ES2701763T3 - Proteasa neutra producida de forma recombinante procedente de Paenibacillus polymyxa - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir de forma recombinante una proteasa neutra, comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) proporcionar en un vector de expresión un ADN con una secuencia que codifica una preproenzima de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, y transformar un organismo huésped de la especie Bacillus amyloliquefaciens con el vector de expresión, obteniendo de este modo un organismo huésped transformado; seguido de (b) expresar el ADN en el organismo huésped transformado, en el que el organismo huésped transformado segrega la proteasa neutra; seguido de (c) aislar la proteasa neutra segregada; produciendo de forma recombinante de este modo la proteasa neutra.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteasa neutra producida de forma recombinante procedente de Paenibacillus polymyxa.

La presente divulgación proporciona la secuencia de una preproenzima de Paenibacillus polymyxa que es la precursora de una proteasa neutra, la expresión de la misma en un organismo huésped transformado y procedimientos para la producción de la proteasa neutra, mediante medios recombinantes. Además, se divulga el uso de la proteasa neutra producida de forma recombinante en el campo de la biología celular, particularmente con el propósito de realizar una disociación de tejido. La divulgación también incluye combinaciones con otras proteasas. Además, se divulgan secuencias de nucleótidos que codifican la proteasa neutra, así como fragmentos de las mismas.

La presente invención se refiere a los medios para proporcionar una proteasa neutra expresada de forma recombinante y activa enzimáticamente de Paenibacillus polymyxa, también conocida como Dispase®. Particularmente, se proporciona una secuencia de aminoácidos que es adecuada para la producción a gran escala por medio de la expresión recombinante de la misma, específicamente y con una ventaja particular en especies de Bacillus transformadas que sirven como una cepa huésped recombinante. En un modo de realización específico, la proteasa neutra de Paenibacillus polymyxa expresada de forma recombinante se segrega en el medio de cultivo líquido y se purifica a partir del mismo.

Antecedentes

El documento US 2006/269527 A1 informa de una proteasa neutra liofilizada de Bacillus polymyxa. El documento WO 2009/140343 A1 también divulga una proteasa neutra liofilizada. El documento EP2161333 A1 informa de la estabilización de termolisina en solución acuosa. El documento WO 1998/24889 A1 informa de una composición enzimática para la disociación de tejido, comprendiendo la composición dos enzimas colagenasa y una endoproteasa. El documento US 3930954 A, también citado más adelante, divulga la expresión y purificación de una proteasa neutra de B. polymyxa. Stenn, K.S., et al., J. Invest. Dermatol. 93 (1989) 287-290, también citado más adelante, describe la dispasa de B. polymyxa. Ikram-Ul-Haq et al. Pakistan Congress of Zoology. Proceedings, Zool. Soc. Of Pakistan (PK) 24 (2004) 67-75 se refiere a estudios sobre la optimización de la producción de proteasa mediante Bacillus subtilis IH-16. Mansfield J. et al. Protein Expression and Purification 39 (2005) 219-228 describe la clonación y expresión de una proteasa neutra de B. stearothermophilus en E. coli. Wang Lin-Fa et al. J Gen Microbiol 139 (1993) 343-347 describe la expresión de la proteasa neutra nprE de B. subtilis en S. cerevisiae. Honjo M. et al. J Biotechnol 1 (1984) 265-277 describe la clonación y expresión del gen para la proteasa neutra de B. amyloliquefaciens en B. subtilis. Matta Hittu et al. Int J Food Microbiol 42 (1998) 139-145 describe el aislamiento de una proteasa extracelular termoestable de la cepa B-17 de B. polymyxa, proteasa que se califica como una metaloendopeptidasa neutra. Takekawa, S., et al., J. Bacteriology 173 (1991) 6820-6825, también citado más adelante, informa de la clonación y expresión de una proteasa neutra de B. polymyxa. Twentyman P.R. et al. Cancer Lett 9 (1980) 225-228 informa sobre el uso de proteasas neutras de tipo IX de B. polymyxa para la disociación de tejido tumoral y la obtención de células a partir del mismo. Ruf A. et al. Acta Crystallographica Section D 69 (2013) 24-31 informa de la estructura de una metaloproteasa extracelular bacteriana similar a termolisina, haciendo referencia a la base de datos Uniprot con n.° de acceso E3E6L0 de 1 de mayo de 2013.

A partir de filtrados o sobrenadantes de cultivos de Paenibacillus polymyxa (P. polymyxa; también conocida anteriormente como Bacillus polymyxa o B. polymyxa, todos estos nombres taxonómicos se usan indistintamente en el presente documento), se aisló y caracterizó una proteasa neutra. En la literatura más reciente, la proteasa neutra a menudo se denomina "Dispase®", que es una marca registrada de Godo Shusei Co., Ltd., Tokio, Japón. Debido a la fibronectinasa y la actividad proteolítica de la colagenasa de tipo IV, se conoce la utilidad técnica de Dispase® particularmente en el campo de las células animales o el cultivo de tejidos. Por tanto, la disociación de un tejido (incluyendo los aglutinamientos de células o los agregados de células) en capas de células o incluso suspensiones de células sueltas se realiza con frecuencia con la actividad de esta enzima, solo con Dispase® o bien con Dispase® como un componente de combinaciones, es decir, combinada con otras enzimas proteolíticas, específicamente colagenasas, por ejemplo, como se divulga en el documento US 5.830.741.

El documento US 3.930.954 divulga una proteasa neutra de una cepa de B. polymyxa que tiene el número de acceso ATCC 21993 (en el documento también denominada FERM-P n.° 412). El documento describe, particularmente, el cultivo de la cepa bacteriana en condiciones aeróbicas en un medio líquido complejo (caldo de cultivo) que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y sales inorgánicas. La actividad proteolítica presente en el caldo de cultivo se supervisó durante el cultivo, indicando la cantidad de proteasa neutra segregada por las células en el sobrenadante líquido. Cuando se alcanzó la actividad máxima, se obtuvo el cultivo y los componentes particulados, incluyendo las células bacterianas, se separaron del sobrenadante mediante filtración en gel, seguido de concentración del filtrado a presión reducida. Tras una etapa de fraccionamiento no especificada adicionalmente con isopropanol, se obtuvo una preparación que representaba un 70 % de la actividad proteolítica total detectada en el caldo de cultivo. Otros procedimientos de enriquecimiento de proteasa enseñados en el documento US 3.930.954 incluyen la precipitación por adición de sal con sulfato de amonio y la precipitación con metanol, etanol y acetona, cada uno dando como resultado una preparación en bruto. Posteriormente, se aplicaron otras etapas de purificación, que finalmente dieron lugar a una preparación purificada. Por medio de análisis por ultracentrifugación, se determinó un peso molecular de 35.900 dalton (Da) y se examinaron una serie de otros parámetros bioquímicos y biofísicos. Sin embargo, no se aportaron datos inequívocos que aclararan si la preparación divulgada contenía una proteasa única purificada homogéneamente o una mezcla de proteínas diferentes.

Stenn, K.S., et al., J. Invest. Dermatol. 93 (1989) 287-290 divulgan un análisis de la especificidad del sustrato de una proteasa neutra (= Dispase®). Además, se presenta otra caracterización bioquímica de la proteasa neutra, usando material purificado derivado del filtrado de cultivo de B. polymyxa, y haciendo referencia al documento US 3.930.954. Notablemente, en el documento se muestra un gel de SDS pAg E que representa una muestra de 600 pg de proteína de una preparación de Dispase® disponible comercialmente. El gel teñido con azul de Coomassie presenta una banda principal delgada que migra a 41 kDa, aunque también al menos dos bandas débiles que migran entre 30 y 20 kDa, y otra banda débil que migra entre 20 y 14,4 kDa.

Usando la cepa 72 de B. polymyxa de Murao, S., et al. (Agric. Biol. Chem. 47 (1979) 941-947), los autores de Takekawa, S., et al., J. Bacteriology 173 (1991) 6820-6825 describen la clonación en E. coli de un ADN de B. polymyxa genómico (SEQ ID NO: 1) que comprende una secuencia de nucleótidos con un marco abierto de lectura que codifica aparentemente la preproenzima con 590 aminoácidos (SEQ ID NO: 2; producto de traducción primario, molécula precursora antes de la secreción) de una proteasa neutra. Basándose en la composición de aminoácidos, se calculó que el peso molecular de la proteína segregada madura (procesada) conceptual que comprendía 304 aminoácidos era de 32.477 Da. Se descubrió que la proteasa neutra expresada en E. coli de un fragmento de B. polymyxa genómico y analizada a partir del sobrenadante de células de E. coli transformadas y alteradas migraba a aproximadamente 35 kDa en geles de SDS PAGE.

Para la comparación, Takekawa, S., et al. (supra) también purificaron una proteasa neutra extracelular de B. polymyxa del líquido de cultivo. Se determinó la secuencia de aminoácidos del extremo N de la proteasa neutra purificada. Notablemente, los primeros tres residuos de aminoácido en la secuencia del extremo N de Ala Thr Gly Thr Gly Lys Gly Val Leu Gly Asp Xaa Lys Ser Phe (SEQ ID NO:4) difieren de la secuencia de aminoácidos predicha comprendida en la SEQ ID n O: 2 en las posiciones 287-301 que se descubrió que era Asn Glu Ala Thr Gly Lys Gly Val Leu Gly Asp Ser Lys Ser Phe. El motivo de esta discrepancia seguía siendo incierto y no se aclaró adicionalmente.

Los autores de la presente divulgación pretendían producir una cepa huésped microbiana transformada que expresara de forma recombinante una proteasa neutra de Paenibacillus polymyxa. De forma inesperada, lo que sucedió es que las secuencias divulgadas por Takekawa, S., et al. (supra) no eran adecuadas para construir una cepa de expresión adecuada. Incluso resultó más sorprendente que el ADN aislado de la ATCC 21993 de B. polymyxa codificara una secuencia de aminoácidos de un producto de traducción primario para una proteasa neutra que no solo comprendía 592 aminoácidos, sino que también mostraba alteraciones en varias posiciones en el polipéptido codificado, en comparación con las secuencias publicadas previamente. Otro efecto sorprendente fue que Bacillus amyloliquefaciens es un organismo huésped particularmente adecuado para la producción recombinante de la proteasa neutra procedente de Paenibacillus polymyxa.

Sumario

La presente invención proporciona un procedimiento para producir de forma recombinante una proteasa neutra, comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) proporcionar en un vector de expresión un ADN con una secuencia que codifica una preproenzima de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, y transformar un organismo huésped de la especie Bacillus amyloliquefaciens con el vector de expresión, obteniendo de este modo un organismo huésped transformado; seguido de (b) expresar el ADN en el organismo huésped transformado, en el que el organismo huésped transformado segrega la proteasa neutra; seguido de (c) aislar la proteasa neutra segregada; produciendo de forma recombinante de este modo la proteasa neutra.

La invención proporciona además una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la posición 289 a la posición 592 de la SEQ ID NO: 5, seleccionándose la secuencia de nucleótidos del grupo que consiste en (a) una secuencia de nucleótidos que tiene la secuencia de la posición 898 a la posición 1811 de la SEQ ID NO: 6; (b) secuencias de nucleótidos derivadas de la secuencia de nucleótidos de la posición 898 a la posición 1811 de la SEQ ID NO: 6 como resultado del código redundante. La invención proporciona además un vector que contiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención. La invención proporciona además un organismo huésped transformado de la especie Bacillus amyloliquefaciens que contiene al menos un vector de acuerdo con la invención.

Un primer aspecto de todos los modos de realización como se divulga en el presente documento es un procedimiento para producir de forma recombinante una proteasa neutra, comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) proporcionar en un vector de expresión un ADN con una secuencia que codifica una preproenzima de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, y transformar un organismo huésped con el vector de expresión, obteniendo de este modo un organismo huésped transformado, en el que el organismo huésped es una especie procariota grampositiva; seguido de (b) expresar el ADN en el organismo huésped transformado, en el que el organismo huésped transformado segrega la proteasa neutra; seguido de (c) aislar la proteasa neutra segregada; produciendo de forma recombinante de este modo la proteasa neutra.

Un segundo aspecto de todos los modos de realización como se divulga en el presente documento es una proteasa neutra obtenida realizando un procedimiento para producir de forma recombinante una proteasa neutra como se divulga en el presente documento.

Un tercer aspecto de todos los modos de realización como se divulga en el presente documento es un procedimiento de aislamiento de células vivas de un tejido animal in vitro, que comprende las etapas de (a) proporcionar una proteasa neutra producida de forma recombinante obtenida realizando un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y (b) incubar el tejido in vitro con la proteasa neutra de la etapa (a), en el que los componentes proteínicos de la matriz extracelular del tejido se degradan proteolíticamente, y en el que se obtiene una capa de células o una suspensión de células vivas individuales, aislando de este modo las células vivas de un tejido animal in vitro.

Un cuarto aspecto de todos los modos de realización como se divulga en el presente documento es el uso de una proteasa neutra obtenida realizando un procedimiento para producir de forma recombinante una proteasa neutra como se divulga en el presente documento, siendo el uso de la proteasa neutra el aislamiento de células vivas de un tejido animal in vitro.

Un quinto aspecto de todos los modos de realización como se divulga en el presente documento es un kit de partes que comprende en un compartimento sellado un liofilizado de una proteasa neutra obtenida realizando un procedimiento para producir de forma recombinante una proteasa neutra como se divulga en el presente documento.

Un sexto aspecto de todos los modos de realización como se divulga en el presente documento es un procedimiento para preparar una combinación de una pluralidad de proteasas, que comprende las etapas de (a) proporcionar una proteasa neutra producida de forma recombinante obtenida realizando un procedimiento obtenido realizando un procedimiento para producir de forma recombinante una proteasa neutra como se divulga en el presente documento, y (b) mezclar la proteasa neutra de la etapa (a) con otra proteasa.

Un séptimo aspecto de todos los modos de realización como se divulga en el presente documento es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la posición 289 a la posición 592 de la SEQ ID NO: 5, seleccionándose la secuencia de nucleótidos del grupo que consiste en (a) una secuencia de nucleótidos que tiene la secuencia de la posición 898 a la posición 1811 de la SEQ ID NO: 6; (b) secuencias de nucleótidos derivadas de la secuencia de nucleótidos de la posición 898 a la posición 1811 de la SEQ ID NO: 6 como resultado del código redundante.

Un octavo aspecto de todos los modos de realización como se divulga en el presente documento es un vector que contiene una secuencia de nucleótidos como se divulga en el presente documento.

Un noveno aspecto de todos los modos de realización como se divulga en el presente documento es un organismo huésped grampositivo procariota transformado que contiene al menos un vector como se divulga en el presente documento.

Leyenda de la figura

Figura 1 En el presente documento se divulga la alineación de la secuencia de aminoácidos publicada de Takekawa, S., et al., J. Bacteriology 173 (1991) 6820-6825 (SEQ ID NO: 3; "Seq-1" en la figura) con la secuencia de aminoácidos procedente de la ATCC 21993 de P. polymyxa (SEQ ID NO: 5; "Seq-2" en la figura).

Descripción detallada

Dispase® (= proteasa neutra procedente de Paenibacillus polymyxa, P. polymyxa) es una metaloenzima que se clasifica como una aminoendopeptidasa que puede escindir fibronectina, colágeno IV y colágeno I, pero este último aparentemente en menor grado. La proteasa neutra de P. polymyxa es útil para la disociación de tejido (= desagregación) y, particularmente, para los procedimientos de subcultivo, puesto que no daña las membranas celulares. Puesto que la proteasa neutra de P. polymyxa de acuerdo con la presente divulgación se puede producir a partir de una fuente bacteriana, está libre de contaminación por micoplasma y virus animal. Es muy estable con respecto a la temperatura, pH e interferencia por los componentes séricos. La actividad de proteasa neutra de P. polymyxa se reduce en gran medida mediante dilución, lo que permite que los cultivos en suspensión crezcan sin dificultad. Incluso se puede añadir la proteasa neutra de P. polymyxa a los cultivos en suspensión de células para prevenir la aglutinación de células no deseada.

La proteasa neutra de P. polymyxa preparada de forma recombinante de acuerdo con la presente divulgación es útil para preparar muchos tipos de células para su cultivo. Por tanto, la proteasa neutra de P. polymyxa como se proporciona con el presente documento es un agente rápido, eficaz, pero suave, para separar incluso capas de células, es decir, la epidermis intacta de la dermis y láminas epiteliales intactas en cultivo a partir del subestrato. En ambos casos, afecta a la separación escindiendo las proteínas de la matriz extracelular en la región de la zona de la membrana basal, mientras que mantiene la viabilidad de las células epiteliales. La proteasa neutra de P. polymyxa de acuerdo con la presente divulgación y usada como proteasa única es útil para desprender células epidérmicas como láminas intactas confluentes de la superficie de placas de cultivo sin disociar las células. Dicho procedimiento sienta las bases para el uso en el cultivo e incluso en el trasplante de láminas de células epiteliales de la piel desprendidas del sustrato de cultivo mediante la proteasa neutra de P. polymyxa. Además, la proteasa neutra de P. polymyxa es útil para la obtención y transferencia de células diploides y líneas de células normales. Otras aplicaciones para la disociación de tejido hacen uso de combinaciones de una proteasa neutra de P. polymyxa y otra proteasa, tal como colagenasa.

De acuerdo con los sorprendentes hallazgos de los autores de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento para producir de forma recombinante una proteasa neutra, comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) proporcionar en un vector de expresión un ADN con una secuencia que codifica una preproenzima de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, y transformar un organismo huésped con el vector de expresión, obteniendo de este modo un organismo huésped transformado, en el que el organismo huésped es una especie procariota grampositiva; seguido de (b) expresar el ADN en el organismo huésped transformado, en el que el organismo huésped transformado segrega la proteasa neutra; seguido de (c) aislar la proteasa neutra segregada; produciendo de forma recombinante de este modo la proteasa neutra. Más específicamente, la secuencia de ADN procede de la ATCC 21993 de Paenibacillus polymyxa.

La secuencia que codifica la preproenzima de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 se puede expresar en cualquier organismo huésped adecuado conocido por el experto en la técnica. Un organismo huésped particular es una bacteria grampositiva, específicamente una especie seleccionada del grupo que consiste en Bacillus, Clostridium, Lactococcus, Lactobacillus, Staphylococcus y Streptococcus. De acuerdo con la invención, el medio de producir de forma recombinante la proteasa neutra codificada por la SEQ ID NO: 5 hace uso de la especie Bacillus amyloliquefaciens como organismo huésped transformado.

En un modo de realización específico, la etapa de expresar el ADN en el organismo huésped transformado se realiza cultivando el organismo huésped transformado en un medio líquido, en el que el organismo huésped transformado segrega la proteasa neutra en el medio líquido. Posteriormente, la proteasa neutra segregada se puede aislar del medio líquido.

Se puede lograr otra ventaja usando, en cualquiera de los procedimientos para producir de forma recombinante una proteasa neutra, un organismo huésped que carezca de proteasas extracelulares. Los ejemplos de proteasas extracelulares de B. amyloliquefaciens son Npr y Apr, bien conocidas para el experto.

En una secuencia de trabajo ejemplar para la disociación de tejido, se proporciona una polimerasa neutra de P. polymyxa producida de forma recombinante de acuerdo con la presente divulgación como un liofilizado. En una primera etapa, se disuelve el liofilizado en un tampón adecuado fisiológicamente, por ejemplo, en PBS (solución salina tamponada con fosfato), que esté libre de iones Mg2+ y Ca2+. A continuación, se esteriliza la solución de proteasa neutra de P. polymyxa, por ejemplo, por medio de filtración a través de una membrana de filtro (por ejemplo, con tamaño de poro de 0,22 pm). Se obtiene una muestra de tejido vivo, es decir, extraída del animal. De forma alternativa, se proporciona un recipiente de cultivo con células adheridas o un recipiente de cultivo con agregados de células (las células también se denominan "tejido" en el presente documento). En un modo de realización particular, se fragmenta el tejido mediante medios mecánicos (por ejemplo, usando tijeras o un bisturí) y se lavan los fragmentos en PBS estéril. Posteriormente, se incuban los fragmentos en una solución de proteasa neutra de P. polymyxa precalentada, con lo que los fragmentos se cubren con la solución. La incubación con la proteasa neutra de P. polymyxa se realiza típicamente a temperatura fisiológica, particularmente a 37 °C.

El tiempo necesario para la disociación de tejido deseada (es decir, el grado o la extensión de la misma) normalmente se determina empíricamente, en el que se varían típicamente la concentración de proteasa neutra de P. polymyxa en la solución y/o el tiempo de incubación. El tiempo de incubación en la solución de proteasa neutra de P. polymyxa puede ser de varias horas sin efectos adversos en las células. Opcionalmente el tejido incubado se puede agitar suavemente. Si fuera necesario, se pueden separar las células dispersadas de los agregados que existen todavía por medio del paso de la suspensión de células obtenida a través de una malla o rejilla estéril. La decantación también es un procedimiento para obtener células disociadas. Otras técnicas son conocidas para el experto en la técnica, particularmente para retirar capas de células que se desprenden por debajo del tejido mediante incubación con una proteasa neutra de P. polymyxa. Si se desea una desagregación adicional, se puede añadir una solución de Dispase recién preparada.

Se pueden sedimentar células o capas de células disociadas, se puede retirar la solución enzimática mediante decantación o se diluye la solución de proteasa neutra de P. polymyxa con medio de cultivo de células para inhibir la actividad proteolítica adicional. Son posibles otros procedimientos para hacer esto. Se pueden sembrar y cultivar las células obtenidas mediante la secuencia de trabajo anterior usando procedimientos estándar.

Por tanto, la presente divulgación proporciona además un procedimiento para aislar células vivas de un tejido animal in vitro, que comprende las etapas de (a) proporcionar una proteasa neutra producida de forma recombinante obtenida realizando un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y (b) incubar el tejido in vitro con la proteasa neutra de la etapa (a), en el que los componentes proteínicos de la matriz extracelular del tejido se degradan proteolíticamente, y en el que se obtiene una capa de células o una suspensión de células individuales. Específicamente, el tejido animal procede de un animal vertebrado, más específicamente de una especie animal seleccionada de ratón, conejillo de Indias, hámster, rata, perro, oveja, cabra, cerdo, bovino, caballo, una especie de primate, y ser humano.

En otro modo de realización, un procedimiento para aislar células vivas de un tejido animal in vitro comprende el uso de una combinación de proteasas que incluye una proteasa neutra de P. polymyxa producida de forma recombinante como se divulga en el presente documento. A modo de ejemplo, la combinación puede comprender otra proteasa neutra, tal como termolisina. Además, las combinaciones de proteasa neutra de P. polymyxa con una colagenasa proporcionan una gran ventaja para la disociación de tejido.

En un modo de realización específico, se proporciona una proteasa neutra de P. polymyxa producida de forma recombinante como se divulga en el presente documento o una combinación de proteasas que incluye una proteasa neutra de P. polymyxa producida de forma recombinante como se divulga en el presente documento como un liofilizado, es decir, como una preparación criodesecada. Dicha preparación se puede almacenar durante un periodo de tiempo prolongado.

Además, se proporciona un kit de partes que comprende en un compartimento sellado, tal como un frasco, un liofilizado de una proteasa neutra obtenida realizando un procedimiento para producir de forma recombinante una proteasa neutra, como se divulga en el presente documento. El kit puede contener en un compartimento sellado separado una preparación liofilizada de una colagenasa. El kit también puede contener en un compartimento sellado separado una preparación liofilizada de una termolisina. Otro modo de realización es un kit que comprende en un compartimento sellado, tal como un frasco, un liofilizado de una proteasa neutra obtenida realizando un procedimiento para producir de forma recombinante una proteasa neutra, como se divulga en el presente documento, en el que la proteasa neutra se combina con otra proteasa, tal como (pero sin limitarse a) una colagenasa y/o termolisina.

Se proporcionan los siguientes ejemplos y el listado de secuencias para ayudar a la comprensión de la presente invención.

Ejemplo 1

Construcción de construcciones de expresión (ADN)

Usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y varios oligonucleótidos de ADN mono- y/o bicatenario que representan subsecuencias de las cadenas de ADN genómico codificantes y no codificantes deseadas, se generaron secuencias de genes artificiales. Para empezar, los pares de oligonucleótidos parcialmente superpuestos que representaban fragmentos de cadenas opuestas se hibridaron con el ADN molde y se generaron moléculas de ADN bicatenario mediante prolongación de cadena mediada por polimerasa y posterior amplificación por PCR. Se crearon sintéticamente otras moléculas de ADN. Se verificaron todas las secuencias de ADN generados artificialmente mediante secuenciación.

Ejemplo 2

Construcciones de expresión que usan información sobre la secuencia publicada

Un primer intento de expresar una proteasa neutra de P. poymyxa se basó en la divulgación de Takekawa, S., et al., J. Bacteriology 173 (1991) 6820-6825. En una primera etapa, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, específicamente la subsecuencia de CDS (343)..(2115) correspondiente al marco abierto de lectura que codifica la SEQ ID NO: 2, se adaptó cambiando el uso del codones. Aunque la secuencia de aminoácidos codificada permaneció sin cambios, se introdujeron mutaciones neutras que optimizaban el marco abierto de lectura para la expresión en Bacillus subtilis. Se creó y sintetizó un ADN artificial con el marco de lectura que codifica la SEQ ID NO: 2. Codificaba la secuencia de aminoácidos de P. polymyxa de la preproenzima con 590 aminoácidos, es decir, incluyendo la secuencia señal y el propéptido. En la construcción de expresión, se introdujo un sitio de unión a ribosoma específico de B. subtilis en dirección 5' del marco abierto de lectura. Se clonó la construcción de ADN en un vector de expresión que proporciona un promotor específico de la fase de crecimiento que promueve la transcripción en B. subtilis en la fase de crecimiento estacionaria en cultivo líquido. El plásmido de expresión seleccionable y competente para la replicación resultante fue pLE2D01nprPp.

Se construyó un derivado fusionando tres glicinas y seis histidinas al extremo C de la secuencia de aminoácidos de la preproenzima, dando como resultado un polipéptido codificado con 599 aminoácidos con seis histidinas terminales. El plásmido de expresión seleccionable y competente para la replicación resultante fue pLE2D01nprHisPp.

Se generaron cepas de B. subtilis transformadas y se realizaron experimentos de expresión en condiciones estándar; es decir, se aplicaron condiciones en el caso de que otras dianas de expresión hubieran demostrado ser permisivas con la expresión y secreción de cantidades detectables de proteína diana.

Sorprendentemente, ambos plásmidos de expresión, pLE2D01nprPp y pLE2D01nprHisPp, dieron lugar a resultados negativos. Ambos intentos de expresar y segregar la proteasa neutra de P. polymyxa fueron infructuosos.

Para excluir cualquier impacto negativo de la secuencia promotora, aunque dicho efecto se considerara improbable, se intercambió el promotor en cada uno de los dos plásmidos anteriores con otro promotor que promovía la expresión dependiente de la adición de un compuesto inductor específico al cultivo. Los plásmidos de expresión resultantes se denominaron pLE2E01nprPp y pLE2E01nprHisPp. Se realizaron experimentos de expresión que incluían la etapa de adición del inductor. Como resultado, estas modificaciones no dieron lugar a un cambio. Ambos intentos adicionales de expresar y segregar la proteasa neutra de P. polymyxa fueron infructuosos.

En otro intento, se intercambió el sitio de unión a ribosoma específico de B. subtilis con el sitio de unión a ribosoma de P. polymyxa natural del gen descrito originalmente (SEQ ID NO: 1). Los plásmidos de expresión resultantes se denominaron pLE2D01nprRBSPp y pLE2D01nprRBSHisPp. De nuevo, los resultados negativos no se pudieron anular. Ambos intentos adicionales de expresar y segregar la proteasa neutra de P. polymyxa fueron infructuosos.

Además, se realizaron experimentos de mutación alterando/delecionando posiciones de aminoácido relacionadas con la discrepancia de secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3, es decir, mediante la secuencia de aminoácidos del extremo N de la proteasa neutra natural aislada del sobrenadante de cultivo de Paenibacillus polymyxa.

Sorprendente e inesperadamente, ninguno de los intentos directos anteriores de expresar la proteasa neutra de P. polymyxa en Bacillus subtilis dio lugar a una actividad de proteasa que estaba por encima de la de fondo, en comparación con una cepa de control de B. subtilis transformada con un vector de expresión "vacío", es decir, con un vector que comprendía las mismas características descritas anteriormente, pero sin ninguna secuencia codificante deseada insertada. Se obtuvieron resultados idénticos cuando se usó B. amyloliquefaciens como huésped de expresión.

A este respecto se observa que las secuencias publicadas por Takekawa, S., et al., J. Bacteriology 173 (1991) 6820-6825 se clonaron y seleccionaron en E. coli, es decir, en un organismo microbiano que no estaba relacionado con P. polymyxa, taxonómicamente y en términos evolutivos. Se puede especular que ese paso a través de un huésped tan distinto podría haber dado lugar a alteraciones del ADN exógeno. Además, Takekawa, S., et al. (supra) caracterizaron la expresión de la proteasa neutra en E. coli usando extractos celulares. Sin embargo, los clones positivos se identificaron inicialmente basándose en un halo en placas de agar con leche desnatada, lo que sugiere alguna actividad de proteasa extracelular en una fase inicial del estudio.

No se ha descubierto el motivo exacto para explicar por qué la secuencia publicada de Takekawa, S., et al. (supra) no da lugar a una expresión detectable de la proteasa neutra, al menos en cuanto a lo que atañe al sistema de B. subtilis. No obstante, se realizó otro intento de aclarar si la información sobre la secuencia documentada por Takekawa S. et al. (supra) podría no representar el verdadero gen de Paenibacillus polymyxa.

Ejemplo 3

Resultados de secuenciación para la cepa ATCC 21993 de Paenibacillus polymyxa

Se aisló el ADN genómico total aislado de la cepa ATCC 21993 de Paenibacillus polymyxa y se amplificó el gen que codificaba la proteasa neutra usando PCR. Se secuenció el ADN amplificado. Sorprendentemente, se descubrieron varias diferencias al nivel de secuencia de ADN, provocando las diferencias cambios en la secuencia de aminoácidos que está codificada. La secuencia de aminoácidos del gen de proteasa neutra de la cepa ATCC 21993 se proporciona en la SEQ ID NO: 5.

Al nivel de secuencia de aminoácidos, en la figura 1 se presenta una alineación con la secuencia publicada de Takekawa, S., et al. (supra). La alineación muestra una serie de intercambios de aminoácidos e incluso una deleción y una inserción. 17 de los intercambios de aminoácidos podrían ser de pertinencia estructural de orden más alto, puesto que en estos casos los aminoácidos no son similares (tamaño, carga), pero difieren significativamente.

Notablemente, la secuencia de aminoácidos determinada en el presente estudio contenía el extremo N determinado anteriormente por Takegawa S.et al. (supra). Por tanto, las posiciones 289 a 303 de la SEQ ID NO: 5 corresponden a la secuencia del extremo N determinada previamente de la SEQ ID NO: 4. De acuerdo con los presentes datos de secuenciación, tras un procedimiento de maduración proteolítico, incluyendo un procesamiento proteolítico en el extremo N durante el transcurso de la secreción, la proteasa neutra extracelular derivada de la cepa ATCC 21993 es el polipéptido dado por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 desde la posición 289 a la posición 592.

Ejemplo 4

Construcciones de expresión que usan información sobre la secuencia publicada

Se aisló el ADN que codificaba la proteasa neutra de la cepa ATCC 21993 de Paenibacillus polymyxa como se describe en el ejemplo 3. Basándose en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, se concibió una secuencia de ADN para su expresión en B. subtilis que codificaba la proteasa neutra y se clonó en vectores de expresión diferentes, en analogía con el ejemplo 2. La secuencia de ADN de un fragmento clonado que incluye la secuencia codificante de la proteasa neutra (preproenzima) de dicha cepa ATCC 21993 de Paenibacillus polymyxa se presenta como la SEQ ID NO: 6. Una construcción ejemplar codificaba la secuencia de aminoácidos de P. polymyxa de la preproenzima, incluyendo la secuencia señal y el propéptido. Se clonó la construcción de ADN en un vector de expresión que proporciona un promotor específico de la fase de crecimiento que promueve la transcripción en B. subtilis en la fase de crecimiento estacionaria en cultivo líquido. El plásmido de expresión seleccionable y competente para la replicación resultante fue pLE2D01DisnatPp.

Se intentó además construir un derivado fusionando una secuencia de marca de tres glicinas consecutivas seguidas de seis histidinas al extremo C de la secuencia de aminoácidos de la preproenzima. Los experimentos de transformación respectivos proporcionaron clones que en placas de agar con leche produjeron halos indicativos de la secreción de proteasa. Por tanto, la producción recombinante de la proteasa neutra es posible en B. subtilis.

Las cepas de B. subtilis transformadas se caracterizaron adicionalmente. La secuenciación de los plásmidos de expresión reveló sorprendentemente que todos estos clones contenían marcos abiertos de lectura específicos de proteasa neutra en los que se había perdido la marca de histidina añadida. En el sistema de expresión de B. subtilis particular, la estructura de marca His adjunta al extremo C podría haber sido incompatible con la expresión y/o secreción de la enzima proteasa neutra recombinante activa proteolíticamente. Por tanto, no se continuó más con este intento y no se generó ningún clon que expresara activamente una proteasa neutra con marca His recombinante en el sistema de B. subtilis.

Sin embargo, se transformó el plásmido de expresión pLE2D01DisnatPp en varias especies de Bacillus, no solo incluyendo Bacillus subtilis, sino también Bacillus amyloliquefaciens. Se realizaron transformaciones de control con vectores de expresión "vacíos", como se describe anteriormente.

Sorprendentemente, en cultivos líquidos, las cepas huésped de Bacillus amyloliquefaciens transformadas segregaron cantidades particularmente altas de proteasa neutra en el medio, mientras que en las mismas condiciones no se observaron actividades de proteasa neutra significativas en el sobrenadante de cultivo con Bacillus subtilis. El efecto no parecía ser dependiente de la composición del medio líquido. El motivo de esta observación inesperada no se aclaró.

Las cepas huésped de Bacillus subtilis transformadas particulares usadas para la transformación contenían mutaciones con pérdida de función en uno o más genes endógenos que codificaban una proteasa extracelular (segregada). Dichas cepas se consideran ventajosas, particularmente en el presente caso cuando la proteína diana deseada que se va a expresar de forma recombinante y a segregar es una proteasa en sí misma. Particularmente en el huésped de B. subtilis transformado, se mutaron genes seleccionados de AprE, NprE, Epr, y una combinación de los mismos. Además, se obtuvieron cepas en las que se mutaron los tres de estos genes.

Con respecto a Bacillus amyloliquefaciens, las mutaciones ventajosas en la cepa huésped incluían los genes de proteasa extracelular endógenos Npr y Apr. Se generaron transformantes respectivos que incluían una o ambas de las dos mutaciones con pérdida de función en la proteasa mencionadas anteriormente.

Ejemplo 5

Determinación de la actividad proteolítica en medio líquido

Se usaron los kits de ensayo de proteasa EnzChek® (Invitrogen, E6638). El ensayo basado en fluorescencia directa detecta metaloproteasas, serina proteasas, proteasas ácidas y sulfhidrilproteasas. El kit de ensayo contiene derivados de caseína que se marcan con el colorante BODIPY® FL (E6638) verde fluorescente insensible al pH, lo que da como resultado una extinción casi total de la fluorescencia del conjugado. La hidrólisis catalizada por proteasa libera péptidos marcados con colorante BODIPY FL fluorescente. El incremento concurrente de la fluorescencia, que se puede medir con un espectrofluorómetro, minifluorómetro o lector de microplacas, es proporcional a la actividad de proteasa.

Los experimentos de control se realizaron con muestras en las que no se expresó proteasa neutra ("muestras nulas"). Se realizaron controles adicionales con muestras, incluyendo "muestras nulas", a las que se añadió una cantidad predeterminada de proteasa neutra disponible comercialmente (Dispase®, Roche Diagnostics Manheim, Alemania, n.° de cat. 04942086001).

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   i. Un procedimiento para producir de forma recombinante una proteasa neutra, comprendiendo el procedimiento las etapas de

   (a) proporcionar en un vector de expresión un ADN con una secuencia que codifica una preproenzima de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, y transformar un organismo huésped de la especie Bacillus amyloliquefaciens con el vector de expresión, obteniendo de este modo un organismo huésped transformado; seguido de (b) expresar el ADN en el organismo huésped transformado, en el que el organismo huésped transformado segrega la proteasa neutra; seguido de

   (c) aislar la proteasa neutra segregada;

   produciendo de forma recombinante de este modo la proteasa neutra.
2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ADN comprende la secuencia de la posición 34 a la posición 1896 de SEQ ID NO: 6.
3. 3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que la etapa (b) comprende cultivar el organismo huésped transformado en un medio líquido, en el que el organismo huésped transformado segrega la proteasa neutra en el medio líquido.
4. 4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la etapa (c) comprende aislar la proteasa neutra segregada del medio líquido.
5. 5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el organismo huésped carece de una proteasa extracelular seleccionada de Npr y Apr.
6. 6. Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la posición 289 a la posición 592 de SEQ ID NO: 5, seleccionándose la secuencia de nucleótidos del grupo que consiste en

   (a) una secuencia de nucleótidos que tiene la secuencia de la posición 898 a la posición 1811 de la SEQ ID NO: 6;

   (b) secuencias de nucleótidos derivadas de la secuencia de nucleótidos de la posición 898 a la posición 1811 de la SEQ ID NO: 6 como resultado del código redundante.
7. 7. La secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la secuencia de nucleótidos es la secuencia de la posición 34 a la posición 1811 de lSEQ ID NO: 6.
8. 8. Un vector que contiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7.
9. 9. Un organismo huésped transformado de la especie Bacillus amyloliquefaciens que contiene al menos un vector de acuerdo con la reivindicación 8.