른 조직들 및 기관들을 해칠 수 있는, 진신성 홍반 루프스 (systemic lupus erythematosus)를 포함하는 루프스; 피부, 소장 및 폐를 해칠 수 있는 피부경화증 (scleroderma); 침샘, 눈물샘 및 관절을 해칠 수 있는 스조렌 증후군 (Sjogren's syndrome); 폐 및 신장을 해칠 수 있는 굿파스처 증후군 (Goodpasture's syndrome); 동 (sinuses), 폐 및 신장을 해칠 수 있는 웨그너 육아종 (Wegener's granulomatosis); 큰 근육 그룹을 해칠 수 있는 류마티스성 다발성 근육통 (polymyagia rheumatica); 또한 머리와 목의 동맥을 해칠 수 있는 관자 동맥염/거대세포 동맥염 (temporal arteritis/giant cell arteritis)을 포함한다. ' 국소적 자가면역 질환'으로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 췌장 샘을 해치는 제 1형 당뇨병; 갑상샘을 해치는 하시모토 갑상샘염 (Hashimoto's thyroiditis) 및 그레이브 질환 (Graves' disease); 위창자 도관을 해치는 복강 질환 (celiac disease), 크론 질환 (Crohn's disease) 및 궤양성 대장염; 중추 신경계를 해치는 다발성 경화증 (multiple sclerosis, MS) 및 길레인-바르 증후군 (Guillain-Barre syndrome); 부신을 해치는 에디슨 질환 (Addison's disease); 간을 해치는 원발성 담도 경화증 (primary biliary sclerosis), 경화 담관염 (sclerosing cholangitis) 및 자가면역 간염; 또한 손가락, 발가락, 코, 귀를 해칠 수 있는 레이노드 현상 (Raynaud's phenomenon)을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스를 포함하는 약제학적 조성물, 바람직하게는 백신에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 암, 감염성 질환 및/또는 자가면역 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 것으로 의도된다.

본 발명은 또한 암, 감염성 질환 및/또는 자가면역 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 약제학적 조성물의 제조, 바람직하게는 백신의 제조에 사용되는 본 발명의 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 용도에 관한 것이다.

약제학적 조성물 및 상세하게는 백신은 통상적으로 국소적, 비경구적 또는 소화적 경로에 의한 투여를 위해 제조될 수 있다. 투여의 경로는 예를 들어 위내 (intragastric), 피하적 (subcutaneous), 심장내 (intracardiac), 근육내 (intramuscular), 정맥내 (intravenous), 복강내 (intraperitoneal), 종양내 (intratumor), 비강내 (intranasal), 호흡기내 (intrapulmonary) 또는 기관내 (intratracheal) 경로일 수 있다. 후자의 세 가지 구현예의 경우, 에어로졸 또는 점적주입 (instillation)이 유리하다. 투여는 단일 용량으로서 만들어지거나, 또는 한 번에 또는 소정의 시간 간격 이후에 여러 번 반복될 수 있다. 적절한 투여의 경로 및 용량은 다양한 변수들, 예를 들어 개인, 치료될 질환 또는 전달될 관심있는 유전자(들)의 함수로서 변화될 수 있다. 첫 번째 가능성에 따르면, 약제학적 조성물 상세하게는 백신은 생체내 (in vivo)에 (예를 들어, 접근가능한 종양 내 또는 그의 주변에 정맥내 주사에 의해, 치료적 또는 예방적 백신접종을 위해 피하적으로) 직접적으로 투여될 수 있다. 또한 환자로부터 세포 (골수 줄기세포, 말초혈액 림프구, 근육세포 등)를 수집하고, 이들을 선행기술의 기법에 따라 시험관내 (in vitro) 형질전환하거나 감염시키고, 이들을 환자에게 재투여하는 것으로 이루어진 생체내 (ex vivo) 접근법을 채택하는 것이 가능하다. 게다가, 적절하고 본 발명의 범위를 벗어남이 없는 경우에는 서로 다른 경로에 의해 약제학적 조성물 상세하게는 백신에 포함된 다양한 성분들의 동시적 또는 연속적인 투여를 수행하는 것을 착상하는 것도 가능하다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따른 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 생산에 사용되는 아나티대 과 (Anatidae family)에 속하는 조류 세포로부터 획득된 불멸화 조류 세포주의 용도에 관한 것이다. 아나티대과 중에서, 카이리나 (Cairina) 또는 아나스 (Anas) 속에 속하는 세포가 바람직하다. 카이리나 모스카타 (Cairina moschata)에 또는 아나스 플라티린코스 (Anas platyrhynchos) 종에 속하는 불멸화 조류 세포주는 보다 더 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주는 국제특허출원 제 WO 2007/077256호에 의해 기재된 텔로머라제 역전사효소 (TERT)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주이다. 상세하게는, 다음의 불멸화 조류 세포주가 바람직하다:

또한 본 관점으로, 본 발명은:

- 본 발명의 방법에 따른 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 생산에 사용되는 텔로머라제 역전사효소 (TERT)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주의 용도;

- 본 발명의 방법에 따른 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 생산에 사용되는 유럽 세포배양 기탁기관 (ECACC)에 기탁번호 제 08060502호 하로 기탁된 바와 같은 T3-17490 (실시예 2에 기술된 바와 같음) 또는 그의 유도체의 용도;

- 본 발명의 방법에 따른 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 생산에 사용되는 유럽 세포배양 기탁기관 (ECACC)에 기탁번호 제 08060501호 하로 기탁된 바와 같은 T6-17490 (실시예 3에 기술된 바와 같음) 또는 그의 유도체의 용도;에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주는 E1A 핵산 서열 및 국제특허출원 제 WO 2009/004016호에 의해 기재된 텔로머라제 역전사효소 (TERT)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주이다.

또한 본 관점으로, 본 발명은 본 발명의 방법에 따른 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 생산에 사용되는 E1A 핵산 서열 및 국제특허출원 제 WO 2009/004016호에 의해 기재된 텔로머라제 역전사효소 (TERT)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주의 용도에 관한 것이다.

본 출원 전부를 통해 사용되는 바, 기탁된 불멸화 조류 세포주의 "유도체 (derivative)"는 "관심 있는 물질 (substance of interest)"을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 불멸화 조류 세포주를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "관심 있는 물질"은 이에 제한되는 것은 아니지만, 약제학적으로 활성을 가진 단백질 예로 성장인자, 성장조절인자, 항체들, 항원들, 면역접종 또는 백신접종에 유용한 그들의 유도체들 등, 인터루킨, 인슐린, 에리트로포이에틴, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, 인터페론 (인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마), 혈액응고인자 (예로, 인자 VIII; 인자 IX; tPA) 또는 그의 조합들을 포함할 수 있다.

도 1은 벤조나제

엔도뉴클레아제 활성 (온도 25℃; Mg² ⁺2 mM; pH 8.0)에 미치는 다양한 벤조나제

농도들 (예로, 10 mM; 50 mM)의 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 T3-17490 (ECACC 제 08060502호) 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 (계대 39)의 광학현미경 영상을 나타낸 것이다.
도 3은 T3-17490 (ECACC 제 08060502호) 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주의 성장 곡선 (계대 7로부터 계대 75까지)을 나타낸 것이다.
도 4는 T3-17490 (ECACC 제 08060502호) 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주의 집단 배가시간의 진행과정 (계대 7로부터 계대 75까지)을 나타낸 것이다.
도 5는 T6-17490 (ECACC 제 08060501호) 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주 (계대 45)의 광학현미경 영상을 나타낸 것이다.
도 6은 T6-17490 (ECACC 제 08060501호) 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주의 성장 곡선 (계대 15로부터 계대 51까지)을 나타낸 것이다.
도 7은 T6-17490 (ECACC 제 08060501호) 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주의 집단 배가시간의 진행과정 (계대 15로부터 계대 51까지)을 나타낸 것이다.

본 발명을 설명하기 위하여, 다음의 실시예들이 제공된다. 본 실시예들은 어떠한 경우라도 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지는 않는다.

실시예들

실시예 1: 방법 A

단계 a): 패키징 세포의 배양을 준비하는 것.

66개의 SPF 달걀이 2% 포몰 용액에서 60초 동안 배양된다. 70% 에탄올로 헹구어낸 이후에, 달걀은 열리고, 배아는 추출되어 해부된다. 그 다음, 획득된 조직은 36.5℃에서 120분 동안 디스파제 (dispase, UI/ml) 및 트리플 셀렉트 (triple select, UI/ml)에 의해 소화된다. 혼합물은 소화되지 않은 조직을 제거하도록 여과되고 CEFs는 원심분리 (2,300 rpm, 15분)에 의해 수집된다. CEFs는 55 L의 VP-SFM (인비트로겐사)에 넣어 2일 동안 36.5℃에서 배양된다.

단계 b): 패키징 세포 배양을 오르토폭스바이러스로 감염시키는 것.

세포 배양 배지는 그 다음 제거되고 TG4010이라고도 불리는 MVA-[MUC1-IL2] (MOI 0.05) (국립 미생물 배양 기탁기관 (CNCM)에 기탁번호 제 N^O I-721호 하로 기탁된 MVA)가 55 L의 기본 이글 배지 (Basal Medium Eagle, 인비트로겐사)에 첨가된다.

단계 c): 감염된 패키징 세포를 자손 오르토폭스바이러스가 생산될 때까지 배양하는 것.

감염된 CEFs는 그 다음 3일 동안 36.5℃에서 배양된다.

단계 d): 하나 이상의 핵산분해효소의 존재 시 배양하는 것.

자손 MVA를 포함하는 감염된 CEFs는 그 다음 벤조나제

10 U/ml 또는 50 U/ml (머크사; 제품번호 1.01653.0001) 존재 시 다음의 조건 하에서 배양된다:

- 온도 25℃에서 교반하면서 2시간

- Mg² ⁺ 2 mM

- pH 8.0

단계 e): 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 오르토폭스바이러스를 회수하는 것.

세포 배양 배지 및 CEFs가 수집된다. 그 다음 혼합물은 실버슨

L4R 고속 균질화기 (실버슨사)를 사용하여 11 ml/분으로 15분 동안, 또는 소니튜브 36kHz 타입 SM 35/3WU (헤레우스사 PSP)를 사용하여 1,500 ml/분으로 75분 동안 균질화된다.

그 다음 획득된 혼합물은 온도 25℃ 및 pH 8.0에서 2시간 동안 교반하면서 배양된다.

단계 f): 단계 e)에서 회수된 오르토폭스바이러스에 핵산분해효소(들) 활성을 저해하고 상기 오르토폭스바이러스가 단계 g)에서 음이온 교환 흡착제에 흡착되지 않도록 적합한 조건 하에서 단가 염을 첨가하는 것.

획득된 혼합물은 그 다음 NaCl 250 mM 존재 시 pH 8.0에서 배양된다.

단계 g): 단계 f)에서 획득된 혼합물을 핵산의 포획을 허용하도록 적합한 조건 하에서 음이온 교환 흡착제와 접촉시키는 것.

획득된 혼합물은 그 다음 우노스피어

Q (바이오래드사)에 첨가된다. 우노스피어

Q (바이오래드사) 비드-형성 매트릭스는 먼저 무균 물로 세척된 다음 10 mM 트리스 완충용액 (pH 8.0)을 넣어 고압멸균되고 다음으로 250 mM 또는 300 mM NaCl 완충용액 (pH 8.0)을 사용하여 평형화된다.

그 다음 우노스피어

Q (바이오래드사) 비드-형성 매트릭스는 연동 작용하는 왓슨-마로우 펌프 (Watson-Marlow pump) (제품번호 323ES/4D, 520S; 왓슨-마로우사)를 사용하여 플렉스보이

백 (Flexboy

bag)(제품번호 FFB101961; 사토리우스 스테딤 바이오테크사)에 담겨있는 단계 f)에서 획득된 혼합물에 첨가된다.

우노스피어

Q (바이오래드사) 비드-형성 매트릭스 및 단계 f)에서 획득된 혼합물은 상온에서 (20℃ 내지 22℃) 느리게 교반하면서 1시간 동안 접촉하도록 나둔다.

단계 h): 단계 g)에서 획득된 혼합물을 세포성 잔재물의 배출을 허용하도록 적합한 조건 하에서 정화하는 것.

획득된 혼합물은 그 다음 사토리우스

PP2 5μm (사토리우스사)와 결합된 사토리우스

PP2 8μm (사토리우스사) 상에서 1 L/분의 유속으로 심층 여과에 의해 정화된다.

단계 i): 음이온 교환 흡착제를 유동물에 남아있는 오르토폭스바이러스를 회수하도록 적합한 조건 하에서 단가 염을 포함하는 용액으로 세척하는 것.

우노스피어

Q (바이오래드사)는 그 다음 연동 작용하는 왓슨-마로우 펌프 (Watson-Marlow pump) (제품번호 323ES/4D, 520S; 왓슨-마로우사)를 사용하여 S08 완충용액 (삼투압 농도 (290 mOsm/kg)로 10 mM 트리스-HCl; 5% 슈크로스 (w/v); 10 mM 소듐 글루타메이트; 50 mM NaCl; pH 8.0)에 녹인 250 mM 또는 300 mM NaCl로 세척된다.

그 다음 단계 h)에서 획득된 유동물 및 단계 i)에서 획득된 유동물은 최종 50 g/L의 사카로스 존재 시 하룻밤 (예로, 18시간) 동안 5℃에서 배양된다.

단계 j): 단계 h)에서 획득된 유동물 및 단계 i)에서 획득된 유동물을 농축하는 것.

단계 h)에서 획득된 유동물 및 단계 i)에서 획득된 유동물은 그 다음 0.1 μm 프로스탁 미세여과 모듈 (제품번호 PSVVAG021, 밀리포아사)을 통하여 18회 반복농축된다.

단계 k): 단계 j)에서 획득된 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획을 투과 여과하는 것.

보유물은 그 다음 동일한 모듈 예로, 0.1 μm 프로스탁 미세여과 모듈 (제품번호 PSVVAG021, 밀리포아사) 상에서 투과 여과된다

DNA의 정량은 퀀티-iT^TM 피코그린

dsDNA 분석 키트 (Quanti^TM-iT Picogreen

dsDNA Assay Kit, 카탈로그 번호 P7589, 인비트로겐사)를 사용하여 수행된다.

결과: 남아있는 DNA가 전혀 검출되지 않는다.

실시예 2: 본 발명의 방법에 따라 오르토폭스바이러스의 생산에 사용되는 T3-17490 불멸화 카이리나 모스카타 세포주 ( ECACC 에 기탁번호 제 08060502호 하로 기탁된 바와 같음)

T3-17490 세포 (계대 39)는 균질한 섬유모세포 유사 형태를 가진다 (도 2). 정적인 단일층 (static monolayer)은 100% 충만도 (confluence)까지 안정하고 밀착 저해 (contact inhibition)되어 있다. 세포는 마이코플라스마 오염에 대해 음성으로 또한 미생물 오염에 대해서도 마찬가지로 테스트되었다. T3-17490 세포주 성장 곡선 (계대 7로부터 계대 75까지) (도 3)은 계대 19로부터 계대 75까지 연속적인 지수적 성장기를 보여준다. 집단 배가 시간 (population doubling time, PDT)의 진행 과정에 초점을 맞추어, 점진적인 안정화 및 감소가 관찰된다. 상세하게는, PDT가 최근 10회의 계대 동안 48시간 표시 시점에서 안정화되는 것이 확인될 수 있다 (도 4). 해당하는 집단 배가의 횟수 (집단 배가 수준, PDL)가 2가지 지수적 성장기를 누적시켜서 계산되었다: 75 계대 동안 세포는 적어도 147번의 집단 배가 (PD)를 겪었다. 노화가 시작되기 이전에 일차 세포가 겪을 수 있는 집단 배가의 횟수는 조직 및 종 의존적이다. 통상적으로, 고점 한계는 50 및 60 PD 사이에 위치하는 것으로 인정된다. 따라서 T3-17490 세포는 헤이플릭 한계 (Hayflick limit)를 휠씬 초과하고 결론적으로 불멸화 세포주라고 명명된다.

N.B.:

- 집단 배가 수준 (PDL)은 세포 세대의 횟수를 말한다

(바이오매스의 2배 증가).

PDL 계산법: PDL = Ln (최종/초기 세포수)/Ln(2);

- 집단 배가 시간 (PDT)은 세대 시간이라고도 불리고,

한 번의 집단 배가에 필요한 시간이다.

PDT 계산법: PDT = △t * Ln(2)/Ln (최종/초기 세포수).

실시예 3: 본 발명의 방법에 따라 오르토폭스바이러스의 생산에 사용되는 T6-17490 불멸화 카이리나 모스카타 세포주 ( ECACC 에 기탁번호 제 08060501호 하로 기탁된 바와 같음)

T6-17490 세포 (계대 45)는 균질한 섬유모세포 유사 형태를 가진다 (도 5). 정적인 단일층은 100% 충만도까지 안정하고 밀착 저해되어 있다. 세포는 마이코플라스마 오염에 대해 음성으로 또한 미생물 오염에 대해서도 마찬가지로 테스트되었다. T6-17490 세포주 성장 곡선 (계대 15로부터 계대 51까지) (도 6)은 계대 19로부터 연속적인 지수적 성장기를 보여준다. 이 기간 동안 측정된 집단 배가 시간 (PDT)은 점진적으로 감소되었다. 평균 PDT는 94시간으로부터 (계대 20 내지 35) 52시간까지 (계대 36 내지 51) 유지되었다 (도 7). 51번 계대에 해당하는 계산된 집단 배가 (PDL)의 횟수는 적어도 71번의 집단 배가가 된다. 따라서 T6-17490 세포는 헤이플릭 한계를 휠씬 초과하고 결론적으로 불멸화 세포주라고 명명된다.

N.B.:

- 집단 배가 수준 (PDL)은 세포 세대의 횟수를 말한다

(바이오매스의 2배 증가).

PDL 계산법: PDL = Ln (최종/초기 세포수)/Ln(2);

- 집단 배가 시간 (PDT)은 세대 시간이라고도 불리고,

한 번의 집단 배가에 필요한 시간이다.

PDT 계산법: PDT = △t * Ln(2)/Ln (최종/초기 세포수).

실시예 4: 방법 B

단계 a'): 패키징 세포의 배양을 준비하는 것.

단계 b'): 패키징 세포 배양을 오르토폭스바이러스로 감염시키는 것.

단계 c'): 감염된 패키징 세포를 자손 오르토폭스바이러스가 생산될 때까지 배양하는 것.

감염된 CEFs는 그 다음 3일 동안 36.5℃에서 배양된다.

단계 d' ): 하나 이상의 핵산분해효소의 존재 시 배양하는 것.

자손 MVA를 포함하는 감염된 CEFs는 그 다음 10 U/ml 또는 50 U/ml의 벤조나제

(머크사; 제품번호 1.01653.0001) 존재 시 다음의 조건 하에서 배양된다:

- 온도 25℃에서 교반하면서 2시간

- Mg² ⁺ 2 mM

- pH 8.0

단계 e'): 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 오르토폭스바이러스를 회수하는 것.

단계 f' ): 단계 e' )에서 회수된 오르토폭스바이러스를 핵산분해효소(들) 활성을 저해할 수 있는 하나 이상의 제제의 존재 시 배양하는 것.

획득된 혼합물은 그 다음 250 mM NaCl의 존재 시 10 mM EDTA, pH 8.0에서 배양된다.

단계 g' ): 단계 f' )에서 획득된 혼합물을 상기 오르토폭스바이러스 및 핵산의 포획을 허용하도록 적합한 조건 하에서 음이온 교환 흡착제와 접촉시키는 것.

획득된 혼합물은 그 다음 바이오세프라

Q 하이퍼Z (팰사)에 첨가된다. 바이오세프라

Q 하이퍼Z (팰사) 비드-형성 매트릭스는 먼저 무균 물로 세척된 다음 0,5 N NaOH로 소독되고 10 mM 트리스 완충용액 (pH 8.0)으로 세척된 다음 10 mM 트리스, 10 mM NaCl, 5% 사카로스 완충용액 (pH 8.0)을 사용하여 평형화된다.

그 다음 바이오세프라

Q 하이퍼Z (팰사) 비드-형성 매트릭스는 연동 작용하는 왓슨-마로우 펌프 (Watson-Marlow pump) (제품번호 323ES/4D, 520S; 왓슨-마로우사)를 사용하여 플렉스보이

백 (제품번호 FFB101961; 사토리우스 스테딤 바이오테크사)에 담겨있는 단계 f')에서 획득된 혼합물에 첨가된다.

바이오세프라

Q 하이퍼Z (팰사) 비드-형성 매트릭스 및 단계 f')에서 획득된 혼합물은 상온에서 (20℃ 내지 22℃) 느리게 교반하면서 1시간 동안 접촉하도록 나둔다.

단계 h' ): 단계 g')에서 획득된 혼합물을 세포성 잔재물의 배출을 허용하도록 적합한 조건 하에서 정화하는 것.

획득된 혼합물은 그 다음 사토리우스

PP2 5μm (사토리우스사)와 결합된 사토리우스

단계 i' ): 오르토폭스바이러스를 단가 염을 포함하는 용액으로 용출하는 것.

오르토폭스바이러스는 연동 작용하는 왓슨-마로우 펌프 (Watson-Marlow pump) (제품번호 323ES/4D, 520S; 왓슨-마로우사)를 사용하여 S08 완충용액 (삼투압 농도 (290 mOsm/kg)로 10 mM 트리스-HCl; 5% 슈크로스 (w/v); 10 mM 소듐 글루타메이트; 50 mM NaCl; pH 8.0)에서 NaCl 농도 구배의 증가에 의해 용출된다.

단계 j' ): 단계 i' )에서 획득된 혼합물을 농축하는 것.

단계 i')에서 획득된 용출물은 그 다음 0.1 μm 프로스탁 미세여과 모듈 (제품번호 PSVVAG021, 밀리포아사)을 통하여 18회 반복농축된다.

단계 k' ): 단계 j')에서 획득된 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획을 투과 여과하는 것.

DNA의 정량은 퀀티-iT^TM 피코그린

dsDNA 분석 키트 (Quanti^TM-iT Picogreen

결과: 남아있는 DNA가 전혀 검출되지 않는다.

상기 명세서에서 인용된 모든 문서들 (예로, 특허들, 특허출원들, 공고들)은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다. 본 발명의 여러 가지 변형들 및 변화들은 본 발명의 범위 및 정신을 벗어남이 없이 당업자에게는 자명한 것이 될 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 구현예들과 연결되어 기술되었더라도, 청구된 본 발명은 이러한 특정한 구현예들에 부당하게 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 당업자에게 자명한 본 발명을 달성하는 기술된 양식의 다양한 변형들은 다음의 청구항들의 범위 이내에 속하는 것으로 의도된다.

Claims

다음의 단계를 포함하는, 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스 (Orthopoxvirus)를 생산하고 정제하는 방법:
a) 패키징 세포 (packaging cells)의 배양을 준비하고;
b) 상기 패키징 세포 배양을 오르토폭스바이러스로 감염시키고;
c) 상기 감염된 패키징 세포를 자손 오르토폭스바이러스가 생산될 때까지 배양하고;
d) 하나 이상의 핵산분해효소 (nucleases)의 존재 시 배양하고;
e) 상기 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 오르토폭스바이러스를 회수하고;
f) 단계 e)에서 회수된 상기 오르토폭스바이러스에 단가 염 (monovalent salts)을 핵산분해효소(들) 활성을 저해하고 단계 g)에서 음이온 교환 흡착제에 상기 오르토폭스바이러스의 흡착을 피하도록 적합한 조건 하에서 첨가하고;
g) 단계 f)에서 획득된 상기 혼합물을 핵산의 포획을 허용하도록 적합한 조건 하에서 음이온 교환 흡착제와 접촉시키고;
h) 단계 g)에서 획득된 상기 혼합물을 세포성 잔재물의 배출을 허용하도록 적합한 조건 하에서 정화시키고;
i) 상기 음이온 교환 흡착제를 상기 유동물에 남아있는 오르토폭스바이러스를 회수하도록 적합한 조건 하에서 단가 염을 포함하는 용액으로 세척하고;
j) 단계 h)에서 획득된 상기 유동물 및 단계 i)에서 획득된 상기 유동물을 농축하고;
k) 단계 j)에서 획득된 상기 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획을 투과 여과한다.
다음의 단계를 포함하는, 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스를 생산하고 정제하는 방법:
a') 패키징 세포의 배양을 준비하고;
b') 상기 패키징 세포 배양을 오르토폭스바이러스로 감염시키고;
c') 상기 감염된 패키징 세포를 자손 오르토폭스바이러스가 생산될 때까지 배양하고;
d') 하나 이상의 핵산분해효소의 존재 시 배양하고;
e') 상기 배양 상청액 및/또는 패키징 세포로부터 오르토폭스바이러스를 회수하고;
f') 단계 e')에서 회수된 상기 오르토폭스바이러스를 1) 핵산분해효소(들) 활성을 저해할 수 있는 하나 이상의 제제, 및 임의적으로 2) 하나 이상의 안정화제 (stabilizers)의 존재 시 배양하고;
g') 단계 f')에서 획득된 상기 혼합물을 상기 오르토폭스바이러스 및 핵산의 포획을 허용하도록 적합한 조건 하에서 음이온 교환 흡착제와 접촉시키고;
h') 단계 g')에서 획득된 상기 혼합물을 세포성 잔재물의 배출을 허용하도록 적합한 조건 하에서 정화시키고;
i') 상기 오르토폭스바이러스를 단가 염을 포함하는 용액으로 용출시키고;
j') 단계 i')에서 획득된 상기 혼합물을 농축하고;
k') 단계 j')에서 획득된 상기 오르토폭스바이러스를 포함하는 분획을 투과 여과한다.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 패키징 세포는 불멸화 세포주 (immortalized cell lines)이고, 바람직하게는 불멸화 조류 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서,
상기 불멸화 세포주는 아나티대 과 (Anatidae family)에 속하는 조류 세포로부터, 바람직하게는 카이리나 모스카타 (Cairina moschata) 종로부터 획득된 불멸화 조류 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 불멸화 조류 세포주는 텔로머라제 역전사효소 (TERT)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 조류 세포주는 유럽 세포배양 기탁기관 (ECACC)에 기탁번호 제 08060502호 하로 기탁된 불멸화 조류 세포주 T3-17490 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 조류 세포주는 유럽 세포배양 기탁기관 (ECACC)에 기탁번호 제 08060501호 하로 기탁된 불멸화 조류 세포주 T6-17490 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 불멸화 조류 세포주는 E1A 핵산 서열 및 텔로머라제 역전사효소 (TERT)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 패키징 세포는 일차 또는 이차 조류 세포이고, 바람직하게는 닭 배아 섬유모세포 (CEFs)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
pH 는 7.0 및 9.0 사이, 바람직하게는 7.5 및 8.5 사이에 포함되고, 더욱 바람직하게는 8.0인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 핵산분해효소(들)은 엔도뉴클레아제(들)이고, 바람직하게는 벤조나제
(Benzonase
)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 핵산분해효소(들)의 농도는 5 내지 100 U/ml의 범위이고, 바람직하게는 5 내지 50 U/ml의 범위이며, 더욱 바람직하게는 10 U/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 오르토폭스바이러스를 회수하는 단계보다:
1) 패키징 세포의 막을, 바람직하게는 고속 균질화기 (homogenizer)로 또는 음파 파쇄 (sonication)에 의해 파괴하는 단계; 또한
2) 단계 1)에서 획득된 상기 혼합물을 먼저 첨가된 핵산분해효소(들)에 의해 패키징 세포로부터 방출된 핵산의 분해를 허용하도록 적어도 1시간 동안 배양하는 단계;가 선행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 음이온 교환 흡착제는 정화 단계에 사용되는 필터의 공극 크기보다 큰 직경, 바람직하게는 8 μm 이상의 직경, 더욱 바람직하게는 50 μm 및 150 μm 사이에 포함되는 직경, 더욱 바람직하게는 90 μm 및 120 μm 사이에 포함되는 직경, 보다 더 바람직하게는 120 μm의 직경을 가지는 비드-형성 매트릭스 (beads-formed matrix)로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 음이온 교환 흡착제의 기능적 그룹은 디메틸아미노에틸 (DMAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 트리메틸아미노에틸 (TMAE) 및 트리에틸아미노에틸 (TEAE)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 트리메틸아미노에틸 (TMAE)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 정화 단계는 심층 여과 (depth fitration)에 의해, 바람직하게는 5 μm의 공극 크기를 가지는 필터와 결합된 8 μm의 공극 크기를 가지는 필터를 통하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 농축 단계는 미세여과 (microfiltration)에 의해 0.09 및 0.15 μm 사이에 포함되는 공극 크기를 가지는 필터를 통하여, 바람직하게는 0.1 μm의 공극 크기를 가지는 필터를 통하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 투과여과 단계는 0.09 및 0.15 μm 사이에 포함되는 공극 크기를 가지는 필터를 통하여, 바람직하게는 0.1 μm의 공극 크기를 가지는 필터를 통하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 방법은 상기에 더하여 1) 젤 여과 단계; 및 2) 투과여과 단계:를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
단계 f)에서 사용되는 상기 단가 염은 NaCl인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
단계 f)에서 사용되는 상기 단가 염의 농도는 50 내지 150 mM의 범위이고, 바람직하게는 100 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서,
단계 f')에서 상기 핵산분해효소 활성을 저해할 수 있는 제제(들)은 킬레이팅 제제이고, 바람직하게는 에틸렌디아민 테트라아세테이트 (EDTA)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항에 있어서,
상기 EDTA 농도는 5 내지 20 mM의 범위이고, 바람직하게는 10 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서,
단계 i')에서 사용되는 상기 단가 염은 NaCl인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서,
단계 i')는 단가 염의 농도 구배의 0으로부터 2.5 M까지의 범위로, 바람직하게는 0으로부터 2 M까지의 범위로, 더욱 바람직하게는 0으로부터 1.5 M까지의 범위로 증가에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
상기 청구항들의 어느 한 항에 있어서,
상기 오르토폭스바이러스는 백시니아 바이러스 (Vaccinia virus)인 것을 특징으로 하는 방법.
상기 청구항들의 어느 한 항에 있어서,
상기 오르토폭스바이러스는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (modified Vaccinia virus Ankara, MVA)인 것을 특징으로 하는 방법.
상기 청구항들의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 오르토폭스바이러스는 사이토신 탈아미노효소 (cytosine deaminase) 활성을 가지는 단백질, 바람직하게는 FCU1 단백질 또는 FCU1-8 단백질을 인코딩하는 자살 유전자 (suicide gene)가 되는 외인성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
상기 청구항들의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 오르토폭스바이러스는 종양 관련 항원 (Tumor associated antigen, TAA), 바람직하게는 MUC1을 인코딩하는 외인성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
상기 청구항들의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 오르토폭스바이러스는 항원, 바람직하게는 HCV 또는 HPV를 인코딩하는 외인성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29항 또는 제 30항에 있어서,
상기 재조합 오르토폭스바이러스는 사이토카인, 바람직하게는 IL-2를 인코딩하는 외인성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28항 내지 제 31항의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 오르토폭스바이러스는 상기에 더하여 외인성 서열(들)의 발현에 필요한 요소들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
약제학적 조성물로서, 바람직하게는 백신으로서 사용되는 상기 제 1항 내지 제 32항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스.
암, 감염성 질환 및/또는 자가면역 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 상기 제 1항 내지 제 32항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스.
상기 제 1항 내지 제 32항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스를 포함하는, 바람직하게는 백신인 약제학적 조성물.
제 35항에 있어서,
암, 감염성 질환 및/또는 자가면역 장애를 치료 및/또는 예방하는 약제학적 조성물.
암, 감염성 질환 및/또는 자가면역 장애을 치료 및/또는 예방하는 약제학적 조성물, 바람직하게는 백신의 제조를 위한, 상기 제 1항 내지 제 32항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 용도.
상기 제 1항 내지 제 32항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 생산을 위한, 아나티대 과 (Anatidae family)에 속하는 조류세포로부터, 바람직하게는 카이리나 모스카타 (Cairina moschata) 종으로부터 획득된 불멸화 조류 세포주의 용도.
상기 제 1항 내지 제 32항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 생산을 위한, 텔로머라제 역전사효소 (TERT)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주의 용도.
상기 제 1항 내지 제 32항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 생산을 위한, 유럽 세포배양 기탁기관 (ECACC)에 기탁번호 제 08060502호 하로 기탁된 T3-17490 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포 또는 그의 유도체의 용도.
상기 제 1항 내지 제 32항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 생산을 위한, 유럽 세포배양 기탁기관 (ECACC)에 기탁번호 제 08060501호 하로 기탁된 T6-17490 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포 또는 그의 유도체의 용도.
상기 제 1항 내지 제 32항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득된 정제된 야생형, 약독화 및/또는 재조합 오르토폭스바이러스의 생산을 위한, E1A 핵산 서열 및 텔로머라제 역전사효소 (TERT)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카이리나 모스카타 불멸화 조류 세포주의 용도.