JP2012515213A

JP2012515213A - 免疫応答を増強するための、ｍＴＯＲ阻害剤を含有する方法及び組成物

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Publication number: JP2012515213A
Application number: JP2011546329A
Authority: JP
Inventors: キム，ヒョン; シュリカント，プラトル; ワン，イェンピン; リー，チンシェン; ラオ，ラジェシュ
Original assignee: Health Research Inc
Current assignee: Health Research Inc
Priority date: 2009-01-14
Filing date: 2010-01-14
Publication date: 2012-07-05
Also published as: CA2748931A1; US20100196311A1; CN102281761A; EP2375897A1; EP2375897A4; WO2010083298A1

Abstract

抗原に対する免疫応答を増強する組成物及び方法が提供される。組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の個体群と、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤とを含む。個体において、抗原に対する増強された免疫応答を得る方法は、個体に対して前記抗原と哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤とを投与することを必要とする。ＣＤ８＋Ｔ細胞は養子細胞移入（ＡＣＴ）療法にも使用しうる。

Description

本願は、その開示内容の全体が本明細書中で援用される、２００９年１月１４日出願の米国出願番号６１／１４４，５３７及び２０１０年１月７日出願の米国出願番号６１／２９３，０９６に対して優先権を主張する。本発明は、国立衛生研究所より授与された助成金番号５Ｒ０１ＣＡ１０４６４５の助成の元になされた。米国政府は本発明について、所定の権利を有する。

本発明は、一般的には免疫応答の調整に関し、さらに詳しくは、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤を用いて、個体における細胞性免疫応答を増強することに関する。

がんワクチンは、臨床的及び前臨床的な研究において活発な治験が行われている。基本的に、免疫システムを標的がんに動員することは魅力的である。免疫システムには、腫瘍特異的な抗原を認識し、正常組織中にある罹患細胞を根絶させる能力がある。しかしながら、患者を扱うための、がんワクチンの有効な応用は限定的なものにとどまっている。そして、がんワクチンの有効性を高めることには、現在進行中で未だ満たされていない必要性がある。

本発明は、ワクチンの効果を増強するための組成物及び方法を提供する。一つの態様として、本発明は、個体における抗原に対する免疫応答を増強するための方法を提供する。この方法は、個体に対して抗原とｍＴＯＲ阻害剤とを投与することを含む。ｍＴＯＲ阻害剤と抗原とは、同じ組成物に含まれる成分として投与されてもよく、されなくてもよい。また、同時投与、又は、段階的に投与されてもよい。好ましくは、抗原の投与の後にｍＴＯＲ阻害剤が投与される。

他の態様としては、本発明はＣＤ８＋Ｔ細胞の個体群及びｍＴＯＲ阻害剤を含む組成物を提供する。かかる組成物はさらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的な抗原を含んでもよく、さらに、ＩＬ−１２のようなアジュバントを含んでもよい。

増強された免疫応答には、個体において、抗原を有する細胞に対する、増強された細胞性の免疫応答をも含みうる。増強された応答には、抗原を有する細胞に対して細胞傷害性を示すＣＤ８＋Ｔ細胞の増加も包含しうる。増強された免疫応答にはまた、或いは代替的に、増強された栄養及び／又は抗原に対する抗原リコール応答を示すＣＤ８＋Ｔ細胞、又は、抗原に特異的なエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の量及び／又は活性の増加をも含みうる。このような免疫応答のコンビネーションが、本発明の組成物及び方法によって導かれうる。増強された免疫応答は、抗原を発現している細胞の生長阻害、個体における抗原を発現した細胞の死、及び／又は個体の生存の延長によって、もしくは当業者に知られた別の態様によって、具現化され得る。

様々な態様において、本発明の方法及び組成物を使用して処置される個体は、抗原に対する増強された免疫応答を必要とする個体である。その個体は以前にｍＴＯＲ阻害剤を受け取っていない個体でありうる。このような個体の無制限の例は、例えば組織移植のために免疫抑制療法を受けている個人も含まれる。一つの態様では、個人は、がんの処置を必要としている個人である。

本発明は、あらゆるｍＴＯＲ阻害剤を用いること、及び、ＣＤ８＋Ｔ細胞に提示されうるあらゆる抗原に対する細胞性の免疫応答（体液性及び／又は先天性の免疫応答もまた、含まれうる）を増強することに適していることが期待される。

図１は、タイプＩエフェクター成熟のためのプログラムナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞がｍＴＯＲ活性を増強し、維持することを示している。（Ａ及びＢ）ＢＯＫ（Ａｇ＋Ｂ７．１）（±）ＩＬ−１２で刺激されたＯＴ−Ｉ細胞について、（Ａ）ＩＣＳによるＩＦＮ−γ、（Ｂ）細胞溶解活性が測定された。（一次；刺激付与後７２時間、二次；２回目の刺激付与後２４時間）；^＊＊＊ｐ＜０．０００２。（Ｃ〜Ｅ）抗原（Ａｇ）（この抗原は、Ｌｙｓ及びＬｕｅ（ＯＶＡｐ）に後続されているＡｓｎＰｈｅＧｌｕに後続されているＳｅｒＩｌｅＩｌｅからなるペプチドである。１０ｎＭで使用）に刺激されたＯＴ−Ｉ細胞が、所記の時間においてＩＣＳによって測定された。（Ｃ）はリン酸化ｍＴＯＲ、（Ｄ）はリン酸化Ｓ６Ｋ、（Ｅ）はリン酸化リボソームＳ６である。ｍＴＯＲ阻害のために、ラパマイシン（２０ｎｇ／ｍＬ）が抗原、サイトカインの添加３０分前に加えられた。データは、類似の結果であった少なくとも３回の独立した実験の代表値である（データは平均±標準偏差で示されている）。

ＩＬ−１２はＰＩ３Ｋ及びＳＴＡＴ４を通じて抗原誘導性のｍＴＯＲ活性を強化する（Ａ及びＢ）Ａｇ＋Ｂ７．１（±）ＩＬ−１２及びＬＹ２９４００２（１０μＭ）で刺激されたＯＴ−Ｉ細胞は、ＩＣＳによって、（Ａ）４８時間におけるリン酸化Ａｋｔ、（Ｂ）所記の時間におけるリン酸化Ｓ６Ｋが測定された。（Ｃ）Ａｇ＋Ｂ７．１（ＩＬ−１２有／無）で刺激された野生型（ＷＴ）又はＳｔａｔ４^−１−ＯＴ−Ｉ細胞の、所記の時点におけるリン酸化Ｓ６Ｋが分析された；^＊＊＊ｐ＜０．０００１。示された実験は、類似の結果であった少なくとも３回の独立した実験の代表値である（データは平均±標準偏差で示されている）。

持続的なｍＴＯＲ活性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の遺伝的なタイプＩエフェクター分化に本質的である（Ａ−Ｃ）Ａｇ＋Ｂ７．１（±）ＩＬ−１２及びラパマイシンによって刺激されたＯＴ−Ｉ細胞は、一次及び二次フェーズにおいて、（Ａ）ＩＣＳによるＩＦＮ−γ（^＊＊＊ｐ＜０．０００２；ｎ．ｓ．有意でない）、（Ｂ）細胞溶解活性、（Ｃ）ＩＣＳによる７２時間におけるグランザイムＢの発現、が測定された。（Ｄ及びＥ）（Ｄ）４８時間におけるＳ６Ｋリン酸化、（Ｅ）一次、二次フェーズにおけるＩＦＮ−γの産生を測定するために、ＯＴ−Ｉ細胞はＡｇ＋Ｂ７．１（±）ＩＬ−１２で刺激され、刺激後１２時間においてラパマイシンが添加された。示された実験は、類似の結果であった少なくとも３回（Ａ、Ｂ）及び２回（Ｃ−Ｅ）の独立した実験の代表値である（データは平均±標準偏差で示されている）。

ＩＬ−１２増強性のｍＴＯＲリン酸化はＣＤ８＋Ｔ細胞のＴ−ｂｅｔ決定性のタイプＩエフェクター成熟に本質的である（Ａ−Ｃ）Ａｇ＋Ｂ７．１（±）ＩＬ−１２及びラパマイシンによって刺激されたＯＴ−Ｉ細胞は、（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲによる、所記の時点におけるＴ−ＢｅｔｍＲＮＡ、（Ｂ）ＩＣＳによる、所記の時点におけるＴ−ｂｅｔタンパク質の発現、（Ｃ）抗原リコールの前後の、ＩＣＳによる、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の発現、が測定された。^＊＊ｐ＜０．００３５；^＊＊＊ｐ＜０．０００５。（Ｄ）野生型（ＷＴ）及びＴｂｘ^−／−ＯＴ−Ｉ細胞はＡｇ＋Ｂ７．１（±）ＩＬ−１２で刺激され、一次及び二次フェーズにおいてＩＦＮ−γ産生が測定された。^＊＊＊ｐ＜０．０００１；（Ｅ及びＦ）Ａｇ＋Ｂ７．１（±）ＩＬ−１２及びラパマイシンによって刺激されたＯＴ−Ｉ細胞は、Ｔ−ｂｅｔ−ＥＲレトロウィルスベクター（±）４ＨＴ（１０ｎＭ）で形質導入され、ＩＣＳによって（Ｅ）ＩＣＳによるＴ−ｂｅｔタンパク質の発現、（Ｆ）二次フェーズ（１６８時間）でのＩＦＮ−γ、が測定された。（Ｇ及びＨ）Ａｇ＋Ｂ７．１（±）インシュリン（１Ｕ／ｍＬ）及びラパマイシンによって刺激されたＯＴ−Ｉ細胞は、ＩＣＳによって、（Ｇ）４８時間におけるＳ６Ｋリン酸化、（Ｈ）７２時間におけるＴ−ｂｅｔ発現が測定された。示された実験は、類似の結果であった少なくとも３回（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）及び２回（Ｃ、Ｇ、Ｈ）の独立した実験の代表値である（データは平均±標準偏差で示されている）。

ｍＴＯＲ阻害は、持続的なエオメス（Ｅｏｍｅｓ）の発現とＣＤ８＋Ｔ細胞におけるメモリーの表現型マーカーをプロモートする（Ａ及びＢ）Ａｇ＋Ｂ７．１（±）ＩＬ−１２及びラパマイシンによって刺激されたＯＴ−Ｉ細胞は、（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲによって、所記の時点におけるエオメスｍＲＮＡ、（Ｂ）ＩＣＳによって、７２時間におけるエオメスタンパク質の発現が測定された。^＊ｐ＜０．０３。（Ｃ）Ａｇ＋Ｂ７．１（±）ＩＬ−１２及びラパマイシンによって刺激されたＯＴ−Ｉ細胞は、Ｔ−ｂｅｔ−ＥＲレトロウィルスベクター（±）４ＨＴ（１０ｎＭ）で形質導入され、９６時間におけるエオメスタンパク質の発現が測定された。（Ｄ）Ａｇ＋Ｂ７．１（±）ＩＬ−１２及びラパマイシンによって刺激されたＯＴ−Ｉ細胞は、７２時間におけるＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＫＬＲＧ１、ＣＤ１２７、及びＣＤ１２２の発現が測定された。（Ｅ）所記の時点におけるＢｃｌ−２及びＢｃｌ−３ｍＲＮＡの発現。（Ｆ及びＧ）Ａｇ＋Ｂ７．１（±）ＩＬ−１２及びラパマイシンによって７２時間刺激されたＯＴ−Ｉ細胞は、２度洗浄され、さらに７２時間、（Ｆ）ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）、^＊ｐ＜０．０２、（Ｇ）ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）、^＊ｐ＜０．０２の存在下で静置され、１４４時間における細胞の回復パーセント（％）が測定された。示された実験は、類似の結果であった３回の独立した実験の代表値である（データは平均±標準偏差で示されている）。

ｍＴＯＲ阻害は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の産出を増強する。Ａｇ＋Ｂ７．１（±）ＩＬ−１２及びラパマイシンによって７２時間刺激されたＯＴ−Ｉ細胞（Ｔｈｙ１．１^＋）は、７２時間目に回収され、ＢＬ／６レシピエントに養子移入された（細胞数２×１０^６）。（Ａ）移入後２４時間の、リンパ節（^＊＊ｐ＜０．００５２）、脾臓（^＊＊ｐ＜００３７）、及び肝臓（^＊＊ｐ＜０．００１２、^＊＊ｐ＜０．００１１）における養子移入されたＯＴ−Ｉ細胞の全体数（Ｂ−Ｅ）レシピエントマウスは、移入後４０日にＩＦＡ−ＯＶＡで免疫され、二次的なＣＤ８＋Ｔ細胞の応答が３日後に測定された。（Ｂ）脾臓での免疫前（４０日）及び後（４３日）の養子移入された細胞の全体数。丸カッコ中の数字は、４０日から４３日でのＣＤ８α^＋Ｔｈｙ１．１^＋の増加倍率を示している。（Ｃ）４３日、脾臓でのＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８α^＋Ｔｈｙ１．１^＋細胞の全体数、^＊ｐ＜０．０１、^＊＊ｐ＜０．００８。丸カッコ中の数字は、ＭＦＩ及びＩＦＮ−γの発現を示している。（Ｄ）４３日、脾臓でのＣＤ８α^＋Ｔｈｙ１．１^＋細胞のグランザイムＢの発現、（Ｅ）４３日のインビボでの抗原特異的な細胞分解。２回の独立した実験の代表値が示されている（データは平均±標準偏差で示されている）。

ｍＴＯＲ阻害はＣＤ８＋Ｔ細胞性の抗腫瘍免疫を促進する（Ａ及びＢ）ナイーブもしくは７２時間調整されたＯＴ−Ｉ細胞がＢＬ／６レシピエントに養子移入された。マウスは、ＯＴ−Ｉ細胞の養子移入２４時間後にＥ．Ｇ７腫瘍細胞２×１０^６（細胞数）が接種された。（Ａ）腫瘍接種後の腫瘍サイズ（ｍｍ^３）、（Ｂ）腫瘍接種後の腫瘍フリー生存のパーセント、が示されている。２回の独立した実験の代表値が示されている。

腎細胞がんモデル。テムシロリムスと併用のｍＴＯＲ阻害は腫瘍抗原ＣＡ９を発現しているＲＥＮＣＡ腫瘍を移植されて１０日後のＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて、がんワクチン（ｈｓｐ１１０とＣＡ９の複合体）の抗腫瘍効果を増強した。各ラインは個々のマウスにおける腫瘍の生長を表している。ワクチンを作成するために、ＣＡ９（抗原標的）とＨＳＰ１１０（熱ショックタンパク質アジュバント）が１：１（モル割合）で混合され４３℃で３０分インキュベートされた。０日目に、２×１０^５のＲＥＮＣＡ−ＣＡ９細胞がマウスに移植された。ワクチンは１０、１７、２４日目に皮内投与された。テムシロリムスは１１〜１６、１８〜２３、２５〜３０日目に腹腔内投与された。

テムシロリムスと併用のｍＴＯＲ阻害は、ｇｐ１００を発現しているＢ１６腫瘍を移植されて１０日後のＣ５７／ＢＬ６マウスにおいて、がんワクチン（ｇｐ１００とＣＡ９の複合体）の抗腫瘍効果を増強した。各ラインは個々のマウスにおける腫瘍の生長を表している。ワクチンを作成するために、ｇｐ１００（抗原標的）とＣＡ９（アジュバント）が１：１（モル割合）で混合され室温で３０分インキュベートされた。０日目に、２×１０^５のＢ１６−ｇｐ１００細胞がマウスに移植された。ワクチンは１０、１７、２４日目に皮内投与された。テムシロリムスは１１〜１６、１８〜２３、２５〜３０日目に腹腔内投与された。

ＣＡ９＋ｇｐ１００による免疫は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定されるｇｐ１００特異的なＩＦＮ−γ応答を誘発した。

図１１は、ｍＴＯＲ阻害剤が、樹立された卵巣がんに対して免疫仲介性の防御を増強することを示すデータの、図式的な描写である。

図１２は、ｍＴＯＲ阻害剤が、免疫仲介性の抗胸腺腫効果を増強することを示すデータの、図式的な描写である。

図１３は、ｍＴＯＲ阻害剤が、恒常的増殖（ＨＰ）誘導性の抗腫瘍効果を増強することを示すデータの、図式的な描写である。

図１４は、ｍＴＯＲ阻害剤が、免疫仲介性の腫瘍防御を増強することを示すデータの、図式的な描写である。

図１５は、ｍＴＯＲ阻害剤処置が、恒常的増殖（ＨＰ）誘導性の抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強することを示すデータの、図式的な描写である。

図１６は、ｍＴＯＲ阻害剤が、卵巣腫瘍のＣＤ８＋Ｔ細胞仲介性の養子細胞移入（ＡＣＴ）療法を増強することを示すデータの、図式的な描写である。

本発明は、免疫応答を調整するための組成物及び方法を提供する。一つの態様において、本発明はＣＤ８＋Ｔ細胞の個体群と哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤とを含む組成物を提供する。当該組成物は、さらにＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的な抗原を含んでいてもよい。

ここで用いられる「ＣＤ８＋」Ｔ細胞とは、ＣＤ８（分化抗原群８）を発現するＴ細胞を意味する。ＣＤ８はその性質がよく特徴づけられている膜貫通糖タンパク質であって、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）のコレセプターとして機能する。ＣＤ８は、ヒトの抗原提示細胞の表面において、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ−Ｉ）に結合する。

他の態様においては、本発明は、個体に対して抗原とｍＴＯＲ阻害剤とを投与することを含む、個体において抗原に対する免疫応答を増強するための方法を提供する。抗原とｍＴＯＲ阻害剤とは、個体において、抗原に対する免疫応答を増強するために効果的である量が投与される。ｍＴＯＲ阻害剤と抗原とは、同時に投与されることもされないこともありうる。

増強された免疫応答は、個体において抗原を有する細胞に対する、増強された細胞性の免疫応答も含みうる。「増強」は、抗原（及び、付加的に何らかのアジュバント）が投与されたが、ｍＴＯＲ阻害剤は投与されていないコントロールと比較しうる。増強された細胞性の免疫応答は、抗原を有する細胞に対する細胞傷害性を示すＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、或いは、増強された養分、及び／又は抗原に対する抗原リコール応答を示すＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、もしくは、抗原に特異的なエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の量及び／又は活性の増加、或いは、前述の細胞性の免疫応答の種類の組み合わせ、を含みうるが、これらに制限されるものではない。本発明の方法によって誘発される増強された細胞仲介性の免疫応答は、体液性及び／又は先天性の免疫応答の有益な変化を伴いうる。一つの態様においては、増強された免疫応答は、抗原を発現する細胞の成長の阻害、個体における抗原発現細胞の死、及び／又は個体の生存が延長されることによって証明されうる。

本発明において我々は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）が、ナイーブＣＤ８＋（ＯＴ−Ｉ）Ｔ細胞において、ホスホイノシチド３−キナーゼ及びＳＴＡＴ４転写因子経路を通じて、抗原及び共刺激分子（Ｂ７．１）誘導性のｍＴＯＲキナーゼ活性を増強及び維持したことを示す。しかしながら、代表的なｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン）によるｍＴＯＲ活性のブロックは、Ｔ−ｂｅｔ転写因子の持続的な発現が失われるがゆえに、ＩＬ−１２誘導性のエフェクター機能を逆転した。我々は、ＩＬ−１２で調整されたＯＴ−Ｉ細胞のラパマイシン処理は、持続的なエオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ）の発現を促進すること、及び、増強された栄養分と養子免疫移入における抗原リコール反応とを示す、メモリー細胞前駆体を産生することを示す。このメモリー細胞前駆体は、ＩＬ−１２調節性エフェクターＯＴ−Ｉ細胞よりも大きな腫瘍への効果を示す。このように、また、いかなる理論にも制限されることを意図しないが、本発明は、ｍＴＯＲは、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてエフェクター及び／又はメモリー細胞の運命を決定づける転写プログラムの中心的調節因子であることを、初めて開示するものである。

ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生的運命の決定における、ｍＴＯＲの役割を発見することに加えて、我々は、ワクチン療法にｍＴＯＲ阻害剤を付加することは、個体に対して治療的および予防的な利益を提供しうることを開示する。特に我々は、発明の様々な態様において、がんの動物モデルにおいてがんワクチンの免疫学的な効果を増強するために、テムシロリムス及びラパマイシンのそれぞれを用いることを開示する。これと関連して、テムシロリムスは、直接的な抗増殖剤（細胞増殖抑制剤）特性を有することを知られ、また、進んだ腎細胞がん（ＲＣＣ）への処置として応用されている。がんへの処置のためにｍＴＯＲ阻害剤を他の細胞増殖抑制剤と一緒に用いることは、示唆されてきている（T. Abraham and J. Gibbons; Clin Cancer Res (2007) 13:3109-3114)。しかしながら、ｍＴＯＲ阻害剤をワクチンと併用する技術については教示も示唆もされていない。反対に、テムシロリムスやラパマイシンは免疫抑制剤として汎用的に使用されており、免疫抑制効果があると知られている薬剤とワクチンとを組み合わせることは望ましくないと教示されている。例えば、スパナーは、その免疫抑制効果ゆえにラパマイシンをがんワクチンのアジュバントとして用いることに反対を示しており、同じことが、Ｔ細胞の細胞周期の進行を調節していると考えられているＰＩ−３Ｋ経路に関連している、他のｍＴＯＲ阻害剤にも適用されうる(Spaner, D.E., Journal of Leukocyte Biology Volume 76, 2004年8月, pp338-351)。さらに、抹消寛容と免疫抑制について重要であるＴ細胞タイプの中では、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）が決定的であると考えられてきた。自然発生的な制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の全体のうち５〜１０％を占め、ＣＤ２５及びＦＯＸＰ３の発現に基づいて同定される（Sakaguchi S: Nat Immunol 6:345-52, 2005）。しかしながら、ｍＴＯＲの機能の阻害は、インビトロ、インビボの両方においてマウスＴｒｅｇｓの増加を生じさせることが示されている（Battaglia M, et al. Blood 105:4743-8, 2005、Battaglia et al: Diabetes 55:1571-80, 2006）。さらに、ヒトでは、ｍＴＯＲの阻害はインビトロでＴｒｅｇｓの増加を導くこと、インビボでＴｒｅｇｓの抑制能力を増強することが示されてきた（Monti P, et al. Diabetes 57:2341-7, 2008）。このように、先行技術の記載からの予測としては、ｍＴＯＲ阻害剤をワクチンと組み合わせることは、ワクチンの抗原性の成分への免疫反応を生成するのに有害であると思われ、そのために、ワクチンの抗原性の成分に対する免疫反応を増強し、さらに、増大させることは予測されていなかった。しかしながら我々は予想外なことに、ｍＴＯＲ阻害剤をがんワクチン療法に付加することが、ワクチンの抗原性の成分に対する免疫応答を増強し、免疫仲介性の応答を通じてがん細胞の生長を阻害して、コントロールに対して生存を延長できることを見出した。このように、ｍＴＯＲ阻害剤には免疫抑制物質として確立された役割がある中で、ワクチン療法と組み合わされた場合に、ｍＴＯＲ阻害はがん抗原に対して免疫応答を増強するという本願の発見は驚くべきものであった。この点において、我々は特に、ＲＣＣとメラノーマの樹立されたマウスモデルにおいて、ｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン、テムシロリムス）ががんワクチンの効果を増強しうることを開示する。我々はさらに、樹立されたマウスモデルを用いて、ラパマイシンが卵巣腫瘍および胸腺腫に対して免疫仲介性の防御を増強することを開示する。我々はさらにまた、ラパマイシン処置は、恒常的増殖（ＨＰ）誘導性の抗腫瘍免疫を増強しうること、また、腫瘍の攻撃に対して、持続的な免疫記憶の誘導に基づいて予防的利益を提供しうることを開示する。このように、本願発明はワクチン、特にがんワクチンの効果を増強するために、従来になく、驚くべき効果的な方法を提供するものである。このように、本願発明は、少なくとも一部分でも細胞仲介性の免疫応答を通じて実施されるあらゆるワクチン療法を増強することが期待される。

一つの態様において、本発明の方法は抗原に対する免疫応答の増強の必要がある個体に対して行われる。

一つの態様において、個体はｍＴＯＲ阻害剤で免疫抑制療法をされていない個体である。このような個体についての無制限の例には、ｍＴＯＲ阻害剤を使って自己免疫疾患や組織移植による処置を受けていない個体を含む。個体はがんがあると疑われている者であってもよいし、がんだと診断された者であってもよいし、もしくは例えば、遺伝子的な傾向や、習慣的又は職業的なリスクファクター等のがんが発展するリスクがある個体であってもよい。

ｍＴＯＲはヒトにおいてＦＲＡＰ１遺伝子にコードされたよく特徴づけられたタンパク質である。そのヌクレオチド符号及びアミノ酸配列は本技術分野で知られており、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ１１７１６６（２００６年６月２６日エントリー）にてアクセス可能であり、ここに参照として援用される。

ここに示される開示に基づいて、あらゆるｍＴＯＲ阻害剤が本発明の組成物及び方法の使用のために好適であること、及び、あらゆる個体によって発現されるあらゆるｍＴＯＲタンパク質が、阻害剤の標的として好適であることが予測される。キナーゼ阻害剤の幅広いスペクトラムとは対照的に、ｍＴＯＲの阻害のために選択性及び／又は特異性を有する阻害剤を使用することが好ましい。このように、多様で制限のない態様において、ｍＴＯＲはラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムストリン（everolimus torin）、及びデフォロリムス、これらのアナログ、及び、ｍＴＯＲ阻害剤及び／又はこれらのアナログの組み合わせでありうる。

また、抗原が、ＭＨＣクラスＩ分子と関連した抗原提示細胞による提示のために好適なアミノ酸配列を含んでいる抗原である限り、あらゆる抗原が本発明において好ましく使用できる。このように、抗原はタンパク質もしくはペプチドであり、又は、タンパク質もしくはペプチドを含みうる。抗原は、組換え型抗原であってもよく、化学的に合成されてもよく、細胞培養から単離されたものでもよく、また、個体から得た生物学的サンプルから単離されたものでもよい。抗原は、感染性微生物の細胞上に提示されるものでもよく、また、抗原は罹患又は感染した細胞、組織、器官において発現されてもよい。所望の抗原は、よく特徴づけられたものでも、逆に知られていないものでも、また、例えば特定の細胞もしくは組織タイプからの溶解物中で知られ、その存在が予測されているものでもよい。

一つの態様において、抗原は腫瘍抗原である。腫瘍抗原は商業的に提供されている抗原であり、もしくは、組換え法や腫瘍細胞溶解物からの調製のような簡便な手法で入手することができる。腫瘍溶解物からの抗原は単離されたものでもよく、溶解物そのものを抗原として用いるのでもよい。抗原は精製された形態、もしくは部分精製又は未精製の形態で使用され得る。ここで、「精製された」は、他の成分や要素から分離されていることを意味する。抗原は、未精製、部分精製、実質的な精製、もしくは純粋な抗原として、本発明の組成物に追加され得、及び／又は、本発明の方法に使用され得る。抗原は、実質的に全ての他の成分が除去された時に精製されたと考えられる。つまり、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、９９％より高い純度である。部分的、もしくは実質的に精製された抗原は、自然にみられる材料、つまり、例えば他の細胞タンパク質、膜、及び／又は核酸等の細胞材料が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％もしくはそれより多く、除去されたものでありうる。

様々な態様において、がん細胞抗原はがん細胞によって発現されうる。がん細胞の特定の例は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、腹膜偽性粘液腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸部がん、睾丸腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起細胞腫（oliodendroglioma）、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、胸腺腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、及び、Ｈ鎖病を含むが、これに制限されるものではない。

抗原は、感染性病原体又は感染性微生物によって発現される抗原でありうる。感染性病原体又は感染性微生物の特定の例は、ウィルス、バクテリア、菌、原生生物、又は他の寄生生物や感染性の物質を含むが、これに制限されるものではない。

他の態様において、本発明は、個体に対して抗原に特異的であるＣＤ８＋Ｔ細胞と、効果的な量のｍＴＯＲ阻害剤とを含む組成物を投与することを含む、個体において所望の抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供する。

単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原に対して特異的かつナイーブであってもよく、もしくは、本発明の方法において使用される前に、免疫応答の増強が所望される抗原と接触させられていてもよい。代替的に、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、個体に投与される前に、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗原を提示している抗原提示細胞とともにＣＤ８＋Ｔ細胞をインキュベートすることによって、所望の抗原に暴露されていてもよい。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、所望の抗原に対する増強された免疫応答が意図されている個体から、多様な周知の技術及び薬剤のいずれかを使用して、単離されてもよい。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、本発明の方法を実行するために、個体に再び導入されるのでもよい。

他の態様において、本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の個体群とｍＴＯＲ阻害剤とを含む組成物を提供する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それに対する免疫応答増強が所望される抗原に特異的である。ＣＤ８＋Ｔ細胞とｍＴＯＲ阻害剤との暴露は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に、ＣＤ８＋Ｔ細胞が個体に戻されて抗原と接触する時に、抗原に対する増強された細胞性免疫応答に関与する能力を与えるため、前記組成物は、本発明の方法における使用に好適である。単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、組成物中で多様な細胞の割合を占め得る。例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、組成物のＴ細胞又は全細胞の中で、少なくとも、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％、或いはその間の整数値を占め得る。

ＣＤ８＋Ｔ細胞とｍＴＯＲ阻害剤とを含む組成物はさらに抗原を含んでいてもよい。単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物中に抗原があるとき、抗原は独立した要素として存在してもよく、抗原とＣＤ８＋Ｔ細胞の表面に提示されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とが相互作用できるいずれかの状態で存在してもよい。抗原がＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲと相互作用可能である時、ＣＤ８＋Ｔ細胞は活性化されうる。ＣＤ８＋ＴＣＲによって認識され得るように、組成物中に抗原が提供される多様な態様の例は、例えば樹枝状細胞のような抗原提示細胞の表面でＭＨＣ−１と共に提示（もしくは、動物モデルにおいて同等である提示）される抗原をも含むが、これに制限されるわけではない。代替的に、抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲによる抗原の認識を容易にするいずれかの他の天然又は合成された分子や、組成物、複合物、物質、基質等と物理的に接触させられることもできる。例えば、抗原はＭＨＣ−Ｉや他のＣＤ８＋ＴＣＲに抗原を提示させるのに好適な分子と複合化されてもよく、ＭＨＣ−Ｉや他の好適な分子（例えば、組成物がＣ５７ＢＬ／６マウスＣＤ８＋Ｔ細胞を含む場合には、Ｋ^ｂ）は、抗原がＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるように、例えばラテックス微粒子、いずれかのプレートのプラスチックの表面、もしくは他のいずれかの好適な基質等の基質と、ＣＤ８＋Ｔ細胞ＴＣＲに対する抗原の適切なアクセスを容易にするように物理的に接触させられてもよい。組成物はさらに、共刺激体分子として良く知られた多様なもののいずれかを含んでいてもよい。当業者によって、ここに述べられている組成物は、個体に投与されるためのＣＤ８＋Ｔ細胞を準備するために好適であり、及び／又は、個体に直接的に投与され得、さらに精製されてもよく、また、細胞仲介性の免疫反応を生じることが所望されるいずれかの抗原に対する、ワクチン療法の治療的もしくは予防的な増強を提供する目的で個人に投与されることに好適な組成物を与える、いずれかの他の多様な物質やプロセスと組み合わされ、処置され、混合され得ることが認識されるであろう。一つの態様において、組成物は、ＩＬ−１２のようなサイトカインをも含む。

生物学的なサンプルを得る方法、サンプルからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する方法は当技術分野で周知である。例えば、Ｔ細胞表面マーカーに基づいてＴ細胞を選別・分離する恒常的な細胞ソーティング法が、本発明の組成物や方法に含むためのＣＤ８＋Ｔ細胞の個体群を得るために使用されうる。例えば、血液及び／又は末梢血リンパ球を含む生物学的サンプルが個体から得られ、そのサンプルから市版の装置や試薬を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞が単離され、その結果ＣＤ８＋Ｔ細胞の個体群が得られる。ＣＤ８＋Ｔ細胞はさらに、例えば、ＣＤ４４、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、ＣＤ１２２、ＣＤ１５４、ＣＤ２７、ＣＤ６９、ＫＬＲＧ１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７、ＩＬ−７Ｒａ等の付加的な細胞表面マーカーの使用を通じて、表現型に基づいてさらに特徴づけられ、及び／又は単離され得る。細胞はまた、ＣＤ４＋／ＮＫ１．１＋、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１９＋細胞のネガティブセレクトによって最初に単離されることもできる。細胞は、ナイーブ（ＣＤ６２Ｌｌhi、ＣＤ４４low、ＩＬ−７Ｒａhi、ＣＤ１２２low）でありえ、もしくは、抗原経験であり得る；ＣＤ６２Ｌ（low−moderate）、ＣＤ４４hi、ＩＬ−７Ｒａ（high or low）、ＣＤ１２２適度にhi。ＣＤ８＋Ｔ細胞の個体群はｍＴＯＲ阻害剤及び／又は抗原といずれかの好適な容器、装置、細胞培養培地、システム等で混合され、インビトロで培養され、Ｔ細胞が有するように拡大し、及び／又は成熟し、及び／又は分化して、当業者には知られた多様な所望の特性をＴ細胞が有するように、１又は複数の抗原、及びいずれかの他の薬剤、もしくは細胞培養培地と暴露される。例えば、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、免疫応答増強が望まれる抗原を有する細胞に対する細胞傷害性活性を高めるように取り扱われうるし、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、増強された栄養、及び／又は抗原の提示に対する抗原リコール応答を取得しうるし、もしくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞の機能的な／表現型の特性を有しうる。

本発明の組成物は、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、及び／又は安定剤を含みうる。薬剤と混合するのに適した組成物のいくつかの例は次から見出すことができる：Remington：The Science and Practice of Pharmacy (2005) ２１版、フィラデルフィア、ペンシルヴェニア州、Lippincott Williams & Wilkins。組成物はさらに、いずれかの好適なアジュバントを含んでもよい。アジュバントには、トールライク（ＴＬＲ）、ＮＬＲ及び全てのＤＡＭＰＳ、及び、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、サルモネラフラジェリンペプチド／タンパク質、ＣｐＧ含有ＤＮＡ、尿酸結晶、乳化油、ウィルスベクター、ＲＮＡ、及び／又はｓｓＤＮＡを含むＰＡＭＰＳを活性化し、抗原を付加混合するために使用され、もしくは、抗原を提供されたホストに注入される腫瘍学的アジュバントを含み、またこれらに制限されるものではない。

例えば、抗原の分子構成、処方される個体のサイズや年齢、その個体において罹患が疑われ或いは診断されている疾病のタイプ及びステージ等の要素を考慮に入れて、本発明の方法を実行するためにどのような投与処方を作成するかは、当業者には認識され得る。

抗原とｍＴＯＲ阻害剤とは、同じ組成物中の成分として同時に投与されうる。個体に抗原を投与した後に、ｍＴＯＲ阻害剤を投与することが好ましい。例えば、最初のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、抗原の投与の数時間後から６０日後までに行うことができ、これらの間のいずれの日、時間とすることもできる。さらに、ｍＴＯＲ阻害剤を繰り返し投与することが好ましい。例えば、本発明の方法の一つの態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は少なくとも１日１回、少なくとも１週間の期間、投与される。ｍＴＯＲ阻害剤は１週間より長く、例えば８−６０日及びその間の全ての整数の日数に渡って日々投与されうる。一つの態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は２０日を超えない期間投与されるが、我々は２０日を超える投与は増強効果を弱めることを見出しているからである。

本発明の組成物に含まれ、及び／又は本発明の方法において使用されるｍＴＯＲ阻害剤の量は、現在の開示の利益が得られるように当業者によって決定され得る。ある態様では、１５μｇのラパマイシンを含有する組成物を５−８日間、１日１回投与することが、がんモデルマウスでの免疫システム仲介性の効果を増強するのに有効であった。ｍＴＯＲ阻害剤の量及び投与処方は、所与のヒト患者や所与のｍＴＯＲ阻害剤に対して、例えば体重基準のｍｇ／ｋｇに基づいて見積もられ得ることが期待される。

本発明の方法は、抗原と関わる疾病や不調を処置するための従来の療法と併用して実行されうる。例えば、本方法が個体において腫瘍抗原の免疫応答を増強するために使用される場合、化学療法、外科的介入、放射線療法を含み、これらに制限されない処置様式が、本発明の方法に先立ち、同時に、もしくは続いて、実行されうる。

続く例示は本発明の説明するものだが、本発明はこれらに制限されない。

［実施例１］
この実施例は実施例２〜９のデータを得るために使用された材料及び方法を説明するものである。

（マウスと試薬）遺伝子操作されたＣ５７ＢＬ／６マウス；ＣＤ４^＋ＴＣＲトランスジェニックRag2^-/-（ＯＴ−ＩＩ）、ＣＤ８^＋ＴＣＲトランスジェニックRag2^-/- （ＯＴ−Ｉ、ＷＴ）、Stat4^-/- ＯＴ−Ｉ Rag2^-/-、及びTbx21^-/- ＯＴ−Ｉ Rag2^-/-が、ＲＰＣＩのＩＡＣＵＣガイドラインに従って給餌及び飼育された。ｒｍＩＬ−１２（２ｎｇ／ｍＬ）はＷｙｅｔｈ，Ｉｎｃ．（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から贈与された。ＩＦＮ−αはＴ．Ｔｏｍａｓｉ（ＲＰＣＩ）より贈与された。ｒｍＩＬ−７はペプロテック（ロッキーヒル、ニュージャージー州）から購入された。２−ＤＧ、４−ＨＴ、ラパマイシンはシグマアルドリッチ（セントルイス、ミズーリ州）から購入された。ＬＹ２９００４２はカルビオケムから購入された。インシュリンはノヴォノルディスク（プリンストン、ニュージャージー州）から購入された。

（ＯＴ−１細胞の刺激）ナイーブＯＴ−１細胞は、公知の方法によってＨ−２Ｋ^ｂ／オボアルブミン抗原とＢ７．１を発現しているラテックスマイクロスフェアで刺激された。ナイーブＯＴ−ＩＩ細胞は、抗-ＣＤ３-/抗-ＣＤ２８-でコーティングされたラテックス微粒子で刺激された。いくつかの実験で、胚性繊維芽細胞由来の細胞株、特に、ＢＯＫ（H-2K^b,OVAp及びB7,1を発現したMEC.B7.SigOVA）が、公知の方法によってナイーブＯＴ−Ｉ細胞を刺激するための抗原提示細胞として使用された。

（インビトロでの二次的抗原リコール応答の測定）インビトロでの二次的抗原リコール応答を検討するために、７２時間培養されたＯＴ−Ｉ細胞（一次）を、培地で３回洗浄し、さらに７２時間、２４ウェルプレートで、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）のみと再度培養した（１×１０^５／ｍＬ）。１４４時間に細胞を回収し、培地で３回洗浄し、数を揃え（５×１０^５）、さらに２４時間、Ａｇ／Ｂ７．１のみと再度刺激した（二次刺激）。１６８時間目に細胞を回収してフローサイトメトリー及びインビトロ機能アッセイにて測定した。

（レトロウィルス形質転換及びＴ−Ｂｅｔ誘導）製造者のマニュアルに従って、ＬｉｐｏＤ２９３ＤＮＡインビトロトランスフェクション試薬（SigmaGen Laboratories）を用いて、Ｔ−ｂｅｔ−ＥＲＲＶ（エストロゲン応答性レトロウィルスベクター）をレトロウィルスパッケージングベクターｐＣＬ−Ｅｃｏと共に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ細胞にトランスフェクションした。翌日、培地を除去し、レトロウィルス上清がトランスフェクション３日後に回収された。形質転換のために、２４時間刺激されたＯＴ−Ｉ細胞はポリブレン（８μｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ）を含有するレトロウィルス上清に懸濁され、３０℃で９０分、２２００回転でスピン−トランスダクションされた。スピン−トランスダクションの後、４−ＨＴ（１０ｎＭ）と共に、以前と同じ極性環境を含む新鮮な培地で細胞を培養した。最初の刺激から７２時間後、細胞は３回洗浄され、４−ＨＴとＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）の他はいかなる刺激も無く、維持された。

（統計分析）統計分析のため、対応のないスチューデントｔ検定が適用された。様々な群の間で腫瘍生存がカプランマイヤー生存曲線とログ順位統計を用いて比較された。有意はｐ＜０．０５とした。

［実施例２］
この例は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のタイプＩエフェクター分化を調整する指令が、ｍＴＯＲ活性を増強することを示すものである。タイプＩエフェクター機能のためのナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の調製の基礎となる指令（各々、シグナル１、２、３−抗原［Ａｇ］、Ｂ７．１［共刺激］、ＩＬ−１２［サイトカイン］）の機構を特徴づけるために、我々は、接着細胞株（Ｈ−２Ｋ^ｂ、ＯＶＡｐ及びＢ７．１を発現しているＢＯＫ）で刺激されたＯＴ−Ｉ細胞におけるタイプＩエフェクターの成熟にＩＬ−１２が果たす決定的な役割を確定することから検討を開始した。ＩＬ−１２の付加は、強度のＩＦＮ−γの産生、７２時間のＯＴ−Ｉ細胞における細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性をもたらした（図１Ａ，１Ｂ、一次）。
さらに、一次エフェクターＯＴ−Ｉ細胞（７２時間）をさらに７２時間ＩＬ−７と静置し（１４４時間目に１２％ＩＦＮ−γが検出された）、Ａｇ及びＢ７．１に刺激された場合、ＩＬ−１２処理されたＯＴ−Ｉ細胞のみがＩＦＮ−γ及びＣＴＬ活性が再度誘発されていた（図１Ａ、１Ｂ、二次）。このように、ＩＬ−１２はＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター成熟に決定的な役割を有している。

ｍＴＯＲキナーゼは多様な細胞外シグナルのインテグレータ、また、細胞の運命を決定づける内部エネルギーレベルのセンサーであると見られてきたが、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞がタイプＩエフェクターへ分化する調節の指令の集積におけるｍＴＯＲの役割は不明確である。第一に、我々はＩＬ−１２の存在下又は不存在下で、刺激後の様々な時間においてＡｇ及びＢ７．１（Ａｇ＋Ｂ７．１）がＯＴ−Ｉ細胞のｍＴＯＲを活性化する能力について試験した。Ａｇ＋Ｂ７．１でのナイーブＯＴ−Ｉ細胞の刺激は、ｍＴＯＲリン酸化（活性化）を２時間までに誘導したが、１２時間が最大であり、４８時間ではほぼ観察されなかった（図１Ｃ）。注目すべきことに、ＩＬ−１２の付加は、Ａｇ＋Ｂ７．１誘導性のｍＴＯＲリン酸化を２時間において強化し、これは４８時間まで維持された（図１Ｃ）。このように、Ａｇ＋Ｂ７．１がｍＴＯＲリン酸化を誘導にも関わらず、ＩＬ−１２の付加はＯＴ−Ｉ細胞におけるｍＴＯＲリン酸化を増強・維持する。ｍＴＯＲリン酸化の誘導はキナーゼ活性をも導くことを確認するために、我々はｍＴＯＲキナーゼ活性の直接的なターゲットである、ｐ７０Ｓ６Ｋリン酸化（Ｓｅｒ３７１）の反応速度を観察した。１２時間（最大）では、Ａｇ＋Ｂ７．１とＩＬ−１２を加えたＡｇ＋Ｂ７．１との両方が同量のＳ６Ｋリン酸化を誘導したが、ＩＬ−１２の存在下では４８時間まで、ｍＴＯＲリン酸化と相関して（図１Ｃ）Ｓ６Ｋリン酸化を維持することができた（図１０）。同様に、Ｓ６Ｋの下流基質であるＳ６（Ｓｅｒ２３５及び−２３６）のリン酸化が、ＩＬ−１２処理されたＯＴ−Ｉ細胞では増強・維持された（図１Ｅ）。ＯＴ−Ｉ細胞における、Ａｇ＋Ｂ７．１±ＩＬ−１２刺激誘導性のＳ６Ｋ及びＳ６のリン酸化はラパマイシン（ｍＴＯＲ複合体−１の特異的阻害剤）によりブロックされる（図１Ｄ，１Ｅ）。このように、ＯＴ−Ｉ細胞におけるｍＴＯＲ活性化への指令とそのキナーゼ活性の能力が確認された。Ａｇ＋Ｂ７．１に刺激されたＯＴ−Ｉ細胞における芽球化現象とＣＤ９８の発現の誘導は、ラパマイシン感受性の態様でＩＬ−１２によってさらに増大した。これらの観察は、ｍＴＯＲを、ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクターの応答を調整する指令のターゲットとして同定するものであり、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−１２決定性のタイプＩ分化の調節におけるｍＴＯＲキナーゼの潜在的な役割を示唆するものである。

［実施例３］
本実施例は、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１２増強性のｍＴＯＲ活性はＰＩ３Ｋ及びＳＴＡＴ４を要求することを示すものである。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｍＴＯＲ活性を支配する分子的な経路を決定するために、我々はＡｇ−、Ｂ７．１−、及びＩＬ−１２−誘導性のホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−Ａｋｔキナーゼ経路がＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｍＴＯＲシグナルに要求されるかどうか分析した。Ａｇ＋Ｂ７．１±ＩＬ１２で刺激されたＯＴ−Ｉ細胞は、ＰＩ３Ｋ活性の機能的な測定としてＡｋｔリン酸化（Ｔｈｒ３０８）が測定された。ＩＬ−１２の有無に関わらずＡｇ＋Ｂ７．１は３０分までに同量のＡｋｔリン酸化を誘導したが、ＩＬ−１２の存在下では４８時間までＡｋｔリン酸化が増加した。このＡｋｔリン酸化はＰＩ３Ｋ阻害剤（ＬＹ２９４００２）によってブロックされた（図２Ａ）。こうしてＩＬ−１２はＯＴ−Ｉ細胞においてＡｇ＋Ｂ７．１誘導性ＰＩ３Ｋ活性を増加させることが確認された。さらに、ＩＬ−１２で増強されたｍＴＯＲ活性（２、１２、２４時間において観察されたＳ６Ｋリン酸化）は、ＰＩ３Ｋ阻害によってブロックされた（図２Ｂ）、このことは、抗原に刺激されたＯＴ−Ｉ細胞における、Ａｇ＋Ｂ７．１及びＩＬ−１２に活性化されるＰＩ３Ｋ活性は、ｍＴＯＲキナーゼ活性の誘導に要求されることを示している。

ＩＬ−１２がＣＤ８＋Ｔ細胞に強いエフェクター成熟を指令する能力は、ＳＴＡＴ４転写因子を要求する。ＯＴ−Ｉ細胞におけるＩＬ−１２増強性のｍＴＯＲ活性が、ＳＴＡＴ４依存性であるかどうかを確認するために、我々は野生型（ＷＴ）もしくはＳｔａｔ^−/−ＯＴ−Ｉ細胞が、Ａｇ＋Ｂ７．１±ＩＬ−１２による刺激においてＳ６Ｋリン酸化を誘導する能力を試験した。ＰＩ３Ｋ阻害での我々の観測と対照的に、ＯＴ−Ｉ細胞におけるＳＴＡＴ４の不在は、早い時点（２時間、１２時間）ではＩＬ−１２誘導性のＳ６Ｋリン酸化には影響しない。しかしながら、誘導されたＳ６Ｋリン酸化の量を維持することはできなかった（４８時間）（図２Ｃ）。このように、ＩＬ−１２誘導性のＰＩ３Ｋ及びＳＴＡＴ４は、ＯＴ−Ｉ細胞におけるｍＴＯＲ活性の調節において、異なる役割を有している。

［実施例４］
本実施例は、維持されたｍＴＯＲ活性は遺伝的なタイプＩエフェクター機能に対して本質的であることを示すものである。抗原刺激中のＩＬ−１２の存在はｍＴＯＲ活性を増加させ、また、タイプＩエフェクターの成熟に決定的であるので、我々は、維持されたｍＴＯＲキナーゼ活性はＯＴ−Ｉ細胞におけるＩＬ−１２調節性のタイプＩエフェクター機能に要求されるかどうかについて分析した。そうするために、我々はナイーブＯＴ−Ｉ細胞をＢＯＫ±ＩＬ−１２、及びラパマイシンで刺激し、エフェクター機能が一次及び二次活性化されたＯＴ−Ｉプールにおいて分析された。ＩＬ−１２で調整されたＯＴ−Ｉ細胞へのラパマイシンの追加は、一次活性化されたＯＴ−Ｉ細胞からのＩＦＮ−γ産生に影響しなかったが、グランザイムＢ（ＧｒａｎｚｙｍｅＢ）発現の減少に伴ってＣＴＬ活性を減少させた（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ；一次）。対照的に、我々は、二次活性化されたプールからＩＬ−１２で調整されたエフェクター機能の完全な回復を認めた。（ＩＦＮ−γ産生、ＣＴＬ活性）（図３Ａ、３Ｂ；二次）。このＩＬ−１２で調整されたタイプＩエフェクター機能のブロックは、ラパマイシン誘導性の細胞増殖及び／又はタンパク質合成の阻害によるものでない。なぜなら、ＩＬ−１２存在下でのこれらの細胞の再活性化は、ＩＦＮ−γの顕著な産生を招いたからである。これらの結果は、ＩＬ−１２誘導性のナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のタイプＩエフェクター機能への関与はｍＴＯＲ活性を要求することを示唆している。加えて、我々は、一次刺激後１４４時間において、ラパマイシン処理のＩＬ−１２誘導性のＩＦＮ−γ産生及びＣＴＬ活性のブロックを観測した。これらの結果はさらにラパマイシン処理はタイプＩエフェクター機能をブロックすることを確認しており、また、二次活性化プール（１６８時間）において観察されたエフェクター機能の欠失は単独のものであると考えられた。なぜなら、これらの細胞はＩＦＮ−γ産生を再誘導する能力はないからであり、ラパマイシン処理された細胞の不応性によるのではないからである。

ＩＬ−１２処理によって生じる持続的なｍＴＯＲ活性はタイプＩエフェクターの機能のために要求されるのかどうか確認するために、我々は、Ａｇ＋Ｂ７．１刺激後１２時間においてラパマイシンを付加することによってＩＬ−１２誘導性ｍＴＯＲ活性の持続をブロックし（ｍＴＯＲ活性化は１２時間がピーク；図１Ｃ及び１Ｄ）（図３Ｄ）、一次及び二次活性化されたＯＴ−ＩプールからＩＦＮ−γ産生能力を観測した。処理０時間で観測されたように、１２時間におけるラパマイシン付加はＩＬ−１２誘導性のエフェクター機能をブロックした（図３Ｅ、一次活性化と二次活性化応答の対比）。このように、最初の１２時間に誘導されるｍＴＯＲ活性はＣＤ８＋Ｔ細胞をタイプＩエフェクターに調節するのに十分でないかもしれず、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるタイプＩエフェクター機能の調節のための、ＩＬ−１２誘導性の持続的なｍＴＯＲ活性（１２時間、それ以降）の重要さを示唆しているのかもしれない。

［実施例５］
本実施例は、ＩＬ−１２増強性のｍＴＯＲ活性は持続的なＴ−ｂｅｔ発現に重要であることを示すものである。持続的なＴ−ｂｅｔの発現はタイプＩエフェクター細胞の運命づけに必要かつ十分であり（松田ら、２００７）、また、ｍＴＯＲ阻害はＯＴ−Ｉ細胞においてＩＬ−１２刷り込みのタイプＩエフェクター成熟を逆転させるため（図３）、我々は次に、ラパマイシン処理がＯＴ−Ｉ細胞においてＴ−ｂｅｔ発現に影響するかどうか、Ｔ−ｂｅｔＲＮＡ発現の速度論的解析を行うことで、決定するために検討をおこなった（図４Ａ）。試験された全ての時点（２４−９６時間）において、ＩＬ−１２は、Ａｇ＋Ｂ７．１誘導性のＴ−ｂｅｔ発現を増強し、維持した。しかしながら、ｍＴＯＲ阻害は、Ａｇ＋Ｂ７．１及びＩＬ−１２誘導性の早期のＴ−ｂｅｔ発現（２４−４８時間）には影響しなかったが、ＩＬ−１２誘導性の持続的なＴ−ｂｅｔｍＲＮＡ発現をブロックし（９６時間にわずかに観察される）、そしてそれに応じて、ＯＴ−Ｉ細胞はＴ−ｂｅｔタンパク質発現を喪失した（図４Ｂ）。さらに、１２時間におけるｍＴＯＲ活性の阻害はまた、観察されたタイプＩエフェクター成熟の欠失と同様に、Ｔ−ｂｅｔ発現の欠失を生じた（図３Ｅ）。このように、ＩＬ−１２に増大された（増強され、維持された）ｍＴＯＲ活性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞における継続的なＴ−ｂｅｔ発現に要求される。

抗原リコールの間のラパマイシン仲介性のＩＦＮ−γ産生のブロックは、Ｔ−ｂｅｔ発現の再誘導能力の欠損のためであることを示すために、我々は、７２時間４（１４４時間）のＩＬ−７処理によって休眠しているＩＬ−１２処理されたＯＴ−Ｉ細胞を採用し、抗原リコールの前（１４４時間）及び後（１６８時間）のＴ−ｂｅｔ発現を測定した。穏やかなＴ−ｂｅｔ発現が１４４時間においてＡｇ＋Ｂ７．１及びＩＬ−１２で一次的に調整されたＯＴ−Ｉ細胞で観察された（図４Ｃ）。注目すべきことに、抗原リコールにおいて、ＩＬ−１２調整されたＯＴ−Ｉ細胞はＴ−ｂｅｔタンパク質を顕著に多量に再誘導したが、これは、ラパマイシン処理感受性であった（図４Ｃ）。これらの観察は、ラパマイシン処理は持続的なＴ−ｂｅｔ発現をブロックしていることを示しているが、これが、ＩＬ−１２仲介性のタイプＩエフェクターのブロックを生じているのかもしれない。この結論は、ＩＬ−１２で調整されたＴｂｘ２１^−／−ＯＴ−Ｉ細胞は、一次フェーズにおけるＩＦＮ−γのＩＦＮ−γ産生能力が影響されていないにも関わらず（図４Ｄ、一次）同様にタイプＩエフェクター機能を生成することに失敗していることに支持される（図４Ｄ、二次）。これらの観察は、ラパマイシン処理されたＩＬ−１２で調整されたＯＴ−Ｉ細胞（図３Ａ）と同調するものであり、ｍＴＯＲ阻害における持続的なＴ−ｂｅｔ発現の欠失は、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１２調整性のタイプＩエフェクターの分化をブロックしているという我々の他の議論を支持するものである。

ラパマイシン処理でのＴ−ｂｅｔ発現の欠失が、タイプＩエフェクター機能の欠失を導くのかどうか直接的に決定するために、我々は、ラパマイシン処理されたＩＬ−１２調整されたＯＴ−Ｉ細胞でＴ−ｂｅｔの異所性の発現を誘導し、二次活性化されたＯＴ−ＩプールからＩＦＮ−γ産生を再誘導できる能力を測定した。レトロウィルスベクター、Ｔ−ｂｅｔ−ＥＲ（Ｔ−ｂｅｔ−ＥＲＲＶ）が採用され、Ｔ−ｂｅｔの発現はタモキシフェン（４−ＨＴ）によって調整された（松田ら、２００７）。実際、Ｔ−ｂｅｔ−形質導入ＯＴ−Ｉ細胞へのタモキシフェン（Ｔｍ、１０ｎＭ）の添加は、Ｔ−ｂｅｔ発現の実質的な増加をもたらし（図４Ｅ）、ラパマイシン処理ＩＬ−１２−調整されたＯＴ−Ｉ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を再生させた（図４Ｆ）。このように、ＩＬ−１２誘導性の継続的なｍＴＯＲリン酸化は持続的なＴ−ｂｅｔ発現およびＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴ−ｂｅｔ依存性のタイプＩエフェクターの関与に本質的であることを示している。

代謝ホルモンインシュリンは、インシュリンレセプター基質（ＩＲＳ）を通じてｍＴＯＲキナーゼ活性化に働く。一方、解糖阻害剤である２−デオキシグルコース（２ＤＧ）はｍＴＯＲ活性のブロックを導く。そこで我々は、ｍＴＯＲ活性を代謝的に調節するためにインシュリンと２ＤＧを採用し、これらがＯＴ−Ｉ細胞におけるＴ−ｂｅｔの発現に影響しうるかどうかを試験した。実際、Ａｇ＋Ｂ７．１で刺激されたＯＴ−Ｉ細胞へのインシュリンの付加は、ｍＴＯＲ活性（Ｓ６Ｋｐ）及びＴ−ｂｅｔ発現のｍＴＯＲ依存性の増加を増強した（図４Ｇ、４Ｈ）。一方、Ａｇ＋Ｂ７．１＋ＩＬ−１２で刺激されたＯＴ−Ｉ細胞への２ＤＧの付加は、ｍＴＯＲ活性及びＴ−ｂｅｔ発現の欠失を導いた。これらの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴ−ｂｅｔ発現を調整するために指令の重要なインテグレータとしてのｍＴＯＲを同定するものである。

［実施例６］
本実施例は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞におけるｍＴＯＲキナーゼの異なる要求を示すものである。ＣＤ４＋Ｔ細胞のラパマイシン処理はＦｏｘｐ３発現制御性Ｔ細胞に免疫不応答（anergy）及び／又は偏位（deviation）をもたらすので、我々は、Ａｇ＋Ｂ７．１及びＩＬ−１２誘導性のｍＴＯＲ活性の阻害が、活性化や増殖をブロックし、及び／又は異なるサブタイプのエフェクターへの偏在を生じて、ＣＤ８＋Ｔ細胞のタイプＩエフェクター分化に干渉するかどうかを分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の公知の観察に従い、我々の結果も、ラパマイシン処理は活性化（ＣＤ４４発現）、増殖（ＣＦＳＥ希釈）、及び、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＯＴ−ＩＩ）の細胞回復を顕著に低減することを示す。しかしながら、ラパマイシン処理はＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ）の早期（ＣＤ６９、１２時間）及び遅れた活性化（ＣＤ４４）に影響せず、ただ増殖（ＣＦＳＥ）と細胞の回復にわずかに影響したのみであった。さらに、報告されているＣＤ４＋Ｔ細胞のＦｏｘＰ３発現とは対照的に、ラパマイシン処理されたＯＴ−Ｉ細胞は継続的にＦｏｘＰ３を発現しなかったが、これはＴ細胞の調節的機能の一部である。さらに、ｍＴＯＲ阻害でのＴ−ｂｅｔの欠失は、タイプ２もしくはタイプ１７サブセットへの偏位を導かなかった。これらの観察は、ラパマイシンの多様な投与量（２０ｎｇ／ｍＬ〜２μｇ／ｍＬ）でも確認された。高投与量ではラパマイシンはＯＴ−Ｉ細胞（Ｓ６Ｋｐ、Ｓ６ｐ）のｍＴＯＲ活性を効果的に阻害したが、ＣＤ４＋Ｔ細胞とは異なって、活性化阻害、増殖及び調節性Ｔ細胞サブセットの偏在はなかった。これらの結果は、ラパマイシンはＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞で違う効果を有することを示している。そして、ＩＬ−１２誘導性のタイプＩＣＤＳ＋エフェクター分化のブロック能力は、他のエフェクターサブタイプに対する免疫不応答や偏位が理由ではないことをこれらの結果は示すものである。

［実施例７］
本実施例は、ｍＴＯＲ阻害が持続的なエオメソデルミンの発現を誘導し、メモリー−前駆ＣＤ８＋Ｔ細胞を産生することを示すものである。ラパマイシン処理は、タイプＩエフェクター分化をブロックせず、また、免疫不応答や他の転写調節因子の発現を誘導しなかったので、我々は次に、ラパマイシン処理されたＩＬ−１２で調整されたＯＴ−Ｉ細胞の運命を特徴づけることを探求した。近い転写調節因子である、Ｔ−ｂｅｔとエオメソデルミンとは、エフェクターやメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞において逆に調節を受ける。Ｔ−ｂｅｔの発現を抑えるｍＴＯＲ阻害が、エオメソデルミンの誘導を導くかどうか決定するために、我々は、ＯＴ−Ｉ細胞におけるエオメソデルミンｍＲＮＡの発現を体系的に分析した。我々は、ナイーブＯＴ−Ｉ細胞においてエオメソデルミンのわずかな発現を観察したが、これはＡｇ＋Ｂ７．１で刺激されたときには増強され、ＩＬ−１２付加時には低減された（図５Ａ）。しかしながら、Ａｇ＋Ｂ７．１及びＩＬ−１２調整されたＯＴ−Ｉ細胞へのラパマイシンの付加は、エオメソデルミンｍＲＮＡの発現を顕著に増強し、これは、試験されたすべての時間（２４−９６時間）において維持された（図５Ａ）。エオメソデルミンｍＲＮＡの増加は、タンパク質レベルでも確認された。ラパマイシン処理されたＩＬ−１２調整ＯＴ−Ｉ細胞は、エオメソデルミンタンパク質の有意な増加を生じたからある（図５Ｂ）。我々が一貫して、Ａｇ＋Ｂ７．１及びＩＬ−１２調整されたＯＴ−Ｉ細胞におけるｍＲＮＡ誘導なしに、エオメソデルミンタンパク質の発現のわずかな増加（有意でない）を観測したことは特筆すべきである（図５Ａ、５Ｂ）。ＯＴ−Ｉ細胞におけるラパマイシン仲介性のエオメソデルミンの上方調節は、ｍＴＯＲ阻害の直接的な帰結であるのか、或いは、持続的なＴ−ｂｅｔ発現を阻害する能力による帰結であるのか検討するために、我々は、ラパマイシンで調整されたＯＴ−Ｉ細胞において、異所的にＴ−ｂｅｔ発現を誘導し、タモキシフェンの存在／非存在下でのエオメソデルミンの発現を分析した。実際に、ラパマイシン処理されたＯＴ−Ｉ細胞におけるＴ−ｂｅｔの誘導は、エオメソデルミンの発現を減少させた（図５Ｃ）。さらに我々は、Ａｇ＋Ｂ７．１及びＩＬ−１２で処理されたＴｂｘ２１^−／−ＯＴ−Ｉ細胞におけるエオメソデルミン発現の増加を、継続的に観察した。これらを合わせると、これらの結果は、ＩＬ−１２で調整されたＯＴ―Ｉ細胞においてｍＴＯＲ阻害は、転写プログラムを、持続的なＴ−ｂｅｔからエオメソデルミン発現へと選択的に切り替えることを示している。我々はまたＯＴ−Ｉ細胞において、ＩＦＮ−αもｍＴＯＲ活性やＴ−ｂｅｔ発現を調整するかどうかを決定した。我々は、Ａｇ＋Ｂ７．１刺激ＯＴ−Ｉ細胞において、ＩＦＮ−αは、ｍＴＯＲ活性やＴ−ｂｅｔ発現を増強することはできないことを確認した；しかしながら我々は、エオメソデルミンの発現とＩＦＮ−γの産生において、増加を観察した。これらの結果は、ＩＬ−１２は、持続的なｍＴＯＲとＴ−ｂｅｔの発現の促進によってタイプＩエフェクター成熟を刷り込むことについて、独特の能力を有すること、また、ＩＦＮ−αは、持続的なｍＴＯＲ活性とｍＴＯＲ依存的なＴ−ｂｅｔ発現を促進する能力を欠くので、この活性を欠いているかもしれないことを確認した。

我々は次に、Ｔ−ｂｅｔにおけるラパマイシン誘導性のエオメソデルミン発現スイッチは、タイプＩ成熟でのブロックと同じように、それらのメモリー前駆細胞への形質転換を生じるのかどうか、決定するため検討した。我々は、メモリー前駆ＣＤ８＋Ｔ細胞に伴うマーカー（例えば、ＣＤ６２Ｌ（リンパ節ホーミング）、ＣＤ６９（リンパ節保存）、ＣＤ１２７（ＩＬ−７α；メモリーＴ細胞の維持に本質的）、ＣＤ１２２（ＩＬ−１５Ｒβ、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の恒常的更新に本質的）、ＫＬＲＧ１（メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の産生と逆相関）、及び、Ｂｃｌ−２（抗アポトーシス作用、メモリーＴ細胞で発現が増加）を用いてＯＴ−Ｉ細胞の表現型の分析をおこなった。ラパマイシン処理されたＩＬ−１２で調整されたＯＴ−Ｉ細胞は、顕著に高い量のＣＤ６２Ｌを発現し、ラパマイシン処理されていない細胞と比較して持続的なＣＤ６９発現を示した（図５Ｄ）。ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ６９発現の増加は、ラパマイシン処理されたＯＴ−Ｉ細胞は、リンパ節ホーミングと保存により大きな能力を有しているかもしれないことを示している。さらに、ラパマイシン処理された細胞は、未処理のコントロールと比較して、観察された全ての時間点（図５Ｄ、５Ｅ）で、生存促進性の遺伝子（Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−３）の発現の増加及び維持と同時に、より高いＫＬＲＧ^ｌｏ細胞の頻度を有している。すなわち、ラパマイシン処理はメモリー前駆ＣＤ８＋Ｔ細胞を示唆する表現型を促進するのである。しかしながら、ラパマイシン処理はＣＤ１２２発現を減少させ、ＯＴ−Ｉ細胞がインビトロでのＩＬ−５刺激に応答する能力の欠損したことを示した（図５Ｄ、５Ｆ）。これは、ラパマイシン処理はＴ−ｂｅｔ発現の低下をもたらし、また、ＣＤ１２２はＣＤ８＋Ｔ細胞においてＴ−ｂｅｔの直接的な遺伝子ターゲットであるという事実と合致するものである。我々は、ラパマイシン処理でＣＤ１２７の発現には何の変化も認めなかったが、これらの細胞はインビトロでのＩＬ−７応答性についてより敏感になっていた（図５Ｄ及び５Ｇ）。いずれにしてもこれらのデータは、ｍＴＯＲ阻害は、メモリーの運命であるエオメソデルミン転写調節因子の持続的な発現と共に、ＩＬ−１２調整エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞のメモリー様表現型を与えていることを示している。

我々は次に、ＩＬ−７と７２時間調整された調製されたＯＴ−Ｉ細胞についてのさらに７２時間の再培養、又は、抗原リコール（１６８時間）が、メモリー様表現型に影響するかどうかを検討した。我々はラパマイシン処理ＯＴ−Ｉ細胞はＣＤ６２Ｌ^ｈｉおよびＫＬＲＧ１^ｌｏ表現型を維持することを決定した。しかし、ＣＤ６９^ｈｉ表現型は失われた。注目すべきことに、７２時間で観察されたＣＤ１２２^ｌｏ表現型は再生し、我々はＣＤ１２７の発現にはいかなる変化も認めなかった。このように、ラパマイシン処理ＯＴ−Ｉ細胞をＩＬ−７と静置することは、基本的に、ＣＤ６９^ｈｉ表現型を維持する能力を回避し、メモリー前駆表現型を維持するのである。

［実施例８］
本実施例は、ｍＴＯＲ阻害はメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の産生を増強することを示すものである。ＩＬ−１２仲介性タイプＩエフェクター機能をブロックする、エオメソデルミン発現のための持続的なＴ−ｂｅｔを切り替える、そして、ＯＴ−Ｉ細胞においてメモリー様表現型を誘導するというラパマイシンの能力に基づいて、我々は、ラパマイシン処理されたＩＬ−１２で調整されたＯＴ−Ｉ細胞が養子移入の後にメモリー応答を生じるかどうか分析した。これを試験するため、我々は初めに、ラパマイシン処理されたＯＴ−Ｉ細胞が、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ６９発現の増加によって示唆されるように、二次性リンパ器官に局在する能力が変化をしめすかどうかを検討した。養子移入されたＡｇ＋Ｂ７．１±ＩＬ−１２及びラパマイシンで調整されたＯＴ−Ｉ細胞（Ｔｈｙ１．１^＋）は、２４時間後にＣ５７ＢＬ／６（Ｔｈｙ１．２^＋）レシピエントにおいて検出された。ラパマイシン処理されたＯＴ−Ｉ細胞は、二次性リンパ器官（リンパ管及び脾臓）における局在が増加していることを示した。また、これに対応して、例えば肝臓（図６Ａ）や血液のような、三次的な場所ではより少ない数が観察された。ラパマイシン処理されないＯＴ−Ｉ細胞ではこの局在パターンを示さなかった（図６Ａ）。しかしながら、我々は、肺での細胞数についていかなる有意な違いも観察しなかった。すなわち、ｍＴＯＲ活性阻害は、抗原及びＩＬ−１２調整ＣＤ８＋Ｔ細胞の局在を、二次性リンパ区画にシフトさせるのである。

メモリー前駆ＯＴ−Ｉ細胞を産生するラパマイシン処理が、メモリー機能を与えるのかどうかを確認するために、我々は養子移入された細胞の持続性（４０日）及び抗原リコール応答（４３日）を試験した。Ａｇ＋Ｂ７．１及びＩＬ−１２で調整されたＯＴ−Ｉ細胞は、Ａｇ＋Ｂ７．１で刺激されたＯＴ−Ｉ細胞よりも強い持続性を示した（図６Ｂ）。しかしながら、４０日に検出された増加数によって示されるように、ラパマイシン処理はＯＴ−Ｉ細胞の持続能力を著しく増強した（図６Ｂ）。ＯＴ−Ｉ細胞の増加した持続性はおおまかには、ラパマイシン処理されたＯＴ−Ｉ細胞がラパマイシン処理されていないコントロールと同様のＣＦＳＥ希釈を示すように、より大きな恒常的増殖の結果であるというよりは、生存関連遺伝子の発現がより高度に出現する、生存のための分化能力によるものである（図５Ｅ）。さらに、ラパマイシン処理されたＯＴ−Ｉ細胞は、抗原再免疫試験（図６Ｂ）及びエフェクター応答（ＩＦＮ−γ、グランザイムＢ発現、ＣＴＬ活性（図６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ））におけるクローン性増殖によって評価されるように、活発な抗原リコールを産生する。さらに重要なことに、ラパマイシン処理群においては、細胞当たりでのＩＦＮ−γ及びグランザイムＢの発現の増加があるが、このことは、この群で見られたインビボでの細胞分解性の致死の増加は、細胞数の増加によるだけでなく、抗原リコールでのエフェクター成熟の増加によることを示している。つまり、ラパマイシン処理はＣＤ８＋Ｔ細胞の持続性を増強するだけでなく、抗原再免疫においてより高度なエフェクター能力を与えるのである。養子移入されたＯＴ−Ｉ細胞の短期（５日）及び長期（４０日；メモリー）における表現型分析は、ラパマイシン処理された細胞は、５日ではメモリー前駆細胞表現型を保ちながらＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９がより多く発現しているが、この表現型は４０日には代替されていることを示している。加えて、４０日では、Ｔ−ｂｅｔ及びＣＤ１２２発現は変化を示さなかった。まとめると、これらの観察は、ラパマイシン処理は、二次性区画に局在可能かつ養子移入で持続可能なＣＤ８＋メモリー前駆細胞の産生を促進することを示している。しかしながら、ＣＤ８＋メモリー前駆細胞は後には代替し、強い抗原リコールエフェクター応答を生成する。

［実施例９］
本実施例は、ラパマイシン処理されたＩＬ−１２調整ＯＴ−Ｉ細胞は、増強された腫瘍効力を有することを示す。養子細胞移入（ＡＣＴ）において体外で創出された腫瘍抗原特異的なエフェクターＣＤ８＋細胞の使用は、臨床的な設定において腫瘍の退縮をもたらす（モーガンら、２００６）。ラパマイシン処理されたＩＬ−１２調整ＯＴ−Ｉ細胞の腫瘍効力を試験するために、我々は、ラパマイシン処理された、又はされていないＩＬ−１２調整ＯＴ−Ｉ細胞（７２時間）を、Ｅ．Ｇ７腫瘍細胞、腫瘍サイズ（ｓ．ｃ．）を有する完全なＣ５７ＢＬ／６レシピエントに養子移入し、その後の生存が追跡された。ナイーブＯＴ−Ｉ細胞のレシピエントと比較して、Ａｇ＋Ｂ７．１刺激ＯＴ−Ｉ細胞を移植されたマウスは明らかな効果を示し（３０日までに、１００％に対し８０％死亡率）、ＩＬ−１２調整ＯＴ−Ｉ細胞ではさらに効果があった（３０日までに５０％死亡率）。ラパマイシン処理ＩＬ−１２調整ＯＴ−Ｉ細胞は、１２０日まで７８％のレシピエントが腫瘍なく生存し、著しく増強された腫瘍効力を示した（図７Ｂ）。さらに、ラパマイシン処理ＩＬ−１２調整ＯＴ−Ｉ細胞は、ラパマイシン処理されていない対照と比較した場合、腫瘍サイズの制御が著しく増強されている（図７Ａ）。これらの結果は、抗原、及び、ＩＬ−１２調整エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞よりも大きな腫瘍効力を示すメモリー応答のためのＩＬ−１２調整ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ｍＴＯＲ阻害が調節することを示している。

［実施例１０］
本実施例は、テムシロリムス及びラパマイシンは、ＲＣＣ及びメラノーマのマウスモデルにおいて、がんワクチンの抗腫瘍効力を増強することを示す。ＲＣＣモデルにおいて、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）が免疫アジュバントして提供され、標的抗原であり、明細胞ＲＣＣでは９０％の発現率である炭酸脱水素酵素（ＣＡ９）と複合化された。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ＣＡ９を発現するように改変された同系のＲＥＮＣＡ腫瘍が移植された。腫瘍移植された目的の処理モデルでは、マウスは、移植から１０日後に、テムシロリムス有り／無しのがんワクチンで処置された（図８）。図８にみられるように、ワクチン単体では腫瘍の生長に対して緩い効果しかない。テムシロリムス単独では、腫瘍生長の減少はあるが、ワクチンとテムシロリムスの組み合わせは腫瘍の生長に対してより大きな効果がある（図９）。同様にメラノーマモデルでも、ワクチンとテムシロリムスとの組み合わせは腫瘍の生長に対してより大きな効果を有した。このモデルでは、ＣＡ９はメラノーマ抗原ｇｐ１００と複合化された。Ｃ５７／ＢＬ６マウスはｇｐ１００を発現するように改変された同系のＢ１６腫瘍が移植された；マウスは１０日後に腫瘍ワクチンで処置された。ワクチンがラパマイシンで増強されたマウス卵巣がんモデルでも、同様の結果が観察された。

［実施例１１］
本実施例は、テムシロリムスの増強効果は免疫仲介性であることを示す。特に、テムシロリムスはインビトロにおいてＲＥＮＣＡ（腎臓がん細胞）の生長に直接的な影響を有したが、インビトロにおいてＢ１６メラノーマの生長には影響を有さなかった（図１０）。このことは、メラノーマモデルでは、テムシロリムスの一次的な効果は免疫仲介性であることを示した。この可能性に合致して、ＣＡ９＋ｇｐ１００による免疫は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、脾臓細胞からｇｐ１００特異的なＩＦＮ−γ−応答を誘発した。この応答は、テムシロリムスと同時に処理することで有意に増大した（ｐ＜０．０５）。さらに、特異的な致死はインビボのＣＴＬアッセイにおいて、テムシロリムス処理によって増加した。Ｐｍｅｌ−１細胞がＣ５７／ＢＬ６マウスに養子移入され、テムシロリムス有り／無しのｇｐ１００＋ＣＡ９で免疫された。Ｐｍｅｌ−１細胞は、ｇｐ１００．１３の２５−３３番目のアミノ酸に対応するＨ−２Ｄｂ制限エピトープを認識する遺伝子改変細胞である。Ｈ−２Ｄｂ制限エピトープを負荷された標的細胞は、注入され、１４時間後にフローサイトメトリーで検出された。テムシロリムス非受容群での特異的な致死は６６％であった。ワクチンとともにテムシロリムスが投与された場合、特異的致死は７８％に増加した。

［実施例１２］
本実施例は、本発明の多様な態様を示すものであり、各例は、ｍＴＯＲ阻害剤の使用が、抗がん免疫応答を増強することを示している。各例において、ブラック６（Ｂｌａｃｋ６）マウスが使用された。

図１１に示されたデータは、ラパマイシンは、樹立された卵巣腫瘍に対して免疫仲介性の防御を増強することを示している。簡潔には、２０日に卵巣腫瘍保有マウスが、マウス卵巣漿液上皮細胞（「ＭＯＳＥＣ」）の注入によって創出された。免疫付与は、ＭＨＣ−Ｉの関連において鶏アルブミン抗原を発現している鶏痘由来ウィルスベクター（「Ｔｒｉｃｏ」（サノフィパスツール社）、「Ｔｒｉｃｏｍ」とも言われる）を用いて行われた。ウィルスはＴ細胞の活性化に関与する３つの共刺激分子（Ｂ７．１、ＬＦＡ３及びＬＦＡ−１）を発現している（例えば、ガーネットら、Curr Pharm Des. 2006;12(3):351-61を参照のこと。この文献は参照により援用される）。腫瘍保有マウスの生存が追跡された。各実験群は２０匹であり、実験は２度繰り返された。図１１のデータに見られるように、ラパマイシンの添加は、コントロール群との比較において、腫瘍保有マウスの免疫仲介性の生存について核心的な増強効果を有する。

図１２に示されたデータは、ｍＴＯＲ阻害剤の投与は、胸腺腫保有マウスのウィルス免疫仲介性の生存を増加させることを示している。図１２にまとめられたデータは、図１１で説明されたのと同様の実験環境を使用して、マウスＴ細胞胸腺腫鶏アルブミン発現細胞（ＥＧ．７）を接種されたマウスの分析に関する。これらのデータからは、ｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン）とワクチン付与の組み合わせは、腫瘍保有マウスの生存を優位に増強することがわかる。

図１３に示されたデータは、ｍＴＯＲ阻害剤の添加は、恒常的増殖（ＨＰ）誘導性の抗腫瘍免疫を増強することを示している。特に、放射線誘導性のリンパ球減少は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞において、機能的な成熟およびメモリーをもたらすＨＰを誘導する。腫瘍（胸腺腫−ＥＧ．７）保有マウスでは、ナイーブ腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入に続く放射線は、腫瘍の生長に対する防御を生成する。図１３に示されるように、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞がラパマイシン存在下におけるリンパ球減少によって成熟するようにラパマイシンが投与された時に、このＨＰ−誘導性の腫瘍免疫は増強される。すなわち本発明は、様々な種類の、がん抗原保有マウスに対する免疫学的応答の誘導の効果を増強することにも効果的である。

図１４は本発明の増強された予防的効果を示すデータの、図示的なまとめを提供している。これらのデータは一部ＯＴ−Ｉ細胞を用いて作られた。簡潔には、ＯＴ−Ｉ細胞は、全てのＣＤ８＋Ｔ細胞がｋ^ｂに提示されたオボアルブミンのペプチドに特異的なＴＣＲを発現している、汎用の遺伝子改変ＯＴ−Ｉマウスから得られる。ペプチドのアミノ酸配列は当業者に知られている。

図１４に示されるとおり、ナイーブＯＴ−Ｉ細胞は、ナイーブ同系マウスに注入され、その後、ナイーブレシピエントマウスは上述のとおり構築されたＴｒｉｃｏｍウィルスを用いてオボアルブミン抗原に対して免疫付与される。免疫付与に続いて、ｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン）が日毎に７日間付与される。図１４で示されるグラフは胸腺腫試行第一日目（４０日）を「０」とされている。注目すべきことに、データは、４０日後に同系の腫瘍によって試行された時に、ラパマイシン処理は、ウィルス免疫付与マウスの生存を有意に増強したことを示している。これは、持続的な腫瘍免疫及び抑止のための、メモリーＣＤ８Ｔ細胞を産生する能力を表している。すなわち、本発明は、予防的免疫のための強力な方法を提供するものであり、例えば、個体におけるがん成長のリスクや、また、再発リスクに対しても採用されうる。

図１５は、ｍＴＯＲ処理がＨＰ−誘導性の抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強することを示している。特に、図１５に示されるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは放射線照射され、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数はＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞で回復された。マウスはＥＧ．７細胞（アルブミン抗原を発現した胸腺腫細胞）で試行された後、ラパマイシンが日毎に８日間投与された。再度のｍＴＯＲ阻害剤の使用は、予防的免疫応答の＋ラパマイシンの列で表されたように、ＨＰ−誘導性腫瘍免疫を増強する。

図１６は、卵巣腫瘍の治療において本発明が、ＣＤ８＋Ｔ細胞仲介性のＡＣＴ（養子細胞療法）療法の増強を誘発したことを示している。特に、ナイーブＯＴ−Ｉ細胞が、ラテックス微粒子及びＣ５７ＢＬ／６マウス同等ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋ^ｂ）と併せて、抗原と共に、７２時間、ＩＬ−１２及びｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン）の存在／不存在下で、培養される。エクスビボで産生されたＣＤ８＋細胞に特異的な抗原は、回収され、腫瘍を有する同系レシピエントに注入された（４０日）。養子移入のアプローチは、皮下又は腹腔内を通じて、ＭＯＳＥＣ−Ｏｖａ腫瘍を有するように作出されたマウスに対して用いられた。皮下注入は、サイズの測定に適当な腫瘍をもたらし、腹腔内ルートは、生存時間を決定するために有用なデータを生じた。これらは、添付のグラフに記載されている。データは卵巣腫瘍試行（４０日）を制御し、生存を促進する強い能力を示している。このように、ラパマイシン処理抗原、及び共刺激され、完全に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、胸腺腫の防御と類似の態様で、養子細胞移入によって卵巣腫瘍免疫を促進する。マウスは３００日まで腫瘍フリーであり、再試行にも抵抗を示した。すなわち、メモリーＴ細胞が示唆される。

Claims

ＣＤ８＋Ｔ細胞の個体群及び哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤を含む組成物。
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が前記組成物の細胞中に少なくとも１０％含まれる、請求項１に記載の組成物。
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が特異的で、かつ、個体において免疫応答の増強が所望される抗原をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
さらにインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を含む、請求項３に記載の組成物。
抗原が腫瘍抗原である、請求項３に記載の組成物。
増強された免疫応答を必要とする個体において、抗原に対する増強された免疫応答を得るための方法であって、前記個体において前記抗原及び哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤を投与することを含む方法。
前記個体が、がんを有すると診断されもしくは疑われており、前記がんが前記抗原を発現しているがん細胞を含む、請求項６に記載の方法。
個体において、前記抗原の投与に続いて前記ｍＴＯＲ阻害剤が投与される、請求項６に記載の方法。
少なくとも７日間、少なくとも１日１回、ｍＴＯＲ阻害剤が個体に投与される、請求項８に記載の方法。
継続して２０日間を超えない期間、ｍＴＯＲ阻害剤が個体に投与される、請求項８に記載の方法。
ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシン又はテムシロリムスである、請求項６に記載の方法。
さらに、個体において、前記抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物を投与することを含む、請求項６に記載の方法。
個体にＣＤ８＋Ｔ細胞を投与する以前に、前記抗原がＣＤ８＋Ｔ細胞に提示されている、請求項１２に記載の方法。
個体にＣＤ８＋Ｔ細胞を投与する以前に、ＣＤ８＋Ｔ細胞がｍＴＯＲ阻害剤と接触させられている、請求項１３に記載の方法。
個体にＣＤ８＋Ｔ細胞を含む前記組成物を投与する以前に、個体からＣＤ８＋Ｔ細胞が単離されている、請求項１２に記載の方法。