JP5034438B2

JP5034438B2 - Channel system and hybridization detection apparatus

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Publication number: JP5034438B2
Application number: JP2006285776A
Authority: JP
Inventors: 通博大西
Original assignee: Sony Corp
Current assignee: Sony Corp
Priority date: 2006-10-20
Filing date: 2006-10-20
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2026-10-20
Also published as: JP2008102053A

Description

本発明は、ハイブリダイゼーション検出に係わる技術に関する。より詳しくは、流路系内でハイブリダイゼーションを進行させ、これを検出する技術に関する。 The present invention relates to a technique related to hybridization detection. More specifically, the present invention relates to a technology for detecting and detecting hybridization in a flow path system.

近年、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析、遺伝子ネットワーク解明等に利用され得るバイオアッセイ技術の開発が進んでいる。例えば、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれる集積基板を用いた方法が挙げられる。 In recent years, development of bioassay techniques that can be used for gene mutation analysis, SNPs (single nucleotide polymorphism) analysis, gene expression frequency analysis, gene network elucidation, and the like has progressed. For example, a method using an integrated substrate called a so-called DNA chip or a DNA microarray (hereinafter collectively referred to as “DNA chip” in the present application) can be mentioned.

このＤＮＡチップやタンパク質を集積したプロテインチップなどに代表されるようなセンサーチップ技術は、検出用物質（プローブと称されることが多い。）とターゲット物質との間の特異的な相互作用を利用して、ターゲット物質の含有量、構成成分、機能等を調べる方法である。 Sensor chip technology represented by DNA chips and protein-integrated protein chips utilizes a specific interaction between a detection substance (often referred to as a probe) and a target substance. In this way, the content, constituent components, functions, etc. of the target substance are examined.

最近では、検出用物質とターゲット物質との間の特異的な相互作用を、流路やキャピラリーを利用して行う技術が提案されている。例えば、特許文献１には、ポリヌクレオチドの増幅を行う部分と、検出用オリゴヌクレオチドが固定されている多孔質層を有するハイブリダイゼーション部分とが、流路によって連結されているポリヌクレオチドの分析用部材が開示されている。 Recently, a technique has been proposed in which a specific interaction between a detection substance and a target substance is performed using a channel or a capillary. For example, Patent Document 1 discloses a polynucleotide analysis member in which a polynucleotide amplification portion and a hybridization portion having a porous layer to which a detection oligonucleotide is fixed are connected by a flow path. Is disclosed.

特許文献２には、毛細管状の流路の内壁にプローブ化合物を固定して、被検ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションを進行させるポリヌクレオチドの分析方法が開示されている。 Patent Document 2 discloses a method for analyzing a polynucleotide in which a probe compound is immobilized on the inner wall of a capillary channel and hybridization proceeds with a test polynucleotide.

特許文献３には、５種の異なるＤＮＡプローブが担持された各マイクロビーズを、マイクロアレイ容器の流路に充填し、検体とビーズに固定されたＤＮＡプローブとの間で選択的にハイブリダイゼーションを形成させる方法が開示されている。
特開２００５−１３０７９５号公報。特開２００４−１２１２２６号公報。特開２００２−３０３６２７号公報。 In Patent Document 3, each microbead carrying five different DNA probes is filled in the flow path of the microarray container, and hybridization is selectively formed between the sample and the DNA probe fixed to the bead. Is disclosed.
Japanese Patent Laying-Open No. 2005-130795. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-121226. JP 2002-303627 A.

上記のように、流路やキャピラリーなどの細い流路内において、ハイブリット形成を進行させる場合、反応効率をよくするために多孔質のマイクロビーズを用いることが多い。しかし、多孔質のマイクロビーズを用いると、送液中のターゲット核酸が多孔質マイクロビーズに吸着することがある。そのため、ターゲット検出の際、マイクロビーズに固定された核酸鎖とのハイブリット形成なのか、多孔質マイクロビーズへの吸着なのかの区別が困難となる。 As described above, when the formation of hybrids proceeds in a narrow channel such as a channel or a capillary, porous microbeads are often used in order to improve reaction efficiency. However, when porous microbeads are used, the target nucleic acid being fed may be adsorbed onto the porous microbeads. Therefore, at the time of target detection, it is difficult to distinguish between hybridization with a nucleic acid chain fixed to microbeads and adsorption to porous microbeads.

また、ターゲット核酸が多孔質マイクロビーズに吸着してしまうと、マイクロビーズ上の核酸鎖にターゲット核酸が十分な濃度や量で行き届かず、反応効率が低下するばかりか、反応条件が不安定となる問題もあった。 In addition, if the target nucleic acid is adsorbed to the porous microbeads, the target nucleic acid does not reach the nucleic acid strand on the microbeads at a sufficient concentration or amount, which not only reduces the reaction efficiency but also makes the reaction conditions unstable. There was also a problem.

そこで、本発明は、多孔質マイクロビーズへの核酸の吸着を防止し、反応効率の上昇、及び反応条件を安定させることを主目的とする。 Therefore, the main object of the present invention is to prevent the adsorption of nucleic acids to the porous microbeads, increase the reaction efficiency, and stabilize the reaction conditions.

本願発明者は、前記課題を解決するために、充填するビーズの好適な条件などについて鋭意研究した結果、反応効率を上昇させ、かつ反応条件を安定させることが可能な新規流路系などを見出した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventor has intensively studied suitable conditions for beads to be filled, and as a result, has found a novel flow path system capable of increasing reaction efficiency and stabilizing reaction conditions. It was.

本発明では、ビーズが充填された細管からなる流路系であって、核酸鎖が固定されているハイブリット形成用ビーズと、カチオン性イオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズと、が少なくとも充填されたカラム層を有する流路系を提供する。 In the present invention, the flow path system is composed of a capillary tube filled with beads, and is filled with at least a hybrid-forming bead on which a nucleic acid chain is fixed and a porous microbead having a cationic ion exchange capacity. A flow path system having a column layer is provided.

前記多孔質マイクロビーズは、カチオン性イオン交換能を持つものであれば特に限定されないが、好適な一例としては、パフュージョンクロマトグラフィー粒子が挙げられる。 The porous microbeads are not particularly limited as long as they have a cationic ion exchange capacity, but a suitable example includes perfusion chromatography particles.

前記ハイブリット形成用ビーズ上では、固定された前記核酸鎖と、ターゲット核酸とが相補結合するハイブリット形成を進行させることができる。 On the hybrid-forming bead, hybrid formation in which the immobilized nucleic acid chain and the target nucleic acid are complementarily bonded can proceed.

前記核酸鎖を、同種塩基配列を有するリンカーとすれば、前記ハイブリット形成用ビーズ上では、固定された該リンカーとターゲット核酸とが相補結合する第１ハイブリット形成と、該ターゲット核酸の一本鎖部分と送液中のプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成と、を進行させることもできる。 If the nucleic acid chain is a linker having the same base sequence, a first hybrid formation in which the immobilized linker and the target nucleic acid are complementarily bonded on the hybrid forming bead, and a single-stranded portion of the target nucleic acid. And the formation of the second hybrid in which the probe nucleic acid in the solution is complementarily bound can be allowed to proceed.

前記リンカーの同種塩基配列の一例としては、ポリＴ又はポリＵ等が挙げられる。この場合、流路系内のハイブリット形成用ビーズ上では、該ポリＴ又はポリＵと全ＲＮＡサンプル中のポリＡテール部分を有するｍＲＮＡとが相補結合する第１ハイブリット形成と、該ｍＲＮＡと送液中のプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成と、を進行させることができる。 An example of the same base sequence of the linker includes poly-T or poly-U. In this case, the first hybrid formation in which the poly-T or poly-U and mRNA having the poly-A tail portion in the total RNA sample are complementary-bonded on the hybrid-forming bead in the flow path system, and the mRNA and the liquid supply The second hybrid formation in which the probe nucleic acid therein is complementarily bound can proceed.

本発明に係る流路系は、前記ハイブリット形成用ビーズが少なくとも充填されている反応部と、前記多孔質マイクロビーズが充填されている送液促進部と、が順に層をなすように形成してもよい。一例を挙げると、前記反応部と、前記反応部の上流領域に設けられた前記送液促進部と、前記反応部の下流領域に設けられた前記送液促進部と、からなる３層構造となるように形成することができる。 The flow path system according to the present invention is formed such that the reaction portion filled with at least the hybrid-forming beads and the liquid feeding promotion portion filled with the porous microbeads are sequentially layered. Also good. As an example, a three-layer structure including the reaction section, the liquid feeding promotion section provided in the upstream area of the reaction section, and the liquid feeding promotion section provided in the downstream area of the reaction section, Can be formed.

また、本発明に係る流路系は、前記ハイブリット形成用ビーズと、前記多孔質マイクロビーズと、を混合充填して形成してもよい。 The flow path system according to the present invention may be formed by mixing and filling the hybrid forming beads and the porous microbeads.

さらに、本発明に係る流路系は、前記ハイブリット形成ビーズと前記多孔質マイクロビーズとが混合充填されている反応部と、前記多孔質マイクロビーズが充填されている送液促進部と、が順に層をなすように形成してもよい。一例を挙げると、前記反応部と、前記反応部の上流領域に設けられた前記送液促進部と、前記反応部の下流領域に設けられた前記送液促進部と、からなる３層構造となるように形成することができる。 Furthermore, in the flow path system according to the present invention, the reaction part in which the hybrid-forming beads and the porous microbeads are mixed and packed, and the liquid feeding promotion part in which the porous microbeads are filled are in order. You may form so that a layer may be made. As an example, a three-layer structure including the reaction section, the liquid feeding promotion section provided in the upstream area of the reaction section, and the liquid feeding promotion section provided in the downstream area of the reaction section, Can be formed.

本発明に係る流路系に送液する全溶液は、界面活性作用及び核酸分解酵素失活作用を有する物質を同濃度含む溶液が望ましい。前記物質の一例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を挙げることができる。 The total solution fed to the flow path system according to the present invention is preferably a solution containing the same concentration of a substance having a surface activity and a nuclease deactivation activity. An example of the substance is sodium dodecyl sulfate (SDS).

本発明に係る流路系は、ハイブリダイゼーション検出装置に用いることができる。例えば、本発明に係る流路系と、前記ハイブリット形成用ビーズ上におけるハイブリット形成を検出する検出部と、を少なくとも備えるハイブリダイゼーション検出装置を提供できる。 The flow path system according to the present invention can be used in a hybridization detection apparatus. For example, it is possible to provide a hybridization detection apparatus including at least a flow path system according to the present invention and a detection unit that detects hybridization on the hybridization beads.

以下、本発明で使用する技術用語の定義付けを行う。「ターゲット核酸」とは、サンプル溶液中に含まれる核酸であって、本発明に係る流路系を用いて、その含有量、構成成分、機能などの分析を行うことを目的とする核酸をいう。「塩基配列」とは、重合している２以上の塩基を意味する。「リンカー」とは、ビーズに対して核酸を保持するために利用される所定配列の核酸である。 Hereinafter, technical terms used in the present invention will be defined. A “target nucleic acid” is a nucleic acid contained in a sample solution and is intended to analyze its content, components, functions, etc. using the flow channel system according to the present invention. . “Base sequence” means two or more bases that are polymerized. A “linker” is a nucleic acid of a predetermined sequence that is used to hold a nucleic acid to beads.

「プローブ核酸」とは、ハイブリダイゼーション検出に有用な情報を提供できる核酸であって、例えば、蛍光物質が標識された一本鎖核酸、あるいは放射性物質が標識された一本鎖核酸などを挙げることができ、前者では励起蛍光を検出し、後者では放射線を検出することによって、ハイブリダイゼーションを検出できる。 “Probe nucleic acid” refers to a nucleic acid that can provide useful information for detection of hybridization, such as a single-stranded nucleic acid labeled with a fluorescent substance or a single-stranded nucleic acid labeled with a radioactive substance. Hybridization can be detected by detecting excitation fluorescence in the former and detecting radiation in the latter.

「ポリ」とは、塩基が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＴ」とは塩基チミン（Ｔ）が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＵ」とは、塩基ウラシル（Ｕ）が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＡテール（poli(A)tail）」とは、ｍＲＮＡの３’末端に付加されているアデニノシンの鎖である。 “Poly” means a nucleic acid molecule having a base sequence in which two or more bases are polymerized. “Poly T” means a nucleic acid molecule having a base sequence in which two or more base thymines (T) are polymerized. “Poly U” means a nucleic acid molecule having a base sequence in which two or more base uracils (U) are polymerized. A “poly (A) tail” is a chain of adeninosin added to the 3 ′ end of mRNA.

本発明に係る流路系は、多孔質マイクロビーズへの核酸の吸着を防止できるため、流路内でのハイブリダイゼーション等の反応効率を上昇させ、かつ反応条件を安定させることが可能となる。 Since the channel system according to the present invention can prevent the adsorption of nucleic acids to the porous microbeads, it is possible to increase the reaction efficiency such as hybridization in the channel and to stabilize the reaction conditions.

以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。 DESCRIPTION OF EXEMPLARY EMBODIMENTS Hereinafter, preferred embodiments for carrying out the invention will be described with reference to the drawings. In addition, embodiment described below shows an example of typical embodiment of this invention, and, thereby, the range of this invention is not interpreted narrowly.

まず、図１を用いて、本発明に係る流路系の構成を説明する。図１は、本発明に係る流路系の一実施形態を示す図である。 First, the configuration of the flow path system according to the present invention will be described with reference to FIG. FIG. 1 is a diagram showing an embodiment of a flow path system according to the present invention.

この図１に符号１で示す流路系は、大別して、サンプル溶液の流路となる口径０．５ｍｍ程度の細管１１と、該細管１１の一端に形成された導入部１２と、該細管１１の他端側に形成された排出部１３と、から構成されている。なお、図１に示された矢印Ｗは、サンプル溶液等の流れる方向を示している。 The flow path system denoted by reference numeral 1 in FIG. 1 is roughly divided into a narrow tube 11 having a diameter of about 0.5 mm that serves as a flow path for the sample solution, an introduction portion 12 formed at one end of the narrow tube 11, and the narrow tube 11. And a discharge portion 13 formed on the other end side. An arrow W shown in FIG. 1 indicates the direction in which the sample solution or the like flows.

この図示された流路系１には、導入部１２に近接する細管１１部分の内部に微小粒径のハイブリット形成用ビーズ２が多数充填されている。ハイブリット形成用ビーズ２には、核酸鎖Ｎが固定されている（後述の図２参照）。このハイブリット形成用ビーズ２上では、ハイブリダイゼーションなどの所望の相互作用が進行する。 The illustrated flow path system 1 is filled with a large number of microbeads for forming hybrids 2 inside the portion of the narrow tube 11 adjacent to the introduction part 12. A nucleic acid chain N is fixed to the hybrid forming bead 2 (see FIG. 2 described later). On the hybrid forming beads 2, a desired interaction such as hybridization proceeds.

ハイブリット形成用ビーズ２のビーズベット長Ｂは、自由に設計することができる。一般に、ビーズベット長Ｂが長くなるほど、マイクロ流路内圧も上昇するので、好適な一例を挙げると、ビーズベット長４ｍｍ以下、より好ましくは２ｍｍ以下である。 The bead bed length B of the hybrid forming beads 2 can be freely designed. In general, the longer the bead bed length B is, the higher the microchannel internal pressure is. Therefore, a preferred example is a bead bed length of 4 mm or less, more preferably 2 mm or less.

ハイブリット形成用ビーズ２の下流側（即ち、排出部１３側）に多孔質マイクロビーズ３が多数充填されている。この多孔質マイクロビーズ３は、送液されてくるサンプル溶液や洗浄用のバッファー溶液などの送液速度を促進するための役割を担う。 A large number of porous microbeads 3 are filled on the downstream side of the hybrid forming beads 2 (that is, on the discharge part 13 side). The porous microbead 3 plays a role for accelerating the liquid feeding speed of the sample solution to be fed or the buffer solution for washing.

多孔質マイクロビーズ３は、送液されるサンプル溶液中のターゲット核酸を吸着しないものが望ましい。ターゲット核酸が多孔質マイクロビーズ３に吸着してしまうと、ターゲットの検出の際、ハイブリット形成用ビーズ２に固定された核酸鎖Ｎとのハイブリット形成なのか、多孔質マイクロビーズ３への吸着なのかの区別が困難となる。また、ターゲット核酸が多孔質マイクロビーズに吸着してしまうと、マイクロビーズ上の核酸鎖に、ターゲット核酸が十分な濃度や量で行き届かず、反応効率が著しく低下し、更に、反応条件も不安定となる。 The porous microbead 3 desirably does not adsorb the target nucleic acid in the sample solution to be sent. If the target nucleic acid is adsorbed to the porous microbead 3, whether it is a hybrid formation with the nucleic acid chain N fixed to the hybrid formation bead 2 or an adsorption to the porous microbead 3 when the target is detected. It becomes difficult to distinguish between In addition, if the target nucleic acid is adsorbed on the porous microbeads, the target nucleic acid cannot reach the nucleic acid strands on the microbeads at a sufficient concentration and amount, and the reaction efficiency is remarkably reduced, and the reaction conditions are not satisfactory. It becomes stable.

本発明では、多孔質マイクロビーズ３として、カチオン性イオン交換能を持つものを用いることにより、ターゲット核酸の吸着を防止することに成功した。そのため、流路系１内での反応効率を上昇させ、かつ反応条件を安定させることが可能となった。 In the present invention, the use of porous microbeads 3 having a cationic ion exchange ability succeeded in preventing the target nucleic acid from being adsorbed. Therefore, the reaction efficiency in the flow path system 1 can be increased and the reaction conditions can be stabilized.

多孔質マイクロビーズ３は、送液を促進し、かつ、カチオン性イオン交換能を有するものであれば特に限定されないが、好適な一例としては、パフュージョンクロマトグラフィー粒子を挙げることができる。 The porous microbead 3 is not particularly limited as long as it promotes liquid feeding and has a cationic ion exchange ability, and a suitable example includes perfusion chromatography particles.

このパフュージョンクロマトグラフィー粒子の典型的なものは、貫通孔（Through pore）と称される大きなポアと吸着孔（Diffusive pore）と称される小さなポアを持っている。これにより、バッファー溶液に溶け込んだ分子は、前記貫通孔を通りぬけ、吸着孔の隅々まで運ばれる。このため、分子と充填材表面の官能基との接触面積が大きくなり、バッファーの流れと官能基との距離は充填材の粒径に関係がなく非常に小さくなる（１μｍ以下）ので、高流速で、かつ低圧の送液を行うことができる。 A typical perfusion chromatography particle has a large pore called “Through pore” and a small pore called “Diffusive pore”. As a result, the molecules dissolved in the buffer solution pass through the through-hole and are carried to every corner of the adsorption hole. For this reason, the contact area between the molecule and the functional group on the surface of the filler is increased, and the distance between the buffer flow and the functional group is very small (1 μm or less) regardless of the particle size of the filler. In addition, low-pressure liquid feeding can be performed.

次に、図２から図６を用いて、ハイブリット形成用ビーズ２上におけるハイブリット形成の様子を説明する。 Next, the state of hybrid formation on the hybrid forming beads 2 will be described with reference to FIGS.

図２は、流路系１内に充填されているハイブリット形成用ビーズ２１の表面上の物質構成の一例を模式的に示す図である。 FIG. 2 is a diagram schematically showing an example of the substance configuration on the surface of the hybrid forming bead 21 filled in the flow channel system 1.

ハイブリット形成用ビーズ２１は、例えばポリスチレンなどの材料で形成された微小なマイクロビーズである。このハイブリット形成用ビーズ２１の表面は、核酸の一末端を化学的に結合させるのに好適な構成を備えている。 The hybrid forming beads 21 are micro micro beads formed of a material such as polystyrene. The surface of the hybrid forming bead 21 has a structure suitable for chemically bonding one end of the nucleic acid.

ハイブリット形成用ビーズ２１は、該ハイブリット形成用ビーズ２１の表面に対して、例えば、アビジン-ビオチン結合やカップリング反応（例えば、ジアゾカップリング反応）などを介して結合された核酸鎖Ｎを備えている。この状態で、ハイブリット形成用ビーズ２１を流路系１に充填する（図１参照）。 The hybrid-forming bead 21 includes a nucleic acid chain N bound to the surface of the hybrid-forming bead 21 through, for example, an avidin-biotin bond or a coupling reaction (for example, a diazo coupling reaction). Yes. In this state, the flow channel system 1 is filled with the beads 21 for hybrid formation (see FIG. 1).

核酸鎖Ｎは、ハイブリット形成用ビーズ２１に保持された状態で、流路系１内において待ち受けており、送液されてくるサンプル液中の相補的なターゲット核酸Ｘとハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションの様子を、図３に示す。 The nucleic acid chain N is awaited in the flow path system 1 while being held by the hybridization bead 21 and hybridizes with a complementary target nucleic acid X in the sample solution being fed. The state of hybridization is shown in FIG.

図３では、ハイブリット形成用ビーズ２１に保持された状態の核酸鎖Ｎの一本鎖部分に対して、ターゲット核酸Ｘがハイブリダイゼーションし、二本鎖を形成している様子を模式的に示す。図示しないが、核酸鎖Ｎ、又はターゲット核酸Ｘに、予めハイブリダイゼーション検出に利用できる蛍光物質、あるいは放射性物質などを標識（ラベル）しておくことで、該標識物質から得られる光情報や放射線情報を捕捉することによって、前記ハイブリダイゼーションを検出することができる。 FIG. 3 schematically shows a state in which the target nucleic acid X is hybridized to a single strand portion of the nucleic acid strand N held on the hybrid forming bead 21 to form a double strand. Although not shown, optical information and radiation information obtained from the labeling substance by labeling the nucleic acid strand N or the target nucleic acid X with a fluorescent substance or radioactive substance that can be used for hybridization detection in advance. The hybridization can be detected by capturing.

図４は、図２とは異なる実施形態のハイブリット形成用ビーズ２２の表面上の物質構成を模式的に示す図である。 FIG. 4 is a diagram schematically showing a substance structure on the surface of the hybrid forming bead 22 of the embodiment different from that in FIG.

このハイブリット形成用ビーズ２２は、該ハイブリット形成用ビーズ２２の表面に対して、例えば、アビジン-ビオチン結合やカップリング反応（例えば、ジアゾカップリング反応）などを介して結合されたオリゴ核酸であるリンカーＬを備えている。該リンカーＬは、ターゲット核酸Ｘと相補結合する塩基配列を有していれば特に限定されないが、一例を挙げると、同種塩基配列であるポリＴ又はポリＵを有するものが好適である。 The hybrid-forming bead 22 is a linker that is an oligonucleic acid bonded to the surface of the hybrid-forming bead 22 through, for example, an avidin-biotin bond or a coupling reaction (for example, diazo coupling reaction). L is provided. The linker L is not particularly limited as long as it has a base sequence that complementarily binds to the target nucleic acid X. For example, a linker having poly-T or poly-U that is the same base sequence is preferable.

図５は、リンカーＬとターゲット核酸Ｘが相補結合する様子を模式的に示す図である。例えば、図５に示すように、リンカーＬがポリＴ塩基配列部分を有する場合、ターゲット核酸ＸのポリＡ部位がポリＡセレクションプロセスに基づいて、前記ポリＴ部分と相補結合する。ターゲット核酸Ｘの好適例の一つとして、ポリＡテールを有するｍＲＮＡを挙げることができる。 FIG. 5 is a diagram schematically showing a state in which the linker L and the target nucleic acid X are complementarily bonded. For example, as shown in FIG. 5, when the linker L has a poly T base sequence portion, the poly A site of the target nucleic acid X is complementarily bonded to the poly T portion based on the poly A selection process. As a suitable example of the target nucleic acid X, mRNA having a poly A tail can be mentioned.

前記ターゲット核酸Ｘは、リンカーＬを介してハイブリット形成用ビーズ２２に保持された状態で、流路系１内において待ち受けており、送液されてくるサンプル溶液中の相補的なプローブ核酸Ｐとのハイブリダイゼーションを進行する。ハイブリダイゼーションの様子を図６に示す。 The target nucleic acid X is awaited in the flow channel system 1 while being held on the hybrid-forming bead 22 via the linker L, and is connected to the complementary probe nucleic acid P in the sample solution being sent. Proceed with hybridization. FIG. 6 shows the state of hybridization.

図６は、ハイブリット形成用ビーズ２２にリンカーＬを介して保持されたターゲット核酸Ｘの一本鎖部分に対して、プローブ核酸Ｐがハイブリダイゼーションし、二本鎖を形成している様子を模式的に示している。 FIG. 6 is a schematic view showing that the probe nucleic acid P is hybridized to the single-stranded portion of the target nucleic acid X held on the hybrid-forming bead 22 via the linker L to form a double strand. It shows.

この図６に示すように、プローブ核酸Ｐには、予めハイブリダイゼーション検出に利用できる蛍光物質Ｆ、あるいは放射性物質（図示せず）などを標識（ラベル）しておくことで、該標識物質から得られる光情報や放射線情報を捕捉することによって、前記ハイブリダイゼーションを検出することが可能となる。 As shown in FIG. 6, the probe nucleic acid P is obtained by labeling a fluorescent substance F that can be used for hybridization detection or a radioactive substance (not shown) in advance. The hybridization can be detected by capturing light information and radiation information.

このようなハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、被験者の細胞などから抽出されたｍＲＮＡをハイブリット形成用ビーズ２２に、リンカーＬを介して保持しておき、このｍＲＮＡに対して、公知の疾病発現原因遺伝子に係わる塩基配列を有するプローブ核酸Ｐがハイブリダイズするか否かを判定する目的の検査などに利用できる。 In such a hybridization assay, for example, mRNA extracted from a subject's cells or the like is held in the hybridization bead 22 via a linker L, and this mRNA is converted into a known disease-causing gene. It can be used for the purpose of determining whether or not the probe nucleic acid P having the relevant base sequence is hybridized.

以上のアッセイは、例えば、図７の工程図に示された方法に基づいて実施できる。まず、流路系１を構成する細管１１の所定位置に向けて、パフュージョンクロマトグラフィー粒子のような多孔質マイクロビーズ３を充填する（図７中の（Ｉ）参照）。 The above assay can be performed, for example, based on the method shown in the flow chart of FIG. First, the porous microbeads 3 such as perfusion chromatography particles are packed toward a predetermined position of the narrow tube 11 constituting the flow path system 1 (see (I) in FIG. 7).

次に、多孔質マイクロビーズ３の上流側に向けて、リンカーＬが固定化されているハイブリット形成用ビーズ２２を充填する（図７中の（II）参照）。 Next, the hybrid-forming beads 22 on which the linker L is immobilized are filled toward the upstream side of the porous microbeads 3 (see (II) in FIG. 7).

そして、ハイブリット形成用ビーズ２２に向けて、ターゲット核酸Ｘを含む第１サンプル溶液Ｓ１を送液する（図７中の（III）参照）。このとき、ハイブリット形成用ビーズ２２に保持されているリンカーＬ（例えば、ポリＴ）とターゲット核酸Ｘ（例えば、ポリＡテール部分）とが、相補結合する（第１ハイブリット形成、図７中の（IV）参照）。 Then, the first sample solution S1 containing the target nucleic acid X is fed toward the hybrid forming beads 22 (see (III) in FIG. 7). At this time, the linker L (for example, poly T) and the target nucleic acid X (for example, poly A tail portion) held in the hybridization bead 22 are complementarily bound (first hybridization, (( See IV).

続いて、プローブ核酸Ｐを含有する第２サンプル溶液Ｓ２を、前記第１ハイブリット形成後のハイブリット形成用ビーズ２２へ向けて送液する（図７中の（Ｖ）参照）。そして、所定温度、ｐＨ条件で所定時間、ターゲット核酸Ｘとプローブ核酸Ｐとの間のハイブリダイゼーションを進行させる（第２ハイブリット形成、図７中の（VI）参照）。このときのプローブ核酸Ｐから得られる情報（例えば、標識された蛍光物質からの励起蛍光情報）により、ハイブリダイゼーションを検出する。 Subsequently, the second sample solution S2 containing the probe nucleic acid P is sent toward the hybrid forming beads 22 after the first hybrid formation (see (V) in FIG. 7). Then, hybridization between the target nucleic acid X and the probe nucleic acid P is allowed to proceed for a predetermined time at a predetermined temperature and pH (second hybrid formation, see (VI) in FIG. 7). Hybridization is detected by information obtained from the probe nucleic acid P at this time (for example, excitation fluorescence information from a labeled fluorescent substance).

以上説明した本発明に係る流路系１は、図８に示すように、ハイブリット形成用ビーズ２が充填されている反応部１１１ａと、多孔質マイクロビーズ３が充填されている送液促進部１１２ａが順に層をなすように形成している（図８中符号１ａで示す）が、その構成は限定されない。図９から図１１を用いて、本発明に係る流路系１への各ビーズの充填方法を例示する。 As shown in FIG. 8, the flow path system 1 according to the present invention described above includes a reaction part 111a filled with the beads for hybrid formation 2 and a liquid feeding promotion part 112a filled with the porous microbeads 3. Are sequentially formed in layers (indicated by reference numeral 1a in FIG. 8), but the configuration is not limited. A method of filling each bead into the flow channel system 1 according to the present invention is illustrated using FIGS. 9 to 11.

図９は、図８とは異なる実施形態の流路系１ｂを示す図である。本実施形態に係る流路系１ｂは、ハイブリット形成用ビーズ２を充填した反応部１１１ａと、反応部１１１ａの上流領域（導入部１２側）に多孔質マイクロビーズ３を充填して設けられた送液促進部１１２ａ_１と、反応部１１１ａの下流領域（排出部１３側）に多孔質マイクロビーズ３を充填して設けられた送液促進部１１２ａ_２と、からなる３層構造をしている。即ち、反応部１１１ａの両側を、送液促進部１１２ａ_１、１１２ａ_２で挟み込んだ構成となっている。 FIG. 9 is a view showing a flow path system 1b of an embodiment different from that in FIG. The flow path system 1b according to the present embodiment includes a reaction part 111a filled with the beads 2 for hybrid formation, and a feed provided by filling the porous microbead 3 in the upstream region (on the introduction part 12 side) of the reaction part 111a. a liquid promoting portion 112a _1, and a fluid-supply promoting section 112a ₂ which is provided by filling a porous microbeads 3 downstream area of the reaction part 111a (the discharge portion 13 side), a three-layer structure consisting of and. That is, both sides of the reaction unit 111a are sandwiched between the liquid feeding promotion units 112a ₁ and 112a ₂ .

送液促進部１１２ａ_１、１１２ａ_２を設けることにより、送液促進だけでなく、以下の効果も期待できる。一般に、導入部１２や排出部１３の近傍の細管部分では、外部ポンプ等との接続のためのナットなどの諸部材が設けられることが多い。そのため、この部分に反応部１１１ａを設けると、光などの検出や測定などが困難となる。しかし、送液促進部１１２ａ_１、１１２ａ_２を反応部１１１ａの下流側、及び上流側に設けることによって、検出、測定などの対象となる反応部１１１ａが流路系１の中央部近くに配置できるようになるので、検出、測定などが容易になるという利点が生まれる。 By providing the liquid feeding promoting portions 112a ₁ and 112a ₂ , not only the liquid feeding promotion but also the following effects can be expected. In general, the thin tube portion in the vicinity of the introduction portion 12 and the discharge portion 13 is often provided with various members such as nuts for connection with an external pump or the like. Therefore, if the reaction part 111a is provided in this part, it becomes difficult to detect and measure light. However, by providing the liquid feeding promoting units 112a ₁ and 112a ₂ on the downstream side and the upstream side of the reaction unit 111a, the reaction unit 111a to be detected and measured can be arranged near the center of the flow path system 1. As a result, there is an advantage that detection, measurement, and the like are facilitated.

また、反応部１１１ａの両側を、送液促進部１１２ａ_１、１１２ａ_２で挟み込む構成をとることで、流路系１ｂ内には、隙間なくビーズを充填することができる。流路系１ｂ内に隙間なくビーズを充填することで、輸送などによる振動の影響も受け難くすることができる。 In addition, by adopting a configuration in which both sides of the reaction part 111a are sandwiched between the liquid feeding promotion parts 112a ₁ and 112a ₂ , it is possible to fill the flow path system 1b with no gaps. By filling the flow path system 1b with beads without a gap, it is possible to make it less susceptible to vibration due to transportation or the like.

図１０は、図８、及び図９とは異なる実施形態の流路系１ｃを示す図である。本実施形態に係る流路系１ｃには、ハイブリット形成用ビーズ２と多孔質マイクロビーズ３を混合充填している。 FIG. 10 is a view showing a flow path system 1c according to an embodiment different from those shown in FIGS. The flow path system 1c according to the present embodiment is filled with the hybrid forming beads 2 and the porous microbeads 3 in a mixed manner.

本発明に用いる多孔質マイクロビーズ３は、核酸を吸着しないため、ハイブリット形成用ビーズ２と混合しても、ハイブリット形成用ビーズ２上でのハイブリット形成を阻害しない。従って、ハイブリット形成用ビーズ２と多孔質マイクロビーズ３を混合充填することにより、流路系１ｃ内の反応効率の低下、及び反応条件の不安定化を招くことなく、送液促進効果を得ることができる。 Since the porous microbeads 3 used in the present invention do not adsorb nucleic acids, even if mixed with the hybrid forming beads 2, they do not inhibit the hybrid formation on the hybrid forming beads 2. Therefore, by mixing and filling the hybrid-forming beads 2 and the porous microbeads 3, a liquid feeding acceleration effect can be obtained without causing a decrease in reaction efficiency in the flow path system 1 c and destabilization of reaction conditions. Can do.

図８で示した実施形態と同様に、ハイブリット形成用ビーズ２と多孔質マイクロビーズ３を混合充填した反応部１１１ｂの下流領域（排出部１３側）に、多孔質マイクロビーズ３を充填した送液促進部１１２ｂを設け、反応部１１１ｂと送液促進部１１２ｂが順に層をなすように形成してもよい（図１１参照）。 Similarly to the embodiment shown in FIG. 8, the liquid feeding solution in which the porous microbeads 3 are filled in the downstream region (on the discharge unit 13 side) of the reaction part 111 b in which the hybrid forming beads 2 and the porous microbeads 3 are mixed and filled. The promotion part 112b may be provided, and the reaction part 111b and the liquid feeding promotion part 112b may be formed so as to form layers in order (see FIG. 11).

また、図９で示した実施形態と同様に、前記反応部１１１ｂと、反応部１１１ｂの上流領域（導入部１２側）に多孔質マイクロビーズ３を充填して設けられた送液促進部１１２ｂ_１と、反応部１１１ｂの下流領域（排出部１３側）に多孔質マイクロビーズ３を充填して設けられた送液促進部１１２ｂ_２と、からなる３層構造としてもよい（図１２参照）。即ち、反応部１１１ｂの両側を、送液促進部１１２ｂ_１、１１２ｂ_２で挟み込んだ構成をとることも自由である。 Further, similarly to the embodiment shown in FIG. 9, the reaction part 111b and the liquid feeding promotion part 112b ₁ provided by filling the upstream region (the introduction part 12 side) of the reaction part 111b with the porous microbeads 3 are provided. Alternatively, a three-layer structure including a liquid feeding promotion part 112b ₂ provided by filling the porous microbead 3 in the downstream region (on the discharge part 13 side) of the reaction part 111b may be used (see FIG. 12). That is, it is also free to adopt a configuration in which both sides of the reaction unit 111b are sandwiched between the liquid feeding promotion units 112b ₁ and 112b ₂ .

送液促進部１１２ｂ_１、１１２ｂ_２を設けることにより、送液促進だけでなく、上記と同様の効果も期待できる。即ち、検出、測定などの対象となる反応部１１１ｂが流路系１の中央部近くに配置できるようになり、検出、測定などが容易になるという利点、及び、流路系１ｅ内に隙間なくビーズを充填することで、輸送などによる振動の影響を受け難くなるという利点が生じる。 By providing the liquid feeding promoting portions 112b ₁ and 112b ₂ , not only the liquid feeding promotion but also the same effect as described above can be expected. That is, the reaction part 111b to be detected and measured can be arranged near the center of the flow path system 1, and the advantage that the detection and measurement are facilitated, and there is no gap in the flow path system 1e. Filling the beads has the advantage of being less susceptible to vibrations due to transportation and the like.

本発明に係る流路系１（１ａ〜１ｅ）に送液するサンプル溶液などの溶液は、ハイブリット形成等に影響を与えない限り、目的に合わせてあらゆる物質を含ませることができる。例えば、流路系１（１ａ〜１ｅ）に送液する溶液全部に、界面活性作用を有する物質を含ませれば、マイクロビーズへの核酸等の吸着を防止することができるため、洗浄等を行う必要がなく、液相の置換の必要もなくなる。そのため、総測定時間の短縮を図ることができる。 The solution such as the sample solution fed to the flow path system 1 (1a to 1e) according to the present invention can contain any substance according to the purpose as long as it does not affect the formation of the hybrid. For example, if a solution having a surface-active action is included in all the solutions sent to the flow path system 1 (1a to 1e), it is possible to prevent the adsorption of nucleic acids or the like to the microbeads, so that washing or the like is performed. There is no need to replace the liquid phase. Therefore, the total measurement time can be shortened.

また、核酸分解酵素失活作用を有する物質を含ませれば、RNaseやDNaseなどの核酸分解酵素による影響を抑制することができる。そのため、効率の良い、安定した測定を行うことができる。 In addition, if a substance having a nuclease deactivating activity is included, the influence of RNase or DNase or other nuclease can be suppressed. Therefore, efficient and stable measurement can be performed.

界面活性作用及び核酸分解酵素失活作用を有する物質の好適な一例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」とする。）を挙げることができる。ＳＤＳは、マイクロビーズへの核酸等の吸着を防止する効果があるため、サンプル液などの送液後に、洗浄を行う必要がない。また、後述の実施例３で説明するとおり、ＳＤＳは、蛍光測定に影響を及ぼさないため、蛍光測定時に、ＳＤＳを含まない液相に置換する必要がない。そのため、RNaseやDNaseなどの核酸分解酵素による影響を抑制し、安定した測定を行うことができる。 A preferred example of a substance having a surface activity and a nuclease deactivation activity is sodium dodecyl sulfate (hereinafter referred to as “SDS”). Since SDS has an effect of preventing the adsorption of nucleic acids or the like to the microbeads, it is not necessary to perform washing after feeding the sample liquid or the like. Further, as will be described later in Example 3, since SDS does not affect the fluorescence measurement, it is not necessary to replace it with a liquid phase not containing SDS during the fluorescence measurement. Therefore, it is possible to suppress the influence of nuclease such as RNase and DNase and perform stable measurement.

本発明に係る流路系１（１ａ〜１ｅ）へサンプル液を送液する場合、そのまま送液することも可能であるが、サンプル液を濾過した後に流路系１（１ａ〜１ｅ）へ送液することがより好ましい。浮遊物質などを除去するためである。サンプル液中の浮遊物質などを予め濾過しておけば、流路系１（１ａ〜１ｅ）の目詰まりを防止できる。 When the sample liquid is sent to the flow path system 1 (1a to 1e) according to the present invention, it is possible to send the liquid as it is, but after the sample liquid is filtered, the sample liquid is sent to the flow path system 1 (1a to 1e). More preferably, it is liquid. This is for removing suspended substances. If the suspended substances in the sample liquid are filtered in advance, clogging of the flow path system 1 (1a to 1e) can be prevented.

濾過に用いるフィルタは、浮遊物質や長鎖の核酸を除去できるものが望ましい。好適な一例としては、その孔径が０．６５μｍ以下、より好ましくは０．１μｍ以下のフィルタを挙げることができる。フィルタ濾過する前に、濾過の精度を上げるために、遠心分離を行うことも自由である。 The filter used for filtration is preferably one that can remove suspended substances and long-chain nucleic acids. As a suitable example, a filter having a pore diameter of 0.65 μm or less, more preferably 0.1 μm or less can be mentioned. Before filtering, it is free to centrifuge to increase the accuracy of filtration.

本発明に係る流路系１（１ａ〜１ｅ）では、排出部１３において、減圧を行うことも可能である。一般に、上流からの送液により、流路系１（１ａ〜１ｅ）の上流側に圧力が集中するが、下流側を陰圧に保つことで、流路系１（１ａ〜１ｅ）中の液相の流れを改善することができる。減圧の仕方の一例としては、排出部１３に図示しないがシリンジなどを接続し、該シリンジを吸引することで排出側を陰圧に保つことができる。 In the flow path system 1 (1a to 1e) according to the present invention, it is possible to reduce the pressure in the discharge unit 13. In general, the pressure is concentrated on the upstream side of the flow path system 1 (1a to 1e) by liquid feeding from the upstream side, but the liquid in the flow path system 1 (1a to 1e) is maintained by keeping the downstream side at a negative pressure. Phase flow can be improved. As an example of how to reduce the pressure, although not shown in the drawings, a discharge device 13 is connected to a syringe or the like, and the discharge side can be kept at a negative pressure by sucking the syringe.

以上で説明した流路系１（１ａ〜１ｅ）は、単独で使用してもよいが、多数本セットした構成のマルチ流路系（図示せず）を採用してもよい。例えば、導入部１２を共通にして、同一のサンプル溶液を同時に多数の流路系１（１ａ〜１ｅ）へ送液できるようにし、さらには、各流路系の反応部１１１ａ（１１１ｂ）には、異なる種類のターゲット核酸Ｘを保持させておくことによって、網羅的なハイブリダイゼーション検出を同時一斉に行うようにしてもよい。 Although the flow path system 1 (1a to 1e) described above may be used alone, a multi flow path system (not shown) having a configuration in which a large number of sets are used may be employed. For example, the introduction part 12 is made common so that the same sample solution can be simultaneously fed to a number of flow path systems 1 (1a to 1e). Further, the reaction section 111a (111b) of each flow path system has Alternatively, comprehensive hybridization detection may be performed simultaneously by holding different types of target nucleic acids X.

図１３は、流路系１（１ａ〜１ｅ）を用いるハイブリダイゼーション検出装置の検出部の好適な実施形態の一例を示す図である。 FIG. 13 is a diagram illustrating an example of a preferred embodiment of a detection unit of a hybridization detection apparatus using the flow path system 1 (1a to 1e).

図１３に示された検出部４は、ハイブリダイゼーションを蛍光検出する場合の典型的な構成を備える。ハイブリット形成用ビーズ２上においてハイブリダイゼーションした状態で存在する核酸Ｎ、若しくはプローブ核酸Ｐには、予め蛍光物質が標識されている。 The detection unit 4 shown in FIG. 13 has a typical configuration in the case of fluorescence detection of hybridization. The nucleic acid N or probe nucleic acid P present in a hybridized state on the hybrid forming bead 2 is previously labeled with a fluorescent substance.

流路系１（１ａ〜１ｅ）のハイブリット形成用ビーズ２が充填されている反応部１１１ａ（１１１ｂ）へ向けて、所定波長の蛍光励起光Ｌを図示しない光源から出射して平行光に途中変換し、反応部１１１ａ（１１１ｂ）の近傍に配置されたレンズ４１によって反応部１１１ａ（１１１ｂ）へ向けて絞り込んで照射する。 A fluorescence excitation light L having a predetermined wavelength is emitted from a light source (not shown) toward the reaction part 111a (111b) filled with the hybrid forming beads 2 of the flow path system 1 (1a to 1e) and converted into parallel light in the middle. Then, the lens 41 arranged in the vicinity of the reaction part 111a (111b) is squeezed and irradiated toward the reaction part 111a (111b).

これにより、反応部１１１ａ（１１１ｂ）内で励起された蛍光ｆを、前記レンズ４１で平行光に変換し、さらに後方に配置されたレンズ４２で絞り込み、その後方に配置された光ディテクタ４３で検出し、蛍光強度を測定する。なお、本発明に係わる検出部は、この蛍光検出手段に限定されず、核酸Ｎ、若しくはプローブ核酸Ｐが提供する情報種に応じて、これを検出できる構成を採用することが可能である。 As a result, the fluorescence f excited in the reaction unit 111a (111b) is converted into parallel light by the lens 41, further narrowed down by the lens 42 arranged behind, and detected by the photodetector 43 arranged behind the lens 42. Then, the fluorescence intensity is measured. In addition, the detection part concerning this invention is not limited to this fluorescence detection means, According to the information species which the nucleic acid N or the probe nucleic acid P provides, the structure which can detect this is employable.

実施例１では、本発明にかかる流路形に充填する多孔質マイクロビーズとして、好適なものを調べた。 In Example 1, suitable microbeads filled in the channel shape according to the present invention were examined.

＜マイクロビーズの調整＞
まず、逆相性、疎水性、アニオン性のイオン交換性、カチオン性のイオン交換性をそれぞれ持つ多孔質のマイクロビーズ（PORPS、Applied Biosystems）を準備した。それぞれのマイクロビーズの特性を表１に示す。10％エタノール水溶液に、それぞれのマイクロビーズを2.5％で懸濁し、マイクロビーズ懸濁液を調整した。

<Preparation of micro beads>
First, porous microbeads (PORPS, Applied Biosystems) each having reverse phase, hydrophobicity, anionic ion exchange property, and cationic ion exchange property were prepared. The characteristics of each microbead are shown in Table 1. Each microbead was suspended at 2.5% in a 10% ethanol aqueous solution to prepare a microbead suspension.

＜マイクロカラムの作製＞
まず、流路系を構成する細管として、内径０．５３ｍｍ、外径０．６８ｍｍ、長さ６ｃｍのフューズド・シリカ・キャピラリー・チューブ（ジーエルサイエンス株式会社製）を用意した。 <Preparation of microcolumn>
First, a fused silica capillary tube (manufactured by GL Science Co., Ltd.) having an inner diameter of 0.53 mm, an outer diameter of 0.68 mm, and a length of 6 cm was prepared as a thin tube constituting the flow path system.

そして、送液の下流側端部に、孔径１μｍのフィルタをセットした排出部、上流側にはフィルタをセットしない導入部を、それぞれチュービングスリーブ、フェラル、ナットを用いて取り付けた。また、上流側の導入部には、レオダイン型シリンジに対応するフィルポートを取り付け、下流側の排出部にはルアー・ロック・ニードルを取り付けた。 And the discharge part which set the filter with a hole diameter of 1 micrometer in the downstream edge part of liquid feeding, and the introduction part which does not set a filter in the upstream were attached using the tubing sleeve, the ferrule, and the nut, respectively. Further, a fill port corresponding to the rheodyne syringe was attached to the upstream introduction portion, and a luer lock needle was attached to the downstream discharge portion.

＜送液促進部の形成＞
上記で調整した各種マイクロビーズ懸濁液をマイクロチューブ内に注入した。注入後、マイクロチューブ中に充填されたマイクロビーズのベットを純水で十分洗浄、乾燥した。 <Formation of liquid feeding promotion part>
The various microbead suspensions prepared above were injected into the microtube. After the injection, the microbead bed filled in the microtube was sufficiently washed with pure water and dried.

＜マイクロカラムのセット＞
前記で作製したマイクロカラムからルアー・ロック・ニードルとフィルポートを取り外し、蛍光顕微鏡のステージであるヒートプレート上に固定し、温度制御を行った。上流側のシリコン・チューブは圧力計に接続し、下流側のシリコン・チューブは廃液貯めにセットした。圧力計は、シリンジ・ポンプにセットしたシリンジと接続し、シリンジ中の液相を圧力計経由でマイクロカラムに注入できるようにした。送液中の内圧を常時モニターした。 <Micro column set>
The luer lock needle and fill port were removed from the microcolumn prepared above, fixed on a heat plate as a stage of a fluorescence microscope, and temperature control was performed. The upstream silicon tube was connected to a pressure gauge, and the downstream silicon tube was set in the waste liquid reservoir. The pressure gauge was connected to a syringe set in a syringe pump so that the liquid phase in the syringe could be injected into the microcolumn via the pressure gauge. The internal pressure during feeding was constantly monitored.

＜コンディショニング液・洗浄液・核酸溶液の調整＞
ベットのコンディショニング液として、0.5M塩化ナトリウム水溶液を調整した。洗浄液として、0.1％SDSを含有した0.5M塩化ナトリウム水溶液を調製した。核酸溶液として、5’側をCy3で標識した21-merのポリデオキシヌクレオチドを、5μMの濃度で0.5M塩化ナトリウム水溶液に溶解し、調整した。 <Preparation of conditioning solution / cleaning solution / nucleic acid solution>
A 0.5M aqueous sodium chloride solution was prepared as a bed conditioning solution. As a washing solution, a 0.5 M sodium chloride aqueous solution containing 0.1% SDS was prepared. A 21-mer polydeoxynucleotide labeled with Cy3 on the 5 ′ side was dissolved in a 0.5 M sodium chloride aqueous solution at a concentration of 5 μM as a nucleic acid solution.

＜Cy3標識核酸の各種マイクロビーズへの吸着の測定＞
まず、上記で調整したコンディショニング液700μLをマイクロカラム内へ注入し、マイクロカラムの液相を置換した。次に上記で調整した核酸溶液400μLをマイクロカラム内へ注入し、各種マイクロビーズへ核酸を吸着させた。その後、上記で調整した洗浄液700μLをマイクロカラム内へ注入し、ベットの洗浄を行った。最後に、上記で調整したコンディショニング液700μLを再度マイクロカラム内へ注入し、マイクロカラムの液相を置換した。この間、ヒートプレートを用いて、マイクロカラムを37℃に温度制御した。 <Measurement of adsorption of Cy3-labeled nucleic acid to various microbeads>
First, 700 μL of the conditioning liquid prepared as described above was injected into the microcolumn to replace the liquid phase of the microcolumn. Next, 400 μL of the nucleic acid solution prepared above was injected into the microcolumn, and the nucleic acid was adsorbed to various microbeads. Thereafter, 700 μL of the cleaning solution prepared above was injected into the microcolumn to wash the bed. Finally, 700 μL of the conditioning solution prepared as described above was injected again into the microcolumn to replace the liquid phase of the microcolumn. During this time, the temperature of the microcolumn was controlled at 37 ° C. using a heat plate.

最初にコンディショニング液を注入した後と、最後にコンディショニング液を注入した後に、蛍光測定を行った。蛍光測定は、以下のように行った。 Fluorescence measurement was performed after first injecting the conditioning solution and finally after injecting the conditioning solution. The fluorescence measurement was performed as follows.

多芯の光ファイバー・プローブを用意し、光ファイバーの一部は照明系へ、他は受光系へ分けた。プローブの先端にはレンズを置き、直径500μｍの範囲の照明と受光ができるようにした。照明は、高圧水銀光源からの光を、Cy3用の励起光用の蛍光フィルタを通して、光ファイバーの照明系の方へ入れることにより行った。蛍光の測定は光ファイバーの受光系の方から放射される蛍光を、Cy3用の蛍光用の蛍光フィルタを通して、分光器に導光して行った。 A multi-core optical fiber probe was prepared, and a part of the optical fiber was divided into the illumination system and the other into the light receiving system. A lens was placed at the tip of the probe so that illumination and light reception with a diameter of 500 μm were possible. Illumination was performed by passing light from a high-pressure mercury light source through a fluorescent filter for excitation light for Cy3 toward the optical fiber illumination system. The fluorescence was measured by guiding the fluorescence emitted from the optical fiber receiving system to the spectroscope through a fluorescence filter for fluorescence for Cy3.

＜結果＞
最初のコンディショニング液注入後の蛍光と、最後のコンディショニング液注入後の蛍光との差スペクトルを図１４に示す。570ｎｍ付近にピークを持つスペクトルがCy3に起因する蛍光である。 <Result>
FIG. 14 shows the difference spectrum between the fluorescence after the first conditioning liquid injection and the fluorescence after the last conditioning liquid injection. A spectrum having a peak near 570 nm is fluorescence caused by Cy3.

図１４に示す通り、逆相性のOligoR3（図１４中Ｃ参照）と疎水性のPOROS20HP2（図１４中Ｂ参照）、アニオン性のイオン交換能を持つPOROS20HQ（図１４中Ｄ参照）では、蛍光の増加が確認できる。これにより、逆相性、疎水性、アニオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズには、ポリヌクレオチドが吸着することが分かった。 As shown in FIG. 14, fluorescence is reversed in reverse-phase OligoR3 (see C in FIG. 14), hydrophobic POROS20HP2 (see B in FIG. 14), and POROS20HQ (see D in FIG. 14) having anionic ion exchange capacity. An increase can be confirmed. As a result, it was found that the polynucleotide was adsorbed on porous microbeads having reverse-phase, hydrophobic, and anionic ion exchange capacities.

なお、逆相性のPOROS20R1（図１４中Ａ）では蛍光の減少がみられたが、検討の結果、ポリヌクレオチドの吸着は認められるものの、洗浄液中のSDSの作用によって、POROS20R1自信の蛍光が消失していることが分かった。 In addition, although the fluorescence decreased in the reverse phase POROS20R1 (A in FIG. 14), the adsorption of the polynucleotide was observed as a result of the examination, but the fluorescence of POROS20R1 confidence disappeared by the action of SDS in the washing solution. I found out.

一方、カチオン性のイオン交換能を持つPOROS20HS1（図１４中Ｅ参照）、POROS20S（図１４中Ｆ参照）、POROS10S（図１４中Ｇ参照）では、蛍光変化はほとんど確認できなかった。これにより、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズには、ポリヌクレオチドがほとんど吸着しないことが分かった。 On the other hand, in POROS20HS1 (see E in FIG. 14), POROS20S (see F in FIG. 14), and POROS10S (see G in FIG. 14) having cationic ion exchange capacity, almost no change in fluorescence could be confirmed. As a result, it was found that the polynucleotide was hardly adsorbed on the porous microbeads having cationic ion exchange ability.

実施例１では、本発明に係るマイクロ流路系の送液促進部に充填するマイクロビーズとしては、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズが最も好適であることが分かった。 In Example 1, it was found that porous microbeads having a cationic ion exchange ability are most suitable as the microbeads filled in the liquid feeding promotion part of the microchannel system according to the present invention.

実施例２では、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズが、本発明に係るマイクロ流路系を用いたハイブリット形成へ影響がないか調べた。 In Example 2, it was examined whether porous microbeads having cationic ion exchange ability have an influence on the formation of hybrids using the microchannel system according to the present invention.

＜マイクロビーズの調整、及び送液促進部の形成＞
カチオン性のイオン交換能を持つPOROS20Sを用い、実施例１と同様の方法により、POROS20S懸濁液を調整した。実施例１と同様の方法でマイクロカラムを作製し、調整したPOROS20S懸濁液をマイクロチューブ内に注入した。注入後、マイクロチューブ中に充填されたPOROS20Sのベットを純水で十分洗浄、乾燥した。 <Preparation of microbeads and formation of liquid feeding promotion part>
A POROS20S suspension was prepared in the same manner as in Example 1 using POROS20S having a cationic ion exchange capacity. A microcolumn was prepared in the same manner as in Example 1, and the prepared POROS20S suspension was injected into the microtube. After the injection, the POROS20S bed filled in the microtube was thoroughly washed with pure water and dried.

＜ポリヌクレオチド結合マイクロビーズの調整＞
Streptavidin Coated Microsphere plain（直径６μｍ、Polysciences）の水溶液に、５'末端にビオチンを修飾したデオキシチミジン（ｄＴ）のポリヌクレオチド（２１ｍｅｒ）を加えて、アビジン−ビオチン結合によりポリｄＴが固定されたビーズ（以下、「ポリｄＴビーズ」と称する。）を調製した。 <Preparation of polynucleotide-binding microbeads>
A deoxythymidine (dT) polynucleotide (21mer) modified with biotin at the 5 ′ end was added to an aqueous solution of Streptavidin Coated Microsphere plain (diameter 6 μm, Polysciences), and beads with poly dT immobilized by avidin-biotin bonding (21-mer). Hereinafter, referred to as “poly dT beads”) was prepared.

＜ハイブリット形成部の形成＞
調整したポリｄＴビーズを、実施例１と同様の方法で上記で形成した送液促進部の上流へ注入し、ハイブリット形成部を形成し、２層のマイクロカラムとした。 <Formation of hybrid forming part>
The adjusted poly dT beads were injected upstream of the liquid transfer promoting part formed as described above in the same manner as in Example 1 to form a hybrid forming part to form a two-layer microcolumn.

＜コンディショニング液・洗浄液・核酸溶液の調整＞
実施例１と同様に、コンディショニング液、洗浄液を調整した。また、核酸溶液として、３’末端をCy3で標識した120-merのポリ（ｄＡ）のポリデオキシヌクレオチドを、5μMの濃度で0.5M塩化ナトリウム水溶液に溶解し、調整した。 <Preparation of conditioning solution / cleaning solution / nucleic acid solution>
In the same manner as in Example 1, conditioning liquid and cleaning liquid were prepared. In addition, a 120-mer poly (dA) polydeoxynucleotide labeled with Cy3 at the 3 ′ end was dissolved in a 0.5 M sodium chloride aqueous solution at a concentration of 5 μM to prepare a nucleic acid solution.

＜ハイブリット形成、及び蛍光測定＞
実施例１と同様の方法で、最初のコンディショニング液の注入、核酸溶液の注入、洗浄液の注入、最後のコンディショニング液の注入を順番に行った。最初にコンディショニング液を注入した後と、最後にコンディショニング液を注入した後に、核酸溶液中のCy3標識したポリｄＡ配列とポリｄＴビーズ上ポリｄＴ配列間のハイブリット形成を、実施例１と同様の方法で蛍光測定した。 <Hybrid formation and fluorescence measurement>
In the same manner as in Example 1, the first conditioning solution was injected, the nucleic acid solution was injected, the washing solution was injected, and the last conditioning solution was injected in order. After first injecting the conditioning solution and finally injecting the conditioning solution, hybridization between the Cy3 labeled poly dA sequence and the poly dT sequence on the poly dT beads in the nucleic acid solution was carried out in the same manner as in Example 1. Fluorescence measurement was performed.

＜結果＞
最初のコンディショニング液注入後の蛍光と、最後のコンディショニング液注入後の蛍光との差スペクトルを図１５に示す。図１５に示す通り、Cy3に起因する蛍光の増加が観察された。これにより、ハイブリット形成部において、ハイブリット形成が行われたことが確認できた。 <Result>
FIG. 15 shows the difference spectrum between the fluorescence after the first conditioning liquid injection and the fluorescence after the last conditioning liquid injection. As shown in FIG. 15, an increase in fluorescence due to Cy3 was observed. Thereby, it was confirmed that hybrid formation was performed in the hybrid formation portion.

実施例２では、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを用いても、ハイブリット形成に影響を与えないことが分かった。 In Example 2, it was found that even if porous microbeads having a cationic ion exchange capacity were used, the hybrid formation was not affected.

実施例１、及び２の結果から、ハイブリット形成部を、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを充填した送液促進部で挟み込み、３層化することも可能であると示唆された。即ち、ハイブリット形成部の上流に送液促進部を形成しても、核酸がほとんど吸着しないため、ハイブリット形成部においての核酸濃度や量の低下はないと考えられる。 From the results of Examples 1 and 2, it was suggested that the hybrid-forming part can be sandwiched by a liquid-feeding promoting part filled with porous microbeads having a cationic ion exchange ability to form three layers. . That is, even if the liquid feeding promoting part is formed upstream of the hybrid forming part, nucleic acid is hardly adsorbed, so that it is considered that there is no decrease in the nucleic acid concentration or amount in the hybrid forming part.

実施例３では、SDSを常時含んだ液相を用いる場合のハイブリット形成への影響、及びハイブリット形成部に、ポリｄＴビーズとカチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを混合したベットを用いた場合のハイブリット形成への影響をそれぞれ調べた。 In Example 3, the influence on the hybrid formation when a liquid phase always containing SDS is used, and a bed in which poly dT beads and porous microbeads having cationic ion exchange ability are mixed in the hybrid formation part is used. The effects on the hybrid formation were investigated.

＜混合マイクロビーズ懸濁液の調整＞
実施例２と同様の方法でポリｄＴビーズを、実施例１と同様の方法により、カチオン性のイオン交換能を持つPOROS20S懸濁液をそれぞれ調整した。調整したそれぞれの懸濁液を、ポリｄＴビーズの重量比が、0％、25％、50％、100％となるように混合した。 <Preparation of mixed microbead suspension>
A poly dT bead was prepared in the same manner as in Example 2, and a POROS20S suspension having a cationic ion exchange capacity was prepared in the same manner as in Example 1. Each prepared suspension was mixed so that the weight ratio of poly dT beads was 0%, 25%, 50%, and 100%.

＜送液促進部・ハイブリット形成部の形成＞
実施例１と同様の方法でマイクロカラムを作製し、調整したPOROS20S懸濁液をマイクロチューブ内に注入した。注入後、マイクロチューブ中に充填されたPOROS20Sのベットを純水で十分洗浄、乾燥して、送液促進部を形成した。 <Formation of liquid feeding promoting part / hybrid forming part>
A microcolumn was prepared in the same manner as in Example 1, and the prepared POROS20S suspension was injected into the microtube. After the injection, the bed of POROS20S filled in the microtube was sufficiently washed with pure water and dried to form a liquid feeding acceleration part.

調整した混合マイクロビーズ懸濁液を、上記で形成した送液促進部の上流へ、実施例１と同様の方法で注入し、ハイブリット形成部を形成し、２層のマイクロカラムとした。 The prepared mixed microbead suspension was injected into the upstream of the liquid feeding promoting portion formed above by the same method as in Example 1 to form a hybrid forming portion to form a two-layer microcolumn.

＜コンディショニング液・洗浄液・核酸溶液の調整＞
コンディショニング液、及び洗浄液として、0.1％SDSを含有した0.5M塩化ナトリウム水溶液を調製した。核酸溶液として、３’末端をCy3で標識した120-merのポリ（ｄＡ）のポリデオキシヌクレオチドを、5μMの濃度で、0.1％SDSを含有する0.5M塩化ナトリウム水溶液に溶解し、調整した。 <Preparation of conditioning solution / cleaning solution / nucleic acid solution>
A 0.5M sodium chloride aqueous solution containing 0.1% SDS was prepared as a conditioning solution and a washing solution. As a nucleic acid solution, a 120-mer poly (dA) polydeoxynucleotide labeled at the 3 ′ end with Cy3 was dissolved in a 0.5 M sodium chloride aqueous solution containing 0.1% SDS at a concentration of 5 μM.

＜ハイブリット形成、及び蛍光測定＞
実施例１と同様の方法で、コンディショニング液の注入、核酸溶液の注入、洗浄液の注入を順番に行った。コンディショニング液を注入した後と、洗浄液を注入した後に、核酸溶液中のCy3標識したポリｄＡ配列とポリｄＴビーズ上ポリｄＴ配列間のハイブリット形成を、実施例１と同様の方法で蛍光測定した。 <Hybrid formation and fluorescence measurement>
In the same manner as in Example 1, the conditioning solution, the nucleic acid solution, and the cleaning solution were injected in this order. After injecting the conditioning solution and injecting the washing solution, the fluorescence formation of the hybrid between the Cy3 labeled poly dA sequence in the nucleic acid solution and the poly dT sequence on the poly dT beads was measured by the same method as in Example 1.

＜結果＞
コンディショニング液注入後の蛍光と、洗浄液注入後の蛍光との差スペクトルを図１６に示す。図１６に示す通り、Cy3に起因する蛍光の増加が観察された。これにより、ハイブリット形成部において、ハイブリット形成が行われたことが確認できた。即ち、SDSを常時含んだ液相を用いても、ハイブリット形成に影響はないことが分かった。 <Result>
FIG. 16 shows a difference spectrum between the fluorescence after the conditioning liquid is injected and the fluorescence after the cleaning liquid is injected. As shown in FIG. 16, an increase in fluorescence due to Cy3 was observed. Thereby, it was confirmed that hybrid formation was performed in the hybrid formation portion. That is, it was found that even when a liquid phase constantly containing SDS was used, there was no effect on the formation of hybrids.

また、図１６に示す通り、蛍光強度は、ポリｄＴビーズの含有量に従って増加する傾向がみられた（図１６中Ａ〜Ｄ参照）。そこで、ポリｄＴビーズの含有量に対しての570ｎｍでの蛍光の増加を図１７にプロットしたところ、ほぼ比例していることが分かった。即ち、ハイブリット形成部に、ポリｄＴビーズとカチオン性のイ
オン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを混合したベットを用いても、ハイブリット形成に影響を与えないことが分かった。 Further, as shown in FIG. 16, the fluorescence intensity tended to increase according to the content of poly dT beads (see A to D in FIG. 16). Therefore, when the increase in fluorescence at 570 nm with respect to the content of poly dT beads was plotted in FIG. 17, it was found that the increase was substantially proportional. That is, it was found that even when a bed in which poly dT beads and porous microbeads having a cationic ion exchange capacity were used in the hybrid formation part, the hybrid formation was not affected.

実施例３では、本発明に係るマイクロ流路系において、SDSを常時含んだ液相を用いることが可能であることが確認できた。このことから、蛍光測定のための液相の置換が不要となり、総測定時間を大幅に短縮できることが明らかとなった。 In Example 3, it was confirmed that in the microchannel system according to the present invention, it was possible to use a liquid phase always containing SDS. From this, it was clarified that replacement of the liquid phase for fluorescence measurement is unnecessary and the total measurement time can be greatly shortened.

また、本発明に係るマイクロ流路系のハイブリット形成部において、ポリｄＴビーズとカチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを混合したベットを用いることが可能であることも確認できた。このように、多孔質マイクロビーズを、送液促進部だけでなく、ハイブリット形成部へも用いることができると、送液促進だけでなく、試料に起因する目詰まりを減少できると考えられる。 In addition, it was confirmed that a bed in which poly dT beads and porous microbeads having cationic ion exchange ability were mixed could be used in the microfluidic hybrid forming portion according to the present invention. As described above, if the porous microbeads can be used not only in the liquid feeding promoting part but also in the hybrid forming part, it is considered that not only the liquid feeding promotion but also clogging caused by the sample can be reduced.

本発明に係る流路系は、多孔質マイクロビーズへの核酸の吸着を防止できるため、流路内でのハイブリダイゼーション等の反応効率を上昇させ、かつ反応条件を安定させることが可能となる。また、多孔質マイクロビーズを用いることで、マイクロ流路内での目詰まり、及びマイクロ流路内圧上昇の防止ができる。そのため、高流量送液が可能である。特に、様々な浮遊物、長鎖の核酸などを含む全ＲＮＡサンプルの送液にも有効に利用できる。更に、送液する全溶液に界面活性作用、及び核酸分解酵素失活作用を有する物質を含ませれば、総測定時間の短縮を図ることができ、RNaseやDNaseなどの核酸分解酵素による影響を抑制し、効率的で安定した測定を行うことができる。 Since the channel system according to the present invention can prevent the adsorption of nucleic acids to the porous microbeads, it is possible to increase the reaction efficiency such as hybridization in the channel and to stabilize the reaction conditions. Further, by using porous microbeads, clogging in the microchannel and an increase in the internal pressure of the microchannel can be prevented. Therefore, high flow rate liquid feeding is possible. In particular, it can also be used effectively for feeding a total RNA sample containing various suspended matters, long-chain nucleic acids and the like. Furthermore, the total measurement time can be shortened by suppressing the influence of RNase and DNase and other nucleolytic enzymes by including substances that have surface activity and nucleolytic enzyme deactivation in the entire solution. In addition, efficient and stable measurement can be performed.

本発明に係る流路系の一実施形態を示す図である。It is a figure showing one embodiment of a channel system concerning the present invention. 流路系１内に充填されているハイブリット形成用ビーズ２１の表面上の物質構成の一例を模式的に示す図である。FIG. 3 is a diagram schematically illustrating an example of a substance configuration on the surface of a hybrid forming bead 21 filled in a flow path system 1. ハイブリット形成用ビーズ２１に保持された核酸鎖Ｎとターゲット核酸Ｘがハイブリット形成する様子を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically a mode that the nucleic acid chain | strand N hold | maintained at the bead 21 for hybrid formation and the target nucleic acid X hybridize. 図２とは異なる実施形態のハイブリット形成用ビーズ２２の表面上の物質構成を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the substance structure on the surface of the bead 22 for hybrid formation of embodiment different from FIG. ハイブリット形成用ビーズ２２に保持されたリンカーＬとターゲット核酸Ｘが相補結合する様子を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically a mode that the linker L hold | maintained at the bead 22 for hybridization and the target nucleic acid X carry out a complementary bond. ハイブリット形成用ビーズ２２にリンカーＬを介して保持された状態のターゲット核酸Ｘとプローブ核酸Ｙがハイブリダイゼーションする様子を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically a mode that the target nucleic acid X and probe nucleic acid Y of the state hold | maintained via the linker L by the bead 22 for hybridization are hybridized. 本発明に係る流路系１を用いたアッセイの工程例を示す図である。It is a figure which shows the example of a process of the assay using the flow-path system 1 which concerns on this invention. 本発明に係る流路系１ａの一実施形態を示す図である。It is a figure showing one embodiment of channel system 1a concerning the present invention. 図８とは異なる実施形態の流路系１ｂを示す図である。It is a figure which shows the flow-path system 1b of embodiment different from FIG. 図８、及び図９とは異なる実施形態の流路系１ｃを示す図である。It is a figure which shows the flow-path system 1c of embodiment different from FIG.8 and FIG.9. 図８、図９、及び図１０とは異なる実施形態の流路系１ｄを示す図である。It is a figure which shows the flow-path system 1d of embodiment different from FIG.8, FIG.9 and FIG.10. 図８、図９、図１０、及び図１１とは異なる実施形態の流路系１ｅを示す図である。It is a figure which shows the flow-path system 1e of embodiment different from FIG.8, FIG.9, FIG.10 and FIG. 流路系１（１ａ〜１ｅ）を用いるハイブリダイゼーション検出装置の検出部の好適な実施形態の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of suitable embodiment of the detection part of the hybridization detection apparatus using the flow-path system 1 (1a-1e). 実施例１において、最初のコンディショニング液注入後の蛍光と、最後のコンディショニング液注入後の蛍光との差スペクトルを示す図面代用グラフである。In Example 1, it is a drawing substitute graph which shows the difference spectrum of the fluorescence after the injection of the first conditioning liquid, and the fluorescence after the final conditioning liquid injection. 実施例２において、最初のコンディショニング液注入後の蛍光と、最後のコンディショニング液注入後の蛍光との差スペクトルを示す図面代用グラフである。In Example 2, it is a drawing substitute graph which shows the difference spectrum of the fluorescence after the injection of the first conditioning liquid, and the fluorescence after the final conditioning liquid injection. 実施例３において、コンディショニング液注入後の蛍光と、洗浄液注入後の蛍光との差スペクトルを示す図面代用グラフである。In Example 3, it is a drawing substitute graph which shows the difference spectrum of the fluorescence after injection | pouring of a conditioning liquid, and the fluorescence after washing | cleaning liquid injection | pouring. 実施例３において、ポリｄＴビーズの含有量に対しての570ｎｍでの蛍光の増加を示す図面代用グラフである。In Example 3, it is a figure substitute graph which shows the increase in the fluorescence in 570 nm with respect to the content of a poly dT bead.

符号の説明Explanation of symbols

１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅマイクロ流路系
１１細管
１２導入部
１３排出部
２、２１、２２ハイブリット形成用ビーズ
３多孔質マイクロビーズ
１１１、１１１ａ、１１１ｂ反応部
１１２、１１２ａ、１１２ｂ送液促進部
Ｎ核酸鎖
Ｐプローブ核酸
Ｘターゲット核酸
Ｌリンカー
Ｆ蛍光物質
Ｓ_１第１サンプル液
Ｓ_２第２サンプル液 1, 1a, 1b, 1c, 1d, 1e Microchannel system 11 Narrow tube 12 Introducing section 13 Discharging section 2, 21, 22 Hybrid forming beads 3 Porous microbeads 111, 111a, 111b Reacting sections 112, 112a, 112b Solution promoting part N Nucleic acid chain P Probe nucleic acid X Target nucleic acid L Linker F Fluorescent substance S ₁ First sample solution S ₂ Second sample solution

Claims

ビーズが充填された細管からなる流路系であって、
核酸鎖が固定されているハイブリット形成用ビーズと、
カチオン性イオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズと、
が少なくとも充填されたカラム層を有し、
前記ハイブリット形成用ビーズが少なくとも充填されている反応部と、
前記多孔質マイクロビーズが充填されている送液促進部と、が順に層をなし、
前記反応部と、前記反応部の上流領域に設けられた前記送液促進部と、
前記反応部の下流領域に設けられた前記送液促進部と、
からなる３層構造であることを特徴とする流路系。 A flow path system consisting of narrow tubes filled with beads,
A hybrid-forming bead having a nucleic acid chain immobilized thereon;
Porous microbeads with cationic ion exchange capacity;
There have a column layer which is at least filled,
A reaction part filled with at least the beads for hybrid formation;
The liquid feeding facilitating portion filled with the porous microbeads, in order, forms a layer,
The reaction section; and the liquid feeding promotion section provided in the upstream region of the reaction section;
The liquid feed promoting part provided in the downstream region of the reaction part;
A flow path system characterized by having a three-layer structure .

前記多孔質マイクロビーズは、パフュージョンクロマトグラフィー粒子であることを特徴とする請求項１記載の流路系。 The channel system according to claim 1, wherein the porous microbeads are perfusion chromatography particles.

前記ハイブリット形成用ビーズ上では、
固定された前記核酸鎖と、ターゲット核酸とが相補結合するハイブリット形成が行われることを特徴とする請求項１記載の流路系。 On the hybrid-forming beads,
2. The flow path system according to claim 1, wherein hybridization is performed in which the fixed nucleic acid strand and the target nucleic acid are bonded to each other in a complementary manner.

前記核酸鎖は同種塩基配列を有するリンカーであって、
前記ハイブリット形成用ビーズ上では、
固定された該リンカーとターゲット核酸とが相補結合する第１ハイブリット形成と、
該ターゲット核酸の一本鎖部分と送液中のプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成と、が行われることを特徴とする請求項１記載の流路系。 The nucleic acid chain is a linker having the same base sequence,
On the hybrid-forming beads,
First hybrid formation in which the immobilized linker and the target nucleic acid are complementarily bonded;
2. The flow path system according to claim 1, wherein a second hybrid formation in which a single-stranded portion of the target nucleic acid and a probe nucleic acid in a liquid supply are complementary-bonded is performed.

前記リンカーの同種塩基配列はポリＴ又はポリＵであり、
該ポリＴ又はポリＵと全ＲＮＡサンプル中のポリＡテール部分を有するｍＲＮＡとが相補結合する第１ハイブリット形成と、
該ｍＲＮＡと送液中のプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成と、
が行われることを特徴とする請求項４記載の流路系。 The homologous base sequence of the linker is poly-T or poly-U,
A first hybrid formation in which the poly-T or poly-U and mRNA having a poly-A tail portion in a total RNA sample are complementarily bound;
A second hybrid formation in which the mRNA and the probe nucleic acid in the solution are complementarily bound;
The flow path system according to claim 4, wherein:

前記反応部に前記ハイブリット形成ビーズと前記多孔質マイクロビーズとが混合充填されている請求項１記載の流路系。 The hybrid-forming beads and the porous flow path system of claim 1 wherein the microbeads and are mixed filled in the reaction section.

前記流路系に送液する全溶液は、界面活性作用及び核酸分解酵素失活作用を有する物質を同濃度含む溶液であることを特徴とする請求項１記載の流路系。 2. The flow path system according to claim 1, wherein the total solution fed to the flow path system is a solution containing the same concentration of a substance having a surface activity and a nuclease deactivation activity.

前記物質は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）であることを特徴とする請求項７記載の流路系。 The flow path system according to claim 7, wherein the substance is sodium dodecyl sulfate (SDS).

請求項１記載の流路系と、
前記ハイブリット形成用ビーズ上におけるハイブリット形成を検出する検出部と、
を少なくとも備えるハイブリダイゼーション検出装置。 A flow path system according to claim 1;
A detection unit for detecting hybridization on the hybridization beads;
A hybridization detection apparatus comprising at least.