CN100354423C

CN100354423C - 一种培育转基因芦荟的方法

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Publication number: CN100354423C
Application number: CNB2005101090720A
Authority: CN
Inventors: 何聪芬; 叶兴国; 董银卯; 张佳星; 陈杰; 王艳丽; 徐惠君; 杜丽璞; 赵华; 兰社益
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2005-10-17
Filing date: 2005-10-17
Publication date: 2007-12-12
Anticipated expiration: 2025-10-17
Also published as: CN1742565A

Abstract

本发明公开了一种培育转基因芦荟的方法。该方法包括以下步骤：1)以经消毒灭菌的茎段为外植体，将其切成小块后，在23-27℃下，用经芦荟农杆菌共培养用液体培养基悬浮制成的携带有目的基因的农杆菌的菌液浸泡20-40min进行侵染，取出茎块，再在22-26℃、光照8-12小时/天的条件下，进一步侵染2-4天；2)将经农杆菌侵染的芦荟茎块置于不添加筛选剂的恢复培养基上，恢复培养6-8天；3)将经恢复培养的芦荟茎块置于丛生芽诱导与筛选培养基上，在22-26℃、光照8-12小时/天的条件下培养18-22天；4)将在丛生芽诱导与筛选培养基上长出的愈伤组织或幼嫩丛生芽移至新的丛生芽诱导与筛选培养基上在与步骤3)相同的条件下进行继代与筛选培养，获得丛生芽；5)将丛生芽进行壮苗、生根后，得到转基因芦荟。

Description

一种培育转基因芦荟的方法

技术领域

本发明涉及一种培育转基因芦荟的方法。

背景技术

芦荟(Aloe)属百合科多年生单子叶植物，具有医疗、美容、保健、食用等多种功能，被***粮农组织(FAO)誉为“21世纪人类的最佳保健品”。可用于商业性栽培的优良芦荟品种，必须同时具备三个条件：1)有效成分含量高；2)适应性强，便于扩大种植面积，发展集约化生产；3)单位面积产量高，有利于获得最佳的经济效率。然而，芦荟不耐寒，虽耐旱，但在贫瘠、干旱的土壤中生长缓慢，且产量低；食用芦荟品种味苦、味感差，这些不利因素阻碍了芦荟的大规模产业化进程。虽然芦荟属内资源丰富(共有500多种)，但芦荟开花不结实，或结实率极低，且种子育苗技术复杂、成苗率低(熊佑清，姚利，芦荟，中国农业大学出版社，62-65)。此外，部分性状的改良不能靠常规育种达到，需要借助基因工程的手段。目前人们对芦荟的研究侧重于对其有效成分的分析和开发利用。虽然芦荟组织培养及快繁技术已经成熟(由继红，芦荟组织培养研究进展，中国野生植物资源，2001，2：10-11；杜勇军，李惠芝，祁云枝，芦荟芽快繁及试管苗栽培驯化研究，西北植物学报，2003，12(1)：72-75)，但对芦荟转基因体系的构建及其相关转基因方面的研究尚未见报道。

植物转基因主要采用农杆菌介导法和基因枪介导法。农杆菌介导法因具有操作简单、成本低、转化效率高、重复性好、可以导入大片段DNA，且导入的基因一般为单拷贝或低拷贝整合，可以减少发生基因沉默现象等优点，应用最为广泛，已在大豆等双子叶经济作物的改良中得到推广应用。随着人们对农杆菌介导法转化机理认识的深入，转化方法也不断得到改进，如选用高侵染力的菌株、超双元载体、适宜的外植体、高效的启动子、适宜的共转化培养基、合适的选择剂、较高浓度的酚类化合物如乙酰丁香酮(acetoayringone，AS)处理等(孔英珍，周功克，王根轩，王亚馥，影响根癌农杆菌转化的因素及其在单子叶作物上的应用，应用生态学报，2000，11(5)：791-794)。利用改良的农杆菌介导法已经在水稻、玉米、小麦、大麦等有重要价值的单子叶植物中也已成功获得了转基因植株，并得到了详细的分子生物学和遗传性证据(Hiei Y，Komari T，Kabo T.，Transformation of rice mediated by Agrobacteriumtumefaciens.，Plant Mol Biol，1997，35：205-218；Ishida Y，Saito H，Ohta S.High efficiency transformat ion of maize(Zea mays L)mediated by Agrobacteriumtumefaciens，Nat Biotech，1996，14：745-750；Cheng Ming，E.F.Joyce，PangShengzhi et al.，Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacteriumtumefaciens，Plant Physiol，1997，115：971-980)。目前，人们致力于拓宽农杆菌转化单子叶植物的宿主范围和转化效率的提高，如柴宝峰等经研究建立了单子叶早熟禾农杆菌介导的转基因方案(CHAI Bao-Feng，LIANG Ai-Hua，WANG Wei，Hu Wei，Agrobacterium-mediated Transformation of Kentucky Bliuegrass，Acta BotanicaSinica，2003，45(8)：966-973)，发现影响转基因效率的主要因素有：愈伤组织的胚性、光照时间、共转化时间、抗生素浓度和选择压力。已经获得的单子叶植物的成功转化实例表明，幼胚及成熟或未成熟胚经诱导所产生的胚性愈伤组织是农杆菌转化和再生获得成功的基础(殷丽青，张建军，王惠梅，程磊，王新其，沈革志，提高根癌农杆菌介导水稻遗传转化转化频率的研究，上海交通大学学报(农业科学)，2003，21(增刊)：43-47)，此外，共培养条件包括温度、时间、培养基成分也是影响农杆菌转化效率的主要因素(李卫，郭光沁，郑国锠，根癌农杆菌介导遗传转化研究的若干新进展(评述)，科学通报，2000，45(8)：798-807)。如何诱导产生适宜农杆菌转化的非胚性组织，研制适宜的共培养条件是目前农杆菌介导的单子叶植物基因转化的任务之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用农杆菌介导法培育转基因芦荟的方法。

本发明所提供的培育转基因芦荟的方法，可包括以下步骤：

1)以经消毒灭菌的茎段为外植体，将其切成小块后，在23-27℃下，用经芦荟农杆菌共培养用液体培养基(ACC)悬浮制成的携带有目的基因的农杆菌的菌液浸泡20-40min进行侵染，取出茎块，再在22-26℃、光照8-12小时/天的条件下，进一步侵染2-4天；所述芦荟农杆菌共培养用液体培养基是在1/8-1/12MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA)，α-萘乙酸(NAA)，乙酰丁香酮(acetoayringone，AS)，葡萄糖，谷氨酸盐和干酪素水解物；

2)将经农杆菌侵染的芦荟茎块置于不添加筛选剂的恢复培养基(ARC)上，在22-26℃、光照8-12小时/天的条件下恢复培养6-14天；所述不添加筛选剂的恢复培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤和α-萘乙酸和对农杆菌具有致死作用的抗生素；

3)将经恢复培养的芦荟茎块置于丛生芽诱导与筛选培养基(ASC)上，在22-26℃、光照8-12小时/天的条件下培养18-22天，进行丛生芽的诱导与筛选；所述丛生芽诱导与筛选培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤，α-萘乙酸，glufosinate-ammonium(商用名为Liberty，法国Aventis作物科学公司)和对农杆菌具有致死作用的抗生素；

4)将在丛生芽诱导与筛选培养基上长出的愈伤组织或幼嫩丛生芽移至新的丛生芽诱导与筛选培养基上在与步骤3)相同的条件下进行继代与筛选培养，获得丛生芽；

5)将丛生芽进行壮苗、生根后，得到转基因芦荟。

对芦荟茎段进行消毒灭菌的方法可为：将芦荟茎段先在20％NaClO溶液中浸泡20-30min，再在0.1％升汞(HgCl)溶液中浸泡6-8min。

步骤1)中携带有目的基因的农杆菌的菌液的制备方法可为：将OD₆₅₀值为0.6-0.8的携带有目的基因的农杆菌菌液中的菌体悬浮于0.6-1倍菌液体积的芦荟农杆菌共培养用液体培养基中即可。可将芦荟茎块置于灭菌的滤纸上，在22-26℃、光照8-12小时/天条件下，进行进一步地侵染。

为确定灭菌效果，在用农杆菌侵染前，可先将经消毒灭菌的芦荟茎块置于丛生芽诱导培养基(AC)上，在22-26℃、光照8-12小时/天的条件下预培养5-6天，优选的预培养条件为：温度24℃、光照10小时/天；所述丛生芽诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤和α-萘乙酸。

所述步骤1)中用于侵染的农杆菌可为任意一种根癌农杆菌，如EHA101、C58c1或LBA4404等，优选为EHA101；芦荟农杆菌共培养用液体培养基优选为在1/10MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤，α-萘乙酸，乙酰丁香酮(acetoayringone，AS)，葡萄糖，谷氨酸盐和干酪素水解物；步骤3)丛生芽诱导与筛选培养基中的抗生素可为任意一种对农杆菌具有致死作用的抗生素，如头孢霉素、万古霉素或羧苄青霉素等。

在上述培育方法中所用到的培养基添加剂的浓度为：芦荟农杆菌共培养用液体培养基中6-BA的浓度为2.5-4mg/L，优选为3mg/L，NAA的浓度为0.15-0.2mg/L，优选为0.18mg/L，AS的浓度为180-220μM，优选为200μM，葡萄糖的质量百分浓度为0.8-1.2％，优选为1％，谷氨酸盐的浓度为0.3-0.7g/L，优选为0.5g/L，干酪素水解物的浓度为0.08-0.12g/L，优选为0.1g/L；不添加筛选剂的恢复培养基中6-BA的浓度为2.5-4mg/L，优选为3mg/L，NAA的浓度为0.15-0.2mg/L，优选为0.18mg/L；丛生芽诱导与筛选培养基中6-BA的浓度为2.5-4mg/L，优选为3mg/L，NAA的浓度为0.15-0.2mg/L，优选为0.18mg/L，glufosinate-ammonium的浓度为2-3mg/L，优选为2.5mg/L，抗生素种类不同则浓度不同，如选用羧苄青霉素时，浓度为200-300mg/L，优选为250mg/L；丛生芽诱导培养基中6-BA的浓度为2.5-4mg/L，优选为3mg/L，NAA的浓度为0.15-0.2mg/L，优选为0.18mg/L。

步骤1)中对芦荟茎块进行侵染的方法优选为：将经消毒的芦荟茎段切成小块后，先在25℃下，携带有目的基因的农杆菌的菌液中浸泡30min，取出茎块，再在24℃，光照10小时/天的条件下，在灭菌的滤纸上培养3天；步骤2)中经农杆菌侵染的芦荟茎块在不添加筛选剂的恢复培养基上恢复培养的条件优选为：在24℃、光照10小时/天的条件下培养7天；步骤3)中经恢复培养的芦荟茎块在丛生芽诱导与筛选培养基上的培养条件优选为：在24℃、光照10小时/天的条件下培养20天。

本发明提供了一种利用农杆菌介导法培育转基因芦荟的方法，在实际应用方面，该方法将产生以下积极效果：(1)加速优良外源基因向芦荟中的转移；(2)为提高芦荟生长阶段的抗寒、耐盐能力，扩展芦荟的种植范围，提高单位面积芦荟叶片的产量奠定了基础；(3)为增强芦荟医疗、保健产品的功效和稳定性，改善芦荟食品的口感，延长芦荟食品保鲜期，提高芦荟化妆品的保湿、防止紫外线效果等诸多具有现实和产业化意义的改良工作顺利实现奠定基础，从而加速芦荟的产业化进程。此外，本发明为弄清影响农杆菌介导的多肉单子叶植物转基因体系的主要因素，发掘并利用更广泛的农杆菌介导的转基因受体资源也具有重要意义。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为由芦荟茎段诱导生成的丛生芽

图1A为pPNT289的物理图谱

图1B为pPNT290的物理图谱

图2为不同农杆菌-质粒载体组合侵染芦荟茎段后分别在固体培养基和滤纸上共培养3天后X-gluc的染色结果

图3为芦荟茎块在添加有1mg/L、3mg/L、5mg/L glufosinate-ammonium的丛生芽诱导固体培养基上生长14天后的生长情况

图4为芦荟茎块在添加有不同浓度(1、2、3、4、5mg/L)glufosinate-ammonium的丛生芽诱导固体培养基上生长14天后的存活曲线图

图5为转基因芦荟的PCR检测结果

图6为转基因芦荟的ELISA检测结果

图7为芦荟转基因苗

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法；所用百分含量均为质量百分含量。

丛生芽诱导培养基(AC)：在MS基本培养基的基础上添加2.5mg/L 6-BA和0.15mg/LNAA。

芦荟农杆菌共培养用培养基(ACC)：在1/10MS培养基的基础上添加2.5mg/L 6-BA，0.15mg/L NAA，200μM AS，1％葡萄糖，0.5g/L谷氨酸盐，0.1g/L干酪素水解物(固体培养基再添加7-8％琼脂)。

芦荟恢复培养基(ARC)：在MS基本培养基的基础上添加2.5mg/L 6-BA，0.15mg/LNAA和250mg/L羧苄青霉素。

芦荟丛生芽诱导与筛选培养基(ASC)：在MS基本培养基的基础上添加2.5mg/L6-BA，0.15mg/L NAA，glufosinate-ammonium 2.5mg/L和250mg/L羧苄青霉素。

实施例1、芦荟外植体灭菌方法的优化

以芦荟茎段为例，对芦荟外植体的灭菌方法进行优化，具体方法为：将芦荟茎段切成约1cm×1cm的小块，在70％酒精中浸泡30s后，分成四组，分别经0.1％升汞溶液(HgCl)灭菌8min、0.1％HgCl溶液灭菌13min、10％次氯酸钠(NaClO)溶液灭菌15min、20％NaClO溶液灭菌25min，再用无菌水漂洗3-4次，然后将芦荟茎块置于丛生芽诱导培养基上，在24℃、光照10小时/天的条件下培养，统计外植体成活率和污染比率，结果如表1所示，兼顾成活率和灭菌效率，确定将芦荟外植体先在20％NaClO溶液中浸泡20-30min，再在0.1％升汞(HgCl)溶液中浸泡6-8min为优选的芦荟外植体灭菌方法。

表1芦荟茎段外植体不同灭菌方法效果的比较结果

	外植体总数	未染菌外植体数目	未染菌比例(％)	成活外植体数目	成活比例(％)
	外植体总数	未染菌外植体数目	未染菌比例(％)	成活外植体数目	成活比例(％)	0.1％升汞浸泡13分钟	139	121	87.1	90	42.7
0.1％升汞浸泡8分钟	137	90	65.7			0.1％升汞浸泡13分钟	139	121	87.1
0.1％升汞浸泡8分钟	137	90	65.7	10％次氯酸钠浸泡15分钟	59	0	0.0	179	82.5
20％次氯酸钠浸泡25分钟	289	217	75.1	10％次氯酸钠浸泡15分钟	59	0	0.0

实施例2、用于农杆菌侵染的芦荟外植体的优选

将芦荟灭菌后，分别将叶片、叶鞘、茎段切成1cm×1cm的小块，置于丛生芽诱导培养基上，在24℃、光照10小时/天的条件下培养4-5周，观察外植体的再生情况，统计存活数目及存活比例，结果如表2所示，确定芦荟的茎段为最适宜于农杆菌侵染的外植体，由其经诱导生成的丛生芽如图1所示。

表2芦荟外植体生长状况比较结果

外植体类型	外植体数目	存活数目	存活比例％
外植体类型	外植体数目	存活数目	存活比例％	叶片	224	0	0.0
叶鞘	140	31	22.1	叶片	224	0	0.0
叶鞘	140	31	22.1	茎部	148	103	69.6

实施例3、不同农杆菌菌系侵染效果的比较

将质粒载体pPNT289(物理图谱如图1A所示)、pPNT290(物理图谱如图1B所示)，分别转化农杆菌EHA101，经筛选得到分别携带有pPNT289、pPNT290的重组子，命名为EHA101/pPNT289和EHA101/pPNT290；用同样方法将质粒pPNT289、pPNT290分别转化农杆菌C58c1，经筛选得到分别携带有pPNT289、pPNT290的重组子，命名为C58c1/pPNT289、C58c1/pPNT290。收集上述四种OD₆₅₀值为0.8的重组农杆菌菌液的菌体，将菌体悬浮于0.8倍上述菌液体积的芦荟农杆菌共培养用液体培养基(ACC)中，得到农杆菌菌液。然后将用ACC液体培养基悬浮制成的四种农杆菌菌液对芦荟茎段侵染30min，再分别在ACC固体培养基和无菌空白滤纸上在24℃、光照10小时/天的条件下共培养3天，培养结束后，对其进行X-Gluc染色，染色结果如图2所示，计算经侵染的外植体中GUS基因的瞬时表达率，并进行对比分析，结果如表3所示，EHA101/pPNT289的侵染效果明显优于其它组合，经EHA101侵染后的外植体中GUS基因的瞬时表达率达到约80％，而C58c1侵染后的外植体中GUS基因的瞬时表达率只有约30％，表明EHA101菌系的整体侵染效果优于c58c1菌系，将EHA101确定为优选的用于构建芦荟外植体侵染菌株的出发菌株。

表3不同农杆菌-质粒载体组合侵染芦荟茎段后分别在固体培养基和滤纸上共培养3天后X-gluc的染色结果

菌系-载体组合	共培养方法	X-gluc检测的外植体数	表达GUSgene的外植体数	染色比例(％)
菌系-载体组合	共培养方法	X-gluc检测的外植体数	表达GUSgene的外植体数	染色比例(％)	EHA101/pPNT289	滤纸	30	20	66.7
固体培养基(ACC)	31	8	25.8			滤纸	30	20	66.7
固体培养基(ACC)	31	8	25.8	EHA101/pPNT290		滤纸	36	2	5.6
固体培养基(ACC)	33	1	3.0			滤纸	36	2	5.6
固体培养基(ACC)	33	1	3.0		C58c1/pPNT290	滤纸	33	0	0.0
固体培养基(ACC)	34	0	0.0			滤纸	33	0	0.0
固体培养基(ACC)	34	0	0.0	C58c1/pPNT289		滤纸	29	1	3.5
固体培养基(ACC)	34	0	0.0			滤纸	29	1	3.5

实施例4、转基因芦荟的培育及检测

一、转基因芦荟的培育

以农杆菌EHA101为出发菌株，利用农杆菌介导法培育转基因芦荟，具体的培育过程包括以下步骤：

1、农杆菌的侵染

以芦荟茎段为外植体，洗净后，将芦荟茎段先在20％NaClO溶液中浸泡25min，再在0.1％升汞溶液中浸泡8min进行灭菌。用15#手术刀将灭菌后的芦荟茎段切成1cm×1cm的小块。将OD₆₅₀值为0.7的实施例3中携带有目的基因的农杆菌EHA101/pPNT289菌液中的菌体悬浮于1倍菌液体积的ACC液体培养基中，得到EHA101/pPNT289菌液。在25℃下，将经消毒灭菌的芦荟茎块置于ACC液体培养基悬浮制成的EHA101/pPNT289菌液中浸泡30min进行侵染，取出茎块，置于无菌的空白滤纸上，再在24℃、光照10小时/天的条件下共培养3天进行进一步的侵染。

2、恢复培养

将步骤1获得的经农杆菌侵染的芦荟茎块置于不添加抗生素筛选剂的恢复培养基上，在24℃、光照10小时/天的条件下，恢复培养7天。

3、丛生芽的诱导、筛选及筛选剂适宜浓度的确定

1)丛生芽诱导与筛选培养基中筛选剂glufosinate-ammonium适宜浓度的确定将步骤2获得的经恢复培养的芦荟茎块置于添加有不同浓度(1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L)筛选剂glufosinate-ammonium的丛生芽诱导固体培养基中，在24℃、光照10小时/天的条件下培养，观察芦荟外植体生长及芽诱导情况，培养14天后的芦荟茎块在添加有1mg/L、3mg/L、5mg/L glufosinate-ammonium的丛生芽诱导固体培养基上的生长情况如图3所示，统计存活的茎段数及存活比例，统计结果如表4所示，根据统计结果绘制成曲线图(图4，横坐标为筛选剂浓度，纵坐标为存活比例)，将成活率50％时的筛选剂浓度定为其适宜浓度，故确定芦荟转化中丛生芽诱导与筛选培养基中筛选剂glufosinate-ammonium(以bar基因作为选择标记)的适宜浓度为2.5mg/L。

表4芦荟茎段在不同浓度glufosinate-ammonium筛选剂下存活比例的统计结果

筛选剂浓度(mg/L)	芦荟茎段总数	存活茎段数	存活比例(％)
筛选剂浓度(mg/L)	芦荟茎段总数	存活茎段数	存活比例(％)	1	43	34	79.1
2	38	24	63.2	1	43	34	79.1
2	38	24	63.2	3	40	17	42.5
4	39	15	38.5	3	40	17	42.5
4	39	15	38.5	5	39	11	28.2

2)丛生芽的诱导、筛选

将经恢复培养的芦荟茎块置于含有2.5mg/L glufosinate-ammonium的丛生芽诱导与筛选培养基上，在24℃、光照10小时/天的条件下培养20天，进行丛生芽的诱导与筛选。

4、丛生芽的获得

将步骤3在丛生芽诱导与筛选培养基上长出的愈伤组织或幼嫩丛生芽移至新的丛生芽诱导与筛选培养基上在与步骤3相同的条件下进行继代与筛选培养，获得丛生芽。

5、转基因芦荟的获得

将步骤4获得的丛生芽进行壮苗、生根后，得到转基因芦荟。

二、转基因芦荟的检测

1、转基因芦荟的PCR检测

对步骤一获得的转基因芦荟用PCR的方法进行检测，根据NPT II基因序列设计引物，引物序列如下：

引物1(上游引物)：5’-TGTTCCGGCTGTCAGCGCAG-3’

引物2(下游引物)：5’-TCGGCAAGCAGGCATCGCCA-3’

采用SDS法提取芦荟再生苗的总DNA并以此作为模板，在引物1和引物2的引导下，对转基因植株中的NPTII基因进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃5min；然后94℃30s，58℃30s，72℃90s，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示(泳道M：DNA MarkerDL2000，泳道1-8：不同的待测植株，泳道9：阴性对照，泳道10：阳性对照)，可扩增出大小为476bp DNA片段的为阳性转基因植株。

2、转基因芦荟的ELISA检测

用ELISA法检测转基因植株中NPT II蛋白的表达情况，采用agdia公司的Pathoscreen kit for neomyc in phosphotransferase II试剂盒并参照试剂盒说明书进行操作，检测结果如图6所示(1-4：PCR阳性的待测植株；5：阴性对照；6-7：未进行PCR检测的待测植株；8：阳性对照)，经步骤1 PCR检测和步骤2 ELISA检测获得了阳性转基因芦荟(图7)。

Claims

1、一种培育转基因芦荟的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以经消毒灭菌的茎段为外植体，将其切成小块后，在23-27℃下，用经芦荟农杆菌共培养用液体培养基悬浮制成的携带有目的基因的农杆菌的菌液浸泡20-40min进行侵染，取出茎块，再在22-26℃、光照8-12小时/天的条件下，进一步侵染2-4天；所述芦荟农杆菌共培养用液体培养基是在1/8-1/12 MS基本培养基的基础上添加了浓度为2.5-4mg/L的6-苄基腺嘌呤，浓度为0.15-0.2mg/L的α-萘乙酸，浓度为180-220μM的乙酰丁香酮，质量百分浓度为0.8-1.2％的葡萄糖，浓度为0.3-0.7g/L的谷氨酸盐和浓度为0.08-0.12g/L的干酪素水解物；

2)将经农杆菌侵染的芦荟茎块置于不添加筛选剂的恢复培养基上，在22-26℃、光照8-12小时/天的条件下恢复培养6-14天；所述不添加筛选剂的恢复培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为2.5-4mg/L的6-苄基腺嘌呤、浓度为0.15-0.2mg/L的α-萘乙酸和对农杆菌具有致死作用的抗生素；

3)将经恢复培养的芦荟茎块置于丛生芽诱导与筛选培养基上，在22-26℃、光照8-12小时/天的条件下培养18-22天，进行丛生芽的诱导与筛选；所述丛生芽诱导与筛选培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为2.5-4mg/L的6-苄基腺嘌呤、浓度为0.15-0.2mg/L的α-萘乙酸、浓度为2-3mg/L的glufosinate-ammonium和对农杆菌具有致死作用的抗生素；

5)将丛生芽进行壮苗、生根后，得到转基因芦荟。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中对芦荟茎段进行消毒灭菌的方法为：将芦荟茎段先在20％NaClO溶液中浸泡20-30min，再在0.1％升汞溶液中浸泡6-8min。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中携带有目的基因的农杆菌的菌液，是将OD₆₅₀值为0.6-0.8的携带有目的基因的农杆菌菌液中的菌体悬浮于0.6-1倍菌液体积的芦荟农杆菌共培养用液体培养基中制成的；对芦荟茎块在22-26℃、光照8-12小时/天条件下，进-步侵染是在灭菌的滤纸上进行的。

4、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：在用农杆菌侵染前，先将经消毒灭菌的芦荟茎块置于丛生芽诱导培养基上，在22-26℃、光照8-12小时/天的条件下预培养5-6天；所述丛生芽诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为2.5-4mg/L的6-苄基腺嘌呤和浓度为0.15-0.2mg/L的α-萘乙酸。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述对芦荟茎块进行预培养的条件为：温度24℃、光照10小时/天。

6、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中用于侵染的农杆菌出发菌株为EHA101或C58c1；芦荟农杆菌共培养用液体培养基为在1/10 MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤，α-萘乙酸，乙酰丁香酮，葡萄糖，谷氨酸盐和干酪素水解物；步骤3)丛生芽诱导与筛选培养基中的抗生素为头孢霉素、万古霉素或羧苄青霉素。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中用于侵染的农杆菌出发菌株为EHA101。

8、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述芦荟农杆菌共培养用液体培养基中6-BA的浓度为3mg/L，NAA的浓度为0.18mg/L，AS的浓度为200μM，葡萄糖的质量百分浓度为1％，谷氨酸盐的浓度为0.5g/L，干酪素水解物的浓度为0.1g/L；不添加筛选剂的恢复培养基中6-BA的浓度为3mg/L，NAA的浓度为0.18mg/L；丛生芽诱导与筛选培养基中6-BA的浓度为3mg/L，NAA的浓度为0.18mg/L，glufosinate-ammonium的浓度为2.5mg/L。

9、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中对芦荟茎块进行侵染的方法为：将经消毒的芦荟茎块先在25℃下，用经芦荟农杆菌共培养用液体培养基悬浮制成的携带有目的基因的农杆菌的菌液浸泡30min，取出茎块，再在24℃，光照10小时/天的条件下，培养3天；所述步骤2)中经农杆菌侵染的芦荟茎块在不添加筛选剂的恢复培养基上恢复培养的条件为：在24℃、光照10小时/天的条件下培养7天；所述步骤3)中经恢复培养的芦荟茎块在丛生芽诱导与筛选培养基上的培养条件为：在24℃、光照10小时/天的条件下培养20天。