JP2011521966A - 塩基性線維芽細胞成長因子に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、塩基性線維芽細胞成長因子に対する中和モノクローナル抗体、前記抗体を含む医薬組成物、及びこのような医薬組成物を患者に投与することを含む治療方法に関する。

Description

関連出願についてのクロスリファレンス
この出願は、米国特許出願第61/057,183号(2008年5月29日に出願)及び米国特許出願第61/170,561号(2009年4月17日に出願)に対して米国特許法(35 U.S.C.)第119条(e)の利益を主張し、全ての目的に関し、それら全部についてここに組込まれる。

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ファイル名022382-000820US_SEQLIST.TXTに書かれた配列表は、12,406バイトであり、Kyung Jin Kim et al.「塩基性線維芽細胞成長因子に対するモノクローナル抗体」と共に出願するために、2009年5月28日に作られた。このファイルに含まれる情報は、参照によりここに組み込まれる。

連邦政府後援の研究又は開発の下で行われた発明の権利に関する声明

本願に記載されている仕事は、米国国立衛生研究所からグラント5R44 CA101283-03によって、部分的に資金が提供された。アメリカ政府は、本発明にかかる、ある種の権利を有する。

本発明は、一般に、新規生物製剤の開発のための、モノクローナル抗体(mAb)と組換えＤＮＡ技術の組み合わせに関し、より詳しくは、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子に結合し、中和するモノクローナル抗体の生産に関する。

原型的な塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF)、酸性FGF(FGF1とも呼ばれる)及び塩基性FGF(FGF2とも呼ばれる)は、1970年代に、最初に単離された(FGF2は、Gospodarowicz et al., J. Biol. Chem. 250:2515, 1975による)。現在、FGFファミリーの、22のメンバーが知られており、これらのメンバーは、活性及び配列の類似性に基づいて７つのサブファミリーにグループ分けできる(Ornitz et al., Genome Biol. 2: 3005.1, 2001)。しかしながら、FGF ファミリーのメンバーは、4つのチロシンキナーゼ受容体(FGFR1 4)及びそれらのアイソフォームだけに結合し、組織特異的な様式で発現する。FGF1サブグループは、FGF1及びFGF2からなり、これらは4つ全てのFGFRと結合し、FGF2は、FGFR1cに特に強く結合する(Ornitz et al., J. Biol. Chem. 271:15292, 1996)。

ヒトFGF2は、アミノ酸155個の前駆体に由来する成熟型である、アミノ酸146個からなる18 kDaの非グリコシル化ポリペプチドである(Ornitz et al., Genome Biol. 2:3005.1, 2001; Okada-Ban et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32:263, 2000)。このFGF2の18 kDa型は、シグナル配列をコードしていないが、ER-ゴルジ複合体から独立している、一般的ではないエネルギー依存的な経路により分泌できる(Mignatti et al., J. Cell Physiol. 151:81, 1992; Florkiewicz et al., J. Cell Physiol. 162:388, 1995)。シングルコピーのFGF2遺伝子は、様々なサイズのN末端拡張を提供する4つの交互CUG開始部位を利用することにより、18 kDa型に加えて、4つの高分子量(HMW)型のタンパク質をコードしており、その結果、22 kDa(196アミノ酸)、22.5 kDa(201アミノ酸)、24 kDa(210アミノ酸)及び34 kDa(288アミノ酸)のタンパク質を生じさせる(Florkiewicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3978, 1989; Prats et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1836, 1989)。HMW型は、分泌されずに細胞核へ輸送され、細胞内分泌の様式により細胞成長又は挙動を調整できる(Delrieu, FEBS Lett. 468:6, 2000)。

高い親和性でFGFR1-4へ結合することに加えて、FGF2は、より低い親和性でヘパリン硫酸塩プロテオグリカン(HSPG)に結合する。FGF2は、モノマーとして分泌されるが、細胞表層HSPGは、側面と側面との形態で非共有結合することで、FGF2と二量体化し、その後FGF受容体との二量体化とその活性化を可能にする(Mohammadi et al., Cytokine Growth Factor Rev 16:107, 2005)。FGFRの細胞外ドメインへのFGF及びHSPGの結合は、受容体の二量体化、活性化及び自己リン酸化を誘導する。

FGF(特にFGF2)は、様々な細胞型に対して多様な活性を示す(Ornitz et al., Genome Biol. 2:3005.1, 2001)。FGF2は、線維芽細胞や内皮細胞を含む特定の細胞の増殖を刺激する(即ち、上記特定細胞の***を促進する)ことから、特定の細胞(例：神経細胞)に対する生存因子(抗アポトーシス的)である(Okada-Ban, op. cit.)。それは、内皮細胞の分化(形態形成)及び遊走(運動性)も刺激する(Dow et al., Urology 55:800, 2000)。FGF2は、特に神経系の発達に関係する。重要なことに、FGF2は、強力な血管新生因子である(Presta et al., Cytokine and Growth Factor Rev. 16:159, 2005)。

FGF2及び他のFGFは、血管新生及び腫瘍細胞の両方を直接刺激することで、癌の一因になることが信じられている(Presta et al., op cit.)。腫瘍進行中に、癌細胞は、ストローマ細胞から分泌される細胞外FGF2に反応でき(パラクリン)、そして、腫瘍細胞自体は、FGF2を分泌することができ、オートクリン様式で反応できる。FGF2又はその受容体FGFR1は、大部分のグリオーマにおいて発現又は過剰発現することが示されている(Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5710, 1990; Morrison et al. Cancer Res. 54:2794, 1994)。FGF2は、前立腺腫瘍の進行に関係し(Dow et al., Urology 55:800, 2000)、そして悪性黒色腫の増殖に対する主要なメディエーターである(Wang et al., Nature Med. 3:887, 1997)。腫瘍の進行に関するFGF2又はFGFR1の過剰発現及び/又は関係は、唾液腺腫瘍(Myoken et al., J. Path. 178:429, 1996)、食道癌(Barclay et al., Clin. Cancer Res. 11:7683, 2005)、そして甲状腺癌(Boelaert et al., J. Clin. Endocrin. Metabol. 88:2341, 2003)に関して報告されている。

FGF2に対するポリクローナル抗体(抗血清)は、マウスにおいて移植可能な軟骨肉腫の腫瘍成長を阻害すること(Baird et al., J. Cell Biochem. 30:79, 1986)、インビトロにおいてFGF2の様々な活性を中和すること(Kurokawa et al., J. Biol. Chem. 264:7686, 1989)、そして局所的に適用した時、頭蓋内異種移植片であるU87グリオーマ細胞の成長を阻害すること(Stan et al., J. Neurosurg. 82:1044, 1995)が報告されている。モノクローナル抗体の中で、DG2 mAbは、インビトロ及びインビボにおいてFGF2の活性を中和すること(Reilly et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 164:736, 1989; WO 91/06668)、ヌードマウスにおいてラットC6グリオーマ異種移植片の成長を中程度に阻害すること(Gross et al., J. Nat. Cancer Inst. 85:121, 1993)、そしてi.p.又はi.v.ではなく病巣内に輸送した時、ラット軟骨肉腫の成長を中程度に阻害すること(Coppola et al., Anticancer Res. 17:2033, 1997)が報告されている。同様に、抗FGF2 mAb DE6は、インビトロにおいてグリオーマ細胞の成長を阻害することが報告されている(Morrison et al., J. Neuroscience Res. 34:502, 1993)。一方で、抗FGF2 mAb bFM-1及びbFM-2は、インビトロで内皮細胞の成長を阻害するが、インビボにおいて腫瘍血管新生を阻害しないことが報告された(Matsuzaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9911, 1989)。中和抗FGF2 mAb 1E6は、RPMI4788結腸腫瘍異種移植片の成長を阻害することが報告されている(Aonuma et al., 19:4039, 1999)。抗FGF2 mAb 254F1は、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)の増殖を阻害することが報告されている一方で、mAb FB-8は、インビトロにおいて非小細胞肺癌の細胞株の増殖を阻害することが報告されている(Kuhn et al., Lung Cancer 44:167, 2004)。抗FGF2 mAb 254F1 3H3は、U87MG及びT98Gグリオーマ及びHeLa細胞異種移植片の成長を抑制すること(Takahashi et al., FEBS Let. 288:65, 1991)及びマウスのK1000 FGF2形質転換3T3細胞株の成長を抑制する(Hori et al., Cancer Res. 51:6180, 1991)ことが報告された。

ここで記載されているGAL-F2抗FGF2 mAbは、AACR2009年次総会においてポスター#1236で述べられ、全ての目的に関し、その全部について、ここに組み込まれる。

１つの実施形態において、本発明は、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子(FGF2)に対する中和mAbを提供する。上記mAbは、FGF2の生物活性(4つのFGF受容体FGFR1-4の1つ以上に結合すること；線維芽細胞、内皮細胞、Mv 1 Luミンク肺上皮細胞及び/又は様々なヒト腫瘍細胞の増殖を誘導すること；そして血管新生を誘導することを含む)の内、少なくとも１つ、好ましくはいくつか又は全てを阻害する。抗FGF2 mAbは、単剤として使用した時、このような活性を阻害できる。好適な抗FGF2 mAbは、マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片の成長を阻害する。好ましくは、本発明のmAbは、遺伝子工学的に操作(例：キメラ化、ヒト化又はヒト型)される。典型的な抗体は、GAL-F2とそのキメラ及びヒト化型、そしてGAL-F2と同じエピトープを有するか又はGAL-F2と結合が競合するmAbである。このような抗体を生産している細胞株も、提供される。他の実施形態において、中和抗FGF2抗体(例：キメラ又はヒト化GAL-F2)を含む医薬組成物が提供される。第3の実施形態において、上記医薬組成物は、癌又は他の疾患を治療するために患者に投与される。

ヒトFGF2(hFGF2)及びマウスFGF29(mFGF 2)に対するGAL-F2及びコントロールマウスmAb(mIgG)のELISA結合 4つのFGF受容体FGFR1-4のそれぞれに対して、GAL-F2は阻害するが、コントロールマウスmAb 5G8は阻害しないことを示しているFGFR-Fc/FGF2-Flag結合ELISA 様々な抗FGF2 mAbを用いた、ヒトFGF2に対するビオチン化GALF2の競合結合アッセイ GAL-F2又はコントロールmAb 5G8による、FGFR1又はFGFR2を安定して形質導入したBaF3細胞のFGF2誘導増殖の阻害。Noneは、FGF 2(又はmAb)を細胞に適用していないことを意味する。 GAL-F2又はコントロールmAb 5G8による、Mv 1 Luミンク肺上皮細胞のFGF 2誘導増殖の阻害。Noneは、FGF2(又はmAb)を細胞に適用していないことを意味する。 コントロールマウスmAb(mIgG)、GAL-F2又はbFM-1抗FGF 2 mAbの存在下で、ソフトアガー中においてクローン化したSMCC-7721細胞の顕微鏡写真 GAL-F2(1週当たり100μgを2回)又はPBS単独で処理した、腫瘍接種後の5日目から開始したマウスにおけるRPMI 4788ヒト結腸腫瘍異種移植片の成長 GAL-F2又はbFM-1抗FGF2 mAb(1週当たり100μgを2回)又はPBS単独での処理を、腫瘍接種後の6日目から開始したマウスにおけるRPMI 4788ヒト結腸腫瘍異種移植片の成長 PBS単独、GAL-F2(1週当たり100μgを2回)、シスプラチン(1週当たり100μgを1回)又はGAL-F2とシスプラチンの両方で処理したマウスにおけるSMMC-7721ヒト肝臓癌腫瘍異種移植片の成長。1グループあたり5匹のマウスである。 PBS単独、GAL-F2又はM225抗EGFR mAb(1週当たり100μgを2回)又はGAL-F2とM225の両方での処理を、接種後の6日目から開始したマウスにおけるHepG2ヒト肝臓癌腫瘍異種移植片の成長。1グループあたり6匹のマウスである。 HuGAL-F2軽鎖(A)の成熟可変領域(配列番号：2)及び重鎖(B)の成熟可変領域(配列番号：5)のアミノ酸配列は、マウスGAL-F2(配列番号：1及び4)とヒトアクセプターV領域(配列番号：3及び6)に合わせて示されている。CDRは、GAL-F2配列中で下線が引かれている。そして、マウスL2G7アミノ酸で置換されたアミノ酸は、HuGAL-F2配列中で二重下線が引かれている。１文字アミノ酸コードとカバットナンバリング(Kabat numbering)システムが、軽鎖及び重鎖の両方に対して使用されている。 明細書中で述べる通りに実行された、ヒト化(HuGAL-F2)及びキメラ(ChGAL-F2)mAb及びコントロールヒト抗体hIgGの競合結合 完全な成熟HuGAL-F2抗体の軽鎖(A) (配列番号：7)及び重鎖(B) (配列番号：8)のアミノ酸配列である。各段における最初のアミノ酸には、番号が付され、その番号は連続している。軽鎖において、Cκ領域の最初のアミノ酸には下線が引かれている。重鎖において、CH1、ヒンジ、CH2及びCH3領域の最初のアミノ酸には下線が引かれている。

本発明は、中和抗FGF2モノクローナル抗体、それらを含む医薬組成物及び疾患治療のためにそれらを使用する方法を提供する。

1.抗体
抗体は、非常に大きな、複合分子(〜150,000の分子量又は約1320アミノ酸)であって複雑な内部構造を有する。天然の抗体分子は、2対の同一のポリペプチド鎖(各対は、1つの軽鎖及び1つの重鎖を有する)を含む。各軽鎖及び重鎖は、2つの領域(目標抗原との結合に関係する可変(「V」)領域と、免疫系の他の要素と相互作用する定常(「C」)領域)からなる。軽鎖及び重鎖の可変領域は、3次元空間的に一体となり、抗原(例：細胞表層の受容体)を結合する可変領域を形成する。各軽鎖又は重鎖の可変領域の中には、相補性決定領域(「CDR」)と呼ばれている3つの短い断片(平均10アミノ酸の長さ)が存在する。抗体の可変ドメインにおける6つのCDR(軽鎖由来の3つと重鎖由来の3つ)は、3次元空間的に一緒に折り畳まれ、目標抗原と結合する実際の抗体結合部位を形成する。CDRの位置及び長さは、Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987により正確に定義されている。CDRに含まれない可変領域の部分は、フレームワークと呼ばれ、CDRのための環境を形成する。Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901, 1987は、構造により決定される超可変領域又はループの関連概念を定めている。

ヒト化抗体は、遺伝子工学的に操作された抗体であって、マウス抗体(「ドナー抗体」であり、ラット、ハムスター又は他のヒト以外の種であってもよい)由来のCDRがヒト抗体(「アクセプター抗体」)へ移植されたものである。アクセプター抗体の配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、ヒト抗体配列の共通配列又は生殖系配列であってもよい。このように、ヒト化抗体は、ドナー抗体由来のCDR及び可変領域のフレームワーク及びヒト抗体由来の定常領域を有する抗体である。加えて、高い結合親和性を保持するために、2つの追加構造要素のうちの少なくとも1つが採用可能である。米国特許第5,530,101及び5,585,089を参照し、引用によりここに組み込まれ、それには、ヒト化抗体の構築に関する詳細な指示を提供している。ヒト化抗体は、典型的には、ヒト化重鎖とヒト化軽鎖を有する。一般に、ヒト化重鎖の重鎖可変領域フレームワークとヒト化軽鎖の軽鎖可変領域フレームワークには、アクセプターヒト重鎖又は軽鎖可変領域フレームワーク(ヒト共通可変領域フレームワーク及び複合ヒト可変領域フレームワークを含む。)のどちらにも存在しない残基となる置換が10又は12を超えては含まれていない。

ヒト化抗体は、多くの場合マウス抗体由来の全6つの完全なCDR(Kabatにより定義されるもの)が組込まれるが、マウス抗体由来の完全なCDRより少ないものによって、作製することもできる(例：Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002)。多くの抗体は、結合に関係する1つか2つのCDRを省くことができると科学文献には記載されている。Padlan et al., FASEB Journal 9: 133-139 (1995); Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428 (2002); Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, (1999); Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441 (2000)。同様に、CDRの一部(即ち、結合に必要なCDR残基のサブセット。SDRと称される。)だけをヒト化抗体に組込むことを必要としてもよい。

抗原に接触せず、SDR中にないCDR残基は、以前の研究(例：CDRH2の残基H60-H65は、必要とされない場合が多い。)に基づいたり、コチア(Chothia)超可変ループの外側に位置するカバットCDRの領域からであったり、分子モデリング及び／又は経験によったり、又はGonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004中の記述によったりして同定することができる。CDR又はその残基が省かれる場合は、可変領域フレームワーク配列を提供するヒトアクセプター配列において対応する位置を占めているアミノ酸で、通常置換される。含められる置換の数は、互いに競合する、考慮すべき複数の事項のバランスを反映する。このような置換は、ヒト化抗体中に存在するマウスアミノ酸の数を減少させ、その結果、潜在的な免疫原性を減少させる点で、潜在的に有利である。しかしながら、置換は親和性の変化を引き起こす場合があり、親和性の著しい減少は、回避することが好ましい。CDR中において置換する位置及び置換するアミノ酸も、経験的に選択できる。

ヒト化抗体の高い結合親和性を保持するための上記第1の構造要素において、ヒト化抗体における重鎖可変領域のフレームワークは、多くの既知ヒト抗体の中からアクセプター抗体を適切に選択することにより、ドナー抗体の重鎖可変領域のフレームワークと配列同一性が最大(65%と95%の間)となるように選ばれる。第2の構造要素において、ヒト化抗体の構築の際に、ヒトアクセプター抗体のフレームワークの中(CDRの外側)における選択されたアミノ酸は、所定の規則に従って、ドナー抗体からの対応するアミノ酸で置換される。具体的には、フレームワーク中で置換されるアミノ酸は、CDRと相互作用するこれらの能力に基づいて選択される。例えば、置換されるアミノ酸は、ドナー抗体配列中のCDRに隣接でき、又は3次元空間において測定される、ヒト化抗体中のCDRにおける4-6オングストロームの範囲内に隣接できる。

キメラ抗体は、マウス(又は他の齧歯動物)抗体の可変領域がヒト抗体の定常領域と結合する抗体であり、遺伝子工学による構築がよく知られている。このような抗体は、マウス抗体の結合特異性を保持する一方で、約2/3がヒト型である。マウス、キメラ及びヒト化抗体に存在する非ヒト配列の比率から、キメラ抗体の免疫原性は、マウスとヒト化抗体との中間であることが示される。遺伝子工学的に操作して、マウス抗体と比較して免疫原性が減少したかもしれない抗体の他のタイプは、ファージディスプレイ法を使用(Dower et al., WO91/17271; McCafferty et al., WO92/001047; Winter, WO92/20791; 及び Winter, FEBS Lett. 23:92, 1998, それぞれは参照によりここに組み込まれる)して又はトランスジェニック動物を使用(Lonberg et al., WO93/12227; Kucherlapati WO91/10741, それぞれは参照によりここに組み込まれる)して作製されたヒト抗体を含む。

ここで使用する、「ヒト様」抗体という用語は、一方又は両方の鎖のアミノ酸配列のかなりの部分(例：約50%以上)がヒト免疫グロブリン遺伝子を起源とするmAbを指す。故に、ヒト様抗体は、キメラ、ヒト化及びヒト抗体を包含するが、これらに限定はされない。ここで使用する、「減少した免疫原性」を有するmAbは、ヒト患者に投与した時、マウス抗体より著しく少ない免疫原性を有すると期待されるものである。このような抗体は、キメラ、ヒト化及びヒトmAbと、B細胞又はT細胞エピトープ(例：露出した残基)に寄与し得る、マウス抗体中の特定のアミノ酸を置換することによって作製されたmAbを含む(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)。ここで使用する、「遺伝子工学的に操作された」mAbは、遺伝子が組換えDNA技術の助けを借りて、構築されたか又は非天然環境(例：マウス中又はバクテリオファージ上のヒト遺伝子)に置かれたものであり、従って、例えば、従来のハイブリドーマ技術により作製されるマウスmAbは含まないだろう。

mAbのエピトープは、その抗原中の、mAbが結合する領域である。2つの抗体のうち、一方が抗原へ結合することを競合的に阻害する(ブロックする)場合、2つの抗体は同じ又は重複するエピトープと結合する。即ち、一方の抗体が1x、5x、10x、20x又は100x過剰である場合、競合結合アッセイで測定されるように、他方の結合は、少なくとも50%、しかし好ましくは75%、90%又は99%阻害される(例えば、Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990を参照)。あるいは、2つの抗体がその抗原の同じ領域と結合する場合、その2つの抗体は、同じエピトープを有する。また、抗原のアミノ酸変異によって一方の抗体の結合が低減又は排除される場合に、他方の抗体の結合も低減又は排除ということが実質的に全てのアミノ酸で起こる場合にも、その2つの抗体は、同じエピトープを有する。抗原のアミノ酸変異によって一方の抗体の結合が低減又は排除される場合に、他方の抗体の結合も低減又は排除ということがいくつかのアミノ酸で起こる場合には、2つの抗体は重複するエピトープを有する。

2.中和抗FGF2抗体
結合がFGF2の1以上の生物活性を部分的に又は完全に阻害する場合(即ち、mAbが単剤として使用される時)、FGF2に結合するモノクローナル抗体(mAb) (即ち、抗FGF2 mAb)は、FGF2を中和する又は中和していると言える。中和抗体が阻害し得る、FGF2の生物学的特徴は、以下の特徴である：4つのFGF受容体の内の1つ以上に結合する特徴、特定の細胞(線維芽細胞、内皮細胞、Mv 1 Luミンク肺上皮細胞及び様々なヒト腫瘍細胞を含む)の増殖を刺激(即ち、***を促進)する特徴、細胞の分化及び遊走(例：内皮細胞)をする特徴、又は血管新生を刺激(例えばヒト血管内皮細胞(HUVEC)増殖或いは管形成の刺激によって、又はニワトリ胚絨毛尿膜(CAM)に適用する時に血管の誘導によって測定したように)する特徴。

例えば、0.01、0.1、0.5、1、2、5、10、20又は50μg/mlの濃度での本発明の中和mAbは、実施例において記載されている方法又は従来技術として公知の方法によりアッセイされるように、少なくとも約50%、しかし好ましくは75%、より好ましくは90%又は95%又は更に99%、最も好ましくはほぼ100%(基本的に完全に)FGF2の生物学的機能を阻害する。典型的には、使用するFGF2の量が生物活性を完全に刺激するには、ちょうど十分である時、又は1、2或いは5ng/ml又は0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、 3或いは10μg/mlである時に、抑制の程度は測定される。好ましくは単剤として使われる時に、mAbは中和化する(即ち、生物活性を阻害する)が、任意に、2つのmAbは一緒に使用することで抑制を与えることができる。最も好ましくはmAbが、上記の生物活性のうち、1つのみならず、2、3又はいくつかを中和し、ここでの目的に関しては、単剤として使用する抗FGF2 mAbが、FGF2のすべての生物活性を中和することは「完全に中和する」と言え、このようなmAbが最も好ましい。本発明のmAbは、好ましくはFGF2に特異的であり、即ち、他のFGF(例：FGF1)や血管内皮成長因子(VEGF)のようなFGF2に関連があるタンパク質とは結合しない又はより低い程度(例：少なくとも10倍低い)で結合する。本発明の一部のmAbは、ヒトFGF2とマウスFGF2の両方、又はヒトFGF2とマウス、ラット、ラビット、チキン、イヌ及び/又はサル(例：カニクイザル)FGF2の1、2或いはそれ以上或いはその全てと結合する。他のmAbは、ヒトFGF2に特異的である。本発明のmAbは、典型的には、少なくともFGF2に対して107 M^-1、しかし好ましくは10⁸ M^-1以上、及び最も好ましくは10⁹ M^-1以上又は更に10¹⁰ M^-1以上の結合親和性(Ka)を有する。

本発明のmAbは、天然4量体(2つの軽鎖及び2つの重鎖)の抗FGF2抗体を含み、既知のアイソフォームIgG、IgA、IgM、IgD及びIgE及びそれらのサブタイプ(即ち、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4及びマウスIgG1、IgG2a、IgG2b、及びIgG3)のいずれであってもよい。本発明のmAbは、Fv、Fab及びF(ab’)2のような抗体の断片、二機能性ハイブリッド抗体(例：Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105, 1987)、単鎖抗体(Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988)、単一アームの抗体(Nguyen et al., Cancer Gene Ther. 10:840, 2003)、及び定常領域を変更した抗体(例：米国特許第5,624,821号)をも含むことを意図している。mAbは、動物(例：マウス、ラット、ハムスター又はチキン)起源であってもよく、又は遺伝子工学的に操作されたものであってもよい。齧歯動物のmAbは、周知技術の標準的な方法によって作製される。この方法は、適当なアジュバントi.p.、i.v.での又は足蹠内への、FGF2を用いた多重免疫の後、脾臓又はリンパ節細胞を抽出し、適切な不死化細胞株と融合させ、FGF2に結合する抗体を生産するハイブリドーマを選択することを含む(例として実施例を参照)。上記記載の既知の方法によって作製されたキメラ及びヒト化mAbは、本発明の好ましい実施形態である。例えば、ファージディスプレイ又はトランスジェニックマウス法によって作製されたヒト抗体も好適である(例：上記したDower et al., McCafferty et al., Winter, Lonberg et al., Kucherlapati,を参照)。

下記記載の中和抗FGF2 mAb GAL-F2は、本発明の一例である。ここに記載される所望の特性(中和FGF2)を有する単一で原型的な抗ヒトFGF2 mAb(例：GAL-F2)が一度単離されると、既知の方法を用いて、類似の特性を有する他のmAbを生成することは容易である。例えば、上記の通りハイブリドーマを作製し、FGF2との結合に対して原型的なmAbと競合する能力に関するスクリーニングによりmAbを得る目的で、マウスをFGF2により免疫してもよい。GAL-F2が結合するエピトープを含むより小さいFGF2の断片を用いて、マウスを免疫化することもできる。エピトープは、例えば、FGF2に渡っている一連の重複ペプチドへの結合に関してスクリーニングすることによって突き止めることができる。あるいは、Jespers et al., Biotechnology 12:899(参照によりここに組み込まれる)に記載の方法を用いて、同じエピトープを有し、従って原型的なmAb(例：GAL-F2)に類似した特性を有するmAbの選択を導いてもよい。ファージディスプレイを用いて、最初に、原型的な抗体の重鎖が(好ましくはヒトの)軽鎖の集団とペアを作り、FGF2結合mAbを選択する。そして新規な軽鎖は、(好ましくはヒトの)重鎖の集団とペアを作り、原型的なmAbと同じエピトープを有する(好ましくはヒトの)FGF2結合mAbを選択する。あるいは、GAL-F2の変異体は、ハイブリドーマから得られるGAL-F2の重鎖及び軽鎖をコードしているcDNAの突然変異誘発によって得ることが可能である。

GAL-F2と同じ又は重複するエピトープを有する(例：GAL-F2とFGF2の結合と競合する)中和mAbが、他の例を提供する。GAL-F2のキメラ又はヒト化型は、特に好適な実施形態である。GAL-F2の重鎖及び/又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列と90%、95%又は99%の同一性があり、その機能的特性を維持するmAb、及び/又は少数の機能的に重要でないアミノ酸置換(例：同類置換)、欠失又は挿入により区別されるmAbも本発明に含む。対応するGAL-F2のCDRと90%、95%又は99%又は100%の同一性がある、少なくとも１及び好ましくは全6つのCDRを有するmAbも含まれる。ここで、本願の他の場所と同様に、配列同一性のパーセントは、カバットナンバリング慣習により最大限アライメントした抗体配列で決定される。アライメント後、対象の抗体領域(例：重鎖又は軽鎖の全ての成熟した可変領域)が、参照する抗体と同じ領域を比較する場合、対象の抗体の領域と参照する抗体の領域間における配列同一性のパーセントは、対象の抗体領域と参照する抗体領域の両方において同じアミノ酸によって占められる位置の数を、2つの領域においてアライメントされた位置の総数(ギャップは数に入れない)で割り、100を掛けることでパーセントに変換されるものである。

本発明にかかる天然のmAbは、ハイブリドーマから生産されたものであってもよい。遺伝子工学的に操作されたmAb(例：キメラ又はヒト化mAb)は、様々な既知の方法により発現してもよい。例えば、それらの軽鎖及び重鎖V領域をコードしている遺伝子は、重複するオリゴヌクレオチドから合成してもよく、必要な調節領域(例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ部位等)を提供する発現ベクター(例：インビトロゲンから市販されているもの)に、利用可能なC領域と共に挿入してもよい。CMVプロモーター―エンハンサーの使用は、好適である。発現ベクターは、様々な周知の方法(例：リポフェクション又は電気穿孔法)を用いて、様々な哺乳類の細胞株(例：CHO又はSp2/0及びNS0を含む非生産性骨髄腫)、及び適切な抗生物質選択により選ばれた、抗体を発現している細胞へ形質導入してもよい。米国特許第5,530,101号を参照。より大きな量の抗体は、市販のバイオリアクターにおいての生育させた細胞によって生産させてもよい。

一度発現させると、本発明のmAb又は他の抗体は、標準的な技術的方法(例：精密濾過法、限外濾過法、プロテインA又はGアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー及び/又は有機染料に基づくアフィニティークロマトグラフィーの他の形態等)に従って精製してもよい。少なくとも約90又は95%の均一性を有する実質的に純粋な抗体が、好適であり、製薬用途のために、98%又は99%又はそれ以上の均一性が、最も好適である。

3.処理法
本発明は、本発明にかかるmAb(例：抗FGF2)を、疾患を患っている患者に投与(治療処置)又は疾患の発症或いは再発の危険がある患者に投与(予防処置)する治療法を提供する。「患者」という用語には、ヒトの患者、獣医学的な患者(例：ネコ、イヌ及びウマ)、家畜(例：ウシ、ヒツジ及びブタ)、及び試験目的で使用する実験動物(例：マウス及びラット)が含まれる。この方法は、特にヒト患者の治療に適している。ヒト患者を治療する方法において使用するmAbは、ヒトFGF2タンパク質と結合し、その配列は、例えば、Ornitz et al., Genome Biol. 2: 3005.1, 2001、又はOkada-Ban et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32:263, 2000により提供され、Swiss-ProtデータベースのLocus P09038でも提供される。ヒトタンパク質に対するmAbは、種ホモログがヒトタンパク質と抗原交差反応性を有する他の種においても使用することができる。このような交差反応性を欠いている種においては、抗体は、その種に存在する種ホモログに対して適切な特異性で使用される。しかしながら、実験動物での異種移植実験においては、異種移植片により発現されるヒトタンパク質に対して特異性を有するmAbが、通常使用される。

好ましい実施形態において、本発明は、ここに記載されている抗体を含む医薬製剤を提供する。抗体の医薬製剤は、生理的に許容可能な担体中にmAbを含む。この製剤は、任意的に、賦形剤又は安定剤を有し、凍結乾燥の形又は水性溶液の形である。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、採用する投与量及び濃度においては受取対象に対して無毒性であり、そして緩衝液(例：pH 5.0〜8.0、最も多くの場合6.0〜7.0のリン酸塩、クエン酸塩又は酢酸塩)、塩(例：等張にするための塩化ナトリウム、塩化カリウム等)、抗酸化、防腐剤、低分子量のポリペプチド、タンパク質、親水性ポリマー(例：ポリソルベート80)、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖及び当業者に公知の他の標準成分(Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. 1980)を含む。mAbは、1-100 mg/ml(例：10 mg/ml)の濃度で、典型的には存在する。

他の好ましい実施形態として、本発明は、医薬製剤中の抗FGF2 mAbを使用して、疾患患者を治療する方法を提供する。医薬製剤中に調製されたmAbは、任意の適切なルート、特に静脈内投与又はボーラス投与による非経口、筋肉又は皮下的なルートによって、患者に投与することが可能である。静脈内投与は、少なくとも15分間、しかしより多くの場合30分間に渡って、又は1、2或いは更に3時間に渡って投与可能である。mAbは、直接疾患部位(例：腫瘍)に注入することも可能であり、又は担体となる薬剤(例：リポソーム)にカプセル化することも可能である。与えられる用量は、少なくとも部分的に、治療中の状態を軽減するのに十分な量(「治療的に有効な用量」)であり、任意に0.1〜5 mg/kg(体重あたり)で、例えば1、2、3又は4 mg/kgであるが、10 mg/kgという多くの量であってもよく又は15、20又は30 mg/kgであってもよい。一定の単位投与量(例：100、200、500、1000又は2000 mg)で投与してもよく、又は用量は、患者の表面積(例：1000 mg/m²)に基づいてもよい。通常、1〜8の用量(例：1、2、3、4、5、6、7又は8)が癌治療のために投与されるが、10、20又はそれ以上の用量が投与されてもよい。mAbは、毎日、週2回、毎週、隔週、又は毎月投与してもよい。また、例えばmAbの半減期に依存する若干の他の間隔(例：1週間、2週間、4週間、8週間、3-6ヵ月間又はそれ以上又は疾患が進行するまで)で投与してもよい。長期投与のような、治療の繰り返しコースも可能である。

用量の組合せ、投与の頻度及び、治療中の患者に存在する疾患を、少なくとも部分的に軽減する効果的な用量、投与頻度及び投与ルートの組み合わせは、治療的に有効な投与計画と言える。患者における疾患の発症を阻害又は遅延させる効果的な用量、投与頻度及び投与ルートの組み合わせは、予防的に有効な投与計画と称する。

本発明の抗FGF2 mAbを用いる治療の影響を特に受けやすい疾患は、血管新生を必要としたり、FGF2の高いレベルと関係したり、又はFGF2の発現と関係したりすると考えられる固形腫瘍を含む。このような腫瘍は、抗FGF2 mAbを用いる治療が適当であり、例えば卵巣癌、乳癌、肺癌(小細胞又は非小細胞)、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌又は肝細胞腫(肝癌)、頭頚部腫瘍、黒色腫、肉腫、細胞腫及び脳腫瘍(例：グリア芽細胞腫のようなグリオーマ)を含む。白血病及びリンパ腫及び多発性骨髄腫のような血液悪性腫瘍も、このような治療に影響を受けやすい可能性がある。本発明の抗FGF mAbを用いる治療が適切である、血管新生に関係する他の疾患は、加齢性黄斑変性症(AMD)、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障及び目に関する他の疾患、乾癬及び皮膚に関する他の病気、並びに関節リウマチを含む。

好ましい実施形態において、抗FGF2 mAbは、他の治療法と組み合わせて(即ち、他の治療法と一緒に、言い換えると他の治療法の前、間又は後に)投与される。例えば、癌治療のために、抗FGF2 mAbは、周知の化学療法薬、例えばアルキル化剤(例：カルマスティン、クロラムブシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジン及びシクロホスファミド)； 代謝拮抗薬(例：フルオロウラシル、フロキシウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキセート及びヒドロキシウレア)；植物アルカロイド及び抗生物質(例：ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エトポシド、マイトマイシン、ミトキサントロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びタキソール(パクリタキセル)又は関連化合物(例：タキソテール(登録商標))を含む天然物；トポイソメラーゼ１阻害イリノテカン；テモゾロマイド及びグリアデル(登録商標)ウェハースであってカルマスティンを含有しているものを含む、脳腫瘍のために特に承認される薬剤；そしてチロシンキナーゼ阻害剤(例：グリベック(登録商標) (メシル酸イマチニブ)、スーテント(登録商標) (リンゴ酸スニチニブ)、ネクサバール(登録商標) (ソラフェニブ)、タルセバ(登録商標) (エルロチニブ)、及びイレッサ(登録商標) (ゲフィチニブ)；血管新生阻害剤；並びにすべての承認された及び実験的な抗癌剤であって、WO 2005/017107 A2(参照よりここに組み込まれる)に一覧として表示されているものの内、任意の1つ以上と共にも投与してもよい。抗FGF2 mAbは、標準化学療法の投与計画で使用する1、2、3又はそれ以上のこれらの他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。通常、他の薬剤は、治療している癌の特定のタイプに対して効果的であることが既に公知の物である。抗FGF2 mAbは、特に化学療法薬に対する耐性に打ち勝ち、これによりそれらの効果を増加させることに役立つ(Song et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 97:8658, 2000を参照)。

癌治療のために抗FGF 2 mAbと投与ができる他の薬剤は、モノクローナル抗体(例：HER2抗原に対するハーセプチン^TM；VEGFに対するアバスチン(登録商標)を含む)；又は上皮増殖因子(EGF)受容体(例：アービタックス(登録商標) (セツキシマブ)及びベクチビックス(登録商標) (パニツムマブ))に対する抗体のような生物製剤を含む。肝細胞増殖因子(HGF)に対する抗体は、抗FGF2 mAbと共に使用することが特に好ましい。抗FGF2 mAbは、mAb L2G7 (Kim et al., Clin Cancer Res 12:1292, 2006 and US Patent No. 7,220,410)及び特にそのキメラ及びヒト化型(例：HuL2G7(WO 07115049 A2)；WO 2005/017107 A2(特に2.12.1)に記載されているヒト抗HGF mAb；そしてWO 07143090 A2又はWO 07143098 A2に記載されているHGF結合タンパク質；そして、上述したmAbのいずれかと結合に対して競合するその他の中和抗HGF mAbを含む。HGFのcMet受容体と結合するmAbも、好適である(例：抗cMet mAb OA-5D5(Martens et al., Clin. Cancer Res. 12:6144, 2006)であって、遺伝子工学的に操作され、たった1つの「アーム」(即ち、結合ドメイン)を有するもの)。更に、抗FGF2 mAbは、いかなる形の手術及び/又は放射線療法(外照射療法、強度変調放射線治療(IMRT)及びいかなる形の放射線手術(例：ガンマナイフ)を含む)と共に使用してもよい。

抗FGF2 mAb抗体を含む治療(例：標準化学療法)は、抗FGF2 mAbを使用しないこと以外同じ治療(例：化学療法)と比較して、癌患者の無増悪期間の中央値又は全生存期間の中央値を少なくとも30%又は40%、しかし好ましくは50%、60%〜70%又は更に100%以上増加させることによって疾患を軽減できる可能性がある。加えて、又は、代わりに、抗FGF2 mAbを含む治療(例：標準化学療法)は、抗FGF2 mAbを使用しないこと以外同じ治療(例：化学療法)と比較して、これらの腫瘍(例：卵巣、胸部、肺、結腸及びグリア芽細胞腫であって、特に再発性又は難治性の時のもの)を有する患者の完全寛解率、部分的な寛解率又は客観的な寛解率(完全＋部分的)を少なくとも30%又は40%、しかし好ましくは50%、60%〜70%又は100%上昇させる可能性がある。

典型的には、臨床試験(例：第2相、第2/3相又は第３相試験)において、単独の化学療法(又はこれにプラセボを加えた療法)を受けている患者のコントロール群と比較して、抗FGF2 mAbを加えた化学療法で治療される患者における増悪期間の中央値及び/又は寛解率の、上述した増加は、例えばp = 0.05又は0.01又は更に0.001のレベルにおいて統計的に有意である。完全及び部分的な寛解率は、癌の臨床試験において、一般的に用いられる客観的基準(例：国立癌研究所及び/又は食品医薬品局によって、リスト化されるか又は承認されるようなもの)で測定される。

4.他の方法
本発明の抗FGF2 mAbは、診断、予防及び検査方法での使用も見いだせる。腫瘍患者の腫瘍又は循環器系におけるFGF2のレベルを測定し、レベルが測定可能であるか又は更に上昇するかどうか決定し、その結果、腫瘍を追跡する又は腫瘍治療を導くために使用してもよい。その理由は、測定可能な又は上昇したFGF2のレベルに関係する腫瘍は、抗FGF2 mAbを有する治療に、最も影響を受けやすいことが予想されるためである。例えば、高レベルのFGF2に関係する腫瘍は、特に抗FGF2 mAbを用いる治療の影響を受けやすいだろう。具体例な実施形態として、mAbは、FGF2のレベル(例：腫瘍生検標本又は血清又は細胞培養中のFGF2分泌細胞の培地上清中におけるレベル)を測定する目的で、ELISA又はラジオイムノアッセイにおいて使用することができる。異なるエピトープに結合する(即ち、結合が競合しない)2つの抗FGF2 mAbの使用は、FGF2を検出するための、感度が高い「サンドイッチ」ELISAを開発することに特に役立つだろう。様々なアッセイのために、mAbは、蛍光分子、スピン標識分子、酵素又は放射性同位元素で標識してもよく、FGF2アッセイを実行するための、必要な試薬の全てを有するキットの形で提供してもよい。他の用途において、抗FGF2 mAbは、例えばアフィニティークロマトグラフィにより、FGF2を精製するために使用されるだろう。

実施例１：試薬及びアッセイ
GST-FGF2、FGF2-Fc及びFGF2-Flagの調製
ヒトFGF2に関するcDNA配列(155アミノ酸を有する前駆体の形；Sommer et al., 1987)を合成し(GenScript, Inc)、PCRで増幅し、pDisplayベクター(Invitrogen)の派生体にクローンした。これらのプラスミドは、大腸菌(E. coli)BL21(DE3)細胞へ導入し、FGF2発現は、1 mM IPTGを使用して誘導した。FGF2発現レベルは、FGF2特異的ELISAキット(R&D Systems)を用いて測定し、FGF2は、Wiedlocha et al., Mol. Cell Biol. 16:270, 1996に記載されているヘパリン-セファロースCL-6Bビーズ(Amersham Biosciences)を用いて精製した。FGF2の融合タンパク質であって、グルタミン合成酵素を有するもの(GST-FGF2)、Flagペプチドを有するもの(FGF2-Flag)、及びヒトIgG1 Fcドメインを有するもの(アミノ酸216〜446；FGF2-Fc)は、FGF2/FGFR結合アッセイと免疫化に使用したものであって、標準分子生物学的技術を使用して、適当な遺伝子構造物から同様に生産した。GST-FGF2は、抗GSTカラムを用いて精製し、FGF2-Fcは、プロテインA/Gカラムを用いて精製し、FGF-Flagは、FGF2-Flag濃度を決定した後の培養上清を使用した。加えて、精製ヒトFGF2(QED Bioscience Inc.)及びマウスFGF2(ProSpec-Tany Technogene Ltd.)は、購入した。

FGF R-Fcタンパク質の調製
ヒトFGFR1アルファ(IIIc) (FGFR1cと表す)及びヒトFGFR2Cアルファ(IIIc) (FGF R2cと表す)の細胞外ドメイン(ECD)を、イムノアドヘシン分子として発現した。DNA断片がコードしているFGFR1c及びFGFR2cの全てのECDを、ポリペプチドリンカーを介してヒトFcに融合した。これらのFGFR-Fc分子は、ヒト293F細胞へ形質導入し、293発現培地において、G418(1 mg/ml)の存在下で安定した293形質転換体を選択することで、発現した。293F形質転換細胞から分泌されたFGFR-Fcは、プロテインA/Gカラムを用いて精製した。加えて、ヒトFGFR3c-Fc及びヒトFGFR4-Fc融合体は、R & D Systemsから得た。

FGF2断片の合成
FGF2のアミノ酸残基29-44(ペプチド#1)、101-118(ペプチド#3)及び137-155(ペプチド#4)からなるペプチドは、SynBioSciにより合成された。追加のシステイン残基は、ペプチド#1及び#3のc末端及びペプチド#4のN末端に付加した。これらのペプチド断片は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合した。

FGF2結合ELISA
ELISAウェルを、終夜4℃において50μg/mlのヘパリン(Sigma)によりコーティングし、室温(RT)で1時間、0.3-1μg/mlのヒト又はマウスFGF 2のいずれかでインキュベートした。これによって、ヘパリンは、FGF2を補足することができる。室温で1時間、2% BSAでのブロッキング後に、ハイブリドーマ培養上清又は精製mAbを加え、室温で1時間とした。結合した抗FGF2抗体は、HRPヤギ抗マウスIgG Fcを加え、室温で1時間後に洗浄し、TMB基質(Sigma)を加え、450 nmにより読み取ることで検出した。

FGFR-Fc/FGF2-Flag結合ELISA
抗FGF2 mAbのブロッキング活性は、FGFR-Fc/FGF2-Flag結合ELISAによって、測定した。ELISAウェルは、終夜4℃でヒトIgG-Fcに対して特異的なヤギ抗体2μg/mlを用いてコーティングした。RTで1時間、2% BSAでブロッキング後、ウェルは、0.5μg/mlのFGFR1c-Fc、FGFR2c-Fc、FGFR3c-Fc又はFGFR4-Fcを用いて1時間インキュベートした。洗浄後、ウェルは、様々な濃度のmAbの存在下で１時間、FGF2-Flag(0.2μg/ml)と共にインキュベートした。結合したFGF2-Flagは、HRP抗Flag M2抗体(Sigma)を加えることで検出した。

実施例2：モノクローナル抗体の生成
Balb/cマウス(5-6週齢のメス)は、下表にて説明するように、MPL/TDM (Sigma-Aldrich)中に再懸濁したGST-FGF2、FGF2-Fc及び/又はKLH結合FGF2合成ペプチドを、１週間隔で14回、後部足蹠の注射することで免疫化した。最終的な注射の3日後に、膝窩のリンパ系細胞は、Chuntharapai et al., Methods Enzymol 288:15, 1997に記載されているように、35%のポリエチレングリコールを用いる標準融合法を使用してP3/X63-Ag8U1マウス骨髄腫細胞と融和した。融合の10日後に、ハイブリドーマ培養上清は、上記のFGF2結合ELISAを使用して、FGF2と結合する能力に関してスクリーニングした。選択されたmAbは、それから、FGFR1-Fc/ FGF-Flag結合ELISAにおける活性阻害に関してスクリーニングした。選択されたハイブリドーマは、それから、Harlow et al., 1988に記載されている限界希釈法を使用して、2度クローン化した。

図1から、このようにして作製したmAb GAL-F2は、ヒト及びマウスFGF2の両方と、ほぼ等しく良好に、結合することが示される一方で、ネガティブコントロールのマウスIgG mAbはFGF2と結合しないことが示される。図2から、コントロールmAb 5G8を除くGAL-F2は、4つのFGF受容体FGFR1-4のそれぞれに対してヒトFGF 2の結合を阻害できることが示される。上記のELISA結合FGFR-Fc/FGF2-Flagを使用する他の実験において、GAL-F2 (濃度10μg/ml)は、4つのFGFR(FGFR1、FGFR2、FGFR3及びFGFR4)のそれぞれに対するFGF2の結合を完全に阻害、即ち、実験誤差を含めた背景レベルまでシグナルが減少した一方で、抗FGF2 mAb bFM-1及び3H3は実質的に減少したが、完全ではなかった。

実施例３：GAL-F2のエピトープ
特定の中和活性を有することが報告されている、いくつかの市販の抗FGF2 mAb(3H3(Calbiochem)、mAb bFM-1(Millipore)及びmAb FB-8(Abcam))を購入した。GAL-F2が、これらのmAbのいずれかと同じエピトープを有するかどうか決定するために、競合結合ELISAを実行した。ELISAプレートは、50μl/ウェルのヘパリン(50μg/ml)で、終夜コーティングし、上清を静かに除去し、50μl/ウェルのFGF2で、1時間インキュベートした。2% BSAでブロッキング後、テストされる様々な濃度の各抗FGF2 mAbの存在下において、0.5μg/mlのビオチン化されたGAL-F2 mAbと共にウェルをインキュベートした。各ウェルにおける、FGF2と結合しているビオチン化されたGAL-F2のレベルは、HRP-ストレプトアビジンを添加し、次にTMB基質を添加することで検出した。図3から、mAb 3H3、bFM-1及びFB-8とネガティブコントロールマウスmAb(mIgG)は、FGF2との結合についてGAL-F2と競合しない一方で、当然GAL F2は、それ自体と競合したことが示される。それゆえに、テストした従来の抗FGF2 mAbは、GAL-F2と同じ又は重複した、FGF2上のエピトープを有しない。

実施例４：GAL-F2によるFGF2誘導増殖の抑制
BaF3細胞(DSMZ、Germany)は、10% FCS、10% WEHI-3馴化培地及び抗生物質を補充したRPMI 1640培地(GIBCO)において維持した。安定してFGFR1c又はFGFR2cを発現するBa/F3細胞は、Ornitz et al., 1996に記載されている直鎖状FGFR1c及びFGFR2c発現ベクターDNAを用いた電気穿孔法によって、作製した。安定した形質転換細胞は、10日間G418(600μg/ml)を用いて選択した。FGFR1c又はFGFR2cを発現している安定したBa/F3形質転換体は、WEHI-3培地がない条件において、FGF2に応答して増殖することを示した。GAL-F2 mAbの阻害(中和)活性を決定するために、FGFR1c又はFGFR2cを発現しているBaF3細胞(10,000細胞/ウェル)を、洗浄し、10% FCS、2μg/mlのヘパリン及び20 ng/mlのFGF-2 を含み且つ様々な濃度のGAL-F2が存在しているRPMIに再懸濁した。37℃、5% CO₂、36-48時間のインキュベート後、増殖のレベルは、WST-1 (Roche Applied Science)を添加し、2時間後に測定した。図4は、GAL F2は、FGF2誘導増殖を10 μg/mlのmAbで、ほぼ完全に阻害したことを示す。

通常の上皮細胞上におけるGAL-F2の阻害活性は、Mv 1 Luミンク肺上皮細胞(ATCC由来のCCL-64)を使用して測定した。10% FCSを含むDMEMにおいて生育したMv 1 Lu細胞(2 x 103細胞/100μl/ウェル)を、無血清DMEMにおいて再懸濁した。次に、様々な濃度のmAbの存在下で、背景増殖を阻害する1TGF-β(１ng/ml)と共にFGF2(1-2ng/ml)を用いてMv 1 Lu細胞を24時間刺激した。細胞増殖のレベルは、WST-1 (Roche Applied Science)を添加し、24-48時間後に測定した。図5は、GAL-F2が、1μg/mlのmAbで、Mv 1 Lu細胞のFGF2誘導増殖をほぼ完全に阻害したことを示す。同様の実験において、GAL-F2は、10 ng/mlのFGF2により誘導したHUVECの増殖を、0.1μg/mlの濃度(即ち、FGF2とほぼ等しいモル比)で約75%、そして、1.0μg/mlの濃度で完全に阻害した。これは、bFM-1 抗FGF2 mAbによる阻害の程度よりいくらか良好であり、3H3 抗FGF2 mAbより実質的に良好であった。このことから内皮細胞の増殖は、血管新生における基本的ステップであるため、GAL-F2は血管新生を阻害することが示される。

実施例５：コロニー形成アッセイ
GAL-F2の抗腫瘍活性は、ソフトアガー中におけるヒト腫瘍細胞のコロニー形成に対する効果によって、インビトロで調査した。アッセイは、以下の通り実行した：6ウェルプレートを、1.5 ml/ウェルの0.6%寒天(10% FCS含有DMEM)でコーティングし、1.5 mlの0.3%寒天(10% FCS含有DMEM)を重ねて層とした。寒天層の上層は、10μg/mlのmAbを加えた2 x 10⁴ SMMC-7721ヒト肝臓癌腫瘍細胞と混合した。プレートは、10〜14日間、加湿インキュベータ中において37℃でインキュベートし、0.005%のクリスタルバイオレットで1時間染色し、顕微鏡撮影により検討した。図6から、無関係なコントロールマウスIgG mAbの存在下における細胞と比較して、GAL-F2存在下の細胞がはるかに少ない数のコロニーを形成した一方で、bFM-1抗FGF 2 mAbは、コロニーの数を減らさなかったことが示される。それ故、GAL-F2は、ソフトアガー中におけるヒト腫瘍細胞のコロニー形成を阻害した。

実施例６：血管新生分析
GAL-F2の抗血管新生活性は、30ngのFGF2及び/又は3μgのGAL-F2を含むか又は含まない0.4 mlのマトリゲル(BD Biosciences)を背部に注射したBALB/cマウスにおいて測定した。マトリゲルプラグは、写真撮影のために6日目に回収した。FGF2は、このアッセイにおいて、血管の形成を刺激した一方で、GAL-F2は、この刺激を少なくとも部分的に阻害した。

実施例７：異種移植モデル
異種移植実験は、Kim et al., Nature 362:841, 1993に以前から記載されているように実行する。完全DMEM培地で典型的に生育したヒト腫瘍細胞を、HBSS中に回収する。メスの無胸腺ヌードマウス又はNIH-III Xid/Beige/ヌードマウス(4-6週齢)は、0.1 mlのHBSS中に存在する2-10 x 10⁶細胞を背部領域の皮下に注射する。腫瘍サイズが50-100 mm³に達すると、マウスをランダムにグループ分けをして、5 mg/kgのmAb (総量100μg)を0.1 ml量で週に2回、i.p.で投与する。腫瘍サイズは、［長さ(a)及び幅(b)］の2次元で測定することによって、週2回測定される。腫瘍体積は、V = ab2/2に従って計算され、平均腫瘍体積±SEMとして表される。各処理グループ中のマウスの数は、典型的にはマウス5-7匹である。統計解析は、例えば、スチューデントｔ検定を使用することで実行できる。

図7から、GAL-F2がRPMI 4788結腸腫瘍異種移植片の成長を強く阻害したことが示され、図8から、bFM-1抗FGF2 mAbが異種移植片の成長を阻害した程度はGAL-F2よりも低いことが示される。図９から、GAL-F2がXid/Beige/ヌードマウスにおけるSMMC-7721肝臓癌腫瘍異種移植片を阻害したが、週１回の5 mg/kgの化学療法薬シスプラチンが異種移植片の成長を阻害した程度はそれよりも低いことが示される。GAL-F2及びシスプラチンの組合せは、いずれの薬剤を単独で使用するよりも強く阻害したことから、これらの薬剤の加法的又は相乗的効果を示している。図10から、GAL-F2がアービタックス由来の抗EGF受容体mAb M225より強く、ヌードマウスにおけるHepG2肝臓癌腫瘍異種移植片を阻害したことが示されているが、GAL-F2及びM225の組合せがいずれの薬剤よりもいくらか強く阻害したことから、更にこれらの薬剤の加法的又は相乗的効果を示している。しかしながら、試験した全ての異種移植片の成長をGAL F2が阻害することができなかったのは、おそらく、その成長がFGF2に依存していないためである。

実施例８：GAL-F2のヒト化
GAL-F2 mAbにおける軽鎖及び重鎖可変領域のクローニング、キメラmAbの構築及び発現、並びにヒト化GAL-F2 mAbの設計、構築、発現及び精製は、分子生物学の標準方法(例：L2G7 mAbに関する米国特許出願第11/731,774号(全ての目的は参照によりここに組み込まれる)にて説明)を使用して全て実行した。GAL-F2における(成熟)軽鎖及び重鎖可変(V)領域のアミノ酸配列は、それぞれ図11A及び11Bに示され、上段にGAL-F2が表示される。より詳しくは、ヒト化GAL-F2 mAbを設計するために、Queen et al.(米国特許第5,530,101号及び5,585,089号)の方法に、通常、従った。図11A及び11Bの最下段にそれぞれ示すように、ヒトVκ配列ABA70776及びVH配列AAL04519は、GAL-F2 VL及びVH配列に対するアクセプター配列として機能するためにそれぞれ選択された。理由は、それらが特に高いフレームワーク相同性(即ち、配列同一性)をそれらに対して有するためである。GAL-F2可変ドメインについてコンピューターが生み出した分子モデルは、潜在的にそれらと相互作用するのに十分CDRに近い、GAL-F2フレームワーク中におけるアミノ酸の位置を決めるために用いた。ヒト化GAL-F2軽鎖及び重鎖可変領域を設計するために、マウスGAL-F2 mAb由来のCDRを、初めは概念的に、アクセプターフレームワーク領域に移植した。コンピューターモデルがCDRとの重要な接触を示唆したフレームワーク位置(それはCDRの立体構造を維持するために必要かもしれない)において、マウス抗体由来のアミノ酸を、ヒトフレームワークのアミノ酸で置換した。ヒト化GAL-F2 mAb(HuGAL-F2と表す。)に対しては、カバットナンバリングを使用した、重鎖の残基1、27及び30(残基27及び30はコチア超可変ループH1中に存在する)、48、67、71及び94 で実行され、軽鎖の残基においては実行しなかった。HuGAL-F2における軽鎖及び重鎖V領域の配列は、それぞれ図11A及び11Bに示され、中段にはHuGAL-F2が表示され、それらは、それぞれのGAL-F2ドナー及びヒトアクセプターV領域に対して配置され、CDR(カバットにより定義)には下線が引かれ、上記の置換アミノ酸には二重下線が引かれている。

本発明は、図11に示す軽鎖及び重鎖V領域を含むヒト化GAL-F2 mAb HuGAL-F2だけでなく、異型ヒト化GAL-F2 mAbも提供する。この異型ヒト化GAL-F2 mAbは、通常はフレームワーク(CDRの可能性もある)中での、少数(例：典型的には1、2、3、5、又は10以下)の置換、欠失又は挿入により、軽鎖及び重鎖の可変領域がHuGAL-F2の配列と異なる。特に、上記の置換のサブセットだけを、アクセプターフレームワーク中に作製することができ、又は追加の置換を作製することができる。例えば、マウスGAL-F2 VHアミノ酸69Lをアクセプターアミノ酸69Iで置換してもよく、又はマウスアミノ酸はカバットナンバリングによる位置1、3、60及び／又は67の一部又は全部において、ヒト化軽鎖のそれぞれのアミノ酸を置換してもよい。一方で、VHアミノ酸1E(Glu)は、その代わりにQ(Gln)でもよい。実際、HuGAL-F2のCDRと接触しないフレームワーク残基の多くは、GAL-F2又は他のマウス又はヒト抗体の対応する位置からのアミノ酸の置換に適応することができ、そして、CDRと接触する可能性のある多くの残基でさえも置換を受け入れやすく、又はCDR中のアミノ酸さえ変更可能である。CDR置換の１つの例は、CDR中の残基を、可変領域のフレームワークを供給するために用いるヒトアクセプター配列の対応する位置を占めている残基で置換することである。

ほとんどの場合、異型ヒト化GAL-F2配列においてなされた置換は、置換されたHuGAL-F2アミノ酸に対して保存的である。アミノ酸は、保存的な置換(即ち、グループ内置換)を決定するために以下の通りに分類することができる：グループI(疎水性側鎖)：met、ala、val、leu、ile；グループII(中性の親水性側鎖)：cys、ser、thr；グループIII(酸性側鎖)：asp、glu；グループIV(塩基性側鎖)：asn,、gln、his、lys、arg；グループV(鎖の配向性に影響を及ぼす残基)：gly、pro；グループVI(芳香族側鎖)：trp、tyr、phe。

好ましくは、HuGAL-F2中における置換(保存的であってもなくても)は、結合親和性又はヒト化mAbの有効性、即ち、FGF2の生物活性を中和するその能力に対して実質的な影響を及ぼさない。その能力とは、例えば、異型ヒト化GAL-F2 mAbについての、ここで記載されているアッセイの一部又は全部の有効性は、HuGAL-F2と基本的に(即ち、実験誤差の範囲内で)同じであることである。好ましくは、成熟異型軽鎖及び重鎖V領域の配列は、それぞれ、HuGAL-F2成熟軽鎖及び重鎖V領域と、少なくとも90% 、より好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の同一である。あるいは、GAL-F2の可変領域に対して高い配列同一性を有する他のヒト抗体可変領域も、ヒト化抗体フレームワーク、特にヒトサブグループI由来のカッパーV領域及びヒトサブグループＩ由来の重鎖V領域、又はこれらのサブグループの共通配列を提供するために適している。

他のヒト化抗体において、例示した抗体に関連して言及されるドナー置換に対するアクセプターの位置(即ち、H1、H27、H30、H48、H67、H71及び94)のうち、少なくとも1、2、3、4、5、6又は全7つは、マウスドナー抗体の重鎖の対応する位置を占めている残基によって、好ましくは占められている。重鎖アクセプター配列がAAL04519以外の場合、ドナー置換に対するアクセプターは、特定の位置を占めている残基がアクセプターとドナー間で既に同じことであるか否かに依存して、特定の可変フレームワーク領域の特定の位置が特定の占有であることが必要かもしれないし、必要でないないかもしれない。

ここで述べられる典型的なmAb HuGAL-F2は、例えば、特許出願第11/731,774号に示されるように、ヒトκ及びγ1定常領域を有しており、従って、これはIgG1である。HuGAL-F2の(成熟)軽鎖及び重鎖の完全配列は、図13に示される。このように、典型的なヒト化抗体は、配列番号：７の軽鎖及び配列番号：８の重鎖を有する。これらの配列がそれぞれKm(3)及びG1m(3)のアロタイプである一方で、IgG1 mAbのいずれの(IgG1、κ)アロタイプもHuGAL-F2の表示によって包含されることが理解される。HuGAL-F2が従来の手順により製造される時、軽鎖及び/又は重鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端における1つ又はいくつかのアミノ酸(例：重鎖のC末端リシン)は、ある比率で又は全ての分子において欠落している又は誘導体化される可能性があり、そのような組成物であってもHuGAL-F2の表示によって包含され、ヒト化GAL-F2 mAbと考えられるだろう。ヒト化mAbの他のアイソタイプ(例：IgG2、IgG3及びIgG4)は、HuGAL-F2の可変領域を適切なヒト定常領域と組合せることによって作製することができる。置換をHuGAL-F2定常領域に作製することで、エフェクター機能(例：補体媒介細胞毒性又はADCC(例えば、Winter et al.,米国特許第5,624,821号; Tso et al., 米国特許第5,834,597号; 及びLazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006を参照))を減少又は増加させることが可能であり、また、ヒトにおける半減期を延長(例えば、Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004を参照)することも可能である。具体的には、しかし、限定されるものではないが、IgG定常領域の位置250のGln及び／又は位置428のLeuに対して変異を有するHuGAL-F2は、本発明の実施形態である。

HuGAL-F2の結合親和性をマウス-ヒトキメラmAb ChGAL-F2のそれと比較するために、競争結合実験を、標準ELISA法を用いて実行した。具体的には、ヒトFGF2は、ヘパリンでコーティングしたELISAプレートに固定した。標識していないChGAL-F2、HuGAL-F2又はコントロールヒト抗体hIgGの濃度を増加させた状態で、ビオチン化されたGAL-F2 mAb(0.5μg/ml)と共にウェルをインキュベートした。結合したビオチン化GAL-F2のレベルは、HRPストレプトアビジン及び基質の添加で測定した。図12に示すように、HuGAL-F2とChGAL-F2は、ほぼ等しく良好に競合し、HuGAL-F2がわずかに良好の可能性があることから、HuGAL-F2のFGF2に対する結合親和性は少なくともChGAL-F2と同じ程度であり、従ってオリジナルのマウスGAL-F2 mAbと同程度であることが示されている。標識したmAbの結合を50%まで阻害するのに必要とされるHuGAL-F2の濃度から、FGF2に対するHuGAL-F2の結合親和性Kaが少なくともほぼ10⁹ M^-1であると推定できる。HuGAL-F2は、ここに記載されているFGF2活性に対する生物学的アッセイのいずれで試験してもよく、GAL-F2 mAbと同程度にFGF2活性を阻害するだろう。

本発明が好ましい本実施形態に関して記載されていたにもかかわらず、様々な修正が本発明を逸脱しない範囲でなされることができることを理解すべきである。もし文脈から明らかでなければ、本発明のいかなるステップ、要素、実施形態、特徴又は態様も、他のものと共に使うことができる。登録番号及び同種の引例を含む全ての公開公報、特許及び特許出願は、同じ文脈に対する全ての目的に関して、それら全体を参照することによりここに組込まれ、あたかも、それぞれ個々の公開公報、特許及び特許出願は、全ての目的に関して、その全体を参照することにより組込まれることが、具体的に且つ個々に示される。複数の配列が異なる時間における登録番号と関係している場合、2008年5月29日現在の登録番号に関係する配列が意図される。図中の対応する配列と配列表との間における、いかなる相違が発生する場合であっても、図が支配する。

ブタペスト条約の下、2008年1月8日に、モノクローナル抗体GAL-F2(ATCC番号PTA-8864)を生産しているハイブリドーマは、米国菌培養収集所、私書箱1549、マナッサ、VA 20108に寄託している。この寄託は、公認の寄託機関に保管され、寄託機関が受け取ったサンプルに関する開放の最近の要求後少なくとも5年の期間、寄託日から少なくとも30年の期間、又は関連特許の有効期間の内、いずれか最も長い期間の間は、変異、生存不能、棄損が起きた場合取り替えてもらえるだろう。公開されたこれらの細胞株に関する入手可能性に対するすべての制限は、本願から生じる特許の発行の際に、取り除かれるであろう。

Claims (21)

1. ヒト塩基性線維芽細胞成長因子(FGF2)に結合し、中和するモノクローナル抗体(mAb)であって、遺伝子工学的に操作されたmAb。
2. 前記mAbがキメラmAbである、請求項１記載のmAb。
3. 前記mAbがヒト化mAbである、請求項１記載のmAb。
4. 前記mAbがヒトmAbである、請求項１記載のmAb。
5. 前記mAbが、FGF受容体FGFR1、FGFR2、FGFR3及びFGFR4のそれぞれに対するFGF2の結合を完全に阻害する、請求項１記載のmAb。
6. 前記mAbが、Mv 1 Lu細胞のFGF2誘導増殖を阻害する、請求項１記載のmAb。
7. 前記mAbが、マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片の成長を阻害する、請求項１記載のmAb。
8. 前記mAbが、Fab又はF(ab’)₂断片又は単鎖抗体である、請求項１記載のmAb。
9. 請求項１記載のmAbを含む、医薬組成物。
10. 請求項１記載のmAbを含む医薬組成物を患者に投与することを含む、癌患者の治療方法。
11. FGF2への結合がハイブリドーマPTA-8864により生産される抗体と競合し、免疫原性を減少させたモノクローナル抗体(mAb)。
12. 前記mAbが、マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片の成長を阻害する、請求項１１記載のmAb。
13. 前記mAbが、ヒト化mAb又はヒトmAbである、請求項１１記載のmAb。
14. 請求項１１記載のmAbを含む医薬組成物。
15. 請求項１１記載のmAbを含む医薬組成物を患者に投与することを含む、癌患者の治療方法。
16. 前記癌が肝細胞癌である、請求項１５記載の方法。
17. PTA-8864ハイブリドーマにより生産される、マウス、キメラ又はヒト化型のmAb。
18. 図１１Ａ(GAL-F2) (配列番号：１)の配列由来のCDRを有するヒト化軽鎖及び図１１Ｂ(GAL-F2) (配列番号：４)の配列由来のCDRを有するヒト化重鎖を含むヒト化抗体。
19. カバットナンバリングによる残基H1、H27、H30、H48、H67、H71及びH94は、図１１Ｂ(GAL-F2) (配列番号：４)に示される重鎖の対応する位置を占めている残基によって占められる、請求項１８記載のヒト化抗体。
20. 軽鎖可変領域が、図１１Ａ(HuGAL-F2)(配列番号：２)に示される配列と少なくとも95%の配列同一性を有し、重鎖可変領域が図１１Ｂ(HuGAL-F2) (配列番号：５)に示される配列と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項１８記載のヒト化抗体。
21. 図１１Ａ(HuGAL-F2) (配列番号：２)及び１１Ｂ(HuGAL-F2) (配列番号：５)に示される、3つの軽鎖CDR及び3つの重鎖CDRを含む、請求項１８記載のヒト化抗体。