KR20140128977A - Cd4+ t-세포 반응의 증강을 위한 변형된 에피토프 - Google Patents

Cd4+ t-세포 반응의 증강을 위한 변형된 에피토프 Download PDF

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Abstract

본 발명은 T-세포 에피토프를 포함하는 면역원성 펩티드에 관한 것이다. 상기 펩티드는 이러한 변형을 포함하지 않는 동일한 펩티드로 수득한 CD4+ T-세포 반응보다 훨씬 더 강한 CD4+ T-세포 반응이 수득가능하도록 변형된다. 특히, 변형은 펩티드의 MHC-결합 부위에 인접하지만 그 외부에 있는 위치에서의 시스테인의 부가, 시스테인의 삽입, 또는 잔기의 시스테인으로의 돌연변이이다. 질환, 예컨대 감염성 또는 알레르기성 질환 및 자가면역 질환의 치료, 억제 또는 예방, 이식편 거부의 예방 또는 억제, 또는 종양 세포의 박멸에 있어서 이와 같이 변형된 펩티드의 용도가 또한 개시된다.

Description

CD4+ T-세포 반응의 증강을 위한 변형된 에피토프{MODIFIED EPITOPES FOR BOOSTING CD4+ T-CELL RESPONSES}
본 발명은 T-세포 에피토프를 포함하는 면역원성 펩티드에 관한 것이다. 상기 펩티드는 이러한 변형을 포함하지 않는 동일한 펩티드로 수득한 CD4+ T-세포 반응보다 훨씬 더 강한 CD4+ T-세포 반응이 수득가능하도록 변형된다. 특히, 변형은 펩티드의 MHC-결합 부위에 인접하지만 그 외부에 있는 위치에서의 시스테인의 부가, 시스테인의 삽입, 또는 잔기의 시스테인으로의 돌연변이이다. 질환, 예컨대 감염성 또는 알레르기성 질환 및 자가면역 질환의 치료, 억제 또는 예방, 이식편 거부의 예방 또는 억제, 또는 종양 세포의 박멸에 있어서 이와 같이 변형된 펩티드의 용도가 또한 개시된다.
병원체에 대한 백신접종의 목적은 가능한 한 강한 특정의 면역 반응을 도출하는 것이다. 이러한 백신접종은 약한 고유의 면역원성을 갖는 항원을 사용한다. 이러한 약한 면역원성에 대한 원인은 인간 집단에서의 조직적합성 복합체의 매우 큰 다양성과 관련된다. 이러한 복합체 (CD8+ T 세포에 대한 제시를 위한 클래스 I 또는 CD4+ T 세포에 대한 제시를 위한 클래스 II)는 항원-제시 세포로 지칭되는 특화된 세포의 표면에서 T 세포에 항원을 제시한다. T 세포가 활성화되는 강도는 항원 프로세싱 후에 수득된 펩티드와 로딩된 항원-제시 세포와 특정 T 세포 사이에 형성된 시냅스의 강도 및 지속기간에 따라 달라진다.
약한 면역원성을 피하는 통상의 방법은 아주반트를 첨가하는 것이다. 알루미늄 염에서부터 오일 에멀젼까지 이러한 아주반트 중 몇몇이 기재되어 있다. 아주반트가 면역원성을 증가시키는 메카니즘은 비-특이적이고, 사용되는 아주반트의 유형에 의존한다. 그러나, 다수의 경우에, 아주반트의 사용은 염증성 부작용으로 인해 제한된다.
백신 항원의 면역원성을 특이적으로 증가시키는 일반적 방법이 매우 많이 바람직하다. 이는 세포외 병원체, 예컨대 박테리아 또는 기생충에 대한 백신 항원, 뿐만 아니라 세포내 병원체, 예컨대 바이러스에 대한 백신 항원과 관련된다.
면역 반응은 조절성 T 세포에 의해 억제될 수 있다. 흉선에서 중점적으로 선택되는 천연 하위세트 또는 항원 충돌에 의해 말초부에서 수득되는 말초 하위세트에 속하는 이러한 세포는 억제성 시토카인, 예컨대 IL-10 또는 TGF-베타의 생산, 표적 세포의 필수 영양소, 예컨대 아르기닌 또는 트립토판의 고갈, 또는 세포 접촉을 비롯한, 면역 반응을 억제하는 다수의 메카니즘을 이용한다. 천연 조절성 T 세포의 레퍼토리는 흉선에서 자가항원이 제시되었을 때 선택의 결과로서 자가-반응성이다. 말초 또는 유도된 조절성 T 세포는 자가항원 또는 동종항원과의 접촉에 의해 형성되어 활성화된다.
항원-특이적 조절성 T 세포의 백분율은 매우 낮으며, 이러한 세포는 시험관내에서 확장시키기 어렵다. 또한, 이러한 세포를 생체내에서 확장시키는 방법은 매우 성공적이지 않았다. 예를 들어, 아주반트의 부재 하에 MHC (주요 조직적합성 복합체) 클래스 II 에피토프를 포괄하는 합성 펩티드의 투여는 IL-10을 생산하는 조절성 T 세포의 확장을 도출한다. 그러나, 조절성 T 세포의 활성화 및 확장은 T 세포 표면에서 표면 CD28과 상호작용하는, B7 패밀리의 것을 비롯한 공동자극 분자의 표면 발현을 발생시키는 항원-제시 세포의 공동-자극, 즉 활성화에 엄격하게 의존하는 것으로 알려져 있다. CD28이 결핍된 마우스는 조절성 T 세포를 생산하지 않고, 크게 증가된 자가면역 질환 발생률을 갖는다.
따라서 조절성 T 세포의 확장에 요구되는 백신 항원의 면역원성을 개선하는 일반적 방법이 크게 요구된다. 이러한 설정에서 백신 항원은 자가항원 또는 동종항원을 포함한다.
다수의 종양이 요법을 위한 표적으로 작용할 수 있는 항원을 발현한다. 이러한 항원은 종양에 의해 떨어져나와 숙주 항원-제시 세포에 의해 숙주 면역계에 제시된다. 간접 항원 제시 경로로 지칭되는 이러한 과정은 종양 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 도출한다. 그러나, 대부분의 경우에, 종양 세포는 MHC 클래스 II 결정기를 발현하지 않으며, 효율적인 면역 반응은 오직 MHC 클래스 I 결정기에 의해 제시되는 종양-유래 펩티드를 인식하는 CD8+ T 세포에 의존한다. 이는 클래스 I 제한 펩티드를 사용하여 종양-특이적 CD8+ T 세포를 증강시키기 위한 다수의 시도에 의해 설명된 바와 같이 별로 효율적이지 않다 (문헌 [Boon et al. 2006, Ann Rev Immunol 24, 175-208]). 따라서, 신규 전략이 요망된다.
종양 특이적 CD4+ T 세포가 심지어는 종양이 MHC 클래스 II 결정기를 발현하지 않는 경우에도 종양 거부에서 소정의 역할을 수행할 수 있다는 일부 제안이 있었으며 (문헌 [Perez-Diez et al. 2007, Blood 15, 5346-5354]), 이는 NK 세포 또는 기질 세포에 대한 간접 효과를 시사한다. 그러나, CD4+ T 세포 반응을 증강시키기 위한 어떠한 시도도 제안되지 않았다.
간접 경로에 의해 제시된 종양 항원에 대한 CD4+ T 세포 특이적 반응을 증가시키는 일반적 방법이 크게 바람직하다. 이는 종양유전자 또는 원종양유전자, 바이러스-유래 단백질, 생존 인자 또는 클론형 결정기를 생산하는 종양과 관련된다.
따라서, 상기에서 공통적으로 요구되는 것은 CD4+ T 세포 활성화를 증강시키고, 이어서 증가된 이펙터 CD4+ T 세포-기능, 증가된 조절성 T-세포 기능 및 증가된 CD8+ T 세포-활성화 중 하나 이상을 발생시키는 작용제 또는 방법을 발견하는 것이다. CD4+ T 세포는 활성화되었을 때 자연적으로는 세포독성 또는 세포용해성이 아니다. 산화환원-활성 펩티드 태그 ("CXXC" 또는 "CXX[S/T]" 또는 "[S/T]XXC" 펩티드 모티프)를 이러한 태그를 자연적으로 함유하지 않는 T-세포 항원에 첨가하면 이와 같이 변형된 T-세포 항원에 의해 활성화된 CD4+ T 세포가 비-세포용해 CD4+ T-세포에서 세포용해 CD4+ T-세포로 전환된다는 것이 개시되어 있다 (WO 2008/017517; WO 2009/100505; WO 2009/100204; WO 2009/100205; WO 2009/100206; WO 2009/100207; WO 2009/100208). 그러나 이들 문헌 중 어느 것도 비-세포용해 CD4+ T-세포를 세포용해 CD4+ T-세포로 전환시키지 않으면서 CD4+ T 세포의 "정상적인" 활성화를 증강시키는 것은 기재하지 않았다.
본 발명의 측면은
a) MHC 단백질의 클레프트에 결합하는 T 세포 에피토프, 및
b) 상기 에피토프의 n-말단 및/또는 c-말단 측면에 있는 1 내지 6개의 아미노산 및 시스테인 잔기를 포함하며, 단 상기 시스테인은 모티프 Cxx[CST] 또는 [CST]xxC가 발생하는 경우 상기 에피토프에 인접하여 있거나 또는 상기 에피토프로부터 최대 7개 아미노산만큼 떨어져 있을 때 상기 모티프를 갖는 서열에서는 발생하지 않는 것인 서열
을 포함하며, 부분 a) 및 b)에 정의된 서열이 상기 항원성 단백질의 야생형 서열에서 발생하는 서열과 상이한 인공 펩티드인 단리된 면역원성 펩티드에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서, 부분 b)에 정의된 서열은 오직 1개의 시스테인을 함유한다.
구체적 실시양태에서, 에피토프는 MHC 클래스 II 에피토프이다.
특정한 실시양태에서, 펩티드는 9 내지 100개 아미노산, 9 내지 50개 아미노산, 또는 9 내지 20개 아미노산의 길이를 갖는다.
다른 특정한 실시양태에서, 시스테인 아미노산은 에피토프에 대해 N- 또는 C-말단에 인접하여 위치하며, 이 때 에피토프와 시스테인 아미노산 사이에는 아미노산이 없다.
본 발명과 관련하여 질환 연관 T 세포 에피토프의 예는 감염원의 T 세포 에피토프, 또는 자기 항원, 알레르겐, 동종인자 또는 동종이식 항원의 T 세포 에피토프이다. 질환-연관 T 세포 에피토프의 다른 예는 종양에 특이적이거나 또는 우선적인 T 세포 에피토프이다.
본 발명은 면역원성 펩티드에 관한 것이다. 특히, 상기 면역원성 펩티드는 다음으로 이루어진다:
(i) T 세포 에피토프 (단, 상기 T 세포 에피토프가 MHC에 결합하는 아미노산 잔기를 플랭킹하는 아미노산 잔기를 포함하는 경우에, 상기 플랭킹 아미노산 잔기는 자연적으로 상기 T 세포 에피토프의 MHC 결합 영역에 인접한 최대 6개의 아미노산 내에 시스테인 아미노산을 포함하지 않고, 모노- 또는 디시스테인 산화환원 모티프를 포함하지 않음); 및
(ii) T 세포 에피토프의 MHC-결합 영역의 외부의 위치에 있는 시스테인 아미노산 (여기서, 상기 시스테인 아미노산은 상기 위치에서 T 세포 에피토프에 부가 또는 삽입되거나, 또는 상기 시스테인 아미노산은 T 세포 에피토프의 상기 위치에서 비-시스테인 아미노산의 시스테인으로의 돌연변이로부터 발생함).
본 발명에 따른 면역원성 펩티드에서, (ii)의 상기 시스테인 아미노산은 MHC-결합 영역으로부터 최대 5개의 아미노산만큼 떨어져 있는 위치에서 T 세포 에피토프에 부가 또는 삽입될 수 있거나, 또는 (ii)의 상기 시스테인 아미노산은 MHC-결합 영역으로부터 최대 5개의 아미노산만큼 떨어져 있는 위치에서 비-시스테인 아미노산의 시스테인 아미노산으로의 돌연변이로부터 발생할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드에서, (ii)의 상기 시스테인 아미노산은 T 세포 에피토프 MHC-결합 영역으로부터 최대 5개 아미노산의 인공 링커 아미노산 서열만큼 떨어져 있을 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 펩티드 중 어느 하나에서, 상기 시스테인 아미노산은 MHC 결합 영역에 대해 N- 또는 C-말단에 인접하여 위치할 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 펩티드 중 어느 하나에서, 상기 질환-연관 T 세포 에피토프는 감염원, 자기 항원, 알레르겐, 동종인자 또는 동종이식 항원의 T 세포 에피토프, 또는 종양에 특이적이거나 또는 우선적인 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 면역원성 펩티드 및 또한 용매, 희석제, 담체 또는 아주반트 중 하나 이상를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 면역원성 펩티드 또는 이러한 펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 의약으로 사용하기에 적합하다. 면역원성 펩티드에 함유된 T 세포 에피토프의 특성에 따라, 면역원성 펩티드를 포함하는 의약은 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약, 자가면역 질환, 알레르기성 질환의 치료, 예방 또는 억제, 이식편 거부의 예방 또는 억제, 동종인자를 중화하는 면역 반응의 예방 또는 억제 또는 종양 또는 암 세포의 치료, 예방 또는 박멸을 위한 의약으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드 또는 이러한 펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 효과적인 이펙터 CD4+ T 세포 반응, 효과적인 조절성 T 세포 반응 및/또는 CD8+ T 세포의 효과적인 활성화로 이어질 수 있는 효과적인 CD4+ T 세포 반응을 유도하기 위한 의약으로 사용하기 위한 것이다.
본원에서 CD8+ T 세포의 활성화는 초활성화된 CD4+ T 세포에 의한 시토카인, 예컨대 인터류킨 2의 생산을 통한 간접적 활성화이다.
본 발명의 또 다른 측면은
(a) CD4+ T-세포 반응을 도출할 수 있는 항원성 단백질의 T-세포 에피토프로 이루어진 펩티드 서열을 제공하는 단계,
(b) (a)의 펩티드 서열에 상기 에피토프 서열로부터 최대 5개 아미노산만큼 떨어져 있는 시스테인 잔기를 포함하는 서열을 연결시키며, 단 상기 시스테인은 모티프 [CST]-xx-C 또는 C-xx-[CST]가 발생하는 경우 상기 MHC 결합 영역에 인접하여 있거나 또는 상기 MHC 결합 영역으로부터 최대 7개 아미노산만큼 떨어져 있을 때 상기 모티프를 갖는 서열에서는 시스테인으로 발생하지 않는 것인 단계,
(c) 단계 a) 및 b)에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 펩티드를 합성하는 단계
를 포함하는, CD4+ T-세포 반응을 도출할 수 있는 항원성 단백질의 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 항원성 단백질 내의 T 세포 에피토프의 서열은 컴퓨터 알고리즘 및/또는 생화학적 검정에 의해 결정될 수 있다.
이러한 방법에서, 부분 b의 펩티드 서열은 에피토프 서열의 N 말단 또는 C 말단에 있는 최대 6개 아미노산의 영역에서의 항원성 단백질의 아미노산 서열을 변형시킴으로써 수득할 수 있다.
이는 시스테인의 도입, 모티프 [CST]-xx-C 또는 C-xx-[CST]에서 시스테인으로 발생하는 시스테인의 결실, 및 한 위치에서의 시스테인의 결실 및 또 다른 위치에서의 시스테인의 도입으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이에 의해 수행될 수 있다.
대안적으로, 부분 b의 펩티드 서열는 에피토프 서열의 N 말단 또는 C 말단에 있는 최대 6개 아미노산의 영역에서의 항원성 단백질의 서열과 관련되지 않은 인공 서열일 수 있다.
자가면역 질환, 알레르기성 질환의 치료, 예방 또는 억제, 이식편 거부의 예방 또는 억제, 동종인자를 중화하는 면역 반응의 예방 또는 억제 또는 종양 또는 암 세포의 치료, 예방 또는 박멸을 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명에 따른 면역원성 펩티드 또는 이러한 펩티드를 포함하는 조성물의 용도가 또한 고려된다.
도 1. 임의의 펩티드와 로딩하지 않은 ("펩티드 없음") 또는 천연 p21-35 펩티드와 로딩한 ("Der p2 p21-35"), 또는 위치 21의 시스테인 (p21-35 펩티드의 N-말단 아미노산)을 알라닌으로 돌연변이시킨 p21-35 펩티드와 로딩한 ("Der p2 p21-35 Cys21Ala") 나이브 항원-제시 세포의 존재 하의 Der p2 p21-35 펩티드-특이적 CD4+ T 세포 클론의 증식.
도 2. 예비-처리되지 않은 (삼각형) 또는 ALK 단백질로부터 유래된 T 세포 항원 (상기 T 세포 항원은 T 세포 항원의 MHC-결합 영역에 인접한 시스테인을 포함함)으로의 예비면역화에 의해 예비-처리된 (사각형) 면역적격 C57BL/6 마우스에서의 NPM-ALK 종양의 성장.
도 3. 세포를 (a) 그의 천연 또는 야생형 (도면에서 wtALK) 서열에서 ALK 단백질의 아미노산 1541-1555에 해당하는, 서열 GAA EGG WTGPGAGPR (서열 14)의 펩티드 또는 (b) 단일 시스테인이 ALK 단백질의 위치 1544에 부가된 서열 CGG WTGPGAGPR (서열 15)의 펩티드로 자극시킨 후에 삼중수소화 티미딘의 혼입에 의해 평가된 바와 같은 CD4+ T 세포의 증식 속도.
정의
본원에 사용된 경우에 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된, 2 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하나, 특정 실시양태에서는 비-아미노산 구조물 (예를 들어, 연결 유기 화합물)을 포함할 수 있는 것인 분자를 의미한다. 본 발명에 따른 펩티드는 20가지의 일반 아미노산 중 임의의 것, 또는 그의 변형된 버전을 포함할 수 있거나, 또는 화학적 펩티드 합성 또는 화학적 또는 효소적 변형에 의해 도입된 비-자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 경우에 용어 "에피토프"는 B 또는 T 세포 림프구의 세포 표면에 제시된 항체 또는 그의 일부 (Fab', Fab2' 등), 또는 수용체에 의해 특이적으로 인식되고, 그에 결합하며, 상기 결합에 의해 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질 또는 인자 중 하나의 또는 여러 부분 (입체형태적 에피토프를 정의할 수 있음)을 의미한다.
본원에 사용된 경우에 용어 "항원"은 하나 이상의 합텐(들) (오직 담체에 부착된 경우에 면역 반응을 도출함)을 포함하고/거나, 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 거대분자 구조물을 지칭한다. 전형적으로, 상기 거대분자는 (다당류를 포함하거나 또는 포함하지 않는) 단백질 또는 펩티드이거나, 단백질성 조성물로 구성된 것이고, 하나 이상의 에피토프를 포함하며; 본원에서 상기 거대분자는 대안적으로 "항원성 단백질" 또는 "항원성 펩티드"로 지칭될 수 있다.
용어 "동종인자"는 동일한 종의 2개의 개체를 비교한 경우에 다형성을 나타내는 단백질, 펩티드 또는 인자 (즉, 임의의 분자), 및 보다 일반적으로는 동종인자를 제공받은 대상체에서 (동종반응성) 면역 반응을 유도하는 임의의 단백질, 펩티드 또는 인자를 지칭한다.
본 발명과 관련하여 용어 "T 세포 에피토프" 또는 "T-세포 에피토프"는 우세한, 준-우세한 또는 소수의 T 세포 에피토프, 즉 T 림프구의 세포 표면에 있는 수용체에 의해 특이적으로 인식되고 결합되는 항원성 단백질 또는 인자의 일부를 지칭한다. 에피토프가 우세한 것인지, 준-우세한 것인지 또는 소수의 것인지의 여부는 에피토프에 대해 도출되는 면역 반응에 의존한다. '우세함'은 단백질의 모든 가능한 T 세포 에피토프 중에서, 이러한 에피토프가 T 세포에 의해 인식되고, 이를 활성화시킬 수 있는 빈도에 의존한다. 특히, T 세포 에피토프는 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 결합되는 에피토프이다. 단백질 서열 내의 T 세포 에피토프는 기능적 검정 및/또는 하나 이상의 인실리코 예측 검정에 의해 확인될 수 있다. T 세포 에피토프 서열 내의 아미노산은 MHC 단백질의 결합 그루브 내에서의 그의 위치에 따라 넘버링된다. 본 발명의 펩티드 내에 존재하는 T-세포 에피토프는 8 내지 25개 아미노산, 8 내지 16개 아미노산으로 이루어질 수 있거나, 또는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 아미노산으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 면역원성 펩티드의 T 세포 에피토프는 단백질의 천연 에피토프 서열에 상응할 수 있거나, 또는 변형된 T 세포 에피토프가 천연 T 세포 에피토프 서열과 유사하게 MHC 클레프트 내에 결합하는 그의 능력을 보유한다면, 그의 변형된 버전일 수 있다. 변형된 T 세포 에피토프는 MHC 단백질에 대해 천연 에피토프와 동일한 결합 친화도를 가질 수 있지만, 이는 또한 저하된 친화도를 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 변형된 펩티드의 결합 친화도는 본래 펩티드보다 10배 이상 더 낮고, 보다 특히 5배 이상 더 낮다.
용어 "MHC"는 "주요 조직적합성 항원"을 지칭한다. 인간에서, MHC 유전자는 HLA ("인간 백혈구 항원") 유전자로 알려져 있다. 일관적으로 관례에 따르지 않더라도, 일부 문헌은 HLA 단백질 분자를 지칭하기 위해 HLA를 사용하고, HLA 단백질을 코딩하는 유전자를 지칭하기 위해 MHC를 사용한다. 이와 같이, 용어 "MHC" 및 "HLA"는 본원에 사용되는 경우에 동의어이다. 인간의 HLA 시스템은 마우스에서 그의 등가물, 즉 H2 시스템을 갖는다. 가장 집중적으로-연구된 HLA 유전자는 9개의 소위 고전적 MHC 유전자: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA 및 HLA-DRB1이다. 인간에서, MHC는 3개의 영역으로 분류된다: 클래스 I, II 및 III. A, B 및 C 유전자는 MHC 클래스 I에 속하는 반면, 6개의 D 유전자는 클래스 II에 속한다. MHC 클래스 I 분자는 3개의 도메인 (알파 1, 2 및 3)을 함유하는 단일 다형성 쇄로 만들어지며, 이 쇄는 세포 표면에서 베타 2 마이크로글로불린과 연관된다. 클래스 II 분자는 각각 2개의 쇄 (알파 1 및 2, 및 베타 1 및 2)를 함유하는 2개의 다형성 쇄로 만들어진다.
클래스 I MHC 분자는 실질적으로 모든 유핵 세포 상에서 발현된다. 클래스 I MHC 분자와 관련하여 제시된 펩티드 단편은 CD8+ T 림프구 (세포독성 T 림프구 또는 CTL)에 의해 인식된다. CD8+ T 림프구는 빈번하게 세포독성 이펙터로 성숙되고, 이는 자극 항원을 보유하는 세포를 용해시킬 수 있다. 클래스 II MHC 분자는 활성화된 림프구 및 항원-제시 세포 상에서 주로 발현된다. CD4+ T 림프구 (헬퍼 T 림프구 또는 HTL)는 통상적으로 대식 세포 또는 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포 상에서 발견되는 클래스 II MHC 분자에 의해 제시되는 특유의 펩티드 단편을 인식하여 활성화된다. CD4+ T 림프구는 증식하여, IL-4 및 IL-10의 생산을 통해 항체-매개 반응을 지지하거나 또는 IL-2 및 IFN-감마의 생산을 통해 세포-매개 반응을 지지하는 시토카인을 분비한다.
기능적 HLA는 내인성 뿐만 아니라 외래의, 잠재적으로 항원성 펩티드가 결합하는 깊은 결합 그루브에 의해 특성화된다. 그루브는 잘-정의된 형태 및 물리-화학적 특성에 의해 추가로 특성화된다. HLA 클래스 I 결합 부위는 펩티드 말단이 그루브의 말단에 구속되어 폐쇄된다. 이들은 또한 보존된 HLA 잔기를 갖는 수소 결합의 네트워크에 연관된다. 이러한 구속의 관점에서, 결합된 펩티드의 길이는 8-10개 잔기로 제한된다. 그러나, 최대 12개 아미노산 잔기의 펩티드가 또한 HLA 클래스 I에 결합할 수 있는 것으로 입증되었다. 다양한 HLA 복합체의 구조의 중첩은 결합의 일반적 방식을 확인하였으며, 여기서 펩티드는 상대적으로 선형의 확장된 입체형태를 채택한다.
HLA 클래스 I 결합 부위와 대조적으로, 클래스 II 부위는 양쪽 말단에서 개방된다. 이는 펩티드를 실제 결합 영역으로부터 확장시킴으로써, 양쪽 말단에 "걸린다". 이에 따라 클래스 II HLA는 9 내지 25개 초과의 아미노산 잔기 범위의 다양한 길이의 펩티드 리간드에 결합할 수 있다. HLA 클래스 I과 유사하게, 클래스 II 리간드의 친화도는 "불변" 및 "가변" 성분에 의해 결정된다. 불변 부분은 다시 HLA 클래스 II 그루브에 보존된 잔기와 결합된 펩티드의 주쇄 사이에 형성된 수소 결합의 네트워크로부터 생성된다. 그러나, 이러한 수소 결합 패턴은 펩티드의 N- 및 C-말단 잔기로 제한되지 않고, 전체 쇄에 걸쳐 분포된다. 후자는 이것이 복합체화된 펩티드의 입체형태를 엄격하게 선형 결합 모드로 제한하기 때문에 중요하다. 이는 모든 클래스 II 동종이형에서 공통적이다. 펩티드의 결합 친화도를 결정하는 제2의 성분은 클래스 II 결합 부위 내의 다형성의 특정 위치로 인해 달라질 수 있다. 상이한 동종이형은 그루브 내에 상이한 상보성 포켓을 형성하며, 이에 의해 펩티드의 하위유형-의존성 선택, 또는 특이성이 설명된다. 중요하게는, 클래스 II 포켓 내에 유지된 아미노산 잔기 상의 제약이 일반적으로 클래스 I에서보다는 "유연하다". 다양한 HLA 클래스 II 동종이형 사이에 훨씬 더 큰 펩티드 교차 반응성이 존재한다. MHC II 분자의 그루브에 맞는 MHC 클래스 II T 세포 에피토프의 +/- 9 아미노산의 서열은 일반적으로 P1 내지 P9로 넘버링된다. 에피토프의 추가의 아미노산 N-말단은 P-1, P-2 등으로 넘버링되고, 에피토프의 아미노산 C-말단은 P+1, P+2 등으로 넘버링된다.
용어 "종양-연관 항원"은 종양 또는 종양 세포(들)와 연관된 (이에 의해 운반된, 이에 의해 생산된, 이에 의해 분비된 등) 임의의 단백질, 펩티드 또는 항원을 지칭한다. 종양-연관 항원은 종양 또는 종양 세포(들)와 (거의) 독점적으로 연관되고 건강한 정상 세포와는 연관되지 않을 수 있거나 또는 건강한 정상 세포에 비해 종양 또는 종양 세포(들)에서 과다발현될 수 있다 (예를 들어, 10배, 100배, 1000배 또는 그 초과). 보다 특히 종양-연관 항원은 종양 세포의 MHC 결정기에 의해 (프로세싱된 형태로) 제시될 수 있는 항원이다. 따라서, 종양-연관 항원은 오직 MHC 분자를 발현하는 종양 또는 종양 세포와 연관될 가능성이 있다. 종양 연관 항원은 또한 종양에 특이적이거나 또는 우선적인 항원으로 지칭될 수 있다. 종양-연관 항원에 포함된 T 세포 에피토프는 또한 본원에서 종양에 특이적이거나 또는 우선적인 T 세포 에피토프로 지칭된다.
"알레르겐"은 병에 걸리기 쉬운, 특히 유전적으로 병에 걸리기 쉬운, 개별 (아토피성) 환자에서 IgE 항체의 생산을 도출하는 물질, 통상적으로 거대분자 또는 단백질성 조성물로서 정의된다.
용어 "치료 유효량"은 환자에서 원하는 치료 또는 예방 효과를 생성하는 본 발명의 펩티드 또는 그의 유도체의 양을 지칭한다. 예를 들어, 질환 또는 장애와 관련하여, 이는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 어느 정도 감소시키는 양, 및 보다 특히 질환 또는 장애와 연관된 또는 이로 인해 유발된 생리학적 또는 생화학적 파라미터를 부분적으로 또는 완전히 정상으로 되돌리는 양이다. 본 발명의 하나의 특정한 실시양태에 따라, 치료 유효량은 정상적인 생리학적 상황의 개선 또는 복구로 이어질 본 발명의 펩티드 또는 그의 유도체의 양이다. 예를 들어, 면역 장애를 앓고 있는 포유동물의 치유적 치료를 위해 사용되는 경우에, 이는 상기 포유동물의 일일 양 펩티드/kg 체중이다. 대안적으로, 투여가 유전자-요법을 통하는 경우에, 네이키드 DNA 또는 바이러스 벡터의 양은 본 발명의 펩티드, 그의 유도체 또는 동족체의 적절한 투여량의 국소 생산을 보장하도록 조정된다.
용어 "유도체"는 본 발명의 펩티드와 관련하여 본원에 사용된 경우에 적어도 펩티드 활성 부분 (즉, 세포용해 CD4+ T 세포 활성을 도출할 수 있음), 및 이에 더하여 다양한 목적, 예컨대 펩티드의 안정화 도는 펩티드의 약동학적 또는 약력학적 특성의 변경을 가질 수 있는 상보성 부분을 포함하는 분자를 지칭한다.
용어 "펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드 (또는 핵산)" 및 "펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 핵산)"는 본원에 사용된 경우에 적절한 환경에서 발현되었을 때 관련 펩티드 서열 또는 그의 유도체 또는 동족체의 생성을 발생시키는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 펩티드를 코딩하는 정상 서열 뿐만 아니라 요구되는 활성을 갖는 펩티드를 발현할 수 있는 이들 핵산의 유도체 및 단편을 포함한다. 한 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산은 포유동물 기원 또는 포유동물에 상응하는 펩티드 또는 그의 단편, 가장 구체적으로 인간 펩티드 단편을 코딩하는 서열이다.
설명
상기 기재된 바와 같이, 4-아미노산 산화환원-활성 펩티드 태그 ("CXXC" 또는 "CXX[S/T]" 또는 "[S/T]XXC" 모티프)를 T 세포 항원에 첨가하면 (여기서, 상기 태그는 항원의 MHC-결합 부위의 외부에 있고 이를 플랭킹함) 활성화시에 CD4+ T 세포가 세포용해 CD4+ T 세포로 전환된다. 이러한 전환은 정상적으로 자연에서는 발생하지 않고, 자연적인 면역 반응 동안 유도된 세포용해 세포는 세포용해 CD8+ T 세포로 제한된다. 이러한 시스템을 연구하여 본 발명으로 이어지는 추가의 작업에서, T 세포 항원에 부가된 펩티드 태그의 산화환원 활성이 산화환원-활성 태그 내의 시스테인 잔기 중 하나 이상을 비-시스테인 잔기 (그러나 비-시스테인 잔기로서 세린 또는 트레오닌은 제외함)로 전환시킴으로써 폐쇄되는 경우에, 이어서 CD4+ T 세포가 활성화될 수 있다는 것을 발견하였다. 그러나, 놀랍게도, 이러한 활성화는 시스테인 잔기가 펩티드 태그에 전혀 존재하는 경우에서보다 훨씬 더 강력하였다. 또한 MHC-결합 영역에 인접한 또는 상기 T 세포 항원의 부위에서의 단일 시스테인 잔기의 T 세포 항원의 존재는 상기 보다 강력한 CD4+ T 세포 활성화를 도출하기에 충분한 것으로 발견되었다.
따라서, 임의의 이론 또는 작용 방식에 제한되지 않고, CD4+ T 세포의 활성화의 유형에 연속성이 있는 것으로 보인다: (i) 상기 기재된 바와 같은 MHC-결합 부위를 플랭킹하는 영역에서 산화환원-활성 펩티드 태그 또는 단일 시스테인을 포함하지 않는 T 세포 항원에 의한 "기저" 천연 활성화, (ii) MHC-결합 부위에 인접한/이를 플랭킹하는 영역에서 단일 시스테인을 포함하는 T 세포 항원에 의한 (기저 활성화에 비해) 증가된 활성화, 및 (iii) T 세포 항원의 MHC-결합 부위에 인접한/이를 플랭킹하는 영역에서 산화환원-활성 펩티드 태그를 포함하는 T 세포 항원에 의해 활성화시에 CD4+ T 세포의 세포용해 CD4+ T 세포로의 전환.
본 발명은 항원 펩티드 서열의 MHC-결합 부위의 외부에 시스테인 잔기를 포함하도록 변형된 단리된 T 세포 항원, 뿐만 아니라 CD4+ T 세포의 활성화를 증가시키기 위한 이와 같이 변형된 항원의 용도에 관한 것이다. 상기 증가된 활성화는 항원 펩티드 서열의 외부에 이러한 시스테인 잔기를 포함하지 않는 T 세포 항원에 의한 CD4+ T 세포의 활성화와 비교한 것이다. 이러한 본 발명에 따른 면역원성 펩티드 뿐만 아니라 그의 용도는 하기에 보다 상세하게 기재된다.
따라서, 본 발명은 면역원성 펩티드에 관한 것이다. 특히, 상기 면역원성 펩티드는 다음으로 이루어진다:
(i) T 세포 에피토프 (여기서, 상기 T 세포 에피토프가 MHC에 결합하는 아미노산 잔기를 플랭킹하는 (또는 T 세포 에피토프의 MHC 결합 부위를 구성하는 아미노산 잔기를 플랭킹하는) 아미노산 잔기를 포함하는 경우에, 상기 플랭킹 아미노산 잔기는 자연적으로 상기 T 세포 에피토프의 MHC 결합 영역에 인접한 (및 이에 연속하는) 최대 6개의 아미노산 내의 위치에 시스테인 아미노산을 포함하지 않고, 모노- 또는 디시스테인 산화환원 또는 산화환원-활성 모티프를 포함하지 않음); 및
(ii) T 세포 에피토프의 MHC-결합 영역의 외부의 위치에 있는 시스테인 아미노산 (여기서, 상기 시스테인 아미노산은 상기 위치에서 T 세포 에피토프에 부가 또는 삽입되거나, 또는 상기 시스테인 아미노산은 T 세포 에피토프의 상기 위치에서 비-시스테인 아미노산의 시스테인으로의 돌연변이로부터 발생함).
본 발명의 면역원성 펩티드는 개략적으로 A-L-B 또는 B-L-A로 나타낼 수 있으며, 여기서 A는 T-세포 에피토프를 나타내고, L은 링커를 나타내고, B는 유리 시스테인 잔기를 나타낸다. 본 발명의 면역원성 펩티드는 화학적 합성에 의해 만들어질 수 있으며, 이는 비-천연 아미노산의 혼입을 허용한다. 따라서, 시스테인 잔기는 티올 기를 갖는 또 다른 아미노산, 예컨대 티올 관능기를 갖는 메르캅토발린, 호모시스테인 또는 다른 천연 또는 비-천연 아미노산에 의해 대체될 수 있다. 환원 활성을 갖기 위해 시스테인 잔기는 시스테인 디술피드 가교의 일부로서 발생하지 않아야 한다. 그럼에도 불구하고, 메틸화된 시스테인은 생체내에서 유리 티올기를 갖는 시스테인으로 전환될 수 있으므로, 시스테인 잔기는 예컨대 메틸화를 통해 변형될 수 있다.
본 발명의 면역원성 펩티드는 길이가 실질적으로 다양할 수 있으며, 예를 들어 약 12-13개 아미노산 (8-9개의 아미노산 및 시스테인 잔기를 함유하는 4개의 플랭킹 아미노산의 T-세포 에피토프) 내지 최대 50개 또는 그 초과의 아미노산이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드는 40개 아미노산의 엔도솜 표적화 서열, 시스테인을 포함하는 약 6개 아미노산의 플랭킹 서열, 및 9개 아미노산의 T 세포 에피토프 펩티드를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 펩티드는 12개 아미노산 내지 20개, 최대 25, 30, 50, 75, 100 또는 200개의 아미노산으로 이루어진다. 보다 특정한 실시양태에서, 펩티드는 10 내지 20개의 아미노산으로 이루어진다. 이러한 펩티드는 임의로 엔도솜-표적화 신호에 임의로 커플링될 수 있다.
상기에서, T 세포 에피토프는 자연 발생 단백질의 인접 부분인 것으로 의도된다. 이러한 인접 부분은, 예를 들어 항원-제시 세포의 프로테아솜 또는 엔도솜에 의해 소화되는 자연 발생 단백질의 소화의 결과일 수 있다. 대안적으로, 이러한 부분은 인공적일 수 있다 (예를 들어, 재조합적으로 또는 합성적으로/화학적으로 생산됨). 모든 경우에, T 세포 에피토프는 자연 발생 단백질의 부분과 동일한 아미노산 서열을 가지며, 즉 이는 자연에서 발생하는 바와 같이/자연적으로 인접한 아미노산 서열을 갖는다.
T 세포 에피토프는 주요 조직적합성 복합체 (MHC)의 그루브에 결합하는 아미노산으로 이루어질 수 있거나, 또는 동일한 아미노산을 플랭킹 아미노산 잔기와 함께 포함할 수 있다. 이러한 플랭킹 잔기는 MHC에 대한 에피토프의 결합에 기여하지 않으며, MHC 그루브 외부에 "걸린다". 플랭킹 잔기는 T 세포 에피토프의 MHC-결합 부분의 N- 및/또는 C-말단에 존재할 수 있다. 본 발명의 면역원성 펩티드에서, 상기 시스테인 잔기는 에피토프가 MHC 그루브에 맞는 경우에, 상기 시스테인 잔기가 MHC 결합 그루브의 외부에서 유지되도록 위치한다. 플랭킹 잔기를 포함하는 T 세포 에피토프, 예컨대 본원에서 실시예 2에 사용된 T 세포 에피토프는 자연적으로 그의 아미노산 서열에 시스테인 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 부분적으로 본 발명의 근원이다 (상기 T 세포 에피토프는 MHC-결합 부분의 N-말단 측면에 있는 및 자연적으로 이에 근접한 2개의 플랭킹 아미노산 잔기를 포함하고; 상기 플랭킹 아미노산 잔기는 자연 발생 시스테인을 포함함). 본 발명에 따라 요구되는 위치에 시스테인을 자연적으로 포함하는 T 세포 에피토프는 시스테인 잔기가 MHC-결합 아미노산에 인접한, 즉 그의 바로 N- 또는 C-말단에 있고 자연적으로 그와 근접한 최대 6개의 아미노산 내의 인접한 천연 서열에서 발생하는 경우에 본 발명에서 제외된다. 플랭킹 아미노산 잔기가 모노- 또는 디시스테인 산화환원 모티프를 (자연적으로, 비-자연적으로, 또는 본 발명에 의해 기술된 바와 같이 시스테인의 첨가/시스테인의 삽입/시스테인으로의 돌연변이 후에) 포함하는 MHC-결합 부위 외부에 플랭킹 아미노산 잔기를 포함하는 면역원성 펩티드가 본 발명에서 추가로 제외된다. 상기 설명된 바와 같이, 후자의 펩티드에서의 산화환원 모티프의 존재는 자연적으로 비-세포용해 CD4+ T-세포를 세포용해 CD4+ T-세포로, 즉 본 발명에서 원하지 않는 특성을 갖는 CD4+ T-세포로 전환시킨다. 상기에서 디시스테인 산화환원 모티프는 "CXXC"-모티프인 것으로 의도되는 반면, 모노시스테인 산화환원 모티프는 "CXX[S/T]" 또는 "[S/T]XXC" 모티프인 것으로 의도된다. 그의 MHC-결합 영역 내에 (대안적으로, MHC 분자에 대한 결합시에 MHC-클레프트에 매립된) 시스테인 아미노산을 포함하는 본 발명에 따른 면역원성 펩티드는 본 발명에서 제외되지 않는다.
본 발명에 따른 면역원성 펩티드에서, (ii)의 상기 시스테인 아미노산은 MHC-결합 영역으로부터 최대 5개의 아미노산만큼 떨어져 있는 (즉, 최대 5개의 아미노산이 상기 시스테인과 MHC-결합 영역의 말단 아미노산 사이에 있을 수 있음) 위치에서 T 세포 에피토프에 부가 또는 삽입될 수 있거나, 또는 (ii)의 상기 시스테인 아미노산은 MHC-결합 영역으로부터 최대 5개의 아미노산만큼 떨어져 있는 (즉, 최대 5개의 아미노산이 상기 시스테인과 MHC-결합 영역의 말단 아미노산 사이에 있을 수 있음) 위치에서 비-시스테인 아미노산의 시스테인 아미노산으로의 돌연변이로부터 발생할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드에서, (ii)의 상기 시스테인 아미노산은 T 세포 에피토프의 MHC-결합 영역으로부터 최대 5개 아미노산의 인공 링커 아미노산 서열만큼 떨어져 있을 수 있다 (즉, 최대 5개의 아미노산이 상기 시스테인과 MHC-결합 영역의 말단 아미노산 사이에 있을 수 있음). 펩티드 링커 이외에도, 다른 유기 화합물이 면역원성 펩티드의 일부를 서로 연결하는 링커로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 펩티드 중 어느 하나에서, 상기 시스테인 아미노산은 MHC 결합 영역에 대해 N- 또는 C-말단에 인접하여 위치할 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 펩티드 중 어느 하나에서, 상기 질환-연관 T 세포 에피토프는 감염원, 자기 항원, 알레르겐, 동종인자 또는 동종이식 항원의 T 세포 에피토프, 및 종양에 특이적이거나 또는 우선적인 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명의 임의의 면역원성 펩티드는 펩티드가 MHC 클래스 II 결정기 내에서의 프로세싱 및 제시를 위해 (후기) 엔도솜으로 흡수되는 것을 용이하게 하는 아미노산 서열 (또는 또 다른 유기 화합물)을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드는, 예를 들어 엔도솜 표적화 서열을 추가로 포함할 수 있다. 후기 엔도솜 표적은 단백질의 세포질 꼬리에 존재하는 신호에 의해 매개되고, 잘 확인된 펩티드 모티프, 예컨대 디류신-기재 [DE]XXXL[LI] 또는 DXXLL 모티프 (예를 들어 DXXXLL), 티로신 기재 YXXØ 모티프 또는 소위 산성 클러스터 모티프에 상응한다. 기호 Ø는 거대 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 예컨대 Phe, Tyr 및 Trp를 나타낸다. 후기 엔도솜 표적 서열은 MHC-클래스 II 분자에 의한 항원-유래 T 세포 에피토프의 프로세싱 및 효율적인 제시를 허용한다. 이러한 엔도솜 표적화 서열은 예를 들어 gp75 단백질 (문헌 [Vijayasaradhi et al. 1995, J Cell Biol 130, 807-820]), 인간 CD3 감마 단백질, HLA-BM
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(문헌 [Copier et al. 1996, J Immunol 157, 1017-1027]), DEC205 수용체의 세포질 꼬리 (문헌 [Mahnke et al. 2000, J Cell Biol 151, 673-683]) 내에 함유된다. 엔도솜으로의 분류 신호로서 기능하는 펩티드의 다른 예는 문헌 [Bonifacio and Traub (2003), Annu Rev Biochem 72, 395-447]의 종설에 개시되어 있다. 대안적으로, 서열은 병원체-연관 유래 T 세포 에피토프, 또는 자가- 또는 동종항원 유래 T 세포 에피토프를 향한 T 세포 반응을 극복하지 않고 후기 엔도솜에서 흡수를 용이하게 하는, 단백질로부터의 준-우세한 또는 소수의 T 세포 에피토프의 것일 수 있다.
상기 면역원성 펩티드 중 임의의 것은 화학적 합성에 의해 또는 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 면역원성 펩티드 및 추가로 용매, 희석제, 담체 또는 아주반트 중 하나 이상를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 백신접종 전략에 사용된 감염원으로부터 유래된 특정 항원을 향한 면역 반응을 증가시킴으로써 대상체에서 감염을 예방, 치료 또는 억제하기 위한 단리된 면역원성 펩티드의 용도에 관한 것이다. 특히, 면역 반응은 상기 대상체에서 CD4+ 헬퍼 T 세포 및/또는 항체 반응의 활성화이다. 상기에서, 상기 병원체-연관 항원은 바이러스, 박테리아 또는 기생충으로부터 유래될 수 있다. 특히, 본 발명은 이펙터 CD4+ T 세포 (또한, 헬퍼 CD4+ T 세포로 지칭됨)의 확장 및 기능적 활성을 증진, 증강 또는 증대시키는 방식을 제공한다. 이러한 이펙터 또는 헬퍼 CD4+ T 세포는 그의 표면 표현형, 시토카인 및 트랜스크립톰의 생산에 따라 정의된 세포의 여러 하위세트에 속한다. 따라서, Th1, Th2, Th17 및 Tfh 세포는 고유의 이펙터 하위세트의 대표로서 기술된다. 또한, Th9 세포는 최근에 설명되었다 (검토를 위해, 문헌 [Locksley et al. 2009, J Exp Med 206, 1643-1646] 참조). 특히, 본 발명은 특정 CD4+ T 헬퍼 세포를 확장시키는 방식을 제공한다. 결과는 보다 높은 항체 농도의 생성을 포함하는 병원체를 향한 보다 효율적인 반응이다.
본 발명은 또한 알레르겐 또는 자가항원에 대한 조절성 T 세포 반응을 증가시킴으로써 대상체에서 알레르겐 또는 자가항원에 대한 면역 반응을 억제하기 위한 단리된 면역원성 펩티드의 용도에 관한 것이다. 이는 또한 동종항원에 대해 특이적인 조절성 T 세포 반응을 증가시킴으로써 대상체에서 동종항원에 대한 면역 반응을 억제하기 위한 단리된 면역원성 펩티드의 용도에 관한 것이다. 상기에서, 상기 자가항원 또는 동종항원은 자가면역 질환, 예컨대 인슐린-의존성 당뇨병, 갑상선염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염과 연관된 자가항원을 포함하며, 클래스 I 또는 클래스 II의 주요 조직적합성 복합체 (MHC)로부터 유래된 동종항원, 소수의 조직적합성 항원 또는 조직 특이적 항원을 포함한다. 동종항원 (본원에서 동종인자와 동의어로 사용됨)에 대한 면역 반응의 경우에, 면역 반응은 동종인자의 생물학적 활성을 중화할 수 있다. 후자의 예는 예를 들어 혈우병 환자에서 외인성 인자 VIII에 대한 중화 항체의 발생을 포함한다. 본 발명은 대상체에서 자가면역 질환 또는 이식편 거부를 예방, 치료 또는 억제하는 방식, 또는 대상체에서 동종인자 (예컨대, 그를 필요로 하는 수용자가 투여된 인자 VIII를 중화시키는 면역 반응을 시작할 수 있는 혈액 응고 인자 VIII)를 중화하는 면역 반응을 예방, 치료 또는 억제하는 방식을 제공한다. 특히, 본 발명은 조절성 CD4+ T 세포의 확장 및 기능성 활성을 증대시키는 방식을 제공한다. 이러한 조절성 T 세포는 Foxp3 전사 리프레서의 발현에 의해 규정된 천연 조절성 T 세포 집단 또는 주로 억제성 시토카인, 예컨대 IL-10 및 TGF-베타의 생산에 의해 규정된 유도된 또는 획득된 조절성 T 세포의 하위세트 중 하나에 속한다 (검토를 위해, 문헌 [Yi et al. 2006, Cell Mol Immunol 3, 189-195] 참조). 특히, 본 발명은 특정의 CD4+ 조절성 T 세포를 확장시키는 방식을 제공한다. 결과는 자가항원에 대한 면역 반응의 보다 효율적인 억제 및 감소된 이식편 거부 비율이다.
본 발명은 또한 백신접종 전략에서 종양에 의해 떨어져나온 종양-특이적 항원을 향한 면역 반응을 증가시킴으로써 대상체에서 종양을 치료하기 위한 단리된 면역원성 펩티드의 용도에 관한 것이다. 특히, 면역 반응은 상기 대상체에서 이펙터 CD4+ T 세포 반응의 활성화이다. 상기에서, 상기 종양-유래 항원은 종양유전자 또는 원종양유전자, 바이러스-유래 단백질, 생존 인자 또는 클론형 결정기로부터 유래될 수 있다. 본 발명은 대상체에서 종양 또는 암 세포의 성장을 방지 또는 억제하거나, 또는 종양 또는 암을 치료하는 방식을 제공한다. 이는 또한 종양- 또는 암-유발 병원체 (예를 들어, 인간 유두종바이러스의 특정 균주)로의 감염을 예방하는 것을 목적으로 하는 백신접종을 포함한다. 특히, 본 발명은 증대된 또는 증가된 이펙터 CD4+ T 세포 활성화를 통해 CD8+ T 세포의 확장 및 기능적 활성을 증대시키는 방식을 제공한다. 특히, 본 발명은 특정 CD8+ T 세포를 확장시키는 방식을 제공한다. 결과는 CD8+ T 세포의 보다 높은 활성을 나타내는, 종양-유래 항원 또는 종양-유발 병원체로부터의 항원을 향한 보다 효율적인 반응이다.
상기 중 임의의 것에서, "치료"는 적어도 치료되는 질환 또는 장애의 안정화를 발생시키거나 또는 질환 또는 장애의 건강한 상태로의 부분적 또는 완전한 전환을 발생시키는 것으로 이해된다. 질환 또는 장애의 "억제"는 치료하지 않은 경우의 상기 질환 또는 장애의 평균 추가적 발생과 비교하였을 때 상기 질환 또는 장애의 추가적 발생을 지연시키는 것으로 이해된다. 본 발명의 면역원성 펩티드는 백신접종 접근법에 사용될 수 있으므로, 이러한 펩티드는 표적 질환 또는 장애를 아직 나타내지 않거나 이를 앓고 있지 않은 대상체에게 투여될 수 있으며, 상기 투여는 상기 표적 질환 또는 장애의 발생을 예방하는 것을 목적으로 한다. 이러한 예방적 또는 사전 면역화 또는 예방은 표적 질환 또는 장애의 발생을 완전하게 차단할 수 있거나, 또는 표적 질환 또는 장애가 예를 들어 악화되는 수준으로 진행되는 것을 예방할 수 있다. 예방적 백신접종 또는 면역화는 특히 예를 들어 병원체에 대한 증가된 노출 (이러한 위험이 있음)로 인한, 유전 또는 다른 소질로 인한, 선천성 결함으로 인한 등의 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에서 흥미롭다.
본 발명을 이용하여 증가되는 면역 반응이 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 질환의 예가 하기 기재된다. 본 발명에 사용하기 위해 T-세포 에피토프가 유래될 수 있는 항원이 또한 예시된다.
ㆍ 알레르기성 질환에 대한 백신접종
T-세포 에피토프의 선택에 사용될 수 있는 알레르겐은 전형적으로 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르겐이다:
- 땅콩 (Ara h1), 어류 (파라알부민), 예를 대구, 계란 흰자 (오브알부민), 갑각강, 예를 들어 새우 (트로포미오신), 우유 (베타 락토글로불린), 예를 들어 소의 우유, 밀 (글루텐), 곡류, 장미증 패밀리의 과일 (사과, 자두, 딸기), 백합과, 십자화과, 가지과 및 미나리과 패밀리의 채소, 각과류, 참깨, 땅콩, 대두 및 다른 콩과식물 패밀리 알레르겐, 향신료, 멜론, 아보카도, 망고, 무화과, 바나나 등에 존재하는 음식 알레르겐.
- 더마토파고이데스(Dermatophagoides) 종 또는 디. 프테로니시누스(D. pteronyssinus), 디. 파리나에(D. farinae) 및 디. 마이크로세라(D. microceras), 유로글리푸스 마이네이(Euroglyphus maynei) 또는 블로미아(Blomia) 종으로부터 수득한 집먼지 응애 알레르겐,
- 바퀴벌레 (Bla g2) 또는 막시류에 속하는 곤충으로부터의 알레르겐,
- 화분, 나무, 목초 및 잡초의 화분으로부터의 알레르겐,
- 동물, 특히 고양이 (Fel d1), 개, 말 및 설치류 (mus m1)로부터의 알레르겐,
- 진균, 특히 아스페르길루스(Aspergillus) (aspf1) 알테르나리아(Alternaria) (Alt A6) 또는 클라도스포리움(Cladosporium) (cla h3)으로부터의 알레르겐,
- 생성물, 예컨대 라텍스, 아밀라제 등에 존재하는 직업성 알레르겐.
ㆍ 세포내 및 세포외 병원체에 대한 백신접종
- 세포내 병원체는 세포내 라이프 사이클을 갖는 바이러스, 박테리아, 미코박테리아 또는 기생충으로부터 유래된 임의의 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바이러스 ssDNA, dsDNA 및 RNA 바이러스를 포함하고, 그의 예로는 헤르페스비리다에(Herpesviridae), 플라비비리다에(Flaviviridae) 및 피코나비리다에(Picornaviridae), 인플루엔자, 홍역 및 면역결핍 바이러스가 있다. 박테리아 및 미코박테리아는 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 인간 또는 동물에 대한 다른 미코박테리아 병원체, 예르시니오시스(Yersiniosis), 브루셀라(Brucella), 클라미디아에(Chlamydiae), 미코플라즈마(Mycoplasma), 리케트시아에(Rickettsiae), 살모넬라 및 시겔라에(Shigellae)를 포함한다. 기생충은 플라스모디움스(Plasmodiums), 레이슈마니아스(Leishmanias), 트리파노소마스(Trypanosomas), 톡소플라즈마 곤디이(Toxoplasma gondii), 리스테리아(Listeria), 히스토플라스마(Histoplasma) 등을 포함한다.
- 세포외 병원체는 주로 세포외 생활 주기를 갖는 바이러스, 박테리아 및 기생충으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 본 발명에서 사용할 항원은 이들로부터 유래될 수 있다.
ㆍ 종양에 대한 백신접종
본 발명의 생성물에 의해 표적화될 수 있는 종양의 예시 및 본 발명에 사용될 수 있는 예시 연관 항원은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
- 종양유전자, 예컨대 일부 흑색종에서 확인된 MAGE;
- 원종양유전자, 예컨대 연부 조직 암종, 예컨대 신장 또는 부갑상선의 것 상에서 뿐만 아니라 다발성 골수종에서 발현되는 시클린 D1;
- 바이러스-유래 단백질, 예컨대 일부 암종 및 일부 호지킨-유형 림프종에서 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스로부터 유래된 것;
- 생존 인자, 항-아폽토시스성 인자임, 예컨대 수르비빈 또는 bcl2;
- 클론형 결정기, 예컨대 여포성 림프종 또는 다발성 골수종에서 B 세포 수용체로부터 유래된 이디오타입 결정기 또는 T 세포 악성종양에서 T 세포 수용체 결정기.
본 발명을 이용한 조절성 T 세포의 도출에 의한 내성의 증가가 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 질환의 예가 이하에 기재된다. 본 발명에 사용하기 위한 T-세포 에피토프가 유래될 수 있는 항원이 또한 예시된다.
ㆍ 상기 기재된 바와 같은 알레르기성 질환
ㆍ 자가-면역 질환
자가면역 질환은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 기관-특이적 질환, 예컨대 애디슨병, 용혈성 또는 악성 빈혈, 굿패스쳐 증후군, 그레이브스병, 특발성 혈소판감소성 자반증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 당뇨병, 포도막염, 크론병, 궤양성 결장염, 천포창, 아토피성 피부염, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 간경변증, 자가면역 폐장염, 자가-면역 심장염, 중증 근무력증, 사구체신염 및 자연 불임);
(b) 전신 질환, 예컨대 홍반성 루푸스, 건선, 혈관염, 다발근염, 경피증, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 류마티스 관절염 및 쇼그렌 증후군). 따라서, 자가면역 장애는 자신의 세포 또는 조직에 대해 지시되고, "자가-항원" (특정 포유동물 유기체의 자신의 구성성분 부분인 (예를 들어, 단백질의) 항원을 의미함)에 대한 반응을 포함한다. 이러한 메카니즘에서, 자가-항원은 B- 및/또는 T-세포에 의해 인식되고, 이는 상기 자가-항원에 대한 면역 반응을 설치할 것이다.
따라서, 용어 "자가-면역 질환" 또는 "자가-면역 장애"에 포괄되는 질환의 비제한적 목록은 급성 파종 뇌척수염 (ADEM), 애디슨병, 원형 탈모증, 항인지질 항체 증후군 (APS), 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 수포성 유천포창, 베체트병, 복강 질환, 염증성 장 질환 (IBD) (예컨대, 크론병 및 궤양성 결장염), 피부근염, 제1형 당뇨병, 굿패스쳐 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군 (GBS), 하시모토병, 특발성 혈소판감소성 자반증, 홍반성 루푸스, 혼합 결합 조직 질환, 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증, 기면증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 건선, 건선성 관절염, 다발근염, 원발성 담즙성 간경변증, 류마티스 관절염 (RA), 쇼그렌 증후군, 측두 동맥염, 혈관염, 베게너 육아종증 및 아토피성 피부염을 포함한다.
<표>
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ㆍ 이식
본 발명에 사용하기 위한 동종항원은 다음으로부터 유래된 군으로부터 선택된다:
- 클래스 I 또는 클래스 II의 주요 조직적합성 복합체
- 부수적 조직적합성 복합체
- 조직-특이적 항원
ㆍ 동종인자에 대한 면역 반응
본 발명에 사용하기 위한 동종인자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
- 인자 VIII, 인자 IX 및 스타필로키나제를 포함하는, 응고 결함 또는 섬유소용해 결함을 위한 대체 요법
- 호르몬, 예컨대 성장 호르몬 또는 인슐린,
- 시토카인 및 성장 인자, 예컨대 인터페론-알파, 인터페론-감마, GM-CSF 및 G-CSF,
- 면역 반응의 조절을 위한 항체, 예를 들어 알레르기성 질환에서 항-IgE 항체, 이식편 거부 및 다양한 자가면역 질환에서 항-CD3 및 항-CD4 항체, 비-호지킨 림프종에서 항-CD20 항체, 신기능부전에서 에리트로포이에틴.
상기 본원에 기재된 임의의 용도 및 방법에서, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드는 상기 면역원성 펩티드로 프라이밍된 CD4+ 이펙터 T-세포에 의해 대체될 수 있거나, 또는 면역원성 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 면역원성 펩티드 대신 개체에게 투여할 네이키드 DNA 또는 바이러스 벡터의 형태)에 의해 대체될 수 있다. 또한, 다중, 즉 1종 초과 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 초과)의 면역원성 펩티드의 조합이 상기 중 임의의 것에서 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 면역원성 펩티드를 발현할 수 있다는 특징을 갖는 단리된 바이러스 벡터를 추가로 포괄한다.
상기 본원에 기재된 임의의 용도에서, 상기 수용자는 포유동물, 특히 (비-인간) 영장류 또는 인간이다.
본 발명에 따른 면역원성 펩티드는 관심 항원의 T 세포 에피토프(들)로부터 출발하여 생성될 수 있다. 특히, 사용되는 T-세포 에피토프는 우세한 T-세포 에피토프일 수 있다. 본 발명의 내용에서 사용하기 위한 관심 항원으로부터의 T-세포 에피토프의 확인 및 선택은 당업자의 지식 범위 내에 있다. 예를 들어, 관심 항원으로부터 단리된 펩티드 서열은, 예를 들어 T 세포 생물학 기술에 의해 시험하여, 펩티드 서열이 T 세포 반응을 도출하는지 여부를 결정할 수 있다. T 세포 반응을 도출하는 것으로 밝혀진 펩티드 서열이 T 세포 자극 활성을 갖는 것으로 정의된다. 인간 T 세포 자극 활성은 추가로 관심 항원으로부터 유래된 펩티드/에피토프로 관심 항원에 대해 감작화된 개체로부터 수득한 T 세포를 배양한 후에 T 세포의 증식이 예를 들어 삼중수소화 티미딘의 세포 흡수에 의해 측정시에 펩티드/에피토프에 반응하여 발생하는지 여부를 결정함으로써 시험할 수 있다. T 세포의 펩티드/에피토프에 대한 반응에 관한 자극 지수는 펩티드/에피토프에 대한 반응의 최대 CPM을 대조군 CPM으로 나누어 계산할 수 있다. 배경 수준과 동일하거나, 배경 수준의 2배보다 더 큰 T 세포 자극 지수 (S.I.)는 "양성"인 것으로 간주된다. 양성 결과를 사용하여 시험된 펩티드/에피토프 군에 대한 각각의 펩티드/에피토프의 평균 자극 지수를 계산한다. 비-천연 (또는 변형된) T-세포 에피토프는 임의로 MHC 클래스 II 분자에 대한 그의 결합 친화도에 대해 추가로 시험될 수 있다. 비-천연 (또는 변형된) T-세포 에피토프의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 가용성 HLA 클래스 II 분자는 주어진 클래스 II 분자에 동질접합성인 세포의 용해에 의해 수득된다. 후자는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 가용성 클래스 II 분자는 그 클래스 II 분자에 대한 그의 강한 결합 친화도에 따라 생산된 비오틴-표지된 참조 펩티드와 인큐베이션한다. 이어서, 클래스 II 결합에 대해 평가된 펩티드를 다양한 농도에서 인큐베이션하고, 그의 클래스 II 결합으로부터 참조 펩티드를 제거하는 그의 능력을 뉴트라비딘을 첨가하여 계산한다. 방법은 예를 들어 문헌 [Texier et al. 2000, J Immunol 164, 3177-3184]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명의 면역원성 펩티드는 2.0 이상의 평균 T 세포 자극 지수를 갖는다. 2.0 이상의 T 세포 자극 지수를 갖는 면역원성 펩티드는 예방제 또는 치료제로서 유용한 것으로 간주된다. 본 발명에 따른 면역원성 펩티드는 2.5 이상, 3.5 이상, 4.0 이상, 또는 심지어 5.0 이상의 평균 T 세포 자극 지수를 가질 수 있다. 또한, 이러한 펩티드는 전형적으로 약 100 이상, 150 이상, 약 200 이상 또는 약 250 이상의 확신 지수 (P.I.)를 갖는다. 펩티드에 대한 확신 지수는 펩티드에 반응하는 T 세포를 갖는 관심 항원에 대해 감수성인 개체의 집단 (예를 들어, 9명 이상의 개체, 16명 이상의 개체 또는 29 또는 30명 이상, 또는 심지어는 그 초과의 개체)에서, 평균 T 세포 자극 지수를 개체의 퍼센트로 곱하여 측정된다 (이에 따라, 펩티드/에피토프의 여러 특성에 의해 증대된 SI에 상응함). 따라서, 확신 지수는 관심 항원에 대해 감수성인 개체의 집단에서 펩티드에 대한 T 세포 반응의 강도 (S.I.) 및 펩티드에 대한 T 세포 반응의 빈도 둘 다를 나타낸다. 예를 들어, 우수한 지도화 기술에 의해 최적의 T 세포 에피토프를 결정하기 위해, T 세포 자극 활성을 가지며 이에 따라 T 세포 생물학 기술에 의해 확인된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드를 펩티드의 N- 또는 C-말단에서 아미노산 잔기를 부가하거나 결실시킴으로써 변형시키고, 변형된 펩티드에 대한 T 세포 반응성의 변화를 결정하기 위해 시험한다. T 세포 생물학 기술에 의해 결정시에 천연 단백질 서열 중에서 중첩 영역을 공유하는 2개 이상의 펩티드가 인간 T 세포 자극 활성을 가지는 것으로 밝혀진 경우에, 이러한 펩티드 모두 또는 그의 일부를 포함하는 추가의 펩티드를 생산할 수 있고, 이러한 추가의 펩티드를 유사한 절차에 의해 시험할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 펩티드를 선택하고, 재조합적으로 또는 합성적으로 생산한다. T 세포 에피토프 또는 펩티드는 펩티드/에피토프에 대한 T 세포 반응의 강도 (예를 들어, 자극 지수) 및 개체의 집단에서 펩티드에 대한 T 세포 반응의 빈도를 비롯한, 다양한 인자에 기초하여 선택된다.
항원의 확인을 위해 사용되는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 위치 클로닝 또는 발현 클로닝 전략을 이용하여 후보 항원을 확인할 수 있다. 방법론의 자세한 설명은 예를 들어 문헌 [Mendoza et al. 1997, Immunity 7, 461-472]을 참조한다. 대안적으로, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에서 APC에 의해 실제로 제시되는 펩티드를 다양한 크로마토그래피 방법에 의해 용리 및 분리할 수 있다. 이러한 방법론의 자세한 설명은 문헌 [Scott et al. 2000, Immunity 12, 711-720]에서 찾아볼 수 있다. 하나 이상의 시험관내 알고리즘에 의해 후보 항원을 스크리닝함으로써 항원성 단백질 내의 T 세포 에피토프 서열을 확인할 수 있다. 적합한 알고리즘은 다음 웹사이트 상에서 발견되는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
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이러한 알고리즘의 보다 상세한 내용은 예를 들어 문헌 [Zhang et al. (2005) Nucleic Acids Res 15 33, W180-W183 (PREDBALB); Salomon & Flower (2006) BMC Bioinformatics 7, 501 (MHCBN); Schuler et al. (2007) Methods Mo/ Biol. 409, 75-93 (SYFPEITHI); Donnes & Kohlbacher (2006) Nucleic Acids Res. 34, W194-W197 (SVMHC); Kolaskar & Tongaonkar (1990) FEBS Lett. 276, 172-174 및 Guan et al. (2003) Appl Bioinformatics 2, 63-66 (MHCPred)]에 기재되어 있다.
보다 특히, 이러한 알고리즘은 항원성 단백질 내에서 MHC II 분자의 그루브에 맞는 하나 이상의 나노펩티드 서열의 예측을 허용한다.
본 발명의 면역원성 펩티드는, 예컨대 박테리아 세포 (예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)), 효모 세포 (예컨대, 피키아(Pichia) 종, 한세눌라(Hansenula) 종, 사카로미세스(Saccharomyces) 또는 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 종), 곤충 세포 (예컨대, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)로부터의 것), 식물 세포 또는 포유동물 세포 (예컨대, CHO, COS 세포)에서의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 한편, 그에 따라 요구되는 적합한 발현 벡터의 구축 (추가 정보, 예컨대 프로모터 및 종결 서열 포함)은 표준 재조합 DNA 기법을 포함한다. 재조합적으로 제조된 본 발명의 면역원성 펩티드는, 예컨대 면역원성 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 인접하여 삽입된 효소 절단 부위의 효소적 절단에 이어, 적합한 정제를 통해 보다 큰 전구체 단백질로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 면역원성 펩티드의 길이가 제한되어 있다는 점을 고려하여, 상기 펩티드는 화학적 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 펩티드는 상이한 아미노산의 서로에 대한 커플링에 의해 제조된다. 화학적 합성은 특히, 예컨대 D-아미노산, 비-자연 발생 측쇄를 가진 아미노산, 또는 변형된 측쇄를 가진 천연 아미노산, 예컨대 메틸화된 시스테인을 포함하는 경우에 적합하다. 화학적 펩티드 합성 방법은 잘 기재되어 있고, 펩티드는 회사, 예컨대 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 및 다른 회사로부터 주문할 수 있다. 펩티드 합성은 고체상 펩티드 합성 (SPPS) 또는 다르게는, 용액상 펩티드 합성으로서 수행될 수 있다. 가장 잘 알려진 SPPS 방법은 t-Boc 및 Fmoc 고체상 화학법으로서, 이는 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 추가로, 본래 켄트(Kent)에 의해 기재되고 (문헌 [Schnolzer & Kent 1992, Int J Pept Prot Res 40, 180-193]), 예를 들어 문헌 [Tam et al. 2001, Biopolymers 60, 194-205]에서 검토된 바와 같이, 펩티드는 라이게이션 전략 (2개의 비보호 펩티드 단편의 화학선택적 커플링)을 사용하여 서로 연결됨으로써 보다 긴 펩티드를 형성할 수 있다. 이는 SPPS 범위를 능가하는, 단백질 합성을 달성할 수 있는 방대한 잠재력을 제공한다. 100-300개 잔기의 크기를 갖는 다수의 단백질을 상기 방법에 의해 성공적으로 합성하였다. SPPS에서의 상당한 진전으로 인하여, 합성 펩티드는 지속적으로 생화학, 약리학, 신경생리학, 효소학 및 분자생물학 연구 분야에서 계속적으로 증가하는 중요한 역할을 수행해오고 있다.
관심 면역원성 펩티드의 물리적 및 화학적 특성 (예를 들어, 용해도, 안정성)을 조사하여 펩티드가 치료 조성물에서 사용하기에 적합한지/적합할 수 있는지 여부를 확인한다. 전형적으로, 펩티드의 서열을 조절함으로써 이를 최적화시킨다. 임의로, 합성 후에 당업계에 공지된 기법을 사용하여 펩티드를 변형시킬 수 있다 (화학적 변형, 예컨대 관능기 부가/결실).
본 발명은 생체내 또는 시험관내 (생체외)에서 항원-특이적 이펙터 CD4+ T 세포, 또는 항원-특이적 조절성 T 세포 (트레그(Treg) 또는 CD4+ 조절성 T-세포)를 생성하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 보다 높은 수의 CD4+ 이펙터 T 세포 또는 CD4+ 조절성 T 세포가 생산되고, 관심 항원에 특이적인 상기 세포가 생성될 수 있다는 이점을 갖는다.
이러한 방법은 증가된 증식성 특성을 갖는 CD4+ 이펙터 세포의 집단을 수득하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
ㆍ 말초 혈액 세포를 제공하는 단계;
ㆍ 이들 세포를 T 세포 항원이 감염원으로부터 유래된 본 발명에 따른 면역원성 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
ㆍ 이들 세포를 IL-2의 존재 하에 확장시키는 단계.
이러한 방법은 증가된 증식성 특성을 갖는 CD4+ 이펙터 세포의 집단을 수득하는 것을 목적으로 하는 방법을 추가로 포함하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
ㆍ 본 발명에 따른 면역원성 펩티드를 제공하는 단계;
ㆍ T 세포 에피토프가 감염원으로부터 유래된 면역원성 펩티드를 대상체에게 투여하는 단계; 및
ㆍ 증가된 증식성 특성을 갖는 CD4+ 이펙터 세포의 집단을 수득하는 단계.
이러한 방법은 증가된 억제 특성을 갖는 CD4+ 조절성 세포의 집단을 수득하는 방법을 추가로 포함하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
ㆍ 말초 혈액 세포를 제공하는 단계;
ㆍ 이들 세포를 T 세포 에피토프가 자가항원 또는 동종항원으로부터 유래된 본 발명에 따른 면역원성 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
ㆍ 이들 세포를 IL-2의 존재 하에 확장시키는 단계.
이러한 방법은 증가된 억제 특성을 갖는 CD4+ 조절성 세포의 집단을 수득하는 것을 목적으로 하는 방법을 추가로 포함하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
ㆍ T 세포 에피토프가 자가항원 또는 동종항원으로부터 유래된 본 발명에 따른 면역원성 펩티드를 제공하는 단계;
ㆍ 면역원성 펩티드를 대상체에게 투여하는 단계; 및
ㆍ 증가된 억제 특성을 갖는 CD4+ 조절성 세포의 집단을 수득하는 단계.
이러한 방법은 증가된 증식성 특성을 갖는 이펙터 CD4+ T 세포의 집단을 수득하는 방법을 추가로 포함하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
ㆍ 말초 혈액 세포를 제공하는 단계;
ㆍ 이들 세포를 T 세포 에피토프가 종양-유래 항원으로부터 유래된 본 발명에 따른 면역원성 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
ㆍ 이들 세포를 IL-2의 존재 하에 확장시키는 단계.
이러한 방법은 증가된 증식성 특성을 갖는 이펙터 CD4+ T 세포의 집단을 수득하는 것을 목적으로 하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
ㆍ T 세포 에피토프가 종양-유래 항원으로부터 유래된 본 발명에 따른 면역원성 펩티드를 제공하는 단계;
ㆍ 면역원성 펩티드를 대상체에게 투여하는 단계; 및
ㆍ 증가된 증식성 특성을 갖는 이펙터 CD4+ T 세포의 집단을 수득하는 단계.
증가된 증식성 특성을 갖는 이펙터 CD4+ T 세포의 집단 및 상기 방법에 의해 수득가능한 증가된 억제 특성을 갖는 CD4+ 조절성 세포의 집단 뿐만 아니라 표적 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 그의 용도가 또한 본 발명의 일부이다.
임의의 상기-기재된 본 발명의 면역원성 펩티드의 용도를 위해, 상기 펩티드는 항원-특이적 이펙터 CD4+ T 세포 또는 항원-특이적 조절성 T 세포에 의해 대체될 수 있다. 동종이형 및 자가 세포의 사용이 둘 다 고려된다. 상기 항원-특이적 이펙터 CD4+ T 세포 또는 항원-특이적 조절성 T 세포를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 임의의 방법은 또한 입양 세포 요법으로 알려져 있다. 이러한 요법은 질환 또는 장애의 급성 에피소드를 치료하는 경우 및 이러한 질환 또는 장애의 재발을 치료하는 경우에 특히 관심이 있다. CD4+ 이펙터 T 세포는 감염성 질환, 예컨대 바이러스, 박테리아 또는 기생충 질환의 예방에 중요하며, 이에 따라 큰 잠재력이 있다. 그의 효능은 항원성 특이성에 의존한다. CD4+ 조절성 T 세포는 면역조절에 중요하며, 큰 치료 잠재력을 갖는다. 조절성 T 세포-기반 면역요법의 효능은 조절성 T 세포의 항원 특이성에 의존한다. 또한, 폴리클로날 확장된 조절성 T 세포와는 대조적으로 항원-특이적 조절성 T 세포의 사용은 요법에 요구되는 조절성 T 세포의 전체 수를 감소시킨다. CD4+ 이펙터 T 세포는 종양, 예컨대 종양유전자, 원종양유전자, 바이러스-유래 단백질, 생존 인자 또는 클론형 결정기를 발현하는 것의 치료에 중요하다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및 예컨대 재조합 발현 또는 유전자 요법에서의 상기 핵산 서열의 사용 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 핵산 서열은 본 발명의 면역원성 펩티드를 발현할 수 있다.
본 발명의 면역원성 펩티드는 실제로 임의의 적합한 유전자 요법 방법을 이용하여 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 면역원성 펩티드로의 면역화, 적합한 유전자 요법의 이용에 의한 면역화 및 입양 세포 전달을 조합할 수 있다. 조합의 경우에, 상기 면역화, 입양 세포 전달 및 유전자 요법은 임의의 가능한 조합으로 동시에 또는 순차적으로 이용될 수 있다.
유전자 요법에서, 면역원성 펩티드를 코딩하는 재조합 핵산 분자는 표적 세포로의 전달을 위해 네이키드 DNA로서, 또는 리포솜 또는 다른 지질 시스템 중에서 사용될 수 있다. 인간 유전자 요법에서 사용하기 위한 것으로 플라스미드 DNA를 세포 내로 직접적으로 전달하는 다른 방법이 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이는 단백질에 대한 플라스미드 DNA의 복합체를 형성함으로써 세포 상의 수용체에 DNA를 표적화하는 것을 포함한다. 그의 가장 간단한 형태로, 간단하게는 미세주사 공정을 거쳐 미세량의 DNA를 세포의 핵 내로 주사함으로써 유전자 전달을 수행할 수 있다. 일단 재조합 유전자가 세포 내로 도입되면, 상기 유전자는 세포의 정상적인 전사 및 번역 메카니즘에 의해 인식될 수 있고, 유전자 산물로 발현될 것이다. DNA를 더 많은 수의 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법들도 시도되어 왔다. 이러한 방법은 DNA를 인산칼슘으로 침전시키고, 음세포작용에 의해 세포 내로 흡수시키는 형질감염; 세포를 고전압 펄스에 노출시켜 구멍을 막에 도입하는 전기천공; 표적 세포와 융합하는 친지성 소포체 내로 DNA를 패킹하는 리포펙션/리포솜 융합; 및 소형 추진체에 결합된 DNA를 사용한 입자 충격을 포함한다. DNA를 세포 내로 도입시키는 또 다른 방법은 DNA를 화학적으로 변형된 단백질에 커플링시키는 것이다. 아데노바이러스 단백질은 엔도솜을 탈안정화시킬 수 있고, 세포 내로의 DNA 흡수를 증진시킬 수 있다. DNA 복합체를 함유하는 용액에 아데노바이러스를 혼합하거나, 또는 단백질 가교제를 사용하여 아데노바이러스에 공유 부착된 폴리리신에 DNA를 결합시키면, 실질적으로 재조합 유전자의 흡수 및 발현은 개선된다. 아데노-연관 바이러스 벡터는 또한 혈관 세포 내로 유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 경우에 "유전자 전달"이란 외래 핵산 분자를 세포 내로 도입시키는 과정을 의미하는 것으로, 이러한 과정이 수행됨으로써 보통은 상기 유전자에 의해 코딩되는 특정 산물이 발현될 수 있다. 상기 산물은 단백질, 폴리펩티드, 안티센스 DNA 또는 RNA, 또는 효소적으로 활성의 RNA를 포함할 수 있다. 유전자 전달은 배양 세포에서, 또는 포유동물 내로의 직접 투여에 의해 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드를 코딩하는 핵산 분자 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 핵산 분자 서열이 오직 특정 조직에서만 발현되도록 생성된다. 조직 특이적 유전자 발현을 달성하는 방법, 예컨대 특이적으로 하나 이상의 조직(들) 또는 기관(들)에서 펩티드의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에 본 발명의 면역원성 펩티드를 코딩하는 서열을 배치하는 것이 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 발명에 따른 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (예컨대, cDNA), 그의 상동체 또는 유도체를 표적화된 조직 또는 세포 집단으로 전달하기 위해 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, RNA 바이러스 또는 소 유두종 바이러스로부터 유래된 발현 벡터가 사용될 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 상기 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 구축할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조작된 세포가 유전자 요법에서 사용될 수 있다.
유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위한 바이러스 벡터는 재조합 핵산 기술에 의해 매우 쉽게 변형될 수 있다. 상기를 고려하여, 당업자는 본 발명에 따른 면역원성 펩티드 및 그의 용도에서 적용되는 바와 같이 바이러스 벡터 T-세포 에피토프에 대한 변형이 바이러스 벡터 그 자체에 직접 도입될 수 있다는 것을 추가로 쉽게 예상할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 바이러스 벡터 단백질 중 하나 이상에 존재하는 하나 이상의 T-세포 에피토프가 본 발명에 따른 면역원성 펩티드에 대해 기재된 바와 같이 시스테인 잔기를 도입함으로써 변형된다는 특징을 갖는 단리된 바이러스 벡터로서 정의된 변형된 바이러스 벡터를 추가로 포괄한다. 이에 대한 한 실시양태에서, 상기 바이러스 벡터는 추가로 상기 변형된 T-세포 에피토프가 MHC 클래스 II 결정기에 의해 제시될 수 있다는 특징을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단리된 바이러스 벡터는 추가로 T-세포 에피토프 변형을 보유하지 않는 동일한 바이러스 벡터와 비교하였을 때, 그의 세포 형질도입 특성이 현저하게 변경되지 않는 것을 특징으로 한다.
유전자 전달을 통해 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드가 확실하게 투여되는 경우 (즉, 투여되었을 때, 생체내에서 본 발명에 따른 펩티드가 명확하게 발현될 수 있도록 핵산이 투여되는 경우), 핵산의 적절한 투여량은 도입된 핵산의 결과로서 발현되는 펩티드의 발현량에 기초하여 결정될 수 있다.
본 발명의 의약은 반드시 그러한 것은 아니지만, 일반적으로는 활성 성분으로서 본 발명의 면역원성 펩티드, CD4+ 이펙터 T 세포(의 집단) 또는 상기 면역원성 펩티드에 특이적인 CD4+ 조절성 T 세포(의 집단) 또는 상기 면역원성 펩티드를 발현할 수 있는 유전자 치료 벡터 중 하나 이상을 포함하는 (제약) 제제이다. 활성 성분(들) 외에도, 이러한 제제는 (제약상 허용되는) 희석제, 용매, 담체 또는 아주반트 중 하나 이상을 포함할 것이다. 전형적으로, 제약상 허용되는 화합물 (예컨대, 희석제, 담체 또는 아주반트)은, 예컨대 약전 편람(Pharmacopeia handbook) (예를 들어, 미국, 유럽 또는 국제 약전)에서 찾아볼 수 있다. 본 발명의 의약 또는 제약 조성물은 보통 (예방 또는 치료) 유효량의 활성 성분(들)을 포함하며, 여기서 유효성은 예방 또는 치료하고자 하는 상태 또는 장애에 대해 상대적이다. 특히, 본 발명의 제약 조성물은 예방적 또는 치료적 적용을 위한 백신이다.
본 발명의 의약 또는 제약 조성물은 상기 의약 또는 조성물의 다중 투여를 포함하는 예방적 또는 치료적 요법의 일부로서 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되어야 할 필요가 있을 수 있다. 상기 다중 투여는 보통 순차적으로 이루어지고, 2회에 걸친 투여 사이의 시간 간격은 활성 성분의 성질 및 예방 또는 치료되는 상태의 특성에 따라 달라질 수 있고, 그에 적합하게 조정될 수 있다. 단일 투여에서 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 활성 성분의 양이 또한 달라질 수 있으며, 이는 인자, 예컨대 대상체의 신체 상태 (예컨대, 체중, 연령), 예방 또는 치료하고자 하는 증상의 상태, 및 진료의, 의사 또는 간호사의 경험에 의존할 것이다.
예를 들어, 용어 "희석제"는 생리학적 염수 용액을 의미한다. 용어 "아주반트"는 일반적으로 그 자체로 제공된 경우에 있다해도 직접적인 효과는 거의 나타내지 않으면서, 다른 작용제 (예컨대, 약물, 백신)의 효과를 변형시키는 (바람직하게, 증가시키는) 약리학적 또는 면역학적 작용제를 지칭한다. 아주반트의 일례로서, 수산화알루미늄 (명반)이 제공되며, 여기에 본 발명의 면역원성 펩티드가 흡착될 수 있다. 추가로, 다수의 다른 아주반트가 당업계에 공지되어 있으며, 단 이들이 MHC-클래스 II 제시 및 T 세포 활성화에서 펩티드 제시를 용이하게 하는 경우에 사용될 수 있다. 용어 "제약상 허용되는 담체"는, 예를 들어, 상기 조성물을 용해시키거나, 분산시키거나, 또는 확산시킴으로써 치료하고자 하는 장소에 활성 성분을 적용시키거나 보급하는 것을 용이하게 하기 위해, 및/또는 활성 성분의 효능은 손상시키지 않으면서 그의 보관, 수송 또는 취급을 용이하게 하기 위해, 활성 성분과 함께 제제화되는 임의의 재료 또는 물질을 의미한다. 이는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제 (예를 들어, 페놀, 소르브산, 클로로부탄올), 등장화제 (예컨대, 당 또는 염화나트륨) 등을 포함한다. 조성물의 활성 성분의 작용 지속시간을 제어하기 위해 추가의 성분이 포함될 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 고체 또는 액체, 또는 압축되어 액체를 형성하는 기체일 수 있고, 즉 본 발명의 조성물은 적합하게는 농축물, 에멀젼, 용액, 과립, 분진, 스프레이, 에어로졸, 현탁액, 연고, 크림, 정제, 펠릿 또는 분말로서 사용될 수 있다. 상기 제약 조성물 및 그의 제제에서 사용하기에 적합한 제약 담체는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 본 발명 내에서의 그의 선택에 있어 특별한 제한은 없다. 이들은 또한 첨가제, 예컨대 습윤제, 분산제, 점착제, 접착제, 유화제, 용매, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제 (예를 들어, 페놀, 소르브산, 클로로부탄올), 등장화제 (예컨대, 당 또는 염화나트륨) 등을 포함하며, 제약 수행에 부합하고, 즉 포유동물에 영구적인 손상을 발생시키지 않는 담체 및 첨가제이다. 본 발명의 제약 조성물은 임의의 공지된 방식으로, 예를 들어, 1단계 또는 다단계 방법으로 활성 성분을 선택된 담체 물질, 및 적절하게는, 다른 첨가제, 예컨대 계면활성제와 함께 균일하게 혼합, 코팅 및/또는 분쇄함으로써 제조될 수 있다. 이들은 또한 예를 들어, 일반적으로는 약 1 내지 10 μm의 직경을 갖는 마이크로구체 형태로 그를 수득하기 위한 관점에서, 즉 활성 성분의 제어 또는 지속 방출을 위한 마이크로캡슐의 제조를 위해 미분화에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 펩티드, 그의 상동체 또는 유도체 (및 그의 생리학상 허용되는 염 또는 제약 조성물, 이들 모두 "활성 성분"이라는 용어에 포함됨)는 예방 또는 치료하고자 하는 상태에 적절한, 및 투여되는 화합물, 여기서 면역원성 단백질에 적절한 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 가능한 경로는 국소, 전신, 경구 (고체 제형 또는 흡입용), 직장, 비강, 국부 (눈, 협측, 및 설하 포함), 질 및 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 진피내, 동맥내, 경막내 및 경막외 포함)를 포함한다. 바람직한 투여 경로는 예를 들어, 수용자의 상태에 따라, 또는 예방 또는 치료하고자 하는 상태에 따라 달라질 수 있다.
제제는 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 제약 업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 분리된 단위, 예컨대 각각 예정량의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 샤쉐 또는 정제; 분발 또는 과립; 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 또한, 활성 성분은 볼루스, 연약 또는 페이스트로 제공될 수 있다. 정제는 임의로 1종 이상의 부성분과 함께 압착 또는 성형하여 제조할 수 있다. 압착 정제는 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 표면 활성제 또는 분산제와 임의로 혼합된 분말 또는 과립과 같은 자유-유동 형태의 활성 성분을 적합한 기계에서 압착시켜 제조할 수 있다. 성형 정제는 비활성 액체 희석제로 습윤화시킨 분말화된 화합물의 혼합물을 적합한 기계로 성형함으로써 제조할 수 있다. 정제는 임의로 코팅되거나, 홈이 새겨질 수 있고, 그 안의 활성 성분의 지연 또는 제어 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.
이제 본 발명은 하기 실시예에 의해 설명될 것이며, 이들은 제한하고자 하는 어떠한 의도도 없이 제공된다. 또한, 본원에서 기재된 모든 참고문헌은 분명하게 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1
집먼지 응애-유래된 알레르겐 Der p2는 H-2b 또는 H-2d 제한 MHC 클래스 II 에피토프 또는 서열 EPCIIHRGKPF (서열 1; Der p2의 아미노산 잔기 25-35) (여기서 E는 제1 앵커링 잔기에 해당함)를 함유하는 14 kD 비-글리코실화 단백질이다. 서열 CHGS (서열 2; Der p2의 아미노산 잔기 21-24)의 아미노-말단 끝 플랭킹 잔기는 모노시스테인 글루타레독신 모티프를 포괄한다.
P(-4)에 위치한 시스테인 잔기가 아미노산 CHGSEPCIIHRGKPF (MHC 결합 부위를 플랭킹하는 아미노산 잔기는 밑줄표시됨)) (서열 3)를 포괄하는 펩티드와 로딩된 항원-제시 세포와의 동족 상호작용시에 특정 CD4+ 이펙터 T 세포의 증식성 반응을 증가시키는지 여부를 결정하기 위해, 플랭킹 서열의 4개 아미노산 잔기를 각각 알라닌으로 치환하였다.
나이브 BALB/c 마우스로부터 T 세포-고갈 미토마이신 C-처리된 비장세포를 항원-제시 세포로 사용하여, 다양한 돌연변이체 펩티드 (0.1μM)와 로딩하였다. 이어서, p21-35 (서열 3)-특이적 CD4+ T 세포 클론을 48시간 인큐베이션을 위해 배양물에 첨가하고, 그 후에 3H-티미딘을 첨가하고, 추가로 18시간 배양한 후에 그의 혼입을 측정하였다. 결과를 p21-35 야생형 서열 (서열 3)과의 비교에 의해 수득한 혼입의 백분율로서 도 1에 나타내었다. 이는 P(-4)의 시스테인의 알라닌에 의한 치환 (서열 4의 펩티드: AHGSEPCIIHRGKPF)이 특정 T 세포 클론의 증식성 반응을 70% 감소시켰다는 것을 보여준다. 데이터는 3개의 독립적 실험을 대표한다.
실시예 2
NPM-ALK 키메라 유전자는 강력한 종양유전자인 것으로 밝혀진 구성적으로 활성화된 티로신 키나제를 코딩한다. 이러한 융합 유전자는 뉴클레오포스민 (NPM), 및 역형성 림프종 키나제 (ALK)로 명명된 신규 수용체 티로신 키나제 유전자로 구성된다. NPM-ALK 융합 단백질에 대해 트랜스제닉으로 만들어진 마우스 종으로부터 유래된 림프종 세포주는 종양원성 특성을 나타낸다. 면역적격 수용자에 접종된 경우에, 이러한 세포는 공격성 종양을 발생시킨다. 이러한 종양 세포주의 표현형 평가는 이들이 클래스 II 주요 조직적합성 결정기를 발현하지 않지만, 클래스 I MHC 결정기에 대해 양성이라는 것을 보여준다.
C57BL/6 마우스에게 100 μl PBS 중에 현탁된 NPM-ALK 종양 세포 (2x106개 종양 세포 (R80 NPM-ALK 세포, H-2b-제한됨)를 피하 주사에 의해 접종하고, 마지막 펩티드 주사 10일 후에 옆구리에 피하로 주사하고, 종양의 성장을 캘리퍼로 평가하였다. 통상적으로, 이러한 마우스는 5-6일 내에 종양을 발생시키고, 이어서 3주 내에 ± 12 mm의 직경에 도달하도록 성장한다. C57BL/6 마우스를 50 μg의 서열 YCT QDPDVINTA (서열 5)의 펩티드에 의한 종양 세포의 접종 전에 4회 10일의 간격으로 면역화시키고; 펩티드를 명반 (알히드로겔) 담체 상에 부착시켰다. 이러한 MHC 클래스 II-제한 에피토프는 ALK 단백질의 인접한 부분이며, 진뱅크(GenBank) 등록 번호 Q9UM73 (버전 Q9UM73.2)에 주어진 바와 같이 ALK 단백질의 아미노산 1385-1396에 상응한다. 종양 세포를 마지막 면역화 10일 후에 접종하였다. 예비면역화된 마우스에서 종양이 성장하였으며, 이를 예비면역화시키지 않은 대조군와 비교하였다. 도 2에 제시된 결과는 종양 성장이 예비면역화된 마우스에서 매우 많이 감소하였음을 보여준다. 서열 YCTQDPDVINTA (서열 5)의 펩티드는 ALK-특이적 CD4+ T 세포의 활성화를 증가시키는 것으로 입증되었다. 군 사이의 차이는 만-휘트니 U 시험에 의해 평가시에 제20일에 매우 유의하였다 (p<0.008).
실시예 3. 미코박테리움 투베르쿨로시스
미코박테리움 투베르쿨로시스는 해마다 수천명의 사망에 대한 원인이 된다. 유일하게 이용가능한 백신접종인 칼메트-게랑(Calmette-Guerin) 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)-기반 백신 (BCG)은 효율적이지 않다. 또한, 여러 미코박테리움 균주는 종래의 화학요법에 대해 내성을 나타낸다. 항원-특이적 CD4+ 세포는 투베르쿨로시스에서 발생하는 것으로 알려졌으며 (문헌 [Winslow et al. (2003) J. Immunol.170: 2046-2052]), 이는 보호될 수 있다 (문헌 [Khader et al. (2007) Nature Immunol. 8:369-377]).
엠. 투베르쿨로시스는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 결정기 둘 다에 의해 제시되는 다수의 항원을 생산한다. 클래스 I 결정기에 의해 제시된 항원은 CD8+ T 림프구에 의해 인식되며, 이는 엠. 투베르쿨로시스로 감염된 세포의 제거를 목적으로 하는 세포용해 활성을 보유한다. 그러나, 만성 보균자 환자에서, 이러한 메카니즘은 감염된 세포를 제거하기에 충분히 효율적이지 않다.
CD8+ T 세포는 다른 림프구 하위세트, 특히 CD4+ 계통에 속하는 세포로부터의 도움을 필요로 한다. CD4+ T 세포의 활성화는 IL-2의 생산으로 이어지며, 이는 완전한 세포용해 잠재력을 획득하기 위해 CD8+ T 세포에 필요한 신호를 제공한다. 따라서, 특정 CD4+ T 세포가 활성화되는 치료 전략은 엠. 투베르쿨로시스 감염된 세포의 CD8+ T 세포-의존성 제거에 이익을 있을 것이다.
이러한 목적에 가장 우수한 후보 항원 중 하나는 항원 85b (Ag85b)로, 이는 세포내에서 엠. 투베르쿨로시스에 의해 생산되는 단백질이다. 아미노산 서열 266 내지 275에 해당하는 우세한 T 세포 에피토프가 맵핑되었다. 이러한 에피토프의 전체 서열은 YWGAQLNAM (서열 6)이다.
서열 6의 아미노 및 카르복시말단 끝 둘 다에서의 플랭킹 잔기를 조사하여 6개 아미노산의 길이 내에 시스테인이 없음을 확인하였다. 시스테인 잔기를 펩티드의 아미노 말단 끝에서 위치 P-4에 부가하였으며, 이는 서열: CSWE YWGAQLNAM (서열 7; 시스테인은 밑줄표시하였고, Ag85b 항원의 아미노산 163-275 앞에 있음)을 갖는 변형된 T-세포 에피토프를 생성하였다.
C57BL/6 마우스를 아주반트, 예컨대 명반과 함께 서열 7의 펩티드로 면역화시켰다. 50 μg의 펩티드를 2주 간격으로 3회 주사하였다. 마지막 면역화 2주 후에, 마우스를 희생시키고, CD4+ T 림프구를 밀도 구배 원심분리 및 항체-코팅된 자기 비드 상의 선택의 조합에 의해 비장으로부터 제조하였다. 이어서, CD4+ T 세포를 서열 7의 펩티드와 로딩된 항원-제시 세포를 사용하여 시험관내에서 활성화 및 확장시켰으며, 한계 희석에 의해 클로닝하였다.
대조 실험을 위해, C57BL/6 마우스를 서열 6의 펩티드로 면역화시켰다. CD4+ T 세포를 항체-코팅된 자기 비드로의 선택 단계의 조합을 이용하여 상기 기재된 바와 같이 비장으로부터 수득하였다.
특정 CD8+ T 세포의 공급원을 수득하기 위해, C57BL/6 마우스를 재조합 Ag85b로 면역화시키고, CD8+ T 세포를 항-CD8+ 항체와 로딩된 자기 비드를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 비장으로부터 제조하였다.
C57BL/6 마우스로부터 수득한 대식세포를 클래스 I 및 클래스 II MHC 결정기 둘 다에서 단백질의 흡수 및 제조를 위해 Ag85b와 60분 동안 37℃에서 및 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 이러한 대식세포를 크롬 방출 검정을 이용하여 대식세포의 CD8 T 세포-의존성 사멸의 평가를 위해 51Cr과 추가로 인큐베이션하였다.
CD4+ T 세포가 대식세포 용해를 위해 CD8+ T 세포를 활성화시키는 능력을 시험하기 위해, 하기 실험을 수행하였다. Ag85b 유래의 에피토프를 제시하는 51Cr 표지된 대식세포의 배양물에서, 서열 7의 펩티드를 주사한 마우스로부터 상기 기재된 바와 같이 수득한 CD4+ T 세포를 Ag85b로 면역화된 마우스로부터 수득한 CD8+ T 세포의 집단과 함께 첨가하였다. 대조 실험으로서, 서열 6의 펩티드로 면역화된 마우스로부터 수득한 CD4+ T 세포를 Ag85b로 면역화된 동물로부터 수득한 대식세포 및 CD8+과 인큐베이션하였다.
유의한 정도의 대식세포 용해 (51Cr 방출에 의해 측정됨)가 CD4+ T 세포를 서열 7의 펩티드로 면역화된 마우스로부터 수득한 경우에 얻어졌으나 서열 6의 펩티드 면역화에 의해 도출된 CD4+에서는 그렇지 않다는 것을 알 수 있었다.
따라서, 클래스 II-제한 T 세포 에피토프의 플랭킹 영역 내의 시스테인의 존재가 Ag85b 유래의 T 세포 에피토프를 제시하는 대식세포의 사멸을 실시하기에 충분하다고 결론내렸다. 이러한 사멸은 고도로 활성화된 CD8+ T 세포에 의해 수행된다.
실시예 4. 인플루엔자 바이러스
인플루엔자 바이러스는 임의의 다른 바이러스와 같이 편성 세포내 병원체이다. 그의 고도의 전염성 및 획득된 면역력을 한 해로부터 다른 해까지 비효율적으로 만드는 빠르게 돌연변이되는 능력과 관련된 원인으로 해마다 수백만명의 사람에게 영향을 미치는 것으로 널리 알려져 있다. 이 바이러스는 매우 유의한 이환률 및 사망률을 갖는다. 현재 백신접종 전력은 표면 단백질, 예컨대 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제를 사용하며, 이는 높은 역가의 특정 항체를 유도하지만 오히려 감염된 세포를 제거할 세포용해 T 세포를 도출하는데 비효율적이다.
헤마글루티닌 항원은 MHC-클래스 II 결정기와 관련하여 제시되어 이펙터 T 세포를 활성화시키는 다수의 T 세포 에피토프를 보유하며, 이는 특정 항체의 생산을 위한 도움을 제공한다. 클래스 I-제한 T 세포 에피토프를 또한 CD8+ T 세포의 도출로 생산하였다. 그러나, 감염된 세포 상의 CD8+ T 세포의 세포용해 활성은 감염이 신체 전반에 퍼지는 것을 막기에는 불충분하다. 세포독성 CD8+ T 세포의 활성의 증가시킬 수 있는 방법은 인플루엔자 감염의 방지 및 치유에 이익을 가질 것이다.
따라서, 펩티드 YSTVASSLV (서열 8; 예를 들어 진뱅크 등록 번호 AF408859_1의 헤마글루티닌 전구체 아미노산 서열의 아미노산 534-542)는 H1N9 인플루엔자 바이러스로부터의 클래스 II 제한 T 세포 에피토프를 포괄한다. 플랭킹 잔기의 서열 조사는 아미노- 또는 카르복시-말단 끝에서 최대 6개 아미노산의 플랭킹 영역 내에 시스테인 잔기가 위치하지 않는다는 것을 보여준다.
서열 CLAI YSTVASSLV LLV (서열 9; 시스테인은 밑줄표시되고, 예를 들어 진뱅크 등록 번호 AF408859_1의 헤마글루티닌 전구체 아미노산 서열의 아미노산 531-545 앞에 있음)를 갖는, 위치 P-4의 시스테인 잔기를 함유하는 합성 펩티드가 생산되었으며, 이는 또한 카르복시-말단 끝-플랭킹 영역의 3개 아미노산을 함유한다.
서열 9 및 서열 8의 펩티드를 특정 CD4+ T 세포의 집단을 수득하기 위해 실시예 3에 기재된 바와 동일한 프로토콜을 이용하여 C57BL/6 마우스를 면역화하는데 사용하였다.
C57BL/6 마우스의 군을 실시예 3에 기재된 바와 같이 특정 CD8+ T 세포의 공급원을 수득하기 위해 H1N9 인플루엔자 바이러스의 재조합 헤마글루티닌으로 면역화시켰다.
CD4+ T 세포를 서열 8 또는 서열 9의 펩티드로 면역화된 마우스의 각각의 군의 비장으로부터 제조하였다.
수지상 세포를 클래스 I 및 클래스 II 결정기 둘 다에서 에피토프의 제시를 위해 H1N9 인플루엔자 바이러스의 재조합 헤마글루티닌과 로딩하였다. 로딩된 수지상 세포의 배양물을 또한 수지상 세포 용해 (크롬 방출 검정)를 위한 마커로서 51Cr과 인큐베이션하였다.
이러한 수지상 세포를 헤마글루티닌으로 면역화된 마우스로부터 제조한 CD8+ T 세포와 함께 서열 9의 펩티드로 면역화된 마우스로부터의 CD4+ T 세포와 인큐베이션하면 헤마글루티닌-로딩된 수지상 세포의 유의한 용해가 유도되는 반면, 서열 8의 펩티드로의 면역화 후에 수득한 CD4+ T 세포를 사용하여 수행한 실험은 용해를 나타내지 않았다. 배양물에서 CD8+ T 세포를 빠뜨리는 것은 수지상 세포 세포용해를 완전하게 억제하였으며, 이는 용해가 활성화된 CD8+ T 세포에 의해 매개되었다는 것을 나타낸다.
따라서, 클래스 II 제한 T 세포 에피토프의 플랭킹 영역 내에 단일 시스테인 잔기를 도입하는 것은 CD8+ T 세포의 활성화를 증강시켜 표적 세포의 유의한 용해를 발생시키기에 충분하다.
실시예 5. 항-동종인자 항체
치료 단백질 (본 실시예에서 동종인자로 지칭됨)의 투여는 의학에서의 관례이다. 한 예는 A형 혈우병 환자에서 응고 경로의 인자 VIII의 투여이다. 불행히도, 다수의 경우에, 이러한 투여는 치료 단백질을 인식하여 그의 활성을 중화하는 항체의 도출을 발생시킨다. A형 혈우병에서, 인자 VIII의 주입에 의해 치료된 환자 중 약 30%가 인자 VIII의 응혈촉진 활성을 억제하는 항체를 발생시킨다. 따라서 바람직하지 않은 항-동종인자 항체를 특이적으로 제거할 수 있는 방법을 갖는 것이 유리하다.
BO2C11 항체는 C2 도메인에 대한 결합에 의해 인자 VIII의 기능을 억제함으로써 인지질에 대한 인자 VIII의 결합을 방지하는 인간 모노클로날 항체이다 (문헌 [Jacquemin et al. (1998) Blood 92: 496-506]). BO2CII의 중쇄의 가변부 (VH 영역)의 서열은 상보성 결정 영역 3 (CDR 3)과 중첩되는 클래스 II 제한 T 세포 에피토프를 함유한다. 이러한 에피토프를 인식하는 CD4+ T 세포를 도출함으로써 BO2C11에 대한 항체를 발생시키는 것은 순환 BO2C11과의 복합체 형성 및 B 세포 수용체 수준에서의 BO2C11 항체의 생산 억제 둘 다에 의해 BO2C11 항체를 제거하는 특정한 방법을 구성할 것이다.
서열 YCAVPDPDA (서열 10; 진뱅크 등록 번호 CAA11829의 아미노산 서열의 아미노산 114-122에 상응함)는 BO2C11 VH 영역의 CDR3 영역에 위치한 클래스 II 제한 T 세포 에피토프를 포괄한다. 이러한 에피토프의 아미노- 및 카르복시말단 끝 둘 다에서의 아미노산 서열을 조사하여 6개 아미노산 내에 시스테인이 없음을 확인하였다. 시스테인 잔기가 위치 P-4에 부가된 펩티드가 생산되었으며, 카르복시-말단 끝의 천연 플랭킹 서열의 3개 아미노산을 포함하는 CAVY YCAVPDPDA FDI (서열 11; 시스테인은 밑줄표시되고, 진뱅크 등록 번호 CAA11829의 아미노산 서열의 아미노산 111-125 앞에 있음)이 제공되었다.
B 세포 수용체로서 BO2C11 분자를 발현하는 마우스 종이 생성되었다. 이러한 마우스를 명반 상에 부착된 서열 11의 펩티드로 10일 간격의 4회 경우에 50 μg을 사용하여 면역화시켰다. 이어서, 마우스를 채혈하고, 직접 결합 ELISA에 의한 평가로서 서열 10의 펩티드 및 BO2C11 항체를 인식하는 항체의 존재에 대해 시험하였다. 고농도의 서열 10의 펩티드 또는 BO2C11 항체에 대한 항체가 검출되었다.
또한, 순환, 비장 및 골수 B 세포 상의 BO2C11 BCR의 존재를 항-인간 Fc-감마 항체를 사용하여 FACS에 의해 평가하였다. 서열 11의 펩티드로 면역화된 마우스가 순환계, 비장 또는 골수에서 트랜스제닉 BCR을 발현하는 B 세포를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다.
항체의 VH 영역으로부터 유래된 클래스 II 제한 T 세포 에피토프를 포괄하며 플랭킹 잔기 내에 시스테인을 함유하는 펩티드의 투여가 표적 항체 및 이러한 항체를 생산하는 B 세포의 제거를 발생시킨다고 결론내렸다.
실시예 6. 항-T 세포 수용체 항체
병원성 CD4+ T 세포는 알레르기성 및 자가면역 질환을 비롯한 다수의 병리상태에 핵심적인 요소인 것으로 간주된다. 이러한 세포는 B 세포를 도와 항체를 생산하는 시토카인을 생산하고, 완전한 활성화 및 이펙터 기능의 획득을 위해 CD8+ T 세포에 도움을 제공한다. 따라서 병원성 CD4+ T 세포를 특이적으로 제거하는 것이 실현가능한 방법이 매우 바람직할 것이다.
CD4+ T 세포의 알파-베타 T 세포 수용체 (TCR)는 중쇄 및 경쇄 내에 가변부를 함유한다. 이러한 가변부는 클래스 II 제한 T 세포 에피토프를 포괄하며, 이는 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있다.
클론 G121은 더마토파구스 프테로니시누스(Dermatophagus pteronyssinus)의 알레르겐 Der p2에 대해 생성된 CD4+ T 세포이다. TCR의 VH 영역은 G121 TCR VH 영역의 아미노산 106 내지 114에 상응하는 서열: VYFCASSER (서열 12)의 클래스 II 제한 T 세포 에피토프를 함유한다. 이 서열은 VH의 CDR 3 영역에 속하는 카르복시말단 끝에서의 5개 아미노산을 함유한다.
플랭킹 잔기의 서열을 조사하여 에피토프의 아미노- 또는 카르복시말단 끝 상의 6개 아미노산 서열 내에 시스테인이 없음을 확인하였다. 시스테인 잔기가 위치 P-4에 부가된 펩티드가 생산되었으며, 카르복시-말단 끝의 천연 플랭킹 서열의 3개 아미노산을 포함하는 서열 CQTA VYFCASSER TGG (서열 13, 밑줄표시된 시스테인)이 제공되었다.
BALB/c 마우스를 항체-유래 T 세포 에피토프에 대해 실시예 5에 기재된 바와 같은 서열 13의 펩티드로 면역화시켰다. G121 CD4+ T 세포 클론을 CFSE로 표지하고, 꼬리 정맥에 마우스당 200,000개 세포를 주사함으로써 면역화된 마우스에 투여하였다. 세포 투여 1일 후에, 마우스를 사망시키고, CFSE-표지된 G121 클론의 존재를 말초 혈액 및 비장에서 FACS 분석에 의해 검출하였다. 서열 13의 펩티드로 면역화된 마우스는 말초 혈액 또는 비장에 잔류 G121 세포를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 비-면역화된 마우스를 사용하여 수행한 대조 실험은 비장에서 CFSE-표지된 G121 세포를 나타내었다. 추가로, 면역화된 마우스의 혈청은 G121 세포를 우선 서열 13의 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청의 희석액과 인큐베이션하고, 세척하고, FITC-표지된 항-마우스 Fc감마 항체와 추가로 인큐베이션하는 Facs 분석에 의해 확인된 바와 같이 G121 TCR에 대한 항체를 함유한다.
TCR의 가변 영역에 위치한 클래스 II 제한 T 세포 에피토프를 포괄하는 펩티드로 면역화시키는 것이 상응하는 에피토프를 보유하는 세포, 즉 G121 클론을 제거하기에 충분한 항체 반응을 도출하는 것으로 결론내렸다.
실시예 7. ALK + 종양
실시예 2에 보고된 실험은 플랭킹 잔기에 단일 시스테인을 함유하는 ALK의 클래스 II-제한 에피토프를 포괄하는 펩티드로 마우스를 직접 면역화시키는 것이 종양 성장의 유의한 지연 및 종양 크기의 감소를 발생시킨다는 것을 나타낸다. 서열 5의 펩티드는 클래스 II-제한 CD4+ T 세포 상에서 증가된 활성화 특성을 도출하였다. 이러한 예비면역화의 생체내 효과는 종양 세포에 대한 세포용해 특성을 갖는 CD8+ T 세포의 도출에 기인하였다. CD8+ T 세포가 완전한 이펙터 특성을 획득하기 위해 CD4+ T 세포에 의해 제공되는 도움을 필요로 한다는 것이 널리 알려져 있다.
증가된 특정 CD4+ T 세포 활성화가 플랭킹 잔기에 단일 시스테인을 함유하는 에피토프 (서열 5의 펩티드에 의해 예시된 바와 같음)로의 면역화로부터 발생한 주요 효과인지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 나이브 CD4+ T 세포를 ALK의 클래스 II-제한 에피토프에 대한 노출에 의해 강력한 이펙터 세포로 전환시키는 시험관내 실험을 세웠다.
따라서, 나이브 CD4+ T 세포를 자기 비드 분류를 이용하여 C57BL/6 마우스의 비장으로부터 단리하였다. 세포를 그의 천연 또는 야생형 (도면에서 wt) 서열에서 ALK 단백질의 아미노산 1541-1555에 해당하는 서열 GAA EGG WTGPGAGPR (서열 14)의 펩티드 또는 단일 시스테인을 ALK 단백질의 위치 1544에 부가한 서열 CGG WTGPGAGPR (서열 15)의 펩티드와 로딩된 동계 수지상 세포와 인큐베이션하였다.
20 μg의 펩티드를 사용한 4 사이클의 자극 후에, 세포를 세척하고, 항원-제시 세포로서 사용된 T-세포 고갈 비장세포에 대해 5/1 비로 첨가하고, 1 μM 또는 10 μM의 서열 14의 펩티드와 로딩하였다.
도 3은 삼중수소화 티미딘의 혼입에 의해 평가시에 CD4+ T 세포의 증식 속도가 단일 시스테인을 함유하는 펩티드 (서열 15)를 사용하여 CD4+ T 세포를 자극한 경우에 유의하게 증가하였다는 것을 나타낸다.
하기 서열이 본원에 개시되어 있으며, 서열 목록에 포함된다:
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> Katholieke Universiteit Leuven - K.U.Leuven R&D Life Sciences Research Partners vzw <120> MODIFIED EPITOPES FOR BOOSTING CD4+ T-CELL RESPONSES <130> IMC1704KR <150> US61/592,404 <151> 2012-01-30 <150> GB1201511.1 <151> 2012-01-30 <160> 15 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 1 Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 2 Cys His Gly Ser 1 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <400> 3 Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide; Der p2 amino acids 21-35 with mutation c21A <400> 4 Ala His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe 1 5 10 15 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide; ALK-epitope <400> 5 Tyr Cys Thr Gln Asp Pro Asp Val Ile Asn Thr Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide; Mycobacterium tuberculosis Ag85b, amino acids 266-275 <400> 6 Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met 1 5 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide; Mycobacterium tuberculosis Ag85b, amino adics 263-275 preceded by cysteine <400> 7 Cys Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide; influenza virus H1N9, amino acids 534-542 of hemagglutinin precursor <400> 8 Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val 1 5 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide; influenza virus H1N9, amino acids 534-542 of hemagglutinin precursor preceded by cysteine <400> 9 Cys Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val 1 5 10 15 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide; amino adics 114-122 of vh (CDR3) of human anti-factor VIII antibody BO2C11 <400> 10 Tyr Cys Ala Val Pro Asp Pro Asp Ala 1 5 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide; amino adics 111-125 of VH of human anti-factor VIII antibody BO2C11 preceded by cyteine <400> 11 Cys Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Pro Asp Pro Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 15 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide; amino adics 106-114 of VH (CDR3) of anti-Der p2 CD4+ T-cell clone G121 <400> 12 Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Glu Arg 1 5 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide; amino adics 103-117 of VH of anti-Der p2 CD4+ T-cell clone G121 preceded by cysteine <400> 13 Cys Gln Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Glu Arg Thr Gly Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide; amino acids 1541-1555 of ALK protein <400> 14 Gly Ala Ala Glu Gly Gly Trp Thr Gly Pro Gly Ala Gly Pro Arg 1 5 10 15 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide; amino acids 1544-1555 of ALK protein preceded by cysteine <400> 15 Cys Gly Gly Trp Thr Gly Pro Gly Ala Gly Pro Arg 1 5 10

Claims (28)

  1. a) MHC 단백질의 클레프트에 결합하는 T 세포 에피토프, 및
    b) 상기 에피토프의 n-말단 및/또는 c-말단 측면에 있는 1 내지 6개의 아미노산 및 시스테인 잔기를 포함하며, 단 상기 시스테인은 모티프 Cxx[CST] 또는 [CST]xxC가 발생하는 경우 상기 에피토프에 인접하여 있거나 또는 상기 에피토프로부터 최대 7개 아미노산만큼 떨어져 있을 때 상기 모티프를 갖는 서열에서는 발생하지 않는 것인 서열
    을 포함하며, 부분 a) 및 b)에 정의된 서열이 상기 항원성 단백질의 야생형 서열에서 발생하는 서열과 상이한 인공 펩티드인 단리된 면역원성 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 부분 b)에 정의된 서열이 오직 1개의 시스테인을 함유하는 것인 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 에피토프가 MHC 클래스 II 에피토프인 펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 9 내지 100개 아미노산의 길이를 갖는 펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 9 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는 펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 9 내지 20개 아미노산의 길이를 갖는 펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스테인 아미노산이 에피토프에 대해 N- 또는 C-말단에 인접하여 위치하며, 이 때 에피토프와 시스테인 아미노산 사이에는 아미노산이 없는 것인 면역원성 펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프가 감염원의 T 세포 에피토프인 면역원성 펩티드.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프가 자기 항원, 알레르겐, 동종인자 또는 동종이식 항원의 T 세포 에피토프인 면역원성 펩티드.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프가 종양에 특이적이거나 또는 우선적인 T 세포 에피토프인 면역원성 펩티드.
  11. a) MHC 단백질의 클레프트에 결합하는 T 세포 에피토프,
    b) 상기 에피토프의 n-말단 및/또는 c-말단 측면에 있는 1 내지 6개의 아미노산 및 시스테인 잔기를 포함하며, 단 상기 시스테인은 모티프 Cxx[CST] 또는 [CST]xxC가 발생하는 경우 상기 에피토프에 인접하여 있거나 또는 상기 에피토프로부터 최대 7개 아미노산만큼 떨어져 있을 때 상기 모티프를 갖는 서열에서는 발생하지 않는 것인 서열, 및
    c) 용매, 희석제, 담체 또는 아주반트 중 하나 이상
    을 포함하는 단리된 면역원성 펩티드를 포함하는 조성물.
  12. a) MHC 단백질의 클레프트에 결합하는 T 세포 에피토프,
    b) 상기 에피토프의 n-말단 및/또는 c-말단 측면에 있는 1 내지 6개의 아미노산 및 시스테인 잔기를 포함하며, 단 상기 시스테인은 모티프 Cxx[CST] 또는 [CST]xxC가 발생하는 경우 상기 에피토프에 인접하여 있거나 또는 상기 에피토프로부터 최대 7개 아미노산만큼 떨어져 있을 때 상기 모티프를 갖는 서열에서는 발생하지 않는 것인 서열
    을 포함하는, 의약으로 사용하기 위한 단리된 면역원성 펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 부분 b)에 정의된 서열이 오직 1개의 시스테인을 함유하는 것인, 의약으로 사용하기 위한 펩티드.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 에피토프가 MHC 클래스 II 에피토프인, 의약으로 사용하기 위한 펩티드.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 8 내지 100개 아미노산의 길이를 갖는, 의약으로 사용하기 위한 펩티드.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 8 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는, 의약으로 사용하기 위한 펩티드.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 8 내지 20개 아미노산의 길이를 갖는, 의약으로 사용하기 위한 펩티드.
  18. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 질환을 치료하거나 또는 예방하기 위한 의약으로 사용하기 위한 면역원성 펩티드.
  19. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 또는 동종인자를 중화하는 면역 반응을 치료하거나 또는 예방하기 위한 면역원성 펩티드.
  20. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 종양을 치료하거나 또는 예방하기 위한 의약으로 사용하기 위한 면역원성 펩티드.
  21. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 CD4+ T 세포 반응을 유도하거나, CD4+ 조절성 T 세포 반응을 유도하거나 또는 CD8+ T 세포 활성화를 유도하기 위한 의약으로 사용하기 위한 면역원성 펩티드.
  22. 제21항에 있어서, CD8+ T 세포의 활성화가 초활성화된 CD4+ T 세포에 의한 시토카인, 예컨대 인터류킨 2의 생산을 통한 간접적 활성화인 것인 펩티드.
  23. a) MHC 단백질의 클레프트에 결합하는 T 세포 에피토프,
    b) 상기 에피토프의 n-말단 및/또는 c-말단 측면에 있는 1 내지 6개의 아미노산 및 시스테인 잔기를 포함하며, 단 상기 시스테인은 모티프 Cxx[CST] 또는 [CST]xxC가 발생하는 경우 상기 에피토프에 인접하여 있거나 또는 상기 에피토프로부터 최대 7개 아미노산만큼 떨어져 있을 때 상기 모티프를 갖는 서열에서는 발생하지 않는 것인 서열을 포함하는, 의약으로 사용하기 위한 단리된 면역원성 펩티드의 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는, 감염성 질환, 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 종양, 또는 동종인자를 중화하는 면역 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 장애를 치료하거나 또는 예방하는 방법.
  24. a. CD4+ T-세포 반응을 도출할 수 있는 항원성 단백질의 T-세포 에피토프로 이루어진 펩티드 서열을 제공하는 단계,
    b. (a)의 펩티드 서열에 상기 에피토프 서열로부터 최대 5개 아미노산만큼 떨어져 있는 시스테인 잔기를 포함하는 서열을 연결시키며, 단 상기 시스테인은 모티프 [CST]-xx-C 또는 C-xx-[CST]가 발생하는 경우 상기 MHC 결합 영역에 인접하여 있거나 또는 상기 MHC 결합 영역으로부터 최대 7개 아미노산만큼 떨어져 있을 때 상기 모티프를 갖는 서열에서는 시스테인으로 발생하지 않는 것인 단계,
    c. 단계 a) 및 b)에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 펩티드를 합성하는 단계
    를 포함하는, CD4+ T-세포 반응을 도출할 수 있는 항원성 단백질의 펩티드를 제조하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 항원성 단백질에서의 T 세포 에피토프의 서열을 컴퓨터 알고리즘 및/또는 생화학적 검정에 의해 결정하는 것인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 부분 b의 펩티드 서열을 에피토프 서열의 N 말단 또는 C 말단에 있는 최대 6개 아미노산의 영역에서의 항원성 단백질의 아미노산 서열을 변형시킴으로써 수득하는 것인 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이가 시스테인의 도입, 모티프 [CST]-xx-C 또는 C-xx-[CST]에서 시스테인으로 발생하는 시스테인의 결실, 및 한 위치에서의 시스테인의 결실 및 또 다른 위치에서의 시스테인의 도입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 부분 b의 펩티드 서열이 에피토프 서열의 N 말단 또는 C 말단에 있는 최대 6개 아미노산의 영역에서의 항원성 단백질의 서열과 관련되지 않은 인공 서열인 방법.
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