JP2012092124A - ペグ化インスリンリスプロ化合物 - Google Patents

Abstract

【課題】生理的ｐＨで高い可溶性を示し、作用時間が長く、薬物動態学的、薬力学的に優れたインスリンリスプロ化合物の提供。
【解決手段】１７．５〜４０ｋＤａの範囲の分子量を有するポリエチレングリコールとペグ化した、ペグ化インスリンリスプロ化合物と、製薬上許容可能なフェノール系防腐剤および該ペグ化インスリンリスプロ化合物を６量体化するのに充分な量の亜鉛、更に1またはそれ以上の製薬上許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体を含む医薬組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は糖尿病の分野に関する。本発明は特に、非常に可溶性で拡張作用プロフィルを有するペグ化インスリンリスプロ化合物、当該分子の提供方法、当該分子を含む医薬組成物、および当該分子の治療的使用に関する。

正常血糖を達成するため、インスリン補充療法は、正常な個人における内因性インスリン分泌のパターンに出来る限り近づくようにデザインされている。インスリンの生理学的な要求は毎日変動し、（ａ）食事関連の血糖値の上昇に対応するためにインスリンを必要とする吸収段階、および（ｂ）肝グルコース産生を調整して最適な空腹時血糖値を維持するため、一定量のインスリンを必要とする吸収後段階の２段階に分けられ得る。従って、糖尿病の効果的なインスリン療法では、ボーラス注射によって食事時に提供される速効性インスリンと、注射により１日に１度または２度投与して食間の血糖値を制御する長時間作用性インスリンとの２種類の外因性インスリン製剤が、一般的に組み合わされる。

現在利用可能なインスリン補充療法は、１つ以上の重要な面が臨床的に欠けている。例えば、従来の中時間作用性および長時間作用性のインスリン製剤、例えばインスリンデテミルなどの基礎インスリン類似体を毎日投与する場合、基礎グルコース制御を一日中提供するには、その作用期間が不十分である。従って、基礎インスリンの作用期間は、多くの場合、１日に１回の投与によって高血糖を適切に制御するには不十分である。特に吸収後段階の要求を満たすには不十分である。更に、現在の療法では、単回注射を怠ると、「ピーク／トラフ」の薬物水準が有意に増大し、グルコース制御の不良に至る可能性がある。更に、インスリンの放出時間を長期化させるための不溶性ストラテジーの利用、例えば従来の中時間作用性および長時間作用性のインスリン製剤である、Ｎｅｕｔｒａｌ Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ Ｈａｇｅｄｏｒｎ（ＮＰＨ）インスリンおよびＵＬＴＲＡＬＥＮＴＥ（登録商標）の結晶懸濁液などの利用、またはインスリングラルギンの生体内沈降ストラテジーの利用は、注射内変動を増大させ、用量応答プロフィルの変動を増大させる結果となる。特に、ＮＰＨおよびＵＬＴＲＡＬＥＮＴＥ（登録商標）懸濁液は、製品の均一性を保証するため機械的な混合を必要とし、個体内変動を増大させ、最適な空腹時血糖を食間に長期間維持するのに必要な理想的に「平坦な」薬力プロフィルよりもむしろピークを与える傾向にある。従って、インスリン放出を長期化させるために不溶性の状態に依存するインスリン製剤は、可溶性製剤よりも本質的に予測性が低く、適切な血糖制御が難しく、致命的な低血糖エピソードに至る可能性が高い。更に、最近の基礎インスリン類似体は、速効性インスリン製剤または中時間作用性インスリン製剤とは混合しにくい。従って、現在のインスリン補充療法では、糖尿病患者は致命的な低血糖エピソードに罹りやすく、重篤で長期的な糖尿病の合併症を引き起こしやすく、および／または便利性や生活の質の面で患者にかなりの負担をかけやすい。

「非免疫原性ポリペプチド」と題される特許文献１は、約５００Ｄａと約２０，０００Ｄａの間の分子量を有する直鎖ＰＥＧ分子に結合したインスリンを開示している。ＨｉｎｄｓとＫｉｍは、低分子量（６００Ｄａ、７５０Ｄａおよび２０００Ｄａ）であるモノメトキシポリエチレングリコールと結合したインスリンを開示している（非特許文献１を参照）。この記事では、「より高分子のｍＰＥＧ（５０００Ｄａ）と結合すると、コンジュゲートの生物活性がかなり下がることが（以前に）見出されているので」、低分子量のｍＰＥＧインスリンコンジュゲートに研究を限定したと、著者達は述べている。特許文献２は、インスリンリスプロを含むインスリン誘導体と小分子の分岐鎖ポリマーとの結合を開示している。特許文献３は、特に、ＰＥＧの総分子量がそれぞれ約１０ｋＤａおよび約２０ｋＤａである直鎖および分岐鎖ＰＥＧ分子と結合したインスリン分子を開示している。特許文献４（２００８年２月７日に公開）および特許文献５（２００８年７月１７日に公開）は、特に、約２００Ｄａから約４０，０００Ｄａの範囲の名目分子量を有するＰＥＧ分子に結合した種々のインスリン類似体を開示している。

米国特許第４，１７９，３３７号 ＰＣＴ特許出願国際公開公報第２００６／０７９６４１号 ＰＣＴ特許出願国際公開公報第２００４／０９１４９４号 ＰＣＴ特許出願国際公開公報第２００８／０１５０９９号 ＰＣＴ特許出願国際公開公報第２００８／０８４０５１号

Ｈｉｎｄｓ，Ｋ．Ｄ．およびＫｉｍら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ５４：５０５−５３０（２００２）

基礎インスリン補充レジメンに更に適した長時間作用性のインスリンが今でも必要とされているのは明白である。特に、食事インスリン製剤と混合可能であり、長期間持続性の時間−作用プロフィル（すなわち１日１回またはそれ以下の頻度で注射することにより適切に血糖値を制御可能）を有し、より平坦な作用および薬力プロフィル（すなわち「ピーク／トラフ」比が低い）を有し、患者内変動が少なく（すなわち時間−作用プロフィルが予想可能なので、低血糖および／または体重増加の発生率が減少）、および／または注射部位刺激感または注射部位疼痛の少ない可溶性の基礎インスリンが必要とされている。

我々はここに、インスリンリスプロが高分子量のポリエチレングリコール誘導体とペグ化することにより、治療上効果的な基礎インスリン活性を有し、長期間持続性の時間−作用プロフィルを有し、生理的ｐＨで可溶性が高く、および／または一般的に使用される他の食事インスリン製剤と混合可能であるペグ化インスリンリスプロ化合物を提供できるという発見を報告する。

本発明は式Ｉの化合物：
Ｐ−〔（Ａ）−（Ｂ）〕
（式中、
Ａはインスリンリスプロ（配列番号１）のＡ鎖、
Ｂはインスリンリスプロ（配列番号３）のＢ鎖、
Ｐは約２０ｋＤａから約４０ｋＤａの範囲の分子量を有するＰＥＧであり、ＡおよびＢは適切に架橋結合しており、Ｐは共有結合によって直接または間接に、Ａの１位でグリシンのアルファアミノ基、Ｂの１位でフェニルアラニンのアルファアミノ基またはＢの２８位でリジンのイプシロンアミノ基に結合している）、またはその製薬上許容可能な塩を提供する。

本発明は、複数のモノおよびジペグ化インスリンリスプロ化合物を含む組成物であって、組成物中のペグ化インスリンリスプロ化合物の約７５％を超える量が、式Ｉのモノペグ化化合物である組成物も提供する。

本発明は、式Ｉのモノペグ化インスリン化合物を含む組成物であって、組成物中のモノペグ化化合物の約５０％を超える量が、Ｂ鎖の２８位でリジンのイプシロンアミノ基に直接または間接に共有結合しているＰＥＧを有する組成物も提供する。

本発明は、式Ｉのペグ化インスリンリスプロおよび１つ以上の製薬上許容可能な防腐剤、等張剤、金属イオンまたは緩衝剤を含む医薬組成物も提供する。本発明の特定の実施形態では、式Ｉのペグ化インスリンリスプロおよび１つ以上の製薬上許容可能な防腐剤、等張剤、金属イオンまたは緩衝剤を含む医薬組成物が、治療上有効量のインスリン類似体を更に含む。

本発明は、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を含む治療上有効量の医薬組成物を患者に投与するステップを含む、高血糖症、真性糖尿病、または妊娠性糖尿病を治療する方法も提供する。

本発明は、治療のために、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を使用するステップも含む。

本発明は、低血糖症、真性糖尿病、または妊娠性糖尿病を治療するための医薬品製造のために、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を使用するステップも含む。

ラットとイヌのＰＫパラメーターの相対成長スケーリングに基づき、２０ｋＤａのＰＥＧ−Ｂ２８インスリンリスプロ、４０ｋＤａのＰＥＧ−Ｂ２８インスリンリスプロ、およびインスリンデテミルに関してシミュレートした、ヒトＰＫプロフィルをグラフで表したものである。プロフィルは、１週間の投与後の１投与間隔を表したものである。数値は平均ピーク／トラフ比である。 ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％以上）}／Ａ１_{（約５％以下）}インスリンリスプロ（ＬＹ、０．２２５ｍｇ／ｋｇ）またはインスリングラルギン（０．５Ｕ／ｋｇ）を皮下投与した後のヒトのグルコース注入速度（ＧＩＲ）のグラフである。ＧＩＲプロフィルは観察データに基づいており、Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓａｅｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ内で開発した「Ｌｏｅｓｓ平滑化」（Ｓｐｌｕｓ ２０００、プロフェッショナル版、ＭａｔｈＳｏｆｔ社）関数を用いて観察データに適合させた。

本明細書では以下の略語が使用される。ＡＣＮ：アセトニトリル、Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＤＣＭ：ジクロロメタン、メチレンクロライド、ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド、ＤＴＴ：ジチオトレイトール、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、Ｅｔ：エチル、ＥｔＯＨ：エタノール、Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、ＨＣｌ：塩酸、Ｄａ：ダルトン、ｋＤａ：キロダルトン、Ｌｉｌｌｙ：イーライリリー社（インディアナ州インディアナポリス）、ｍＡｂ：モノクローナル抗体、Ｍｅ：メチル、ＭｅＯＨ：メタノール、ＰＢＳ：リン酸塩緩衝液生理食塩水、ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィ、ＳＥＣ：粒径排除クロマトグラフィ、ＳＥＭ：平均値の標準誤差、ＳＰＡ：シンチレーション近接アッセイ、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸。本開示に使用されるアミノ酸の略語は全て、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ§１．８２２（Ｂ）（２）の記載通り、米国特許商標局が認めたものである。

「インスリン」と言う用語は、あらゆる種の野生型インスリンを含むことがここでは意図されており、限定されないが、ブタのインスリン、ウシのインスリン、ヒトのインスリンなどが含まれる。天然または野生型インスリンとは、天然に見出されるインスリンのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するインスリンを意味する。様々な種から得られるインスリンをコードするポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当業者には周知である。例えば、ヒトインスリンは２１のアミノ酸のＡ鎖と３０のアミノ酸のＢ鎖（それぞれ配列番号１および２）を有している。インスリンは天然から得てもよい（つまり天然源から単離してもよい）し、生物合成または合成によって産生してもよい。「インスリン」と言う用語は、あらゆるインスリン誘導体および／またはインスリン類似体を含むことも意図されている。

本明細書で使用する場合、「インスリン類似体」または「インスリン誘導体」と言う用語は、インスリン活性を有し、ヒトインスリンと実質的に同じアミノ酸配列を有してはいるが、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、反転または付加などのヒトインスリンの修飾によってヒトインスリンとは異なっている蛋白質であると定義される。かかる化合物は当業者には周知である。例えば、ＰＣＴ特許出願国際公開公報第９６／１５８０４号および０３／０５３３３９号、米国特許番号第３，５２８，９６０号、５，５１４，６４６号、５，６１８，９１３号、５，７５０，４９７号、６，０１１，００７号、６，２５１，８５６号、欧州特許第２５４，５１６号および２８０，５３４号を参照の事。当業者に公知の典型的かつ非網羅的なインスリン類似体には、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリシンなどが含まれる。更に、本明細書で使用する場合、「インスリン」と言う用語には、インスリン誘導体とインスリン類似体の両方であると考えられる化合物も含まれる。かかる化合物の例は、米国特許第５，７５０，４９７号および６，０１１，００７号に記載されている。当業者に公知のかかる化合物の具体的な例はインスリンデテミルである。

種々のインスリン類似体および／または誘導体は、「速効性」または「迅速に作用する」インスリン類似体であることが知られている。本明細書で使用する場合、「速効性」および「迅速に作用する」と言う用語は、同じ意味で用いられる。「迅速に作用するインスリン類似体」によって生じる食事グルコース効果は、（ａ）ヒトインスリンよりも皮下注射後早く始まる、および／または（ｂ）ヒトインスリンよりも皮下注射後の作用期間が短いことを示す。典型的な速効性インスリン類似体には、生理的条件下で一般的に２量体化または自己会合しにくいので速効性である、「単量体インスリン類似体」が含まれる。単量体インスリン類似体は当業者には公知である。例えば、米国特許第５，７００，６６２号および欧州特許第２１４，８２６号を参照の事。インスリンリスプロは迅速に作用する単量体インスリン類似体であり、野生型インスリンＢ鎖（配列番号２）の２８位にあるプロリンと、野生型インスリンＢ鎖（配列番号２）の２９位にあるリジンが入れ替わっている。従って、インスリンリスプロは、限定されないが、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、Ｂ２８ＬｙｓＢ２９Ｐｒｏヒトインスリンなど、様々な名称によって当業者に知られている。

「架橋結合した」と言う用語は、システイン残基間に存在するジスルフィド結合を意味する。例えば、適切に架橋結合したヒトインスリンは、配列番号１の７位におけるシステインと配列番号２の７位におけるシステイン間のジスルフィド結合、配列番号１の２０位におけるシステインと配列番号２の１９位におけるシステイン間のジスルフィド結合、および配列番号１の６位におけるシステインと配列番号１の１１位におけるシステイン間のジスルフィド結合を含む。同様に、適切に架橋結合したインスリンリスプロ化合物は、配列番号１の７位におけるシステインと配列番号３の７位におけるシステイン間のジスルフィド結合、配列番号１の２０位におけるシステインと配列番号３の１９位におけるシステイン間のジスルフィド結合、および配列番号１の６位におけるシステインと配列番号３の１１位におけるシステイン間のジスルフィド結合を含む。

本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ結合インスリンリスプロ」または「ペグ化インスリンリスプロ」と言う用語は、少なくとも１つのＰＥＧと共有結合し、生体内でインスリン活性を有するヒトインスリンリスプロ、またはその誘導体を意味する。

インスリンおよびインスリンリスプロの生物学的活性は既知である。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物に関して用いられる「インスリン活性」と言う用語は、限定されないが、それぞれ実施例５および実施例６で以下に記載される１型および２型糖尿病の動物モデルなど、一般に評価の定まった少なくとも１つの生体内動物モデルにおいて、血糖値を有意に低下させる能力を意味することが意図されている。従って、インスリン活性には、ＳＴＺ処置のラットにおいて、用量５６８ｎｍｏｌ／ｋｇを単回皮下注射した後約４時間から少なくとも約３６時間、血糖を１００ｍｇ／ｄＬ以下のレベルにまで低下させるペグ化インスリンリスプロ化合物の能力が含まれる。

「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を意味し、カップリング剤が存在してもしなくても、あるいはカップリング部分または活性化部分との誘導化が存在してもしなくてもよい。典型的な例として、ＰＥＧは末端にヒドロキシ基を持つ線形ポリマーであり、ＨＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨの式を有している。ＰＥＧ中の反復サブユニット「ｎ」の数は、ダルトンで表される分子量に関して近似されたものである。ペグ化化合物を調製するのに使用されるＰＥＧ試薬は、一般的に、ＰＥＧポリマー中に異なる数（ｎ）のエチレングリコール・サブユニットを有するＰＥＧの異種混合物を含んでいる。ＰＥＧの１つのエチレングリコール・サブユニットである（−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ））の分子量は約４４ダルトンである。従って、ＰＥＧポリマーの分子量は（ｎ）数によって決定される。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物に結合するＰＥＧは、約４００から約１０００の範囲のサブユニット数ｎを有している。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物に結合するＰＥＧが、約４００から約７５０の範囲のサブユニット数ｎを有しているのが好ましい。より好ましいのは、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物に結合するＰＥＧが、約４００から約５５０の範囲のサブユニット数ｎを有している場合である。最も好ましいのは、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物に結合するＰＥＧが、約４００から約５００の範囲のサブユニット数ｎを有している場合である。

ＰＥＧの数多くの誘導体、それを製造する方法およびインスリンやインスリンリスプロなどの蛋白質にそれを結合する方法は当業者には公知であり、本発明で使用するのに適している。例えば、ＰＣＴ特許出願国際公開公報第０１／６２８２７号、２００６／０２８７４５号、２００６／０９６５３５号、２００６／０３６８２５号、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５，１９９５；Ｖｅｒｏｎｅｓｅら，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−１５２，１９８５；およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．ら，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４：４５９−４７６，２００２を参照の事。本発明で使用される特に好ましい１つのＰＥＧは、ポリマーの一端が下級Ｃ_１−６アルコキシ基などの比較的不活性な基で終わっているＰＥＧである。好ましくは、ＰＥＧはモノメトキシＰＥＧ（一般的にｍＰＥＧと呼ばれる）である。これは線形のＰＥＧで、ポリマーの一端はメトキシ（−ＯＣＨ_３）基である。本発明で使用されるＰＥＧは「活性化ｍ−ＰＥＧ」であるのが更に好ましい。この場合、線形ＰＥＧの一端はメトキシ基で終わり、他端は、好ましい活性化ｍＰＥＧとのペグ化をインスリンリスプロ分子の特定の部位で促進させるため、インスリンリスプロまたはインスリンリスプロ誘導体の好ましい部位と結合するのに適した反応基で終わっている。

ＰＥＧは一般的に分子量がある程度多様なＰＥＧ化合物の混合物として製造および使用されるので、当業者は通常、特定のペグ化化合物を生成するペグ化反応に使用されるＰＥＧ試薬の平均サイズによって、化合物に結合するＰＥＧの分子量を表す。平均値を表すには数多くの方法が可能であるが、一般的には３つの方法が用いられている。すなわち、数平均分子量、重量平均分子量およびｚ平均分子量である。本明細書で使用する場合、「平均分子量」と言う用語は重量平均分子量を意味することが意図されるが、これは、限定されないが、マトリックス補助レーザー脱離イオン化時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、ゲル浸透クロマトグラフィまたは他の液体クロマトグラフィ技術、光散乱技術、超遠心、粘度測定技術など、当業者に周知の技術を用いて測定できる。重量平均分子量を計算する式はΣ（Ｍ_ｉ ^２Ｎ_ｉ）／Σ（Ｍ_ｉＮ_ｉ）で表されてもよく、式中、Ｎ_ｉは混合物に分子量Ｍ_ｉを有する分子のモル比率（または数比率）である。数平均分子量を計算する式はΣ（Ｍ_ｉＮ_ｉ）／Σ（Ｎ_ｉ）で表されてもよく、式中、Ｎ_ｉは混合物に分子量Ｍ_ｉを有する分子のモル比率（または数比率）である。重量平均分子量と数平均分子量の比は多重分散度指数（ＰＤＩ）として知られており、分布の大体の幅を示すものである。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を調製するのに適したＰＥＧ試薬は一般的に多重分散状態（すなわちポリマーの重量平均分子量と数平均分子量は等しくない）である。本発明の化合物または組成物を調製するのに使用されるＰＥＧ試薬のＰＤＩは、約１．１未満であるのが好ましい。更に好ましくは、本発明の化合物または組成物を調製するのに使用されるＰＥＧ試薬のＰＤＩは約１．０５未満である。

本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物に関して、インスリンリスプロ分子に共有結合しているＰＥＧの分子量は約１７．５ｋＤａから約４０ｋＤａの範囲（ｎは約４００から約１０００の範囲）、あるいはＰＥＧの平均分子量は約１７．５ｋＤａから約４０ｋＤａである。好ましくは、インスリンリスプロ分子に共有結合しているＰＥＧの分子量は約２０ｋＤａから約３０ｋＤａの範囲（ｎは約４５０から約７５０の範囲）、あるいはＰＥＧの平均分子量は約２０ｋＤａから約３０ｋＤａである。更に好ましいのは、インスリンリスプロ分子に共有結合しているＰＥＧの分子量は約１７．５ｋＤａから約２５ｋＤａの範囲（ｎは約４００から約５５０の範囲）、あるいはＰＥＧの平均分子量は約１７．５ｋＤａから約２５ｋＤａである。最も好ましいのは、インスリンリスプロ分子に共有結合しているＰＥＧの分子量は約１７．５ｋＤａから約２０ｋＤａの範囲（ｎは約４００から約５００の範囲）、あるいはＰＥＧの平均分子量は約１７．５ｋＤａから約２０ｋＤａである。

特定の実施形態では、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物は、好ましい平均分子量を持った活性化ｍＰＥＧをインスリンリスプロと共有結合させることにより調製される。ペグ化インスリンリスプロの反応条件は、使用される特定のＰＥＧ、インスリンリスプロの結合部位、インスリンリスプロ上で結合標的となる特定の種類の反応基、好ましいペグ化レベルなどによって異なり、当業者が容易に決定できる。特定のペグ化ストラテジーに最も適した実験条件は、一般的に、慣用の実験方法によって、当業者が容易に決定できる。

好ましい実施形態では、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物は、ｍＰＥＧマレイミド（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）やｍＰＥＧチオール（ｍＰＥＧ−ＳＨ）など、比較的チオール選択的な活性化ｍＰＥＧをインスリンリスプロに間接的に結合させることにより、すなわちＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）やＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）などの「アミン／チオール」調整剤を使ってインスリンリスプロに導入したチオール官能基に、チオール選択的活性化ｍＰＥＧを結合させることにより調製される。更に好ましいのは、インスリンリスプロ上のチオール・スルフィドリル基にＰＥＧを共有結合させるのに使用される活性化ｍＰＥＧは、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）などのｍＰＥＧマレイミドである。

本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を調製する好ましい方法は、マイケル付加反応を利用して安定したチオエーテル結合を形成する方法である。反応は非常に特異的であり、他の官能基の存在下、穏やかな条件下で生じる。例えば、ｍＰＥＧマレイミドは、活性化ｍＰＥＧとして、本発明のペグ化インスリンリスプロコンジュゲートを調製するのに役立つ。ペグ化工程は、反応を完結させるため、ｍＰＥＧマレイミドに対してチオール誘導インスリンリスプロをモル過剰使用するのが好ましい。反応は、ｐＨ４．０と９．０の間で、室温で１時間から４０時間行うのが好ましい。チオールを含むペグ化されていない過剰のペプチドは、通常の分離方法によりペグ化生成物から容易に分離される。活性化ｍＰＥＧマレイミドを用いるインスリンリスプロのペグ化に要求される典型的な条件は、実施例１に記載される。

特定の実施形態では、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物は、アミンに比較的特異的な活性化ｍＰＥＧを結合させることにより調製される。インスリンリスプロの主なアミン特異的ペグ化に適した活性化ｍＰＥＧには、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）、ｍＰＥＧスクシンイミジルアルファメチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）、ｍＰＥＧスクシンイミジルカーボネート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）、ｍＰＥＧベンゾトリアゾールカーボネート、ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ）などが含まれる。

本発明の好ましい実施形態では、インスリンリスプロのペグ化に使用される活性ｍＰＥＧによって、加水分解的に安定した共有結合、例えば、アミド結合、ウレタン（カルバメートとしても知られる）結合、アミン結合、チオエーテル（スルフィドとしても知られる）結合、尿素（カルバミドとしても知られる）結合などにより、ｍＰＥＧに共有結合的に結合するインスリンリスプロが生じる。更に好ましいのは、インスリンリスプロのペグ化に使用される活性化ｍＰＥＧはｍＰＥＧ−ＳＣまたはｍＰＥＧ−ＮＰＣである。いずれの場合も、ウレタン（すなわちカルバメート）結合によってＰＥＧに共有結合するインスリンリスプロが生じる。種々の分子量のｍＰＥＧ−ＮＰＣを用いるインスリンリスプロのペグ化に有効な典型的な条件は、実施例２に記載される。

本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物は、一般的に、イオン交換クロマトグラフィ、粒径排除クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィなど、１つ以上の精製技術を用いて精製される。試料中のペグ化インスリンリスプロ化合物の全体的な不均一性（ペグ化反応により生成されたペグ化インスリンリスプロ化合物の数および割合）は、クロマトグラフィ、電気泳動、質量分析、特にＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＮＭＲ分光技術のうち１つ以上を用いて評価できる。

本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物の調製に使用されるインスリンリスプロは、 液相方法、固相方法、半合成法、組み換えＤＮＡ技法など、一般に評価の定まった種々のペプチド合成技術のうちいずれかを用いて調製してよい。例えば、米国特許第５，７００，６６２号（Ｃｈａｎｃｅら）および欧州特許第２１４，８２６（Ｂｒａｎｇｅら）は、種々のインスリン類似体の調製を開示している。インスリンリスプロのＡ鎖およびＢ鎖は、組み換えＤＮＡ技法を用いて、プロインスリン様前駆体分子から調製してもよい。好ましい実施形態では、本発明のペグ化インスリンリスプロを作るのに使用されるインスリンリスプロが、プロインスリン様前駆体を使って生成される。

本発明は式Ｉの化合物：
Ｐ−〔（Ａ）−（Ｂ）〕
（式中、
Ａはインスリンリスプロ（配列番号１）のＡ鎖、
Ｂはインスリンリスプロ（配列番号３）のＢ鎖、
Ｐは約１７．５ｋＤａから約４０ｋＤａの範囲の分子量を有するＰＥＧであり、ＡおよびＢは適切に架橋結合しており、Ｐは共有結合によって直接または間接に、Ａ鎖の１位でグリシンのアルファアミノ基、Ｂ鎖の１位でフェニルアラニンのアルファアミノ基またはＢ鎖の２８位でリジンのイプシロンアミノ基に結合している）、またはその製薬上許容可能な塩を提供する。

本発明の好ましい化合物は、（ａ）Ｐがウレタン結合またはチオエーテル結合によってインスリンリスプロと共有結合し、（ｂ）ＳＴＺ処置ラットにおいて、約５６８ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、ヒトインスリン受容体に対して約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭまたはそれ以下のＫｉ値を有し、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間または約１４時間を超える除去半減期を有することによって特徴付けられる化合物、あるいはＳＴＺ処置ラットにおいて、化合物を約５６８ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で単回皮下注射した後、約４時間から少なくとも約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、約９６時間、約１０８時間または約１２０時間、血糖値を約１００ｍｇ／ｄＬ以下に低下させる活性によって特徴付けられる化合物である。更に好ましい化合物は、（ａ）Ｐがウレタン結合によってインスリンリスプロと共有結合し、（ｂ）ヒトインスリン受容体に対して約１０ｎＭ以下のＫｉ値を有し、（ｃ）ＳＴＺ処置ラットにおいて、約５６８ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、６時間を超える除去半減期を有することによって特徴付けられ、（ｄ）ＳＴＺ処置ラットにおいて、化合物を約５６８ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で単回皮下注射した後、約４時間から少なくとも約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、約９６時間、約１０８時間または約１２０時間、血糖値を約１００ｍｇ／ｄＬ以下に低下させる活性によって特徴付けられる化合物である。更に好ましい化合物は、（ａ）Ｐがウレタン結合によってインスリンリスプロと共有結合し、（ｂ）ヒトインスリン受容体に対して約１０ｎＭ以下のＫｉ値を有し、（ｃ）ＳＴＺ処置ラットにおいて、約５６８ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、６時間を超える除去半減期を有することによって特徴付けられ、（ｄ）ＳＴＺ処置ラットにおいて、化合物を約５６８ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で単回皮下注射した後、約４時間から少なくとも約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、約９６時間、約１０８時間または約１２０時間、血糖値を約１００ｍｇ／ｄＬ以下に低下させる活性によって特徴付けられ、（ｅ）０．２２５ｍｇ／ｋｇの用量で非経口的にヒトに単回投与した場合に、 約２４時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間または約４２時間を超える除去半減期を有することによって特徴付けられる化合物である。

本発明に一貫する特徴および原理によれば、本発明の１つの実施形態は、インスリンリスプロのＡ鎖の１位におけるグリシンのアルファアミノ基（ＰＥＧ−ＧｌｙＡ１インスリンリスプロ）、インスリンリスプロのＢ鎖の１位におけるフェニルアラニンのアルファアミノ基（ＰＥＧ−ＰｈＢ１インスリンリスプロ）、またはインスリンリスプロのＢ鎖の２８位におけるリジンのイプシロンアミノ基（ＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロ）に直接または間接に共有結合する、平均分子量約１７．５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａまたは約４０ｋＤａを有するＰＥＧを含むモノペグ化インスリンリスプロ化合物を提供する。好ましくは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのＢ鎖の１位におけるフェニルアラニンのアルファアミノ基、またはインスリンリスプロのＢ鎖の２８位におけるリジンのイプシロンアミノ基に直接または間接に共有結合する、平均分子量約１７．５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａまたは約４０ｋＤａを有するＰＥＧを含む場合である。更に好ましいのは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのＢ鎖の２８位におけるリジンのイプシロンアミノ基に結合する、平均分子量約１７．５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａまたは約４０ｋＤａを有するＰＥＧを含む場合である。更に好ましいのは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのＢ鎖の２８位におけるリジンのイプシロンアミノ基に結合する、平均分子量約１７．５ｋＤａまたは約２０ｋＤａを有するＰＥＧを含む場合である（２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロ）。最も好ましいのは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのＢ鎖の２８位におけるリジンのイプシロンアミノ基に結合する、平均分子量約２０ｋＤａを有するＰＥＧを含む場合である（すなわち、ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロ）。

本発明の他の実施形態は、インスリンリスプロのＡ鎖の１位におけるグリシンのアルファアミノ基、インスリンリスプロのＢ鎖の１位におけるフェニルアラニンのアルファアミノ基、またはインスリンリスプロのＢ鎖の２８位におけるリジンのイプシロンアミノ基に直接または間接に共有結合する、平均分子量約１７．５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａまたは約４０ｋＤａを有するＰＥＧを含むモノペグ化インスリンリスプロ化合物を提供する。好ましくは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのＢ鎖の１位におけるフェニルアラニンのアルファアミノ基、またはインスリンリスプロのＢ鎖の２８位におけるリジンのイプシロンアミノ基に直接または間接に共有結合する、平均分子量約１７．５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａまたは約４０ｋＤａを有するＰＥＧを含む場合である。更に好ましいのは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのＢ鎖の２８位におけるリジンのイプシロンアミノ基に結合する、平均分子量約１７．５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａまたは約４０ｋＤａを有するＰＥＧを含む場合である。最も好ましいのは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのＢ鎖の２８位におけるリジンのイプシロンアミノ基に結合する、平均分子量約２０ｋＤａを有するＰＥＧを含み、０．２２５ｍｇ／ｋｇの化合物を単回皮下投与でヒトに投与した場合、ＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロが、約２４時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間または約４２時間を超える除去半減期を有することにより特徴づけられる場合である。

別の実施形態では、本発明は、ＰＥＧの結合が異なる部位で生じるペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物、および／またはモノペグ化インスリンリスプロ、ジペグ化インスリンリスプロおよびトリペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含む組成物を提供する。本発明による具体的な組成物は、ｉ）ＰＥＧ−ＧｌｙＡ１インスリンリスプロ、ｉｉ）ＰＥＧ−ＰｈｅＢ１インスリンリスプロ、ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロ、ｉｖ）ジＰＥＧ−ＧｌｙＡ１ＰｈｅＢ１インスリンリスプロ、ｖ）ジＰＥＧ−ＧｌｙＡ１ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロ、ｖｉ）ジＰＥＧ−ＰｈｅＢ１ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロおよびｖｉｉ）ジＰＥＧ−ＧｌｙＡ１ＰｈｅＢ１インスリンリスプロからなる群から選択される２つ以上のペグ化インスリンリスプロ化合物を含む。更に好ましいのは、本発明の組成物はペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、そのペグ化インスリンリスプロ化合物の約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９７％を超える量が式Ｉのモノペグ化インスリンリスプロ化合物である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、そのペグ化インスリンリスプロ化合物の約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９７％を超える量がモノペグ化インスリンリスプロ化合物であり、全ペグ化インスリンリスプロ化合物の約２０％、約１５％、約１０％、約５％または約３％未満がジペグ化されている場合である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、そのペグ化インスリンリスプロ化合物の約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９７％を超える量がＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロの場合である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、そのペグ化インスリンリスプロ化合物の約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９７％を超える量がＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロであり、全ペグ化インスリンリスプロ化合物の約２０％、約１５％、約１０％、約５％または約３％未満がＰＥＧ−ＧｌｙＡ１インスリンリスプロの場合である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、そのペグ化インスリンリスプロ化合物の約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９７％を超える量がＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロであり、全ペグ化インスリンスプロ化合物の約２０％、約１５％、約１０％、約５％または約３％未満がＰＥＧ−ＧｌｙＡ１インスリンリスプロであり、全ペグ化インスリンスプロ化合物の約１０％、約５％または約３％未満がジペグ化インスリンリスプロ化合物の場合である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、全ペグ化インスリンリスプロ化合物の約８０％がＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロ、約１０％がＰＥＧ−ＧｌｙＡ１インスリンリスプロ、約１０％がジＰＥＧ−ＧｌｙＡ１ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロの場合である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、全ペグ化インスリンリスプロ化合物の約９０％以上がＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロ、約５％以下がＰＥＧ−ＧｌｙＡ１インスリンリスプロ、約５％以下がジＰＥＧ−ＧｌｙＡ１ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロの場合である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、全ペグ化インスリンリスプロ化合物の約９０％以上がＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロ、約５％以下がＰＥＧ−ＧｌｙＡ１インスリンリスプロ、約５％以下がジＰＥＧ−ＧｌｙＡ１ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロであり、０．２２５ｍｇ／ｋｇの化合物を単回皮下投与でヒトに投与した場合、ＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロが、約２４時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間または約４２時間を超える除去半減期を有することにより特徴づけられる場合である。最も好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、全ペグ化インスリンリスプロ化合物の約９５％以上がＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロ、約５％以下がＰＥＧ−ＧｌｙＡ１インスリンリスプロであり、０．２２５ｍｇ／ｋｇの化合物を単回皮下投与でヒトに投与した場合、ＰＥＧ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロが、約２４時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間または約４２時間を超える除去半減期を有することにより特徴づけられる場合である。

本明細書で使用する場合、「塩基条件」と言う用語は、ペグ化反応の塩基度を意味する。インスリンリスプロのＢ鎖の２８位にリジンを有するペグ化インスリンリスプロに関して、反応は、より選択的に、実質的に脱プロトン化したインスリンリスプロのアルファアミノ基との間で行われるべきである。水性溶媒または共溶媒では、塩基条件とは７．０を超えるｐＨで反応が行われることを意味する。ペグ化反応が約８．５から約１１．５のｐＨで行われるのが好ましい。有機溶媒では、反応は水中で１０．７５以上のｐＫａに等しい塩基度を有する塩基の存在下で行われる。

本発明は、以下の式のペグ化インスリンリスプロ化合物、またはその製薬上許容可能な塩を製造する工程：
Ｐ−〔（Ａ）−（Ｂ）〕
（式中、
Ａはインスリンリスプロ（配列番号１）のＡ鎖、
Ｂはインスリンリスプロ（配列番号３）のＢ鎖、
Ｐは約２０ｋＤａから約４０ｋＤａの範囲の分子量を有するＰＥＧであり、ＡおよびＢは適切に架橋結合しており、Ｐはウレタン共有結合によってＢの２８位でリジンのイプシロンアミノ基に結合している）も含み、当該工程には、約２５℃と約３０℃の間の反応温度で、Ｂの２８位におけるリジンのイプシロンアミノ基と、約２０ｋＤａと約４０ｋＤａの間の重量平均分子量を有するモノメトキシポリエチレングリコールｐ−ニトロフェニルカルボネート（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ）とをｐＨ約８．５と約１１．５の間の水性溶媒中で反応させるステップが含まれる。好ましくは、反応のｐＨは約１０．５から約１１．１の間に維持され、ペグ化反応は約２５℃と約３０℃の間の温度で約２時間から約１２時間行われ、ｍＰＥＧ−ＮＰＣ対インスリンリスプロの比率は約１．０から約５．０の範囲である。更に好ましいのは、ｍＰＥＧ−ＮＰＣの重量平均分子量が約２０ｋＤａで、反応のｐＨが約１０．５と約１１．１の間に維持され、ペグ化反応が約２５℃と約３０℃の間の温度で約２時間から約１２時間行われ、ｍＰＥＧ−ＮＰＣ対インスリンリスプロの比率が約１．０と約５．０の範囲にある場合である。更に好ましいのは、ＰＥＧ対インスリンリスプロのモル比率が約２．５と約４．５の範囲にあり、ｍＰＥＧ−ＮＰＣの重量平均分子量が約２０ｋＤａで、ペグ化反応のｐＨが約１０．５と約１１．１の間に維持され、ペグ化反応が約２５℃と約３０℃の間の温度で約３時間から約６時間維持される場合である。最も好ましいのは、ＰＥＧ対インスリンリスプロのモル比率が約２．６と約４．５の範囲にあり、ｍＰＥＧ−ＮＰＣの重量平均分子量が約２０ｋＤａで、ペグ化反応のｐＨが約１０．５と約１１．１の間に維持され、反応が約２５℃と約３０℃の間の温度で約３時間維持される場合である。

異なる分子量を有する本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物は、必要に応じて、当業者に公知の種々の技法を用いて単離できる。かかる技法には、限定されないが、ゲル濾過クロマトグラフィおよび／またはイオン交換クロマトグラフィが含まれる。すなわち、ゲル濾過クロマトグラフィを用いて、異なる分子量（本質的にペグ化反応に使用されるＰＥＧの平均分子量に対応する差異）に基づいて、モノペグ化インスリンリスプロ化合物、ジペグ化インスリンリスプロ化合物およびトリペグ化インスリンリスプロ化合物の画分に分けてもよい。例えば、平均分子量約２０ｋＤａを有する活性化ｍＰＥＧにインスリンリスプロを結合させる典型的な反応では、反応混合物は分子量約５，８０８ダルトンを有する非修飾インスリンリスプロ、平均分子量約２５，８０８ダルトンを有するモノペグ化インスリンリスプロ、平均分子量約４５，８０８ダルトンを有するジペグ化インスリンリスプロ、および平均分子量約６５，８０８ダルトンを有するトリペグ化インスリンリスプロが含まれる場合がある。しかし、ゲル濾過技法は流体力学的サイズに基づいて化合物を分離するので、平均分子量約２０ｋＤａを有するｍＰＥＧと結合したモノペグ化インスリンリスプロは、平均分子量が約２５，８０８ダルトンであるにもかかわらず、ゲル濾過中約８２ｋＤａの蛋白質として移動する。当業者は、精製および／または定量化に際し、平均分子量約２０ｋＤａのｍＰＥＧとペグ化したジペグ化種およびトリペグ化種が、非常に異なる移動または保持時間を有することを予期するであろう。

「血漿半減期」と言う用語は、体内の薬物の血漿濃度が半分に低下する時間を意味する。「除去半減期」と言う用語は代替的に使用され、除去の最終対数線形率に相当する。当業者は、半減期がクリアランスと分配量の両方の関数として変化する誘導パラメーターであることを理解している。血漿半減期または除去半減期に関して用いられる「長期的」、「長期化」、または「増大」と言う用語は、本明細書では同じ意味で使用され、比較条件化で測定した場合、基準分子（例えばインスリンリスプロ）の半減期と比べて試験化合物（例えばペグ化インスリンリスプロ）の半減期が統計学的に有意に増大する意味であることが意図されている。

クリアランスは薬物を排除する体の能力の尺度である。例えば薬物の修飾によってクリアランスが低下すれば、半減期は増大することが予想される。しかし、この相互関係は、分配量に変化がない場合のみ正確である。最終対数線形半減期（ｔ_１／２）、クリアランス（ＣＬ）および分配量（Ｖ）の間の有効な近似関係は、ｔ_１／２〜０．６９３（Ｖ／ＣＬ）の式で表される。クリアランスは、除去を説明するにあたり、薬物がどれほど除去されたかではなく、むしろ、薬物を完全に無くすのに必要な血液や血漿などの生物学的流体の量を示すものである。クリアランスは単位時間当たりの量として表わされる。

本明細書で使用する場合、「治療」または「治療する」と言う用語は、糖尿病、高血糖症、あるいは症状や合併症と闘うまたはそれを軽減する目的でインスリン投与を必要とする他の病状に罹患している患者の管理およびケアを意味する。治療には、症状または合併症の発症、症状または合併症の軽減、または病気、病状または疾患の排除のために、本発明の化合物または組成物を投与するステップも含まれる。治療対象の患者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。

式１のペグ化インスリンリスプロ化合物は、１つ以上の式Ｉの化合物をそれを必要とする患者に治療上有効量投与して、高血糖症を治療するのに有効である。本明細書で使用する場合、「治療上有効量」と言う用語は、患者の血糖を調節するのに十分な式Ｉのペグ化インスリンリスプロ化合物またはその組成物の量を意味する。式Ｉのペグ化インスリンリスプロの好ましい治療上有効量は、約０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇから約１００ｎｍｏｌ／ｋｇである。更に好ましいのは、治療上有効量が約０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇから約５０ｎｍｏｌ／ｋｇの場合である。更に好ましいのは、治療上有効量が約０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇから約２０ｎｍｏｌ／ｋｇの場合である。更に好ましいのは、治療上有効量が約０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇから約１０ｎｍｏｌ／ｋｇの場合である。更に好ましいのは、治療上有効量が約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇから約７．５ｎｍｏｌ／ｋｇの場合である。更に好ましいのは、治療上有効量が約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇから約５ｎｍｏｌ／ｋｇの場合である。もっとも好ましいのは、治療上有効量が約０．５ｎｍｏｌ／ｋｇから約５ｎｍｏｌ／ｋｇの場合である。しかし、ペグ化インスリンリスプロ化合物または実際に投与される１つ以上のペグ化インスリンリスプロ化合物を含む組成物の量は、治療対象の病状を含む様々な関連状況（すなわち高血糖症の原因）、投与されるペグ化インスリンリスプロの特定の種またはペグ化インスリンリスプロ化合物の特定の混合物、同時投与される他の薬物、インスリンまたはその他、選択された非経口的投与経路、個々の患者の年齢、体重および反応、並びに患者の症状の重篤性を考慮して、医師が決定するものであることは理解されるべきである。従って、上述の用量範囲は、如何なる意味でも、本発明の範囲を制限するものではない。

「血糖を調節するのに十分」と言う用語は、化合物または組成物を患者に投与することにより、正常な空腹時血漿グルコースレベルになることを意味する。臨床的に正常な空腹時血漿グルコースレベルは７０−１１０ｍｇ／ｄＬである。臨床的に正常な食後血漿グルコースレベルは１４０ｍｇ／ｄＬ未満である。

インスリン構造の共有結合的化学変化が貯蔵中に起きることが知られている。その結果、活性の低下した分子、脱アミド化生成物のように潜在的に免疫原性的な生成物、および高分子量の転換生成物（例えば、２量体、オリゴマー、ポリマー）が形成される場合がある。インスリンの化学的安定性に関する総合的な研究がＪｅｎｓ Ｂｒａｎｇｅ，“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ，” Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９４に記載されている。インスリン組成物は一般的に約２−８℃以下という低温で貯蔵される（低温貯蔵は、室温で貯蔵する場合と比べて貯蔵寿命をかなり改善する）という事実があるにもかかわらず、インスリン製品の保存寿命は、可溶性の凝集体（２量体、オリゴマー、ポリマー）の形成によりやがて低下する。更に、インスリン製品は振動により（例えば、患者がポケットに入れて持ち運んだり、輸送したりすることにより）不溶性の凝集体（フィブリル）を形成する傾向にある。化学的または物理的影響により可溶性および不溶性の凝集体が形成される傾向を最小限にまで減らすことが、インスリン製品の質にとって非常に重要である。従って、インスリン組成物を治療に使用するためには、化学的および物理的な安定特性を証明しなければならない。

本明細書で使用する場合、「安定性」と言う用語は、ペグ化インスリンリスプロ化合物の調剤の物理的および／または化学的安定性を意味する。ペグ化インスリンリスプロ調剤の物理的不安定は、蛋白質分子の凝集により高位のポリマーや更には沈殿物を形成することにより生じる場合がある。「安定した」調剤では、蛋白質の凝集度が受容可能なレベルに制御されており、時間とともに受容不可能なレベルにまで増大するということがない。本発明の特定の実施形態では、ペグ化インスリンリスプロ調剤は、凝集度が出発物質の凝集度の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％または３０％以内であれば、特定の期間安定であると考えられる。本発明の特定の実施形態では、ペグ化インスリンリスプロ調剤は、ポリペプチドの生物学的活性が出発物質の活性の少なくとも約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％であれば、特定の期間安定であると考えられる。

本明細書で使用する場合、「化学的安定性」と言う用語は、ペグ化インスリンリスプロ組成物が、貯蔵中に、約２−８℃の低温貯蔵および約２０−４０℃の高温貯蔵を含む静止条件下で、可溶性の蛋白質凝集体を形成する傾向にあることを意味する。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物の化学的安定性は、特定の条件化で（例えば、特定の温度および湿度条件で特定の期間）、製剤の分析属性を決定することにより測定できる。測定可能な分析属性には、例えば、粒径排除ＨＰＬＣを用いる高分子量種の形成などが含まれる。その結果は、次にモニターし、予め特定されたパラメーターと比較できる。

本明細書で使用する場合、「物理的安定性」と言う用語は、ペグ化インスリンリスプロ組成物の振動など、物理的な行為の結果として不溶性の蛋白質凝集体が形成される傾向にあることを意味する。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を種々の医薬調剤の形で、一定期間、種々の温度で貯蔵した場合の物理的安定性は、当業者に周知の方法により評価してよい。試料の見かけの光減衰（吸光度または光学密度）の測定もその中に含まれる。かかる光減衰の測定は、製剤の混濁に関係している。混濁は製剤中の蛋白質または複合体の凝集や沈殿により生じる。物理的安定性を評価する他の方法は当業者には周知であり、粒子の存在または不在の視覚的評価やチオフラビンＴ蛍光顕微鏡検査法によるフィブリル／ゲル形成の検出などもその中に含まれる。

本発明の他の実施形態は、患者（特にヒト）に投与するのに適しており、式Ｉに示した少なくとも１つのペグ化インスリンリスプロ化合物の治療上有効量および１つ以上の製薬上許容可能な賦形剤、希釈剤、緩衝液、金属イオンまたは担体を含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物はその性質上一般的に非経口的（そうでない場合もある）であり、当業者に周知の従来の非経口製品用賦形剤、緩衝液、希釈剤、金属イオンまたは担体を使用し、種々の技術のいずれかによって調製してもよい。

本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物はきわめて水溶性であるので、本発明の医薬組成物は水を主要溶媒として包含する組成物を含んでおり、ペグ化インスリンリスプロ化合物の全濃度は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上であり、製薬上許容可能な緩衝液を含み、医薬組成物のｐＨは約４．０から約８．５である。本発明の医薬組成物のｐＨは約６．０から約８．５であるのが好ましい。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、全濃度が約２．５ｍｇ／ｍＬから約６０ｍｇ／ｍＬの範囲のペグ化インスリンリスプロ化合物および緩衝液を含み、組成物のｐＨが約６．０から約８．５の範囲の場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、全濃度が約５ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬの範囲のペグ化インスリンリスプロ化合物および緩衝液を含み、医薬組成物のｐＨが約６．５から約７．５の範囲の場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、全濃度が約１０ｍｇ／ｍＬから約４０ｍｇ／ｍＬの範囲のペグ化インスリンリスプロ化合物および緩衝液を含み、医薬組成物のｐＨが約６．５から約７．５の範囲の場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、全濃度が約１５ｍｇ／ｍＬから約４０ｍｇ／ｍＬの範囲のペグ化インスリンリスプロ化合物および緩衝液を含み、医薬組成物のｐＨが約７．０から約７．５あるいは約７．０から約８．０の範囲の場合である。本発明の医薬組成物が更に治療上有効量のインスリンを含んでいるのが更に好ましい。更に好ましいのは、上記インスリンがインスリン類似体の場合である。更に好ましいのは、インスリン類似体が迅速に作用するインスリン類似体の場合である。最も好ましいのは、迅速に作用するインスリン類似体がインスリンリスプロの場合である。

「緩衝液」と言う用語は、酸塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する溶液を意味する。使用される緩衝液は製薬上許容可能な緩衝液であるのが好ましい。「製薬上許容可能な緩衝液」と言う用語は、インスリン製剤に使用しても安全であり、医薬組成物のｐＨを目的のｐＨへ制御する効果のある溶液を意味する。好ましい実施形態では、緩衝液は約６．０から約８．５の範囲のｐＨを有している。更に好ましいのは、緩衝液が約７．０から約８．０の範囲のｐＨを有している場合である。本発明の組成物をこの範囲のｐＨに制御するのに用いられる製薬上許容可能な緩衝液は、限定されないが、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、アルギニン緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびそれらの組み合わせを含む。「トリス」は２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールおよびその薬理学的に許容可能な塩を意味する。遊離塩基および塩酸塩（すなわちトリスＨＣｌ）が、トリスの一般的な２つの形態である。トリスはトリメチロールアミノメタン、トロメタミン、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとしても当業者に知られている。本発明の医薬組成物は、約２．５ｍＭから約５０ｍＭのリン酸塩緩衝液またはトリス緩衝液を含むのが好ましい。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が約５ｍＭから約２０ｍＭのリン酸塩緩衝液またはトリス緩衝液を含む場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が約５ｍＭから約１０ｍＭのリン酸塩緩衝液を含む場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が約５ｍＭのリン酸塩緩衝液を含む場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が約７．５ｍＭから約５０ｍＭのトリス緩衝液を含む場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が約１０ｍＭから約２５ｍＭのトリス緩衝液を含む場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が約１５ｍＭから約２０ｍＭのトリス緩衝液を含む場合である。最も好ましいのは、本発明の医薬組成物が約１６ｍＭのトリス緩衝液を含む場合である。

本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物および組成物は、非経口的に患者に投与される既知のインスリン製剤と同様の方法で製剤化してもよい。かかる製剤化は当業者には周知である。式Ｉのペグ化インスリンリスプロ化合物をＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）インスリンリスプロまたはＨｕｍｕｌｉｎ（登録商標）の製剤化と同様に製剤化するのが好ましい。従って、本発明の好ましい医薬組成物は、水、式Ｉのペグ化インスリンリスプロ化合物、等張剤および製薬上許容可能な緩衝液を含んでもよい。本発明の医薬組成物は製薬上許容可能な防腐剤を更に含むのが好ましい。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、インスリンの６量体化を促進し得る二価の陽イオン、例えば亜鉛および／またはコバルトを更に含む場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、少なくとも１つの６量体安定化剤を更に含む場合である。更に、ｐＨを調整するため、塩酸および／または水酸化ナトリウムを添加してもよい。

「等張剤」は生理学的に寛容な化合物で、製剤に適切な等張性を与えることにより、投与された医薬組成物に接触する細胞膜に水の正味の流れが生じるのを防ぐ。グリセリンとしても知られるグリセロールは等張剤として一般的に使用される。他の等張剤としては、ｉ）限定されないが、マンニトールやソルビトールなどの他の糖アルコール、ｉｉ）限定されないが、ＮａＣｌなどの塩、ｉｉｉ）限定されないが、デキストロースなどの単糖類、ｉｖ）限定されないが、ラクトース、ショ糖、トレハロースなどの二糖類などが含まれる。本発明の医薬組成物には１つ以上の等張剤を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、約２７０ミリオスモルから約３３０ミリオスモルの範囲の等張性を持つ製剤を生成することのできる１つ以上の等張剤を有するのが好ましい。等張剤がグリセロール、ソルビトール、ショ糖、ＮａＣｌ、トレハロースおよび／またはマンニトールであれば更に好ましい。更に好ましいのは、等張剤がグリセロール、ソルビトール、ショ糖、ＮａＣｌおよび／またはトレハロースの場合である。更に好ましいのは、グリセロール、ソルビトール、ショ糖、ＮａＣｌまたはトレハロースが、約１００ｍＭから約２００ｍＭの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。更に好ましいのは、グリセロールが、約１００ｍＭから約２００ｍＭの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。更に好ましいのは、グリセロールが、約１５０ｍＭから約１８０ｍＭの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。更に好ましいのは、グリセロールが、約１３０ｍＭから約１７５ｍＭの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。更に好ましいのは、ＮａＣｌが、約５０ｍＭから約３００ｍＭの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。更に好ましいのは、ＮａＣｌが、約１００ｍＭから約２００ｍＭの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。最も好ましいのは、ＮａＣｌが、約１５０ｍＭの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。

本発明の医薬組成物は６量体安定化化合物を含んでもよい。「６量体安定化化合物」と言う用語は、６量体会合状態にある本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を安定化させる、非蛋白質様の小分子量の化合物である。インスリン分子用の既知の６量体安定化化合物は、カルシウムイオン、亜鉛、コバルト、銅、ニッケル、鉄、マグネシウム、マンガン、陰イオン、特に塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアネート、およびフェノール系化合物、特にフェノール、フェノール系防腐剤、レゾルシノール、４’−ヒドロキシアセトアニリド、４−ヒドロキシベンズアミドおよび２，７−ジヒドロキシナフタレンである。好ましくは、６量体安定化化合物は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、メチルパラベン、カルシウム、塩化物、または２つ以上の当該化合物の組み合わせである。６量体安定化化合物はフェノール、ｍ−クレゾール、カルシウム、塩化物、またはそれらの組み合わせであるのが更に好ましい。好ましくは、本発明の医薬組成物は、約１ｍＭと７５ｍＭの間のカルシウム、約１ｍＭと約５０ｍＭの間のカルシウム、約１ｍＭと約２５ｍＭの間のカルシウム、約５ｍＭと約５０ｍＭの間のカルシウム、約２．５ｍＭと約３０ｍＭの間のカルシウム、約２．５ｍＭと約１５ｍＭの間のカルシウム、約２．５ｍＭと約１０ｍＭの間のカルシウム、約５ｍＭと約３０ｍＭの間のカルシウム、約５ｍＭと約１５ｍＭの間のカルシウムを含む。より好ましくは、本発明の医薬組成物は約２．５ｍＭと１０ｍＭの間のカルシウムを含む。

本発明の医薬組成物の多用途製剤は防腐剤を含んでいてもよい。「防腐剤」と言う用語は、医薬製剤に添加され、抗菌薬として作用する化合物を意味する。非経口製剤として有効で許容可能な、当業者に公知の防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサル、安息香酸、およびそれらの種々の混合物が含まれる。特定のフェノール系防腐剤、例えばメチルパラベン、フェノールおよびｍ−クレゾールは、インスリンおよびインスリン様化合物と結合し、物理的または化学的安定性あるいは両方の安定性を増大させる立体配座的変化を誘起することが知られている（例えば、Ｂｉｒｎｂａｕｍ，Ｄ．Ｔ．ら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｒｅｓ．１４：２５−３６（１９９７）；Ｒａｈｕｅｌ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ，Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：５８３７−５８４５（１９９７）を参照）。「フェノール系防腐剤」には、フェノール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、メチルパラベンの化合物、およびそれらの混合物が含まれる。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物の製剤に使用される防腐剤は、フェノール系防腐剤であってもよいし、６量体安定化化合物と同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、フェノール系防腐剤はｍ−クレゾールまたはフェノールである。本発明の医薬組成物は、約０．１ｍＭから約７５ｍＭの濃度のフェノールおよび／またはｍ−クレゾールを、防腐剤として、約７．０から約８．０のｐＨで含んでいるのが更に好ましい。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、約１ｍＭから約６０ｍＭの濃度のフェノールおよび／またはｍ−クレゾールを、防腐剤として、約７．０から約８．０のｐＨで含んでいる場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、約１０ｍＭから約４０ｍＭの濃度のフェノールおよび／またはｍ−クレゾールを、防腐剤として、約７．０から約８．０のｐＨで含んでいる場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、約３０ｍＭの濃度のフェノールおよび／またはｍ−クレゾールを、約７．０から約８．０のｐＨで含んでいる場合である。最も好ましいのは、本発明の医薬組成物が、約３０ｍＭの濃度のフェノールおよび／またはｍ−クレゾールを、約７．３から約７．５のｐＨで含んでいる場合である。

上述したように、本発明の医薬組成物は、インスリンの６量体化を促進あるいはインスリン化合物を安定化する二価の金属陽イオン、例えば亜鉛またはコバルトを含んでいてもよい。「二価の金属陽イオン」と言う用語は、複数の蛋白質分子と複合体を形成するために共有するイオンまたはイオン群を意味する。遷移金属、アルカリ金属およびアルカリ土類金属は、インスリン化合物と複合体を形成することが知られている金属の例である。遷移金属が好ましい。二価の金属陽イオンは、亜鉛、銅、コバルト、ニッケル、マンガン、マグネシウム、カドミウムおよび鉄からなる群から選択される１つ以上の陽イオンであるのが好ましい。二価の金属陽イオンが亜鉛であるのが更に好ましい。亜鉛は、インスリンおよびインスリンリスプロを含む種々のインスリン類似体および／または誘導体の６量体形成を促進することが知られている。本発明の医薬組成物に含まれる亜鉛やコバルトなどの二価の陽イオンの主要な役割は、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物および／または本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を含む医薬組成物に含まれる他のインスリンまたはインスリン類似体の６量体形成を促進することである。フェノール系防腐剤が存在する場合、本発明の医薬組成物を含む溶液のｐＨを亜鉛（ＩＩ）イオンの存在下で中性領域に調整することにより、あるいはｐＨを中性領域に調整した後に亜鉛（ＩＩ）を添加することにより、６量体形成を促進できる場合がある。亜鉛対インスリン化合物、インスリン類似体および／またはペグ化インスリンリスプロ化合物の比率は、下限として約０．３３に固定するのが好ましい。すなわち、２つの亜鉛原子に対して１つのインスリン６量体、インスリン類似体６量体および／またはペグ化インスリンリスプロ６量体が好ましい。更に好ましいのは、亜鉛対インスリン化合物、インスリン類似体および／またはペグ化インスリンリスプロ化合物の比率が約０．３３から約０．６７の場合である。亜鉛結合で蛋白質と競合する化合物、例えばクエン酸塩やリン酸塩が存在する場合は、処理中に追加の亜鉛を使用してもよい。６量体化に必要な量を超える過剰の亜鉛（例えば、亜鉛対インスリン化合物、インスリン類似体および／またはペグ化インスリンリスプロ化合物の比率が約０．３３から約０．８３の場合）が、６量体化を更に促進するのに好ましい場合がある。６量体化に必要な量を超える過剰の亜鉛を本発明の医薬組成物に存在させてもよく、それが化学的および物理的安定性の改善、「懸濁性」の改善、および時間−作用の更なる拡張にとって好ましい場合がある。一方、クエン酸塩緩衝液またはリン酸塩緩衝液中の過剰の亜鉛は、それぞれクエン酸亜鉛またはリン酸亜鉛並びにインスリンの沈殿の原因となる場合がある。

本発明によれば、インスリン、インスリン類似体およびペグ化インスリンリスプロ６量体１モル当たり約０．３モルから約３モルの亜鉛を製剤中に存在させてもよい。全インスリン、インスリン類似体およびペグ化インスリンリスプロの６量体１モル当たり約０．３モルから約１モルの亜鉛を本発明の医薬組成物中に存在させるのが、更に好ましい。更に好ましいのは、全インスリン、インスリン類似体およびペグ化インスリンリスプロの６量体１モル当たり約０．３モルから約０．７モルの亜鉛を本発明の医薬組成物中に存在させる場合である。最も好ましいのは、インスリン、インスリン類似体およびペグ化インスリンリスプロの６量体１モル当たり約０．３モルから約０．５５モルの亜鉛を本発明の医薬組成物中に存在させる場合である。本発明に亜鉛を提供する亜鉛化合物は、製薬上許容可能な亜鉛化合物であればどれでもよい。インスリン製剤への亜鉛の添加は、製薬上許容可能な亜鉛源同様、当業者には公知である。亜鉛は塩として供給されるのが好ましい。例えば、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、クエン酸亜鉛、酸化亜鉛、硝酸亜鉛などである。

本発明の更なる実施形態では、本発明の医薬組成物は更に１つ以上の表面活性剤を含む。本明細書で使用する場合、「表面活性剤」と言う用語は、気相液相界面の吸着により液相の表面張力を減少させる試剤を含む。表面活性剤の例には、限定されないが、非イオン性の表面活性剤、例えば、ポリソルベート（ポリソルベート８０やポリソルベート２０など）、ポロキサマー（ポロキサマー１８８など）、トリトン（商標）（トリトン（商標）Ｘ−１００など）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、エチレンとプロピレングリコールのコポリマー（プルロニックスやＰＦ６８など）が含まれる。例えば、本発明の医薬組成物には、約０．００１−０．５％（例えば、０．０５−０．３％）の表面活性剤が存在してもよい。本発明の医薬組成物に使用される表面活性剤はポロキサマー１８８であるのが好ましい。更に好ましいのは、表面活性剤がポロキサマー１８８で、その濃度が約０．５ｍｇ／ｍＬと約１０ｍｇ／ｍＬの間、約１ｍｇ／ｍＬと約１０ｍｇ／ｍＬの間、約２ｍｇ／ｍＬと約１０ｍｇ／ｍＬの間、約３ｍｇ／ｍＬと約１０ｍｇ／ｍＬの間、約４ｍｇ／ｍＬと約１０ｍｇ／ｍＬの間、約１ｍｇ／ｍＬと約５ｍｇ／ｍＬの間、約２ｍｇ／ｍＬと約５ｍｇ／ｍＬの間、約３ｍｇ／ｍＬと約５ｍｇ／ｍＬの間、および約４ｍｇ／ｍＬと約５ｍｇ／ｍＬの間の場合である。

本発明は、好ましくはヒトにおいて、低血糖症および／または糖尿病の治療に使用される、式Ｉのペグ化インスリンリスプロ化合物またはその製薬上許容可能な塩も提供する。

本発明は、好ましくはヒトにおいて、低血糖症および／または糖尿病の治療用の医薬品の製造に使用される、式Ｉのペグ化インスリンリスプロ化合物またはその製薬上許容可能な塩も提供する。

本発明のペグ化インスリンリスプロを含む医薬組成物は、それを必要とする患者に非経口的に投与してもよい。非経口投与は、注射器、任意にペンタイプの注射器または機械駆動の注入器を用いて、皮下、筋肉内または静脈内注射によって行ってもよい。あるいは、非経口投与は輸液ポンプを用いて行ってもよい。

（調製１：ＧｌｙＡ１−ＨＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯインスリンリスプロ（３）およびＬｙｓＢ２８−ＨＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯインスリンリスプロ（４））
Ｔｒｔ−ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−ＯＨ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を１ｍｍｏｌずつＤＭＦ２ｍＬ中で３０分混合して、Ｔｒｔ−ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−ＮＨＳエステルを調製する。１／１０ｍｍｏｌのインスリンリスプロを５％トリエチルアミン（ＴＥＡ）のＤＭＳＯ溶液１０ｍＬに溶解する。その溶液に、活性化したＴｒｔ−ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−ＮＨＳを０．２ｍｍｏｌ加える。室温で２時間反応させた後、反応を終了させるため、エタノールアミン０．２ｍＬを添加する。次に反応混合物を９０ｍＬの水で希釈し、ＲＰ−Ｃ１８カラムで精製する。目的のＬｙｓＢ２８−Ｔｒｔ−ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯインスリンリスプロ（２）の画分をプールし凍結乾燥する。それとは別に、目的のＧｌｙＡ１−Ｔｒｔ−ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯインスリンリスプロ（１）の画分をプールし凍結乾燥する。０．２ｍＬのチオアニソールと０．４ｍＬのトリイソプロピルシランを含むＴＦＡ５ｍＬに、１／１０ｍｍｏｌの（１）または（２）を溶解する。３０分後、ＴＦＡを蒸発によって除去し、残留性のペプチドを１０％ＡＣＮの水溶液５０ｍＬに移す。その結果得られる溶液をＲＰ−Ｃ１８カラムで精製する。目的の（３）または（４）の画分をプールし、任意に凍結乾燥する。

（調製２：ＰｈｅＢ１−ＨＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯインスリンリスプロ（７））
１／１０ｍｍｏｌのインスリンリスプロを５％ＴＥＡのＤＭＳＯ溶液１０ｍＬに溶解する。その溶液に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルカーボネートのＤＭＳＯ溶液０．２ｍｍｏｌを添加する。室温で１時間反応させた後、反応を終了させるため、エタノールアミン０．２ｍＬを添加する。次に反応混合物を９０ｍＬの水で希釈し、ＲＰ−Ｃ１８カラムで精製する。目的のＢｏｃ−ＧｌｙＡｌおよびＢｏｃ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロの画分をプールし、凍結乾燥して（５）を得る。１／１０ｍｍｏｌの（５）を５％ＴＥＡのＤＭＳＯ溶液１０ｍＬに溶解する。その溶液に、活性化したＴｒｔ−ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−ＮＨＳを０．２ｍｍｏｌ加える。室温で２時間反応させた後、反応を終了させるため、エタノールアミン０．２ｍＬを添加する。次に反応混合物を９０ｍＬの水で希釈し、ＲＰ−Ｃ１８カラムで精製する。目的の画分をプールし凍結乾燥すると、Ｔｒｔ−ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−ＰｈｅＢ１、Ｂｏｃ−ＧｌｙＡ１およびＢｏｃ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロ（６）が得られる。０．２ｍＬのチオアニソールと０．４ｍＬのトリイソプロピルシランを含むＴＦＡ５ｍＬに、１／１０ｍｍｏｌの（６）を溶解する。３０分後、ＴＦＡを蒸発によって除去し、残留性のペプチドを１０％ＡＣＮの水溶液５０ｍＬに移す。その結果得られる溶液をＲＰ−Ｃ１８カラムで精製する。目的の画分をプールし凍結乾燥すると、（７）が得られる。

（実施例１：チオール誘導化インスリンリスプロ中間体のペグ化）
平均分子量約２０ｋＤａ（ｂ）、３０ｋＤａ（ａ）、４０ｋＤａ（ａ）または６０ｋＤａ（ｃ）を有するモノメトキシＰＥＧ−ＭＡＬを１００ｍＭのＮＨ_４Ａｃ緩衝液（ｐＨ４．６９）とＡＣＮの１対１混合液に溶解する。チオール誘導化インスリンリスプロ（例えば、化合物（３）、（４）または（７））の凍結乾燥粉末を上記溶液に添加する。反応は分析用ＲＰ−ＨＰＬＣを使ってモニターしてもよい。反応が完結（通常約４時間後）したら、混合物は水で希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを使って精製する。目的の画分をプールし凍結乾燥すると、ペグ化インスリンリスプロ化合物が得られる。実施例１に記載の方法で調製した典型的なペグ化インスリンリスプロ化合物は、８（ａ）、８（ｂ）、９（ａ）、９（ｂ）、１０（ａ）、１０（ｂ）および１５（ｃ）として以下に示してある。これらのペグ化インスリンリスプロ化合物は、約４００から約１０００の範囲のｎを有しているのが好ましい。更に好ましいのは、これらのペグ化インスリンリスプロ化合物が、約４００から約７５０の範囲のｎを有している場合である。更に好ましいのは、これらのペグ化インスリンリスプロ化合物が、約４００から約５５０の範囲のｎを有している場合である。更に好ましいのは、これらのペグ化インスリンリスプロ化合物が、約４００から約５００の範囲のｎを有している場合である。更に好ましいのは、これらのペグ化インスリンリスプロ化合物が、約４５０から約５００の範囲のｎを有している場合である。最も好ましいのは、これらのペグ化インスリンリスプロ化合物が約４５０のｎを有している場合である。

（実施例２：モノメトキシポリエチレングリコールｐ−ニトロフェニルカルボネート（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ）を用いたインスリンリスプロのペグ化）
１／１０ｍｍｏｌのインスリンリスプロを２０ｍＬの０．２Ｍホウ酸塩緩衝液にｐＨ１０．５で溶解し、ＡＣＮ２０ｍＬ中の平均分子量約２０ｋＤａを有するｍＰＥＧ−ＮＰＣ１．９８ｇを激しく攪拌しながら上記溶液に添加する。反応はＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣでモニターする。約４時間後、反応混合物を酢酸を使ってｐＨ５−７に酸性化し、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを使って精製する。目的の画分をプールし凍結乾燥すると、モノペグ化ＰＥＧ２０Ｋインスリンリスプロが２０％から４５％の範囲の収率で得られる。ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳで同定し、純度を確認する。Ａ鎖またはＢ鎖に結合するｍＰＥＧの割合は、得られたコンジュゲートをトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で処理した後に放出される遊離のＡ鎖およびＢ鎖の領域積分によって決定する。ｍＰＥＧ−ＮＰＣ対インスリンリスプロの比率は、モノペグ化種とジペグ化種の生成物分布を決定する。反応ｐＨはペグ化の部位特異性を支配する。ｐＨが約８から約１２に上がると、化合物（１１）が主要生成物になる。ｐＨ１０．５で、約２０ｋＤａの平均分子量（ｎは約４５０）を有するｍＰＥＧ−ＮＰＣを用いて反応を行うと、（１１）対（１２）の比率は約８５対１５になる。

上記のペグ化反応は、０．２ＭのＮａＯＨを連続添加して反応混合物のｐＨを維持することにより、非緩衝水溶液中で行うこともできる。ｐＨを約１１．５に維持しながら、約２０ｋＤａの平均分子量を有するｍＰＥＧ−ＮＰＣを用いて、非緩衝水溶液中で反応を行わせると、ペグ化反応生成物は、（１１）と（１２）を約９２対８の割合で含む。化合物（１１）は、約４００から約１０００の範囲のｎを有するのが好ましい。更に好ましいのは、化合物（１１）が約４００から約７５０の範囲のｎを有する場合である。更に好ましいのは、化合物（１１）が約４００から約５５０の範囲のｎを有する場合である。更に好ましいのは、化合物（１１）が約４００から約５００の範囲のｎを有する場合である。更に好ましいのは、化合物（１１）が約４５０から約５００の範囲のｎを有する場合である。最も好ましいのは、化合物（１１）が約４５０のｎを有する場合である。

（実施例３：インビトロ受容体親和性）
受容体結合アッセイは、ヒトインスリン受容体（ｈＩＲ）またはヒトＩＧＦ−１受容体（ｈＩＧＦ−１Ｒ）を過剰発現している、安定的に形質移入された２９３ＥＢＮＡ ＨＥＫ細胞から調製したＰ１膜上で行われる。結合親和性は、ヒト組み換え（３−［^１２５Ｉ］ヨードチロシルＡ^１４）インスリン（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）またはヒト組み換え［^１２５Ｉ］インスリン様成長因子（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）のいずれかを用いて、競合放射性リガンド結合アッセイで決定する。アッセイは、ＰＶＴ ＰＥＩ処置タイプＡ麦芽アグルチニン結合ＳＰＡビーズを用いてＳＰＡ法で行った。全ての試薬調製にＳＰＡアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ）を用いた。化合物の３倍段階希釈（１００ｎＭから２ｐＭ）はＦｒｅｅｄｏｍ／Ｅｖｏロボット（Ｔｅｃａｎ）を用いてアッセイ緩衝液で調製し、マルチメク（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて９６ウェル白色透明ボトムマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ）に添加した。放射性リガンド、膜およびＳＰＡビーズをマルチドロップ装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）を使って添加する。室温で１０時間インキュベーションした後、マイクロベータ・トリラックス・シンチレーション・カウンターを用いて放射線を測定する。非標識インスリンリスプロと非標識ＩＧＦ−Ｉをそれぞれ陽性対照および陰性対照として各実験に含める。ＩＣ_５０値は４パラメーター非線形ロジスティック回帰分析により決定する。親和定数（Ｋｉ）は、Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｄ／Ｋｄ）の式に基づいてＩＣ５０値から計算する。式中、Ｄは実験に使用される放射性リガンドの濃度に等しく、Ｋｄは飽和結合解析で決定される放射性リガンドの平衡結合親和定数に等しい（ｈＩＲとｈＩＧＦ−１ＲのＫｄはそれぞれ０．１２４ｎＭおよび０．１３０ｎＭである）。以下に報告する幾何平均Ｋｉは１０＾（平均対数Ｋｉ）であり、式中、平均対数Ｋｉ＝平均（Ｋｉ１＋Ｋｉ２＋Ｋｉ３．．．Ｋｉｎ）であり、独立実験の数（ｎ）は３以上である。しかし、ヒトＩＧＦ−１に関して以下に記載する場合、ｎは２である。

実施例１に記載する方法で調製した以下のペグ化インスリンリスプロ化合物は、上述のｈＩＲ結合アッセイにおいて３０ｎＭ未満の幾何平均Ｋｉを有している。そのペグ化インスリンリスプロ化合物とは、平均分子量約４０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物１０（ａ）、平均分子量約４０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物８（ａ）、平均分子量約６０ｋＤａを有する分岐ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物１５（ｃ）、平均分子量約３０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）、平均分子量約４０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）、および平均分子量２０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ｂ）である。ｈＩＲおよびｈＩＧＦＲ結合アッセイでは、平均分子量約４０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）の幾何平均Ｋｉは、それぞれ３．０７ｎＭ＋／−０．３２ｎＭ（＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ、ｎ＝６）および８４．３ｎＭ超（ＳＥＭ＝未決定、ｎ＝６）である。更に、４０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは２０ｋＤａの線形ｍＰＥＧ−ＮＰＣを用いて実施例２に記載の方法で調製した異種ペグ化インスリンリスプロ生成物も、上述のｈＩＲ結合アッセイにおいて３０未満の幾何平均Ｋｉを有している。上述のｈＩＲ結合アッセイでは、インスリンリスプロの幾何平均Ｋｉは０．２２＋／−０．０７２ｎＭ（＋／−ＳＥＭ、ｎ＝４）である。上述のｈＩＧＦＲ結合アッセイにおいては、上記の全化合物が７５ｎＭを超える幾何平均Ｋｉを有しており、ヒトＩＧＦ−１の幾何平均Ｋｉは１．５１＋／−０．２３ｎＭ（＋／−ＳＥＭ、ｎ＝２）である。

ペグ化位置Ｂ２８はｈＩＲ親和性を約１０倍減少させ、これらインスリンリスプロのペグ化種をｈＩＲの弱いアゴニストにしていることを、このデータは示している。更に、これらペグ化インスリンリスプロ種は、上述の条件下のアッセイにおいて、測定可能なＩＧＦＲ−１結合特性を全く有していない。

（実施例４：インスリン受容体リン酸化全細胞アッセイを用いたペグ化インスリンリスプロの効力評価）
本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物は、商業的に入手可能な異種時間分解蛍光測定アッセイであるＤＥＬＦＩＡ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、機能活性を評価してもよい。簡単に言えば、ヒトインスリン受容体を過剰表現している２９３ＨＥＫ細胞をトリプシン処理し、無血清培地（ＳＦＭ）（脂肪酸のない０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ）を用いて、ポリＤリジンコートＣｏｓｔａｒ９６ウェルハーフエリア組織培養プレートの６０，０００細胞／ウェルで平板培養する。その細胞培養プレートをＣＯ_２インキュベーター中３７℃で一晩インキュベーションする。抗インスリン受容体Ａ鎖ｍＡｂ８３１４キャプチャープレートも、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル黒色ハーフエリアマイクロタイタープレートを使って前の晩に調製し、３０μＬの抗インスリン受容体Ａ鎖ｍＡｂ８３１４（Ｓｏｏｓ，Ｍ．Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２３５：１９９−２０８（１９８６）、マサチューセッツ州ケンブリッジのアブカム社などから商業的に入手可能）を用いて４℃で一晩処理し、１０ｍＭ炭酸ナトリウムで１μｇ／ｍＬに希釈する。結合していないｍＡｂ８３１４を除去するため、ｍＡｂ８３１４キャプチャープレートを５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％ツイーン（ＴＢＳＴ）で４度洗浄する。次にＴＢＳＴ中の１％ＢＳＡを用いて４℃で１時間を超える間、ｍＡｂ８３１４キャプチャープレートをブロックする。ブロッキング後、キャプチャープレートをＴＢＳＴで２度洗浄して過剰のＢＳＡ溶液を除去する。キャプチャープレートをブロッキング緩衝液に浸漬したら、細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、温度を室温と同じにする。試験化合物をＳＦＭで連続的に希釈する。インスリン受容体の自己リン酸化を刺激するため、希釈したテスト試薬５０μＬを細胞単層に加える。室温で３０分反応させた後、試験化合物を吸引除去し、５０μＬの２ｘ溶解緩衝液（２％ＮＰ４０、１００ｍＭトリス、ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、ＥＤＴＡを含むＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼインヒビターおよび４ｍＭバナジン酸塩）を添加することにより、反応を停止させる。溶解緩衝液中、室温で３０分反応させた後、３０μＬの溶解物を３０μＬのユウロピウムＮ１抗ホスホチロシンＰＹ２０抗体であるＥｕ−Ｎ１−Ｐｙ２０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を含むブロックされたキャプチャープレートに移し、１０ｍＭのヘペス緩衝液、１４０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％ツイーンで５０ｎｇ／ｍＬに希釈する。この混合液を室温で１時間インキュベーションし、その後ＴＢＳＴで６度洗浄して、結合しなかったＥｕ−Ｎ１−Ｐｙ２０および細胞分解物を除去する。その後１０分間、発生するシグナルに合わせて間歇的に振盪しながら、５０μＬのＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でインキュベーションする。リン酸化したインスリン受容体は、時間分解蛍光測定ユウロピウム設定でＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒを用いて定量化する。リン酸化レベルはインスリン（１００ｎＭ）の最大刺激用量に対する応答％として計算される。インスリン類似体の効力は、用量応答の４パラメーター適合を用いて、ＥＣ５０用量として計算される。実施例４に記載されるアッセイにおいて、実施例１に記載される方法で調製した、１５ｎＭ未満のＥＣ５０を有するペグ化インスリンリスプロ化合物には、平均分子量約４０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物１０（ａ）、平均分子量約４０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）、平均分子量約３０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）および平均分子量約２０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ｂ）が含まれる。実施例４に記載されるアッセイでは、線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）のＥＣ５０は１０．８８ｎＭである。約４０ｋＤａ、約３０ｋＤａまたは約２０ｋＤａの平均分子量を有する線形ｍＰＥＧ−ＮＰＣを用いて実施例２に記載の方法で調製した異種ペグ化インスリンリスプロ生成物も、実施例４に記載のアッセイにおいて１５ｎＭ未満のＥＣ５０を有している。約４０ｋＤａの平均分子量を有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを使って調製した化合物８（ａ）と約４０ｋＤａの平均分子量を有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを使って調製した化合物９（ａ）の５０対５０および７０対３０の混合物も、実施例４に記載のアッセイにおいて１５ｎＭ未満のＥＣ５０を有している。同じアッセイにおいて、ヒトインスリンとインスリンリスプロのＥＣ５０はそれぞれ２．３ｎＭおよび０．７ｎＭである。

ペグ化位置Ｂ２８はｈＩＲインビトロ活性を約１０倍から２０倍減少させ、これらインスリンリスプロのペグ化種をｈＩＲの弱いアゴニストにしていることを、このデータは示している。更に、これらペグ化インスリンリスプロ種は、測定可能なＩＧＦＲ−１結合特性を全く有していない。

（実施例５：１型糖尿病ラットモデルを用いた、ペグ化インスリンリスプロのインビボ効力および薬物動態学的プロフィルの評価）
試験開始３日前に、１０週目のＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）（体重２５０−２８０ｇ）の尾静脈に０．５Ｍクエン酸（ｐＨ４．５）中のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）４５ｍｇ／ｋｇを静脈内投与する。試験開始時に、ラットを体重および血糖に基づいて群分けする。この研究には、血糖が４００ｍｇ／ｄＬと５５０ｍｇ／ｄＬの間のラットだけを含める。試験開始日の朝、試験化合物をいくつかの所定用量の１つでラットに単回皮下注射する。尾静脈から定期的に血液の重複抜き取りを行い、ＥＤＴＡ二ナトリウムを含むチューブに集める。血糖値をグルコメーターで測定する。静脈血試料から血漿も集め、商業用のラットインスリン・ラジオイムノアッセイを用いて、投与された薬物の血漿濃度を測定する。経時的血糖（ｍｇ＊ｈ／ｄＬ）曲線の下の面積を各ラットについて計算し、それを４パラメーターロジスティック回帰分析に使用してＥＤ５０を決定する。このアッセイでは、平均分子量約４０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）、平均分子量約３０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）および平均分子量約２０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ｂ）の効力（ＥＤ５０）は、典型的な用量応答曲線に基づいて、それぞれ２４１ｎｍｏｌ／ｋｇ、１３８ｎｍｏｌ／ｋｇおよび６９ｎｍｏｌ／ｋｇである。更に、当該化合物は、５６８ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下注射によって、ＳＴＺ処置ラットの血糖値を少なくとも３６時間、この種のラットにとっては正常なレベル（１００ｍｇ／ｄＬ以下）にまで低下させることができた。一方、インスリンデテミルは、上記のエッセイにおいて、５６８ｎｍｏｌ／ｋｇ単回投与によって血糖値を５−６時間正常化する。

薬価パラメーターの評価に加えて、ラットにおける試験化合物の平均薬物動態パラメーター値も重複血液試料を用いて測定する。薬物動態パラメーターは、モデル非依存性の方法（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏ）を用いて計算する。得られる薬物動態パラメーター値は、用量の関数として非線形を示す。報告される値の範囲は、テストされる最高用量（５６８ｎｍｏｌ／ｋｇ）と最低用量（５．６ｎｍｏｌ／ｋｇ）の間の薬物動態パラメーター値に対応する。

平均分子量約２０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ｂ）の薬物動態的結果は、最高濃度に至るまでの時間（Ｔ_最大）が６時間から１２時間の範囲、見かけのクリアレンス速度（ＣＬ／Ｆ）が０．０５Ｌ／ｈ／ｋｇから０．１４Ｌ／ｈ／ｋｇの範囲、見かけの分配量（Ｖ／Ｆ）が０．６Ｌ／ｋｇから７．２Ｌ／ｋｇの範囲、除去半減期（ｔ_１／２）が８．５時間から３４．５時間を示した。

平均分子量約３０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）の薬物動態的結果は、Ｔ_最大が１２時間、ＣＬ／Ｆが０．０５Ｌ／ｈ／ｋｇから０．１３Ｌ／ｈ／ｋｇの範囲、Ｖ／Ｆが０．６Ｌ／ｋｇから２．０Ｌ／ｋｇの範囲、ｔ_１／２が８．３時間から１１．０時間を示した。

平均分子量約４０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）の薬物動態的結果は、Ｔ_最大が１２時間から２４時間の範囲、ＣＬ／Ｆが０．０６Ｌ／ｈ／ｋｇから０．２Ｌ／ｈ／ｋｇの範囲、Ｖ／Ｆが１．０Ｌ／ｋｇから７．５Ｌ／ｋｇの範囲、ｔ_１／２が１１．１時間から４８．５時間を示した。

５６８ｎｍｏｌ／ｋｇのインスリンリスプロをＳＴＺ処置雄ラットに同様にして投与すると、測定値は、ｔ_１／２が約１時間、ＣＬ／Ｆが約１．２Ｌ／ｈ／ｋｇである。

１８．９ｎｍｏｌ／ｋｇから５６８ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲のインスリンデテミルをＳＴＺ処置雄ラットに同様にして投与すると、ｔ_１／２が１．９時間から３．１時間の範囲、ＣＬ／Ｆが約０．８Ｌ／ｈ／ｋｇから１．７Ｌ／ｈ／ｋｇの範囲が観察される。

デテミルと例示のペグ化インスリンリスプロ化合物の間の見かけのＣＬ比は、薬物動態学的な複雑性の故に、測定に使用される用量によって結果が異なる。しかし、２０ｋＤａまたは４０ｋＤａのＰＥＧと結合した例示のペグ化インスリンリスプロ化合物は、ＳＴＺ誘発糖尿病ラットにおいて、見かけのクリアランスがデテミルよりも約５倍から３０倍緩慢であることを、実施例５に記載の試験が示している。

（実施例６：２型糖尿病ラットモデルを用いた、ペグ化インスリンリスプロのインビボ作用期間および薬物動態学的特性の評価）
４０ｋＤａ線形ＰＥＧを有する化合物９（ａ）のグルコダイナミック（Ｇｌｕｃｏｄｙｎａｍｉｃ）活性は、ビヒクル対照（ＰＢＳ）または平均分子量約４０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）５１７ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与後、雄のＺＤＦ（ｆａ／ｆａ）ラット（ｎ＝４ラット／群）で評価する。薬物動態特性および薬価特性を評価するため、試料を連続して集める。平均分子量約４０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）５１７ｎｍｏｌ／ｋｇを雄のＺＤＦ（ｆａ／ｆａ）ラットに単回皮下投与することにより、血糖値が統計学的に有意なレベルまで低下し、それが少なくとも７日間持続した（偽薬に対してｐ＜０．０５）。平均分子量約４０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＭＡＬを用いて調製した化合物９（ａ）への曝露も７日間検証可能である。

（実施例７：コバルトイオンの存在下でフェノールを含むＰＥＧ−Ｂ２８_{（９２．４％）}Ａ１_{（７．６％）}インスリンリスプロ、インスリンリスプロまたはその混合物（７０％ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}Ａ１_{（７．６％）}インスリンリスプロ対３０％インスリンリスプロ）のフェノール系防腐剤滴定）
ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}Ａ１_{（７．６％）}インスリンリスプロまたはインスリンリスプロを、２０ｍＭのＫＳＣＮおよび５０ｍＭのトリスＣｌＯ_４を含む溶液にｐＨ８．０で溶解する。上記蛋白質の標的濃度は、蛋白質含有量（ε_２８０＝１．０５（ｍｇ／ｍＬ）^−１ｃｍ^−１）に基づいて約４ｍｇ／ｍＬである。塩化コバルト（４１．９ｍｇ）を水１ｍＬで溶解し、コバルトイオン濃度０．１７６Ｍの原液を得る。コバルトイオン対インスリン６量体の最終モル比が４になるように、コバルト原液のアリコート（蛋白質の濃度によって異なるが、約２μＬ）を０．８ｍＬの蛋白質溶液に添加する。６量体化を評価するため、コバルト配位化学における歪みをフェノール系防腐剤濃度の関数として５７４ｎｍでモニターした。具体的には、滴定終了時点での最終容量が０．８４ｍＬを超えないように、濃縮フェノール溶液（０．５６４Ｍ）をマイクロリットルアリコート用いて、蛋白質溶液０．８ｍＬを滴定する。フェノールの各アリコートと４００ｎｍから８００ｎｍまでの可視スペクトルの溶液を集めた後、最終溶液を最低２０分間攪拌する。５７４ｎｍで記録した吸光度は、ＨＩＳ^Ｂ１０配位結合コバルトモル濃度、すなわちインスリン６量体のＨＩＳ^Ｂ１０部分は二価の金属イオン２つと配位結合するという知識に基づいて６量体蛋白質濃度掛ける２でその吸光度を割ることによって、モル吸光係数に変換する。ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}Ａ１_{（７．６％）}インスリンリスプロとインスリンリスプロの７０／３０（モル対モル）混合製剤を調製するには、蛋白質をまず混合し、次にコバルトを添加し、それからフェノール系防腐剤で滴定する。

インスリンリスプロでは、天然の配列であるＢ２８の位置のプロリンとＢ２９の位置のリジンが、野生型のヒトインスリンと比較して逆転している。この逆転によりＢ鎖のＣ末端で立体配座的な移動が生じ、その結果、２量体を形成するリスプロインスリン単量体の能力が立体的に妨害される。従って、２量体会合定数が野生型ヒトインスリンの２量体会合定数と比べて３００倍減少する。驚いたことにかつ予想外にも、表１に示されるように、野生型のヒトインスリンと比べて既に脆弱化しているインスリンリスプロの２量体化ドメインの近くで６つの２０ｋＤａＰＥＧ部分が結合しているにもかかわらず、ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}Ａ１_{（７．６％）}インスリンリスプロは、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）で使用される調剤条件と類似の条件で、二価の金属イオンおよびフェノール系防腐剤の存在下、６量体の複合体として会合することを結果が示している。更に、ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}Ａ１_{（７．６％）}インスリンリスプロとインスリンリスプロの７０／３０混合物も６量体の複合体を形成する能力が証明されており、基礎インスリンおよび迅速に作用するインスリンの予備混合製剤を即座に、および／または安定して調製できることをこの事実は支持している。

（表Ｉ）

（実施例８：亜鉛、フェノールおよび／またはカルシウムと共に製剤されたＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}／Ａ１_{（７．６％）}インスリンリスプロの６量体状態の分析）
インスリンおよび特定のインスリン類似体の化学的貯蔵安定性および使用時安定性は、溶液中で個別の６量体複合体を形成する能力によって促進される。二価の金属イオン（Ｚｎ^＋２またはＣｏ^＋２）およびフェノール系防腐剤（フェノールまたはｍ−クレゾール）の存在下でインスリンまたはインスリンリスプロを６量体化する能力は、ＡｓｎＡ２１の脱アミド化を遅らせ、その結果、高分子量の粒子（ＨＭＷＰ）の形成を最小限に抑える。

ＰＥＧ２０ｋＤａ−ＬｙｓＢ２８インスリンリスプロが６量体を形成する能力を評価するため、Ａ_{２７６ｎｍ}＝８．６ｍｇインスリンリスプロ／ｍＬまたは３８．２ｍｇペグ化インスリンリスプロコンジュゲート／ｍＬに基づく最初の蛋白質濃度を有する、ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}／Ａ１_{（７．６％）}インスリンリスプロをｐＨ６．７で一晩、水中で透析する。次に、透析した蛋白質を水で希釈して、蛋白質濃度を４．６ｍｇ／ｍＬまたは２０．６ｍｇのペグ化蛋白質コンジュゲート／ｍＬに調整する。４ｘ緩衝液原液をｐＨ７．０で調製する。リン酸塩緩衝液の最終濃度は４０ｍＭ、ｍ−クレゾールの最終濃度は１２．８ｍｇ／ｍＬとする。酸化亜鉛原液は酸化亜鉛を１ＮのＨＣｌ０．５ｍＬに溶解し、次に水で希釈することにより調製し、最終亜鉛濃度を０．０９７Ｍとする。蛋白質濃度４．６ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}／Ａ１_{（７．６％）}インスリン４５０μＬを亜鉛原液のアリコート（添加される亜鉛原液の最大全容量＝２．５μＬ、またはＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}／Ａ１_{（７．６％）}インスリン６量体当たり４亜鉛イオンに相当する量）および４ｘリン酸塩緩衝液原液１５０μＬと混合することにより、種々の亜鉛濃度（０μＭから４００μＭ）を有する、近ＵＶ円偏光二色性（ＣＤ）分析用の溶液試料を調製する。最終ｐＨは、必要に応じてｐＨ約７．０に調整する。ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９６％）}／Ａ１_（４％）インスリンリスプロまたはインスリンリスプロの６量体会合を、０．２ｃｍセルを用いて、近ＵＶ円偏光二色性により、ジスルフィド変化に感応性の高い２５０ｎｍでモニターする。平均残基楕円率をモル６量体当たりのモル亜鉛の比率に対してプロットする。

驚いたことにかつ予想外にも、表ＩＩに示されるように、野生型のヒトインスリンと比べて既に脆弱化しているインスリンリスプロの２量体化ドメインの近くで６つの２０ｋＤａＰＥＧ部分が結合しているにもかかわらず、ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}／Ａ１_{（７．６％）}インスリンは、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）の調剤条件と類似の条件で、二価の金属イオンおよびフェノール系防腐剤の存在下、６量体の複合体として会合することを結果が更に示している。

６量体促進テスト製剤において、６量体化およびリガンド結合がＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}／Ａ１_{（７．６％）}インスリンの熱安定性に及ぼす影響についても、ＣＤ熱変性実験で調べた。全体的な信号変化はＺｎ^２＋結合試験で使用した２５０ｎｍよりも２４０ｎｍの方が大きかったが、全溶液吸光度が高品質のＣＤデータが得られるほど十分低かったので、熱変性試験で用いた波長は２４０ｎｍであった。１ｍｍのキュベット中、２４０ｎｍにおける熱スキャンデータを５℃から約９５℃の間で集めた（最終温度は試料間でわずかな違いがあった）。スキャン速度およびデータピッチは１℃／分、周波数帯域幅は１．５ｎｍ、応答時間は８秒であった。熱変性データは、生信号（２４０ｎｍにおける１０００分の１度単位）およびＦ_ｕｎｆ（Ｔ）＝［Ｙ_ｏｂｓ（Ｔ）−Ｙ_ｎａｔ（Ｔ）］／［Ｙ_ｕｎｆ（Ｔ）−Ｙ_ｎａｔ（Ｔ）］の式で与えられる見かけの変性割合（Ｆｕｎｆ）の両方としてプロットしてよい。式中、Ｙ_ｏｂｓ（Ｔ）は温度の関数として観察される信号であり、Ｙ_ｎａｔ（Ｔ）およびＹ_ｕｎｆ（Ｔ）は、それぞれ未変性ベースラインおよび変性ベースラインの直線的外挿値である。変性開始温度は、Ｆ_ｕｎｆが未変性ベースライン（Ｆ_ｕｎｆ＝０）から増加し始める温度として定義され、中間温度はＦ_ｕｎｆ＝０．５の温度である。

本質的に上述の方法で行われるＣＤ熱変性実験が示すところによれば、ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}／Ａ１_{（７．６％）}インスリン６量体とインスリンリスプロ６量体を１６ｍＭトリス、ｐＨ７．２、３．１ｍｇ／ｍＬのｍ−クレゾールおよび亜鉛で同様に製剤した場合、前者の熱安定性は後者の熱安定性よりも実質的に減少した。更に、上述のＣＤ熱変性試験は、ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（９２．４％）}／Ａ１_{（７．６％）}インスリンリスプロの融点がカルシウムと塩化物イオンの濃度に依存して有意に上昇することも見出した（データ省略）。具体的には、変性開始温度は１６ｍＭトリス、ｐＨ７．２、３．１ｍｇ／ｍＬのｍ−クレゾールおよび亜鉛中では約３０℃であるが、７５ｍＭ塩化カルシウムを含む同じ製剤中では劇的に約５０℃まで上昇する。製剤に塩化カルシウムの代わりにＮａＣｌ（２５ｍＭから１５０ｍＭのＮａＣｌ）を加えた場合も同様の効果が観察された。従って、ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８インスリンリスプロ化合物を含む医薬組成物において、カルシウムおよび／または塩化物は非常に有効な６量体促進賦形剤であり、貯蔵中に当該医薬組成物の化学的および／または物理的安定性を増大する効果があろう。

（表ＩＩ：亜鉛／６量体比の関数としての平均残基楕円率（ＭＲＥ）変動）

（実施例９：ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％）}／Ａ１_{（約５％）}インスリンリスプロの生成）
１５０ｍＭの第二リン酸ナトリウムおよび５０ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液を約４℃から約６℃で１５０ｍＭの第三リン酸ナトリウムと混合し、１０．８５と１１．１０の間のｐＨを持つ緩衝液を得る。インスリンリスプロ結晶（３０−６０ｍｇ／ｍＬ）を約４℃から約６℃で緩衝液に徐々に添加し、結晶溶解中に凝集物の形成が生じるのを避けるため穏和に攪拌する。

重量平均分子量約２０ｋＤａ＋／−約２ｋＤａのＰＥＧを有するモノメトキシポリエチレングリコールｐ−ニトロフェニルカーボネート（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ）を６０ｍｇ／ｍＬから１２０ｍｇ／ｍＬの濃度で、冷水（４−６℃）に溶解する。その場合、必要量の冷水を容器に入れ、攪拌して渦流を作り、適切かつ急速な分散が起きるように、ｍＰＥＧ−ＮＰＣを渦流の眼に徐々に注ぐ。ｍＰＥＧ−ＮＰＣ粉末は細かい粉末であり、分散させるとかなりの量の気泡が容器中に放出される。容器中のｍＰＥＧ−ＮＰＣ溶液は、容量に応じて３０分間から６０分間脱泡する。

上記の方法で調製したインスリンリスプロ溶液は機械的攪拌用の冷却塔付き容器に移す。その容器には温度とｐＨ測定用の装置が備わっている。攪拌は、レイノルズ数に基づいて乱流部分で操作される標準回転翼を用いて行う。ｍＰＥＧ−ＮＰＣ（ＰＥＧ）溶液は、全ＰＥＧ添加時間が３時間から５時間になる速度で、容器中で測定する。冷却塔の温度は４℃から６℃に維持し、混合は継続して行う。反応液のｐＨは、必要量の１５０ｍＭ第三リン酸ナトリウムを添加することにより、１０．８５から１１．１０の間に維持する。ＰＥＧ対インスリンリスプロの最終モル比が２．５から４．５の範囲になるまで、ＰＥＧを添加する。

ＰＥＧ添加の終了時点で、冷却塔の温度を６０分以内に２５℃から３０℃に上昇させ、ｐＨを約１０．７から約１１．０に維持しながら、反応混合物をその温度で約３時間から約６時間インキュベーションする。インキュベーション期間の終了時点で、２ｘ緩衝液（１００ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）を添加することにより反応混合物をクエンチし、同じ２Ｘ緩衝液で希釈することにより伝導率（２．５ｍＳ／ｃｍ）および濃度（３−５ｍｇ／ｍＬ）を調節する。

反応混合物は、適切な樹脂（高速流通ＳＰセファロース樹脂など）を充填した陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ）カラムを使って精製する。樹脂は層高約１５ｃｍから約３０ｃｍになるまでカラムに充填し、１００ｍＭの酢酸ナトリウム（緩衝液Ａ）で平衡化し、希釈した反応混合物（生成物５−８ｇ／樹脂Ｌ）を低いｐＨ（約２．５から約４．０）かつ適切な流速（約５０ｃｍ／時間から約９０ｃｍ／時間）で充填する。モノペグ化生成物および未反応の蛋白質が樹脂上で選択的に結合するが、マルチペグ化した副生成物および過剰の試薬のほとんどはカラムを通過する。希釈した塩濃度（２０−３０ｍＭ）の緩衝液Ａを用いて弱く吸着したマルチペグ化副生成物を洗い流し、次に塩濃度の高い（５０−７０ｍＭ）緩衝液（８−１２ＣＶ）を使った勾配溶出によってペグ化生成物を樹脂から優先的に除去すると同時に、未反応の蛋白質はカラムに残ったままになる。生成物を集め（３−５ＣＶ）、カラムは塩濃度の高い（１００ｍＭ）緩衝液Ａで洗浄して未反応の蛋白質を除去する。

３−５ｍｇ／ｍＬのＣＥＸカラム主流（３−５ＣＶ）は、接線流濾過により、標準のフラットシート膜（３−５ｋＤａ分子量カットオフ）を用いて４０−８０ｍｇ／ｍＬまで濃縮する。この工程は、初期濃度を経て、緩衝液を交換し、目的の最終濃度まで行われる。操作フラックスは、工程中ずっと１０−２０Ｌ／ｍ^２（フィルター面積）／時間（ＬＭＨ）に維持し、膜間差圧（ＴＭＰ）は約１５ｐｓｉから約３５ｐｓｉに維持する。

最終濃度のバルク活性医薬成分溶液は、適切な温度（−２０℃から−７０℃）で凍結させ、適切な温度（−２０℃から−７０℃）で保存する。

（実施例１０：イヌにおけるペグ化インスリンリスプロの薬物動態学的プロフィル）
２歳から４歳の雌のビーグル犬（体重７−１０ｋｇ）に、例示の試験化合物１８．９ｎｍｏｌ／ｋｇを皮下投与する。血液試料を定期的に腕頭静脈または伏在静脈から得て、それをＥＤＴＡ二ナトリウムを含むチューブに集める。血漿を静脈血サンプリングで集め、商業用のインスリンラジオイムノアッセイを用いて血漿中の投与薬の濃度を測定する。本質的に実施例２に記載した方法で調製した例示化合物である、平均分子量約４０ｋＤａ、約３０ｋＤａおよび約２０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＮＰＣを用いて調製した化合物１１の各々について、薬物動態学的プロフィルおよびパラメーターを決定した。

薬物動態学的パラメーターは、モデル非依存性の方法（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏ）を用いて計算した。平均分子量約２０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＮＰＣを用いて調製した化合物１１は、最高濃度に至るまでの時間（Ｔ_最大）が約１２時間、見かけのクリアレンス速度（ＣＬ／Ｆ）が約０．０４６Ｌ／ｈ／ｋｇ、最大濃度（Ｃ_最大）が約１４ｎＭ、除去半減期（ｔ_１／２）が約１４時間を示した。

平均分子量約３０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＮＰＣを用いて調製した化合物１１は、Ｔ_最大が約２４時間、ＣＬ／Ｆが約０．０２７Ｌ／ｈ／ｋｇ、Ｃ_最大が約１８ｎＭ、ｔ_１／２が約２３時間を示した。

平均分子量約４０ｋＤａを有する線形ｍＰＥＧ−ＮＰＣを用いて調製した化合物１１は、Ｔ_最大が約２４時間、ＣＬ／Ｆが約０．０２６Ｌ／ｈ／ｋｇ、Ｃ_最大が約１５ｎＭ、ｔ_１／２が約２０時間を示した。

インスリンデテミルも同様に１８．９ｎｍｏｌ／ｋｇを雌のビーグル犬に投与し、Ｔ_最大が約１．３時間、ＣＬ／Ｆが約０．１２Ｌ／ｈ／ｋｇ、Ｃ_最大が約２３ｎＭ、ｔ_１／２が約３．５時間を示した。

表ＩＩＩはイヌにおける比較パラメーターを示す。この試験に使用したインスリン特異的なＲＩＡは、ペグ化インスリンリスプロと内生的インスリンの両方を検出する。

（表ＩＩＩ：イヌにおけるペグ化インスリンリスプロのＰＫパラメーター）

１８．９ｎｍｏｌ／ｋｇ皮下投与、ｎ＝３／群

（実施例１１：ヒトにおける平均「平坦化」および用量の推定）
改善された基礎インスリン療法の主要な基準は、患者への１日１回の投与に適した、真に平坦なプロフィルを達成する能力である。十分な平坦さはピーク／トラフ（ＰＴ）比が２未満の場合であると定義される。比較目的で述べると、公表されているＰＫプロフィルに基づいて計算したＰＴ比は、デテミルで約４から９、グラルギンで約１．２から２．６である。１８．９ｎｍｏｌ／ｋｇの例示化合物および同量のインスリンデテミルに関するラットとイヌのＰＫデータ（それぞれ実施例５および１０を参照）は１−ＣＭＴ ＰＫモデルに適合させ、ｋａ、ＣＬ／ＦおよびＶ／Ｆのパラメーターで表示した。次に各ＰＫパラメーターを相対成長式Ｐ＝ａＢＷ^ｂに適合させる。式中、ｂはｋａ、ＣＬ／ＦおよびＶ／Ｆに関して各々−０．２５、０．７５および１に固定し、ａは適合パラメーターである。ヒト平均推定値を各ＰＫパラメーターについて取得し、ヒトに１日量を投与後、シミュレーションは平均プロフィルを生成した。３０ｋＤａおよび４０ｋＤａペグ化インスリンリスプロコンジュゲートは類似しているので、シミュレーションは２０ｋＤａペグ化インスリンリスプロ、４０ｋＤａペグ化インスリンリスプロおよびインスリンデテミルだけを示してある。２０ｋＤａおよび４０ｋＤａペグ化インスリンリスプロ化合物のピーク／トラフ（ＰＴ）比は、インスリンデテミルのピーク／トラフ（ＰＴ）比よりも劇的に平坦であることを、生成されたシミュレーションが示している。図１はシミュレーションの結果を示す。

効能に要求されるペグ化インスリンリスプロのヒト用量を推定するストラテジーは、ラットモデルにおけるペグ化インスリンリスプロとインスリンデテミルとの間の相対効力が臨床における相対効力と類似しているという推定の下に、既知の臨床コンパレーター（インスリンデテミル）をラット効能モデルの内部対照として用いることである。臨床におけるペグ化インスリンリスプロの１日必要量は、以下の式を用いて計算できる。

表ＩＶは各ペグ化インスリンリスプロコンジュゲートの相対効力比を示してある。表Ｖは、ラット、イヌおよびヒト（推定）における例示ペグ化インスリンリスプロ対デテミルの見かけの相対クリアランス比を示してある。

（表ＩＶ：ラットにおけるペグ化インスリンリスプロコンジュゲートおよびインスリンデテミルの相対濃度ベース効力）

（表Ｖ：インスリンデテミル対ペグ化インスリンリスプロ化合物の相対ＣＬ／Ｆ比）

表ＩＶの相対効力推定および表Ｖの相対ＣＬ／Ｆ推定を用いると、ヒトにおけるペグ化インスリンリスプロコンジュゲートの平均用量推定値は、２０ｋＤａペグ化インスリンリスプロ化合物と４０ｋＤａペグ化インスリンリスプロ化合物に関して、それぞれ４．２ｎｍｏｌ／ｋｇおよび６．９ｎｍｏｌ／ｋｇである。かかる推定値は、２型糖尿病患者に関してデテミルのラベルに記載されている臨床平均１日量１８．５ｎｍｏｌ／ｋｇのインスリンデテミルに基づいている。時間作用および効力の両方を考慮した場合、臨床最大平均投与推定量はインスリンデテミルよりも約３倍低い。最善のケースでは、２０ｋＤａペグ化インスリンリスプロコンジュゲート、３０ｋＤａペグ化インスリンリスプロコンジュゲートおよび４０ｋＤａペグ化インスリンリスプロコンジュゲートの臨床平均投与推定量は、インスリンデテミルよりも約２０倍および約４５倍低い。

（実施例１２：ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％以上）}／Ａ１_{（約５％以下）}インスリンリスプロおよびグラルギンを健康なボランティアに単回投与した後のグルコース注入速度）
本質的に実施例９に記載の方法で調製したＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％以上）}／Ａ１_{（約５％以下）}インスリンリスプロ（ＬＹ）の単回用量を用いて、３部分からなる最初のヒト用量試験を行った。パートＡは３つの試験期間からなり、第１期間で被験者にはＬＹ用量が皮下（ＳＣ）注射され、第２期間でインスリングラルギン用量（０．５Ｕ／ｋｇ）が注射され、第３期間で別のＬＹ用量が注射された。パートＢは非盲検、単回用量、２回の反復期間試験で、被験者には２４時間および３６時間のグルコースクランプ法を用いて、両期間ともＬＹの単回用量が投与された。パートＣは非盲検、２期間、単回用量、一定のシーケンス、コンパレーター制御試験で、第１期間で被験者にはＬＹのＳＣ用量０．５ｍｇ／ｋｇが単回投与され、第２期間ではインスリングラルギンのＳＣ用量０．８Ｕ／ｋｇが単回投与された。被験者にはパートＡとパートＣの各期間で２４時間のグルコースクランプ法が施され、パートＢの各期間ではより長い期間（３６時間まで）グルコースクランプ法が施された。パートＡ、ＢおよびＣにおいて、ＬＹは以下のような単回用量が皮下投与された。
パートＡ用量：０．００２５、０．０１２５、０．０７５、０．３２５ｍｇ／体重ｋｇ
パートＢ用量：０．１５、０．２２５ｍｇ／ｋｇ
パートＣ用量：０．５ｍｇ／ｋｇ

被験者には、ペグ化インスリンリスプロ化合物の単回用量またはコンパレーターとしてインスリングラルギンの単回用量（０．５Ｕ／ｋｇ）、そして第３期間にＬＹの別の単回用量が投与される。全ての治療期間で、各インスリン化合物の注射後、被験者にはオイグリセミッククランプ法を最高２４／３６時間施す。インスリン作用のグルコダイナミック（ＧＤ）尺度を提供する立証済みの経時的ＧＩＲを参考にして、グルコース注入速度（ＧＩＲ）を正常血糖を維持するように調節する。オイグリセミックグルコースクランプ法の狙いは、インスリン化合物の用量を投与後、グルコース注入期間中ずっと、正常血糖が維持されることである。ここでは、内因性のインスリン分泌および肝グルコース産生が最少であり、グルコーススペースから輸送されるグルコース（すなわち代謝されたグルコース）は全て投与された外因性インスリンの直接の結果であることが想定されている。この場合のＧＩＲは、経時的なインスリン作用のＧＤ尺度となる。グルコースクランプ試験は全て、一晩（約８時間の）絶食後行われる。試験日の朝、容量ポンプの制御下で２０％デキストロース溶液（緩衝液でｐＨを中性近くに調整）を投与する目的で、小さいカテーテルを１本の腕（理想的には肘窩）の静脈に挿入する。静脈グルコース採取のため、別のカテーテルを理想的には手首または手に挿入する。動脈血化した静脈血を採取するため、その部分を加熱装置で約５５−６０℃に加熱する。血液試料をベッドサイドで採取し、自動グルコースオキシダーゼ法を用いて直ちに全血中グルコース濃度を測定する。基礎血液採取および約３０分間の安定期間の後、各被験者にインスリン化合物の用量が皮下投与される。インスリン化合物の皮下投与開始を時間ゼロと定義する。インスリン投与完了後、血糖を測定するために頻繁に血液を採取しながら、最高２４時間または３６時間正常血糖を維持するため、グルコースを種々の速度で静脈内に注入する。

血液採取は、投与前約３０分間約１０分ごとに行い、投与後最初の２時間、５−１０分ずつ継続（任意に、２．５分ずつの頻度で採取してもよい）し、その後クランプの最後まで１０−３０分間隔に頻度を下げる。

グルコースクランプ中、グルコース注入速度を調節して、個々の被験者の所定標的血糖濃度を維持する。標的濃度は空腹時血糖値に近い値が好ましい。グルコースクランプの狙いは、投与前標的値（空腹時平均血糖値よりも５ｍｇ／ｄＬ下回る値として定義される）の＋５％内に血糖濃度を維持することである。従って、ＧＩＲは変動しても、血糖濃度は一定に保たれる。だから、変動するグルコース注入速度は、試験インスリン化合物の活性を反映している。試料の血糖値および注入速度がクランプ中変動することは立証済みである。

本質的に実施例１２に記載の方法で行われた試験は、ＬＹが理想的な「基礎」インスリンであり、作用期間が長く、見かけの半減期が２４時間と４４時間の範囲にあり、基礎特性すなわちピーク／トロフ比が２未満（図２）であるという特徴を有することを、ヒトにおいて実証した。更に、ＬＹの作用期間はインスリングラルギンの作用期間よりも長い（図２）。グルコダイナミックスにおける被験者内変動は３０％未満（データ省略）であり、これはグラルギンと同等またはそれよりも優れている。最後に、試験のパートＣ（０．５ｍｇ／ｋｇ）からのグルコダイナミック（ＧＤ）データは、ＬＹのＧＩＲプロフィルを「ピークなし」と示し、３６時間を超える期間ＧＤを維持し、グラルギンのピークＧＩＲ応答（０．５Ｕ／ｋｇ、データ省略）を凌駕した。

（実施例１３：ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％）}／Ａ１_{（約５％）}インスリンリスプロ医薬組成物の化学的および物理的安定性）
実施例７および８で上述したように、ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％）}／Ａ１_{（約５％）}インスリンリスプロは、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）と類似の製剤条件において、二価の金属イオンおよびフェノール系防腐剤の存在下、６量体複合体として会合できる。従って、インスリンリスプロの商業用溶液製剤（すなわちＨｕｍａｌｏｇ（登録商標）溶液製剤）と類似のＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８インスリンリスプロ製剤に関して、化学的安定試験および物理的安定試験が行われた。試験対象の医薬製剤の化学的安定性は、指示された貯蔵期間中、様々な温度において、最初の時点と有意に異なる変化が種々の分析特性で検出されない場合、許容可能であると見なされる。試験対象の医薬製剤の物理的安定性は、視覚評価において粒子が全く観察されず、チオフラビンＴ蛍光顕微鏡検査法による検査でフィブリルやゲル形成が観察されない場合に、許容可能であると見なされる。

ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８インスリンリスプロ１モル当たり０．５モルの亜鉛、１６ｍｇ／ｍＬのグリセリンおよび３．１５ｍｇ／ｍＬのｍ−クレゾール（リン酸塩緩衝液またはクエン酸塩緩衝液でそれぞれｐＨ７．０またはｐＨ６．５に調整）を含むＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８インスリンリスプロ製剤を調製し、化学的安定性および物理的安定性の両方を試験した。安定性への亜鉛の影響を評価するため、亜鉛を含まない類似の製剤も試験した。３５℃の試料は約１ヶ月間貯蔵後ゲル粒子を形成し、２５℃の試料は約２ヶ月の貯蔵後有意な数の粒子および気泡を形成した。視覚的評価ではクエン酸塩緩衝液の試料の方がリン酸塩緩衝液の試料よりもひどいように見えたが、クエン酸塩緩衝液とリン酸塩緩衝液の両方並びに亜鉛を含む製剤と亜鉛を含まない製剤の両方が、３５℃の加速条件で類似の化学的／物理的安定性を示した。インスリンリスプロ対照製剤は透明であった。クエン酸塩緩衝液とリン酸塩緩衝液の両方が、５℃で少なくとも１３ヶ月間、許容可能な化学的安定性を示した。

その後の調査では、フェノール系防腐剤であるｍ−クレゾールは、高温（＞２５℃）に曝されたＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８インスリンリスプロと組み合わせた場合、ゲル化を促進することが示された。興味深いことに、ｍ−クレゾールをｍＰＥＧだけ（活性化しているか否かに関係なく）に添加した場合、高温に曝しても、ゲル粒子は生じなかった。

インスリンリスプロの基本的調剤方法では、高温でＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８インスリンリスプロ化合物に許容可能な安定性が与えられなかったので、ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％）}／Ａ１_{（約５％）}インスリンリスプロ化合物を含み、改善された化学的および物理的安定性を示し、非経口的に投与される医薬組成物として商業化に適した医薬組成物を開発した。

ＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％）}／Ａ１_{（約５％）}インスリンリスプロ（１５ｍｇ／ｍＬ）の以下の製剤は、４０℃で１週間、３０℃で１ヶ月、２５℃で３ヶ月および５℃で８ヶ月以上、化学的および物理的に許容可能な安定性を示した。
１）１６ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．０−８．０、１０ｍＭの塩化カルシウム、２０ｍｇ／ｍＬの砂糖（ショ糖またはトレハロース）、３ｍｇ／ｍＬ（２８ｍＭ）のｍ−クレゾールおよびＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％）}／Ａ１_{（約５％）}インスリンリスプロ１．０モル当たり０．５モルの亜鉛。
２）１６ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．０−８．０、１０ｍＭの塩化カルシウム、３ｍｇ／ｍＬのポロキサマー、３ｍｇ／ｍＬ（２８ｍＭ）のｍ−クレゾールおよびＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％）}／Ａ１_{（約５％）}インスリンリスプロ１．０モル当たり０．５モルの亜鉛。
３）５ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０、１３０ｍＭのグリセリン、３ｍｇ／ｍＬ（２８ｍＭ）のｍ−クレゾール、３ｍｇ／ｍＬのポロキサマーおよびＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％）}／Ａ１_{（約５％）}インスリンリスプロ１．０モル当たり０．３モルの亜鉛。

亜鉛、ｍ−クレゾール、カルシウムなどの６量体促進賦形剤を含むＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％）}／Ａ１_{（約５％）}インスリンリスプロ製剤は、一般的に、物理的および化学的に高い安定性を示す。特に高温状態ではそうである。亜鉛およびｍ−クレゾールを含むＰＥＧ_{２０ｋＤａ}Ｂ２８_{（約９５％）}／Ａ１_{（約５％）}インスリンリスプロ製剤にカルシウム、塩化物および／またはＮａＣｌを添加すると、４０℃以上の温度に曝された製剤の物理的安定性が更に向上する。更に、リン酸塩緩衝液およびクエン酸塩緩衝液を用いた製剤は、一般的に、トリス緩衝液を用いた製剤よりも物理的安定性が低かった。

Claims (3)

1. 以下の式のペグ化インスリンリスプロ化合物：
   Ｐ−〔（Ａ）−（Ｂ）〕
   (式中、
   Ａはインスリンリスプロ（配列番号１）のＡ鎖、
   Ｂはインスリンリスプロ（配列番号３）のＢ鎖、
   Ｐは１７．５〜４０ｋＤａの範囲の分子量を有するＰＥＧであり、ＡおよびＢは適切に架橋結合しており、Ｐはウレタン共有結合によって、Ｂの２８位でリジンのイプシロンアミノ基に結合している)、またはその製薬上許容可能な塩、
   1またはそれ以上の製薬上許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体、および製薬上許容可能なフェノール系防腐剤および該ペグ化インスリンリスプロ化合物を６量体化するのに充分な量の亜鉛、
   を含む医薬組成物。
2. 以下の式のペグ化インスリンリスプロ化合物：
   Ｐ−〔（Ａ）−（Ｂ）〕
   (式中、
   Ａはインスリンリスプロ（配列番号１）のＡ鎖、
   Ｂはインスリンリスプロ（配列番号３）のＢ鎖、
   Ｐは１７．５〜４０ｋＤａの範囲の分子量を有するＰＥＧであり、ＡおよびＢは適切に架橋結合しており、Ｐはウレタン共有結合によって、Ｂの２８位でリジンのイプシロンアミノ基に結合している)、またはその製薬上許容可能な塩、および
   1またはそれ以上の製薬上許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体、および治療的有効量のインスリンリスプロ
   を含む医薬組成物。
3. 製薬上許容可能なフェノール系防腐剤および該ペグ化インスリンリスプロ化合物を６量体化するのに充分な量の亜鉛をさらに含む請求項２記載の医薬組成物。

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