JP2012068127A - Particle for medical use and method for capturing physiologically active substance - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法に関する。 The present invention relates to a medical particle and a method for capturing a physiologically active substance.
ビオチンは、ビオチン結合性タンパク質と特異的に結合反応を生じることは古くから知られており、その結合力は抗原−抗体反応の１００万倍以上と強く、ほとんど非可逆反応に近い結合性を示す。この特性を活かし、ビオチン−ビオチン結合タンパク質反応は、生化学分野における検出反応によく用いられる。ビオチン結合タンパク質で最も古くから利用されている物質はアビジンであり、アビジンは生卵白由来のタンパク質である。 Biotin has been known to cause a specific binding reaction with a biotin-binding protein for a long time, and its binding force is as strong as 1,000,000 times that of an antigen-antibody reaction, and it exhibits a binding property almost similar to an irreversible reaction. . Taking advantage of this property, the biotin-biotin binding protein reaction is often used for detection reactions in the biochemical field. The biotin-binding protein that has been used for a long time is avidin, which is a protein derived from raw egg white.
例えば、特許文献１には、アビジンとビオチンの相互作用を利用した細胞分離方法が開示されている。具体的には、多孔質アクリルアミドゲルにアビジンを固定化したビーズを充填したカラムに、ビオチン化抗体と細胞との複合体を通過させ、ビオチン−アビジンの強力な結合力を利用して、目的細胞をカラム内に吸着させて分離するものである。この方法は、ビオチン−アビジンの結合力の強さを利用しており、処理速度、純度の点で優れている。しかし、ポリアクリルアミドビーズにアビジンが直接結合しているためアビジンが有効に作用せず、細胞−抗体−ビオチンの吸着速度および吸着効率が低下してしまうという問題があった。 For example, Patent Document 1 discloses a cell separation method using the interaction between avidin and biotin. Specifically, a complex of biotinylated antibody and cells is passed through a column packed with beads in which avidin is immobilized on a porous acrylamide gel, and the strong binding force of biotin-avidin is used to target cells. Is adsorbed in a column and separated. This method uses the strength of the binding force of biotin-avidin and is excellent in terms of processing speed and purity. However, since avidin is directly bound to polyacrylamide beads, avidin does not act effectively, and there is a problem that the adsorption rate and adsorption efficiency of cell-antibody-biotin are lowered.
一方、非特許文献１には、表面をストレプトアビジンで修飾した磁性ビーズを利用したウイルス検出方法が記載されている。この文献に記載された手法は、以下の通りである。まず、検体から標的核酸（ウイルスのゲノム核酸）を放出させた液中に、これに相補的な配列を持ち、かつ、末端をビオチンで修飾したプローブを加える。この時点でプローブは自身に相補的な標的核酸が存在すればハイブリダイズする。そこに、表面をストレプトアビジンで修飾した磁性ビーズを加えると、プローブ末端のビオチン分子とストレプトアビジンは強力に結合するので、もし最初の検体血漿にウイルスが存在していた場合、「磁性ビーズ〜ストレプトアビジン〜ビオチン〜プローブ〜標的核酸」複合体が形成される。この複合体を磁石で回収し、標的核酸を精製・抽出している。 On the other hand, Non-Patent Document 1 describes a virus detection method using magnetic beads whose surface is modified with streptavidin. The technique described in this document is as follows. First, a probe having a complementary sequence and a terminal modified with biotin is added to a solution in which a target nucleic acid (viral genomic nucleic acid) is released from a specimen. At this point, the probe hybridizes if there is a complementary target nucleic acid. If magnetic beads whose surface is modified with streptavidin are added, the biotin molecule at the end of the probe and streptavidin bind strongly, so if there was a virus in the first sample plasma, `` magnetic beads-streptavidin The “avidin-biotin-probe-target nucleic acid” complex is formed. This complex is recovered with a magnet, and the target nucleic acid is purified and extracted.
しかし、本文献にも記載されているように、通常、磁性ビーズを回収するには反応容器である試験管の外壁に強力な磁石を当て、ビーズが集まってくるのを待つ方法が取られる。しかしながらこの方法では、ビーズを十分集めるのに時間がかかること、不要な反応液を吸引除去してもかなりの量の液が管壁に残ること、といった欠点がある。そこで本文献では、チップの細くなった部分に磁石を近づけて磁性ビーズを集める方法を採用しているが、強力な磁石が必要であることに変わりはなく、設備が大掛かりになり、汎用性に乏しいという欠点があった。 However, as described in this document, generally, a method of applying a powerful magnet to the outer wall of a test tube that is a reaction vessel and waiting for the beads to collect is used to recover the magnetic beads. However, this method has the disadvantages that it takes time to collect enough beads and that a considerable amount of liquid remains on the tube wall even if unnecessary reaction liquid is removed by suction. Therefore, in this document, the method of collecting the magnetic beads by bringing the magnet close to the thinned part of the chip is used, but there is no change in the need for a strong magnet, and the equipment becomes large and versatile. There was a drawback of being scarce.
本発明の目的は、ビオチン化合物の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子およびその医療用粒子を用いた生理活性物質の捕捉方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a medical particle that has an excellent ability to immobilize a biotin compound and can be quickly and easily collected by general-purpose equipment such as a desktop small centrifuge and a method for capturing a physiologically active substance using the medical particle. It is to provide.
このような目的は、下記（１）〜（１２）に記載の本発明により達成される。
（１）生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、
側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットとを有することを特徴とする医療用粒子。
（２）前記第２繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものであり、その側鎖末端にビオチン結合性タンパク質を結合させたものである（１）に記載の医療用粒子。
（３）前記重合体が前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットを有するランダム共重合体である（１）または（２）に記載の医療用粒子。
（４）前記第１繰り返しユニットと、前記第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が、９７／３〜５０／５０である（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（５）前記ビオチン結合性タンパク質は、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンより選ばれる一種以上である（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（６）前記第１繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものである（１）ないし（５）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（７）前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、下記式（１）で表されるモノマーである（６）に記載の医療用粒子。
（９）前記無機材料が、無機酸化物である（８）に記載の医療用粒子。
（１０）前記無機酸化物が、酸化ケイ素である（９）に記載の医療用粒子。
（１１）前記重合体が、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなり、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されている（１）ないし（１０）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（１２）（１）ないし（１１）のいずれか１項に記載の医療用粒子を用いることを特徴とする、生理活性物質の捕捉方法。
Such an object is achieved by the present invention described in the following (1) to (12).
(1) Medical particles having a function of capturing a physiologically active substance,
The polymer is immobilized on the surface of the particulate substrate,
The polymer includes a first repeating unit having a hydrophilic group in a side chain;
A medical particle comprising a second repeating unit having a biotin-binding protein at the end of a side chain.
(2) The second repeating unit is derived from an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue, and is obtained by binding a biotin-binding protein to a side chain end thereof. The medical particles described.
(3) The medical particle according to (1) or (2), wherein the polymer is a random copolymer having the first repeating unit and the second repeating unit.
(4) The copolymerization ratio (first repeat unit / second repeat unit) of the first repeat unit and the second repeat unit is 97/3 to 50/50 (1) to (3) The medical particles according to any one of the above.
(5) The biotin-binding protein according to any one of (1) to (4), wherein the biotin-binding protein is at least one selected from avidin, streptavidin, or neutravidin.
(6) The medical particle according to any one of (1) to (5), wherein the first repeating unit is derived from an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue.
(7) The medical particle according to (6), wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue is a monomer represented by the following formula (1).
(9) The medical particle according to (8), wherein the inorganic material is an inorganic oxide.
(10) The medical particle according to (9), wherein the inorganic oxide is silicon oxide.
(11) The polymer includes the first repeating unit, the second repeating unit, and a unit having a silane coupling agent in a side chain, and is bonded to the base material via the silane coupling agent ( The medical particles according to any one of 1) to (10).
(12) A method for capturing a physiologically active substance, comprising using the medical particles according to any one of (1) to (11).
本発明によれば、ビオチン化合物の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法を得ることができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the capture | acquisition method of the medical particle | grains and bioactive substance which is excellent in the fixability of a biotin compound, and can be collect | recovered rapidly and easily with general purpose equipment, such as a desktop small centrifuge, can be obtained.
以下、本発明の医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法について説明する。
本発明の医療用粒子は、生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットと、を有することを特徴とする。
また、本発明の生理活性物質の捕捉方法は、上記に記載の医療用粒子を用いることを特徴とする。
Hereinafter, the method for capturing medical particles and physiologically active substances of the present invention will be described.
The medical particles of the present invention are medical particles having a function of capturing a physiologically active substance, and a polymer is immobilized on the surface of a particulate base material, and the polymer is attached to a side chain. It has the 1st repeating unit which has a hydrophilic group, and the 2nd repeating unit which has a biotin-binding protein at the terminal of a side chain, It is characterized by the above-mentioned.
The method for capturing a physiologically active substance of the present invention is characterized by using the medical particles described above.
本発明の医療用粒子は、生理活性物質を捕捉する機能を有するものである。具体的には、ビオチンを捕捉する機能を有する医療用粒子に関するものであり、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質の結合反応を利用するものである。さらに具体的には、ビオチン結合性タンパク質を結合させた基材にビオチンを含む生理活性物質を捕捉させることにより、該生理活性物質と特異的に結合する生体分子を選択的に回収しうる粒子を得るものである。
ここで、生理活性物質とは、例えばビオチンを含む生体分子、例えば、ビオチン化した抗原、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、レクチン等を挙げることができる。
The medical particles of the present invention have a function of capturing a physiologically active substance. Specifically, the present invention relates to a medical particle having a function of capturing biotin, and utilizes a biotin-biotin binding protein binding reaction. More specifically, particles capable of selectively recovering biomolecules that specifically bind to the bioactive substance by capturing the bioactive substance containing biotin on the substrate to which the biotin-binding protein is bound. To get.
Here, examples of the physiologically active substance include biomolecules including biotin, such as biotinylated antigen, antibody, peptide, DNA, RNA, sugar, lectin and the like.
前記粒子状の基材は、特に限定されるものではなく、有機材料、無機材料を問わず用いることができる。有機材料としては、例えばアフィニティクロマトグラフィーの担体として用いられる多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の他に、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル等の粒子が挙げられる。 The particulate base material is not particularly limited, and any organic material or inorganic material can be used. Examples of organic materials include porous agarose particles (trade name: Sepharose) and dextran particles (trade name: Sephadex) used as carriers for affinity chromatography, as well as polyacrylamide gel (trade name: Bio-Gel P, Biorad), polystyrene, ethylene-maleic anhydride copolymer, polymethyl methacrylate and the like.
また、無機材料としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの合金や無機酸化物等が挙げられる。これらの中でも無機酸化物が粒子自体の強度が高い点で好ましい。中でも、酸化ケイ素が取り扱いやすく最も好ましい。 Examples of the inorganic material include gold, silver, platinum, palladium, iridium, rhodium, osmium, iron, copper, cobalt, and alloys and inorganic oxides thereof. Among these, inorganic oxides are preferable because the strength of the particles themselves is high. Among these, silicon oxide is most preferable because it is easy to handle.
前記粒子状の基材の平均粒径は、目的および用途に応じて適宜選択される。特に、無機物の場合、粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で有機物の粒子を製造する方法に比較して、粒径の制御が容易である。
具体的に、本発明の医療用粒子に用いる基材の粒径としては、用途によっても異なるが、平均粒径が数ｎｍ〜１００μｍ程度のものが好ましい。特には、１００ｎｍ〜５０μｍが好ましく、最も１μｍ〜４０μｍが好ましい。前記基材の平均粒径が前記範囲内であると、特に生理活性物質の捕捉量とハンドリングの良さとのバランスに優れる。
このような平均粒径は、例えば粒度分布計で測定することができる。
The average particle diameter of the particulate substrate is appropriately selected according to the purpose and application. In particular, in the case of an inorganic substance, the particle diameter can be easily controlled as compared with a method of producing organic particles by emulsion polymerization or suspension polymerization in which it is difficult to control the particle diameter.
Specifically, the particle diameter of the substrate used for the medical particles of the present invention is preferably one having an average particle diameter of about several nm to 100 μm, although it varies depending on the application. In particular, 100 nm to 50 μm is preferable, and 1 μm to 40 μm is most preferable. When the average particle size of the substrate is within the above range, the balance between the amount of the physiologically active substance captured and the good handling is particularly excellent.
Such an average particle diameter can be measured with a particle size distribution meter, for example.
前記粒子状の基材の表面には、重合体が固定されている。この重合体は、ビオチン結合生理活性物質を効率良く、かつ簡易に粒子状基材に結合することを可能とするものである。さらに、このビオチン結合生理活性物質と反応する別の物質（検出対象以外のタンパク質等）の非特異吸着を効果的に抑制するものである。 A polymer is fixed on the surface of the particulate substrate. This polymer makes it possible to bind a biotin-binding physiologically active substance to a particulate substrate efficiently and easily. Furthermore, non-specific adsorption of another substance (protein other than the detection target) that reacts with the biotin-binding physiologically active substance is effectively suppressed.
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットと、を有する。すなわち、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットが、検出対象以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制し、側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットがビオチン結合生理活性物質を捕捉することができるものである。 The polymer has a first repeating unit having a hydrophilic group in the side chain and a second repeating unit having a biotin-binding protein at the end of the side chain. That is, the first repeating unit having a hydrophilic group in the side chain suppresses non-specific adsorption of proteins other than the detection target, and the second repeating unit having a biotin-binding protein at the end of the side chain is biotin-binding physiological activity. The substance can be captured.
前記側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットは、例えばアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、ホスホリルコリン基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来するものである。これらの中でもアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものが好ましい。これにより、血清中に含まれるタンパク質の非特異吸着を大きく抑制することができる。 The first repeating unit having a hydrophilic group in the side chain is derived from, for example, an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue, an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a phosphorylcholine group, or the like. Among these, those derived from an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue are preferred. Thereby, the nonspecific adsorption | suction of the protein contained in serum can be suppressed significantly.
具体的にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、下記式（１）で示されるように、（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｙの連鎖からなる化合物であることが好ましい。 Specifically, the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue is composed of a chain of a (meth) acryl group and an alkylene glycol residue Y having 1 to 10 carbon atoms, as represented by the following formula (1). A compound is preferred.
前記式（１）中のアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。炭素数が前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
また、アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。 前記繰り返し数ｑが前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
なお、繰り返し数ｑが、２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
Carbon number of alkylene glycol residue Y in said Formula (1) is 1-10, Preferably it is 1-6, More preferably, it is 2-4, More preferably, it is 2-3, Most preferably Is 2. When the carbon number is within the above range, it is particularly excellent in suppressing nonspecific adsorption.
Further, the repeating number q of the alkylene glycol residue Y is not particularly limited, but is preferably an integer of 1 to 100, more preferably an integer of 2 to 100, still more preferably 2 to 95. It is an integer, most preferably an integer of 20 to 90. When the repeat number q is within the above range, it is particularly excellent in suppressing nonspecific adsorption.
In addition, when the repeating number q is 2 or more and 100 or less, the carbon number of the alkylene glycol residue Y to be repeated may be the same or different.
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、具体的にはメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、目的とする生理活性物質以外の成分の非特異的吸着が少ないこと及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。 Specific examples of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue include methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, ethoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, and 2-hydroxypropyl. (Meth) acrylate and mono-substituted ester thereof, 2-hydroxybutyl (meth) acrylate and mono-substituted ester thereof, glycerol mono (meth) acrylate, (meth) acrylate having polypropylene glycol as a side chain, 2-methoxy Ethyl (meth) acrylate, 2-ethoxyethyl (meth) acrylate, methoxydiethylene glycol (meth) acrylate, ethoxydiethylene glycol (meth) acrylate, ethoxypoly Ji glycol (meth) acrylate and the like, methoxy polyethylene glycol methacrylate or ethoxy polyethylene glycol methacrylate is preferred because it and availability is less nonspecific adsorption of components other than the physiologically active substance of interest.
また、側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットのビオチン結合性タンパク質は、生理活性物質に結合したビオチンまたはビオチン誘導体と特異的に反応する分子が好ましい。具体的には、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが好ましい。ビオチンと前記アビジン類との相互作用は非常に強く、特異性も高いためである。また、低分子であるビオチンを生理活性物質へ導入する事も容易な為、物質固定化の為の強力なツールとすることができる。 The biotin-binding protein of the second repeating unit having a biotin-binding protein at the end of the side chain is preferably a molecule that specifically reacts with biotin or a biotin derivative bound to a physiologically active substance. Specifically, avidin, streptavidin, and neutravidin are preferable. This is because the interaction between biotin and the avidins is very strong and highly specific. In addition, since biotin, which is a low molecule, can be easily introduced into a physiologically active substance, it can be a powerful tool for immobilizing substances.
前記第２繰り返しユニットは、例えば側鎖にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーや側鎖にグリシジル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来し、さらに側鎖の先端に上述したビオチン結合性タンパク質を結合したものが挙げられる。これらの中でも、側鎖にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するユニットにビオチン結合性タンパク質を結合したものが好ましい。これにより、非特異吸着をより抑制することができる。 The second repeating unit is derived from, for example, an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue in the side chain or an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a glycidyl group in the side chain, and further at the tip of the side chain. What bound the biotin-binding protein mentioned above is mentioned. Among these, those obtained by binding a biotin-binding protein to a unit derived from an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue in the side chain are preferable. Thereby, nonspecific adsorption | suction can be suppressed more.
また、第２繰り返しユニットは、下記式（２）で示されるモノマーに由来するユニットのＷを用いてビオチン結合性タンパク質を固定化したものであっても良い。 The second repeating unit may be a unit in which a biotin-binding protein is immobilized using W of a unit derived from a monomer represented by the following formula (2).
式（２）中のＷは、活性エステルであり、具体的には例えばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でもｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。これにより、ビオチン結合性タンパク質と、活性エステルの反応性を向上することができ、第２繰り返しユニットの側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を配置することが容易となる。 W in Formula (2) is an active ester, specifically, for example, p-nitrophenyl active ester group, N-hydroxysuccinimide active ester group, phthalimide active ester group, 5-norbornene-2, 3- Examples thereof include a dicarboximide active ester group, among which a p-nitrophenyl active ester group or an N-hydroxysuccinimide active ester group is preferable, and a p-nitrophenyl active ester group is most preferable. Thereby, the reactivity of the biotin-binding protein and the active ester can be improved, and the biotin-binding protein can be easily arranged at the end of the side chain of the second repeating unit.
前記重合体の前述した第１繰り返しユニットと、第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）は、特に限定されないが、９７／３〜５０／５０であることが好ましく、特に９５／５〜７０／３０であることが好ましい。共重合比が前記範囲内であると、特に非特異吸着を効果的に抑制するとともに、ビオチン化合物の捕捉効果に優れる。
前記共重合比は、例えばＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で元素組成を評価することで算出できる。
The copolymerization ratio (first repeating unit / second repeating unit) between the first repeating unit and the second repeating unit of the polymer is not particularly limited, but is 97/3 to 50/50. Particularly preferred is 95/5 to 70/30. When the copolymerization ratio is within the above range, non-specific adsorption is particularly effectively suppressed and the biotin compound capturing effect is excellent.
The copolymerization ratio can be calculated, for example, by evaluating the elemental composition by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS).
前記重合体は、第１繰り返しユニットと第２繰り返しユニットを含むランダム共重合体であることが好ましい。これにより、第２繰り返しユニットの側鎖の末端に存在するビオチン結合性タンパク質が分散するために、有効に作用することができる。 The polymer is preferably a random copolymer including a first repeating unit and a second repeating unit. Thereby, since the biotin-binding protein present at the end of the side chain of the second repeating unit is dispersed, it can act effectively.
前記重合体の重量平均分子量は、特に限定されないが、５０００〜１００００００であることが好ましく、特に１００００〜１０００００であることが好ましい。重量平均分子量が前記範囲内であると、合成時のハンドリングがよく、また、非特異吸着を効果的に抑制することができる。 Although the weight average molecular weight of the said polymer is not specifically limited, It is preferable that it is 5000-1 million, and it is especially preferable that it is 10000-100,000. When the weight average molecular weight is within the above range, handling during synthesis is good, and nonspecific adsorption can be effectively suppressed.
本発明の医療用粒子では、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなる重合体が、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されていても良い。これにより、ポリマーがビーズから脱離するのを防ぐことができる。 In the medical particle of the present invention, a polymer composed of the first repeating unit, the second repeating unit, and a unit having a silane coupling agent in the side chain is bonded to the base material via the silane coupling agent. May be. This can prevent the polymer from detaching from the beads.
前記側鎖にシランカップリング剤を有するユニットとしては、メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリエトキシシランに由来するものが挙げられる。 As the unit having a silane coupling agent in the side chain, methacryloxypropyldimethylmethoxysilane, methacryloxypropyldimethylethoxysilane, methacryloxypropylmethyldimethoxysilane, methacryloxypropylmethyldiethoxysilane, methacryloxypropyltrimethoxysilane, Those derived from methacryloxypropyltriethoxysilane are mentioned.
シランカップリング剤により、粒子に結合した重合体を形成する具体的な方法としては、無機酸化物の場合は、表面に存在する水酸基との間のカップリング反応で容易に結合させることができる。 As a specific method for forming a polymer bonded to particles by a silane coupling agent, in the case of an inorganic oxide, it can be easily bonded by a coupling reaction with a hydroxyl group present on the surface.
前記シランカップリング剤を用いることで、ポリマーがビーズから脱離することを防ぐことができることから、医療用粒子しての使用において、繰り返される加熱処理や、洗浄工程において、ポリマーの溶解を防ぐことが可能であり、さらに、ポリマーの脱離に伴い発生する、非特異吸着の劣化が抑制され、化学的、物理的安定した医療用粒子を提供することが可能となる。
また、検出対象以外のタンパク質等に対する非特異吸着が少なく、かつ、検出対象は、ビオチン結合性タンパク質とビオチンまたはビオチン誘導体の高い反応性により、粒子表面に捕捉することが可能であるので、Ｓ／Ｎ比の高い医療用粒子を提供することができる。
By using the silane coupling agent, it is possible to prevent the polymer from detaching from the beads. Therefore, in the use as medical particles, the polymer is prevented from being dissolved in repeated heat treatments and washing steps. Furthermore, it is possible to provide chemically and physically stable medical particles in which deterioration of non-specific adsorption that occurs with the desorption of the polymer is suppressed.
In addition, non-specific adsorption to proteins other than the detection target is small, and the detection target can be captured on the particle surface due to the high reactivity of the biotin-binding protein and biotin or biotin derivative. Medical particles having a high N ratio can be provided.
（重合体固定ビーズの作製）
前記重合体固定ビーズの作製について述べる。本発明のビーズの合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、ビーズ粒子表面に、重合性官能基を有するシランカップリング剤を固定化し、前記のビオチン結合タンパク質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および該ビーズを含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、２−ブタノン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルなどの有機過酸化物などを挙げることができる。
本発明の高分子化合物の化学構造は、その結合方式がランダム、ブロック、グラフトなどいずれの形態をなしていてもかまわない。
(Production of polymer fixed beads)
The production of the polymer-fixed beads will be described. The method for synthesizing the beads of the present invention is not particularly limited, but for ease of synthesis, a silane coupling agent having a polymerizable functional group is immobilized on the surface of the bead particles, and the biotin-binding protein is immobilized. An ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group to be converted, an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue, and a mixture containing the beads may be radically polymerized in a solvent in the presence of a polymerization initiator. preferable.
Any solvent may be used as long as each ethylenically unsaturated polymerizable monomer can be dissolved. Examples thereof include 2-butanone, methanol, ethanol, t-butyl alcohol, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, and chloroform. be able to. These solvents are used alone or in combination of two or more.
The polymerization initiator may be any ordinary radical initiator, such as 2,2′-azobisisobutylnitrile (hereinafter referred to as “AIBN”), 1,1′-azobis (cyclohexane-1-carbonitrile), and the like. Examples thereof include organic peroxides such as azo compounds, benzoyl peroxide, and lauryl peroxide.
The chemical structure of the polymer compound of the present invention may be in any form such as random, block or graft.
（ビオチン結合性タンパク質の固定化）
本発明においてビオチン結合性タンパク質をビーズ上に固定化する際には、ビオチン結合性タンパク質を溶解又は分散させた液体を付着する方法が好ましい。ビオチン結合性タンパク質を溶解又は分散した液体のｐＨは５．０〜１１．０であることが好ましく、ｐＨ６．０〜１０がより好ましい。この範囲外だと、ビオチン結合性タンパク質であるやビオチン結合性タンパク質を固定化する分子が変性・分解する恐れがある。
生理活性物質付着後は、固相表面の親水基の特性により、界面活性剤を含む水や緩衝液で洗浄することで、ビオチン結合性タンパク質であると反応しうる別の物質の固相表面への非特異吸着を抑制することが可能となる。しかし、ビオチン結合性タンパク質と反応しうる別の物質に固相表面の分子と反応しうるビオチン又はビオチン誘導体が含まれる場合、ビオチン結合性タンパク質を固定化した以外の固相表面に残存する分子の不活性化処理を、ビオチン又はビオチン誘導体を有する他の化合物で行うことが好ましい。
(Immobilization of biotin-binding protein)
In the present invention, when the biotin-binding protein is immobilized on the beads, a method of attaching a liquid in which the biotin-binding protein is dissolved or dispersed is preferable. The pH of the liquid in which the biotin-binding protein is dissolved or dispersed is preferably 5.0 to 11.0, and more preferably pH 6.0 to 10. Outside this range, the biotin-binding protein or the molecule that immobilizes the biotin-binding protein may be denatured or decomposed.
After the bioactive substance is attached, depending on the properties of the hydrophilic group on the surface of the solid phase, it can be washed with water or a buffer containing a surfactant to bring it to the solid surface of another substance that can react with a biotin-binding protein. It becomes possible to suppress non-specific adsorption of. However, if another substance that can react with the biotin-binding protein contains biotin or a biotin derivative that can react with a molecule on the solid-phase surface, the remaining molecules on the solid-phase surface other than those on which the biotin-binding protein is immobilized The inactivation treatment is preferably performed with other compounds having biotin or a biotin derivative.
（固定化する生理活性物質の構造）
固定化する生理活性物質にビオチン又はビオチン誘導体を、一般的な方法で導入する事で、基材表面に固定化されたビオチン結合タンパク質によって、効果的に目的の生理活性物質を固定化する事が可能となる。より反応性を高める為に、ビオチン又はビオチン誘導体の導入位置は生理活性物質の末端や外側であることが望ましい。生理活性物質の合成法が進歩してきた事で、任意の位置にビオチン又はビオチン誘導体を導入できるようになってきており、生理活性を発現する為に重要な部位に影響を及ぼさないような位置で生理活性物質を担体表面に固定化することが可能である。
ビオチンまたはビオチン誘導体を導入する一般的な方法としては、市販のビオチン標識キット（例えば、同人化学製、Dojin Labling Kit）を用いて生理活性物質をビオチン標識することが可能である。
(Structure of bioactive substance to be immobilized)
By introducing biotin or a biotin derivative into the bioactive substance to be immobilized by a general method, the target bioactive substance can be effectively immobilized by the biotin-binding protein immobilized on the substrate surface. It becomes possible. In order to enhance the reactivity, it is desirable that the biotin or biotin derivative is introduced at the end or outside of the physiologically active substance. Advances in the synthesis of bioactive substances have made it possible to introduce biotin or biotin derivatives at any position, and at positions that do not affect the important sites for developing bioactivity. The physiologically active substance can be immobilized on the surface of the carrier.
As a general method for introducing biotin or a biotin derivative, a bioactive substance can be labeled with biotin using a commercially available biotin labeling kit (for example, Dojin Labling Kit, manufactured by Dojin Chemical).
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example and a comparative example, this invention is not limited to this.
（実施例１）
（アビジンビーズの作製）
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製ＳＩＭ６４８６．５）１３ｇをｐＨ３．０の酢酸水溶液５０ｍＬとエタノール５０ｍＬとの混合液に添加し、シランカップリング剤を加水分解した後に、シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）１０ｇを投入し７０℃で２時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、１００℃で１時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
Example 1
(Production of avidin beads)
After adding 13 g of methacryloxypropyldimethylmethoxysilane (SIM 6486.5 manufactured by Gelest Co.) to a mixed solution of 50 mL of acetic acid aqueous solution of pH 3.0 and 50 mL of ethanol, hydrolyzing the silane coupling agent, silica beads (average particle size) 10 μg of 5 μm, 70 μm pore size, SMB70-5 manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd. was added and stirred at 70 ° C. for 2 hours, and then silica beads were collected from the reaction solution by suction filtration and heated at 100 ° C. for 1 hour. Then, after dispersing with ethanol and shaking well, the supernatant was removed by centrifugation and dried.
数平均分子量Ｍｎ＝約４７５のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下ＰＥＧＭＡ４７５と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングルコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）をエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ４７５、ＭＥＯＮＰの順に９０：１０、８０：２０、７０：３０である。そこにＡＩＢＮを０．００４ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ１０ｇを投入し、アルゴンガス雰囲気下、７０℃で２２時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、ジメチルスルホキシドに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、乾燥させた。 Polyethylene glycol methyl ether methacrylate (also known as methoxy polyethylene glycol methacrylate, hereinafter referred to as PEGMA475, manufactured by Aldrich) having a number average molecular weight Mn of about 475, p-nitrophenyloxycarbonylethylene glycol methacrylate (MEONP) is dissolved in ethanol, and monomer A mixed solution was prepared. The total monomer concentration is 0.2 mol / L, and the respective molar ratios are 90:10, 80:20, and 70:30 in the order of PEGMA475 and MEONP. AIBN was added there so that it might become 0.004 mol / L, and it stirred until it became uniform. Thereafter, 10 g of silica beads treated with the above methacryloxypropyldimethylmethoxysilane were added and reacted at 70 ° C. for 22 hours in an argon gas atmosphere. Next, silica beads were collected from the reaction solution by centrifugation, dispersed in dimethyl sulfoxide, shaken well, and then collected by suction filtration and dried.
得られたシリカビーズ約３７ｍｇを５０μｇ／ｍＬのアビジン溶液（ＰＩＥＲＣＥ製ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎＴＭＢｉｏｔｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ ＰｒｏｔｅｉｎをｐＨ９．５のリン酸水素二カリウム緩衝液で希釈）と混合し３７℃で４時間処理した後、遠心分離により上澄みを除去し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い、さらに０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ｐＨ９．５、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で室温下、１時間処理し、ＭＥＯＮＰの不活性化を行った。 遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させた。 About 37 mg of the obtained silica beads were mixed with a 50 μg / mL avidin solution (NeutrAvidinTM Biotin-Binding Protein manufactured by PIERCE diluted with dipotassium hydrogen phosphate buffer at pH 9.5), treated at 37 ° C. for 4 hours, and then centrifuged. The supernatant was removed by 5), dispersed with a phosphate buffer (PBS), and the supernatant was removed by centrifugation 5 times. Further, 0.1 mol / L of 2-aminoethanol (solvent: pH 9.5, 0.00) was obtained. (05 mol / L Tris-HCl buffer solution) at room temperature for 1 hour to inactivate MEONP. After removing the supernatant by centrifugation, the mixture was dispersed with a phosphate buffer (PBS) and the supernatant was removed by centrifugation 5 times and dried.
（アビジンビーズの測定）
得られたシリカビーズ１０ｍｇにアビジンと特異的に結合する５μｇ／ｍＬのビオチン標識化ＨＲＰ溶液（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅをＰＢＳで２００倍に希釈）２７０μＬ、または５μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識化抗体溶液２７０μＬを投入し、室温で３０分間攪拌した後、遠心分離により上澄みを除去した。次いで、０．０５％の濃度でＴｒｉｔｏｎ×１００を含むＰＢＳを投入し、よく分散させた後、遠心分離により上澄みを除去する操作を１５回繰り返し、フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を用いてシリカビーズを回収した。回収したシリカビーズにＴＭＢＺ溶液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ用発色キットより調製し使用）を加え室温で１５分間攪拌することによりＴＭＢＺとシリカビーズ表面に特異的に捕捉されたビオチン標識化ＨＲＰ、又は非特異的に吸着したＨＲＰ標識化抗体とを反応をさせた後、反応停止液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットより使用）を加え反応を停止させた。その後、フィルターユニットによりシリカビーズと反応液を分離し、反応液における４５０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度には上記操作においてビオチン標識化ＨＲＰ溶液を投入した場合には、主としてシリカビーズに特異的に捕捉されたビオチン標識化ＨＲＰの量が反映され、ＨＲＰ標識化抗体溶液を投入した場合には、主としてシリカビーズに非特異的に吸着されたＨＲＰ標識化抗体の量が反映される。
(Measurement of avidin beads)
5 μg / mL biotin-labeled HRP solution (Zymed Laboratories, Inc. Biotinylated Peroxidase diluted 200-fold with PBS) 270 μL or 5 μg / mL HRP-labeled specifically binds to 10 mg of the resulting silica beads After adding 270 μL of the antibody solution and stirring at room temperature for 30 minutes, the supernatant was removed by centrifugation. Next, PBS containing Triton × 100 at a concentration of 0.05% was added and dispersed well, and then the supernatant was removed by centrifugation 15 times, and a filter unit (Ultrafree-MC manufactured by MILLIPORE) was used. The silica beads were recovered. Biotin-labeled HRP specifically captured on the surface of TMBZ and silica beads by adding a TMBZ solution (prepared and used from a color development kit for peroxidase manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) to the collected silica beads and stirring for 15 minutes at room temperature, or After reacting with the non-specifically adsorbed HRP-labeled antibody, a reaction stop solution (used from a peroxidase coloring kit manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) was added to stop the reaction. Thereafter, the silica beads and the reaction solution were separated by a filter unit, and the absorbance at 450 nm in the reaction solution was measured. When the biotin-labeled HRP solution is added in the above operation, the absorbance mainly reflects the amount of biotin-labeled HRP specifically captured on the silica beads, and when the HRP-labeled antibody solution is input. , Mainly reflecting the amount of HRP-labeled antibody adsorbed non-specifically to silica beads.
（比較例１）
前記アビジンビーズの作製と同様の方法で、ＰＥＧＭＡ４７５とＭＥＯＮＰとの比率を、順に９９：１、２０：８０に変更したものを作製した。前記と同様、タンパク質の特異的捕捉評価および非特異的吸着量評価を行った。
(Comparative Example 1)
In the same manner as the preparation of the avidin beads, the ratio of PEGMA475 and MEONP was changed to 99: 1 and 20:80 in this order. In the same manner as described above, evaluation of specific capture of proteins and evaluation of non-specific adsorption amount were performed.
（比較例２）
シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）に実施例１の処理の施さずそのまま用い、前記と同様、タンパク質の特異的捕捉評価および非特異的吸着量評価を行った。
(Comparative Example 2)
Silica beads (average particle size 5 μm, pore size 70 mm, SMB70-5 manufactured by Fuji Silysia Chemical Co., Ltd.) were used as they were without the treatment of Example 1, and as described above, specific capture evaluation and nonspecific adsorption amount of protein. Evaluation was performed.
表１には実施例１、比較例１及び２のタンパク質の特異的捕捉評価および非特異的吸着量評価における４５０ｎｍの吸光度を示した。表より明らかなように、本発明の粒子は比較例１のシリカビーズに比較してビオチン標識化ＨＲＰによる吸光度（１）とＨＲＰ標識化抗体による吸光度（２）との比（（１）／（２））が大きく、より選択的に目的とするタンパク質を捕捉できていることがわかる。
表１
Table 1
本発明の医療用粒子を用いることで、ビオチンを有する生理活性物質を選択的に捕捉し、それ以外の不要な生理活性物質や蛍光物質の吸着および結合を抑制することできる。 By using the medical particles of the present invention, a bioactive substance having biotin can be selectively captured, and adsorption and binding of other unnecessary bioactive substances and fluorescent substances can be suppressed.
Claims (12)
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、
側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットとを有することを特徴とする医療用粒子。 A medical particle having a function of capturing a physiologically active substance,
The polymer is immobilized on the surface of the particulate substrate,
The polymer includes a first repeating unit having a hydrophilic group in a side chain;
A medical particle comprising a second repeating unit having a biotin-binding protein at the end of a side chain.
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