JP2012152182A - Micro-channel for nucleic acid hybridization, microchip, column, apparatus, and method for nucleic acid hybridization - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide technologies for highly sensitively detecting a bcr-abl gene mRNA.SOLUTION: In the micro-channel 11 for nucleic acid hybridization, a sample solution containing the bcr-abl gene mRNA is circulated, and agarose gel carriers (agarose gel beads) 2 in which a capturing chain with a specific base sequence complementary to the bcr-abl gene mRNA is solid-phased are loaded in such a state as held by a filter 113 disposed on the downstream in the direction of feeding the sample solution.

Description

本発明は、核酸ハイブリダイゼーション用のマイクロ流路、マイクロチップ、カラム及び装置と核酸ハイブリダイゼーション方法に関する。より詳しくは、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子であるｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡを核酸ハイブリダイゼーションによって検出するためのマイクロ流路等に関する。   The present invention relates to a microchannel, microchip, column and apparatus for nucleic acid hybridization and a nucleic acid hybridization method. More specifically, the present invention relates to a microchannel for detecting bcr-abl gene mRNA that is a causative gene of chronic myeloid leukemia by nucleic acid hybridization.

慢性骨髄性白血病（Chronic myelogenous leukemia）の診断のため、従来、骨髄液あるいは末梢血中のｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子をＦＩＳＨ法で観察したり、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法で検出したりすることが行われている。   For diagnosis of chronic myelogenous leukemia, conventionally, the bcr-abl gene in bone marrow fluid or peripheral blood is observed by the FISH method, or the bcr-abl gene mRNA is detected by the RT-PCR method. Things have been done.

ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子は、２２番染色体上のｂｃｒ遺伝子領域と９番染色体上のａｂｌ遺伝子領域が両染色体長腕の転座によって融合して生じる融合（キメラ）遺伝子である。ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子の産物である融合タンパクＢＣＲ−ＡＢＬは、恒常的に活性化されたチロシンキナーゼであり、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ系等を介したアポトーシス抑制遺伝子ｂｃｌ−ｘｌの転写を促進するなど細胞の不死化を引き起こす。さらに、この融合タンパクはＤＮＡ修復を抑制するので、ゲノムが不安定となり、細胞はさらなる遺伝子異常を引き起こしやすくなる。これら一連のＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ活性が、慢性骨髄性白血病の病因とされている。   The bcr-abl gene is a fusion (chimeric) gene produced by fusing the bcr gene region on chromosome 22 and the abl gene region on chromosome 9 by translocation of the long arms of both chromosomes. The fusion protein BCR-ABL, which is the product of the bcr-abl gene, is a constitutively activated tyrosine kinase that promotes the transcription of the apoptosis-suppressing gene bcl-xl via the JAK-STAT system and the like, thereby immortalizing cells. Cause Furthermore, since this fusion protein suppresses DNA repair, the genome becomes unstable and the cells are more likely to cause further genetic abnormalities. A series of these BCR-ABL tyrosine kinase activities has been implicated in the pathogenesis of chronic myeloid leukemia.

本発明に関連して、近年、核酸間のハイブリダイゼーション反応を流路やキャピラリー（以下、これらを「マイクロ流路」とも称する）内で進行させる技術が提案されている。例えば、特許文献１には、ポリヌクレオチドの増幅を行う部分と、検出用オリゴヌクレオチドが固定されている多孔質層を有するハイブリダイゼーション部分とが、流路によって連結されているポリヌクレオチドの分析用部材が開示されている。また、特許文献２には、毛細管状の流路の内壁にプローブ化合物を固定して、被検ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションを進行させるポリヌクレオチドの分析方法が開示されている。   In connection with the present invention, in recent years, a technique has been proposed in which a hybridization reaction between nucleic acids proceeds in a channel or capillary (hereinafter also referred to as “microchannel”). For example, Patent Document 1 discloses a polynucleotide analysis member in which a polynucleotide amplification portion and a hybridization portion having a porous layer to which a detection oligonucleotide is fixed are connected by a flow path. Is disclosed. Patent Document 2 discloses a polynucleotide analysis method in which a probe compound is fixed to the inner wall of a capillary channel and hybridization proceeds with a test polynucleotide.

本発明者らは、特許文献３において、マイクロ流路内での目詰まりを防止し、内圧上昇を防止することが可能なマイクロ流路系を提供している。このマイクロ流路系は、標的核酸鎖に相補的な塩基配列を有し、捕捉鎖を多孔質担体に固相化した核酸分離用担体が充填されたものである（当該文献、請求項６参照）。   In the patent document 3, the present inventors provide a microchannel system capable of preventing clogging in a microchannel and preventing an increase in internal pressure. This microchannel system has a base sequence complementary to a target nucleic acid chain, and is filled with a nucleic acid separation carrier in which a capture strand is solid-phased on a porous carrier (see the document and claim 6). ).

特開２００５−１３０７９５号公報JP 2005-130795 A 特開２００４−１２１２２６号公報JP 2004-121226 A 特開２００９−２６８３８５号公報JP 2009-268385 A

上述のように、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子は慢性骨髄性白血病の病態において中心的な役割を果たしており、その遺伝子発現を検出することは慢性骨髄性白血病の診断及び治療のため非常に重要である。   As described above, the bcr-abl gene plays a central role in the pathology of chronic myelogenous leukemia, and detection of the gene expression is very important for diagnosis and treatment of chronic myelogenous leukemia.

そこで、本発明は、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡを簡便かつ高感度に検出するための技術を提供することを主な目的とする。   Therefore, the main object of the present invention is to provide a technique for detecting bcr-abl gene mRNA easily and with high sensitivity.

上記課題解決のため、本発明は、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡが含まれるサンプル液が通流され、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号１記載の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタによって保持された状態で充填された、核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路を提供する。
このマイクロ流路では、核酸分離用担体として光透過性を有するアガロースゲル担体を充填しているため、励起光や蛍光の遮断や反射、散乱を抑制できる。また、アガロースゲル担体を保持するためのフィルタを送液方向下流側にのみ配設しているため、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡを断片化していない状態で捕捉鎖に接触させることができる。
また、本発明は、上記マイクロ流路が形成され、マイクロ流路へのサンプル液の導入口と、マイクロ流路からのサンプル液の排出口と、が配設された核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ及びカラムを提供する。
さらに、本発明は、上記マイクロチップと、前記導入口に導入されるサンプル液を加熱する加熱部、及び／又はマイクロ流路内の温度を制御する温度制御部と、を備える核酸ハイブリダイゼーション装置をも提供する。 In order to solve the above-mentioned problem, the present invention allows a sample solution containing bcr-abl gene mRNA to flow, and a capture strand having a base sequence described in SEQ ID NO: 1 complementary to bcr-abl gene mRNA is immobilized. In addition, a microchannel for nucleic acid hybridization is provided in which the agarose gel carrier is filled in a state where the agarose gel carrier is held by a filter disposed on the downstream side of the sample solution in the liquid feeding direction.
Since this microchannel is filled with a light-transmitting agarose gel carrier as a nucleic acid separation carrier, it is possible to suppress blocking, reflection, and scattering of excitation light and fluorescence. Further, since the filter for holding the agarose gel carrier is disposed only on the downstream side in the liquid feeding direction, the bcr-abl gene mRNA can be brought into contact with the capture strand in a state where it is not fragmented.
The present invention also provides a microchip for nucleic acid hybridization in which the microchannel is formed, and an inlet for introducing a sample liquid into the microchannel and an outlet for discharging the sample liquid from the microchannel are provided. Provide a column.
Furthermore, the present invention provides a nucleic acid hybridization apparatus comprising the microchip, a heating unit that heats the sample solution introduced into the introduction port, and / or a temperature control unit that controls the temperature in the microchannel. Also provide.

併せて、本発明は、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号１記載の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタによって保持された状態で充填されたマイクロ流路に、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡを含むサンプル液を通流させる手順と、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号２記載の塩基配列を有する検出鎖を含む溶液を前記マイクロ流路に通流させる手順と、
を少なくとも含む核酸ハイブリダイゼーション方法を提供する。 In addition, according to the present invention, an agarose gel carrier on which a capture strand having a base sequence described in SEQ ID NO: 1 complementary to bcr-abl gene mRNA is solid-phased is disposed on the downstream side of the sample solution feeding direction. A sample solution containing bcr-abl gene mRNA is passed through the microchannel filled in a state held by the filter, and has a base sequence described in SEQ ID NO: 2 complementary to bcr-abl gene mRNA A procedure for passing a solution containing a detection strand through the microchannel;
A nucleic acid hybridization method comprising at least:

本発明により、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡを簡便かつ高感度に検出するための技術が提供される。 According to the present invention, a technique for detecting bcr-abl gene mRNA simply and with high sensitivity is provided.

本発明に係るマイクロ流路が形成された核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップの構成を説明する模式図である。（Ａ）は上面図、（Ｂ）は（Ａ）中Ｐ−Ｐ断面に対応する断面図である。It is a schematic diagram explaining the structure of the microchip for nucleic acid hybridization in which the microchannel based on this invention was formed. (A) is a top view, (B) is sectional drawing corresponding to PP cross section in (A). アガロースゲルビーズ２表面の物質構成を説明する模式図である。It is a schematic diagram explaining the substance structure of the agarose gel bead 2 surface. 本発明に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の手順を説明するフローチャートである。It is a flowchart explaining the procedure of the nucleic acid hybridization method which concerns on this invention. 本発明に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の各手順におけるアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を説明する模式図である。It is a schematic diagram explaining the substance structure of the agarose gel bead 2 surface in each procedure of the nucleic acid hybridization method which concerns on this invention. 本発明に係る核酸ハイブリダイゼーション装置の構成を説明する模式図である。It is a schematic diagram explaining the structure of the nucleic acid hybridization apparatus which concerns on this invention. 実施例１において核酸ハイブリダイゼーション方法の各手順における蛍光測定結果を示すスペクトログラムである。FIG. 2 is a spectrogram showing fluorescence measurement results in each procedure of the nucleic acid hybridization method in Example 1. FIG. 実施例２において核酸ハイブリダイゼーション方法の各手順で測定された蛍光強度値を示すグラフである。6 is a graph showing fluorescence intensity values measured in each procedure of the nucleic acid hybridization method in Example 2.

以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

１．核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路及びマイクロチップ
（１）核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ
（２）アガロースゲル担体
２．核酸ハイブリダイゼーション方法
（１）コンディショニング
（２）サンプル液の通流と洗浄
（３）検出鎖溶液の通流と洗浄
（４）検出
３．核酸ハイブリダイゼーション装置
DESCRIPTION OF EXEMPLARY EMBODIMENTS Hereinafter, preferred embodiments for carrying out the invention will be described with reference to the drawings. In addition, embodiment described below shows an example of typical embodiment of this invention, and, thereby, the range of this invention is not interpreted narrowly.

1. 1. Microchannel for nucleic acid hybridization and microchip (1) Microchip for nucleic acid hybridization (2) Agarose gel carrier 2. Nucleic acid hybridization method (1) Conditioning (2) Flow and washing of sample solution (3) Flow and washing of detection strand solution (4) Detection Nucleic acid hybridization device

１．核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路及びマイクロチップ
（１）核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ
図１は、本発明に係る核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路が形成された核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップの構成を説明する模式図である。図１（Ａ）は上面図、（Ｂ）は（Ａ）中Ｐ−Ｐ断面に対応する断面図である。 1. Nucleic Acid Hybridization Microchannel and Microchip (1) Nucleic Acid Hybridization Microchip FIG. 1 is a schematic diagram illustrating the configuration of a nucleic acid hybridization microchip in which a nucleic acid hybridization microchannel according to the present invention is formed. FIG. FIG. 1A is a top view, and FIG. 1B is a cross-sectional view corresponding to a PP cross section in FIG.

図中、符号１で示す核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ（以下、「マイクロチップ」と略記する）には、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡが含まれる溶液（以下、「サンプル液」と称する）が通流されるマイクロ流路１１が形成されている。符号１１１は、マイクロ流路１１へのサンプル液の導入口を示す。また、符号１１２は、マイクロ流路１１からのサンプル液の排出口を示す。導入口１１１から送液されたサンプル液は、マイクロ流路１１内を通流して排出口１１２から排液される。   In the figure, a solution (hereinafter referred to as “sample solution”) containing bcr-abl gene mRNA is passed through a microchip for nucleic acid hybridization (hereinafter abbreviated as “microchip”) denoted by reference numeral 1. A microchannel 11 is formed. Reference numeral 111 denotes an inlet for introducing the sample liquid into the microchannel 11. Reference numeral 112 denotes a sample liquid outlet from the microchannel 11. The sample liquid sent from the inlet 111 flows through the microchannel 11 and is discharged from the outlet 112.

マイクロ流路１１内には、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡを分離するための核酸分離用担体としてアガロースゲル担体（アガロースゲルビーズ）２が充填されている。アガロースゲル担体２のサンプル液送液方向下流側には、フィルタ１１３が配設されている。フィルタ１１３には細孔が形成されており、この細孔はサンプル液やサンプル液中のｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡや塩、界面活性剤等の物質を透過させるが、アガロースゲル担体２を通過させないような孔径とされている。これにより、フィルタ１１３は、マイクロ流路１１内に充填されたアガロースゲル担体２を保持して、流路内を通流するサンプル液とともにアガロースゲル担体２が排出口１１２から排出されるのを防止する。フィルタ１１３の細孔径は、アガロースゲル担体２の大きさに応じて適宜設計され得るが、例えば０．５〜２０μｍ程度、より好ましくは１０μｍ程度とされる。   The microchannel 11 is filled with an agarose gel carrier (agarose gel beads) 2 as a nucleic acid separation carrier for separating the bcr-abl gene mRNA. A filter 113 is disposed on the downstream side of the agarose gel carrier 2 in the sample liquid feeding direction. The filter 113 is formed with pores, which allow the sample liquid and substances such as bcr-abl gene mRNA, salt, and surfactant in the sample liquid to permeate but do not pass the agarose gel carrier 2. The hole diameter is assumed to be large. As a result, the filter 113 holds the agarose gel carrier 2 filled in the microchannel 11 and prevents the agarose gel carrier 2 from being discharged from the outlet 112 together with the sample liquid flowing through the channel. To do. The pore diameter of the filter 113 can be appropriately designed according to the size of the agarose gel carrier 2, and is, for example, about 0.5 to 20 μm, more preferably about 10 μm.

フィルタ１１３は、マイクロ流路１１内に充填されたアガロースゲル担体２の送液方向下流側のみに設けられ、上流側には配されていない。フィルタを上流側に設けた場合、アガロースゲル担体２をマイクロ流路１１内により安定的に保持することができる。しかし、サンプル液中に含まれるｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡがフィルタを通過する際に切断、断片化されてしまうおそれが生じる。ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡがアガロースゲル担体２と接触する前に断片化してしまうと、アガロースゲル担体２に固相化された捕捉鎖との間のハイブリダイゼーション反応の効率が低下する。   The filter 113 is provided only on the downstream side in the liquid feeding direction of the agarose gel carrier 2 filled in the microchannel 11, and is not disposed on the upstream side. When the filter is provided on the upstream side, the agarose gel carrier 2 can be stably held in the microchannel 11. However, there is a possibility that the bcr-abl gene mRNA contained in the sample solution may be cleaved and fragmented when passing through the filter. If the bcr-abl gene mRNA is fragmented before coming into contact with the agarose gel carrier 2, the efficiency of the hybridization reaction with the capture strand immobilized on the agarose gel carrier 2 decreases.

マイクロチップ１は、マイクロ流路１１が成形された基板層１ｂと、導入口１１１及び排出口１１２が形成された基板層１ａと、を貼り合せて構成されている。基板層１ａ，１ｂの材質は、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡの光学検出のため光透過性を有する材質とされ、例えばガラスや各種プラスチック（ＰＰ，ＰＣ，ＣＯＰ、ＰＤＭＳ）とされる。基板層１ａ，１ｂの材質は、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいために、光学誤差の少ない材質を選択することが好ましい。   The microchip 1 is configured by bonding a substrate layer 1b in which a microchannel 11 is formed and a substrate layer 1a in which an introduction port 111 and a discharge port 112 are formed. The material of the substrate layers 1a and 1b is a material having optical transparency for optical detection of the bcr-abl gene mRNA, for example, glass or various plastics (PP, PC, COP, PDMS). As the material of the substrate layers 1a and 1b, it is preferable to select a material having a small optical error since the self-fluorescence is small and the wavelength dispersion is small.

マイクロ流路１１等の基板層１ａ，１ｂへの成形は、ガラス製基板層のウェットエッチングやドライエッチングによって、またプラスチック製基板層のナノインプリントや射出成型、切削加工によって行うことができる。そして、マイクロ流路１１等を形成した基板層１ａ，１ｂを貼り合せることで、マイクロチップ１を形成できる。基板層の貼り合せは、例えば、熱融着、接着剤、陽極接合、粘着シートを用いた接合、プラズマ活性化結合、超音波接合等の公知の手法により行うことができる。なお、ここでは、マイクロチップ１にマイクロ流路１１を一つ設ける場合を例に説明するが、マイクロ流路１１の配設数は２以上としてもよい。   The formation of the microchannel 11 or the like into the substrate layers 1a and 1b can be performed by wet etching or dry etching of a glass substrate layer, or by nanoimprinting, injection molding, or cutting of a plastic substrate layer. And the microchip 1 can be formed by bonding the substrate layers 1a and 1b on which the microchannel 11 and the like are formed. The bonding of the substrate layers can be performed by a known method such as thermal fusion, adhesive, anodic bonding, bonding using an adhesive sheet, plasma activated bonding, ultrasonic bonding, or the like. Here, a case where one microchannel 11 is provided on the microchip 1 will be described as an example, but the number of microchannels 11 may be two or more.

（２）アガロースゲル担体
図２は、アガロースゲル担体２表面の物質構成を説明する模式図である。ここでは、アガロースゲル担体としてアガロースゲルビーズを用いる場合を例に説明する。 (2) Agarose gel carrier FIG. 2 is a schematic diagram for explaining a substance structure on the surface of the agarose gel carrier 2. Here, a case where agarose gel beads are used as an agarose gel carrier will be described as an example.

アガロースゲル担体（以下、「アガロースゲルビーズ」と称する）２の表面には、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡをビーズ上に捕捉するための捕捉鎖２１が固相化されている。捕捉鎖２１は、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡに対し相補的な配列番号１記載の塩基配列を有し、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡと相互作用して二本鎖（ハイブリッド）を形成する。相補鎖２１は、ＤＮＡやＲＮＡに加えて、これらのリボース部分の構造を改変して得られる核酸類似体（例えば、LNA（Locked Nucleic Acid））等からなるオリゴマーとされる。   On the surface of an agarose gel carrier (hereinafter referred to as “agarose gel beads”) 2, a capture chain 21 for capturing bcr-abl gene mRNA on the beads is immobilized. The capture strand 21 has a base sequence described in SEQ ID NO: 1 that is complementary to the bcr-abl gene mRNA, and interacts with the bcr-abl gene mRNA to form a double strand (hybrid). The complementary strand 21 is an oligomer composed of a nucleic acid analog (for example, LNA (Locked Nucleic Acid)) obtained by modifying the structure of these ribose moieties in addition to DNA and RNA.

捕捉鎖２１の塩基配列の長さ（塩基数）は、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列を有することにより、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡと相互作用して二本鎖を形成し得る限りにおいて、配列番号１よりも長くあるいは短くされてもよい。また、捕捉鎖２１は、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列を有している必要はなく、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとの二本鎖形成が可能な限りにおいて、配列番号１中に１塩基又は２塩基以上のミスマッチ（非相補塩基）を有していてもよい。捕捉鎖２１の塩基配列は、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとの解離温度（Ｔｍ）が、後述する検出鎖とｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとの解離温度と同程度となるように設計することが好ましい。   The length (number of bases) of the base sequence of the capture strand 21 has two base sequences that interact with the bcr-abl gene mRNA by having a base sequence complementary to at least a part of the base sequence of the bcr-abl gene mRNA. It may be longer or shorter than SEQ ID NO: 1 as long as it can form a chain. In addition, the capture strand 21 does not have to have a completely complementary base sequence to the base sequence of the bcr-abl gene mRNA, as long as double strand formation with the bcr-abl gene mRNA is possible, SEQ ID NO: 1 may have a mismatch (non-complementary base) of 1 base or 2 bases or more. The base sequence of the capture strand 21 is preferably designed so that the dissociation temperature (Tm) between the bcr-abl gene mRNA and the dissociation temperature between the later-described detection strand and the bcr-abl gene mRNA is the same.

アガロースゲルビーズ２表面への捕捉鎖２１の固相化は、従来公知の手法によって行うことができ、例えばアビジン−ビオチン結合やカップリング反応（ジアゾカップリング反応など）によって行うことができる。アビジン−ビオチン結合を利用する場合には、アガロースゲルビーズ２表面にストレプトアビジンを固定化し、末端にビオチンを修飾した捕捉鎖２１をアビジン−ビオチン間の結合によって固相化する。また、捕捉鎖２１の固相化は、本発明者らが上記特許文献３に開示するイオン交換結合による手法を採用してもよい。   The capture strand 21 can be immobilized on the surface of the agarose gel bead 2 by a conventionally known method, for example, by avidin-biotin bond or a coupling reaction (such as a diazo coupling reaction). When avidin-biotin bond is used, streptavidin is immobilized on the surface of the agarose gel bead 2, and the capture strand 21 whose end is modified with biotin is immobilized by binding between avidin and biotin. The capture strand 21 may be solid-phased by an ion exchange bonding technique disclosed by the present inventors in Patent Document 3 above.

以上では、本発明に係るマイクロ流路を核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップとして実施する場合を例に説明した。本発明に係るマイクロ流路は上記特許文献３に開示されるような核酸ハイブリダイゼーション用カラムとしても好適に実施可能である。   The case where the microchannel according to the present invention is implemented as a microchip for nucleic acid hybridization has been described above as an example. The microchannel according to the present invention can also be suitably implemented as a nucleic acid hybridization column as disclosed in Patent Document 3 above.

２．核酸ハイブリダイゼーション方法
図３は、本発明に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の手順を説明するフローチャートである。また、図４は、本発明に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の各手順におけるアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を説明する模式図である。 2. Nucleic Acid Hybridization Method FIG. 3 is a flowchart for explaining the procedure of the nucleic acid hybridization method according to the present invention. FIG. 4 is a schematic diagram for explaining a substance structure on the surface of the agarose gel beads 2 in each procedure of the nucleic acid hybridization method according to the present invention.

（１）コンディショニング
図３、ステップＳ１では、導入口１１１からハイブリダイゼーション反応用の緩衝液を導入しマイクロ流路１１内に通液させて、アガロースゲルビーズ２のコンディショニングを行う。コンディショニングは、マイクロ流路１１内の液体を置換し、脱気するために行われる。ステップＳ１におけるアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を図４（Ａ）に示す。 (1) Conditioning In FIG. 3, step S <b> 1, a buffer solution for hybridization reaction is introduced from the inlet 111 and is passed through the microchannel 11 to condition the agarose gel beads 2. Conditioning is performed to replace and deaerate the liquid in the microchannel 11. The substance structure on the surface of the agarose gel bead 2 in step S1 is shown in FIG.

（２）サンプル液の通流と洗浄
図３、ステップＳ２では、導入口１１１からサンプル液を導入しマイクロ流路１１内に通液させる。サンプル液は、骨髄細胞あるいは末梢血細胞から抽出したｍＲＮＡ溶液等とできる。本ステップでは、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡに対し相補的な塩基配列を有する捕捉鎖２１とｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとが二本鎖を形成し、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡがアガロースゲルビーズ２表面に捕捉される。 (2) Flow and cleaning of sample liquid In FIG. 3 and step S2, the sample liquid is introduced from the inlet 111 and allowed to flow into the microchannel 11. The sample solution can be an mRNA solution extracted from bone marrow cells or peripheral blood cells. In this step, the capture strand 21 having a base sequence complementary to the bcr-abl gene mRNA and the bcr-abl gene mRNA form a double strand, and the bcr-abl gene mRNA is captured on the surface of the agarose gel bead 2. .

ステップＳ２後のアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を、図４（Ｂ）に示す。図中、符号Ｔはサンプル液に含まれるｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡ、符号Ｎはｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡ以外の核酸鎖（非標的核酸鎖）を示す。   The substance structure on the surface of the agarose gel bead 2 after step S2 is shown in FIG. In the figure, symbol T represents bcr-abl gene mRNA contained in the sample solution, and symbol N represents a nucleic acid chain (non-target nucleic acid chain) other than bcr-abl gene mRNA.

サンプル液の導入は、ステップＳ１で用いたハイブリダイゼーション反応用の緩衝液を液相に用いて行うことが好ましく、より好ましくはアガロースが添加された前記緩衝液を液相に用いて行うことが好ましい。アガロース添加の液相を用いることで、マイクロ流路１１内のアガロースゲルビーズ２同士を緩やかに粘着させて安定させることができる。アガロースの液相への添加量は、０．０２〜０．２％程度、好ましくは０．０５％程度とされる。アガロース添加の液相は、本発明に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の各ステップにおいても用いることができる。   The introduction of the sample solution is preferably performed using the hybridization reaction buffer solution used in step S1 in the liquid phase, and more preferably using the buffer solution to which agarose has been added in the liquid phase. . By using an agarose-added liquid phase, the agarose gel beads 2 in the microchannel 11 can be gently adhered and stabilized. The amount of agarose added to the liquid phase is about 0.02 to 0.2%, preferably about 0.05%. The liquid phase added with agarose can also be used in each step of the nucleic acid hybridization method according to the present invention.

捕捉鎖２１とｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション反応用緩衝液の組成（例えば、塩や界面活性剤の濃度）やマイクロ流路１１内の温度を調整し、適当なハイブリッド形成条件下において行われる。ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡの自己ハイブリッド形成を抑制するため、サンプル液を予め加温してマイクロ流路１１内に導入することが有効である。また、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡの捕捉鎖２１への非特異的な吸着を抑制するため、サンプル液の通流時のマイクロ流路１１内を加温することが有効である。   The hybridization reaction between the capture strand 21 and the bcr-abl gene mRNA is carried out by adjusting the composition of the buffer for the hybridization reaction (for example, the concentration of the salt or surfactant) and the temperature in the microchannel 11 to obtain an appropriate hybrid. Performed under forming conditions. In order to suppress the self-hybridization of bcr-abl gene mRNA, it is effective to heat the sample solution in advance and introduce it into the microchannel 11. In addition, in order to suppress nonspecific adsorption of bcr-abl gene mRNA to the capture strand 21, it is effective to heat the inside of the microchannel 11 when the sample liquid flows.

サンプル液の通液後、導入口１１１から洗浄液を導入しマイクロ流路１１内に通液させ、アガロースゲルビーズ２の洗浄を行う。洗浄は、捕捉鎖２とｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとのハイブリッド形成が維持される条件にて行い、非標的核酸鎖と捕捉鎖２１に非特異的に吸着したｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとをマイクロ流路１１内から除去するために行う。   After passing the sample solution, the cleaning solution is introduced from the inlet 111 and is passed through the microchannel 11 to wash the agarose gel beads 2. The washing is performed under the condition that the hybridization between the capture strand 2 and the bcr-abl gene mRNA is maintained, and the non-target nucleic acid strand and the bcr-abl gene mRNA adsorbed non-specifically to the capture strand 21 are microchannels. 11 to remove from within.

（３）検出鎖溶液の通流と洗浄
続いて、図３、ステップＳ３では、アガロースゲルビーズ２表面に捕捉されたｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡを検出するための検出鎖溶液を導入口１１１からマイクロ流路１１内に導入する。本ステップでは、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡに対し相補的な配列番号２記載の塩基配列を有する検出鎖とｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとが二本鎖を形成し、捕捉鎖２１−ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡ−検出鎖のサンドイッチハイブリッドが形成される。なお、本ステップは、上記のステップＳ２と同時に行ってもよい。 (3) Flow and washing of detection strand solution Subsequently, in FIG. 3, step S3, a detection strand solution for detecting the bcr-abl gene mRNA captured on the surface of the agarose gel beads 2 is introduced from the inlet 111 into the microchannel. 11 is introduced. In this step, the detection strand having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 complementary to the bcr-abl gene mRNA and the bcr-abl gene mRNA form a double strand, and the capture strand 21-bcr-abl gene mRNA- A sandwich hybrid of detection strands is formed. In addition, you may perform this step simultaneously with said step S2.

検出鎖は、捕捉鎖２１と同様に、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡに対し相補的な塩基配列を有し、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡと相互作用して二本鎖を形成する。検出鎖も、ＤＮＡやＲＮＡ、核酸類似体等からなるオリゴマーとされる。また、検出鎖の塩基配列の長さ（塩基数）も、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列を有することにより、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡと相互作用し二本鎖を形成し得る限りにおいて、配列番号２よりも長くあるいは短くされてもよい。さらに、検出鎖は、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列を有している必要はなく、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとの二本鎖形成が可能な限りにおいて、配列番号２中に１塩基又は２塩基以上のミスマッチを有していてもよい。検出鎖の塩基配列は、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとの解離温度（Ｔｍ）が、捕捉鎖２１とｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとの解離温度と同程度となるように設計することが好ましい。   Similar to the capture strand 21, the detection strand has a base sequence complementary to the bcr-abl gene mRNA and interacts with the bcr-abl gene mRNA to form a double strand. The detection strand is also an oligomer composed of DNA, RNA, a nucleic acid analog or the like. The length (number of bases) of the base sequence of the detection strand also interacts with the bcr-abl gene mRNA by having a complementary base sequence to at least a part of the base sequence of the bcr-abl gene mRNA. It may be longer or shorter than SEQ ID NO: 2 as long as it can form a chain. Furthermore, the detection strand does not need to have a completely complementary base sequence to the base sequence of the bcr-abl gene mRNA, and the sequence is as long as double strand formation with the bcr-abl gene mRNA is possible. Number 2 may have a mismatch of 1 base or 2 bases or more. The base sequence of the detection strand is preferably designed so that the dissociation temperature (Tm) between the bcr-abl gene mRNA and the dissociation temperature between the capture strand 21 and the bcr-abl gene mRNA are the same.

検出鎖には、蛍光物質や化学発光物質、放射性物質などの標識物質Ｌが標識（ラベル）される。次に説明するステップＳ４において、これらの標識物質Ｌから発生する蛍光や発光、放射線を検知することで、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡの検出が行われる。   A labeling substance L such as a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or a radioactive substance is labeled (labeled) on the detection chain. In step S4 described below, bcr-abl gene mRNA is detected by detecting fluorescence, luminescence, and radiation generated from these labeling substances L.

ステップＳ３後のアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を、図４（Ｃ）に示す。図中、符号Ｄは検出鎖を示す。検出鎖Ｄの溶液をマイクロ流路１１内に通液すると、捕捉鎖２１とハイブリッドを形成するｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡ（符号Ｔ）に対し、さらに検出鎖Ｄがハイブリダイズする。これにより、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡ（符号Ｔ）は捕捉鎖２１及び検出鎖Ｄとハイブリッドを形成し、サンドイッチハイブリッド（ダブルハイブリッド）となる。   The substance structure on the surface of the agarose gel bead 2 after step S3 is shown in FIG. In the figure, symbol D indicates a detection chain. When the solution of the detection strand D is passed through the microchannel 11, the detection strand D is further hybridized to the bcr-abl gene mRNA (symbol T) that forms a hybrid with the capture strand 21. Thereby, bcr-abl gene mRNA (code | symbol T) forms a hybrid with the capture | acquisition strand 21 and the detection strand D, and becomes a sandwich hybrid (double hybrid).

検出鎖とｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション反応用緩衝液の組成（例えば、塩や界面活性剤の濃度）やマイクロ流路１１内の温度を調整し、適当なハイブリッド形成条件下において行われる。検出鎖のｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡへの非特異的な吸着を抑制するため、検出鎖溶液の通流時のマイクロ流路１１内を加温することが有効である。   The hybridization reaction between the detection strand and the bcr-abl gene mRNA is carried out by adjusting the composition of the hybridization reaction buffer (for example, the concentration of the salt or surfactant) and the temperature in the microchannel 11 to form an appropriate hybrid. Performed under conditions. In order to suppress nonspecific adsorption of the detection strand to the bcr-abl gene mRNA, it is effective to heat the inside of the microchannel 11 when the detection strand solution flows.

検出鎖溶液の通液後、導入口１１１から洗浄液を導入しマイクロ流路１１内に通液させ、アガロースゲルビーズ２の洗浄を行う。洗浄は、検出鎖とｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡとのハイブリッド形成が維持される条件にて行い、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡに非特異的に吸着した検出鎖をマイクロ流路１１内から除去するために行う。   After passing the detection chain solution, a washing solution is introduced from the introduction port 111 and is passed through the microchannel 11 to wash the agarose gel beads 2. The washing is performed under the condition that the hybridization between the detection strand and the bcr-abl gene mRNA is maintained, and the detection strand non-specifically adsorbed to the bcr-abl gene mRNA is removed from the microchannel 11. .

（４）検出
図３、ステップＳ４では、アガロースゲルビーズ２表面に捕捉されたｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡを、検出鎖に標識された標識物質から発生する蛍光や発光、放射線を検知することによって検出する。具体的には、例えば検出鎖に蛍光物質を標識した場合、アガロースゲルビーズ２に励起光を照射し、励起された蛍光物質から発生する蛍光を検知する。蛍光等の強度を測定すれば、蛍光強度等に基づいてｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡを定量的に検出することもできる。 (4) Detection In FIG. 3, step S4, the bcr-abl gene mRNA captured on the surface of the agarose gel bead 2 is detected by detecting fluorescence, luminescence, and radiation generated from the labeling substance labeled on the detection strand. Specifically, for example, when a fluorescent substance is labeled on the detection strand, the agarose gel beads 2 are irradiated with excitation light, and fluorescence generated from the excited fluorescent substance is detected. If the intensity of fluorescence or the like is measured, bcr-abl gene mRNA can be detected quantitatively based on the fluorescence intensity or the like.

本発明においては、核酸分離用担体として光透過性を有するアガロースゲルビーズ２を用いている。アガロースゲルビーズ２では、励起光を照射した際に、励起光がビーズによって遮断されたり、反射あるいは散乱されたりすることがないため、これを充填したマイクロ流路１１では励起光が深部にまで到達でき、発生する蛍光も強い。また、励起光の戻り光を少なくでき、光検出器のダイナミックレンジを広くとることができる。さらに、アガロースゲルビーズ２では、蛍光物質から発せられる蛍光が担体によって遮断されたり、反射あるいは散乱されたりすることがない。従って、励起光や蛍光が担体によって遮断されるために生じる蛍光検出強度の減衰やバックグラウンドの上昇を排除して、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡを高感度、高精度に検出できる。   In the present invention, light-transmitting agarose gel beads 2 are used as the nucleic acid separation carrier. In the agarose gel beads 2, when the excitation light is irradiated, the excitation light is not blocked, reflected, or scattered by the beads, so that the excitation light can reach the deep part in the microchannel 11 filled with the beads. The generated fluorescence is also strong. Further, the return light of the excitation light can be reduced, and the dynamic range of the photodetector can be widened. Furthermore, in the agarose gel beads 2, the fluorescence emitted from the fluorescent material is not blocked by the carrier, and is not reflected or scattered. Therefore, the bcr-abl gene mRNA can be detected with high sensitivity and high accuracy by eliminating the attenuation of the fluorescence detection intensity and the increase in background caused by the excitation light and fluorescence being blocked by the carrier.

３．核酸ハイブリダイゼーション装置
図５は、本発明に係る核酸ハイブリダイゼーション装置の構成を説明する模式図である。 3. Nucleic Acid Hybridization Device FIG. 5 is a schematic diagram illustrating the configuration of the nucleic acid hybridization device according to the present invention.

核酸ハイブリダイゼーション装置は、マクロチップ１と、マイクロチップ１のマイクロ流路１１内の温度を制御するヒートブロック１０３と、マイクロチップ１の導入口１１１に溶液を送液して排出口１１２から排液させる送液手段と、マイクロチップ１のマイクロ流路１１内に充填されたアガロースゲルビーズ２に励起光を照射し、発生する蛍光を検出するための光学検出手段と、を備えている。   The nucleic acid hybridization device sends the solution to the macrochip 1, the heat block 103 that controls the temperature in the microchannel 11 of the microchip 1, and the inlet 111 of the microchip 1, and drains from the outlet 112. And an optical detection means for irradiating the agarose gel beads 2 filled in the microchannel 11 of the microchip 1 with excitation light and detecting the generated fluorescence.

ヒートブロック１０３は、マイクロチップ１のマイクロ流路１１内を加熱又は冷却する温度制御部として機能する。ヒートブロック１０３は、上述のステップＳ３においてｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡの捕捉鎖２１への非特異的な吸着を抑制するため、サンプル液の通流時にマイクロ流路１１内を加温する。また、ヒートブロック１０３は、上述のステップＳ４において検出鎖のｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡへの非特異的な吸着を抑制するため、検出鎖溶液の通流時にもマイクロ流路１１内を加温する。なお、ヒートブロック１０３は、通常使用されるヒーターであってよく、ペルチェ素子やジュール・トムソン素子等に置換してもよい。ヒートブロック１０３の温度は例えば６０℃とされる。   The heat block 103 functions as a temperature control unit that heats or cools the inside of the microchannel 11 of the microchip 1. The heat block 103 heats the inside of the microchannel 11 during the flow of the sample solution in order to suppress nonspecific adsorption of the bcr-abl gene mRNA to the capture strand 21 in step S3 described above. The heat block 103 also heats the inside of the microchannel 11 during the flow of the detection strand solution in order to suppress nonspecific adsorption of the detection strand to the bcr-abl gene mRNA in step S4 described above. The heat block 103 may be a commonly used heater and may be replaced with a Peltier element, a Joule-Thomson element, or the like. The temperature of the heat block 103 is 60 ° C., for example.

送液手段は、通常使用されるポンプやシリンジポンプ、チューブやバルブ等によって構成できる。送液手段には、導入口１１１に導入されるサンプル液を加熱する加熱部としてインラインヒーター１０２が含まれる。インラインヒーター１０２は、上述のステップＳ２においてｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡの自己ハイブリッド形成を抑制するため、サンプル液を予め加温してマイクロ流路１１内に導入する。インラインヒーター１０２における加熱（熱変性）後、マイクロ流路１１のアガロースゲルビーズ２の充填領域まで送液される間に、サンプル液を急冷させることで、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡの自己ハイブリッド形成を抑制できる。インラインヒーター１０２の温度は例えば９５℃とされる。   The liquid feeding means can be constituted by a commonly used pump, syringe pump, tube, valve or the like. The liquid feeding means includes an in-line heater 102 as a heating unit that heats the sample liquid introduced into the introduction port 111. The in-line heater 102 preheats the sample solution and introduces it into the microchannel 11 in order to suppress the self-hybridization of the bcr-abl gene mRNA in the above-described step S2. After heating (thermal denaturation) in the in-line heater 102, the sample solution is rapidly cooled while being sent to the filling region of the agarose gel beads 2 in the microchannel 11, whereby self-hybridization of the bcr-abl gene mRNA can be suppressed. . The temperature of the in-line heater 102 is 95 ° C., for example.

光学検出手段は、励起光光源と、マイクロ流路１１内に充填されたアガロースゲルビーズ２に対して励起光を集光・照射する集光レンズやダイクロイックミラー、バンドパスフィルター等からなる照射系と、励起光の照射によって検出鎖に標識された蛍光物質から発生する蛍光を検出する検出系と、によって構成される。検出系は、例えば、PMT（photo multiplier tube）や、CCDやCMOS素子等のエリア撮像素子等によって構成される。なお、図では、光学検出手段として集光レンズ１０１のみを示している。また、図では、照射系と検出系を同一の光学経路により構成した場合を示したが、照射系と検出系は別個の光学経路により構成してもよい。   The optical detection means includes an excitation light source, an irradiation system including a condenser lens, a dichroic mirror, a bandpass filter, and the like that collects and irradiates excitation light to the agarose gel beads 2 filled in the microchannel 11; And a detection system that detects fluorescence generated from the fluorescent substance labeled on the detection chain by irradiation of excitation light. The detection system includes, for example, a PMT (photo multiplier tube), an area imaging device such as a CCD or a CMOS device, or the like. In the figure, only the condensing lens 101 is shown as the optical detection means. In the figure, the irradiation system and the detection system are configured by the same optical path, but the irradiation system and the detection system may be configured by separate optical paths.

＜実施例１＞
１．ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子断片の合成
ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子の一部と同一の塩基配列（配列番号３参照）を有する合成オリゴヌクレオチドを合成した。また、この合成オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有する捕捉鎖と検出鎖を合成した（「表３」参照）。捕捉鎖と検出鎖は、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子の塩基配列において重複しない領域に相補的となるように設計した。捕捉鎖の３´末端はビオチン化した。また、検出鎖の５´末端を蛍光色素（Ｃｙ３）により標識した。捕捉鎖及び検出鎖の解離温度（Tm）は、いずれも８０℃と計算された。 <Example 1>
1. Synthesis of bcr-abl gene fragment A synthetic oligonucleotide having the same base sequence (see SEQ ID NO: 3) as a part of the bcr-abl gene was synthesized. In addition, a capture strand and a detection strand having a base sequence complementary to the synthetic oligonucleotide were synthesized (see “Table 3”). The capture strand and the detection strand were designed to be complementary to a non-overlapping region in the base sequence of the bcr-abl gene. The 3 ′ end of the capture strand was biotinylated. Further, the 5 ′ end of the detection strand was labeled with a fluorescent dye (Cy3). The dissociation temperature (Tm) of the capture strand and the detection strand was calculated to be 80 ° C.

２．アガロースゲルビーズへの捕捉鎖の固相化
表面にストレプトアビジンが固定されたアガロースゲルビーズ懸濁液（Streptavidin Agarose Resin，Thermo Scientific）と捕捉鎖溶液を混合し、ストレプトアビジン−ビオチン結合によってアガロースゲルビーズ表面に捕捉鎖を固相化した。 2. Immobilization of capture strand on agarose gel beads Mixing agarose gel bead suspension (Streptavidin Agarose Resin, Thermo Scientific) with streptavidin immobilized on the surface and capture strand solution, and capture on the agarose gel bead surface by streptavidin-biotin binding The chain was immobilized.

３．核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップの作製
ガラス製マイクロチップに形成した流路（断面縦幅0.5 mm、横幅0.5 mm、流路長60 mm）内に、孔径１０μｍのフィルタを装着した。アガロースゲルビーズを流路に注入し、充填した。流路内のアガロースゲルビーズ充填領域の長さは３０ｍｍ程度とした。流路に流路切換バルブとシリンジポンプを配管した。 3. Production of Microchip for Nucleic Acid Hybridization A filter having a pore diameter of 10 μm was mounted in a channel (cross-sectional height 0.5 mm, width 0.5 mm, channel length 60 mm) formed on a glass microchip. Agarose gel beads were injected into the channel and filled. The length of the agarose gel bead filling region in the flow path was about 30 mm. A flow path switching valve and a syringe pump were piped in the flow path.

４．核酸ハイブリダイゼーション装置の構成
マイクロチップの流路と流路切換バルブとの間に、印加電圧制御により温度調節が可能なインラインヒーターを配管した。マイクロチップは、ヒートブロック上に設置した。 4). Configuration of Nucleic Acid Hybridization Device An in-line heater capable of adjusting the temperature by controlling the applied voltage was provided between the microchip channel and the channel switching valve. The microchip was placed on a heat block.

５．測定
合成オリゴヌクレオチドと検出鎖を0.05 % アガロースと0.2 % SDSを含有する0.3 M 塩化ナトリウム水溶液に溶解し，サンプル液を調製した。サンプル液３５０μlには、ｍＲＮＡと検出鎖がそれぞれ2 μg，3 μg含まれた。 5. Measurement The synthetic oligonucleotide and the detection strand were dissolved in a 0.3 M sodium chloride aqueous solution containing 0.05% agarose and 0.2% SDS to prepare a sample solution. 350 μl of the sample solution contained 2 μg and 3 μg of mRNA and detection strand, respectively.

インラインヒーター及びヒートブロックを６０℃に設定した。ハイブリッド形成液（0.05 %アガロース, 0.2 %SDS含有0.3 M塩化ナトリウム溶液）を流路に送液し、アガロースゲルビーズのコンディショニングを行い、蛍光測定を行った。送液速度は５０μｌ／分とした。流路を観察したところ、アガロースゲルビーズ間の粘着が見られ、アガロースゲルビーズは流路内に安定して保持されていた。   The in-line heater and heat block were set at 60 ° C. Hybridization solution (0.05% agarose, 0.2 M SDS-containing 0.3 M sodium chloride solution) was sent to the flow path, agarose gel beads were conditioned, and fluorescence measurement was performed. The liquid feeding speed was 50 μl / min. When the flow path was observed, adhesion between the agarose gel beads was observed, and the agarose gel beads were stably held in the flow path.

サンプル液３００μｌを送液し、捕捉鎖と合成オリゴヌクレオチドと検出鎖のサンドイッチハイブリダイゼーションを行った。洗浄液（0.05 %アガロース, 0.2 %SDS含有0.3 M塩化ナトリウム溶液）を０．８ｍｌ送液し、蛍光測定を行った。送液速度は５０μｌ／分とした。   300 μl of the sample solution was fed, and sandwich hybridization of the capture strand, the synthetic oligonucleotide, and the detection strand was performed. 0.8 ml of a cleaning solution (0.05% agarose, 0.2% SDS-containing 0.3 M sodium chloride solution) was fed and fluorescence measurement was performed. The liquid feeding speed was 50 μl / min.

次に、インラインヒーターを９５℃、ヒートブロックを８０℃に昇温し、液相を純水に変更して０．８ｍｌ送液することにより、ハイブリッドを解離（変性）させた。変性操作後に蛍光測定を行った。   Next, the hybrid was dissociated (denatured) by raising the temperature of the inline heater to 95 ° C. and the temperature of the heat block to 80 ° C., changing the liquid phase to pure water and feeding 0.8 ml. Fluorescence measurement was performed after the denaturation operation.

コンディショニング後（Ａ）、サンプル液及び洗浄液の送液後（Ｂ）、及び変性操作後（Ｃ）の蛍光測定結果を図６に示す。コンディショニング後（Ａ）に比べて、サンプル液及び洗浄液の送液後（Ｂ）の蛍光強度が増大していることから、捕捉鎖と合成オリゴヌクレオチドと検出鎖のサンドイッチハイブリッドの形成が確認される。また、変性操作後（Ｃ）、蛍光強度が減少したことから、上記の蛍光強度の増大が、捕捉鎖と合成オリゴヌクレオチドと検出鎖の特異的なハイブリダイゼーションによるものであり、非特異的な吸着によるものではないことが確認できた。   FIG. 6 shows the fluorescence measurement results after conditioning (A), after feeding the sample solution and the washing solution (B), and after the denaturation operation (C). Since the fluorescence intensity after the feeding of the sample solution and the washing solution (B) is increased as compared with that after conditioning (A), formation of a sandwich hybrid of the capture strand, the synthetic oligonucleotide and the detection strand is confirmed. In addition, after the denaturation operation (C), the fluorescence intensity decreased, and thus the increase in fluorescence intensity was due to specific hybridization of the capture strand, the synthetic oligonucleotide and the detection strand, and nonspecific adsorption. It was confirmed that it was not due to.

＜実施例２＞
１．ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡ、捕捉鎖、検出鎖の合成
ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子をクローニングし、ｃＤＮＡからｍＲＮＡを合成した。捕捉鎖及び検出鎖には実施例１と同じものを用いた。捕捉鎖及び検出鎖は、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有する <Example 2>
1. Synthesis of bcr-abl gene mRNA, capture strand, and detection strand The bcr-abl gene was cloned and mRNA was synthesized from cDNA. The same capture strand and detection strand as in Example 1 were used. The capture strand and the detection strand have a base sequence complementary to the bcr-abl gene mRNA.

２．アガロースゲルビーズへの捕捉鎖の固相化
実施例１と同様にして行った。 2. Immobilization of capture strand on agarose gel beads The same procedure as in Example 1 was performed.

３．核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップの作製
流路（流路幅0.5 mm，流路深さ0.5 mm，流路長24 mm）を切ったテフロン（登録商標）基板を２枚のアクリル基板で挟んで積層したマイクロチップを用意し、流路下流側に孔径１０μｍのフィルタを装着した。アガロースゲルビーズを流路に注入し、充填した。流路内のアガロースゲルビーズ充填領域の長さは２０ｍｍ程度とした。流路に流路切換バルブとシリンジポンプを配管した。 3. Fabrication of microchip for nucleic acid hybridization A Teflon (registered trademark) substrate with a flow channel (flow channel width 0.5 mm, flow channel depth 0.5 mm, flow channel length 24 mm) cut between two acrylic substrates was stacked. A microchip was prepared, and a filter having a pore diameter of 10 μm was attached to the downstream side of the flow path. Agarose gel beads were injected into the channel and filled. The length of the agarose gel bead filling region in the flow path was about 20 mm. A flow path switching valve and a syringe pump were piped in the flow path.

４．核酸ハイブリダイゼーション装置の構成
実施例１と同様の構成とした。 4). Configuration of Nucleic Acid Hybridization Device The configuration was the same as in Example 1.

緑色ＬＥＤ光源を用意し、Ｃｙ３励起用フィルタと組み合わせて、Ｃｙ３の励起光源とした。分光器を用意し、Ｃｙ３蛍光用フィルタと組み合わせて、Ｃｙ３の蛍光検出器とした。２つの光ファイバを同軸にバンドルした光ファイバケーブルを用意し、励起光用光ファイバを励起光源に、受光用光ファイバを蛍光検出器に結線した。光ファイバケーブルの先端に設けた対物レンズを、流路内のアガロースゲルビーズに対向させた。これにより、流路内に充填されたアガロースゲルビーズに励起光を照射し、発生する蛍光を検出する光学系を構成した。なお、励起光の照射スポット径は５００μｍとした。   A green LED light source was prepared and combined with a Cy3 excitation filter to provide a Cy3 excitation light source. A spectroscope was prepared and combined with a Cy3 fluorescence filter to obtain a Cy3 fluorescence detector. An optical fiber cable in which two optical fibers were bundled coaxially was prepared, and the optical fiber for excitation light was connected to the excitation light source, and the optical fiber for reception was connected to the fluorescence detector. An objective lens provided at the tip of the optical fiber cable was opposed to the agarose gel beads in the flow path. Thereby, the optical system which detects the fluorescence which irradiates excitation light to the agarose gel bead with which it filled in the flow path, and comprised was comprised. The irradiation spot diameter of the excitation light was 500 μm.

５．測定
ｍＲＮＡと検出鎖を0.2% SDS、0.3 M 塩化ナトリウム水溶液に溶解し，サンプル液を調製した。サンプル液３５０μlには、ｍＲＮＡと検出鎖がそれぞれ5.6 μg，3 μg含まれた。 5. Measurement The mRNA and detection strand were dissolved in 0.2% SDS, 0.3 M sodium chloride aqueous solution to prepare a sample solution. 350 μl of the sample solution contained 5.6 μg and 3 μg of mRNA and detection strand, respectively.

インラインヒーターを９５℃、ヒートブロックを６０℃に設定し，0.2% SDS、0.3 M 塩化ナトリウム水溶液を流路に送液し、アガロースゲルビーズのコンディショニングを行い、蛍光測定を行った。送液速度は５０μｌ／分とした。   The in-line heater was set to 95 ° C., the heat block was set to 60 ° C., 0.2% SDS, 0.3 M sodium chloride aqueous solution was fed into the flow path, the agarose gel beads were conditioned, and the fluorescence measurement was performed. The liquid feeding speed was 50 μl / min.

サンプル液３００μｌを送液し、捕捉鎖とｍＲＮＡと検出鎖のサンドイッチハイブリダイゼーションを行った。0.2% SDS、0.3 M 塩化ナトリウム水溶液を２．１ｍｌ送液して洗浄し、蛍光測定を行った。   300 μl of the sample solution was fed, and sandwich hybridization of the capture strand, mRNA and detection strand was performed. 2.1 ml of 0.2% SDS and 0.3 M sodium chloride aqueous solution was fed and washed, and fluorescence measurement was performed.

次に、ヒートブロックを８０℃に昇温し、液相を純水に変更して１．８ｍｌ送液することにより、ハイブリッドを解離（変性）させた。変性操作後に蛍光測定を行った。   Next, the temperature of the heat block was raised to 80 ° C., the liquid phase was changed to pure water, and 1.8 ml of liquid was fed to dissociate (denature) the hybrid. Fluorescence measurement was performed after the denaturation operation.

コンディショニング後（Ａ）、サンプル液及び洗浄液の送液後（Ｂ）、変性操作後（Ｃ）の蛍光測定結果を図７に示す。コンディショニング後（Ａ）に比べて、サンプル液及び洗浄液の送液後（Ｂ）の蛍光強度が増大していることから、捕捉鎖とｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡと検出鎖のサンドイッチハイブリッドの形成が確認される。また、変性操作後（Ｃ）、蛍光強度が減少したことから、上記の蛍光強度の増大が、捕捉鎖とｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡと検出鎖の特異的なハイブリダイゼーションによるものであり、非特異的な吸着によるものではないことが確認できた。   FIG. 7 shows the fluorescence measurement results after conditioning (A), after feeding the sample solution and washing solution (B), and after denaturation operation (C). Since the fluorescence intensity after feeding the sample solution and the washing solution (B) is higher than after conditioning (A), the formation of a sandwich hybrid of the capture strand, bcr-abl gene mRNA and detection strand was confirmed. The In addition, after the denaturation operation (C), the fluorescence intensity decreased, and thus the increase in the fluorescence intensity was due to specific hybridization of the capture strand, the bcr-abl gene mRNA and the detection strand, and was non-specific. It was confirmed that it was not due to a simple adsorption.

本発明に係る核酸ハイブリダイゼーション用のマイクロ流路等によれば、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡを簡便かつ高感度に検出できる。従って、本発明は、慢性骨髄性白血病の診断及び治療を目的としたｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子の発現検出のため有用である。   According to the microchannel for nucleic acid hybridization and the like according to the present invention, bcr-abl gene mRNA can be detected easily and with high sensitivity. Therefore, the present invention is useful for detecting the expression of the bcr-abl gene for the purpose of diagnosis and treatment of chronic myelogenous leukemia.

１：マイクロチップ、１ａ，１ｂ：基板層、１０１：対物レンズ、１０２：インラインヒーター、１０３：ヒートブロック、１１：マイクロ流路、１１１：導入口、１１２：排出口、１１３：フィルタ、２：アガロースゲルビーズ、２１：捕捉鎖、Ｄ：検出鎖、Ｌ：標識物質、Ｎ：非標的核酸鎖、Ｔ：ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡ 1: Microchip, 1a, 1b: Substrate layer, 101: Objective lens, 102: Inline heater, 103: Heat block, 11: Micro flow path, 111: Inlet, 112: Discharge, 113: Filter, 2: Agarose Gel beads, 21: capture strand, D: detection strand, L: labeling substance, N: non-target nucleic acid strand, T: bcr-abl gene mRNA

Claims (5)

ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡが含まれるサンプル液が通流され、
ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号１記載の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタによって保持された状態で充填された、核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路。 a sample solution containing bcr-abl gene mRNA is passed through,
A state in which an agarose gel carrier on which a capture strand having a base sequence described in SEQ ID NO: 1 complementary to bcr-abl gene mRNA is immobilized is held by a filter disposed on the downstream side of the sample solution feeding direction A microchannel for nucleic acid hybridization, filled with 請求項１記載のマイクロ流路が形成され、
マイクロ流路へのサンプル液の導入口と、マイクロ流路からのサンプル液の排出口と、が配設された核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ。 A microchannel according to claim 1 is formed,
A nucleic acid hybridization microchip in which a sample liquid introduction port to a microchannel and a sample liquid discharge port from the microchannel are arranged. 請求項２記載のマイクロチップと、
前記導入口に導入されるサンプル液を加熱する加熱部、及び／又はマイクロ流路内の温度を制御する温度制御部と、を備える核酸ハイブリダイゼーション装置。 A microchip according to claim 2;
A nucleic acid hybridization apparatus comprising: a heating unit that heats a sample solution introduced into the introduction port; and / or a temperature control unit that controls a temperature in a microchannel. ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号１記載の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタによって保持された状態で充填されたマイクロ流路に、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡを含むサンプル液を通流させる手順と、
ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号２記載の塩基配列を有する検出鎖を含む溶液を前記マイクロ流路に通流させる手順と、
を少なくとも含む核酸ハイブリダイゼーション方法。 A state in which an agarose gel carrier on which a capture strand having a base sequence described in SEQ ID NO: 1 complementary to bcr-abl gene mRNA is immobilized is held by a filter disposed on the downstream side of the sample solution feeding direction Passing the sample solution containing bcr-abl gene mRNA through the microchannel filled with
a procedure for allowing a solution containing a detection strand having the base sequence of SEQ ID NO: 2 complementary to bcr-abl gene mRNA to flow through the microchannel;
A nucleic acid hybridization method comprising at least 請求項１記載のマイクロ流路が形成され、
マイクロ流路へのサンプル液の導入口と、マイクロ流路からのサンプル液の排出口と、が配設された核酸ハイブリダイゼーション用カラム。 A microchannel according to claim 1 is formed,
A nucleic acid hybridization column provided with an inlet for introducing a sample liquid into a microchannel and an outlet for discharging a sample liquid from the microchannel.

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