JP2012196221A - タンパク質生産のための遺伝子組み換えアロエ植物と関連方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】組み換えコンストラクトは、哺乳類のタンパク質をコードする一つ以上のDNA配列と、アロエ植物で組み換えタンパク質の発現を誘導することができる少なくとも一つのプロモーターを含む。遺伝子組み換えアロエ植物を構築し、再生する。
【選択図】図1
Description
本特許出願は、2005年9月26日出願の米国特許仮出願第60/720,540号、表題“TRANSGENIC ALOE PLANTS FOR PRODUCTION OF PROTEINS AND RELATED METHODS”の優先権と利益を主張し、この出願はここにその全容が引用により本明細書に組み込まれる。
本発明は、遺伝子組み換え単子葉植物に関し、より詳細には、遺伝子組み換えアロエ植物と、遺伝子組み換えアロエ植物生産のための方法と組成、および遺伝子組み換えアロエ植物からタンパク質を抽出する方法に関する。
その多くが治療目的で用いられる生物活性タンパク質の市場は拡大し続けている。現在、160以上のタンパク質から作られる医薬品が利用可能である。さらに50くらいが今後2〜3年のうちに認可される見通しである。治療タンパク質生産に対する現行需要は、既に生産能力を上回っている。業界はこの隘路を打開するために、生産能力を4倍から5倍増加させる必要があると予測されている。しかしながら、治療タンパク質の生産設備は高価で、一般的に建設に時間がかかる。従って、より安価で、かつ生産を増加させるために必要な時間を短縮し得る生産方法が必要とされる。
本発明の一つ以上に従う遺伝子組み換えアロエ植物10は、概して、一つ以上の目的タンパク質を発現するように植物に安定的に組み込まれた一つ以上のDNAコンストラクトを含む。本発明の一つ以上に従う遺伝子組み換えアロエ植物10を作製することは、種々の新規の組成と方法を含んでもよい。典型的には、一つ以上のDNAコンストラクトは、遺伝子組み換えアロエ植物10に一つ以上のタンパク質を発現するように改良される。一態様では、一つのコンストラクトは一つのmRNAを発現してもよい。他の態様では、一つのコンストラクトは複数のmRNAを発現してもよい。なおも他の態様では、複数のコンストラクトが複数のmRNAを産出してもよい。各mRNAは一つ以上のポリペプチドを産出してもよい。
図2に図示した配列例に示すように、アロエ細胞もしくはアロエ細胞群は、典型的には所望のコンストラクトの組み込みの前にアロエ植物から分離される。DNAコンストラクトの組み込みに一般的に選ばれるアロエ細胞の種類は、その再生能に基づいて一般的に選択される。アロエ植物体からの茎***組織もしくは根***組織由来の***組織細胞、もしくはアロエ種子由来のアロエ胚細胞を使用してもよい。しかしながら、アロエ植物の多くの部分は、再生する能力、もしくはカルス組織を形成する能力を保持しており、これらを利用してもよい。細胞は典型的には、本発明の開示を考察することで当業者に理解される様々な技術を用いて分離される。典型的には、細胞は外科用メスを用いてアロエ植物から機械的に分離される。あるいは、本発明の開示を考察することで当業者に理解されるように、必要な細胞を分離するために、他の機械的技術もしくはその他の技術を用いてもよい。適切なアロエ細胞もしくはアロエ細胞群が分離されると、通常、アロエ細胞はカルス組織を形成するために培養下で育成される。或る技術は、アロエ細胞が最初にカルス組織に成長することを必要としなくてもよいが、カルス組織は、遺伝子組み換えアロエ植物10を作り出す能力を保持する未分化のアロエ細胞セットの源を提供する。カルス組織は典型的には固形培地上で育成される。しかしながら、カルス組織は液体培地に置くこともできるし、浮遊状態で成長させることもできる。
適切なDNAコンストラクトは、典型的には、得られる遺伝子組み換えアロエ植物10によって目的タンパク質(群)の生成が可能になるように、分離されたアロエ細胞に由来するカルス組織に導入される。本発明の開示を考察することで当業者に理解されるように、DNAコンストラクトは、分離されたアロエ細胞もしくは成熟アロエ植物に導入されてもよい。DNAコンストラクトは、典型的には、コンストラクトの増殖およびアロエ細胞への導入のために、プラスミドもしくはウィルスなどのベクターに組み込まれる。プラスミドベクターの例としては、例示目的として図4に図式的に示してあるInvitrogen(Carlsbad, California)から商標pZErOで市販されているプラスミドを含んでもよく、また、例えばこのプラスミドの機能単位のうちの一つ以上を含んでもよい。
あるいは、例えばインターフェロンなどのいくつかの目的タンパク質は、インターフェロンを分泌の標的とする、天然もしくは合成のドメインを含んでもよい。分泌シグナルは、通常、タンパク質が細胞を離れる際に切断されるか、あるいはいくつかの場合には、実質的にタンパク質の機能に影響を与えることなく、タンパク質によって保持されることもある。分泌シグナルは転移のために分泌シグナルを必要とし得る様々なタンパク質に加えられてもよい。これらの分泌シグナルは様々な植物分泌配列に由来してもよい。DNAコンストラクトもしくは関連ベクターは、少なくとも一つの選択可能なマーカーも含んでもよい。一態様では、DNAコンストラクトは、バクテリアでのベクターの増殖のための第一選択可能マーカーと、アロエ細胞での成長のための選択可能マーカーの両方を含んでもよい。加えて、DNAコンストラクトは、アロエ植物10の特定のアロエ細胞での発現のための、他の調節因子を含んでもよい。他のコンストラクトの構成要素は、転写促進のための5’リーダーとイントロン、3’非翻訳領域(ポリアデニル化シグナルおよびポリアデニル化部位など)、輸送ペプチドのためのDNAなど、付加的な調節因子を含んでもよい。所望の治療タンパク質をコードする配列などの、所望のDNA配列の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応によって行われ得る(U.S. Pat. No. 4,683,202および5,928,906を参照。それぞれ引用によって本明細書に組み込まれる。)。本発明の開示を考察することで、当業者は、プロモーター配列、調節配列、安定化配列、ターゲティング配列、および/または終結配列を含むDNAコンストラクトが、当業者に周知の方法を用いてその機能に影響を及ぼすように改変されてもよいことがわかるだろう。
ベクターに組み込まれた、目的遺伝子と機能的な種々の機能単位を含むDNAコンストラクトを作製した後、DNAコンストラクトは、本発明の開示を考察することで当業者に理解される数多くの技術を用いて、アロエ細胞に導入される。これらのDNAコンストラクトは、概して安定的に形質転換されたアロエ植物10の形成を促進するために設計される。組み換えDNAで植物細胞を形質転換する数多くの方法が当該技術分野で周知であり、本発明において使用され得る。安定的なアロエ形質転換体を作製するために、ベクターに含まれるDNAコンストラクトをアロエ細胞もしくは組織に組み込むいくつかの方法は、A. tumefaciensもしくはA. rhizogenesの感染、複製欠損性ウィルスの感染、バイオリスティック形質転換、プロトプラスト形質転換、花粉への遺伝子導入、生殖器官への導入、未熟胚への導入、もしくは同様の方法を含むことができる。現在、よく用いられている植物形質転換方法のうちの二つは、Agrobacterium媒介形質転換とバイオリスティック形質転換である。
形質転換アロエ細胞もしくはカルス組織は、形質転換細胞を選択するために、典型的には適切な栄養培地で培養される。しばしば、選択培地は、非形質転換細胞を殺す毒素もしくは他の選択因子を含む。本発明の開示を考察することで当業者に理解されるように、様々な培地の交換により、目的遺伝子を含むアロエ植物10の産出が可能になる。
一態様では、本発明はアロエ植物に導入されたDNAコンストラクトの部位特異的組み込みもしくは切除を利用してもよい。部位特異的組み込みもしくは切除の利点は、形質転換コンストラクトが通常は宿主ゲノムに複数コピーでランダムに組み込まれるという、従来の形質転換技術に伴う問題を克服するために使用できるということである。この導入DNAの宿主細胞ゲノムへのランダム挿入は、もし外来DNAが必須遺伝子に挿入される場合、致命的になることがある。加えて、導入遺伝子の発現は、周囲のゲノムDNAに起因する“位置効果”によって影響され得る。さらに、遺伝子抑制、組み換え、および予測不可能な遺伝を含む、植物が保有する導入遺伝子の複製コピーに関連する問題のために、一般的には遺伝子組み換えアロエ植物10のゲノムに挿入されたDNAコンストラクトのコピー数を制御することが好ましく、多くの場合単一コピーのDNAコンストラクトの挿入のみが望ましい。
アロエ細胞もしくはアロエ組織の形質転換に続いて、形質転換アロエ細胞もしくはアロエ組織は、小植物体に成長され得る。選択剤に晒されても生き残ったアロエ細胞、もしくはスクリーニングアッセイで陽性となったアロエ細胞は、再生培地で培養され得、遺伝子組み換えアロエ植物10に成長させられ得る。形質転換アロエ細胞から再生した成長中のアロエ小植物体は、植物成長ミックスに移され、温室もしくは成熟のための栽培室に移す前に、例えば約85%の相対湿度、600 ppmのCO2、25〜250マイクロアインシュタインm-2s-1の光で環境制御されたチャンバーで、寒さに慣れさせることができる。形質転換アロエ植物10は、形質転換体が特定された後、最初の組織に応じて約6週間から10ヶ月で再生される。再生された形質転換アロエ植物10もしくはその子孫となる種子もしくは植物体は、通常は組み換えDNAの発現を調べられる。
ベクターを介して植物細胞と植物に導入された構造タンパク質もしくは酵素は、根、塊茎、葉、種子、花、樹液を含むアロエ植物10の様々な組織において、あるいは植物の部分と発育段階の組み合わせにおいて見られる。一態様では、一つもしくは複数の目的タンパク質は、葉の中心部のゲルマトリックスに濃縮される。別の態様では、一つもしくは複数の目的タンパク質は生物活性があり、アロエ葉12から抽出されてある程度の薬効を提供する。別の態様では、一つもしくは複数の目的タンパク質、および少なくとも一つの天然アロエタンパク質、糖質および/またはゲルマトリックスに見られるその他の化合物は、患者に所望の治療を施すように相乗的に作用する。タンパク質はバイオマス全体もしくは特定の組織から抽出できる。植物細胞からのタンパク質抽出は、物理的方法と化学的方法を含んでもよい。葉もしくは樹液からのタンパク質抽出は、ろ過、超遠心分離法、化学抽出、およびアフィニティークロマトグラフィーを含んでもよい。
第一の実施例では、直接使用のため、あるいはカルス発生のための芽***組織が、アロエ(Aloe vera、Aloe ferox、もしくはAloe arborescenceのいずれか)の茎から分離される。葉の部分は除去され、茎はアロエ葉の縦軸を通って横方向に切られる。組織はTween 20(0.05%)と次亜塩素酸塩(5%)の混合物で10分間滅菌され、その後30秒エタノールで処理し、滅菌水で三回洗浄した。切片はその後、様々な濃度の成長因子(オーキシンとサイトカイニン)と2〜3%のスクロースを含むアガー(0.8〜1%)を含むMS培地の入ったプレートに、露出面を横倒しにして置かれる。生育条件は所望の処理過程に応じて異なる。芽の発達を伴わないカルス培養は、典型的にはこれらの切片を、BAPを含まないNAA(2〜5 mg/L)か、もしくは低濃度のBAP(0.2 mg/L)を含むNAA(2〜5 mg/L)で生育させることによって開始される。未分化細胞は切られた茎の範囲に沿って成長し始め、別の皿上で継代培養されて保持され得る。発芽誘導は、こうした切片を発芽培地(0.2 mg/L NAA(もしくはIAA 0.2 mg/L)と2 mg/L BAPを含むMS培地)に置くことによって直接的に開始させることができる。NAAとIAAは両方ともオーキシンの供給源としてはたらき、また、効果のあるオーキシンとサイトカイニン両方の濃度の範囲が存在する。未熟胚由来のカルス細胞は、市販の種子から育成される。種子は最初に滅菌される(エタノールで30秒、5%次亜塩素酸塩と0.05% Tween 20で15分間、ならびに滅菌水で3回洗浄)。滅菌された種子は、その後セ氏4度で水中に一晩放置される。種皮を除去することによって未熟胚が分離される。三角形の種子の一角に小さな切れ目を作り、胚を搾り出す。その後これは、カルスを誘導するためにオーキシンのみ(NAA 2〜5 mg/L)を含むMS培地か、あるいはカルスと芽の増殖を誘導するためにオーキシンとサイトカイニン(NAA 0.2 mg/L、BAP 2 mg/L)を含むMS培地上に置かれる。糖濃度は通常2〜3%である。
1.pBI121ユビキチンインターフェロンベクター(pBI-UI)
pBI-UIの作製の骨格として、pBI121 Agrobacteriumバイナリベクターが使用される。シグナル配列を持つヒトインターフェロンアルファ2遺伝子は、5’PstIおよび3’SacI/XhoI制限部位を含む遺伝子特異プライマーを用いてヒト293細胞から増幅される。587 bpのインターフェロンPCR産物はpZErOにクローニングされ、シーケンスにかけられる。トウモロコシ由来の1962 bpユビキチン(Ubi)プロモーターエレメントも、ベクターpUBI-GFP由来の領域を増幅し、5’HindIIIおよび3’PstI制限部位にクローニングすることによって、pZErOにクローニングされる。Ubiフラグメントは、その後pZeroインターフェロンベクターにHindIII/PstI(pZErO UI)を用いてサブクローニングされる。無傷のUbiインターフェロンカセットは、その後HindIII/SacIを用いてpBI121にサブクローニングされ、CaMV 35SプロモーターとGUS遺伝子を除去して、pBI UIを得る。このベクターは、agrobacterium媒介感染および形質転換に必要な左右のTエレメント境界領域を保持し、Nosプロモーターの制御下にカナマイシン抵抗性遺伝子(NPTII)を発現する。
このベクターは、UbiプロモーターをpZErOクローニングベクターにクローニングすることによって作製される。このフラグメントの後ろに、IRES(内部リボソーム侵入配列)とカナマイシン抵抗性遺伝子と一緒に、ヒトインターフェロンアルファ2を含むカセットがクローニングされる。この単位は単一の転写産物として発現されるが、二つの別個のタンパク質として翻訳される(IRESによってもたらされる第二転写開始部位のため)。これにより、選択可能マーカーとインターフェロン両方がUbiプロモーターの制御下で発現することが可能になる。
標的組み換えのためのcreおよびflp部位を持つ選択可能マーカーを発現する親株が最初に作製される。目的遺伝子を持つ第二トランスフェクション導入ベクターがcre部位に向けられる。その後不要な遺伝物質がflpを用いて除去される。
1.Agrobacterium媒介遺伝子導入
Agrobacterium strain LB4404(Invitrogen, Carlsbad, CA)は、pBI UIベクターと、50μg/mlカナマイシンと100μg/mlストレプトマイシンを含むLBアガープレート上で選択された陽性クローンと共に電気穿孔された。個々のクローンは250μMアセトシリンゴンを含むLB培地でセ氏30度で一晩培養された。感染は、植物切片もしくはカルスを一晩培養に沈水させ、滅菌ろ紙上にブロットドライ(blotting dry)し、暗所でセ氏25度で250μMアセトシリンゴンを含むMSアガープレート上に播種することで行われた。感染から二日後、Agrobacteriumを殺すために、組織は200μMセフォタキシムを含むMSアガープレートに移された。その後、形質転換体を選択し芽再生を誘導するために、組織は50 mg/Lカナマイシンと0.2 mg/L NAAと2 mg/L BAPを含むMSアガープレートに移される。組織は12時間の光照射でセ氏25度で育成される。不定芽は約2 cmの長さに達するまで育成され、その後切除され、選択を続けながら発根培地上に植え替えられる。目的遺伝子を発現する小植物体は、発現レベルを分析し、土壌に移される。
金粒子(0.6〜1μm)がDNAコンストラクトを含むベクターで被覆される。金粒子は、浸漬させてボルテックスにかけることで70%エタノールで15 分間洗浄され、その後滅菌水で3回洗浄される。その後、金粒子は60 mg/mlの濃度まで50%グリセロールに再懸濁される。洗浄された粒子上にDNAベクターを被覆させるために、3 mgの粒子が1.5 mlマイクロフュージチューブに加えられる。これに5μlのDNAを1μg/μlの濃度で加え、50μlの2.5M CaCl2、および20μlの0.1Mスペルミジンを加え、2〜3分間ボルテックスする。これを安定させ、1〜2秒間遠心し、液体を除去する。これに140μlの70%エタノールを加え、遠心し、液体を捨てる。これに140μlの100%エタノールを加え、遠心して液体を捨てる。沈殿物に48μlの100%エタノールを加え、穏やかに再懸濁させる。遺伝子銃装置(PDS 1000/He, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)は70%エタノールを用いて滅菌される。遺伝子銃装置は、マクロキャリアホルダーと停止スクリーン間の最短ギャップ距離を用いて組み立てられた(推奨設定)。被覆金粒子(8μl)はマクロキャリアの中心上にピペットされる。600〜1100 psiの破裂板を用いて、標的距離は標的組織に応じて設定された(組織は6 cm、カルスは9 cm)。
プロトプラストは、外側の細胞壁がない植物細胞である。このような細胞を作製する利点は、トランスフェクション効率を高め、こうした細胞が融合して体細胞雑種を形成できることである。体細胞雑種は異なる植物由来の遺伝子を混ぜ合わせ、全く新しいものをもたらす可能性がある。
第一の実施例では、成功した形質転換体は、最初に細胞毒素(例えばカナマイシン)に対する抵抗性で選択される。安定的にトランスフェクションされた細胞は、抵抗性マーカーと目的遺伝子(例えばインターフェロンをコードする遺伝子など)の両方を発現しているはずであり、さらに正常な植物を再生できるはずである。選択を開始するために、50 mg/LのカナマイシンがMSアガープレートに加えられる。選択の経過は、細胞が複製する速度に一部依存するが、6〜10週間で起こり得る。この間に、0.2 mg/L NAAと2 mg/L BAPをMSアガープレートに加え、12 hr/dayの光周期(淘汰圧を続けながら)で芽発達を促進することにより、形質転換細胞の再生が誘導される。不定芽が発達し始めると、これらは約2 cmの長さで遺伝子発現を分析され得る。所望の遺伝子産物を発現する芽(RT-PCR、Western blot、および生物学的検定法によって分析する)は、続いて根形成を誘導するためにMSアガープレートに移される(1/2 MSと0.2 mg/L NAA)。
Claims (3)
- 植物内で、前記植物に対して外来性の生物活性タンパク質を生成するために、遺伝子組み換えアロエ植物を生成する方法であり、
アロエ細胞の未分化カルスを、1-ナフタレン酢酸(NAA)もしくはインドール3-酢酸(IAA)および6-ベンジルアミノプリン(BAP)を含む栄養培地で培養するステップと、
前記カルスに、プロモーター、前記外来タンパク質をコードする配列、終結配列、および分泌シグナルペプチドをコードする転移配列を含む組み換えDNAコンストラクトを導入するステップと、
前記カルスを、0.2 mg/l NAAもしくはIAAおよび2 mg/ml BAPを含む発芽・選択培地で培養するステップと、
前記発芽・選択培地で再生された芽を、0.2 mg/l NAAを含む発根培地で培養するステップと、
一旦根が形成し始めたら、小植物体を土壌に移すステップと、
を含み、
前記外来タンパク質は、インターフェロン、免疫グロブリン、リンフォカイン、哺乳類成長因子、哺乳類ホルモン、血液因子、組織適合抗原、SEQ. ID. NO. 36によってコードされるプロトロンビン、およびSEQ. ID. NO. 30によってコードされるダームシジンから選択される哺乳類タンパク質である、
ことを特徴とする、方法。 - 前記カルスはアロエ種子由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記カルス組織は前記組み換えDNAコンストラクトを直接打ち込まれる、請求項1もしくは2に記載の方法。
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