JP2012023988A - Method for nucleic acid analysis, apparatus for implementing the method, and reagent set for nucleic acid analysis - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、鋳型ＤＮＡ或いはその相補鎖に取り込まれる単一核酸分子である塩基（ヌクレオチド：ｄＮＴＰ）の種類や部位の特定、或いは塩基配列を解析するのに適した塩基解析方法、その方法を実施する装置、及び核酸解析用試薬セットに関する。特にＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した、核酸解析方法、その方法を実施する装置、及び核酸解析用試薬セットに関する。 The present invention implements a base analysis method suitable for identifying the type and site of a base (nucleotide: dNTP), which is a single nucleic acid molecule incorporated into a template DNA or its complementary strand, or analyzing the base sequence. And a reagent set for nucleic acid analysis. In particular, the present invention relates to a nucleic acid analysis method using FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), an apparatus for performing the method, and a reagent set for nucleic acid analysis.
（１）近年、非特許文献１にあるように、基板に固定した鋳型ＤＮＡ或いはその相補鎖に単一核酸分子であるヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を順次、捕捉伸長させて、その塩基配列を決定することが提案されている。すなわち基板表面にランダムに分析すべき試料ＤＮＡ断片（単一核酸分子）を１分子ずつ捕捉し伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。 (1) In recent years, as described in Non-Patent Document 1, nucleotide sequences (dNTPs) that are single nucleic acid molecules are sequentially captured and extended on template DNA immobilized on a substrate or its complementary strand, and its base sequence is determined. Has been proposed. That is, the base DNA is determined by capturing and extending sample DNA fragments (single nucleic acid molecules) to be analyzed at random on the substrate surface one by one and detecting the result by fluorescence measurement.
具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの基質として、鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができ、且つ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）を、ＤＮＡポリメラーゼ反応により相補的に順次取り込む工程、次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを、蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、それを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。本技術では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定することができるため、同時に数多くの断片を解析することができ、解析スループットを大きくすることができる。また、本方式では、全反射エバネッセント照射検出方式により、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できる可能性があるため、従来技術の問題であったクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡを精製、増幅が不要にできる可能性があり、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。 Specifically, as a DNA polymerase substrate, four dNTP derivatives (MdNTP) having a label that can be incorporated into a template DNA and can stop the DNA chain elongation reaction due to the presence of a protective group and have a detectable label. The step of sequentially taking complementary DNA polymerase reaction, the step of detecting the incorporated MdNTP by fluorescence, and the step of returning the MdNTP to a state in which it can be extended are defined as one cycle, and this is repeated to repeat the base of the sample DNA. Determine the sequence. In this technique, since DNA fragments can be sequenced one molecule at a time, a large number of fragments can be analyzed simultaneously, and the analysis throughput can be increased. In addition, in this method, there is a possibility that the base sequence can be determined for each single DNA molecule by the total reflection evanescent irradiation detection method, so that the sample DNA is purified and amplified by cloning or PCR, which has been a problem of the prior art. Can be made unnecessary, and rapid genome analysis and genetic diagnosis can be expected.
（２）一方、非特許文献２および特許文献１では、全反射エバネッセント照射検出方式よりも励起光照射体積の一層の低減が可能となるナノ開口エバネッセント照射検出方式によって、核酸増幅の塩素配列の蛍光検出の感度を更に向上させている。
(2) On the other hand, in
具体的には、２枚のガラス基板であるガラス基板Ａとガラス基板Ｂを平行に対向配置し、ガラス基板Ａのガラス基板Ｂと対面する側の表面に、径５０ｎｍのナノ開口を有する膜厚約１００ｎｍの平面状のアルミニウム薄膜を積層する。アルミニウム薄膜は遮光性能を有している必要がある。２枚のガラス基板の中間に前記ナノ開口により反応槽を構成し、反応槽に溶液を充填することによって、２枚のガラス基板の間に溶液層の反応槽を形成する。反応槽には溶液の注入口と排出口があり、注入口から溶液を注入し、排出口から溶液を排出させることで、溶液をガラス基板およびアルミニウム薄膜と平行方向にフローさせることができる。これにより、溶液層の溶液を任意の組成に交換することが可能である。Ａｒイオンレーザから発振した波長４８８ｎｍの励起光を、ガラス基板Ｂと反対方向より、ガラス基板Ａに対して垂直に、対物レンズで絞って照射すると、ナノ開口内部の底平面近傍の溶液層に励起光のエバネッセント場が形成され、それ以上先の溶液層内部に励起光が伝播することはない。一方、蛍光発光は、前記対物レンズを用いて２次元ＣＣＤ上に結像することによって検出される。エバネッセント場では、励起光強度がナノ開口底平面から離れるに従って指数関数的に減衰し、ナノ開口底平面から３０ｎｍ程度の距離で励起光強度が１／１０となる。更に、ナノ開口エバネッセント照射検出方式では、全反射エバネッセント照射検出法と異なり、ガラス基板と平行方向の励起光照射幅が開口径すなわち５０ｎｍに限定されるため、励起光照射体積が一層低減される。このため、遊離の蛍光体の蛍光発光や水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減することが可能となる。その結果、より高濃度の遊離の蛍光体存在下で、対象とする生体分子に標識された蛍光体だけを選択的に検出することが可能となり、非常に高感度な蛍光検出を実現できる。本文献では、以上の蛍光検出方式をＤＮＡ分子の伸長反応によるｄＮＴＰの取り込み計測に応用している。 Specifically, a glass substrate A and a glass substrate B, which are two glass substrates, are arranged opposite to each other in parallel, and a film thickness having a nano-opening with a diameter of 50 nm on the surface of the glass substrate A facing the glass substrate B. A planar aluminum thin film of about 100 nm is laminated. The aluminum thin film needs to have a light shielding performance. A reaction tank is formed by the nano-opening in the middle of two glass substrates, and a solution tank reaction tank is formed between the two glass substrates by filling the reaction tank with a solution. The reaction tank has an inlet and an outlet for the solution. By injecting the solution from the inlet and discharging the solution from the outlet, the solution can flow in a direction parallel to the glass substrate and the aluminum thin film. Thereby, it is possible to exchange the solution of a solution layer into arbitrary compositions. When excitation light with a wavelength of 488 nm oscillated from an Ar ion laser is squeezed with an objective lens perpendicularly to the glass substrate A from the opposite direction to the glass substrate B, it is excited to the solution layer near the bottom plane inside the nano aperture A light evanescent field is formed, and excitation light does not propagate further into the solution layer. On the other hand, the fluorescence emission is detected by forming an image on a two-dimensional CCD using the objective lens. In the evanescent field, the excitation light intensity is exponentially attenuated as the distance from the nano-aperture bottom plane increases, and the excitation light intensity becomes 1/10 at a distance of about 30 nm from the nano-aperture bottom plane. Further, in the nano-aperture evanescent irradiation detection method, unlike the total reflection evanescent irradiation detection method, the excitation light irradiation width in the direction parallel to the glass substrate is limited to the opening diameter, that is, 50 nm, so that the excitation light irradiation volume is further reduced. For this reason, it becomes possible to drastically reduce background light such as fluorescence emission of free phosphor and Raman scattering of water. As a result, it becomes possible to selectively detect only the fluorescent substance labeled with the target biomolecule in the presence of a higher concentration of free fluorescent substance, and it is possible to realize extremely sensitive fluorescence detection. In this document, the above fluorescence detection method is applied to the measurement of dNTP uptake by the elongation reaction of DNA molecules.
（３）特許文献２では、核酸増幅された塩基配列解析にＦＲＥＴ方式を採用して、蛍光標識（ドナー）で修飾されたポリメラーゼ（蛍光標識ポリメラーゼ又は蛍光修飾ポリメラーゼと称せられる）と蛍光標識（アクセプタ）で修飾されたヌクレオチド（蛍光標識ヌクレオチド又は蛍光修飾ヌクレオチドと称せられる）との相互作用により、鋳型鎖（鋳型ＤＮＡ）上での１核酸分子ずつのヌクレオチド捕捉，伸長を、光源により励起されるドナーの蛍光により共鳴励起されるアクセプタの蛍光を検出して、核酸配列（ヌクレオチド配列）をリアルタイムに決定する技術が提案されている。ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を修飾する蛍光標識（アクセプタ）として、４種類のｄＮＴＰ（ＡＴＣＧ）に応じた４種類の蛍光色素を使用する。本技術は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応（ヌクレオチド捕捉伸長反応）を１核酸分子（ヌクレオチド）レベルで観察する方法で、ポリメラーゼと捕捉されるヌクレオチドの間の蛍光標識（ドナー、アクセプタ）による蛍光共鳴励起エネルギーの転移(ＦＲＥＴ) を逐次検出することにより配列を読み取るというものである。具体的には、ドナーとしての蛍光色素に標識されたＤＮＡポリメラーゼがスライドガラス上にガラス面から一定の距離を置いて固定され、別の蛍光標識（アクセプタ）を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）をＤＮＡポリメラーゼ反応により鋳型ＤＮＡ鎖上で相補的に捕捉し伸長させる。このとき、ＤＮＡポリメラーゼに標識された蛍光色素（ドナー）の蛍光波長は、ＭｄＮＴＰに標識された蛍光色素（アクセプタ）を励起可能である。ポリメラーゼに標識された蛍光色素（ドナー）を励起すると、捕捉したＭｄＮＴの取り込みが行われた際、ポリメラーゼとＭｄＮＴＰが相互作用し、ポリメラーゼからＭｄＮＴＰに励起エネルギーが転移（ＦＲＥＴ）し、ＭｄＮＴＰ（アクセプタ）の蛍光色素が励起され蛍光を発する。こうして生じたＭｄＮＴＰからの種類別の蛍光を検出することで塩基種ＡＴＣＧの配列を決定する。一般的にＦＲＥＴ は、ドナーとアクセプタ間の距離が1〜10 ｎｍ の範囲で起こることが知られている。またＦＲＥＴの強度は両分子間の距離の6乗の関数として、距離とともに急速に減少する。すなわちｄＮＴＰを標識する蛍光色素（アクセプタ）は、ポリメラーゼを標識する蛍光色素（ドナー）の近傍においてのみ発光するため、実質的に限られた空間のみが励起されている状態となる。その結果、浮遊ＭｄＮＴＰの蛍光発光や水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減し、非常に高感度な蛍光観察が可能となる。本技術は背景光低減に有効な手段であるが、ドナー色素を常に励起し続ける必要があるため、退色が課題であった。この問題を解決する手段として、量子ドット（Quantum Dot、 Ｑｄｏｔ）の利用が挙げられる。Ｑｄｏｔは通常の蛍光色素と比較して光安定性が強く、長時間露光しても退色が遅いという特徴がある。このためＦＲＥＴのドナー色素として非常に有効である。加えてＱｄｏｔの蛍光強度は極めて強いため、ＱｄｏｔをＦＲＥＴのドナーとして用いる場合、アクセプタ側の蛍光色素の組み合わせによっては、１種類のＱｄｏｔで４種類以上のアクセプタ色素を励起できる可能性がある。即ち、Ｑｄｏｔを励起するための１種類の光源で４色の蛍光色素を励起できるため、他の従来法と比較して操作性、コストの面で有利である。
(3)
上記した背景技術の（１）及び（２）の項で述べた手法は、ＦＲＥＴを使わない所謂、通常の蛍光色素を使用するものである。一方、背景技術の（３）の項で述べた手法は、ＦＲＥＴを採用しているものである。前者、すなわち通常の蛍光色素の場合には、蛍光色素を励起する励起波長と、それにより蛍光したときの蛍光波長とが近いために、励起光の影響が大きい。また、消光までの時間が短い。一方、後者、すなわちＦＲＥＴの場合には、特にＱｄｏｔをドナーとして使用する場合には、ドナーの励起波長とアクセプタの蛍光波長が遠いために、励起光の影響が小さい、また消光までの時間が長いといった特長を有している。 The method described in the above sections (1) and (2) uses a so-called ordinary fluorescent dye that does not use FRET. On the other hand, the method described in the section (3) of the background art employs FRET. In the case of the former, that is, a normal fluorescent dye, the excitation wavelength that excites the fluorescent dye is close to the fluorescence wavelength when the fluorescent dye is excited, so that the influence of the excitation light is large. Also, the time until quenching is short. On the other hand, in the case of the latter, that is, FRET, particularly when Qdot is used as a donor, the influence of excitation light is small and the time until quenching is long because the excitation wavelength of the donor is far from the fluorescence wavelength of the acceptor. It has the following features.
ただし、ＱｄｏｔをドナーとしてＦＲＥＴを利用して４種類のＭｄＮＴＰを励起する場合、４種類の波長の異なる蛍光標識（蛍光色素）のうち、ドナーの励起光を基準にして長波長側に遠くなる波長を有する蛍光色素へのＦＲＥＴ効率が低くなるという傾向がある。ドナーとしてのＱｄｏｔの蛍光波長は、少なくともｄＮＴＰを標識する４種類の蛍光色素（アクセプタ）の蛍光波長よりも短い必要があるが、Ｑｄｏｔの蛍光も分布を持っているため、ＦＲＥＴ効果はアクセプタ側の蛍光色素の励起波長が長くなるほど効果が低くなる。また一般的な蛍光色素の励起光の波長は、およそ４５０ｎｍ〜８００ｎｍの領域であるが、４種類のｄＮＴＰを標識するため、その範囲内で４種類の蛍光色素を選択しようとすると、蛍光色素同士の蛍光スペクトルが一部重なり、隣接する蛍光波長のピークを有する蛍光色素同士が、互いの信号に影響を及ぼすという、いわゆるクロストークが生じる。また４種類の蛍光色素を波長成分ごとに抽出して観察するために、フィルタやミラーなどの光学素子の点数が多く使用せねばならず、それに伴い信号強度が損失する。このため、特に長波長領域におけるアクセプタ側の蛍光色素のS/Nが低く、十分な検出感度を得られない傾向がある。 However, when four types of MdNTP are excited using FRET using Qdot as a donor, among the four types of fluorescent labels (fluorescent dyes) having different wavelengths, the wavelength farther to the longer wavelength side with respect to the excitation light of the donor There is a tendency that the FRET efficiency to the fluorescent dye having a low value is lowered. The fluorescence wavelength of Qdot as a donor must be at least shorter than the fluorescence wavelengths of four types of fluorescent dyes (acceptors) that label dNTPs. However, since the fluorescence of Qdot also has a distribution, the FRET effect is on the acceptor side. The longer the excitation wavelength of the fluorescent dye, the lower the effect. The wavelength of excitation light of a general fluorescent dye is in the range of about 450 nm to 800 nm. Since four types of dNTP are labeled, if four types of fluorescent dyes are selected within the range, the fluorescent dyes In other words, so-called crosstalk occurs in which fluorescent dyes partially overlap and fluorescent dyes having adjacent fluorescence wavelength peaks affect each other's signal. Further, in order to extract and observe four types of fluorescent dyes for each wavelength component, a large number of optical elements such as filters and mirrors must be used, and the signal intensity is lost accordingly. For this reason, the S / N of the fluorescent dye on the acceptor side is particularly low in the long wavelength region, and there is a tendency that sufficient detection sensitivity cannot be obtained.
本発明の目的は、ＦＲＥＴを採用した場合でも、上記したような課題を解消し、しかも、安価で信頼性が高く、また操作性の良い単一核酸分子の塩基配列を解読する方法・装置を提供することにある。 The object of the present invention is to solve the above-described problems even when FRET is adopted, and to provide a method and apparatus for decoding the base sequence of a single nucleic acid molecule that is inexpensive, highly reliable, and easy to operate. It is to provide.
本発明は、上記目的を達成するために、基本的には、次のような核酸解読方法及び装置を提案する。
（１）一つは、単一核酸分子の塩基配列を、蛍光共鳴エネルギー移動を利用して解析する核酸解析方法であって、
ドナーにより励起される第１のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ及び前記第１のアクセプタと種類の異なる第２のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第１のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第２のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＧＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第３のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＴＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのヌクレオチドからなる第４のヌクレオチドセットと、
ＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ及びプライマと、
アクセプタ励起用として、前記ＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ及びプライマのいずれか一つに標識されている前記ドナーと、を用いて、
前記第１〜第４のヌクレオチドセットのセットごとに順次、前記鋳型ＤＮＡ或いはその相補鎖及びプライマを介してポリメラーゼ反応によるヌクレオチドの捕捉，伸長を行い、
前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に取り込まれていくヌクレオチドの近傍に位置する前記ドナーを励起して、このドナーと前記取り込まれたヌクレオチドの第１のアクセプタ或いは第２のアクセプタとの間で生じる蛍光共鳴エネルギー移動により、前記取り込まれたヌクレオチドの第１のアクセプタ或いは第２のアクセプタを励起し、
前記ドナーの信号強度変化及び前記第１，第２のアクセプタからの信号をリアルタイムにモニタリングし、前記第１〜第４のヌクレオチドセットを使用して得られたこれらのモニタリングデータから、前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に取り込まれた前記ヌクレオチドの種類とその位置を特定することを特徴とする。
In order to achieve the above object, the present invention basically proposes the following nucleic acid decoding method and apparatus.
(1) One is a nucleic acid analysis method for analyzing the base sequence of a single nucleic acid molecule using fluorescence resonance energy transfer,
A first nucleotide set consisting of dATP labeled by a first acceptor excited by a donor and dCTP, dGTP, dTTP nucleotides labeled by a second acceptor different in kind from the first acceptor;
A second nucleotide set consisting of dCTP labeled with the same first acceptor and dATP, dGTP, dTTP nucleotides labeled with the same second acceptor;
A third nucleotide set consisting of dGTP labeled with the same first acceptor and dATP, dCTP, dTTP nucleotides labeled with the same second acceptor;
A fourth nucleotide set consisting of dTTP labeled with the same first acceptor and dATP, dCTP, dGTP nucleotides labeled with the second acceptor;
DNA polymerase, template DNA and primer;
For acceptor excitation, using the donor labeled with any one of the DNA polymerase, template DNA and primer,
For each of the first to fourth nucleotide sets, sequentially capture and extend nucleotides by polymerase reaction via the template DNA or its complementary strand and primer,
Fluorescence resonance generated between the donor and the first acceptor or the second acceptor of the incorporated nucleotide by exciting the donor located in the vicinity of the nucleotide to be incorporated into the template DNA or the complementary strand Exciting the first acceptor or the second acceptor of the incorporated nucleotide by energy transfer,
Changes in signal intensity of the donor and signals from the first and second acceptors are monitored in real time, and from these monitoring data obtained using the first to fourth nucleotide sets, the template DNA or The type and position of the nucleotide incorporated into the complementary strand is specified.
例えば、第１のアクセプタは、ドナーにより励起されて蛍光する特性を有し、第２のアクセプタは、第ドナーにより励起されるが、光を生じない或いは第１のアクセプタに対して識別できる発光強度差を有する或いは第１のアクセプタと波長の異なる特性を有している。 For example, the first acceptor has a property of being excited by a donor to fluoresce, and the second acceptor is excited by the first donor but does not generate light or can be distinguished from the first acceptor. It has a characteristic that has a difference or a wavelength different from that of the first acceptor.
或いは、第１のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて蛍光する或いは励起されるが光を生じない特性を有し、前記第２のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて前記第１のアクセプタに対して識別できる発光強度差を有する或いは前記第１のアクセプタと蛍光波長の異なる特性を有している。
（２）さらに、前記核酸解析方法のために使用する核酸解析用試薬セットとして、前記第１〜第４のヌクレオチドセットを有するものを提案する。
（３）本発明に係る核酸解析方法のもう一つは、単一核酸分子の塩基配列を、蛍光共鳴エネルギー移動を利用して解析する核酸解析方法であって、
第１のアクセプタで標識された１〜３種類の塩基及び前記第１のアクセプタと種類の異なる第２のアクセプタで標識されたそれ以外の塩基を混合した基質溶液と、前記アクセプタを共鳴励起するための１種類のドナーにより標識されたＤＮＡポリメラーゼ或いは前記鋳型ＤＮＡとを用いて、核酸増幅の塩基配列伸長反応を行い、
前記ドナーの発光波長帯の信号強度の時間変化情報と、少なくとも１種類のアクセプタの発光波長帯の信号強度の時間変化情報を検出し、
検出される前記ドナーの発光強度の低下と、検出される前記アクセプタの発光強度の上昇から、任意の塩基が取り込まれたことを判定することを特徴とする。
Alternatively, the first acceptor has a property of being excited by the donor to fluoresce or being excited but not generating light, and the second acceptor is excited by the donor and has a property to the first acceptor. Or having a difference in fluorescence wavelength from that of the first acceptor.
(2) Further, a nucleic acid analysis reagent set used for the nucleic acid analysis method is proposed having the first to fourth nucleotide sets.
(3) Another nucleic acid analysis method according to the present invention is a nucleic acid analysis method for analyzing the base sequence of a single nucleic acid molecule using fluorescence resonance energy transfer,
In order to resonantly excite the acceptor, a substrate solution in which 1 to 3 types of bases labeled with the first acceptor and other bases labeled with a second acceptor different in type from the first acceptor are mixed Using a DNA polymerase labeled with one kind of donor or the template DNA, a nucleic acid amplification base sequence extension reaction is performed,
Detecting the time change information of the signal intensity of the emission wavelength band of the donor and the time change information of the signal intensity of the emission wavelength band of at least one acceptor;
It is characterized in that it is determined that an arbitrary base has been incorporated from a decrease in the emission intensity of the detected donor and an increase in the emission intensity of the acceptor detected.
例えば、４種類の塩基を有する第１の基質溶液と、同じく４種類の塩基を有する第２の基質溶液とからなり、前記第１，第２の基質溶液における塩基に標識される前記第１，第２のアクセプタの組み合わせは、４種の塩基のうち、前記第１，第２の基質溶液間で同一の１種については前記第１のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のもう１種については前記第２のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第１のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第１のアクセプタで標識されている。ここで、第１、第２のアクセプタの特性は、前記（１）の方法と同様である。
（４）さらに、上記（３）の方法を実施するために、例えば、上記（３）の互いにアクセプタの組み合わせが異なる４種の塩基を内容とする前記第１、第２の基質溶液を有する核酸解析用試薬セットを提案する。
（５）また、上記（１）、（２）の方法を実施するために、前記第１〜第４のヌクレオチドセットを有する核酸解析用試薬セットと、
アクセプタ励起用の蛍光物質よりなるドナーが標識されているＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ或いはプライマと、
前記第１〜第４のヌクレオチドセットの各々ごとに、前記鋳型ＤＮＡ及びプライマを介してポリメラーゼ反応により行われる核酸増幅にて、前記鋳型ＤＮＡもしくはその相補鎖に捕捉されていくヌクレオチドのうち最新捕捉のヌクレオチドを標識しているアクセプタを励起する光照射系と、
蛍光共鳴エネルギーにより、前記ドナーの蛍光で前記最新捕捉のヌクレオチドを標識しているアクセプタを励起して、前記ドナーによる信号強度変化及び前記第１，第２アクセプタからの信号をリアルタイムにモニタリングする光検出系と、
前記第１〜第４のヌクレオチドセットを使用して得られたこれらのモニタリングデータから、前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に取り込まれた前記ヌクレオチドの塩基配列を解析するデータ演算処理部と、を有することを特徴とする核酸増幅の塩基配列解析装置を提案する。
For example, the first substrate solution is composed of a first substrate solution having four types of bases and a second substrate solution having the same four types of bases, and the first and second substrates labeled with the bases in the first and second substrate solutions. The combination of the second acceptor is that one of the four bases that is the same between the first and second substrate solutions is labeled with the first acceptor, and the other one that is the same between the substrate solutions. The species is labeled with the second acceptor, and for the other species that is the same between the substrate solutions, the first substrate solution is labeled with the first acceptor and the second substrate solution is the second one. For another type that is labeled with an acceptor and is identical between the substrate solutions, the first substrate solution is labeled with the second acceptor and the second substrate solution is labeled with the first acceptor. Here, the characteristics of the first and second acceptors are the same as those in the method (1).
(4) Furthermore, in order to carry out the method of (3) above, for example, the nucleic acid having the first and second substrate solutions of the above (3) containing the four bases having different acceptor combinations. Proposed analysis reagent set.
(5) Moreover, in order to implement the method of said (1) and (2), the reagent set for nucleic acid analysis which has the said 1st-4th nucleotide set,
A DNA polymerase, a template DNA or a primer labeled with a donor made of a fluorescent material for acceptor excitation;
For each of the first to fourth nucleotide sets, the latest capture of the nucleotides captured by the template DNA or its complementary strand by nucleic acid amplification performed by polymerase reaction via the template DNA and primer. A light irradiation system for exciting the acceptor that labels the nucleotide;
Photodetection for monitoring in real time the signal intensity change by the donor and the signal from the first and second acceptors by exciting the acceptor labeled with the latest captured nucleotide with the fluorescence of the donor by fluorescence resonance energy The system,
A data operation processing unit for analyzing the nucleotide sequence of the nucleotide incorporated in the template DNA or the complementary strand from the monitoring data obtained by using the first to fourth nucleotide sets. We propose a nucleic acid amplification base sequence analyzer characterized by the following:
本発明によれば、核酸増幅解析にＦＲＥＴ方式を採用した場合であっても、ＤＮＡポリメラーゼ反応により核酸増幅される４種の塩基配列を検出する場合に、捕捉される核酸分子（ヌクレオチド）を標識するアクセプタは、第１、第２のアクセプタの２種類だけで済むので、従来課題とされていたヌクレオチド側の４種類の蛍光色素同士のクロストークの影響を排除でき、それにより、ノイズ成分が抑制され、各蛍光色素のS/Nが向上する。 According to the present invention, even when the FRET method is employed for nucleic acid amplification analysis, the captured nucleic acid molecule (nucleotide) is labeled when detecting four types of base sequences amplified by the DNA polymerase reaction. Since there are only two types of acceptors, the first and second acceptors, it is possible to eliminate the influence of crosstalk between the four types of fluorescent dyes on the nucleotide side, which has been regarded as a conventional problem, thereby suppressing noise components. Thus, the S / N of each fluorescent dye is improved.
またS/Nの向上に伴い、従来方法で必要とされていた高性能センサや光学部品、高出力光源を安価な部品に置き換えることが可能であるため、コスト削減に繋がる。 In addition, as S / N is improved, it is possible to replace high-performance sensors, optical components, and high-output light sources that have been required in the conventional method with inexpensive components, leading to cost reduction.
また、色素識別のための複雑な計算が不要となるため、観察後のデータ処理が簡便となり、操作性が向上する。結果として、塩基配列解読の信頼性が向上する In addition, since complicated calculation for identifying the dye is not necessary, data processing after observation is simplified and operability is improved. As a result, the reliability of base sequence decoding is improved.
以下、本発明を実施の形態について下記の示す実施例により説明する。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to the following examples.
基板表面に分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、伸長させて、取り込まれたDNA断片（ヌクレオチド：ｄNTP）に修飾された蛍光標識を検出して塩基配列を決定する装置、方法について説明する。 Describes an apparatus and method for capturing a sample DNA fragment to be analyzed on the substrate surface one by one, extending it, detecting a fluorescent label modified with the incorporated DNA fragment (nucleotide: dNTP), and determining the base sequence To do.
本実施例では、ＤＮＡポリメラーゼの基質として、４つの塩基種（ＡＴＣＧ）のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの総称）を鋳型ＤＮＡ或いはその相補鎖に一分子ずつ捕捉し、且つ取り込まれるｄＮＴＰの標識（アクセプタ）を、ＦＥＲＴを利用して励起する蛍光色素（ドナー）を有する。また、４つの塩基種について、一核酸分子（ヌクレオチド）ごとに取り込まれるｄＮＴＰを修飾する標識については、１種類の蛍光色素（第１のアクセプタ）と１種類の無蛍光物質（第２のアクセプタ）、すなわちトータルで２種類のアクセプタを使用する。ここで、アクセプタとして機能する無蛍光物質としては、例えば消光色素（クエンチャ）が例示される。４種類のｄＮＴＰは、第１のアクセプタ（１種類の蛍光色素）と第２のアクセプタ（クエンチャ）の組み合わせであり、次のようなアクセプタ組み合わせを４つのヌクレオチドセットを使用する。 In this example, dNTPs of 4 base species (ATCG) (generic name for dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) are captured as template DNA or its complementary strand one by one as a substrate of DNA polymerase, and dNTP It has a fluorescent dye (donor) that excites the label (acceptor) using FERT. In addition, for four base species, for a label that modifies dNTP incorporated for each nucleic acid molecule (nucleotide), one type of fluorescent dye (first acceptor) and one type of non-fluorescent substance (second acceptor) That is, a total of two types of acceptors are used. Here, examples of the non-fluorescent substance that functions as an acceptor include a quenching dye (quencher). The four types of dNTPs are combinations of a first acceptor (one type of fluorescent dye) and a second acceptor (quencher), and the following acceptor combinations use four nucleotide sets.
すなわち、（i）蛍光共鳴エネルギー移動の励起により光を生じる第１のアクセプタ（蛍光色素）によって標識されたｄＡＴＰ及び第２のアクセプタ（クエンチャ）によって標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第１のヌクレオチドセットと、上記同様に（ii）第１のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、及び第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる第２のヌクレオチド セットと、（iii）第１のアクセプタによって標識されたｄＧＴＰ、及び第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰからなる第３のヌクレオチドセットと、(iv)第１のアクセプタによって標識されたｄＴＴＰ、及び第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのヌクレオチドからなる第４のヌクレオチドセットである。 That is, (i) a dATP labeled with a first acceptor (fluorescent dye) that generates light by excitation of fluorescence resonance energy transfer and a dCTP, dGTP, dTTP nucleotide labeled with a second acceptor (quencher) (Ii) a second nucleotide set consisting of dCTP labeled with a first acceptor and dATP, dGTP, dTTP labeled with a second acceptor, and (iii) a first A third nucleotide set consisting of dATP, dCTP, dTTP labeled by the second acceptor, and (iv) a dTTP labeled by the first acceptor, and a second acceptor. Labeled dATP, dCT A fourth nucleotide set comprising nucleotides dGTP.
第１〜第４のヌクレオチドセットごとに順次、ＤＮＡポリメラーゼ反応によるｄＮＴＰの捕捉、伸長を行い、取り込まれるｄＮＴＰの第１の蛍光色素（第１のアクセプタ）或いはクエンチャ（第２のアクセプタ）とその近傍に位置する第２の標識（ドナー）との間の蛍光共鳴による励起エネルギーの移動（ＦＲＥＴ）を利用した蛍光及び無蛍光の測定データ（リアルタイムモニタリングデータ）を用いることで、塩基配列の解読を行う。 For each first to fourth nucleotide set, dNTP is captured and extended by DNA polymerase reaction in sequence, and the first fluorescent dye (first acceptor) or quencher (second acceptor) of the incorporated dNTP and its vicinity The base sequence is decoded by using fluorescence and non-fluorescence measurement data (real-time monitoring data) using excitation energy transfer (FRET) by fluorescence resonance with the second label (donor) located in the region .
より具体的には、第１〜第４のヌクレオチドセットのセットごとに、ターゲット鋳型ＤＮＡ、プライマ及びポリメラーゼを用いて、順次、ｄＮＴＰの捕捉，伸長を行う（ＦＲＥＴによるリアルタイム蛍光検出を伴う）。この場合、セットごとのｄＮＴＰの捕捉，伸長が完了する度に、鋳型DNA上で合成された伸長鎖を熱変性で分離し，洗浄により除去が行われる。したがって、ヌクレオチドセットごとのｄＮＴＰの捕捉，伸長，熱変性，洗浄を１サイクルとする。 More specifically, for each set of the first to fourth nucleotide sets, capture and extension of dNTP are sequentially performed using target template DNA, a primer, and a polymerase (with real-time fluorescence detection by FRET). In this case, every time dNTP capture and extension for each set is completed, the extended strand synthesized on the template DNA is separated by thermal denaturation and removed by washing. Accordingly, dNTP capture, extension, thermal denaturation, and washing for each nucleotide set are defined as one cycle.
本実施例によれば、ドナーのＦＲＥＴによる信号変化と第１、第２のアクセプタの信号から、第1のヌクレオチドセットでは、捕捉された塩基配列のうちｄＡＴＰの位置を特定でき、第２のヌクレオチドセットでは、捕捉された塩基配列のうちｄＣＴＰの位置を特定でき、第３のヌクレオチドセットでは、捕捉された塩基配列のうちｄＧＴＰの位置を特定でき、第４のヌクレオチドセットでは、捕捉された塩基配列のうちｄＴＴＰの位置を特定できる。したがって、第１から第４のヌクレオチドセットのデータを組み合わせることで、4種の全体的な塩基配列を解読することができる。 According to the present embodiment, the position of dATP in the captured nucleotide sequence can be specified in the first nucleotide set from the signal change caused by donor FRET and the first and second acceptor signals. In the set, the position of dCTP can be specified in the captured base sequence. In the third nucleotide set, the position of dGTP in the captured base sequence can be specified. In the fourth nucleotide set, the captured base sequence can be specified. The position of dTTP can be specified. Therefore, by combining the data of the first to fourth nucleotide sets, the four types of overall base sequences can be decoded.
以上のように、本実施例では、ＦＲＥＴ利用の核酸解析、すなわち試料ＤＮＡの塩基配列の決定を、１種類のドナー、１種類の蛍光アクセプタ（第１アクセプタ）、及び１種類の無蛍光アクセプタ（第２のアクセプタ：クエンチャ）を用いて、４サイクルにより行う。具体的な装置や核酸解析のための準備及び反応工程については、以下に詳述する。なお、本操作は単分子蛍光検出を行うため、測定はＨＥＰＡフィルタなどを介したクリーンルーム様の環境にて行うのが望ましい。
（装置構成）
図１は、本発明の核酸解析方法（蛍光分析方法）に用いるＤＮＡ検査装置（核酸解析装置）の構成図である。基板８にＤＮＡ分子を順次捕捉してヌクレオチド伸長状態をＦＲＥＴ方式により蛍光検出するものである。
As described above, in this embodiment, nucleic acid analysis using FRET, that is, determination of the base sequence of sample DNA is performed using one type of donor, one type of fluorescent acceptor (first acceptor), and one type of non-fluorescent acceptor ( The second acceptor: quencher) is used for four cycles. Specific devices, preparation for nucleic acid analysis and reaction steps will be described in detail below. In addition, since this operation performs single molecule fluorescence detection, it is desirable to perform measurement in a clean room-like environment via a HEPA filter or the like.
(Device configuration)
FIG. 1 is a configuration diagram of a DNA test apparatus (nucleic acid analysis apparatus) used in the nucleic acid analysis method (fluorescence analysis method) of the present invention. The DNA molecules are sequentially captured on the
ここで、図１の装置全体を説明するに先立ち、図２により基板８の構造について説明する。
Here, before explaining the whole apparatus of FIG. 1, the structure of the
図２（Ａ）は、基板（固相）８の斜視図であり、図２（Ｂ）は、基板８と、基板８の下面側に配置したプリズム７と、基板８の上面側に配置したフローチャンバ９とからなる積層体の縦断面図を示す。図２（Ｃ）は、フローチャンバ９を、裏面すなわち基板８に対向する面側からみた斜視図である。図２（Ｃ）のＡ−Ａ線で断面したものが、図２（Ｂ）のフローチャンバ９の断面に相当する。
2A is a perspective view of the substrate (solid phase) 8, and FIG. 2B is a diagram illustrating the
基板８は少なくとも反応領域８ａが透明材質でできており、材質としては合成石英などが用いられる。反応領域８ａは、フローチャンバ９によって形成される液槽９ａに導入される試薬、試料などが接触する。フローチャンバ９については、後述する。
The
反応領域８ａ内に検出対象となるＤＮＡ分子（核酸分子：ヌクレオチド）を捕捉するためのスポット８ｉｊが複数形成されている。スポット８ｉｊの個々の大きさは直径１００ｎｍ以下である。各スポット８ｉｊには、ＤＮＡを捕捉するための表面処理が施されている。
A plurality of spots 8ij for capturing DNA molecules (nucleic acid molecules: nucleotides) to be detected are formed in the
その表面処理は、例えば、変性により得られた一本鎖化されたターゲットである鋳型ＤＮＡをチオール化（図４の符号５０に示すような５’末端のチオール化）によりスポット８ｉｊ上に捕捉（固定）し、その３’末端にポリＡ配列（例えば、図４の符号３０で示す）を付加する。すなわち、スポット８ｉｊに、図４に示すように、金構造体上にポリＡ付加鋳型ＤＮＡ３３を固定する。ポリＡ配列３０は、ポリＴプライマ３４をハイブリダイズにより捕捉するものである。或いは、その表面処理は、ポリＴのオリゴヌクレオチド（例えば図６のポリＴプライマ３４）を捕捉しておき、また、ＤＮＡ断片（例えば図６のターゲットである鋳型ＤＮＡ３３）の一端をポリＡ化処理して、この標的ＤＮＡ断片をハイブリダイゼーション反応にて捕捉する。その際、ＤＮＡ断片濃度を適当に調製することで、個々のスポット８ｉｊに鋳型ＤＮＡに相補的に取り込まれるべきヌクレオチド（ｄＮＴＰ）のみが入るようにすることができる。なお、スポット８ｉｊをより小さくしていくことで、スポット内に捕捉できる分子が１個になるようにすることができる。このような基板では、すべてのスポット８ｉｊに単一分子のｄＮＴＰが捕捉されている場合と、スポット８ｉｊのうち一部のスポットのみｄＮＴＰが捕捉されている場合がある。スポット８ｉｊのうち、一部のスポットのみｄＮＴＰが捕捉されている場合は、残りのスポットには捕捉されておらず、空きの状態となる。なお、一例として、スポット８ｉｊ同士の間隔ｄｘは２マイクロメータ、間隔ｄｙは２マイクロメータとする。
The surface treatment is performed by, for example, capturing the template DNA, which is a single-stranded target obtained by denaturation, on the spot 8ij by thiolation (thiolation of the 5 ′ end as indicated by
スポット８ｉｊは基板表面上にランダムに存在していても構わないが、観察時の効率を考慮して規則的に配置されていることが望ましい。例えば図２（Ａ）のように、格子配列構造（２次元の格子構造）を形成し、その格子点の位置にスポット８ｉｊが配置される。このような、均等間隔の基板の作成法としては、例えば、特開２００２−２１４１４２号公報に記載の手法（金属ナノウェルを用いた蛍光分析用素子の製造方法）などがある。なお、ｄｘ、ｄｙは、スポット８ｉｊの個々の径の大きさより大きく、０.２〜１０マイクロメータ以下、さらには０.５〜６マイクロメータ程度が好ましい。なお、スポット８ｉｊの格子配列構造は正方格子構造、長方格子構造、三角格子構造などにしてもよい。基板の反応スポット８ａは、例えば１ｍｍ×１ｍｍの大きさとする。反応スポット８ａの大きさは、それより大きくても可であるし、０.５ｍｍ×０.５ｍｍの大きさのものを一定間隔で、１次元または２次元に複数個並べたようなものでもよいし、長方形、丸型、三角形、六角形の形状などでもよい。
The spots 8ij may be randomly present on the substrate surface, but it is desirable that the spots 8ij are regularly arranged in consideration of the efficiency during observation. For example, as shown in FIG. 2A, a lattice arrangement structure (two-dimensional lattice structure) is formed, and a spot 8ij is arranged at the position of the lattice point. Examples of a method for producing such a substrate having a uniform interval include a technique described in Japanese Patent Laid-Open No. 2002-214142 (a method for manufacturing a fluorescence analysis element using a metal nanowell). In addition, dx and dy are larger than the size of each diameter of the spot 8ij, preferably 0.2 to 10 micrometers or less, and more preferably about 0.5 to 6 micrometers. The lattice arrangement structure of the spots 8ij may be a square lattice structure, a rectangular lattice structure, a triangular lattice structure, or the like. The
なお、スポット８ｉｊには金属構造体を配置してもよい。金属構造体は半導体プロセスにて作成でき、また、電子線描画、光リソグラフィー、ドライエッチング、ウェットエッチングなどの手法によっても作製できる。金属構造体は、金、銀、アルミ、クロム、チタン、タングステン、白金等で、励起光の波長以下の大きさを有する形状であり、直方体、円錐、円柱、三角柱、一部が突起状のものを有する構造、あるいは、これらを２個または複数個近接して並べた構造など、また金属微粒子なども使用可能である。たとえば、直径１０ｎｍから１００ｎｍ程度の大きさの金の膜状のドットを上記ｄｘ、ｄｙの間隔、たとえば、１×１、１×２、１×３、２×３、２×４、３×５、３×６（マイクロメータ×マイクロメータ）などの間隔の格子状に構築できる。直径２０ｎｍ程度のドットに、大きさ２０ｎｍ程度の蛋白や蛍光物質、リンカーをその上部に捕捉すれば、確率的にその大きさからドットあたり１分子を捕捉し、格子状に単一分子を配置することが可能になる。また、周知の手法でドットに選択的なリンカーを結合させ、それにオリゴヌクレオチド、たんぱく質などを捕捉することで、ドットに目的の分子を捕捉することが可能であり、これを使うことができる。以後このような状態の基板８を用いて核酸増幅を行い蛍光計測する。
A metal structure may be disposed at the spot 8ij. The metal structure can be produced by a semiconductor process, and can also be produced by techniques such as electron beam drawing, photolithography, dry etching, and wet etching. The metal structure is made of gold, silver, aluminum, chromium, titanium, tungsten, platinum, etc., and has a shape that is less than or equal to the wavelength of the excitation light, and is a rectangular parallelepiped, a cone, a cylinder, a triangular prism, or a part that is protruding Or a structure in which two or a plurality of these are arranged close to each other, or metal fine particles can also be used. For example, a gold film-like dot having a diameter of about 10 nm to 100 nm is formed at intervals of the above dx, dy, for example, 1 × 1, 1 × 2, 1 × 3, 2 × 3, 2 × 4, 3 × 5. 3 × 6 (micrometer × micrometer) or the like can be constructed in a grid pattern. If a protein, fluorescent substance, or linker with a size of about 20 nm is captured on the top of a dot with a diameter of about 20 nm, one molecule per dot is stochastically captured from the size, and a single molecule is arranged in a lattice shape. It becomes possible. In addition, by binding a selective linker to a dot by a well-known method and capturing an oligonucleotide, a protein, or the like, it is possible to capture a target molecule in the dot, which can be used. Thereafter, the
ｄＮＴＰおよびポリメラーゼに加える蛍光標識として、種々の蛍光体を使うことができる。Ａｌｅｘａ系やＣｙ系などの一般的な蛍光化合物のほか、量子ドットであるＱｄｏｔなどを使うことができる。ただし、冒頭で述べたとおり、両者の間にはＦＲＥＴにおけるドナーとアクセプタの関係が成立する組み合わせでなければならない。例えばポリメラーゼへの蛍光標識（ドナー）はＱｄｏｔ５２５、前述した第１〜第４のヌクレオチドセットにおける、それぞれ1種の塩基（ヌクレオチドセット毎に異なる）の蛍光標識（蛍光アクセプタ：第１のアクセプタ）はＡｌｅｘａ５５５、残り３種への標識（無蛍光アクセプタ：第２のアクセプタ）についてはクエンチャ（消光色素）など種々の物質を使うことができる。ここで、クエンチャは、Ａｌｅｘａ５５５と同様にアクセプタ（ただしこの場合には無蛍光アクセプタ）として機能するので、蛍光共鳴エネルギー移動により、ドナーは発光強度低下する。第２のアクセプタについては、Ｑｄｏｔ（ドナー）や第１のアクセプタ（Ａｌｅｘａ５５５）との検出信号の明瞭な識別化を図るために、励起によって蛍光を生じない無蛍光ダーククエンチャを用いることが望ましい。クエンチャは、例えばＢＨＱ−１などである。なおｄＮＴＰへの標識は、ヌクレオチド3リン酸のγリン酸に付加することが望ましい。これは標識物質が伸長鎖に残らないようにするためである。 Various fluorescent substances can be used as fluorescent labels to be added to dNTPs and polymerases. In addition to general fluorescent compounds such as Alexa and Cy, it is possible to use Qdot which is a quantum dot. However, as described at the beginning, the two must be a combination that establishes a donor-acceptor relationship in FRET. For example, the fluorescent label (donor) for polymerase is Qdot 525, and the fluorescent label (fluorescent acceptor: first acceptor) of one type of base (different for each nucleotide set) in the first to fourth nucleotide sets described above is Alexa 555. For the remaining three types of labeling (non-fluorescent acceptor: second acceptor), various substances such as a quencher (quenching dye) can be used. Here, since the quencher functions as an acceptor (in this case, a non-fluorescent acceptor) similarly to Alexa555, the emission intensity of the donor decreases due to fluorescence resonance energy transfer. For the second acceptor, it is desirable to use a non-fluorescent dark quencher that does not generate fluorescence by excitation in order to clearly distinguish the detection signal from the Qdot (donor) and the first acceptor (Alexa 555). The quencher is, for example, BHQ-1. It is desirable that the label for dNTP be added to the γ-phosphate of nucleotide triphosphate. This is to prevent the labeling substance from remaining on the extended chain.
ここで、図１に戻り、蛍光測定装置全体について説明する。 Here, returning to FIG. 1, the entire fluorescence measuring apparatus will be described.
Ｑｄｏｔ５２５励起用のレーザ装置１（例えば、ＬＤレーザ、４０５ｎｍ）からのレーザ光をλ／４波長板２を通して円偏光とする。なおレーザは上記に特定されず、ドナーを励起できるものなら種類は問わない。例えば今回のようにＱｄｏｔ５２５を励起する際、Ｈｅ−Ｃｄレーザ（４４２ｎｍ）などを使用しても良い。レーザ光を、レンズを介して全反射照明用の石英製プリズム７に図のように入射面に垂直に入射し、ＤＮＡ分子を捕捉する基板８の裏側から照射する。石英製プリズム７と基板８はマッチングオイル（無蛍光グリセリン等）を介して接触させており、レーザ光はその界面で反射することなく、基板８に導入される。基板８の反応領域８ａ表面は反応液（水）で覆われており、その界面にてレーザ光は全反射し、エバネッセント照明となる。これにより、高いＳ／Ｎで蛍光測定が可能になる。
Laser light from the laser device 1 (for example, LD laser, 405 nm) for Qdot 525 excitation is circularly polarized through the λ / 4
なお、基板８の近傍には、温調器が配置されているが、図では省略した。また、通常観察のため、プリズム下部よりハロゲン照明、ＬＥＤ照明ができる構造としているが、図ではこれを省略している。
In addition, although the temperature controller is arrange | positioned in the vicinity of the board |
基板８の上部には、試薬などを流し、反応させるためのフローチャンバ９が構成されている。図２（Ｃ）に示すように、フローチャンバ９のうち、基板８の反応領域８ａと対向する領域が、既述した液槽９ａとなるために、液槽となる長方形（形状は問わない）で窪みを有しており、その窪みの両端に液体導入孔９ｂと液体排出孔９ｃが設けられている。フローチャンバ９は、石英材などの透明材質より形成されている。また、図１に示すように、フローチャンバ９の上面には、試薬導入口１２が設けてあり、分注ノズル２６を有する分注ユニット２５、試薬保管ユニット２７、チップボックス２８に収容された分注チップを用いて、目的の試薬液の注入などを行う。
A
具体的には、試薬保管ユニット２７には、試料液容器２７ａ、４種類（第１〜第４）のヌクレオチドセット溶液容器２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２７ｅ及び洗浄液容器２７ｆ等が用意される。チップボックス２８内の分注チップを分注ノズル２６に取り付け、適当な試薬液を吸引し、試薬導入口１２から基板の反応領域に導入し、反応させる。廃液は廃液チューブ１０を介して廃液容器１１に排出される。これらは制御ユニット（ＰＣ）２１により自動的に行われる。
Specifically, the
フローチャンバ９は、光軸方向に透明な材質で形成される。フローチャンバ内の蛍光標識ポリメラーゼのドナーの蛍光及びそれに共鳴励起される蛍光標識ヌクレオチドのアクセプタの蛍光は、符号１３に示すようにフローチャンバ９を透過して、自動ピント合わせ装置２９で制御される集光レンズ（対物レンズ）１４で集められ、フィルタユニット１５で必要な波長の蛍光を取り出され、不必要な波長の光が除去される。フィルタユニット１５を透過する蛍光は、ダイクロイックミラー３２により、波長ごとに分割された光束に分離される。分離された光束は、それぞれ補助フィルタ１７ａ、１７ｂを介して、結像レンズ１８ａ、１８ｂにより、それぞれ、２次元センサカメラ１９ａ、１９ｂ（高感度冷却２次元ＣＣＤカメラ）に結像させられ、検出される。カメラの露光時間の設定、蛍光画像の取り込みタイミングなどの制御は、２次元センサカメラコントローラ２０ａ、２０ｂを介して制御ＰＣ２１が行う。結果はモニタ２２に表示される。なお、フィルタユニット１５には、レーザ光除去用のロングパスフィルタ（４０５ｎｍ）、検出する波長帯を透過させるバンドパスフィルタ（透過帯域：４４０−６８０ｎｍ）を組み合わせて用いる。レーザ光除去用のハイパスフィルタの概略特性を図３（Ａ）に、バンドパスフィルタを図３（Ｂ）に、ダイクロイックミラー３２を図３（Ｃ）に示す。
The
なお、装置は、調整などのため、透過光観察用鏡筒１６とＴＶカメラ２３とモニタ２４を備えており、ハロゲン照明などで基板８の状態をリアルタイムで観察できるようになっている。
Note that the apparatus includes a transmission light
図２（Ａ）に示すように、基板８には位置決めマーカ８０、８１が刻印されている。マーカ８０、８１は、スポット８ｉｊの並びと平行に配置され、その間隔が規定されている。そこで、透過照明での観測でマーカ８０，８１を検出することで、スポット８ｉｊの位置を計算することができる。
As shown in FIG. 2A, positioning
本実施例で使用する２次元センサカメラ１９ａ，１９ｂとして、ＣＣＤエリアセンサを使用する。種々の画素サイズ、画素数のＣＣＤエリアセンサを使うことができる。たとえば、画素サイズが７．４×７．４マイクロメータで、画素数２０４８×２０４８画素の冷却ＣＣＤカメラを使用する。なお、２次元センサカメラとしては、ＣＣＤエリアセンサの他、Ｃ−ＭＯＳエリアセンサなどの撮像カメラなどを一般に使うことができる。ＣＣＤエリアセンサにも、構造によって、背面照射型、正面照射型があり、どちらも使用できる。また、素子内部に信号の増倍機能を有する電子増倍型ＣＣＤカメラなども高感度化を図る上で有効である。また、センサは冷却型が望ましく、−２０℃程度以下にすることで、センサの持つダークノイズを低減でき、測定の精度を高めることができる。
CCD area sensors are used as the two-
反応領域８ａからの蛍光像を一度に検出してもいいし、分割することもできる。この場合、基板の位置を移動させるためのＸ−Ｙ移動機構部をステージ下部に配置し、制御ＰＣで照射位置への移動、光照射、蛍光像検出を制御する。本例ではＸ−Ｙ移動機構部は図示していない。
（反応の工程）
図４に本実施例の反応フローを示す。基板８のＤＮＡ捕捉スポット８ｉｊの表面に、金を材質とした構造体が配置されている場合を例として説明する。
＜準備工程＞
ターゲットである鋳型ＤＮＡ３３を変性等によって一本鎖化し、その鋳型ＤＮＡ３３の５’末端をチオール化し（符号５０で示す）、３’末端にポリＡ配列３０を付加する。例えば、試薬バッファを導入口１２よりフローチャンバ９の液槽９ａに導入することにより、金−チオール結合を利用して、金構造体上にポリＡ付加鋳型ＤＮＡ３３を固定する。ポリＴプライマ３４をチャンバに導入し、ポリＡ付加鋳型ＤＮＡ３３にハイブリダイズさせる。余剰な鋳型ＤＮＡ３３およびプライマ３４を洗浄用バッファにてチャンバより洗い流す。
＜伸長反応工程１＞
次に、Ａｌｅｘａ５５５（第１のアクセプタ：蛍光アクセプタ）で標識されたｄＡＴＰ及びＢＨＱ−１（第２のアクセプタ：無蛍光アクセプタ：クエンチャ）で標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる第１のヌクレオチドセットと、Ｑｄｏｔ５２５（ドナー）で標識されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅポリメラーゼ３５とを加えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファを導入口１２よりフローチャンバ９ａへ導入し、伸長反応を開始する。反応中は、ＬＤレーザを連続的に照射し、常にＱｄｏｔ５２５を励起し続け、レーザ光により励起されて蛍光するＱｄｏｔ５２５およびそのＱｄｏｔ５２５からの蛍光波長によりＦＲＥＴにより励起されるＡｌｅｘａ５５５の蛍光強度の変化をモニタリングし続ける。照射方法はエバネッセント照射であり、反応領域８ａ表面近傍のみが励起光照射領域となるため、それ以外の領域に存在するＱｄｏｔ５２５ポリメラーゼ３５は励起されず、背景光の少ない測定ができる。
The fluorescent image from the
(Reaction process)
FIG. 4 shows the reaction flow of this example. A case where a structure made of gold is arranged on the surface of the DNA capture spot 8ij of the
<Preparation process>
The
<Extension reaction step 1>
Next, a first nucleotide set comprising dATP labeled with Alexa555 (first acceptor: fluorescent acceptor) and dCTP, dGTP, dTTP labeled with BHQ-1 (second acceptor: non-fluorescent acceptor: quencher) Then, a Thermo Sequenase Reaction buffer to which
Ｑｄｏｔ５２５とＡｌｅｘａ５５５の蛍光はダイクロイックミラー３２で波長ごとに分けられ、補助フィルタ１７ａ，１７ｂおよびレンズ１８ａ，１８ｂを介してそれぞれ２台のＣＣＤカメラ１９ａ，１９ｂに結像される。第１のＣＣＤカメラ１９ａでは、Ｑｄｏｔ５２５の蛍光が、第２のＣＣＤカメラ１９ｂではＡｌｅｘａ５５５の蛍光がそれぞれ常時モニタリングされる。伸長反応においてヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の取り込みが生じた際、Ｑｄｏｔ５２５とＡｌｅｘａ５５５またはＢＨＱ−１の距離は十分に近くなり、両者の間にはＦＲＥＴにおけるドナー・アクセプタの関係が成立する。すなわち、ドナーであるＱｄｏｔ５２５の蛍光強度が低下した場合、アクセプタ或いはクエンチャが近傍に存在しｄＮＴＰの取り込みが生じたことになる。同時にＡｌｅｘａ５５５の蛍光強度が観察された場合は、取り込まれたｄＮＴＰの種類がＡｌｅｘａ５５５によって標識されたｄＮＴＰであると特定できる。例えば上記第１のヌクレオチドセットを用いて伸長反応を行った際、Ｑｄｏｔ５２５の信号が低下すると同時にＡｌｅｘａ５５５の信号が観察された場合、そのｄＮＴＰの種類は塩基種Ａである。一方、Ｑｄｏｔ５２５の信号が低下したが、Ａｌｅｘａ５５５の蛍光強度が観察されない場合には、クエンチャ（消光色素）であるＢＨＱ−１に標識されたｄＮＴＰ（ここでは、Ｃ、Ｇ、Ｔのうちいずれか一つ）が取り込まれたことになる。Ｑｄｏｔ５２５の蛍光強度低下のイベント数は、また、取り込まれたｄＮＴＰの数に等しいため、上記第１のヌクレオチドセットを用いた場合、上記したＡｌｅｘａ５５５の蛍光信号とＢＨＱ−１の消光信号の配列により、伸長鎖（ヌクレオチド配列）３６中の何塩基の間隔で塩基種Ａ（ｄＡＴＰ）が存在しているかという情報を得ることができる。例えば、Ｑｄｏｔ５２５の信号強度低下が１０回観察され、Ａｌｅｘａ５５５の信号強度の変化が、（０＝信号なし、１＝信号あり）として、［００１００００１００］というデータを得た場合、鋳型ＤＮＡ３３は10ｂｐであり、その３番目と８番目は塩基種Ａであるので、これに相補的なターゲット鋳型ＤＮＡの塩基種は、Ｔであることが特定できる。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３６を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程２＞
前記洗浄バッファによる伸長鎖除去後に、残存する前記ターゲット鋳型ＤＮＡ（ポリＡ付加鋳型ＤＮＡ）３３及び新たに導入したプライマ３４を用い、且つＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＣＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰとからなる第２のヌクレオチドセットを用いて、反応工程１と同様の手順で反応・観察を行う。本工程によって、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３に取り込まれる伸長鎖（ヌクレオチド配列）３６中の塩基種Ｃ（ｄＣＰＴ）については、ＦＲＥＴによりＡｌｅｘａ５５５が蛍光する。したがって、これと相補的なターゲット鋳型ＤＮＡの塩基種Ｇの位置が特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３６を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程３＞
前記洗浄バッファによる伸長鎖除去後に、前記ターゲット鋳型ＤＮＡ（ポリＡ付加鋳型ＤＮＡ）３３及び新たに導入したプライマ３４を用い、且つＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＧＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰとからなる第３のヌクレオチドセットを用いて、反応工程１、２と同様の手順で反応・観察を行う。本工程によって、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３に取り込まれる伸長鎖（ヌクレオチド配列中）３６の塩基種ＧについてはＦＲＥＴによりＡｌｅｘａ５５５が蛍光するので、Ｇに相補的なターゲット鋳型ＤＮＡのＣの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３６を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程４＞
前記洗浄バッファによる伸長鎖除去後に、前記ターゲット鋳型ＤＮＡ（ポリＡ付加鋳型ＤＮＡ）３３及び新たに導入したプライマ３４を用い、且つＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＴＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰからなる第４のヌクレオチドセットを用いて、反応工程１と同様の手順で反応・観察を行う。本工程によって、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３に取り込まれる塩基種（ヌクレオチド配列中）３６の塩基種ＴについてはＦＲＥＴによりＡｌｅｘａ５５５が蛍光するので、Ｔに相補的なターゲット鋳型ＤＮＡのＡの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３６を洗浄バッファによって除去する。
The fluorescence of Qdot 525 and Alexa 555 is divided for each wavelength by the
<
After removal of the extended strand by the washing buffer, dCTP labeled with Alexa555 and dATP labeled with BHQ-1 using the remaining target template DNA (poly A-added template DNA) 33 and the newly introduced
<
After removal of the extended strand by the washing buffer, the target template DNA (poly A-added template DNA) 33 and the newly introduced
<Extension reaction step 4>
After removal of the extended strand by the washing buffer, using the target template DNA (poly A-added template DNA) 33 and the newly introduced
以上の１〜４の反応工程（４サイクル）で得られた蛍光強度信号のモニタリング（検出）データを総合して、鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定する。サンプルとして10ｂｐの未知配列をシーケンシングした際の、第１のヌクレオチドセットによって得られるデータの模式図を図５（Ａ）に、第２のヌクレオチドセットによって得られるデータの模式図を図５（Ｂ）に、第３のヌクレオチドセットによって得られるデータの模式図を図５（Ｃ）に、第４のヌクレオチドセットによって得られるデータの模式図を図５（Ｄ）に示す。図５（Ａ）〜図５（Ｄ）は、Ｑｄｏｔ５２５およびＡｌｅｘａ５５５の信号強度の時間変化を表し、上側の信号が第１のＣＣＤ１９ａで検出されるＱｄｏｔ５２５（ドナー蛍光）由来の信号、下側の信号が第２のＣＣＤ１９ｂで検出されるＡｌｅｘａ５５５（第１のアクセプタ：蛍光アクセプタ）由来およびクエンチャ（第２のアクセプタ：無蛍光アクセプタ）由来の信号である。
The sequence of the
本実施例では、第１のヌクレオチドセットによって得られるｄＮＴＰ配列情報は、ＢＢＡＢＢＢＡＢＢＢ（Ｂ＝Ｃ、Ｇ、Ｔのいずれか）、第２のヌクレオチドセットによって得られるｄＮＴＰ配列情報は、ＤＤＤＤＤＣＤＤＣＤ（Ｄ＝Ａ、Ｇ、Ｔのいずれか）、第３のヌクレオチドセットによって得られるｄＮＴＰ配列情報はＧＨＨＨＨＨＨＧＨＨ（Ｈ＝Ａ、Ｃ、Ｔのいずれか）、第４のヌクレオチドセットによって得られるｄＮＴＰ配列情報はＶＴＶＴＴＶＶＶＶＴ（Ｖ＝Ａ、Ｃ、Ｇのいずれか）となる。以上の結果より、鋳型ＤＮＡ３３に取り込まれたヌクレオチドは順にＧＴＡＴＴＣＡＧＣＴであると特定できる。それにより、相補的なターゲット鋳型ＤＮＡの塩基配列は、ＣＡＴＡＡＧＴＣＧＡと解読される。
In this example, the dNTP sequence information obtained by the first nucleotide set is BB A BBB A BBB (any of B = C, G, T), and the dNTP sequence information obtained by the second nucleotide set is DDDDD C DD C D (D = A, G, T), dNTP sequence information obtained by the third nucleotide set is G HHHHHH G HH (H = A, C, T), fourth nucleotide The dNTP sequence information obtained by the set is V T V TT VVVV T (V = A, C, or G). From the above results, the nucleotides incorporated into the
かような核酸解析（本実施例では塩基配列）は、演算装置（制御ユニット）２１が、ｄＮＴＰの捕捉，伸長が確認されたスポット８ｉｊの位置データ（二次元センサカメラ１９ａ，１９ｂの座標データ）と、その位置における蛍光検出データ（二次元センサカメラセンサ１９ａ，１９ｂの光測定強度）を取り込み、これらのデータに基づき上記の配列情報を演算することで行われる。
Such a nucleic acid analysis (base sequence in the present embodiment) is performed by the arithmetic unit (control unit) 21 using the positional data of the spot 8ij (datum data of the two-
なお本システムでは、反応領域８ａの複数のスポット８ｉｊからの発光を同時計測できるため、スポット８ｉｊにそれぞれ異なる鋳型ＤＮＡを設置する場合には、前記複数の異なる鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取り込まれたｄＮＴＰの塩基種を、つまり複数の鋳型ＤＮＡの配列を上記の位置データおよび蛍光検出データにより同時に決定することができる。
In this system, since light emission from a plurality of spots 8ij in the
また、使用できる蛍光体（ドナー、アクセプタ）は本実施例に示すものに限らず、所定の励起光を使い、異なる蛍光特性を有する蛍光体の組み合わせであれば同様に使用できる。一般には、蛍光極大波長が各々異なる種類の組み合わせであればよい。本実施例では、ドナーとしてのＱｄｏｔ５２５は、４０５ｎｍ励起、５２５ｎｍ蛍光であり、アクセプタとしてのＡｌｅｘａ５５５は、５２５ｎｍ励起、５７０ｎｍ蛍光であり、図１１の蛍光波長特性に示すように両者の蛍光波長特性が十分に離れているので、両者の蛍光識別の精度が高められる。 The usable phosphors (donors and acceptors) are not limited to those shown in the present embodiment, and any combination of phosphors having different fluorescence characteristics using predetermined excitation light can be used. In general, any combination of different types of fluorescent maximum wavelengths may be used. In this example, Qdot 525 as a donor has 405 nm excitation and 525 nm fluorescence, and Alexa 555 as an acceptor has 525 nm excitation and 570 nm fluorescence, and the fluorescence wavelength characteristics of both are sufficient as shown in the fluorescence wavelength characteristics of FIG. Therefore, the accuracy of fluorescence identification between the two is improved.
さらに、本実施例では、第１のアクセプタをドナー励起により発光する蛍光物質により構成し、第２のアクセプタとして、無蛍光アクセプタを用いるが、第２のアクセプタについては、第１のアクセプタに対して識別できる程度の弱い光（例えば、第１のアクセプタの１／１０程度の光）、換言すれば識別可能な発光強度を有する蛍光物質であってもよい（後述の他の実施例でも同様である）。換言すれば、第１のアクセプタの発光強度は、第２のアクセプタの発光強度の１０倍以上である。また、第１のアクセプタと第２のアクセプタとして、互いの波長が顕著に離れている蛍光色素を使用してもよい。 Furthermore, in the present embodiment, the first acceptor is composed of a fluorescent substance that emits light by donor excitation, and a non-fluorescent acceptor is used as the second acceptor. However, the second acceptor is different from the first acceptor. Light that is weak enough to be identified (for example, about 1/10 of the first acceptor), in other words, may be a fluorescent material having a distinguishable emission intensity (the same applies to other examples described later). ). In other words, the emission intensity of the first acceptor is 10 times or more the emission intensity of the second acceptor. Moreover, you may use the fluorescent pigment | dye which the wavelength mutually remarkably separated as a 1st acceptor and a 2nd acceptor.
例えば、ドナーがQdot 525の場合には、第１のアクセプタとしては、Alexa555のほかにCｙ３があり、第２のアクセプタとして消光させるタイプのものにはBHQ-1のほかに、BHQ-2、DABCYL、Eclipse dark quencher、Iowa black FQ等がある。また、第１のアクセプタとして、上記同様にAlexa555或いはCｙ３とした場合、第２のアクセプタとして蛍光強度・波長特性の異なるタイプのものには、TAMRA、Cy3.5などがある。 For example, when the donor is Qdot 525, the first acceptor is Cy3 in addition to Alexa555, and BHQ-1 and BHQ-2, DABCYL are the types that can be quenched as the second acceptor. Eclipse dark quencher, Iowa black FQ, etc. Further, when Alexa555 or Cy3 is used as the first acceptor as described above, TAMRA, Cy3.5, and the like are types of second acceptors having different fluorescence intensity and wavelength characteristics.
本実施例ではまた、石英製プリズム７に対してレーザ光をその入射面に垂直つまり入射角度０度で入射している。これにより、基板８とプリズム７を一体化して移動させても、対物レンズ１４の観察視野からレーザ照射位置がずれないため、基板とプリズムを一体化することができ、プリズムと基板とのカップリング方式を種々選ぶことが可能になる。オイルカップリングのほか、光学接着も可能になり、装置構成を容易に選ぶことができる。
In the present embodiment, laser light is incident on the
本実施例では、基板８の各８ｉｊの反応領域に結合しているドナー蛍光分子が１分子であり、複数の異なる蛍光分子が同じ位置にいないため、本発明のような装置及び方法で効率よく蛍光体種つまりは塩基種が識別でき、しかも高密度な基板に対応できる。
In this embodiment, there is one donor fluorescent molecule bonded to the reaction region of each 8ij of the
なお、本実施例では、検出する波長帯域が４８０−６８０ｎｍであるが、これに制限されることはない。使用する蛍光体の波長帯域に応じて、任意に対応できる。 In this embodiment, the wavelength band to be detected is 480-680 nm, but is not limited to this. It can be arbitrarily supported according to the wavelength band of the phosphor to be used.
実施例では、オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉される基板８に、蛍光測定用の励起光を照射し、それにより生じるドナー蛍光及びＦＲＥＴによるアクセプタ蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する。基板は実質的に透明な基板であり、分子が捕捉されうるスポットが複数設けられ、それらが格子配列構造の格子点位置（スポット８ｉｊ）に配置されている。該基板上で必要な試薬や試料などを反応させ、全反射照明のための光励起用の光源と、照射光学系により該基板上の蛍光体を励起し、発する蛍光を蛍光集光系で集光し、その光束を指定の波長範囲において実質的に各々の波長で異なる比率で分割する分光部により分割し、結像光学系で各々検出器に結像し、複数の検出画素を備えた検出器により検出する。これにより、簡便に多種の蛍光体種を識別検出することができる。
In this embodiment, the
実施例では、基板に金属構造物を形成している。この場合、構造物の光ルミネセンス、光散乱を検出することで、構造物の空間位置を検出することができ、位置の基準マーカとして活用でき、効果的である。 In the embodiment, a metal structure is formed on the substrate. In this case, the spatial position of the structure can be detected by detecting the photoluminescence and light scattering of the structure, which is effective as a reference marker for the position.
格子点位置の領域（スポット、格子点の領域）の大きさは１００ｎｍ径以下にする。少なくとも、隣接する最短の格子点の間隔の１／３以下が好ましい。これにより、光学的に解像しやすくなり、識別が容易になる。格子点位置の捕捉のための領域を１０ｎｍ〜３０ｎｍ程度にすれば、単一分子の捕捉に有効である。 The size of the lattice point position region (spot, lattice point region) is set to a diameter of 100 nm or less. At least 1/3 or less of the interval between the shortest adjacent lattice points is preferable. This facilitates optical resolution and facilitates identification. If the region for capturing the lattice point position is about 10 nm to 30 nm, it is effective for capturing a single molecule.
また、本例では、一定間隔の格子状に捕捉スポットを配置する基板を使用する。格子状に配置することで、透過像と反射像内の相対応する輝点の識別が容易になる。格子状に捕捉スポットを配置する基板を使わない場合にも対応する。分子をランダムに分散させて捕捉する場合など、捕捉位置が、ランダムに分散する場合は、両方の画像を比較し、パターン解析し、または基準マーカを参照して、相対応する輝点を判定すればよい、これによっても同様の効果が得られる。 In this example, a substrate is used in which capture spots are arranged in a lattice pattern with a constant interval. By arranging them in a lattice shape, it becomes easy to identify the corresponding bright spots in the transmission image and the reflection image. This also corresponds to the case where a substrate on which trapping spots are arranged in a grid is not used. If the capture position is randomly dispersed, such as when molecules are randomly dispersed and captured, compare both images, analyze the pattern, or refer to a reference marker to determine the corresponding bright spot. The same effect can be obtained by this.
本実施例は、図６の反応フローに示すように、基板８表面のｄＮＴＰ捕捉スポットに、プライマ３４を固定配置し、これにターゲットとなる鋳型ＤＮＡ３３をハイブリダイズさせ、伸長反応によって鋳型ＤＮＡ３３に相補鎖な伸長鎖３６を合成し、その伸長鎖３６にさらに相補的に捕捉される伸長鎖３８の配列を解読することで、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定する。この場合、伸長鎖３８の配列は、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３の配列そのものとなる。
（装置構成）
実施例１と同様の構成である
（反応の工程）
＜準備工程＞
前準備として、ターゲットである鋳型ＤＮＡ３３を変性等によって一本鎖化し、その鋳型ＤＮＡ３３の３’末端にポリＡ配列３０を付加してポリＡ付加鋳型ＤＮＡ３３を作成しておく。そして、図６の上段に示すように、基板８表面のｄＮＴＰ捕捉スポット８ｉｊには、ポリＴプライマ３４を固定する。固定方法は、例えばポリＴプライマ３４の５’末端をチオール化し（符号５０で示す）、ｄＮＴＰ捕捉スポット８ｉｊ（測定スポット）に配置した金構造体に対し、金−チオール結合を利用する。そして、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３をチャンバに導入し、ポリＴプライマ３４とハイブリダイズさせる。任意のヌクレオチドセット（第１〜第４のヌクレオチドセットのいずれか）およびＱｄｏｔ５２５で標識されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅポリメラーゼ３５を加えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファを導入口１２よりチャンバへ導入し、ポリメラーゼ反応により、ｄＮＴＰの捕捉・伸長反応を開始する。伸長反応完了後、熱変性を行い、遊離した鋳型ＤＮＡ３３を洗浄によって除去する。基板８（スポット８ｉｊ）に残った伸長鎖３６の３’末端に、プライマ認識部位として、ターミナルトランスフェラーゼ等によりポリＡ配列３７を付加する。なおプライマ認識配列としては、既知の配列を付加しても構わない。
＜伸長反応工程１＞
上記準備工程後に、図６の下段に示すように、新たなポリＴプライマ３４をフローチャンバ９に導入し、鋳型ＤＮＡ３３に相補的な伸長鎖３６の末端３’に付加したポリＡ配列３７とハイブリダイズさせる。そして、Ａｌｅｘａ５５５（蛍光アクセプタ：第１アクセプタ）で標識されたｄＡＴＰと、ＢＨＱ−１（無蛍光アクセプタ：第２アクセプタ）で標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰとからなる第１のヌクレオチドセット、および、Ｑｄｏｔ５２５（ドナー）で標識されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅポリメラーゼ３５を加えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファを、導入口１２よりフローチャンバへ導入し、伸長反応を開始する。伸長鎖（鋳型３３に対する相補鎖）３６にとり取り込まれる一分子ずつのｄＮＴＰの伸長により相補的な伸長鎖３８が形成される過程で、実施例１と同様の手順で観察を行う。本工程によってターゲット鋳型ＤＮＡ３３中の塩基種Ａの位置を伸長鎖３８から特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行って伸長鎖３８を遊離させ、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程２＞
前記洗浄バッファによる伸長鎖３８の除去後に、図６の下段に示すように、新たに導入したポリＡ３７及びプライマ３４を用い、且つＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＣＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰとからなる第２のヌクレオチドセットを用いて、反応工程１と同様の手順（反応）で新たに伸長鎖３８を形成し、観察を行う。本工程によって、鋳型ＤＮＡ３３中のＣの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程３＞
前記洗浄バッファによる伸長鎖３８の除去後に、再度、新たに導入したポリＡ３７及びプライマ３４を用い、且つＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＧＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰからなる第２のヌクレオチドセットを用いて、反応工程１と同様の手順で新たに伸長鎖を形成し、観察を行う。本工程によって、鋳型ＤＮＡ３３中のＧの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程４＞
前記洗浄バッファによる伸長鎖３８の除去後に、再度、新たに導入したポリＡ３７及びプライマ３４を用い、且つＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＴＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰからなる第２のヌクレオチドセットを用いて、反応工程１と同様の手順で新たな伸長鎖を形成し、観察を行う。本工程によって、鋳型ＤＮＡ３３中のＴの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。
In this embodiment, as shown in the reaction flow of FIG. 6, a
(Device configuration)
The structure is the same as in Example 1 (reaction process).
<Preparation process>
As a preparation, the
<Extension reaction step 1>
After the above preparation step, as shown in the lower part of FIG. 6, a new
<
After removal of the extended
<
After removal of the
<Extension reaction step 4>
After removal of the extended
以上１〜４の反応工程で得られたデータを総合して、実施例１同様にターゲットである鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定する。
By combining the data obtained in the reaction steps 1 to 4 above, the sequence of the
本実施例では、図７に反応フローに示すように、基板表面に配置したプライマ３４に対し、ターゲットとなる鋳型ＤＮＡ３３を環状化してハイブリダイズさせ、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）反応によってターゲット鋳型ＤＮＡ３３に取り込まれたヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の種類を決定することで、鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定する。ＲＣＡ法とは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて、鋳型となる環状ＤＮＡから相補鎖を連続して合成する手法である。使用するポリメラーゼは、例えばバクテリオファージ由来のｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼやＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）などである。
（装置構成）
実施例１と同様の構成である。
（反応の工程）
＜準備工程＞
前準備として、ターゲットである鋳型ＤＮＡ３３を変性等によって一本鎖化し、その鋳型ＤＮＡ３３の３’末端にポリＡ配列７０を付加して、鋳型ＤＮＡを環状化しておく。そして、図７に示すように、基板表面のｄＮＴＰ捕捉スポット８ｉｊには、ポリＴプライマ３４を固定する。固定方法は例えばポリＴプライマ３４の５’末端をチオール化（５０）し、ｄＮＴＰ捕捉スポット８ｉｊ（測定スポット）に配置した金構造体に対し、金−チオール結合を利用する。そして、上記環状鋳型ＤＮＡ３３をフローチャンバに導入し、ポリＡ配列７０に、ポリＴプライマ３４とハイブリダイズさせる。
＜伸長反応工程１＞
上記準備工程後に、Ａｌｅｘａ５５５（蛍光アクセプタ：第１アクセプタ）で標識されたｄＡＴＰ及びＢＨＱ−１（無蛍光アクセプタ：第２アクセプタ）で標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる第１のヌクレオチドセットと、Ｑｄｏｔ５２５（ドナー）で標識されたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ３５とを加えた反応バッファを、導入口１２よりフローチャンバへ導入し、ＲＣＡ反応を開始する。実施例１と同様の手順で観察を行う。本工程によって鋳型ＤＮＡ３３と相補のｄＮＴＰが順次捕捉され伸長して伸長鎖７１ａ(総称としては、７１で示す)が得られ、その伸長鎖７１ａ中の塩基Ａ（ｄＡＴＰ）の位置を実施例１、２同様のＦＲＥＴを利用して特定する。ちなみに、伸長が続くと、伸長鎖の５’末端で鋳型ＤＮＡのポリＡ配列７０の部分との置換が始まり（新たなプライマ合成）鋳型ＤＮＡ一周分の合成が終了する。伸長鎖７１ａの合成が終了した時点からポリＡ配列７０での置換が終了する時点（新たなプライマ合成が終了する時点）間の任意の時点で、２−ニトロベンジル基が結合するケージドｄＮＴＰをチャンバに導入して伸長反応を停止させる。フローチャンバ９内を洗浄し、遊離ｄＮＴＰを除去する。
＜伸長反応工程２＞
次いで、Ａｌｅｘａ５５５で標識されたｄＣＴＰ及びＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる第２のヌクレオチドセットをフローチャンバ内に導入する。３６０ｎｍ以下の紫外線を照射し、ケージド物質（２−ニトロベンジル基）を遊離させ、伸長鎖７１の伸長反応を再開することにより新たなプライマを拠点として伸長鎖７１ｂを得る。この場合の伸長反応の工程および観察は、伸長反応１の工程と同様の手順である。本工程によって、伸長鎖７１ｂ中の塩基Ｃ（ｄＣＴＰ）の位置を特定する。伸長鎖７１ｂの合成終了時点後、反応工程１同様にタイミングで、２−ニトロベンジル基が結合するケージドｄＮＴＰをチャンバに導入して伸長反応を停止する。チャンバ内を洗浄し、遊離ｄＮＴＰを除去する。
＜伸長反応工程３＞
次いで、Ａｌｅｘａ５５５で標識されたｄＧＴＰ及びＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰからなる第３のヌクレオチドセットをフローチャンバ内に導入する。上記伸長反応２の工程同様に、３６０ｎｍ以下の紫外線を照射し、ケージド物質（２−ニトロベンジル基）を遊離させ、伸長鎖７１の伸長反応を再開することにより、伸長鎖７１ｃを得る。この場合の伸長反応の工程および観察は、伸長反応１、２の工程と同様の手順である。本工程によって、伸長鎖７１ｃ中の塩基Ｇ（ｄＧＰＴ）の位置を特定する。一定時間伸長反応後、２−ニトロベンジル基が結合するケージドｄＮＴＰをチャンバに導入して伸長反応を停止する。チャンバ内を洗浄し、遊離ｄＮＴＰを除去する。
＜伸長反応工程４＞
次いで、Ａｌｅｘａ５５５で標識されたｄＴＴＰ及びＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰからなる第４のヌクレオチドセットをチャンバ内に導入する。３６０ｎｍ以下の紫外線を照射し、ケージド物質（２−ニトロベンジル基）を遊離させ、伸長反応を再開し、伸長鎖７１ｄを得る。この場合、伸長反応工程１〜３と同様の手順で反応・観察を行う。本工程によって、伸長鎖７１ｄ中の塩基Ｔ（ｄＴＰＴ）の位置を特定する。一定時間伸長反応後、２−ニトロベンジル基が結合するケージドｄＮＴＰをチャンバに導入して伸長反応を停止する。チャンバ内を洗浄し、遊離ｄＮＴＰを除去する。
In this example, as shown in the reaction flow in FIG. 7, the
(Device configuration)
The configuration is the same as in the first embodiment.
(Reaction process)
<Preparation process>
As a preparatory step, the
<Extension reaction step 1>
After the preparatory step, a first nucleotide set consisting of dATP labeled with Alexa555 (fluorescent acceptor: first acceptor) and dCTP, dGTP, dTTP labeled with BHQ-1 (non-fluorescent acceptor: second acceptor); A reaction buffer added with
<
Next, a second nucleotide set consisting of dCTP labeled with Alexa555 and dATP, dGTP, dTTP labeled with BHQ-1 is introduced into the flow chamber. The
<
Next, a third nucleotide set consisting of dGTP labeled with Alexa555 and dATP, dCTP, dTTP labeled with BHQ-1 is introduced into the flow chamber. Similarly to the step of the
<Extension reaction step 4>
Next, a fourth nucleotide set consisting of dTTP labeled with Alexa555 and dATP, dCTP, dGTP labeled with BHQ-1 is introduced into the chamber. Ultraviolet rays of 360 nm or less are irradiated to release the caged substance (2-nitrobenzyl group), and the extension reaction is restarted to obtain an
伸長鎖７１ａ〜７１ｄの塩基配列パターンは、いずれも同一であるので、１〜４の伸長反応工程で得られたＦＲＥＴ（Ｑｄｏｔ５２５、Ａｌｅｘａ５５５、ＢＨＱ−１）の蛍光検出データを総合して、ターゲットである鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定する。本例によれば、熱変性が不要であるため、操作が簡便となる。本実施例では最初のヌクレオチドセットで鋳型鎖１周分のシーケンシングを完了した時点で反応を停止し、次のヌクレオチドセットを導入しているが、複数周分のシーケンスを行うことも可能である。この場合、配列を複数回読むことで精度が向上するとい
うメリットがある。
Since the base sequence patterns of the
ＤＮＡポリメラーゼ３５の基質としては、鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができ、かつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体であり、なんらかの手段により該ｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻す（再開する）ことのできるものである。このような伸長可能な状態に戻す試薬として、本例では、蛍光標識ケージドｄＮＴＰを使用するが、蛍光体とヌクレオチドをジスルフィド結合により結合するｄＮＴＰの誘導体などでも同様に実施可能である。この場合、蛍光体の存在で、伸長が停止し、Ｔｒｉｓ［２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ］ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ試薬などでジスルフィド結合を化学的に解離させて伸長可能な状態に戻すことが可能である。
The substrate of the
なお本実施例では、使用者の利便性を考慮し、ヌクレオチドセット交換時に反応を停止するような試薬および機能を追加したが、これらの工程が無くともシーケンシングは成立する。 In this example, in consideration of convenience for the user, a reagent and a function for stopping the reaction at the time of nucleotide set exchange are added, but the sequencing can be established without these steps.
実施例３では、ターゲットとなる鋳型ＤＮＡ３３を環状化し、プライマ３４を介して基板表面に結合させているが、別方式として、ドナーであるＱｄｏｔ５２５−ポリメラーゼ複合体３５を基板表面に配置して（図示省略）、環状の鋳型ＤＮＡ３３を上記複合体と結合させ伸長反応を行い、取り込まれたｄＮＴＰの種類を決定してもよい。装置構成および反応工程は実施例３と同様である。
In Example 3, the
本実施例の反応フローを図８に示す。本実施例では、実施例３同様の反応手順により、基板表面に配置したプライマ３４に対し、ターゲットとなる鋳型ＤＮＡ３３を環状化してハイブリダイズさせ、ＲＣＡ反応によって鋳型ＤＮＡ３３に相補鎖な配列を連続して持つ伸長鎖７１を、前記した第１〜第４のヌクレオチドセットごとに順次合成する（すなわち伸長鎖７１ａ〜７１ｄを順次合成する）。さらに、熱変性、洗浄により環状ＤＮＡ鋳型３３及びポリメラーゼ３５を洗浄除去した後に、ポリＧ配列７２を伸長鎖７１の末端３’に付加し、このポリＧ７２にプライマ７３をハイブリダイズする。この状態で、再度、第１〜第４のヌクレオチドセットを順次、標識ポリメラーゼと共に加えることで、伸長鎖７１ａ〜７１ｄに相補のｄＮＴＰ伸長鎖７４ａ〜７４ｄを合成する。この伸長鎖７４ａ〜７４ｄのＦＲＥＴによる蛍光検出データの配列を解読することで、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定することが可能になる。
（装置構成）
実施例１と同様の構成である
（反応の工程）
＜準備工程＞
前準備として、ターゲットである鋳型ＤＮＡ３３を変性等によって一本鎖化し、その鋳型ＤＮＡ３３の３’末端にポリＡ配列７０を付加して、鋳型ＤＮＡを環状化しておく。そして、図８に示すように、基板表面のｄＮＴＰ捕捉スポット８ｉｊには、ポリＴプライマ３４を固定する。固定方法は例えばポリＴプライマ３４の５’末端をチオール化（５０）し、ｄＮＴＰ捕捉スポット８ｉｊ（測定スポット）に配置した金構造体に対し、金−チオール結合を利用する。そして、上記環状鋳型ＤＮＡ３３をフローチャンバに導入し、ポリＡ配列７０を、ポリＴプライマ３４にハイブリダイズさせる。さらに、既述した第１〜第４のヌクレオチドセットを順次、Ｑｄｏｔ５２５で標識された鎖置換活性を有するポリメラーゼ３５と共に反応バッファとして導入口１２よりフローチャンバへ導入し、実施例３同様のＲＣＡ反応工程により伸長鎖７１（７１ａ〜７１ｄ）を合成する。ここまでは、図７の一連の反応工程と同様であるが、本実施例では、ここまでが前準備工程であるので、蛍光検出は行われない。伸長鎖７１の合成後、熱変性を行い、鋳型ＤＮＡ３３を遊離し且つそれを洗浄によって除去する。残った伸長鎖７１の３’末端に、プライマ認識部位として、ターミナルトランスフェラーゼ等によりポリＧ配列７２を付加する。なおプライマ認識配列としては、既知の配列を付加しても構わない。
＜伸長反応工程１＞
次いで、ポリＣプライマ７３をフローチャンバに導入し、鋳型ＤＮＡ３３に伸長鎖７１（７１ａ〜７１ｄ）のポリＧ配列７２にハイブリダイズさせる。この状態で、Ａｌｅｘａ５５５（第１のアクセプタ）で標識されたｄＡＴＰ及びＢＨＱ−１（第２のアクセプタ）で標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる第１のヌクレオチドセットと、Ｑｄｏｔ５２５（ドナー）で標識されたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ３５とを加えた反応バッファを、導入口１２よりフローチャンバ９へ導入し、ＲＣＡ反応を開始する。本工程で伸長鎖７１（７１ａ〜７１ｄ）に相補な伸長鎖７４（７４ａ〜７４ｄ）を得る。本工程によって伸長鎖７４（７４ａ〜７４ｄ）のうち塩基Ａの蛍光検出データ（前述の実施例同様のＦＲＥＴによる蛍光検出データ）が得られ、このデータを下に鋳型ＤＮＡ３３中の塩基Ａの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖７４及びプライマ７３を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程２＞
次いで、新たにポリＣプライマ７３をチャンバに導入し、反応工程１同様に、残存する伸長鎖７１のポリＧ配列７２とハイブリダイズさせる。この状態で、Ａｌｅｘａ５５５で標識されたｄＣＴＰ及びＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる第２のヌクレオチドセットと、Ｑｄｏｔ５２５で標識されたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ３５とを加えた反応バッファをフローチャンバ９へ導入する。これにより、反応工程１同様にして、伸長鎖７１に相補な伸長鎖７４を得る。本工程によって伸長鎖７４のうち塩基Ｃの蛍光検出データが得られ、このデータを下に鋳型ＤＮＡ３３中の塩基Ｃの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖７４及びプライマ７３を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程３＞
次いで、新たなポリＣプライマ３４をチャンバに導入し、反応工程１、２同様に、残存する伸長鎖７１のポリＧ配列７２とハイブリダイズさせる。この状態で、Ａｌｅｘａ５５５で標識されたｄＧＴＰ及びＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰからなる第３のヌクレオチドセットと、Ｑｄｏｔ５２５で標識されたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ３５とを加えた反応バッファをフローチャンバ９へ導入する。これにより、反応工程１、２同様にして、伸長鎖７１に相補な伸長鎖７４を得る。本工程によって伸長鎖７４のうち塩基Ｇの蛍光検出データが得られ、このデータを下に鋳型ＤＮＡ３３中の塩基Ｇの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖７４及びプライマ７３を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程４＞
次いで、新たなポリＣプライマ３４をチャンバに導入し、反応工程１、２、３同様に、残存する伸長鎖７１のポリＧ配列７２とハイブリダイズさせる。この状態で、Ａｌｅｘａ５５５で標識されたｄＴＴＰ及びＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰからなる第４のヌクレオチドセットと、Ｑｄｏｔ５２５で標識されたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ３５とを加えた反応バッファをフローチャンバ９へ導入する。これにより、反応工程１、２、３同様にして、伸長鎖７１に相補な伸長鎖７４を得る。本工程によって伸長鎖７４のうち塩基Ｔの蛍光検出データが得られ、このデータを下に鋳型ＤＮＡ３３中の塩基Ｔの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖７４及びプライマ７３を洗浄バッファによって除去する。
The reaction flow of this example is shown in FIG. In this example, the
(Device configuration)
The structure is the same as in Example 1 (reaction process).
<Preparation process>
As a preparatory step, the
<Extension reaction step 1>
Next, the
<
Next, a new
<
Next, a new
<Extension reaction step 4>
Next, a new
以上１〜４の反応工程で得られたデータを総合して、ターゲットである鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定する。本実施例によれば、塩基配列を、塩基種ごとに、いずれも伸長鎖７４ａ〜７４ｂから読むので、複数回（本実施例では、４回）読むことで精度が向上する。
By combining the data obtained in the above reaction steps 1 to 4, the sequence of the
上記実施例１から３の変形例として、Ｑｄｏｔ５２５（ドナー）を、ポリメラーゼに代えて鋳型ＤＮＡ３３に標識し、すなわち基板上に鋳型ＤＮＡ３３を介してＱｄｏｔ５２５を固定し、前記第１〜第４のヌクレオチドセットと蛍光標識無しのポリメラーゼとを前記実施例同様に用いてｄＮＴＰ伸長反応を行うことも可能である。鋳型ＤＮＡ上のＱｄｏｔ５２５の位置は、ＦＲＥＴに必要なドナー・アクセプタ間の距離がおおよそ１０ｎｍに制限される関係上、伸長鎖として取り込まれるｄＮＴＰの位置に対して常にＦＲＥＴ反応が可能な距離（例えば１０ｎｍ）内を保てる箇所に設定する必要がある。このような条件の下で、実施例１〜３同様の蛍光検出をヌクレオチドセットごとのｄＮＴＰ伸長反応工程で行えば、鋳型ＤＮＡの配列解析が可能になる。本実施例は、短鎖ＤＮＡの塩基配列の解析に適している。本実施例によれば、ポリメラーゼ反応によりに蛍光標識を行わずに済むため、構造変化や立体障害に伴うポリメラーゼの酵素活性が損なわれる可能性がなくなる。
As a modification of Examples 1 to 3, Qdot 525 (donor) is labeled with
さらに、上記実施例１、２、５等の変形例として、これまた、ポリメラーゼに代えて、プライマ３４にＱｄｏｔ５２５（ドナー）を標識し、上記実施例同様のｄＮＴＰ伸長反応を行い、鋳型ＤＮＡ３３の配列を解読しても良い。本例もまた実施例６同様、ポリメラーゼに蛍光標識を行わずに済むため、構造変化や立体障害に伴うポリメラーゼの酵素活性が損なわれる可能背がなくなる。同じく本例は、ＦＲＥＴに必要なドナー・アクセプタ間の距離がおおよそ１０ｎｍに制限される関係上、短鎖ＤＮＡの解析に適している。
Further, as a modification of the above Examples 1, 2, 5, etc., instead of polymerase, the
上記各実施例の変形例として、プライマ３４の３’末端を２−ニトロベンジル化することで、伸長反応開始のタイミングを制御することができる。この場合、装置に３６０ｎｍ以下のＵＶ光源を追加する。プライマ３４を鋳型ＤＮＡ３３にハイブリダイズ後、ヌクレオチドセットを導入した状態でＵＶを照射することで、保護基が遊離し、伸長反応が開始する。伸長反応の開始を制御することで、より信頼性の高い配列データを得ることが可能となる。
As a modification of each of the above embodiments, the timing for starting the extension reaction can be controlled by 2-nitrobenzylating the 3 ′ end of the
これまで述べてきた各実施例では、第１〜第４のヌクレオチドセットの各セットにおいて、４種類のヌクレオチド（ｄＮＴＰ）のうち、1種の塩基を標識する第１のアクセプタＡｌｅｘａ５５５（蛍光アクセプタ）で標識し、残りの３種類を標識する第２のアクセプタをＢＨＱ−１（無蛍光アクセプタ：クエンチャ）で標識したヌクレオチドセットを使用しているが、他の種々の組み合わせを利用することもできる。 In each example described so far, in each set of the first to fourth nucleotide sets, the first acceptor Alexa555 (fluorescent acceptor) that labels one base among four kinds of nucleotides (dNTP) is used. Although a nucleotide set is used in which the second acceptor for labeling the remaining three types is labeled with BHQ-1 (non-fluorescent acceptor: quencher), other various combinations can also be used.
例えば、上記の組み合わせとは逆に、４種類のヌクレオチド（ｄＮＴＰ）のうち、1種の塩基を標識する第１のアクセプタをＢＨＱ−１（無蛍光アクセプタ：クエンチャ）或いは信号強度の弱い蛍光色素で標識し、残りの3種の塩基を標識する第２のアクセプタをＡｌｅｘａ５５５（蛍光アクセプタ）で標識したヌクレオチドセットを使用してもよい。 For example, contrary to the above-mentioned combination, the first acceptor for labeling one base among four kinds of nucleotides (dNTP) is BHQ-1 (non-fluorescent acceptor: quencher) or a fluorescent dye with low signal intensity. A nucleotide set in which the second acceptor for labeling and labeling the remaining three bases with Alexa 555 (fluorescent acceptor) may be used.
具体的には、ＢＨＱ−１（第１のアクセプタ）によって標識されたｄＡＴＰ及びＡｌｅｘａ５５５（第２のアクセプタ）によって標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第１のヌクレオチドセットと、
ＢＨＱ−１によって標識されたｄＣＴＰ、及びＡｌｅｘａ５５５によって標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第２のヌクレオチドセットと、
ＢＨＱ−１によって標識されたｄＧＴＰ、及びＡｌｅｘａ５５５によって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第３のヌクレオチドセットと、
ＢＨＱ−１によって標識されたｄＴＴＰ、及びＡｌｅｘａ５５５によって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのヌクレオチドからなる第４のヌクレオチドセットと、を用いる。
Specifically, a first nucleotide set consisting of dATP labeled with BHQ-1 (first acceptor) and dCTP, dGTP, dTTP labeled with Alexa 555 (second acceptor);
A second nucleotide set consisting of dCTP labeled with BHQ-1 and dATP, dGTP, dTTP nucleotides labeled with Alexa555;
A third nucleotide set consisting of dGTP labeled with BHQ-1 and dATP, dCTP, dTTP nucleotides labeled with Alexa555;
A fourth nucleotide set consisting of dTTP labeled with BHQ-1 and dATP, dCTP, dGTP nucleotides labeled with Alexa555 is used.
このようなヌクレオチドセットを用いれば、既述したＦＲＥＴを利用した場合、例えば、第１のヌクレオチドセットによって得られた伸長鎖のうち、Ｑｄｏｔ（ドナー）の信号が低下し、Ａｌｅｘａ５５５（第２のアクセプタ）の信号が上昇した場合、取り込まれた塩基はＣ、Ｇ、Ｔのいずれかである。逆にQdotの信号が低下したが、Ａｌｅｘａ５５５の信号が変化しない（上昇しない）場合、ＢＨＱ−１（第１のアクセプタ）標識のｄＡＴＰが取り込まれ、取り込まれた塩基はＡである。 When such a nucleotide set is used, for example, when FRET described above is used, the signal of Qdot (donor) in the extended chain obtained by the first nucleotide set decreases, and Alexa 555 (second acceptor) ) Signal rises, the incorporated base is C, G, or T. Conversely, when the Qdot signal is decreased, but the Alexa555 signal does not change (does not increase), BHQ-1 (first acceptor) -labeled dATP is incorporated, and the incorporated base is A.
同様の手順にして、第２〜第４のヌクレオチドセットの場合にも、それぞれの伸長鎖から、塩基の種類Ｃ、Ｇ、Ｔとその位置が特定される。 In the same manner, in the case of the second to fourth nucleotide sets, the base types C, G and T and their positions are specified from the respective extended strands.
また、上記実施例のヌクレオチドセットに代えて、４種類のヌクレオチドのうち、２種類をＡｌｅｘａ５５５（蛍光アクセプタ：第１のアクセプタ）で標識し、他の２種類をクエンチャ（無蛍光アクセプタ：第２のアクセプタ）で標識した複数のヌクレオチドセットを使用することもできる。図１２（a）〜（ｄ）は、その組み合わせ例を示すものであり、それぞれ、上段が第１のヌクレオチドセット（第１の基質溶液）、下段が第２のヌクレオチドセット（第２の基質溶液）を示す。四角枠が蛍光アクセプタ（第１のアクセプタ）による塩基種であり、○枠が無蛍光アクセプタ（第２のアクセプタ）による塩基種である。 Further, instead of the nucleotide set of the above example, two of the four nucleotides are labeled with Alexa555 (fluorescence acceptor: first acceptor), and the other two are quenched with a quencher (non-fluorescent acceptor: second acceptor). A plurality of nucleotide sets labeled with an acceptor can also be used. FIGS. 12A to 12D show examples of such combinations, where the upper row is the first nucleotide set (first substrate solution) and the lower row is the second nucleotide set (second substrate solution). ). A square frame is a base species by a fluorescent acceptor (first acceptor), and a circle frame is a base species by a non-fluorescent acceptor (second acceptor).
例えば、図１２（a）に示すように、Ａｌｅｘａ５５５（蛍光アクセプタ）で標識されたｄＡＴＰおよびｄＣＴＰと、ＢＨＱ−１（無蛍光アクセプタ：クエンチャ）で標識されたｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる第１のヌクレオチドセットを用いてｄＮＴＰ伸長反応を行い、合成される伸長鎖について、Ａｌｅｘａ５５５と、Ｑｄｏｔの信号強度変化を観察する。次にＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＣＴＰおよびｄＧＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰおよびｄＴＴＰからなる第２のヌクレオチドセットを用いて同様にｄＮＴＰ伸長反応を行い、Ａｌｅｘａ５５５と、Ｑｄｏｔの信号強度変化を観察する。 For example, as shown in FIG. 12 (a), a first nucleotide set consisting of dATP and dCTP labeled with Alexa555 (fluorescent acceptor) and dGTP and dTTP labeled with BHQ-1 (non-fluorescent acceptor: quencher) A dNTP extension reaction is carried out using, and the signal strength changes of Alexa 555 and Qdot are observed for the extended chain to be synthesized. Next, dNTP extension reaction was similarly performed using Alexa555-labeled dCTP and dGTP and a second nucleotide set consisting of dATP and dTTP labeled with BHQ-1, and changes in signal intensity of Alexa555 and Qdot were observed. To do.
以上２回の伸長反応において、２回（１回目及び２回目）ともＡｌｅｘａ５５５の信号が上昇した位置はＣ、１回目のみＡｌｅｘａ５５５の信号が上昇した位置はＡ、２回目のみＡｌｅｘａ５５５の信号が上昇した位置はＧ、どちらの結果でもＡｌｅｘａ５５５の信号が変化しなかった位置はＴと推定できる。本例によれば、使用するヌクレオチドセットが２種類で済むため、操作が簡便になる。 In the above two extension reactions, the position where the Alexa 555 signal increased in both times (first and second times) was C, the position where the Alexa 555 signal increased only once, A, and the signal of the Alexa 555 increased only the second time. The position is G, and the position where the Alexa 555 signal did not change can be estimated as T in either result. According to this example, since only two types of nucleotide sets are used, the operation is simplified.
第１のヌクレオチドセットと第２のヌクレオチドセットの、セットごとのＡｌｅｘａ５５５（第１のアクセプタ）で標識される２種類のｄＮＴＰと、ＢＨＱ−１（第２のアクセプタ）で標識される２種類のｄＮＴＰは、２回（１回目及び２回目）ともＡｌｅｘａ５５５の信号上昇（１、１）、１回目がＡｌｅｘａ５５５の信号上昇（１、０）、２回目がＡｌｅｘａ５５５の信号上昇（０，１）、いずれもＡｌｅｘａ５５５の信号上昇無し（０，０）の２値信号が成立すればよく、上記の一例に限定されるものではない。例えば、そのほか、図１２（ｂ）〜（ｄ）のような組み合わせが考えられる。 Two types of dNTP labeled with Alexa 555 (first acceptor) and two types of dNTP labeled with BHQ-1 (second acceptor) for each set of the first nucleotide set and the second nucleotide set The second (first and second) Alexa 555 signal rise (1, 1), the first Alexa 555 signal rise (1, 0), the second Alexa 555 signal rise (0, 1), both The binary signal of Alexa 555 with no signal rise (0, 0) may be established, and is not limited to the above example. For example, other combinations such as those shown in FIGS. 12B to 12D are conceivable.
本実施例に用いる第１，第２の基質溶液（ヌクレオチドセット）における塩基は、第１，第２のアクセプタとの関係で、次のように定義される。 Bases in the first and second substrate solutions (nucleotide sets) used in this example are defined as follows in relation to the first and second acceptors.
４種の塩基のうち、（ｉ）第１，第２の基質溶液間で同一の１種については第１のアクセプタで標識され、(ii)基質溶液間で同一のもう１種については第２のアクセプタで標識され、（iii）基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第１のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され、（iv）基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第１のアクセプタで標識されている。 Among the four types of bases, (i) one type that is the same between the first and second substrate solutions is labeled with the first acceptor, and (ii) the other type that is the same between the substrate solutions is the second type. (Iii) For another species identical between the substrate solutions, the first substrate solution is labeled with the first acceptor and the second substrate solution is labeled with the second acceptor. (Iv) As for another type that is the same among the substrate solutions, the first substrate solution is labeled with the second acceptor and the second substrate solution is labeled with the first acceptor.
本例の場合にも、第１のアクセプタは、ドナー励起により蛍光する蛍光色素、第２のアクセプタは、ドナー励起により発光しないクエンチャを使用するが、それに限定されず、両者のアクセプタについて発光強度差を有するもの、波長特性の異なるものを使用しても同様の効果が得られる。 Also in this example, the first acceptor uses a fluorescent dye that fluoresces by donor excitation, and the second acceptor uses a quencher that does not emit light by donor excitation. However, the present invention is not limited to this. The same effect can be obtained even when using those having different wavelength characteristics or those having different wavelength characteristics.
また、Ａｌｅｘａ５５５を標識させるｄＮＴＰの種類の数は、全反応工程で一定である必要は無く、特定したい塩基種の数に応じて、例えば第１のヌクレオチドセットでは、上記同様に２種類のｄＮＴＰをアクセプタで標識し、残り２種類のｄＮＴＰをクエンチャで標識し、第２のヌクレオチドセットでは３種類のヌクレオチドを標識するといったような、種々の組み合わせも可能である。 The number of types of dNTPs that label Alexa 555 need not be constant in all reaction steps. Depending on the number of base species to be specified, for example, in the first nucleotide set, two types of dNTPs may be used as described above. Various combinations such as labeling with an acceptor, labeling the remaining two types of dNTPs with a quencher, and labeling three types of nucleotides with the second nucleotide set are also possible.
上記の実施例１〜１０に適用可能な蛍光検出装置の一例は、図１に示されているが、その光学系の一部を変形した実施例を図９に示す。 An example of the fluorescence detection apparatus applicable to the first to tenth embodiments is shown in FIG. 1, and FIG. 9 shows an embodiment in which a part of the optical system is modified.
本実施例では、２種類の蛍光をダイクロイックミラー等で分離し、１台のＣＣＤの異なる領域に結像させる、いわゆる分割型結像光学系の例である。 This embodiment is an example of a so-called split-type imaging optical system in which two types of fluorescence are separated by a dichroic mirror or the like and imaged on different areas of one CCD.
分割型結像光学系では、まず、集光レンズ（対物レンズ）で集められた蛍光１３は、フィルタユニット１５で必要な波長の蛍光を取り出し、分割のためのダイクロイックミラー３２により、波長ごとに透過光と反射光に分割する。分割された光束をそれぞれ、反射光はミラー３９ａで反射し、結像レンズ４０に指定の角度で導く。透過光はミラー３９ｂと３９ｃで折り曲げ、同じ結像レンズ４０に別の指定の角度で導く。両光束は異なる角度で結像レンズ４０に入射することで、２次元センサカメラ４１（高感度冷却２次元ＣＣＤカメラ）に対して、それぞれの画像をずらして結像させる。
In the split-type imaging optical system, first, the
フィルタユニット１５には、レーザ光除去用のロングパスフィルタ（４０５ｎｍ）、検出する波長体を透過させるバンドパス干渉フィルタ（透過帯域：４４０-６８０ｎｍ）を用いる。補助フィルタ４２ａ、４２ｂは迷光除去のため、バンドパス干渉フィルタ（透過帯域：４４０−６８０ｎｍ、透過率９５％以上）を使う。場合により、補助フィルタ４２ａｂは使わなくてもよい。なお、分割透過光と分割反射光の光路の長さは、なるべく同じになるようにしているが、必ずしも同じでなくてもかまわない。図では結像倍率は、両光束で同じであるが、異なるようにしてもよい。同じ輝点の分割透過光像と分割反射光像であることが判断されれば解析可能である。
As the
反射光と透過光を異なる角度で結像レンズ４０に入射させることで、それぞれの蛍光像を同じ２次元センサカメラ４１の異なる位置に結像され、デュアル・ビュー状態で蛍光像を検出することができる。本例により、１個の２次元センサカメラで２種の蛍光体を識別することが可能であり、多種類の蛍光体を同時に簡便に識別検出することができる。
By making the reflected light and transmitted light enter the
本例によれば、抗原、抗体を測定対象にした蛋白チップ、ＤＮＡチップ、抗原検査装置などにも適用できる。同時に２種類のラベルを使うことができるので、２種類の標識抗体などを準備し、同時に反応させ、反応結果を同時に測定でき、各標識抗体ごとの強度を算定することができる。単一分子の測定だけでなく、定量も可能になる。なお、基板に捕捉する抗体、抗原の位置は格子状でなくても良いので、種々のチップに対応することができる。 According to this example, the present invention can also be applied to a protein chip, a DNA chip, an antigen test apparatus, etc., which have antigens and antibodies as measurement targets. Since two types of labels can be used at the same time, two types of labeled antibodies can be prepared, reacted at the same time, the reaction results can be measured simultaneously, and the intensity for each labeled antibody can be calculated. Not only single molecule measurement but also quantification becomes possible. Note that the positions of antibodies and antigens to be captured on the substrate do not have to be in a lattice pattern, and thus can correspond to various chips.
また、本例を細胞染色、細胞チップ等に適用することもできる。例えば、細胞表面抗原に特異的に結合する抗体を準備し、それぞれ蛍光体で標識する。２種類の標識抗体を同時に反応させ、同時に蛍光測定することで、２種の抗体の分布、濃度などを測定することもできる。表面抗原だけでなく、細胞質内のマーカ、膜マーカ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを同時に検出することができる Moreover, this example can also be applied to cell staining, cell chips, and the like. For example, an antibody that specifically binds to a cell surface antigen is prepared and labeled with a phosphor. By simultaneously reacting two types of labeled antibodies and simultaneously measuring fluorescence, the distribution and concentration of the two types of antibodies can also be measured. In addition to surface antigens, cytoplasmic markers, membrane markers, DNA, RNA, etc. can be detected simultaneously
本実施例も、既述した蛍光検出装置のうち光学系の一部を変えた例である。本実施例では、２種類の蛍光をプリズム等で分散させ、１台のＣＣＤに結像させる、いわゆる分散型結像光学系の例である。図１０に本実施例の検出部分の構成を示す。 This embodiment is also an example in which a part of the optical system is changed in the above-described fluorescence detection apparatus. This embodiment is an example of a so-called dispersion type imaging optical system in which two types of fluorescence are dispersed by a prism or the like and imaged on one CCD. FIG. 10 shows the configuration of the detection portion of this embodiment.
分散型結像系ではまず、集光レンズ（対物レンズ）で集められた蛍光１３は、フィルタユニット１５で必要な波長の蛍光を取り出し、不必要な波長の光を除去し、波長分散プリズム４３で分光し、その像を結像レンズ４０で、２次元センサカメラ４１（高感度冷却ＣＣＤカメラ）に結像させ、検出する。フィルタユニット１５には、レーザ光除去用のロングパスフィルタ（４０５ｎｍ）、検出する波長体を透過させるバンドパス干渉フィルタ（透過帯域：４４０−６８０ｎｍ）を用いる。
In the dispersive imaging system, first, the
なお、波長分散プリズム４３により光軸が傾くが、分散の異なるプリズムを複数枚組み合わせ、光軸が傾かないようにすることもできる。
Although the optical axis is tilted by the
本実施例により、１個の２次元センサカメラで２種の蛍光体を識別することが可能であり、多種類（ドナー，アクセプタ）の蛍光体を同時に簡便に識別検出することができる。なお波長を分散させる角度に指定は無いが、分散した結果生じた波長成分のピークは、隣接するスポットの領域と分離可能な距離を置いて存在することが必要である。 According to the present embodiment, two types of phosphors can be identified by one two-dimensional sensor camera, and multiple types (donors and acceptors) of phosphors can be easily identified and detected simultaneously. Although there is no designation for the angle at which the wavelength is dispersed, the peak of the wavelength component generated as a result of the dispersion needs to exist at a distance that can be separated from the adjacent spot region.
１…レーザ装置、２…波長板、７…プリズム、８…基板、８ａ…反応領域、８ｉｊ…ＤＮＡが捕捉されるスポット、９…フローチャンバ、１０…廃液チューブ、１１…廃液容器、
１２…試薬導入口、１３…蛍光、１４…集光レンズ（対物レンズ）、１５…フィルタユニット、１６…透過光観察用鏡筒、１７ａ，１７ｂ，４２ａ，４２ｂ…補助フィルタ、１８ａ，１８ｂ，４０…結像レンズ、１９ａ，１９ｂ，４１…２次元センサカメラ、２０ａ，２０ｂ…２次元センサカメラコントローラ、２１…制御ＰＣ（制御手段、演算手段）、２２，２４…モニタ、２３…ＴＶカメラ、２５…分注ユニット、２６…分注ノズル、２７…試薬保管ユニット、２７ａ…試料液容器、２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，２７ｅ…ヌクレオチドセット溶液容器、２７ｆ…洗浄液容器、２８…チップボックス、２９…自動ピントあわせ装置、
８０，８１…位置決めマーカ、３２…ダイクロイックミラー、３３…鋳型ＤＮＡ、３４…プライマ、３５…標識ポリメラーゼ、３６…鋳型ＤＮＡと相補的な伸長鎖、３７…プライマ認識部位、３８…鋳型ＤＮＡと同じ配列の伸長鎖、３９…ミラー、４３…波長分散プリズム、ｄｘ、ｄｙ…スポット８ｉｊの間隔の寸法
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Laser apparatus, 2 ... Wave plate, 7 ... Prism, 8 ... Substrate, 8a ... Reaction area, 8ij ... Spot where DNA is captured, 9 ... Flow chamber, 10 ... Waste liquid tube, 11 ... Waste liquid container,
DESCRIPTION OF
80, 81 ... Positioning marker, 32 ... Dichroic mirror, 33 ... Template DNA, 34 ... Primer, 35 ... Labeled polymerase, 36 ... Extended strand complementary to template DNA, 37 ... Primer recognition site, 38 ... Same sequence as template DNA , 39 ... mirror, 43 ... wavelength dispersion prism, dx, dy ... spacing dimension of spot 8ij
Claims (33)
ドナーにより励起される第１のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ及び前記第１のアクセプタと種類の異なる第２のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第１のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第２のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＧＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第３のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＴＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのヌクレオチドからなる第４のヌクレオチドセットと、
ＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ及びプライマと、
アクセプタ励起用として、前記ＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ及びプライマのいずれか一つに標識されている前記ドナーと、を用いて、
前記第１〜第４のヌクレオチドセットのセットごとに順次、前記鋳型ＤＮＡ或いはその相補鎖及びプライマを介してポリメラーゼ反応によるヌクレオチドの捕捉，伸長を行い、
前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に捕捉される最新に捕捉されるヌクレオチドの近傍に位置する前記ドナーを励起して、このドナーと前記最新捕捉ヌクレオチドの第１のアクセプタ或いは第２のアクセプタとの間で生じる蛍光共鳴エネルギー移動により、前記取り込まれたヌクレオチドの第１のアクセプタ或いは第２のアクセプタを励起し、
前記ドナーの信号強度変化及び前記第１，第２のアクセプタからの信号をリアルタイムにモニタリングし、前記第１〜第４のヌクレオチドセットを使用して得られたこれらのモニタリングデータから、前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に取り込まれた前記ヌクレオチドの種類とその位置を特定することを特徴とする核酸解析方法。 A nucleic acid analysis method for analyzing a base sequence of a single nucleic acid molecule using fluorescence resonance energy transfer,
A first nucleotide set consisting of dATP labeled by a first acceptor excited by a donor and dCTP, dGTP, dTTP nucleotides labeled by a second acceptor different in kind from the first acceptor;
A second nucleotide set consisting of dCTP labeled with the same first acceptor and dATP, dGTP, dTTP nucleotides labeled with the same second acceptor;
A third nucleotide set consisting of dGTP labeled with the same first acceptor and dATP, dCTP, dTTP nucleotides labeled with the same second acceptor;
A fourth nucleotide set consisting of dTTP labeled with the same first acceptor and dATP, dCTP, dGTP nucleotides labeled with the second acceptor;
DNA polymerase, template DNA and primer;
For acceptor excitation, using the donor labeled with any one of the DNA polymerase, template DNA and primer,
For each of the first to fourth nucleotide sets, sequentially capture and extend nucleotides by polymerase reaction via the template DNA or its complementary strand and primer,
Exciting the donor located in the vicinity of the most recently captured nucleotide captured by the template DNA or the complementary strand, between this donor and the first acceptor or the second acceptor of the most recently captured nucleotide The resulting fluorescence resonance energy transfer excites the first acceptor or the second acceptor of the incorporated nucleotide,
Changes in signal intensity of the donor and signals from the first and second acceptors are monitored in real time, and from these monitoring data obtained using the first to fourth nucleotide sets, the template DNA or A method for analyzing a nucleic acid, comprising identifying the type and position of the nucleotide incorporated into the complementary strand.
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第２のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＧＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第３のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＴＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのヌクレオチドからなる第４のヌクレオチドセットと、
アクセプタ励起用の蛍光物質よりなるドナーが標識されているＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ或いはプライマと、を有することを特徴とする核酸解析用試薬セット。 Utilizing fluorescence resonance energy transfer, it consists of dATP labeled by a first acceptor excited by a donor and dCTP, dGTP, and dTTP nucleotides labeled by a second acceptor different in kind from the first acceptor. A first nucleotide set;
A second nucleotide set consisting of dCTP labeled with the same first acceptor and dATP, dGTP, dTTP nucleotides labeled with the same second acceptor;
A third nucleotide set consisting of dGTP labeled with the same first acceptor and dATP, dCTP, dTTP nucleotides labeled with the same second acceptor;
A fourth nucleotide set consisting of dTTP labeled with the same first acceptor and dATP, dCTP, dGTP nucleotides labeled with the second acceptor;
A reagent set for nucleic acid analysis, comprising a DNA polymerase, a template DNA or a primer labeled with a donor made of a fluorescent material for acceptor excitation.
第１のアクセプタで標識された１〜３種類の塩基及び前記第１のアクセプタと種類の異なる第２のアクセプタで標識されたそれ以外の塩基を混合した基質溶液と、前記アクセプタを共鳴励起するための１種類のドナーにより標識されたＤＮＡポリメラーゼ或いは前記鋳型ＤＮＡとを用いて、核酸増幅の塩基配列伸長反応を行い、
前記ドナーの発光波長帯の信号強度の時間変化情報と、少なくとも１種類のアクセプタの発光波長帯の信号強度の時間変化情報を検出し、
検出される前記ドナーの発光強度の低下と、検出される前記アクセプタの発光強度の上昇から、任意の塩基が取り込まれたことを判定することを特徴とする核酸解析方法。 A nucleic acid analysis method for analyzing a base sequence of a single nucleic acid molecule using fluorescence resonance energy transfer,
In order to resonantly excite the acceptor, a substrate solution in which 1 to 3 types of bases labeled with the first acceptor and other bases labeled with a second acceptor different in type from the first acceptor are mixed Using a DNA polymerase labeled with one kind of donor or the template DNA, a nucleic acid amplification base sequence extension reaction is performed,
Detecting the time change information of the signal intensity of the emission wavelength band of the donor and the time change information of the signal intensity of the emission wavelength band of at least one acceptor;
A nucleic acid analysis method comprising: determining that an arbitrary base has been incorporated from a decrease in the emission intensity of the detected donor and an increase in the emission intensity of the acceptor to be detected.
ドナーにより励起される第１のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ及び前記第１のアクセプタと種類の異なる第２のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第１のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第２のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＧＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第３のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＴＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのヌクレオチドからなる第４のヌクレオチドセットと、
アクセプタ励起用の蛍光物質よりなるドナーが標識されているＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ或いはプライマと、
前記第１〜第４のヌクレオチドセットの各々ごとに、前記鋳型ＤＮＡ及びプライマを介してポリメラーゼ反応により行われる核酸増幅にて、前記鋳型ＤＮＡもしくはその相補鎖に捕捉されていくヌクレオチドのうち最新捕捉のヌクレオチドを標識しているアクセプタを励起する光照射系と、
蛍光共鳴エネルギーにより、前記ドナーの蛍光で前記最新捕捉のヌクレオチドを標識しているアクセプタを励起して、前記ドナーによる信号強度変化及び前記第１，第２アクセプタからの信号をリアルタイムにモニタリングする光検出系と、
前記第１〜第４のヌクレオチドセットを使用して得られたこれらのモニタリングデータから、前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に取り込まれた前記ヌクレオチドの塩基配列を解析するデータ演算処理部と、を有することを特徴とする核酸増幅の塩基配列解析装置。 A nucleic acid analyzer that analyzes the base sequence of a single nucleic acid molecule using fluorescence resonance energy transfer,
A first nucleotide set consisting of dATP labeled by a first acceptor excited by a donor and dCTP, dGTP, dTTP nucleotides labeled by a second acceptor different in kind from the first acceptor;
A second nucleotide set consisting of dCTP labeled with the same first acceptor and dATP, dGTP, dTTP nucleotides labeled with the same second acceptor;
A third nucleotide set consisting of dGTP labeled with the same first acceptor and dATP, dCTP, dTTP nucleotides labeled with the same second acceptor;
A fourth nucleotide set consisting of dTTP labeled with the same first acceptor and dATP, dCTP, dGTP nucleotides labeled with the second acceptor;
A DNA polymerase, a template DNA or a primer labeled with a donor made of a fluorescent material for acceptor excitation;
For each of the first to fourth nucleotide sets, the latest capture of the nucleotides captured by the template DNA or its complementary strand by nucleic acid amplification performed by polymerase reaction via the template DNA and primer. A light irradiation system for exciting the acceptor that labels the nucleotide;
Photodetection for monitoring in real time the signal intensity change by the donor and the signal from the first and second acceptors by exciting the acceptor labeled with the latest captured nucleotide with the fluorescence of the donor by fluorescence resonance energy The system,
A data operation processing unit for analyzing the nucleotide sequence of the nucleotide incorporated in the template DNA or the complementary strand from the monitoring data obtained by using the first to fourth nucleotide sets. Nucleic acid amplification base sequence analyzer characterized by the above.
４種類の塩基を有する第１の基質溶液と、同じく４種類の塩基を有する第２の基質溶液とを備え、前記第１，第２の基質溶液における塩基は、蛍光共鳴エネルギー移動に用いる種類の異なる第１，第２のアクセプタのいずれかにより標識され、このアクセプタの組み合わせは、４種の塩基のうち、前記第１，第２の基質溶液間で同一の１種については前記第１のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のもう１種については前記第２のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第１のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第１のアクセプタで標識されており、
さらに、前記核酸解析装置は、
アクセプタ励起用の蛍光物質よりなるドナーが標識されているＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ或いはプライマと、
前記第１，第２の基質溶液ごとに、前記鋳型ＤＮＡ及びプライマを介してポリメラーゼ反応により行われる核酸増幅にて、前記鋳型ＤＮＡもしくはその相補鎖に捕捉されていく塩基のうち最新の捕捉塩基を標識しているアクセプタを励起する光照射系と、
蛍光共鳴エネルギーにより、前記ドナーの蛍光で前記最新の捕捉塩基を標識しているアクセプタを励起して、前記ドナーによる信号強度変化及び前記第１，第２アクセプタからの信号をリアルタイムにモニタリングする光検出系と、
前記第１，第２の基質溶液を使用して得られたこれらのモニタリングデータから、前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に取り込まれた前記ヌクレオチドの塩基配列を解析するデータ演算処理部と、を有することを特徴とする核酸増幅の塩基配列解析装置。 A nucleic acid analyzer that analyzes the base sequence of a single nucleic acid molecule using fluorescence resonance energy transfer,
A first substrate solution having four types of bases and a second substrate solution having the same four types of bases, wherein the bases in the first and second substrate solutions are of the type used for fluorescence resonance energy transfer The first acceptor is labeled with one of the different first and second acceptors, and the combination of the acceptors is the first acceptor for the same one of the four bases between the first and second substrate solutions. And the second acceptor for the same type between the substrate solutions is labeled with the second acceptor, and for the other type identical between the substrate solutions, the first acceptor of the first substrate solution is used. The second substrate solution is labeled with the second acceptor, and the second substrate solution is labeled with the second acceptor for the other one that is the same among the substrate solutions. What has been labeled with a first acceptor,
Further, the nucleic acid analyzer comprises:
A DNA polymerase, a template DNA or a primer labeled with a donor made of a fluorescent material for acceptor excitation;
For each of the first and second substrate solutions, the latest capture base among the bases captured by the template DNA or its complementary strand is obtained by nucleic acid amplification performed by polymerase reaction via the template DNA and primer. A light irradiation system for exciting a labeled acceptor;
Photodetection that excites an acceptor labeled with the latest capture base with fluorescence of the donor by fluorescence resonance energy, and monitors changes in signal intensity by the donor and signals from the first and second acceptors in real time. The system,
A data operation processing unit for analyzing the nucleotide sequence of the nucleotide incorporated in the template DNA or the complementary strand from the monitoring data obtained by using the first and second substrate solutions. Nucleic acid amplification base sequence analyzer characterized by the above.
ポリメラーゼ反応により前記核酸分子を捕捉，伸長させるためのスポットが複数設けられた基板と、
前記スポットに向けて照射される全反射エバネッセント照射方式の光励起用の照射光源と、
前記スポット位置で、捕捉された核酸分子に修飾された蛍光色素から発せられる蛍光を集光するための蛍光集光系と、
前記蛍光集光系で集光した光を指定の波長ごとに分割するための分離部と、
前記分離部で分割された光を検出器に結像する結像光学系と、
分割され結像される各々の光の時間変化を、同時に検出するための複数の検出画素を備えた検出器と、
検出された光強度の時間変化から核酸の種類を判定するデータ処理部と、を具備する核酸解析用蛍光検出装置。 A fluorescence detection apparatus for nucleic acid analysis used for analyzing a base sequence of a single nucleic acid molecule,
A substrate provided with a plurality of spots for capturing and extending the nucleic acid molecule by polymerase reaction;
An irradiation light source for photoexcitation of a total reflection evanescent irradiation method irradiated toward the spot;
A fluorescence condensing system for condensing fluorescence emitted from a fluorescent dye modified with the captured nucleic acid molecule at the spot position;
A separation unit for dividing the light collected by the fluorescent light collecting system for each specified wavelength;
An imaging optical system that images the light divided by the separation unit on a detector;
A detector having a plurality of detection pixels for simultaneously detecting a temporal change of each of the divided and imaged light;
A fluorescence detection apparatus for nucleic acid analysis, comprising: a data processing unit that determines a type of nucleic acid from a temporal change in detected light intensity.
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| WO2015152198A1 (en) * | 2014-03-31 | 2015-10-08 | コニカミノルタ株式会社 | Surface plasmon resonance fluorescence analysis method, surface plasmon resonance fluorescence analysis device, and alignment method |
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| JP2020530112A (en) * | 2017-07-31 | 2020-10-15 | ベステル エレクトロニク サナイー ベ ティカレト エー．エス． | Identification tag and object identification method |
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