JP2012524542A - 修飾されたプロ(pro)領域をもつプロテアーゼ - Google Patents
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Abstract
【選択図】図面4B
Description
実際に、異種のポリペプチドの分泌は工業で広く使用される技術である。通常は、細胞は大量の望むポリペプチドを生産するために、発現、分泌される目的物である異種ポリペプチドをコードする核酸により形質転換される。望むポリペプチドの発現と分泌は望むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの遺伝子的な操作により制御されてきた。タンパク質生産方法における種々の進歩にも関わらず、洗浄、動物用の飼料、繊維処理工業に限らず各種の産業に用いられるプロテアーゼのような酵素の産生を高めるために細胞外にタンパク質を放出する、より効率的な方法を提供する必要が依然、本技術分野に存在している。
及びE30S-A32Vから選択される2以上のアミノ酸の置換の組み合わせを含む)に機能的に連結している。次に、第二のポリヌクレオチドは配列番号9の成熟プロテアーゼと約60%以上同一であるプロテアーゼの成熟領域をコードする第三のポリヌクレオチドに機能的に連結している。好ましくは、当該置換はバシルス属の種の宿主、例えばバスルス・スブチリスによる成熟プロテアーゼの産生を増強する。
アーゼと約60%以上同一であるバシルス・クラウシ又はバシラス・レンツス由来の野生型の又は変異アルカリセリンプロテアーゼの成熟領域をコードする第三のポリヌクレオチドに機能的連結している。好ましくは、当該置換はバシルス属の種の宿主、例えばバシルス・スブチリスによる成熟プロテアーゼの産生を増強する。
E6S-A32K, E6T-A32K, E6N-A32K, E30W-A32K, E30V-A32K, E6A-E30G, E6R-E30G, E6C-E30G, E6Q- E30G, E6G-E30G, E6H-E30G, E6K-E30G, E6S-E30G, E6W-E30G, E30G-A32R, E30G-A32Q, E30G- A32E, E30G-A32G, E30G-A32H, E30G-A32I, E30G-A32K, E30G-A32S, E30G-A32T, E30G-A32W, E30G-A32V, E6G-E30G-A32E, E6G-E30G-A32S, E6G-E30G-A32T, E6G-E30G-A32W, E6A-E30G, E6R-E30G, E6N-E30G, E6D-E30G, E6C-E30G, E6Q-E30G, E6G-E30G, E6H-E30G, E6K-E30G, E6M-E30G, E6F-E30G, E6P-E30G, E6S-E30G, E6T-E30G, E6W-E30G, E6V-E30G, E6Y-E30G, E6A-E30S, E6G-E30S, E6L-E30S, E6K-E30S, E6F-E30S, E6P-E30S, E6Y-E30S, E6V-E30S, E30S-A32R, E30S- A32N, E30S-A32D, E30S-A32C, E30S-A32Q, E30S-A32E, E30S-A32G, E30S-A32H, E30S-A32L, E30S- A32K, E30S-A32M, E30S-A32F, E30S-A32P, E30S-A32S, E30S-A32T, E30S-A32W, E30S-A32Y, 及び E30S-A32Vから選ばれる2以上のアミノ酸の置換の組み合わせを含む)に機能的に連結している。次に当該第二のポリヌクレオチドは、配列番号9、11、13、15、17、19及び21から選ばれたプロテアーゼの成熟領域をコードする第三のポリヌクレオチドに機能的に連結している。好ましくは、当該置換はバシルス属の種の宿主、例えばバシルス・スブチリスによる成熟プロテアーゼの産生を増強する。
A32K, E6P-A32K, E6S-A32K, E6T-A32K, E6N-A32K, E30W-A32K, E30V-A32K, E6A-E30G, E6R-E30G, E6C-E30G, E6Q-E30G, E6G-E30G, E6H-E30G, E6K-E30G, E6S-E30G, E6W-E30G, E30G-A32R, E30G-A32Q, E30G-A32E, E30G-A32G, E30G-A32H, E30G-A32I, E30G-A32K, E30G-A32S, E30G- A32T, E30G-A32W, E30G-A32V, E6G-E30G-A32E, E6G-E30G-A32S, E6G-E30G-A32T, E6G-E30G- A32W, E6A-E30G, E6R-E30G, E6N-E30G, E6D-E30G, E6C-E30G, E6Q-E30G, E6G-E30G, E6H-E30G, E6K-E30G, E6M-E30G, E6F-E30G, E6P-E30G, E6S-E30G, E6T-E30G, E6W-E30G, E6V-E30G, E6Y- E30G, E6A-E30S, E6G-E30S, E6L-E30S, E6K-E30S, E6F-E30S, E6P-E30S, E6Y-E30S, E6V-E30S, E30S-A32R, E30S-A32N, E30S-A32D, E30S-A32C, E30S-A32Q, E30S-A32E, E30S-A32G, E30S-A32H, E30S-A32L, E30S-A32K, E30S-A32M, E30S-A32F, E30S-A32P, E30S-A32S, E30S-A32T, E30S-A32W, E30S-A32Y,及びE30S-A32V.から選ばれた2以上のアミノ酸の置換の組み合わせを含む)と機能的に連結している。次に、当該第二のポリヌクレオチドは、配列番号9の成熟プロテアーゼと約60%以上同一であるプロテアーゼの成熟領域をコードする第三のポリヌクレオチドと機能的に連結する。好ましくは、当該置換はバシルス属の種の宿主、例えばバシルス・スブチリスによる成熟プロテアーゼの産生を増強する。
E30W-A32K, E30V-A32K, E6A-E30G, E6R-E30G, E6C-E30G, E6Q-E30G, E6G-E30G, E6H-E30G, E6K- E30G, E6S-E30G, E6W-E30G, E30G-A32R, E30G-A32Q, E30G-A32E, E30G-A32G, E30G-A32H, E30G-A32I, E30G-A32K, E30G-A32S, E30G-A32T, E30G-A32W, E30G-A32V, E6G-E30G-A32E, E6G- E30G-A32S, E6G-E30G-A32T, E6G-E30G-A32W, E6A-E30G, E6R-E30G, E6N-E30G, E6D-E30G, E6C- E30G, E6Q-E30G, E6G-E30G, E6H-E30G, E6K-E30G, E6M-E30G, E6F-E30G, E6P-E30G, E6S-E30G, E6T-E30G, E6W-E30G, E6V-E30G, E6Y-E30G, E6A-E30S, E6G-E30S, E6L-E30S, E6K-E30S, E6F- E30S, E6P-E30S, E6Y-E30S, E6V-E30S, E30S-A32R, E30S-A32N, E30S-A32D, E30S-A32C, E30S- A32Q, E30S-A32E, E30S-A32G, E30S-A32H, E30S-A32L, E30S-A32K, E30S-A32M, E30S-A32F, E30S- A32P, E30S-A32S, E30S-A32T, E30S-A32W, E30S-A32Y, 及び E30S-A32V。次に、当該第二のポリヌクレオチドは配列番号9の成熟プロテアーゼと約60%以上同一である、プロテアーゼの成熟領域をコードする第三のポリヌクレオチドに機能的に連結している。好ましくは、成熟プロテアーゼはバシルス・クラウシまたはバシルス・レンツス由来の野生型または変異アルカリセリンプロテアーゼであり、例えば、配列番号9、11、13、15、17、19及び21である。いくつかの実施態様では、当該単離されたポリヌクレオチドの発現は発現ベクターに含まれるAprEプロモーターにより駆動される。
本願発明は修飾されたプロテアーゼをコードする修飾されたポリヌクレオチド、微生物においてプロテアーゼの産生を増強する方法を提供する。特に、修飾されたポリヌクレオチドは、活性な酵素の産生を増強するためにプロ領域の修飾、例えばアミノ酸置換、を受けたプロテアーゼをコードする1以上の変異を含む。本願発明は、さらにバシルス属の種のような、微生物中でのプロテアーゼの発現を変える方法に関する。
本明細書で使用する場合、用語「単離された」と「精製された」は天然で結合していた一以上の成分から分離された核酸又はアミノ酸(又は他の成分)をいう。
クラウシ、B.ハロジュランス、B.メガテリウム、B.コアグランス、B.サーキュランス、B.ラウツス、及びB.スリンギエンシスを含むがこれらに限定されない「バシルス」属の範囲内の全ての種を含む。バシルス属は分類学的再分類を受けていることが知られている。従って、当該属は、B・ステアロテルモフィルス(現在、「ジオバシルス・ステアロテルモフィルス」といわれている。)のような生物を含むが、これに限定されない再分類された種を含むことが意図されている。酸素存在下での耐性内生胞子の産生は、バスルス属を定義づける特徴であると考えられているが、この特性は、最近命名されたアリシクロバシルス(Alicyclobacillus)、アンフィバシルス(Amphibacillus)、アノイリニバシルス(Aneurinibacillus)、アノキシバシルス(Anoxybacillus)、ブレビバシルス(Brevibacillus)、フィロバシルス(Filobacillus)、グラシリバシルス(Gracilibacillus)、ハロバシルス(Halobacillus)、ペニバシルス(Paenibacillus)、サリバシルス(Salibacillus)、テルモバシルス(Thermobacillus)、ウレイバシルス(Ureibacillus)及びビルジバシルス(Virgibacillus)にも当てはまる。
修飾されたプロテアーゼ
本願発明は細菌の宿主細胞で成熟プロテアーゼの産生のための方法と組成物を与える。本組成物は、プロ領域に一以上の変異を含む修飾されたプロテアーゼをコードする修飾されたポリヌクレオチド;修飾されたポリヌクレオチドによりコードされた修飾されたセリンプロテアーゼ;修飾されたプロテアーゼをコードする修飾されたポリヌクレオチドを含む発現カセット;DNA構造体、ベクター;及び本発明のベクターで形質転換された細菌宿主細胞を含む。本方法は細菌宿主細胞、例えば、バシルス属の種の宿主細胞で、成熟プロテアーゼの産生を増強する方法を含む。産生されたプロテアーゼは、酵素に関する工業的生産に使用され、洗浄、動物飼料及び繊維処理工業を含むがこれらに限定されない種々の工業での使用に適している。
前駆体プロテアーゼをコードする前駆体ポリヌクレオチド
いくつかの実施態様では、修飾を受けていない前駆体ポリヌクレオチドは親プロテアーゼ、例えば、バシルス・クラウシとバシルス・レンツス、それらの相同体及び変異体由来のプロテアーゼのような、親プロテアーゼの成熟領域を含む全長のプロテアーゼをコードし、例えば以下のような、ポリヌクレオチドと機能的に連結している。
これは、以下の配列番号7のプロ領域をコードしている。
成熟親プロテアーゼの例は、野生型B.レンツス プロテアーゼ(B.lentus)、
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:9)、及びその変異体、例えば、配列番号第11のプロテアーゼ
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:1 1 );
野生型バシルス・クラウシPB92 プロテアーゼ マキサカル(Maxacal) (米国特許5,217,878)
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR; (SEQ ID NO:13),
ID NO:13)、及びその変異体、例えば
配列番号15のプロテアーゼ
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:15)
配列番号17のプロテアーゼ
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGMGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR; (SEQ ID NO:17),
配列番号19のプロテアーゼ
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGGGSNSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR; (SEQ ID NO:19),
配列番号21のプロテアーゼAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNRMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:21 )
配列番号23のプロテアーゼ
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNRMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRADFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSN RQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:23),
及び
配列番号25のプロテアーゼ
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRADFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRRHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:25)を含む。
配列番号9、11、13、15、17、19、21、23及25の成熟プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの例は、それぞれ図5に示されている配列番号8、10、12、14、16、18、20、22及び24である。遺伝子コードの縮重のため複数のヌクレオチド配列により1のポリペプチドがコードされることが分かる。
AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAP GVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVN AEAATR;(SEQ ID NO:38)
SEQ ID NO:39
AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVN AEAATR(SEQ ID NO:39)
SEQ ID NO:40
AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAP GVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVN AEAATR(SEQ ID NO:40)
SEQ ID NO:41 : AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAP GVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVN AEAATR (SEQ ID NO:41)
SEQ ID NO:42:
AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGMGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAP GVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVN AEAATR(SEQ ID NO:42)
SEQ ID NO:43:
AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGGGSNSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVN AEAATR(SEQ ID NO:43)
SEQ ID NO:44: AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNRMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVN AEAATR(SEQ ID NO:44)
SEQ ID NO:45:
AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNRMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRADFSQYGAGLDIVAP GVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNRQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVN AEAATR ( SEQ ID NO:45)及び
SEQ ID NO:46:
AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRADFSQYGAGLDIVAP GVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRRHLKNTATSLGSTNLYGSGLVN AEAATR (SEQ ID NO:46).
配列番号7のプロポリペプチドに機能的に連結している他の成熟親プロテアーゼは、バチルス属の種由来の成熟プロテアーゼの相同体を含む。例えば、P27693_バシルス_アルカロフィルス(alcalophilus)、例えば配列番号47、P20724_バシルス_属の種_YAB、例えば配列番号48、BAA25184_バシルス属の種、例えば配列番号49、YP_174261_B_クラウシ_KSM-K16例えば、配列番号50、BAA06157 バシルス属の種 G-825-6(配列番号51)及びBAF34115_A_トランスバーレンシス(transvaalensis)、例えば配列番号52(図3)。いくつかの実施態様では、修飾を受けていない前駆体ポリヌクレオチドは、配列番号7のプロポリペプチドに機能的に連結している配列番号9、11、13、15、17、19、21、23及び25の成熟領域と、約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、約98%以上、約99%以上同一であるプロテアーゼの成熟領域を含む前駆体プロテアーゼをコードする。
gtgagaagcaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgttaatctttacgatggcgttcagcaacatgtctgcgcaggct (配列番号2)によりコードされているAprEシグナルペプチドVRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQA(配列番号3)である。他の実施態様では、シグナルペプチドはポリヌクレオチド
gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgcttttagttcatcgatcgcatcggct
(配列番号4)でコードされた融合シグナルペプチドVRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASA(配列番号5)である。さらに他の実施態様では、前駆体ポリヌクレオチドはプロプロテアーゼに天然で、機能的に連結するシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。バシルス属の種の宿主細胞内で修飾されたプロテアーゼの効率的な分泌をすることができるいずれのシグナル配列も本発明のプロ-プロテアーゼに機能的に連結し得る。そのようなシグナルペプチドは細菌の分泌経路、例えばSec 経路、TAT経路を経るタンパク質の分泌に向かう細菌起源のシグナルペプチド、及び真核宿主細胞でのタンパク質の発現に使用できる原核性のシグナル配列を含む(EP1481059B1)。
先に述べた修飾されていない前駆体ポリヌクレオチドは、配列番号7のプロポリペプチド(成熟プロテアーゼに機能的に連結している)の位置1-84でアミノ酸のいずれか一つで一以上の変異を導入することにより修飾されたプロテアーゼをコードするように修飾されている。いくつかの実施態様では、一以上の変異はアミノ酸置換である。
ytanら、Nucleic Acids Res. 29(3):E9[2001]、及びGaytanらNucleic Acids Res. 30(16):e84[2002])を含む。
VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO:59);
配列番号60の全長のプロテアーゼ
VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNL YGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:60)
配列番号61の全長のプロテアーゼ
VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPS WSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO:61 );
配列番号62の全長のプロテアーゼ
VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPS WSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO:62)
配列番号63の全長のプロテアーゼ
VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGMGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPS WSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID:63)
配列番号64の全長のプロテアーゼ
VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGGGSNSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPS WSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:64)
配列番号65の全長のプロテアーゼ
VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNRMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPS WSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:65)
配列番号66の全長のプロテアーゼ
VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNRMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYAN AMAVGATDQNNNRADFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPS WSNRQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAAT (SEQ ID NO:66)
及び、配列番号67の全長のプロテアーゼ
VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRADFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPS WSNVQIRRHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:67)
を含む。
VRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASA (SEQ ID NO:5)
である。バシルス属の種の宿主細胞に修飾されたプロテアーゼの効率的な分泌ができるいずれのシグナルペプチドも、本願発明のプロプロテアーゼに機能的に連結しえる。そのようなシグナルペプチドは、細菌の分泌経路、例えば、Sec 経路、TAT経路を経るタンパク質の分泌に向ける細菌起源のシグナルペプチド、及び原核宿主細胞にタンパク質を発現するため使用できる真核シグナル配列を含む(EP1481059 B1)。
Molecular Biological Methods for Bacillus,John Wiley & Sons,[1990]、特に、第3章;B.スブチリスの適した複製プラスミドは、92ページに記載のものを含む。 Perego, M. (1993) Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis, p.615-624; A.L. Sonenshein, J.A. Hoch, and R. Losick(編)、Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria: biochemistry, physiology and molecular genetics, American Society for Microbiology, Washington, D.C.)
目的タンパク質、例えば、プロテアーゼの細胞における発現と産生のため、修飾されたプロテアーゼをコードする1以上のポリヌクレオチド及び好ましくは、複数のコピーを含む一以上の発現ベクターがプロテアーゼの発現に適した条件下で、細胞を形質転換する。いくつかの実施態様では、プロテアーゼをコードする配列は(ベクターに含まれる他の配列と同様)宿主細胞のゲノムに組み入れられ、一方、他の実施態様では、プラスミドは、細胞内で自律的な染色体外の因子として残る。従って、本願発明は、宿主細胞ゲノムに組み入れられる外来配列と染色体外の因子の両者を与える。本明細書に述べられている各ベクターは本願発明で使用されることが意図されている。いくつかの実施態様では、修飾されたプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド構造体は、修飾されたポリヌクレオチドの細菌の染色体への組み入れ、そして、任意に細菌染色体に、修飾されたポリヌクレオチドの増幅を可能にする組み込みベクター(integrating vector)(例.pJH-GG36; 図4)に存在する。組み入れ部位の例は、aprE、amyE、vegまたはpps領域を含むが、これらに限定されない。実際に、本技術分野の技術者に知られている他の部位が本願発明で使用されることが意図されている。いくつかの実施態様では、修飾されたプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの転写は、選択された前駆体プロテアーゼの野生型プロモーターであるプロモーターにより実施される。いくつかの他の実施態様では、プロモーターは前駆体プロテアーゼに異種であり、しかし、宿主細胞で機能する。具体的には、細菌宿主細胞での使用に適したプロモーターの例は、amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaIIプロモーター、B.ステアロテルモフィルス マルトース産生性アミラーゼ遺伝子、B.アミロリケファシエンス(BAN)アミラーゼ遺伝子、B.スブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子、B.クラウシアルカリプロテアーゼ遺伝子、B.プミルスキシロシダーゼ遺伝子、B.スリンギエンシス cryIIIA、及びB.リケニフォルミス アルファ-アミラーゼ遺伝子のプロモーターを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、プロモーターは以下の配列を有するAprE プロモーターである。
その他のプロモーターは、ファージラムダPR又はPLプロモーター、E.コリ lac、trpまたはtacプロモーターとA4プロモーターを含むがこれらに限定されない。
いくつかの実施態様では、バシルス宿主は以下の遺伝子、degU、degS、degR及びdegQの一以上で変異又は欠失を含むバシルス属の種である。好ましくは、変異はdegU遺伝子にあり、より好ましくは、変異はdegU(Hy)32にある(例えば、Msadek らJ.Bacteriol., 172:824-834[1990];及びOlmosら、Mol.Gen. Genet., 253:562-567[1997])。好ましい宿主株はdegU32(Hy)変異をもつバシルス・スブチリスである。いくつかのさらなる実施態様では、バシルス属の宿主はscoC4(例えば、Caldwellら、J.Bacteriol., 183:7329-7340[2001]); spoIIE(ArigoniらMol.Microbiol., 31:1407-1415[1999]); 及び/又はoppA又はoppオペロンの他の遺伝子(例えば、Peregoら、Mol.Microbiol., 5:173-185[1991]参照)に変異又は欠失を含む。実際、oppA遺伝子中の変異と同じ表現型を惹起するoppオペロン中のいずれれの変異も本発明の変異したバシルス株のいくつかの実施態様で使用されることが考えられている。いくつかの実施態様では、これらの変異のみが生じ、他の実施態様においては、変異の組み合わせが生じる。いくつかの実施態様では、本発明の修飾されたプロテアーゼの産生に使用されうる変異したバシルスは、一以上の先に述べた遺伝子において変異をすでに含むバシルス属の宿主細胞である。加えて、固有のプロテアーゼ遺伝子の変異及び/又は欠失を含むバシルス属の種の宿主細胞が使用される。いくつかの実施態様では、バシルス属の宿主細胞は、aprEとnprE遺伝子の欠失を含む。他の実施態様では、バシルス属の種の宿主細胞は、5つのプロテアーゼ遺伝子(US20050202535)の欠失を含み、他の実施態様では、バシルス属の種の宿主細胞は9つのプロテアーゼ遺伝子の欠失を含む(US2005 0202535)。
以下の実験の開示においては、以下の略号が使用される。:ppm(百万分の一部);M(モル);mM(ミリモル);μM(マイクロモル);nM(ナノモル);mol(モル);mmol(ミリモル);μmol(マイクロモル);nmol(ナノモル);gm(グラム);mg(ミリグラム);μg(マイクログラム);pg(ピコグラム);L(リットル);mlとmL(ミリリットル);μlとμL(マイクロリットル);cm(センチメートル);mm(ミリメートル);μm(マイクロメートル);nm(ナノメートル);U(単位);V(ボルト);MW(分子量);sec(秒);min(s)(分/分);h(s)とhr(s)(時間)、℃(摂氏);QS(十分な量);QC(QuickChange),
ND(実施せず);NA(適用せず);rpm(毎分回転数);w/v(容量に対する重量);v/v(容量対容量);g(重力);OD(吸光度);aa(アミノ酸);bp(塩基対);kb(キロ塩基対);kD(キロダルトン);suc-AAPF-pNA(スクニシル-L-アラニル-L-アラニル-L-プロリル-L-フェニル-アラニル-パラ-ニトロアニリド);DMSO(ジメチルスルホキシド);cDNA(DNAのコピー又は相補的DNA);DNA(デオキシリボ核酸);ssDNA(一本鎖DNA);dsDNA(二本鎖DNA);dNTP(デオキシリボヌクレオチド3リン酸);DTT(1,4-ジチオ-DL-スレイトール);H2O(水);dH2O(脱イオン水);HCl(塩化水素酸);MgCl2(塩化マグネシウム);MOPS(3-[N-モルホリノ]プロパンスルホン酸);NaCl(塩化ナトリウム);PAGE(ポリアクリルアミド ゲル電気泳動);PBS(リン酸で緩衝された生理食塩水[150mM NaCl、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2])、PEG(ポリエチレングリコール);PCR(ポリメラーゼ連鎖反応);PMSF(フッ化フェニルメチルスルホニル);RNA(リボ核酸);SDS(ドデシル硫酸ナトリウム);Tris(トリス(トリヒドロキシ)アミノメタン);SOC(2% Bacto Trypton、0.5%Bacto Yeast Extract、10mM NaCl、2.5mM KCl)、Terrific Broth(TB;
12g/l Bacto Tryptone、24g/l グリセロール、2.31g/l KH2PO4、及び12.54g/l K2HPO4);OD280(280nmにおける吸光度);OD600(600nmにおける吸光度);A405(405nmにおける吸光度);Vmax(酵素触媒反応の最大初期速度);HEPES(N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N-[2-エタンスルホン酸]);Tris-HCl(トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸);TCA(トリクロロ酢酸);HPLC(高圧液体クロマトグラフィー);RP-HPLC(逆相高圧液体クロマトグラフィー);TLC(薄層クロマトグラフィー);EDTA(エチレンジアミン4酢酸);EtOH(エタノール)、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム);Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン);TAED(N,N,N’,N’-エチレンジアミン4酢酸)
以下の実施例は本願発明のある実施態様とある面をさらに実証し、説明するために与えられ、その範囲を限定するものと解釈されてはならない。
実施例1
配列番号9の成熟アルカリプロテアーゼの産生に対する配列番号7のプロ領域における変異の効果
(a)プロ領域の6、30又は32の位置におけるアミノ酸の位置-飽和変異誘導
配列番号9の成熟プロテアーゼの産生に対するプロ領域の位置-飽和的変異誘導が製造業者の指図に従いQuikChange(登録商標)位置-指定変異誘導キット(QC;Stratagene)を使って行われた。AprEプロモーター及び配列番号59の全長のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むDNAカセットがpJH101ベクター(Ferrariら、J. Bacteriol. 154:1513-1515[1983])のEcoRIとHindIII制限部位にクローンされ、pJH-P9プラスミドを生成した。(PnはpJH-Pnプラスミドから発現された成熟プロテアーゼの配列番号をいう。)このDNAカセットは、B・スブチリス aprEプロモーター
gaattcctccattttcttctgctatcaaaataacagactcgtgattttccaaacgagctttcaaaaaagcctctgccccttgcaaatcggatgcctgtctataaaattcccgatattggttaaacagcggcgcaatggcggccgcatctgatgtctttgcttggcgaatgttcatcttatttcttcctccctctcaataattttttcattctatcccttttctgtaaagtttatttttcagaatacttttatcatcatgctttgaaaaaatatcacgataatatccattgttctcacggaagcacacgcaggtcatttgaacgaattttttcgacaggaatttgccgggactcaggagcatttaacctaaaaaagcatgacatttcagcataatgaacatttactcatgtctattttcgttcttttctgtatgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagcgagagatgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattacaataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaaga (SEQ ID NO:1 ),
と、AprEシグナルペプチド、VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQA(配列番号3)をコードする以下のポリヌクレオチド配列、
gtgagaagcaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgttaatctttacgatggcgttcagcaacatgtctgcgcaggct (SEQ ID NO:2)
非修飾プロ領域
AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAIS YIEEDAEVTTM (SEQ ID NO:7),
をコードする以下のポリヌクレオチド配列
gctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtagaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaagtaacgacaatg (SEQ ID NO:6),
、プロテアーゼ(P9)の成熟領域
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:9).
をコードする以下のポリヌクレオチド配列
gcgcaatcagtgccatggggaattagccgtgtgcaagccccagctgcccataaccgtggattgacaggttctggtgtaaaagttgctgtcctcgatacaggtatttccactcatccagacttaaatattcgtggtggcgctagctttgtaccaggggaaccatccactcaagatgggaatgggcatggcacgcatgtggccgggacgattgctgctttaaacaattcgattggcgttcttggcgtagcgccgagcgcggaactatacgctgttaaagtattaggggcgagcggttcaggttcggtcagctcgattgcccaaggattggaatgggcagggaacaatggcatgcacgttgctaatttgagtttaggaagcccttcgccaagtgccacacttgagcaagctgttaatagcgcgacttctagaggcgttcttgttgtagcggcatctggaaattcaggtgcaggctcaatcagctatccggcccgttatgcgaacgcaatggcagtcggagctactgaccaaaacaacaaccgcgccagcttttcacagtatggcgcagggcttgacattgtcgcac caggtgtaaacgtgcagagcacatacccaggttcaacgtatgccagcttaaacggtacatcgatggctactcctcatgttgcaggtgcagcagcccttgttaaacaaaagaacccatcttggtccaatgtacaaatccgcaatcatctaaagaatacggcaacgagcttaggaagcacgaacttgtatggaa gcggacttgtcaatgcagaagctgcaactcgt (SEQ ID NO:8),
を含んでいた。
変異されたプロ配列を有するE.コリ マイクロタイターセル培地の一部が5mlのLB+50ppm カルベニシリンに接種するために使用された。プラスミドDNAがQiagenキット(Qiagen)を用いて調製され、各プラスミドDNAの一部がB.スブチリス宿主細胞を形質転換するために使用された。10マイクロリットルのプラスミドDNA(pJH-P9)が100μlのB.スブチリス comK コンピテント細胞(遺伝子型:ΔaprE, ΔnprE、degUHy32、oppA、DspollE3501、amyE::xylRPxylAcomK-phleo)の形質転換に使用された。非変異のプロ配列(非変異配列番号7)を含むP9構造体を含む対照プラスミドもB. スブチリスcomK細胞を形質転換した。形質転換された細胞は、250rpmで振とうしながら37℃で45分間培養された。形質転換混合物由来の細胞は1.6%スキムミルクと5ppmクロラムフェニコール(CMP)を含有するLAプレートに接種され、37℃で一夜培養された。各形質転換体の1コロニーが採取され、5ppm CMP+1.6%スキムミルクを含有するLAプレートに再度広げられた。
実施例1(b)で述べられたようにして得られたB・スブチリス培地のそれぞれは、修飾されたプロテアーゼの産生について定量された。産生された酵素は基質、スクシニル-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-ニトロアニリド(AAPF)に対する活性について定量された。この定量は加水分解とp-ニトロアニリンの遊離から生じる毎分当たりの405nmの吸光度の増大により修飾されたプロテアーゼの産生量を測定している(Estellら、J Biol Chem., 260 :6518-6521(1985))。この測定はソフトマックス プロ(Sofmax Pro) ソフトウェアを使用して行われ、そして具体的条件は、タイプ:反応速度;リダクション(Reduction):Vmax Points(28ポイントのうちベストの15ポイントを読む);Lm1:405nm;時間:5分;間隔:11秒、が設定された。B.スブチリス培地のそれぞれ10マイクロリットルがプロテアーゼ活性の定量をするため10mM Tris+0.005% TWEEN(登録商標)-80、pH8.6;と25μlの100mg/ml AAPF 基質を含有する、100μlのTris緩衝液に稀釈された。修飾されたプロテアーゼのそれぞれの相対活性が計算され、各アミノ酸置換の対応する修飾プロテアーゼの産生に及ぼす効果が、非修飾のプロテアーゼ前駆体プロテアーゼから処理された成熟プロテアーゼの活性に対するそれぞれの修飾されたプロテアーゼから処理された成熟プロテアーゼの活性の比として決定された。DNA構造体が安定にコンピテントバシルス・スブチリス株に組み入れられると、修飾されたプロテアーゼの活性はマイクロタイターで定量され、活性が非修飾の前駆体から処理された対応するプロテアーゼの活性と比較された。
配列番号59の全長のプロテアーゼに含まれる領域(配列番号7)におけるA32K置換を発現するプラスミドは、2回目の位置6におけるコドンの位置飽和変異誘導を受けて、プロテアーゼのプロ領域のA32K置換と組み合わされた位置6のアミノ酸の置換を含む全長のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの第一のライブラリーを形成した。位置6での変異は、それぞれ配列番号26と27のフォーワードプライマーとリバースプライマーを使用して、製造業者の指図に従いQuikChange(登録商標)位置-指定変異誘導キット(QC; Stratagene)で作成された。同様に、ポリヌクレオチドの第2のライブラリーがプロテアーゼのプロ領域におけるA32Kと組み合わされた位置30のアミノ酸の置換を含む全長のプロテアーゼをコードするために作成された。相補的な、重複したフォーワード(CAAGTAGAGGCAAATGACNNSGTCAAAATTCTCTCTGAG; SEQ ID NO:32配列番号32)とリバースプライマー(CTCAGAGAGAATTTTGACSNNGTCATTTGCCTCTACTTG; SEQ ID NO:33
配列番号:33)が位置30の変異誘導のため使用された。
振とうフラスコでの配列番号9の成熟プロテアーゼの産生に及ぶプロ領域でのアミノ酸置換の効果を試験するため、先に述べたマイクロタイタープレートで培養されたバシルス・スブチリス株のいくつかは以下のように培養された。プロ領域の位置6、30及び32の一つでの1個の置換を含む、あるいはプロ領域の位置6と32、または30と32でアミノ酸の2個の置換の組み合わせを含み、かつ先にマイクロタイタープレートで培養された、修飾された前駆体を発現するバシルス・スブチリス株が最初に5ppmのクロラムフェニコールと1.6%のスキムミルクを含有するルリア寒天プレートに接種された。1個のコロニーが5ppmクロラムフェニコールを含有する5mlのルリア液体培地に接種された。5mlの各培養液は250rpmで振とうしながら37℃で5時間培養された。25mlのグランツII培地を含む250mlの振とうフラスコに1個の置換を含む株の5mlの培養液の1mlが接種され、この250ml培養物は250rpmで振とうしながら37℃で40、培養された。2個の置換を含む株は、表9と10に記載のデータで示されているとおり40及び/又は48時間培養された。振とうフラスコの上澄液は実施例1(c )で述べられているようにAAPF活性について定量された。1個の置換を含む株における活性の結果は表7と8に示され、A32K置換と組み合わされた位置6と32での置換を含む株での活性の結果は、それぞれ表9と10に示されている。
たときその対照サンプルより少ないプロテアーゼを産生したが、振とうフラスコで培養
されたときは各対照サンプルより多くプロテアーゼを産生した(A32T, A32V, E6S-A32K, E30V-A32KとE30W-A32K)。これらの株によるプロテアーゼの産生はマイクロタイターと振とうフラスコ培養で異なる増殖条件により影響を受けるらしい。本技術分野の技術者なら培養条件の最適化方法を知っているであろう。
配列番号11の成熟アルカリプロテアーゼの産生に対する配列番号7のプロ領域における変異の効果
プロ領域の6、30または32の位置におけるアミノ酸の位置飽和変異誘導
配列番号11の成熟プロテアーゼの産生に対するプロ領域の位置飽和変異誘導がQuikChange(登録商標)位置-指向変異誘発キット(QC; Stratagene)を使用し製造業者の指図に従い行われた。AprEプロモーターを含むDNAカセットと配列番号60の全長のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドがpJH101ベクターのEcoRIとHindIII制限部位にクローンされ(FerrariらJ.Bacteriol. 154:1513-1515[1983])、pJH-Pn(図4)pJH-P11プラスミドを生成した(PnはpJH-Pnプラスミドから発現された成熟プロテアーゼの配列番号をいう)。このDNAカセットはB・スブチリス aprEプロモーター、
gaattcctccattttcttctgctatcaaaataacagactcgtgattttccaaacgagctttcaaaaaagcctctgccccttgcaaatcggatgcctgtctataaaattcccgatattggttaaacagcggcgcaatggcggccgcatctgatgtctttgcttggcgaatgttcatcttatttcttcctccctctcaataattttttcattctatcccttttctgtaaagtttatttttcagaatacttttatcatcatgctttgaaaaaatatcacgataatatccattgttctcacggaagcacacgcaggtcatttgaacgaattttttcgacaggaatttgccgggactcaggagcatttaacctaaaaaagcatgacatttcagcataatgaacatttactcatgtctattttcgttcttttctgtatgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagcgagagatgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattacaataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaaga (SEQ ID NO:1 ),
、AprEシグナルペプチド
VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQA (SEQ ID NO:3),
をコードするポリヌクレオチド配列
gtgagaagcaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgttaatctttacgatggcgttcagcaacatgtctgcgcaggct (SEQ ID NO:2),
非修飾プロ領域
AEEAKEKYLI GFNEQEAVSE FVEQVEANDE VAILSEEEEV EIELLHEFET IPVLSVELSP EDVDALELDP AISYIEEDAE VTTM (SEQ ID NO:7),
をコードするポリヌクレオチド配列、
gctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtagaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaagtaacgacaatg (SEQ ID NO:6)
、及びプロテアーゼ P11(配列番号11)の成熟領域
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:1 1 ).
をコードするポリヌクレオチド配列
gcgcaatcagtgccatggggaattagccgtgtgcaagccccagctgcccataaccgtggattgacaggttctggtgtaaaagttgctgtcctcgatacaggtatttccactcatccagacttaaatattcgtggtggcgctagctttgtaccaggggaaccatccactcaagatgggaatgggcatggcacgcatgtggccgggacgattgctgctctagacaattcgattggcgttcttggcgtagcgccgagcgcggaactatacgctgttaaagtattaggggcgagcggttcaggcgccatcagctcgattgcccaaggattggaatgggcagggaacaatggcatgcacgttgctaatttgagtttaggaagcccttcgccaagtgccacacttgagcaagctgttaatagcgcgacttctagaggcgttcttgttgtagcggcatctggaaattcaggtgcaggctcaatcagctatccggcccgttatgcgaacgcaatggcagtcggagctactgaccaaaacaacaaccgcgccagcttttcacagtatggcgcagggcttgacattgtcgca ccaggtgtaaacgtgcagagcacatacccaggttcaacgtatgccagcttaaacggtacatcgatggctactcctcatgttgcaggtgcagcagcccttgttaaacaaaagaacccatcttggtccaatgtacaaatccgcaatcatctaaagaatacggcaacgagcttaggaagcacgaacttgtatgga agcggacttgtcaatgcagaagctgcaactcgt (SEQ ID NO:10),
を含んでいた。
振とうフラスコ培養における配列番号11の成熟プロテアーゼの産生に対するプロ領域におけるアミノ酸置換の効果を試験するため、上記のような前駆体プロテアーゼのプロ領域における位置6での置換を含むバシルス・スブチリス株のいくつかは実施例1(e)で述べられたように48時間培養された。振とうフラスコ培養の上澄液が実施例1(c)で述べられたようなAAPF活性に対して定量された。
配列番号19の成熟アルカリプロテアーゼの産生に対する配列番号7のプロ領域における変異の効果
(a) プロ領域の位置6、30または32のアミノ酸の位置-飽和変異誘導
配列番号19の成熟プロテアーゼの産生に対するプロ領域の位置-飽和変異誘導が、製造業者の指図に従いQuikChange(登録商標)位置-指定変異誘導キット(QC;Stratagene)を使用して行われた。AprEプロモーター、と配列番号64の全長のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むDNAカセットがpJH101ベクター(Ferrariら、J.Bacteriol.154:1513-1515[1983])EcoRIとHindIII制限部位にクローンされpJH-Pn(図4A)、pJH-P19プラスミドを形成した(PnはpJH-Pnプラスミドから発現された成熟プロテアーゼの配列番号を示す。)DNAカセットは、以下のB.スブチリス aprEプロモーター、
gaattcctccattttcttctgctatcaaaataacagactcgtgattttccaaacgagctttcaaaaaagcctctgccccttgcaaatcggatgcctgtctataaaattcccgatattggttaaacagcggcgcaatggcggccgcatctgatgtctttgcttggcgaatgttcatcttatttcttcctccctctcaataattttttcattctatcccttttctgtaaagtttatttttcagaatacttttatcatcatgctttgaaaaaatatcacgataatatccattgttctcacggaagcacacgcaggtcatttgaacgaattttttcgacaggaatttgccgggactcaggagcatttaacctaaaaaagcatgacatttcagcataatgaacatttactcatgtctattttcgttcttttctgtatgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagcgagagatgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattacaataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaaga (SEQ ID NO:1 ),
ポリヌクレオチド配列
gtgagaagcaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgttaatctttacgatggcgttcagcaacatgtctgcgcaggct (SEQ ID NO:2)、(これは、AprEシグナルペプチドVRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQA (SEQ ID NO:3),
をコードしている)
、ポリヌクレオチド配列、
gctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtagaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaagtaacgacaatg (SEQ ID NO:6),
、(これは非修飾のプロ領域、
AEEAKEKYLI GFNEQEAVSE FVEQVEANDE VAILSEEEEV EIELLHEFET IPVLSVELSP EDVDALELDP AISYIEEDAE VTTM (SEQ ID NO:7),
をコードしている)、及びポリヌクレオチド配列
gcgcaatcggtaccatggggaattagccgtgtgcaagccccagctgcccataaccgtggattgacaggttctggtgtaaaagttgctgtcctcgatacaggtatttccactcatccagacttaaatattcgtggtggcgctagttttgtaccaggggaaccatccactcaagatgggaatgggcatggcacgcatgtggctgggacgattgctgctttaaacaattcgattggcgttcttggcgtagcaccgaacgcggaactatacgctgttaaagtattaggggcgagcggtggcggttcgaacagctcgattgcccaaggattggaatgggcagggaacaatggcatgcacgttgctaatttgagtttaggaagcccttcgccaagtgccacacttgagcaagctgttaatagcgcgacttctagaggcgttcttgttgtagcggcatctggcaattcaggtgcaggctcaatcagctatccggcccgttatgcgaacgcaatggcagtcggagctactgaccaaaacaacaaccgcgccagcttttcacagtatggcgcagggcttgacattgtcgcaccaggtgtaaacgtgcagagcacatacccaggttcaacgtatgccagcttaaacggtacatcgatggctactcctcatgttgcaggtgcagcagcccttgttaaacaaaagaacccatcttggtccaatgtacaaatccgcaatcatctaaagaatacggcaacgagcttaggaagcacgaacttgtatggaa gcggacttgtcaatgcagaagcggcaacacgt(配列番号18)(これは、以下のプロテアーゼ19(配列番号19)の成熟領域をコードしている、
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGGGSNSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:19).
を含んでいた。
配列番号64の全長のプロテアーゼに含まれるプロ領域(配列番号7)におけるE30G置換を発現するプラスミドは、2回目の位置6でのコドンの位置-飽和変異誘導を受け、プロテアーゼのプロ領域のE30G置換と組み合わされたアミノ酸6の置換を含む全長のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドのライブラリーを形成した。位置6での変異は、それぞれ、配列番号26と配列番号27のフォーワード及びリバースプライマーを使用して、製造業者が提供した指図に従い、QuikChange(登録商標)位置-指定変異誘導キット(QC;Stratagene)を使用して形成された。
振とうフラスコ培養における配列番号19の成熟プロテアーゼの産生に対するプロ領域のアミノ酸置換の効果を試験するため、先に述べたようにマイクロタイタープレートで培養され、プロ領域にE6A-E30G、E6C-E30G及びE6V-E30Gの置換の組み合わせを含む、いくつかのバシルス・スブチリス株が実施例1(e)で述べられるように48時間培養された。振とうフラスコ培養物の上澄液が実施例1(c)で述べられるようにAAPF活性に関して分析された。
配列番号17の成熟アルカリプロテアーゼの産生に対する配列番号7のプロ領域の変異の効果
プロ領域の6、30又は32の位置におけるアミノ酸の位置-飽和変異誘導
配列番号17の成熟プロテアーゼの産生に対するプロ領域の位置-飽和変異誘導が、製造業者の指示に従いQuikChange(登録商標)位置-指定変異誘導キット(QC; Stratagene)を使って行われた。AprEプロモーター、と配列番号63の全長のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むDNAカセットがpJH101ベクター(Ferrariら、J.Bacteriol.154:1513-1515[1983]) pJH-Pn(図4A)のEcoRIとHindIII制限部位にクローンされpJH-P17プラスミドを形成した(PnはpJH-Pnプラスミドから発現される成熟プロテアーゼの配列番号をいう)。このDNAカセットは、以下のB・スブチリス aprEプロモーター、
gaattcctccattttcttctgctatcaaaataacagactcgtgattttccaaacgagctttcaaaaaagcctctgccccttgcaaatcggatgcctgtctataaaattcccgatattggttaaacagcggcgcaatggcggccgcatctgatgtctttgcttggcgaatgttcatcttatttcttcctccctctcaataattttttcattctatcccttttctgtaaagtttatttttcagaatacttttatcatcatgctttgaaaaaatatcacgataatatccattgttctcacggaagcacacgcaggtcatttgaacgaattttttcgacaggaatttgccgggactcaggagcatttaacctaaaaaagcatgacatttcagcataatgaacatttactcatgtctattttcgttcttttctgtatgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagcgagagatgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattacaataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaaga (SEQ ID NO:1 ),
、ポリヌクレオチド配列、
gtgagaagcaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgttaatctttacgatggcgttcagcaacatgtctgcgcaggct (SEQ ID NO:2)(これは、AprEシグナルペプチドVRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQA (SEQ ID NO:3),
をコードする)、
ポリヌクレオチド配列
gctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtagaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaagtaacgacaatg (SEQ ID NO:6),
(これは、非修飾プロ領域、
AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAIS YIEEDAEVTTM (SEQ ID NO:7),をコードする。)及び、以下のポリヌクレオチド配列、
GCGCAATCGGTACCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTATGGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGTTATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGACTGCAGGCACCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGCAATTCAGGTAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGC GGCAACACGT (SEQ ID NO:16),
(これはプロテアーゼ17(P17)の成熟領域、
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGMGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:17).をコードする。)を含む。
配列番号63の全長のプロテアーゼに含まれるプロ領域(配列番号7)におけるE30G置換を発現するプラスミドは、2回目の、位置6におけるコドンの位置-飽和変異誘導を受け、プロテアーゼのプロ領域のE30G置換と組み合わされたアミノ酸6の置換を含む全長のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの第一のライブラリーを形成した。位置6での変異は、それぞれ、配列番号26と27のフォーワードプライマーとリバースプライマーを使用して製造業者が提供した指図に従いQuikChange(登録商標)位置-指定変異誘導キット(QC;Stratagene)を使って形成された。同様に、ポリヌクレオチドの第2のライブラリーが、プロテアーゼのプロ領域におけるE30Gと組み合わされたアミノ酸32の置換を含む全長のプロテアーゼをコードするように形成された。相補的な重複するフォーワードプライマー、
GAGGCAAATGACGGCGTCNNSATTCTCTCTGAGGAAGAG (SEQ ID NO:34)
とリバースプライマー、
CTCTTCCTCAGAGAGAATSNNGACGCCGTCATTTGCCTC (SEQ ID NO:35),
が位置32を変異させるために使用された。
配列番号63の全長のプロテアーゼに含まれるプロ領域における置換E6G-E30Gの組み合わせを発現するプラスミドは、重ねて、位置32におけるコドンの位置-飽和変異誘導を受けプロテアーゼのプロ領域におけるE6G-E30Gの置換の組み合わせと組み合わされたアミノ酸32の置換を含む全長のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドのライブラリーを形成した。位置32の変異は、それぞれ、配列番号34と配列番号35のフォーワード及びリバーズプライマーを使用して、製造業者が提供した指図に従い、QuikChange(登録商標)位置-指定変異キッド(QC;Stratagene)を使用して形成された。
振とうフラスコ培養における配列番号17の成熟プロテアーゼの産生に対するプロ領域におけるアミノ酸置換の効果を試験するため、先に述べたようにマイクロタイタープレートで培養され、位置30での置換と位置6又は32での2回目の置換と組合わせて含むいくつかのバシルス・スブチリス株及びプロ領域に3個の置換の組み合わせを含む株が、実施例1 (e)に述べられたように48時間培養された。振とうフラスコ培養の上澄液が実施例1(c )で述べられたようにAAPF活性に関して分析された。
配列番号21の成熟アルカリプロテアーゼの産生に対する配列番号7のプロ領域における変異の効果
(a)プロ領域の位置6、30及び32でのアミノ酸の位置-飽和変異誘導
配列番号21の成熟プロテアーゼに産生に対するプロ領域の位置-飽和変異誘導が製造業者が提供する指図に従いQuikChange(登録商標)位置-指定変異誘導キットを使用して行われた。AprEプロモーター、配列番号21の全長プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むDNAカセットがpBN3ベクター(Babeら、Appl. Biochem. 27:117-124[1998]) pBN3(図4B)のEcoRIとHindIII制限部位にクローンされpBN3-P21プラスミドを生成した。このP21 DNAカセットは、B・スブチリス aprEプロモーター
gaattcctccattttcttctgctatcaaaataacagactcgtgattttccaaacgagctttcaaaaaagcctctgccccttgcaaatcggatgcctgtctataaaattcccgatattggttaaacagcggcgcaatggcggccgcatctgatgtctttgcttggcgaatgttcatcttatttcttcctccctctcaataattttttcattctatcccttttctgtaaagtttatttttcagaatacttttatcatcatgctttgaaaaaatatcacgataatatccattgttctcacggaagcacacgcaggtcatttgaacgaattttttcgacaggaatttgccgggactcaggagcatttaacctaaaaaagcatgacatttcagcataatgaacatttactcatgtctattttcgttcttttctgtatgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagcgagagatgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattacaataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaaga (SEQ ID NO:1 ),
、ポリヌクレオチド配列
gtgagaagcaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgttaatctttacgatggcgttcagcaacatgtctgcgcaggct (SEQ ID NO:2)
(AprEシグナルペプチド、VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQA (SEQ ID NO:3),をコードする)
ポリヌクレオチド配列
gctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtagaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaagtaacgacaatg (SEQ ID NO:6),
(非修飾プロ領域、
AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAIS YIEEDAEVTTM (SEQ ID NO:7),をコードする)、
及びポリヌクレオチド配列
GCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTTTAGACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGAGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATCGTATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGACTGCAGGCACCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGT (SEQ ID NO:20),(これはプロテアーゼ21(P21)の成熟領域、
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNRMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:21 ).
をコードする。)
を含んでいた。
プロ領域(配列番号7)におけるE30S置換を発現するプラスミドは、プロテアーゼのプロ領域のE30S置換と組み合わされたアミノ酸6の位置の置換を含む全長プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの第一のライブラリーを形成するため位置6で、2回目のコドンの位置飽和変異誘導を受けた。位置6での変異は、それぞれ、配列番号26と27のフォーワードプライマーとリバースプライマー(表1)を使用して、製造業者により提供された指図に従いQuikChange(登録商標)位置-指定変異誘導キット(QC;Stratagene)を使用して作成された。同様に、ポリヌクレオチドの第二のライブラリーはプロテアーゼのプロ領域におけるE30S置換と組み合わされたアミノ酸32の置換を含む全長のプロテアーゼをコードするように作成された。E30S置換と組合わせたA32X変異を含む変異を受けたポリヌクレオチドのライブラリーを作成するために使用される相補的な重複するフォーワードプライマーは、相補的なフォーワード
GAGGCAAATGACTCGGTCNNSATTCTCTCTGAGGAAGAG (SEQ ID NO:36)
であり、リバースプライマーは、
CTCTTCCTCAGAGAGAATSNNGACCGAGTCATTTGCCTC (SEQ ID NO:37)
であった。
Claims (25)
- 修飾されたプロテアーゼをコードする単離され、修飾されたポリヌクレオチドであって、前記単離され、修飾されたポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含み、前記第1のポリヌクレオチドは配列番号7に表されたプロ領域をコードする第2のポリヌクレオチドに機能的に連結され、前記プロ領域は、前記プロ領域の位置6、30及び32から選ばれた位置で2個以上のアミノ酸の置換の組み合わせを含み、前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号9の成熟プロテアーゼと約60%以上同一であるプロテアーゼの成熟領域をコードする第3のポリヌクレオチドと機能的に連結しており、当該位置は、配列番号7のプロポリペプチドのアミノ酸配列との対応により番号が付されているものである、ポリヌクレオチド。
- 請求項1の単離され、修飾されたポリヌクレオチドであって、前記成熟プロテアーゼは、バシルス・クラウシ(Bacillus clausii)又はバシルス・レンツス(Bacillus lentus)由来の、野生型又は変異アルカリセリンプロテアーゼである、ポリヌクレオチド。
- 請求項1または2の単離され、修飾されたポリヌクレオチドであって、前記成熟プロテアーゼは配列番号9、11、13、15、17、19及び21から選ばれるアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチド。
- 請求項1−3のいずれか1請求項の単離されたポリヌクレオチドであって、前記シグナルペプチドは配列番号3と5から選ばれるアミノ酸配列を有するものである、ポリヌクレオチド。
- 請求項1−4のいずれかの1請求項の単離され、修飾されたポリヌクレオチドであって、前記置換の組み合わせはE6X-E30G、E6X-E30S、E6X-A32K、E30X-A32K、E30G-A32X、E30S-A32X及びE6G-E30G-A32Xから選ばれるものである、ポリヌクレオチド。
- 請求項1-4のいずれかの1請求項の単離され、修飾されたポリヌクレオチドであって、置換の前記組み合わせは、
E6R-A32K, E6N-A32K,E6D-A32K, E6I-A32K, E6K-A32K, E6M-A32K, E6P- A32K, E6S-A32K, E6T-A32K, E6N-A32K, E30W-A32K, E30V-A32K, E6A-E30G, E6R-E30G, E6C-E30G, E6Q-E30G, E6G-E30G, E6H-E30G, E6K-E30G, E6S-E30G, E6W-E30G, E30G-A32R, E30G-A32Q, E30G-A32E, E30G-A32G, E30G-A32H, E30G-A32I, E30G-A32K, E30G-A32S, E30G-A32T, E30G- A32W, E30G-A32V, E6G-E30G-A32E, E6G-E30G-A32S, E6G-E30G-A32T, E6G-E30G-A32W, E6A- E30G, E6R-E30G, E6N-E30G, E6D-E30G, E6C-E30G, E6Q-E30G, E6G-E30G, E6H-E30G, E6K-E30G, E6M-E30G, E6F-E30G, E6P-E30G, E6S-E30G, E6T-E30G, E6W-E30G, E6V-E30G, E6Y-E30G, E6A- E30S, E6G-E30S, E6L-E30S, E6K-E30S, E6F-E30S, E6P-E30S, E6Y-E30S, E6V-E30S, E30S-A32R, E30S-A32N, E30S-A32D, E30S-A32C, E30S-A32Q, E30S-A32E, E30S-A32G, E30S-A32H, E30S-A32L, E30S-A32K, E30S-A32M, E30S-A32F, E30S-A32P, E30S-A32S, E30S-A32T, E30S-A32W, E30S-A32Y, 及びE30S-A32V.
から選ばれるものである、ポリヌクレオチド。 - 請求項1−6のいずれか1請求項の単離されたポリヌクレオチドであって、前記置換はバシルス属の種の宿主細胞による前記成熟プロテアーゼの産生を強化するものである、ポリヌクレオチド。
- 請求項7の単離されたポリヌクレオチドであって、前記バシルス属の種の宿主細胞はバシルス・スブチリス(Bacillus subtilis)宿主細胞である、ポリヌクレオチド。
- 請求項1の単離され、修飾されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項9の発現ベクターであって、さらにAprEプロモーターを含むものである発現ベクター。
- 請求項9または10の発現ベクターを含むバシルス属の種である宿主細胞。
- 前記宿主細胞がB・スブチリス(B.subtilis)宿主細胞である、請求項11の宿主細胞。
- バシルス属の種の宿主細胞で成熟プロテアーゼを産生する方法であって、前記方法は、
a) 請求項10の発現ベクターを提供し
b) 前記発現ベクターによりバシルス属の種の宿主細胞を形質転換し、
c) 適当な条件で前記宿主細胞を培養し、その結果前記プロテアーゼが前記宿主細胞により産生される
工程を含む、成熟プロテアーゼを産生する方法。 - 請求項13の方法であって、前記バシルス属の種の宿主細胞はバシルス・スブチリス宿主細胞である、方法。
- 請求項13または14の方法であって、前記成熟プロテアーゼは、野生型バシルス・クラウシ(Bacillus clausii)又はバシルス・レンツス(Bacillus lentus)アルカリセリンプロテアーゼ、またはそれらの変異体または相同体である、方法。
- 請求項13−15のいずれかの1請求項の方法であって、前記第1のポリヌクレオチドは配列番号3のシグナルペプチドをコードし、前記プロ領域をコードする前記第2のポリヌクレオチドは、
E6R-A32K, E6N-A32K, E6D-A32K, E6I-A32K, E6K-A32K, E6M-A32K, E6P-A32K, E6S-A32K, E6T-A32K, E6N-A32K, E30W-A32K, 及び E30V-A32Kから選択される置換の組み合わせを含み、前記第3のポリヌクレオチドが配列番号9から選択される成熟プロテアーゼをコードするものである、方法。 - 請求項13−15のいずれかの1請求項の方法であって、前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号3のシグナルペプチドをコードし、前記プロ領域をコードする前記第2のポリヌクレオチドは、
E6A-E30G, E6R-E30G, E6C-E30G, E6Q-E30G, E6G-E30G, E6H-E30G, E6K-E30G, E6S-E30G, E6W-E30G, E30G-A32R, E30G-A32Q, E30G-A32E, E30G-A32G,
E30G-A32H, E30G-A32I, E30G-A32K, E30G-A32S, E30G-A32T, E30G-A32W, E30G-A32V, E6G-E30G- A32E, E6G-E30G-A32S, E6G-E30G-A32T, 及びE6G-E30G-A32Wから選択される置換の組合せを含み、前記第3のポリヌクレオチドは配列番号17から選択される成熟プロテアーゼをコードするものである、方法。 - 請求項13−15のいずれかの1請求項の方法であって、前記第1のポリヌクレオチドは配列番号3のシグナルペプチドをコードし、前記プロ領域をコードする前記第2のポリヌクレオチドは、
E6A-E30G, E6R-E30G, E6N-E30G, E6D-E30G, E6C-E30G, E6Q-E30G, E6G-E30G, E6H-E30G, E6K-E30G, E6M-E30G, E6F-E30G, E6P-E30G, E6S-E30G, E6T- E30G, E6W-E30G, E6V-E30G及びE6Y-E30G,
から選ばれる置換の組み合わせを含み、前記第3のポリヌクレオチドは配列番号19から選ばれた成熟プロテアーゼをコードするものである、方法。
- 請求項13−15のいずれか1請求項の方法であって、前記第1のポリヌクレオチドは配列番号3のシグナルペプチドをコードし、前記プロ領域をコードする前記第2のポリヌクレオチドは、
E6A-E30S,E6G-E30S, E6L-E30S, E6K-E30S, E6F-E30S, E6P- E30S, E6Y-E30S, E6V-E30S, E30S-A32R, E30S-A32N, E30S-A32D, E30S-A32C, E30S-A32Q, E30S- A32E, E30S-A32G, E30S-A32H, E30S-A32L, E30S-A32K, E30S-A32M, E30S-A32F, E30S-A32P, E30S- A32S, E30S-A32T, E30S-A32W, E30S-A32Y及び E30S-A32Vから選ばれた置換の組み合わせを含み、前記第3のポリヌクレオチドは配列番号21から選ばれた成熟プロテアーゼをコードするものである、方法。 - 修飾されたプロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記単離され、修飾されたポリヌクレオチドは配列番号3のシグナルペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含み、前記第1のポリヌクレオチドは配列番号7に表されたプロ領域をコードする第2のポリヌクレオチドに機能的に連結し、前記プロ領域はE6A、E6C、E6Y、E30A、E30L、E30P、E30T、E30Y、E30V、A32C、A32E、A32G、A32K及びA32Tから選ばれたアミノ酸の置換を含み、前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号17のプロテアーゼの成熟領域をコードする第3のポリヌクレオチドと機能的に連結している、ポリヌクレオチド。
- 修飾されたプロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記単離され、修飾されたポリヌクレオチドは、配列番号3のシグナルペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含み、前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号7に表されたプロ領域をコードする第2のポリヌクレオチドに機能的に連結しており、前記プロ領域はE6A、E6C、E6F、E6P、E6T、E6W、E6V、A32K及びA32Tから選ばれたアミノ酸の置換を含み、前記第2のポリヌクレオチドは配列番号9のプロテアーゼの成熟領域をコードする第3のポリヌクレオチドに機能的に連結しているものである、ポリヌクレオチド。
- 修飾されたプロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記単離され、修飾されたポリヌクレオチドは、配列番号3のシグナルペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含み、前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号7に表されたプロ領域をコードする第2のポリヌクレオチドに機能的に連結し、前記プロ領域はE6A、E30A、E30L、E30T及びE30Vから選ばれたアミノ酸の置換を含み、前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号19のプロテアーゼの成熟領域をコードする第3のポリヌクレオチドと機能的に連結しているものである、ポリヌクレオチド。
- 修飾されたプロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドであり、前記単離され、修飾されたポリヌクレオチドは配列番号3のシグナルペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含み、前記第1のポリヌクレオチドは配列番号7に表されたプロ領域をコードする第2のポリヌクレオチドと機能的に連結し、前記プロ領域はE6A、E6L、E6F、E6T、E6V、E30I、E30L、E30P、E30T、E30Y、E30V、A32Q、A32S及びA32Tから選ばれるアミノ酸の置換を含み、前記第2のポリヌクレオチドは配列番号11のプロテアーゼの成熟領域をコードする第3のポリヌクレオチドと機能的に連結しているものである、ポリヌクレオチド。
- 修飾されたプロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドであり、前記単離され、修飾されたポリヌクレオチドは配列番号3のシグナルペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含み、前記第1のポリヌクレオチドは配列番号7に表されたプロ領域をコードする第2のポリヌクレオチドと機能的に連結し、前記プロ領域はE30Aのアミノ酸の置換を含み、前記第2のポリヌクレオチドが配列番号21のプロテアーゼの成熟領域をコードする第3のポリヌクレオチドと機能的に連結しているものである、ポリヌクレオチド。
- バシルス・スブチリス宿主細胞で成熟プロテアーゼを産生する方法であって、前記方法は、
a) 請求項20、21、22、23及び24の単離されたポリヌクレオチドから選ばれた単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供し、
b) 前記発現ベクターにより前記バシルス・スブチリス宿主細胞を形質転換し、
c) 適した条件で前記宿主細胞を培養し、その結果前記成熟プロテアーゼが前記宿主細胞により産生される
工程、を含むものである、方法。
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