JP2012139598A - 臓器の再建および増強のための骨格 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】臓器または組織構造の再建、修復、増強、または置換を必要とする患者におけるそのような治療のための生体適合性の合成または天然の骨格が提供される。骨格は、臓器または組織構造の少なくとも一部に適合するような形状であり、1つ以上の細胞集団を播種されてもよい。また、管状脈管の新生臓器への取付のためのインサート、レセプタクルおよびポートも提供される。播種された骨格は、治療を必要とする部位で患者に埋め込まれ、組織化された臓器または組織構造を形成する。骨格はまた、膀胱、尿道、弁、および血管などの臓器または組織を形成するために使用することもできる。
【選択図】図1
Description
et al., J. Urol. 104:693 (1970)を参照)。他の試みは、機械的、構造的、または生体適合性の問題に起因して概して失敗している。恒久的人工材料は、機械的な不具合および結石形成が付随していた。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
層状に組織化された内腔器官または組織構造の再建、修復、増強または置換のための構造体であって、
a)第1の生体適合性の合成または天然のポリマー・マトリクスまたは骨格と、第2の生体適合性の合成または天然のポリマー・マトリクスとを備える埋込型構造体であって、前記第1のポリマー・マトリクスまたは骨格および前記第2のポリマー・マトリクスまたは骨格は、接合するように構成されると共に、接合したときに前記内腔器官または組織構造の少なくとも一部に適合するような形状であり、前記第1のポリマー・マトリクス、前記第2のポリマー・マトリクス、またはその両方が、管状脈管を受けるように構成される少なくとも1つのレセプタクルまたはポートを含有する、埋込型構造体と、
b)ポリマー・マトリクスまたは骨格細胞構造体を形成するために、前記第1のポリマー・マトリクスの第1の表面上もしくは表面内、前記第2のポリマー・マトリクスの第1の表面上もしくは表面内、またはその両方に堆積される少なくとも第1の細胞集団であって、筋肉細胞集団を含む前記第1の細胞集団と、
を備える、構造体。
(項目2)
前記第1のポリマー・マトリクスまたは骨格および前記第2のポリマー・マトリクスまたは骨格は、それぞれ、管状脈管を受けるように構成される少なくとも1つのレセプタクルまたはポートを含有する、項目1に記載の構造体。
(項目3)
生体適合性の材料は生体分解性である、項目1に記載の構造体。
(項目4)
生体適合性の材料は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、またはポリグリコール酸とポリ乳酸のコポリマーである、項目1に記載の構造体。
(項目5)
前記少なくとも1つの細胞集団は、平滑筋細胞集団である、項目1に記載の構造体。
(項目6)
前記第1のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、前記第2のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、またはその両方に堆積された細胞の第2の集団をさらに備える、項目1に記載の構造体。
(項目7)
前記細胞の第2の集団は尿路上皮細胞を含む、項目6に記載の構造体。
(項目8)
前記内腔器官または組織構造は泌尿生殖臓器である、項目1に記載の構造体。
(項目9)
前記内腔器官または組織構造は、膀胱、尿管および尿道より成る群から選択される、項目1に記載の構造体。
(項目10)
前記内腔器官または組織構造は膀胱または膀胱区域である、項目9に記載の構造体。
(項目11)
生体内に形成された前記内腔器官または組織構造は、天然の膀胱組織の伸展性を示す、項目1に記載の構造体。
(項目12)
前記レセプタクルまたはポートは、円筒状または管状のポリマー・マトリクスを備え、該円筒状ポリマーは、その第1の端部に位置する少なくとも1つのフランジを有する、項目1に記載の構造体。
(項目13)
前記レセプタクルまたはポートは、前記円筒状ポリマーの周囲に合うように構成されるワッシャをさらに備える、項目12に記載の構造体。
(項目14)
前記ワッシャは、前記フランジとマトリクスおよび細胞の構造体の第1の表面との間に防水性の封止部を形成するように構成される、項目13に記載の構造体。
(項目15)
前記ワッシャはヒドロゲルを備える、項目14に記載の構造体。
(項目16)
前記第1のポリマー・マトリクスまたは骨格は、閉じたドーム状端部と開いた赤道境界とを有する半球形状を有し、前記第2のポリマー・マトリクスまたは骨格は、前記第1のポリマー・マトリクスの前記赤道境界と接合するように構成されるカラーである、項目1に記載の構造体。
(項目17)
前記第1のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、前記第2のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、またはその両方に堆積された細胞の第2の集団をさらに備える、項目16に記載の構造体。
(項目18)
前記細胞の第2の集団は尿路上皮細胞を含む、項目17に記載の構造体。
(項目19)
前記細胞の第1または第2の集団は、前記カラー形状の第2のポリマー・マトリクスの前記第1または第2の表面上または表面内に堆積されていない、項目18に記載の構造体。
(項目20)
前記第1のポリマー・マトリクスまたは骨格および前記第2のポリマー・マトリクスまたは骨格は、それぞれ、閉じたドーム状端部と開いた赤道境界とを有する半球形状を有する、項目1に記載の構造体。
(項目21)
前記第1のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、前記第2のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、またはその両方に堆積された細胞の第2の集団をさらに備える、項目20に記載の構造体。
(項目22)
前記細胞の第2の集団は尿路上皮細胞を含む、項目21に記載の構造体。
(項目23)
前記第1のポリマー・マトリクスまたは骨格は、前記第1のポリマー・マトリクスの少なくとも1つの境界に沿ったフランジ領域をさらに備える、項目1に記載の構造体。
(項目24)
前記第2のポリマー・マトリクスまたは骨格は、前記第2のポリマー・マトリクスの少なくとも1つの境界に沿ったフランジ領域をさらに備え、前記第2のポリマー・マトリクスまたは骨格の前記フランジ領域は、前記第1のポリマー領域の前記フランジ領域と接合するように構成される、項目23に記載の構造体。
(項目25)
層状に組織化された内腔器官または組織構造の再建、修復、増強または置換のための構造体であって、
a)第1の生体適合性の合成または天然のポリマー・マトリクスまたは骨格と、第2の生体適合性の合成または天然のポリマー・マトリクスとを備える埋込型構造体であって、前記第1および第2のポリマー・マトリクスまたは骨格は、それぞれ、ベースと、それぞれのベースから放射状に延在する少なくとも2つのペタルとを備え、前記第1および第2のポリマー・マトリクスは、接合するように構成されると共に、接合したときに前記内腔器官または組織構造の少なくとも一部に適合するような形状である、埋込型構造体と、
b)ポリマー・マトリクスまたは骨格細胞構造体を形成するために、前記第1のポリマー・マトリクスの第1の表面上もしくは表面内、前記第2のポリマー・マトリクスの第1の表面上もしくは表面内、またはその両方に堆積される少なくとも第1の細胞集団であって、筋肉細胞集団を含む前記第1の細胞集団と、
を備える、構造体。
(項目26)
前記第1および第2のポリマー・マトリクスは、ベースと少なくとも4つのペタルとを備える1つの統合ユニットから得られ、対向するペタルの対は、他のペタルより長さが短い、項目25に記載の構造体。
(項目27)
前記第1および第2のポリマー・マトリクスは、接合するように構成される2つの異なるユニットである、項目25に記載の構造体。
(項目28)
前記第1および第2のポリマー・マトリクスのベースおよびペタル形状部分が接合し、それにより、接合したマトリクスの一端で縦方向の開口を有し、該縦方向の開口部と反対側に円形の開口部を有する、中空の球形または準球形マトリクスを形成する、項目26に記載の構造体。
(項目29)
前記第1および第2のポリマー・マトリクスの前記ベース中に組み込まれたフラップ、タブ、またはハンドルをさらに備える、項目25に記載の構造体。
(項目30)
前記縦方向の開口部は、該開口部のリップに、フラップ、タブ、またはハンドルを含有する、項目28に記載の構造体。
(項目31)
前記第1のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、前記第2のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、またはその両方に堆積された細胞の第2の集団をさらに備える、項目25に記載の構造体。
(項目32)
前記細胞の第2の集団は尿路上皮細胞を含む、項目31に記載の構造体。
(項目33)
前記第1のポリマー・マトリクスまたは骨格は、管状脈管を受けるように構成される少なくとも1つのレセプタクルまたはポートを含有する、項目25に記載の方法。
(項目34)
前記第2のポリマー・マトリクスまたは骨格は、管状脈管を受けるように構成される少なくとも1つのレセプタクルまたはポートを含有する、項目25に記載の方法。
(項目35)
前記第1のポリマー・マトリクスまたは骨格および前記第2のポリマー・マトリクスまたは骨格は、それぞれ、管状脈管を受けるように構成される少なくとも1つのレセプタクルまたはポートを含有する、項目25に記載の方法。
(項目36)
層状に組織化された内腔器官または組織構造の少なくとも一部の再建、修復、増強または置換のための構造体であって、
a)ベースと、前記ベースから放射状に延在する少なくとも2つのペタルとを備える第1の生体適合性の合成または天然のポリマー・マトリクスまたは骨格を備える埋込型な構造体であって、前記第1のポリマー・マトリクスは、組み立てられたときに前記内腔器官または組織構造の少なくとも一部と適合する半形状を形成するように構成される、埋込型な構造体と、
b)ポリマー・マトリクスまたは骨格細胞構造体を形成するために、前記第1のポリマー・マトリクスの第1の表面上または表面内に堆積される少なくとも第1の細胞集団であって、筋肉細胞集団を含む前記第1の細胞集団と、
を備える、構造体。
(項目37)
第2および第3の生体適合性の合成または天然のポリマー・マトリクスをさらに備え、前記第1、第2、および第3のポリマー・マトリクスは、接合するように構成されると共に、接合したときに前記内腔器官または組織構造の少なくとも一部に適合するような形状であり、少なくとも第1の細胞集団は、前記第1のポリマー・マトリクスの第1の表面上もしくは表面内、前記第2のポリマー・マトリクスの第1の表面上もしくは表面内、または前記第3のポリマー・マトリクスの第1の表面上もしくは表面内、あるいはそれら3つの全てに堆積される、項目36に記載の構造体。
(項目38)
前記第1、第2、および第3のポリマー・マトリクスは、3つの部分に細分化された1つの統合テンプレートから得られる、項目37に記載の構造体。
(項目39)
前記第1、第2、および第3のポリマー・マトリクスは3つの異なるテンプレートから得られ、前記第1、第2、および第3のポリマー・マトリクスは、接合するように構成される、項目37に記載の構造体。
(項目40)
前記第1、第2、および第3のポリマー・マトリクスは、少なくとも3つの垂直シームを使用して互いに接合され、それにより第1の王冠形状を形成するトップピース、フロントピース、およびサイドピースを備える、項目37に記載の構造体。
(項目41)
前記トップピース、フロントピース、およびサイドピースを接合させるために4つの垂直シームが使用される、項目40に記載の構造体。
(項目42)
前記サイドピースに組み込まれたフラップ、タブ、またはハンドルをさらに備える、項目40に記載の構造体。
(項目43)
前記第1のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、前記第2のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、前記第3のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、またはそれら3つの全てに堆積された細胞の第2の集団をさらに備える、項目37に記載の構造体。
(項目44)
前記細胞の第2の集団は尿路上皮細胞を含む、項目33に記載の構造体。
(項目45)
層状に組織化された内腔器官または組織構造の再建、修復、増強または置換を必要とする患者におけるそのような治療のための方法であって、
a)項目1、25または33のいずれか1項に記載の埋込型構造体を提供するステップと、
b)ポリマー・マトリクスまたは骨格細胞構造体を形成するために、前記ポリマー・マトリクスの第1の表面上もしくは表面内、前記第2のポリマー・マトリクスの第1の表面上もしくは表面内、またはその両方に、少なくとも第1の細胞集団を堆積させるステップであって、前記第1の細胞集団は実質的に筋肉細胞集団であるステップと、
c)接合した、成形されたポリマー・マトリクスまたは骨格細胞構造体を、内腔器官または組織構造の再生のために、前記治療の部位で前記患者に埋め込むステップと、
を含む、方法。
(項目46)
前記第1のポリマー・マトリクスまたは骨格は、管状脈管を受けるように構成される少なくとも1つのレセプタクルまたはポートを含有する、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記第2のポリマー・マトリクスまたは骨格は、管状脈管を受けるように構成される少なくとも1つのレセプタクルまたはポートを含有する、項目45に記載の方法。
(項目48)
前記第1のポリマー・マトリクスまたは骨格および前記第2のポリマー・マトリクスまたは骨格は、それぞれ、管状脈管を受けるように構成される少なくとも1つのレセプタクルまたはポートを含有する、項目45に記載の方法。
(項目49)
生体適合性の材料は生体分解性である、項目45に記載の方法。
(項目50)
生体適合性の材料は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、またはポリグリコール酸とポリ乳酸のコポリマーである、項目45に記載の方法。
(項目51)
前記第1の細胞集団は、実質的に平滑筋細胞集団である、項目45に記載の方法。
(項目52)
前記内腔器官または組織構造は泌尿生殖臓器のものである、項目45に記載の方法。
(項目53)
前記内腔器官または組織構造は、膀胱、尿管および尿道より成る群から選択される、項目45に記載の方法。
(項目54)
生体内に形成された前記内腔器官または組織構造は、天然の膀胱組織の伸展性を示す、項目45に記載の方法。
(項目55)
前記レセプタクルまたはポートは、円筒状または管状のポリマー・マトリクスを備え、該円筒状ポリマーは、その第1の端部に位置する少なくとも1つのフランジを有する、項目46に記載の方法。
(項目56)
前記レセプタクルまたはポートは、前記円筒状ポリマーの周囲に合うように構成されるワッシャをさらに備える、項目46に記載の方法。
(項目57)
前記ワッシャは、前記フランジとマトリクスおよび細胞の構造体の第1の表面との間に防水性の封止部を形成するように構成される、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記ワッシャはヒドロゲルを備える、項目56に記載の方法。
(項目59)
前記第1のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、前記第2のポリマー・マトリクスの第2の表面上もしくは表面内、またはその両方に堆積された細胞の第2の集団をさらに備える、項目45に記載の方法。
(項目60)
前記細胞の第2の集団は尿路上皮細胞を含む、項目59に記載の方法
生体適合性、および特に生体分解性の材料が、マトリクスの作製に好ましい材料である。
von Recum,(1999);Ratner,et al.,Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine, Academic Press(1996)を参照)。骨格の堅さは、ある骨格が示す伸展性(または伸展性のなさ)の程度を指す。
生体適合性骨格は、例えば、溶媒キャスト法、圧縮成形法、フィラメント引出法、メッシュ法、浸出法、製織法、発泡法、エレクトロスピニング法、および被覆法等の方法を使用して成形することができる。溶媒キャスト法では、塩化メチレン等の適当な溶媒中の1種類以上のポリマーの溶液を、分岐パターンの凹凸構造としてキャストする。溶媒の蒸発後、薄膜が得られる。圧縮成形法では、ポリマーを平方インチあたり30,000ポンド以下の圧力で圧縮して適当なパターンに成形する。フィラメント引出法は、溶融ポリマーからの引出を含み、メッシュ法は、繊維を圧縮してメッシュをフェルト状の材料に形成することを含む。浸出法では、2つの材料を含有する溶液を広げて人工臓器の最終形態に近い形状にする。次に溶剤を使用して成分の1つを溶解させ、孔を形成させる(Mikosに対する米国特許第5,514,378号を参照)。
一実施形態では、骨格に細胞の1つ以上の集団を播種して人工臓器構造体を形成する。人工臓器構造体は、細胞集団を患者自身の組織から得た自家のものであってもよく、あるいは、細胞集団を当該患者と同じ種内の他の患者から得た同種のものであってもよい。人工臓器構造体は、異なる細胞集団を患者とは異なる哺乳類種から得た異種のものであってもよい。例えば、細胞は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、およびヒツジ等の哺乳類の臓器から得ることができる。
658−62;Atala, et al.(1993) J. Urol. 150: 608−12に記載されているように増量および培養することができる。血縁者または同じ種の他のドナーからの細胞もまた、適切な免疫抑制と共に使用することができる。
Surg. 33, 7−12(参照することにより本明細書に組み入れられる)で論じられている。細胞は、当業者には既知の技術を使用して分離されてもよい。例えば、組織または臓器は、機械的に分解され、かつ/または、隣接細胞との結合を弱める消化酵素および/またはキレート剤により処理されて、認め得るほどの細胞の破壊なしに組織を個々の細胞の懸濁液として分散させることができるようになる。酵素による解離は、組織を細かく刻み、多くの消化酵素のいずれかを単独で、または組み合わせて使用して刻まれた組織を処理することにより達成される。これらには、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、および/またはヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、プロナーゼ、およびディスパーゼ等が含まれるが、これらに限定されない。機械的破砕法もまた、臓器表面の擦過、グラインダ、ブレンダ、篩、ホモジナイザ、圧力セル、または高周波発生器等の使用等、多くの方法により達成することができる。組織分解技術の検討には、Freshney,(1987),Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A. R. Liss, Inc.,New York, Ch. 9, pp. 107−126を参照されたい。
A Manual of Basic Technique, 2d Ed.,A. R. Liss, Inc., New York,Ch. 11, pp. and 12, 137−168を参照されたい。例えば、ある細胞の種類は、磁気活性化および蛍光活性化細胞選別により富化することができ、また他の細胞の種類は、特定の細胞の種類を回収するために減らすことができる。
マトリクスまたは骨格上への細胞の播種は、標準的方法に従い行うことができる。例えば、組織修復のためのポリマー基材への細胞播種について報告されている(例えばAtala,A. et al.,J. Urol. 148(2 Pt 2):658−62
(1992);Atala, A.,et al.J. Urol. 150(2 Pt 2): 608−12 (1993)を参照)。培地内で増殖させた細胞をトリプシン処理して細胞を分離し、分離された細胞をマトリクス上に播種することができる。あるいは、細胞培地から得た細胞を細胞層として培養皿から剥離し、事前に細胞を分離することなく細胞層を直接骨格上に播種することができる。
増強する臓器または組織への骨格の移植は、実施例に記載の方法、または当技術分野で知られた方法に従い行うことができる。マトリクスまたは骨格は、グラフト材料を対象臓器に縫合することにより、対象の臓器または組織に移植することができる。臓器全置換のための新生臓器の埋込は、実施例に記載の方法、または当技術分野で知られた外科的方法に従い行うことができる。
膀胱形状ポリマー・マトリクスまたは骨格の形成
ここで説明される新生臓器構造体は、例として新生膀胱構造を用いて示される。ここでは新生膀胱構造について触れているが、ここで説明される方法および材料は、例えば新生腎臓増強構造体等、様々な新生臓器および新生脈管増強構造体の形成に有用であることが理解されるだろう。
単一の新生膀胱テンプレート設計は、組み立てられると、膀胱増強に使用するための球形または準球形の構造体を生成する。使用されるテンプレートに関わらず、組み立てられた構造体は、例えば人間の対象内等の意図される埋込部位の構造内に適合するように設計される。
膀胱置換のための2部構成構造体は、接合して単一の球状または半球状の構造体を形成する異なる骨格部分、好ましくは2つの半形状を使用する。本明細書で使用される場合、半形状は、あらゆる幾何学的形状の半分を指す。接合するよう構成される半形状は、対称でも非対称でもよい。まず異なる骨格部分を単一のテンプレートから一体部分として形成するか、または、2つ以上のテンプレートから互いに接合するように構成される異なる部分として形成することができる。
細胞の採取および培養
生検標本の調達。組織を切離するためにメスを用いて1×1cmの生検標本を膀胱の側部から採取する従来の試験とは対照的に、本実施例で説明される新生膀胱構造を形成するために使用される組織サンプルは、ステープル法を用いて、膀胱頂部から1×1cmの生検標本を採取することにより得られた。Atalaらによる米国特許第6,576,019号に記載の方法等の従来の生検手順は、概して、膀胱ドームから組織を取り出していた。一方、本明細書において使用される生検手順は、膀胱頂部という膀胱ドームの特定部分から組織を取り出す。膀胱頂部から組織を取り出すと、有用な細胞をより多く得ることができることが示されている。有用な細胞とは、増量することができ、本明細書に記載の新生膀胱骨格上に播種することができる生存細胞を指す。
ポリマー・マトリクスまたは骨格への細胞播種
新生膀胱マトリクスまたは骨格のSMC播種。上記実施例2で説明したように平滑筋収縮(SMC)を採取して増量した後、細胞沈殿物を6mlのSMC成長培地に再懸濁させる。鉗子を用いてマトリクスまたは骨格を事前湿潤用容器から取り出し、空の滅菌細胞播種容器(図13および14を参照。当初Tengion Inc.により設計および製造された)。一実施形態では、細胞播種容器は、輸送前の培養期間の播種容器およびバイオリアクタとして、ラバーメイド製プラスチック3クオート容器を使用している。容器は、高さよりも幅のあるもので、マトリクスまたは骨格を細胞で播種する際に有用である。容器の蓋は、新生膀胱の播種を行う際には取り外すことができる。次いで、ガス交換にPALLアクロ−0.2μm PTFEフィルタディスクを使用して、蓋を閉めて封止することができる。この播種容器は、輸送前に6日間毎日交換される2リットルまでの培地を収容することができる。培養培地の容積は、培養期間の間細胞を維持するのに十分な量である。封止された容器は、培養液の交換と膀胱細胞播種のためにBSCとインキュベータの間で移動させることができる。播種容器/バイオリアクタの設計は、膀胱細胞をより良好に均一に分布させるためのあらゆる方向における骨格の操作を容易化する。
細胞播種新生膀胱構造の梱包および輸送
新生膀胱をバイオリアクタ内で6日間インキュベートしたら、輸送容器に移す。本明細書で説明される試験では、輸送容器は、ねじ込み式の蓋を備えテフロン(登録商標)シールされた1リットルNALGENE(登録商標)ポリプロピレン瓶である(図17)。NALGENE(登録商標)瓶は、移す間新生膀胱を支持する内側のプラスチック製バスケットを含む(図18)。新生膀胱は、輸送プロセスの間に動くのを防ぐために、内側の支持バスケットに固定することができる(図19)。内側のバスケットは、手術時に取り外すこともできる。これにより、手術チームは新生膀胱を外側容器から取り出し、培地を切り、滅菌新生臓器バスケットを手術野に置くことができる。この輸送容器は、当初Tengion Inc.により設計および製造されたものである。NALGENE(登録商標)輸送容器は、輸送に必要なサイズおよび容積の要件に合わせて選択された。輸送中、容器は封止され、漏れを防ぐために蓋の縁辺にパラフィルムを2重に巻く。輸送容器は、ラベルが付され、温度制御された断熱性の箱に入れられて輸送される(図20)。
膀胱再建
体重1キログラムあたり0.1mgのアセプロマジンの筋肉注射による前処理後、体重1キログラムあたり約25から約35mgの気管内エアレーションによる吸入麻酔下(フルロタン(flurothane))で手術を行う。術前および術中両方で約500mgのセファゾリンナトリウムを静脈内投与する。1日に体重1キログラムあたり約30ミリグラムの投与量で、術後5日間、セファゾリンナトリウムの皮下投与による追加の処置を行う。術後の鎮痛療法は、体重1キログラムあたり約0.1から約0.6ミリグラムのブトルファノールの皮下投与により行う。
再建膀胱の分析
尿流動態検査およびX線膀胱造影を、手術前、および手術から約1ヶ月後、約2ヶ月後、約3ヶ月後、約4ヶ月後、約6ヶ月後、および約11ヶ月後に行う。動物を手術から約1ヶ月後、約2ヶ月後、約3ヶ月後、約4ヶ月後、約6ヶ月後、および約11ヶ月後に屠殺する。全体分析、組織学的分析、および免疫細胞化学的分析のために膀胱を採取する。
全体所見
所定の時点において、ペントバルビタールの静脈内投与により動物を安楽死させる。全体的な異常について内蔵および尿生殖路を検査する。膀胱を取り出し、天然三角部とグラフトとの間の移行部分を特定するマーキング縫合を露出する。天然三角部、概説した移行部分、および近接して位置する新生膀胱の中からの断面を取る。
組織学的および免疫細胞化学的所見
標本を10%緩衝ホルマリンで固定し処理する。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)ならびにマッソン・トリクロームによる所定の染色法のために、組織切片を約4ミクロンから約6ミクロンに切断する。取り出した膀胱の尿路上皮および平滑筋細胞分化の特性決定を行うために、いくつかの特異的な一次抗体を使用した免疫細胞化学的染色法を用いる。中間フィラメント筋肉細胞タンパク質デスミンの一部と反応する抗デスミン抗体(モノクローナルNCL−DES−DERII、クローンDE−R−11、Novocastra(登録商標)、英国ニューキャッスル)、および膀胱平滑筋アクチンを標識化する抗α平滑筋アクチン抗体(モノクローナルNCL−SMA、クローンasm−1、Novocastra(登録商標)、英国ニューキャッスル)は、平滑筋分化の一般的マーカーとして使用される。尿路上皮を特定するために、上皮組織における細胞骨格複合体の一部を形成する中間フィラメントに対して反応する、抗パンサイトケラチンAE1/AE3抗体(モノクローナル、カタログ番号1124 161、Boehringer Mannheim(登録商標))および抗サイトケラチン7抗体(NCL−CK7、クローンLP5K、IgG2b、Novocastra(登録商標)、英国ニューキャッスル)が使用される。哺乳類ウロプラキンを調査するために、哺乳類尿路上皮で頂端プラークを形成し、尿路上皮分化の末期で重要な機能上の役割を果たす、ポリクローナル抗体を使用した抗非対称ユニット膜(Anti−Asymmetric Unit Membrane:AUM)染色が使用される。神経組織を特定するために、シュワン細胞およびグリア要素に主に存在する酸性プロテイン結合タンパク質S−100と反応する抗S−100抗体(Sigma(登録商標)、ミズーリ州セントルイス、No.IMMH−9)が使用される。
新生臓器骨格への脈管取付用インサート
新生臓器への脈管取付用フランジ付管インサート。新生臓器骨格もしくは構造体への管状脈管の取付、または新生脈管骨格もしくは構造体の新生臓器骨格もしくは構造体もしくは他の管状構造(例えば血管または他の新生脈管骨格もしくは構造体)への取付を容易化するために、骨格材料は1つ以上のフランジ付管の形状で形成される。例えば、新生膀胱構造体の一実施形態では、尿道を管の内部に導入し、膨張させ、フランジの先端表面に縫合される。インサートは、被覆されていないか、部分的に被覆されているか、または被覆され、織メッシュまたは縫合糸または他の一般的な強化法で強化されていてもよい。インサートは新生膀胱骨格設計を使用して以下に例示される。しかし、本明細書で説明されるインサートは、例えば新生腎臓骨格、新生脈管骨格および新生子宮骨格等、様々な新生臓器および新生脈管骨格と併せて有用であることが理解されるだろう。
三角部温存増強における2部構成新生膀胱構造体の使用
図29Aに示す図は、三角部温存外科増強時における実験的手術操作中の、フランジのない一体型の構造体設計より成る最初の増強構造体設計の使用を描いている。一方、図29Bは、実施例1で上述され、また図2に描かれるような、細胞を播種したドーム形状フランジ付構造体、および別個のフランジ付カラーより成る、2部構成構造体の使用を描いている。
非三角部温存増強における2部構成新生膀胱構造体の使用(膀胱全置換)
試験的膀胱全置換結果。図30に示す図は、非三角部温存置換術の時の、スパチュラ操作のために尿管および尿道を適所に導くためのトンネルを使用した当初の新生膀胱構造体による実験的な外科的処置を描いている。
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