JP2018533620A - 血管新生因子に対する高力価のモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)およびアンジオポエチン2(Ang−2)に対する中和モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を含む医薬組成物、および患者に該医薬組成物を投与することを含む治療法に関する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2015年9月14日出願の米国仮特許出願第62/218,226号(その内容全体は、引用により本明細書中に包含させる)に基づく優先権の利益を主張する。
本出願は、2015年9月14日出願の米国仮特許出願第62/218,226号(その内容全体は、引用により本明細書中に包含させる)に基づく優先権の利益を主張する。
発明の分野
本発明は、一般的に、モノクローナル抗体(mAb)と新規の生物学的製剤を開発するための組換えDNA技術との組合せに関し、より具体的には、例えば、血管内皮細胞増殖因子またはアンジオポエチン−2に結合してこれを中和するモノクローナル抗体の産生に関する。
本発明は、一般的に、モノクローナル抗体(mAb)と新規の生物学的製剤を開発するための組換えDNA技術との組合せに関し、より具体的には、例えば、血管内皮細胞増殖因子またはアンジオポエチン−2に結合してこれを中和するモノクローナル抗体の産生に関する。
発明の背景
血管形成は、既存の血管から新しい血管を形成するプロセスである。血管形成は、正常な発生および組織再生のためだけでなく、酸素と栄養素を腫瘍に供給するためにサイズが2〜3mmを超える腫瘍の増殖のためにも必要とされる(N. Vasudev et al., Angiogenesis 17:471−494, 2014に概説されている)。従って、血管形成の阻害によって、腫瘍の増殖を抑制し得ることが提唱された(J. Folkman, N Eng J Med 285:1182−1186, 1971)。異常な血管形成はまた、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症および関節リウマチを含む他の病状にも関与している。
血管形成は、既存の血管から新しい血管を形成するプロセスである。血管形成は、正常な発生および組織再生のためだけでなく、酸素と栄養素を腫瘍に供給するためにサイズが2〜3mmを超える腫瘍の増殖のためにも必要とされる(N. Vasudev et al., Angiogenesis 17:471−494, 2014に概説されている)。従って、血管形成の阻害によって、腫瘍の増殖を抑制し得ることが提唱された(J. Folkman, N Eng J Med 285:1182−1186, 1971)。異常な血管形成はまた、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症および関節リウマチを含む他の病状にも関与している。
血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子1および2(FGF1およびFGF2)、血小板由来増殖因子(PDGF)、胎盤増殖因子(PGFまたはPIGF)、インシュリン様増殖因子(IGF)、アンジオポエチン1および2(Ang−1およびAng−2)、ならびに肝細胞増殖因子(HGF)を含む多くの細胞因子が、血管形成を促進する(R. Gacche et al., Prog Biophys Mol Biol 113:333−354, 2013に概説されている)。VEGF−A、VEGF−B、VEGF−CおよびVEGF−Dからなる相同性の増殖因子のVEGFファミリーは、内皮細胞の増殖、遊走および管形成を媒介することにより重要な役割を果たす(T. Veikkola et al., Semin Cancer Biol 9: 211−220, 1999に概説されている)。これらのうち、VEGF−Aは、最もよく研究されており、正常なおよび腫瘍の血管形成において重要な役割を果たす。識別文字のないVEGFは、本明細書中、VEGF−Aを意味する。
VEGF(すなわち、VEGF−A)は、2つの同一の23kDaモノマーからなるホモ二量体糖タンパク質である。VEGF121、VEGF165、VEGF189およびVEGF206を含むヒトVEGFのいくつかの選択的にスプライシングされたイソ型が存在する(N. Ferrara et al. Nature Med 9:669−676, 2003)。これらのうち、VEGF165は最も豊富に存在し、かつ***促進性のイソ型であり、23kDaのサブユニットに相当する。VEGF189およびVEGF206はヘパリンに結合し、それにより、細胞外マトリックスに結合する。VEGF165は、拡散性である(VEGFの構造および生物学については、Q.T. Ho et al., Int J Biochem Cell Biol 39:1349−1357, 2007に概説されている)。VEGFファミリーメンバーは、3つのチロシンキナーゼ型細胞受容体:VEGFR1(Flt−1)、VEGFR2(Flk−1;KDR)およびVEGFR3に結合し、主にVEGFR2を介してVEGF−Aシグナル伝達をもたらし(C. Fontanella et al., Ann Transl Med 2:123, 2014に概説されている)、そのためVEGFR2は本明細書中、VEGFRとも称される。VEGFのVEGFR2への結合は、受容体の二量体化、リン酸化ならびにMEK−MAPおよびPI3K−AKTシグナル伝達の活性化をもたらし、細胞増殖および内皮細胞生存を引き起こす。
VEGFは、腫瘍における血管形成の主要な誘導因子であるため、VEGFの阻害剤は、癌を処置する可能性を有する。ヒトVEGFに対するモノクローナル抗体(mAb)は、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害するのに有効であった(K.J. Kim et al., Nature 362:841−844, 1993)。この抗体のヒト化形態であるベバシズマブ(Avastin(登録商標))は、いくつかの癌種に対して患者の生存率を改善することが一連の臨床治験において示されており(上記の文献、N. Vasudevに概説されている)、種々の他の薬剤と組合せて、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、頚部癌および卵巣癌の種々の癌腫の処置に、およびグリア芽細胞腫の処置に承認されている(Avastin(登録商標)パッケージラベル)。しかしながら、ベバシズマブの無増悪生存期間または全生存期間への利点は、一般的には、通常数か月と非常に短い(R.S. Kerbel, The Breast S3: S56−S60, 2011)。ベバシズマブの改良を試みて、MAb7392(WO 2011/159704)、ヒト化ウサギmAb hEBV321(Y. Yu et al., PLOS ONE 5:e9072、2010;米国特許第7,803,371号;US 2012/0231011)、ヒト化mAb Y0317(Y. Chen et al., J Mol Biol: 293:865−81, 1999)、ならびにヒトmAb B20.4.1およびB20.4.1.1(US 2009/0142343)を含む他の抗VEGF mAbが作製されている。しかしながら、これらのmAbは、販売の承認を受けていない。
サイトカインのアンジオポエチンファミリーは、アンジオポエチン1(Ang−1)、アンジオポエチン2(Ang−2)およびヒトではあまり研究されていないアンジオポエチン4からなる(アンジオポエチンおよびその受容体の構造および機能の総説については、M. Thomas et al. Angiogenesis 12:125−137, 2009 および E. Fagiani et al., Cancer Letters 328: 18−26, 2013を参照のこと)。アンジオポエチンは、70−75kDaの二量体分子量を有する分泌型糖タンパク質であるが、三量体および四量体などの異種多量体も形成する。そのようなオリゴマー化は、受容体の活性化に必要である。アンジオポエチンは、Tie−2チロシンキナーゼ受容体に結合してシグナル伝達を媒介する。Tie−1は、Tie−2とヘテロ二量体を形成し、シグナル伝達を調節することができるオーファン受容体である。一方、Ang−1は、Tie−2を介して陽性のシグナルを伝達するが、Ang−2は、状況に応じてアゴニストであるか、またはアンタゴニストであると報告されている。アンジオポエチンは、複雑な機序で血管系に作用する。Ang−1は、一般的に血管を安定化させて、胚における血管の発生にとって重要であるが、内皮細胞によって放出されるAng−2は、Ang−1に対する競合的アンタゴニストとして作用し得て、それ故に、内皮細胞からの周皮細胞の分離を促進し、血管先端細胞(tip cell)の発芽(sprouting)を促進し、そしてVEGFの存在下で、血管形成を促進する。
Ab536(J. Oliner et al., Cancer Cell 6:507−16, 2004)、MEDI−3617(C.C. Leow et al., Int J Oncol 40:1321−30, 2012、およびA. Buchanan et al., MAbs 5:255−62, 2013)、LC06(M. Thomas et al., PLoS One. 8:e54923, 2013)およびREGN910(C. Daly et al., Cancer Res 73:108−18, 2012)を含む、Ang−2に特異的に結合してこれを中和するいくつかのヒトmAbが、ファージディスプレイまたはトランスジェニックマウスを用いて作製されている。これらのmAbは、Ang−2のTie−2への結合を阻止し、血管形成を阻害し、かつ種々のモデルにおける腫瘍異種移植片の増殖を阻害する。VEGFおよびAng−2の両方に結合する二重特異性抗体も報告されている(Y. Kienast, Clin Cancer Res 19:6730−6740, 2013)。
発明の概要
一態様において、本発明は、本明細書に記載のVE1抗体と同じエピトープを有するヒト血管内皮細胞増殖因子(VEGF)に対する中和モノクローナル抗体(mAb)を提供する。抗体の例は、VE1ならびにVE1の軽鎖可変領域配列由来の3つのCDRを有する軽鎖可変領域およびVE1の重鎖可変領域配列由来の3つのCDRを有する重鎖可変領域を含むmAb、例えばVE1のキメラ形態およびヒト化形態、例えば図3に記載のヒト化軽鎖および重鎖を含むmAbである。mAbは、VEGFの細胞受容体への結合を含む、VEGFの少なくとも1つ、好ましくはいくつかまたはすべての生物学的活性を阻害する。有利には、抗VEGF mAbは、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する。そのようなmAbを含む医薬組成物もまた提供され、ならびに疾患、例えば癌を有する患者にかかる医薬組成物を投与することにより、該患者を処置する方法もまた提供する。
一態様において、本発明は、本明細書に記載のVE1抗体と同じエピトープを有するヒト血管内皮細胞増殖因子(VEGF)に対する中和モノクローナル抗体(mAb)を提供する。抗体の例は、VE1ならびにVE1の軽鎖可変領域配列由来の3つのCDRを有する軽鎖可変領域およびVE1の重鎖可変領域配列由来の3つのCDRを有する重鎖可変領域を含むmAb、例えばVE1のキメラ形態およびヒト化形態、例えば図3に記載のヒト化軽鎖および重鎖を含むmAbである。mAbは、VEGFの細胞受容体への結合を含む、VEGFの少なくとも1つ、好ましくはいくつかまたはすべての生物学的活性を阻害する。有利には、抗VEGF mAbは、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する。そのようなmAbを含む医薬組成物もまた提供され、ならびに疾患、例えば癌を有する患者にかかる医薬組成物を投与することにより、該患者を処置する方法もまた提供する。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載のA2T抗体と同じエピトープを有するヒトアンジオポエチン2(Ang−2)に対する中和モノクローナル抗体(mAb)を提供する。抗体の例は、A2TならびにA2Tの軽鎖可変領域配列由来の3つのCDRを有する軽鎖可変領域およびA2Tの重鎖可変領域配列由来の3つのCDRを有する重鎖可変領域を含むmAb、例えば、A2Tのキメラ形態およびヒト化形態、例えば図13に記載のヒト化軽鎖および重鎖を含むmAbである。mAbは、Ang−2のその細胞受容体への結合および血管形成の刺激を含む、Ang−2の少なくとも1つ、好ましくはいくつかまたはすべての生物学的活性を阻害する。そのようなmAbを含む医薬組成物もまた提供され、ならびに疾患、例えば癌を有する患者にかかる医薬組成物を投与することにより、該患者を処置する方法もまた提供する。
上記の抗体の何れかに由来する1以上のドメインを、別の標的を有する異なる抗体由来の1以上の結合ドメインと共に組み込んだ二重特異性抗体もまた、提供する。好ましい態様において、他の標的は、ヒト肝細胞増殖因子(HGF)であり、異なる抗体は、HuL2G7であり得るか、または他の標的は、ヒトFGF2であり、異なる抗体は、ヒト化GAL−F2 mAbであり得る。例示的態様において、1以上の結合ドメインは、ヒト化VE1 mAb由来であり、1以上の結合ドメインは、Ang−2に対するヒト化またはヒトmAb、例えばヒト化A2T mAbである。多くの場合、二重特異性抗体は、VEGFに結合する第1の結合ドメインおよびHGFまたはFGF2またはAng−2に結合する第2の結合ドメインをそれぞれ含む、モノマーのホモダイマーである。
発明の実施態様の詳しい説明
1.抗体
本明細書で用いる、“抗体”は、抗原に結合することができる1以上のドメインを含むタンパク質を意味し、ここで、かかるドメインは、天然抗体の可変ドメインに由来するか、またはそれに相同である。モノクローナル抗体(“mAb”)は、異なる抗体の混合物とは異なり、極めて特異的な抗体種である。本明細書に記載の抗体は、一般的に、他にこれと異なる記載がなされない限り、モノクローナルである。抗体の“抗原”とは、抗体が特異的に結合する化合物を意味し、一般的にはポリペプチドであるが、小ペプチドまたは小分子ハプテンまたは炭水化物または他の部類であってもよい。抗体の例には、天然の完全長四量体抗体;Fv、Fab、Fab’および(Fab’)2などの抗体フラグメント;一本鎖(scFv)抗体(Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879, 1988;Bird et al., Science 242:423, 1988);単一アーム抗体(Nguyen et al., Cancer Gene Ther 10:840, 2003);ならびに、二重特異性抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体が含まれ、これらの用語は以下にさらに説明される。抗体は、ニワトリ、げっ歯動物(例えば、マウス、ラットおよびハムスター)、ウサギ、霊長動物およびヒトを含む全ての脊椎動物に由来し得る。定常ドメインを含む抗体は、公知のイソ型IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEならびにそれらのサブタイプ、すなわち、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4およびマウスIgG1、IgG2a、IgG2bおよびIgG3、ならびにそれらのアロタイプおよび同型アロタイプ(isoallotype)(アロタイプおよび同型アロタイプにおける多型位置(polymorphic position)を占める残基の組み合わせを含む)であり得る。抗体は、キメライソ型であってもよく、すなわち、その定常(C)領域の1以上が異なるイソ型由来の領域、例えばγ−1 CH1領域とヒンジ領域、γ−2、γ−3および/またはγ−4遺伝子由来のCH2および/またはCH3ドメインを含んでいてよい。抗体はまた、補体媒介性細胞傷害またはADCCのようなエフェクター機能を低下または増加させる定常領域内の置換(例えば、Winterらの、米国特許第5,624,821号;Tsoらの、米国特許第5,834,597号;ならびに、Lazar et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:4005, 2006を参照のこと)、またはヒトにおける半減期を延長することができる定常領域内の置換(例えば、Hinton et al., J Biol Chem 279:6213, 2004を参照のこと)を含み得る。
1.抗体
本明細書で用いる、“抗体”は、抗原に結合することができる1以上のドメインを含むタンパク質を意味し、ここで、かかるドメインは、天然抗体の可変ドメインに由来するか、またはそれに相同である。モノクローナル抗体(“mAb”)は、異なる抗体の混合物とは異なり、極めて特異的な抗体種である。本明細書に記載の抗体は、一般的に、他にこれと異なる記載がなされない限り、モノクローナルである。抗体の“抗原”とは、抗体が特異的に結合する化合物を意味し、一般的にはポリペプチドであるが、小ペプチドまたは小分子ハプテンまたは炭水化物または他の部類であってもよい。抗体の例には、天然の完全長四量体抗体;Fv、Fab、Fab’および(Fab’)2などの抗体フラグメント;一本鎖(scFv)抗体(Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879, 1988;Bird et al., Science 242:423, 1988);単一アーム抗体(Nguyen et al., Cancer Gene Ther 10:840, 2003);ならびに、二重特異性抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体が含まれ、これらの用語は以下にさらに説明される。抗体は、ニワトリ、げっ歯動物(例えば、マウス、ラットおよびハムスター)、ウサギ、霊長動物およびヒトを含む全ての脊椎動物に由来し得る。定常ドメインを含む抗体は、公知のイソ型IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEならびにそれらのサブタイプ、すなわち、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4およびマウスIgG1、IgG2a、IgG2bおよびIgG3、ならびにそれらのアロタイプおよび同型アロタイプ(isoallotype)(アロタイプおよび同型アロタイプにおける多型位置(polymorphic position)を占める残基の組み合わせを含む)であり得る。抗体は、キメライソ型であってもよく、すなわち、その定常(C)領域の1以上が異なるイソ型由来の領域、例えばγ−1 CH1領域とヒンジ領域、γ−2、γ−3および/またはγ−4遺伝子由来のCH2および/またはCH3ドメインを含んでいてよい。抗体はまた、補体媒介性細胞傷害またはADCCのようなエフェクター機能を低下または増加させる定常領域内の置換(例えば、Winterらの、米国特許第5,624,821号;Tsoらの、米国特許第5,834,597号;ならびに、Lazar et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:4005, 2006を参照のこと)、またはヒトにおける半減期を延長することができる定常領域内の置換(例えば、Hinton et al., J Biol Chem 279:6213, 2004を参照のこと)を含み得る。
天然の抗体分子は、一般的に、1つの重鎖と対形成した1つの軽鎖をそれぞれ含む2つの同一のヘテロ二量体からなる四量体である。各軽鎖および重鎖は、可変領域(VLまたはVH、または単にV)とそれに続く定常領域(CLまたはCH、または単にC)からなる。CH領域自体は、CH1領域、ヒンジ(H)領域、CH2領域およびCH3領域を含む。3次元(3D)空間では、VLおよびVH領域は、共に折り畳まられてVドメインを形成し、それは、抗原に結合するため、結合ドメインとしても知られている。CL領域は、CH1領域と共に折り畳まれ、軽鎖VL−CLおよび重鎖のVH−CH1領域が合して、Fabとして知られる抗体の一部分を形成する:従って、天然の“Y字型”抗体は、各ヘテロ二量体に由来する、2つのFabを含み、Y字型のアームを形成する。1つのヘテロ二量体のCH2領域は、他のヘテロ二量体のCH2領域の反対側に位置し、それぞれのCH3領域は、互いに折り畳まれ、抗体の単一のFcドメインを共に形成して(Yの塩基)、それは、免疫系の他の成分と相互作用する。
各軽鎖または重鎖可変領域内には、相補性決定領域(“CDR”)と呼ばれる3つの短いセグメント(平均約10アミノ酸長)が存在する。抗体可変ドメイン中の6つのCDR(軽鎖由来の3つおよび重鎖由来の3つ)は、3D空間で共に折り畳まれて、標的抗原上に固定される実際の抗体結合部位を形成する。CDRの位置および長さは、Kabat, Eらの、Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983−87により正確に定義されている。CDRに含まれない可変領域のの部分は、フレームワークと呼ばれ、それは、CDRのための環境を形成する。Chothia et al., J Mol Biol 196:901, 1987には、構造によって決定される超可変領域またはループの関連する概念が定義されている。
本明細書で用いる、“遺伝子操作された”mAbは、遺伝子が、組換えDNA技術の使用により構築されたか、または非天然環境に置かれた(例えば、マウス中またはヒトバクテリオファージ上のヒト遺伝子)抗体であり、従って、下記のキメラ抗体およびヒト化抗体が含まれるが、常套のハイブリドーマ技術で作製されたマウスまたは他のげっ歯動物のmAbを包含しない。キメラ抗体(または各々、キメラ抗体軽鎖または重鎖)は、マウス(または他の非ヒト種)抗体(または各々、抗体軽鎖または重鎖)の可変領域がヒト抗体の定常領域と組み合わされている、抗体(または各々、抗体軽鎖または重鎖)である。遺伝子工学によるそれらの構築は、よく知られている。かかる抗体は、マウス抗体の結合特異性を保持しているが、それはヒトの約3分の2である。
ヒト化抗体は、一般的に、非ヒト“ドナー”抗体(例えば、ニワトリ、マウス、ラット、ウサギまたはハムスター)由来のCDRが、ヒト“アクセプター”抗体配列中に移植されている遺伝子操作された抗体であり、該ヒト化抗体は、ドナー抗体の結合特異性を保持している(例えば、Queenの、米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号;Winterの、米国特許第5,225,539号;Carterの、米国特許第6,407,213;Adairの、米国特許第5,859,205号、同第6,881,557号;Footeの、米国特許第6,881,557号を参照のこと)。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、生殖系列のヒト抗体配列、またはそのような配列の2以上の複合体であり得る。従って、ヒト化抗体は、ドナー抗体に完全にまたは実質的に由来する一部または全てのCDR、ならびに、存在する場合、ヒト抗体配列に完全にまたは実質的に由来する可変領域フレームワーク配列および定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化軽鎖(各々、重鎖)は、ドナー抗体軽鎖(各々、重鎖)に完全にまたは実質的に由来する少なくとも1つ、2つおよび通常は3つのCDR、ならびに存在する場合、ヒト軽鎖(各々、重鎖)アクセプター鎖に実質的に由来する軽鎖(各々、重鎖)可変領域フレームワークおよび軽鎖(各々、重鎖)定常領域を有する。ヒト化抗体は、一般的に、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体中のCDRは、対応するアミノ酸(Kabatにより定義されている)の少なくとも85%、90%、95%または100%が、それぞれのCDR間で同一であるとき、非ヒト抗体中の対応するCDRに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワークまたは定常領域は、対応するアミノ酸(Kabatにより定義されている)の少なくとも85%、90%、95%または100%が同一であるとき、ヒト可変領域またはヒト定常領域にそれぞれ実質的に由来する。
本明細書中、本出願の他の箇所と同様に、パーセント配列同一性は、Kabatの番号付け規則(CH領域のEuインデックス)により最大アライメントされた抗体配列を用いて決定される。アライメント後、対象抗体領域(例えば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体)が対照抗体の同じ領域と比較されるとき、該対象抗体領域と対照抗体領域間のパーセント配列同一性は、対象抗体領域および対照抗体領域の両方において同じアミノ酸が占める位置の数を、2つの領域の整列させた位置の総数(ギャップは数えない)で割り、100を掛けて、パーセンテージに換算したものである。
ヒト化抗体における高い結合親和性を保持するために、2つのさらなる構造要素の少なくとも1つを用いることができる。ヒト化抗体の構築のための詳細な説明を提供する、米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号(引用により本明細書中に包含させる)を参照のこと。第一の構造要素において、アクセプターまたはヒト化抗体の重鎖可変領域のフレームワークは、多くの公知のヒト抗体の中からアクセプター抗体重鎖を好適に選択することにより、ドナー抗体の重鎖可変領域のフレームワークと高い配列同一性(65%から95%の同一性)を有するように選択される。第2の構造要素において、ヒト化抗体を構築する際に、特定の規則に従って、ヒトアクセプター抗体のフレームワーク内(CDRの外側)の選択されたアミノ酸を、ドナー抗体由来の対応するアミノ酸で置換する。具体的には、フレームワークにおいて置換されるアミノ酸は、CDRと相互作用するそれらの能力に基づいて選択される。例えば、置換されたアミノ酸は、3次元空間で測定される通り、ドナー抗体配列中のCDRに隣接していてよいか、またはヒト化抗体中のCDRの4〜6オングストローム以内であってもよい。
ヒト化抗体を設計するための他のアプローチ、例えば、“superhumanization”(Tan et al. J Immunol 169:1119, 2002および米国特許第6,881,557号参照)またはStudnicak et al., Protein Eng 7:805, 1994に記載の方法もまた、上記の米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号に記載の方法と同じ結果を得るために用いられ得る。さらに、遺伝子操作された、免疫原性の低下したmAbを産生するための他のアプローチには、“再形成(reshaping)”、“超キメラ化(hyperchimerization)”および“ベニヤリング(veneering)/表面再構成(resurfacing)”が挙げられ、例えば、Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma and Immunology 81:105, 1998;Roguska et al. Protein Eng 9:895, 1996;および、米国特許第6,072,035号および同第5,639,641号に記載されている。ベニヤリング(Veneered)された抗体は、B細胞またはT細胞エピトープに寄与し得る非ヒトドナー抗体の可変領域フレームワーク中の特定のアミノ酸、例えば露出した残基を置換することにより、よりヒト様に作製される(Padlan, Mol Immunol 28:489, 1991)。遺伝子組み換え抗体の他のタイプには、ファージディスプレイ法(Dower et al., WO91/17271;McCafferty et al., WO92/001047; Winter、WO92/20791;および、Winter, FEBS Lett 23:92, 1998(各々、引用により本明細書中に包含させる))を用いて、またはトランスジェニック動物(Lonberg et al., WO93/12227;Kucherlapati WO91/10741(各々、引用により本明細書中に包含させる))を用いることにより作製されたヒト抗体が含まれる。
用語“抗体”または“mAb”には二重特異性抗体も含まれる。“二重特異性抗体”とは、第1の抗原に結合する第1のドメインおよび第2の抗原に結合する第2の(異なる)ドメインを含む抗体であり、ここで、該第1および第2のドメインは、天然抗体の可変ドメインに由来するか、またはそれに相同である。第1の抗原および第2の抗原は、同じ抗原であってもよく、その場合、第1および第2のドメインは、抗原上の異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体なる用語は、第1および第2のドメインに加えて、抗原に結合する1以上の他のドメインを含み、天然抗体の可変ドメインに由来するか、またはそれに相同である、多重特異的抗体を包含する。二重特異性抗体なる用語はまた、天然抗体の可変ドメインに由来するか、またはそれに相同である第1の結合ドメイン、ならびに別のタイプのタンパク質に由来する第2の結合ドメイン、例えば受容体の細胞外ドメイン(“二重特異性抗体−イムノアドヘシン”)を含む抗体を包含する。
二重特異性抗体は、種々の形態で産生されており(例えば、Kontermann, MAbs 4:182−197, 2012およびその引用文献を参照のこと)、例えば一本鎖可変フラグメント(scFv)、Fab−scFv、およびscFv−scFv融合タンパク質(Coloma et al., Nat Biotechnol 15:125−6, 1997;Lu et al., J Immunol Methods 267:213−26, 2002;Mallender, J Biol Chem 269:199−206, 1994)、Bs(scFv)4−IgG(Zuo et al., Protein Eng 13: 361−367, 2000)、二重可変ドメイン抗体(Wu et al., Nat Biotechnol 25:1290−7, 2007)および二重特異性抗体(Holliger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:6444−8, 1993)である。二重特異性F(ab’)2抗体フラグメントは、化学的結合により(Brennan et al., Science 229:81, 1985)またはロイシンジッパーを用いて(Kostelny et al., J Immunol 148:1547−53, 1992)、産生されている。異なるV領域を有する各重鎖−軽鎖対を有するより自然に形成された二重特異性抗体を、例えば、別々に産生された2つの重鎖−軽鎖対を化学的に架橋することにより作製することができる(Karpovsky et al., J Exp Med 160:1686−701, 1984)。自然に形成された二重特異性抗体はまた、2つのハイブリドーマ細胞株を融合させるか(“quadroma”; Milstein et al., Nature 305: 537−40)またはトランスフェクションによって作製された、単一の細胞中に必要な重鎖および軽鎖の両方を発現させることによっても産生される。所望の二重特異性抗体を形成するために細胞中で発現された正しい軽鎖および重鎖の会合は、“knobs−into−holes”技術(Ridgway et al., Protein Eng 9:617−21, 1996; Atwell et al., J Mol Biol 270:26−35, 1997;および、米国特許第7,695,936号)を用いて促進され得る。要すれば、1つの軽鎖−重鎖対の抗原結合フラグメント(Fab)内の重鎖および軽鎖ドメインの交換または“交差”により、“CrossMabs”と呼ばれる二重特異性抗体が得られる(Schaefer et al., Proc Natl Acad Sci USA 108:11187−92, 2011;WO 2009/080251;WO 2009/080252;WO 2009/080253)。
抗体は、抗原に結合しない無関係の抗体よりも顕著に優位な程度で結合する場合に、該抗原に“特異的”に結合すると言われ、従って、一般的に、抗原に対して、少なくとも約106の結合親和性(Ka)、好ましくは107、108、109または1010M−1のKaを有する。一般的に、抗体が抗原に結合すると言われるとき、特異的結合が意味される。抗体が抗原に結合しないと言われる場合、それは、結合を示す何らかのシグナルが、無関係な対照抗体のシグナルと実験誤差内で区別できないことを意味する。mAbのエピトープは、mAbが結合するその抗原の領域である。2つの抗体は、それぞれが抗原への他方の結合を競合的に阻害するとき、同じかまたは重複するエピトープに結合すると判断される。競合的に結合を阻害するということは、競合的結合アッセイで測定したとき、一方の抗体の1倍または5倍過剰量が、他方の結合を少なくとも50%、好ましくは75%阻害することを意味するか、または一方の抗体の10倍、20倍または100倍過剰量が、他方の結合を少なくとも75%、好ましくは90%、さらには95%または99%阻害することを意味する(例えば、Junghans et al., Cancer Res 50:1495, 1990を参照のこと)。あるmAb(第2のmAb)は、(別のmAb(第1のmAb)の)結合を阻害する第2のmAbの阻害濃度50(IC50)が、競合的結合アッセイにおいて、同程度である、すなわち、それ自体の結合を阻害する第1のmAbのIC50の2倍または3倍以内であるとき、抗原と該別の抗体(第1のmAb)との結合について“完全”に競合すると言われる。第2のmAbは、(第1のmAbの)結合を阻害する第2のmAbのIC50が、実質的に高い、例えば、結合を阻害する第1のmAbのIC50の3倍または5倍または10倍を超えるとき、抗原と該第1のmAbとの結合について“部分的”に競合すると言われる。一般的に、2つのmAbは、それぞれが、抗原と他方との結合について完全に競合するとき、抗原上に同じエピトープを有し、少なくとも一方のmAbが、他方のmAbとの結合について部分的に競合するとき、重複するエピトープを有する。あるいは、2つの抗体は、一方の抗体の結合を減少または排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸変異が、他方の結合を減少または排除するとき、同じエピトープを有するが、一方で、2つの抗体は、一方の抗体の結合を減少または排除する全部ではない幾つかのアミノ酸変異が、他方の結合を減少または排除するとき、重複するエピトープを有する。
2.抗VEGF抗体および抗Ang−2抗体
VEGF、Ang−2、HGFおよびFGF2のような本明細書に記載の増殖因子または受容体に言及するとき、他にこれと異なる記載がなされない限り、該増殖因子または受容体のヒト形態が意味される。
VEGF、Ang−2、HGFおよびFGF2のような本明細書に記載の増殖因子または受容体に言及するとき、他にこれと異なる記載がなされない限り、該増殖因子または受容体のヒト形態が意味される。
VEGFに結合するモノクローナル抗体、すなわち、抗VEGF mAb(または、各々、Ang−2に結合するmAb、すなわち、抗Ang−2 mAb)は、結合がVEGF(各々、Ang−2)の1以上の生物学的活性を部分的または完全に阻害するとき、すなわち、mAbが単一の薬剤として使用されるとき、VEGF(各々、Ang−2)を中和する、または中和抗体であると言われる。中和抗体が阻害し得るVEGFの生物学的特性には、VEGFの、その細胞受容体に結合する能力、その受容体のリン酸化を誘導する能力、およびヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)の増殖誘導または血管形成を誘導する能力がある。中和抗体が阻害し得るAng−2の生物学的特性には、Ang−2の、その細胞受容体に結合する能力、その受容体のリン酸化を誘導する能力、および血管形成を誘導する能力がある。例えば、0.01、0.1、0.5、1、2、5、10、20または50μg/mlの濃度の本発明の中和mAbは、以下の実施例に記載のまたは当技術分野で公知の方法によりアッセイして、VEGF(各々、Ang−2)の生物学的機能を、少なくとも約50%阻害する、好ましくは75%、より好ましくは、90%または95%、さらには99%、最も好ましくはおよそ100%(本質的に完全に)阻害する。一般的に、使用されるVEGF(各々、Ang−2)の量が、生物学的活性を完全に刺激するのに十分であるか、または0.05、0.1、0.5、1、3もしくは10μg/mlであるとき、阻害の程度が測定される。好ましくは、mAbは、上記に列記した生物学的活性の、1つではなく、2、3またはいくつかを中和する;本明細書に記載の目的のために、単一の薬剤として使用されるmAbは、VEGF(各々、Ang−2)の全ての生物活性を中和し、これは“完全に中和する”と呼ばれ、このようなmAbが最も好ましい。
本発明の抗VEGF mAbは、好ましくはVEGF(すなわち、VEGF−A)に特異的であり、すなわち、それらは、VEGF−B、VEGF−CおよびVEGF−DなどのVEGF、ならびに他の血管新生因子、例えばHGFおよびFGF2に関連するタンパク質に(特異的に)結合しないか、またははるかに低い程度(例えば10倍未満)でしか結合しない。同様に、本発明の抗Ang−2 mAbは、好ましくはAng−2に特異的であり、すなわち、それらは、Ang−1およびAng−4などのAng−2、ならびにHGFおよびFGF2などの他の血管新生因子に関連するタンパク質に、(特異的に)結合しないか、またははるかに低い程度(例えば10倍未満)でしか結合しない。本発明のmAbは、一般的に、それらの特異的標的に対して、少なくとも107M−1、好ましくは108M−1またはそれ以上、最も好ましくは109M−1またはそれ以上、さらには1010M−1またはそれ以上の結合親和性(Ka)を有する。抗VEGF mAbは、ヒトVEGFに結合し、抗Ang−2 mAbは、ヒトAng−2に結合するが、有利には、他の種、例えばマウスまたはカニクイザルなどの非ヒト哺乳動物由来のVEGF(各々、Ang−2)にも、ヒトVEGF(各々、ヒトAng−2)に対する結合親和性と同様の(例えば10倍以内の)結合親和性で結合する。本発明のmAbには、VEGFまたはAng−2に結合する結合ドメインを有する二重特異性抗体を含む、上記の抗体の種々の形態の全てが含まれる。ヒトVEGFの配列は、Swiss−Prot P15692に提供されており、最初の26塩基は、成熟VEGF−Aにおいて除去されたシグナルペプチドである。
本明細書に記載の抗VEGF mAb VE1は、本発明の一例である。VE1と同じか、または重複するエピトープを有する中和mAbは、他の例を提供する。HuVE1などのVE1のキメラ、ヒト化またはヒト形態、例えばキメラまたはヒト化形態である中和抗VEGF mAbは、とりわけ好ましい態様である。他の好ましい態様において、mAbは、上記の特性(例えば、VEGFを中和する)の1以上を有する本発明の抗VEGF mAb(例えば、VE1またはVE1のヒト化形態)由来の1以上の結合ドメイン、ならびに要すればHGF(例えば、米国特許第7,220,410号および同第7,632,926号)に記載の、L2G7 mAbまたはHuL2G7などのそのヒト化形態)またはFGF2(例えば、米国特許第8,101,725号に記載の、GAL−F2 mAbまたはそのヒト化形態)に結合し、かつそれを中和するmAb由来の第2の結合ドメインを含む、二重特異性抗体である。最も好ましくは、抗VEGF mAbは、実施例に記載の何れかのアッセイにより、または当技術分野で公知の他のアッセイにより評価される通り、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する。個々にまたは集合的に、アミノ酸配列が、VE1のCDRと少なくとも90%、95%または98%同一であるか、または完全に同一であり、その機能的特性を維持するCDRを有するmAb、または、少数の機能的に重要でないアミノ酸置換(例えば、以下に定義されるような、保存的置換)、欠失、または挿入によりVE1とは異なるmAbもまた、本発明に包含される。
本明細書に記載の抗Ang−2 mAb A2TおよびA2Bもまた、本発明の例である。A2TまたはA2Bのいずれかと同じか、または重複するエピトープを有する中和mAbは、他の例を提供する。キメラ、ヒト化またはヒト形態、例えば、HuA2TなどのA2TまたはA2Bのキメラまたはヒト化形態である中和抗Ang−2 mAbは、とりわけ好ましい態様である。特定の態様において、mAbは、上記の特性の1以上(例えば、Ang−2の中和)を有する本発明の抗Ang−2 mAb(例えば、A2TまたはA2Bまたはそれらのヒト化形態)由来の1以上の結合ドメイン、ならびに上記の抗HGFおよび抗FGF2 mAbなどの別のmAb由来の第2の結合ドメインを含む、二重特異性抗体である。理想的には、抗Ang−2 mAbは、実施例に記載の何れかのアッセイまたは当技術分野で公知の他のアッセイにより評価される通り、マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する。個々にまたは集合的に、アミノ酸配列が、A2TまたはA2BのCDRと少なくとも90%、95%または98%同一であるか、または完全に同一であり、その機能的特性を維持するCDRを有するmAb、または、少数の機能的に重要でないアミノ酸置換(例えば、以下に定義されるような、保存的置換)、欠失、または挿入によりA2TまたはA2Bとは異なるmAbもまた、本発明に包含される。
一旦、本明細書に記載の所望の特性を有する単一の典型的な抗VEGFまたは抗Ang−2 mAb、例えばVE1またはA2Tがそれぞれ単離されると、VEGFとの結合についてVE1と競合するmAb、および/またはVE1と同じエピトープを有するmAbを含む、当技術分野で公知の方法により同様の特性を有する他のmAbを作製することは容易である。例えば、マウスをVEGFで免疫化することができ、ハイブリドーマを産生し、得られたmAbを、VEGFへの結合についてVE1と競合する能力についてスクリーニングする。マウスは、VE1が結合するエピトープを含むVEGFのより小さいフラグメントで免疫化されてもよい。エピトープは、例えば、VEGFの配列に至る一連の重複ペプチドへの結合についてスクリーニングすることにより、特定され得る。これらの方法で作製されたマウスmAbは、その後、ヒト化され得る。あるいは、Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994(引用により本明細書中に包含させる)に記載の方法を用いて、mVE1と同じエピトープを有し、そのため同様の特性を有するmAbの選択を導くことができる。ファージディスプレイを用いて、まずVE1の重鎖をVEGF結合mAbを選択するために、(好ましくは、ヒト)軽鎖のレパートリーと対合させ、次いで、新しい軽鎖を、VE1と同じエピトープを有する(好ましくはヒト)VEGF結合mAbを選択するために、(好ましくはヒト)重鎖のレパートリーを対合させる。あるいは、VE1の変異体は、VE1の重鎖および軽鎖をコードするcDNAの突然変異誘発により得られ得る。Ang−2への結合についてA2TもしくはA2Bと競合し、および/またはA2TもしくはA2Bと同じエピトープを有するmAbを開発するために、同じ方法を適用してもよい。
HuVE1のような本発明の好ましい抗VEGF mAbは、ベバシズマブとは異なるエピトープに結合する、すなわちベバシズマブのエピトープと同一ではないエピトープに結合するが、該エピトープは、該抗体が、VEGFへの結合についてベバシズマブと競合するように重複してよい。具体的には、VEGFへのベバシズマブの結合を実質的に損なうVEGFにおける1または複数のアミノ酸置換は、本発明のmAbについて、結合を損なわないか、または同程度に損なうことができ、またその逆もある。本発明の好ましい抗体は、VEGF対して、ベバシズマブよりも、少なくとも2倍、より好ましくは3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、さらには10倍高い結合親和性を有する。同様に、本発明の好ましい抗体は、一般的に、好ましい抗体による阻害についてのIC50に対するベバシツマブによる阻害の阻害濃度−50%(IC50)の比によって測定される通り、VEGFR2へのVEGFの結合を、ベバシズマブよりも、少なくとも2倍、より好ましくは3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、さらには10倍強く阻害する。
遺伝的に操作されたmAb、例えば、キメラまたはヒト化または二重特異性mAbは、当技術分野で公知の種々の方法により発現され得る。例えば、それらの軽鎖および重鎖V領域をコードする遺伝子は、重複オリゴヌクレオチドから合成され、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリA部位などの必要な調節領域を提供する発現ベクター(例えば、Invitrogenから市販されている)中に利用可能なC領域と共に挿入されてよい。CMVプロモーター−エンハンサーの使用が好ましい。その後、発現ベクターは、リポフェクションまたはエレクトロポレーションのような種々の周知の方法を用いて、CHOまたはSp2/0およびNS0を含む非生産性骨髄腫細胞のような多様な哺乳動物細胞株に形質移入(transfection)することができ、抗体を発現する細胞は、適当な抗生物質による選別によって選択される。例えば、米国特許第5,530,101号を参照のこと。市販のバイオリアクターで細胞を増殖させることにより、より大量の抗体を産生することができる。
一旦発現されると、二重特異性mAbを含む本発明のmAbは、精密濾過、限外濾過、プロテインAもしくはG親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および/または有機染料に基づく他の形態の親和性クロマトグラフィーなどのような、当技術分野の標準的技術により精製することができる。薬学的用途のためには、少なくとも約90%または95%の均質性を有する実質的に純粋な抗体が好ましく、98%または99%、あるいはそれ以上の均質性のあるものがより好ましい。mAbが従来の方法で製造されるとき、重鎖のC末端リシンのような、軽鎖および/または重鎖のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の1から数個のアミノ酸が欠損している可能性があるか、または分子の一部分もしくは全部で誘導体化されていてよく、このような組成物はなお同じmAbであると考えられる。
3.二重特異性抗体
上記のmAb、好ましくはVE1もしくはA2TもしくはA2B、またはVE1もしくはA2TもしくはA2Bと同じエピトープを有するmAbに由来する結合ドメインを含むか、またはHuVE1もしくはHuA2TなどのVE1もしくはA2TもしくはA2Bのヒト化形態を含むVE1もしくはA2TもしくはA2B由来のCDRを有する、二重特異性抗体は、本発明に包含される。そのような二重特異性抗体の第2の結合ドメインは、例えば、上皮細胞増殖因子(EGF)などの別の増殖因子、FGF2、肝細胞増殖因子(HGF)、腫瘍壊死因子(TNF)などの何れかの線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β1、TGF−β2またはTGF−β3)、血小板由来増殖因子(PDGF)またはニューレグリンまたはヘレグリンの何れかの形態、およびアンジオポエチン1または2、あるいはこれらの増殖因子の任意の受容体の任意の細胞外ドメインに結合し得る。好ましくは、第2の結合ドメインは、ヒト化またはヒトmAb由来である。これらの増殖因子または受容体のヒト形態への結合が好ましい。これらの増殖因子および受容体の例示的な配列は、例えば、Swiss−Protデータベースから容易に入手可能である。米国特許第8,101,725号(全ての目的のために、引用により本明細書中に包含させる)に記載の抗HGF mAb HuL2G7の結合(可変)ドメイン、またはそのCDRの1以上を含む結合ドメイン、例えば抗FGF2 mAb GAL−F2のヒト化形態の結合ドメイン(米国特許第8,101,725号の図11に示される配列)は、とりわけ好ましい。特に好ましい態様において、一方の結合ドメインは、HuVE1などの本明細書に記載のVEGF mAbの何れか由来であり、第2の結合ドメインは、HuA2Tなどの本明細書に記載の抗Ang2 mAbのいずれか由来である。
上記のmAb、好ましくはVE1もしくはA2TもしくはA2B、またはVE1もしくはA2TもしくはA2Bと同じエピトープを有するmAbに由来する結合ドメインを含むか、またはHuVE1もしくはHuA2TなどのVE1もしくはA2TもしくはA2Bのヒト化形態を含むVE1もしくはA2TもしくはA2B由来のCDRを有する、二重特異性抗体は、本発明に包含される。そのような二重特異性抗体の第2の結合ドメインは、例えば、上皮細胞増殖因子(EGF)などの別の増殖因子、FGF2、肝細胞増殖因子(HGF)、腫瘍壊死因子(TNF)などの何れかの線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β1、TGF−β2またはTGF−β3)、血小板由来増殖因子(PDGF)またはニューレグリンまたはヘレグリンの何れかの形態、およびアンジオポエチン1または2、あるいはこれらの増殖因子の任意の受容体の任意の細胞外ドメインに結合し得る。好ましくは、第2の結合ドメインは、ヒト化またはヒトmAb由来である。これらの増殖因子または受容体のヒト形態への結合が好ましい。これらの増殖因子および受容体の例示的な配列は、例えば、Swiss−Protデータベースから容易に入手可能である。米国特許第8,101,725号(全ての目的のために、引用により本明細書中に包含させる)に記載の抗HGF mAb HuL2G7の結合(可変)ドメイン、またはそのCDRの1以上を含む結合ドメイン、例えば抗FGF2 mAb GAL−F2のヒト化形態の結合ドメイン(米国特許第8,101,725号の図11に示される配列)は、とりわけ好ましい。特に好ましい態様において、一方の結合ドメインは、HuVE1などの本明細書に記載のVEGF mAbの何れか由来であり、第2の結合ドメインは、HuA2Tなどの本明細書に記載の抗Ang2 mAbのいずれか由来である。
本発明の二重特異性抗体は、任意の形態であってよく、例えば、上記のKontermannの文献に列挙される抗体の何れかである。1つの好ましい態様において、二重特異性抗体は、上記のZuoらの文献および図1に記載の記載のBs(scFv)4-IgG形態である。この形態において、一本鎖(scFv)形態の一方の結合ドメインはCL領域に連結され、従って、軽鎖のN末端ドメインになり、一方で、scFv形態の他方の結合ドメインは、CH1ドメインに連結され、従って、重鎖のN末端ドメインとなる。2つの軽鎖および2つの重鎖は、通常のIgG抗体のようにホモ二量体を形成し、それぞれ2つの結合ドメインを含む。従って、Bs(scFv)4−IgG形態の利点は、それが各単量体に同じ重鎖および軽鎖を有するホモ二量体であるため、正しいヘテロ二量体化を確実にするための事前注意が必要ないことである。VLおよびVH領域を繋げる各scFv内のリンカーは、(G4S)3GSとして選択されることが多い。各scFv結合ドメインは、VL−リンカー−VH形態またはVH−リンカー−VL形態(図1Aに示される)であり得て、何れかの結合ドメインは、軽鎖の一部分であってよく、他方は重鎖の一部分であってよく、合計で、Bs(scFv)4−IgG抗体の2×2×2=8変異体を、異なる特性を有し得る所定の2つの結合ドメイン(例えば、HuVE1およびHuL2G7またはHuA2Tの結合ドメイン)から作製することができる。本発明のとりわけ好ましい態様において、scFv VH−リンカー−VL形態中のHuVE1 Vドメインは、CH1に連結されており、scFv VH−リンカー−VL形態中のHuL2G7またはHuA2T Vドメインなどの他の抗体ドメインは、CLに連結されている。
本発明の別の態様において、二重特異性抗体は、例えば、上記のWuらの文献に記載の二重可変ドメイン形態である(ラベルを付して示す図1Aを参照のこと)。そのような二重特異性mAbは、各結合ドメインのうち2つを含み、それぞれの結合ドメインの1つは連続して連結されている。第1および第2のドメインを連結するために、種々のペプチドリンカー、例えば、重鎖のASTKGPSVFPLAPおよび軽鎖のRTVAAPSVIFIPP、または両方の鎖の(G4S)3GSが用いられ得る。例えば、HuL2G7またはHuA2Tの可変ドメインは、第1のドメイン(VL1−VH1)であり、一方、HuVE1の可変ドメインは、第2のドメイン(VL2−VH2)であり得る。リンカーは、上記の前者のものであってもよい。
本発明の他の好ましい態様において、軽鎖および重鎖を含むHuVE1 mAbの1つの単量体は、軽鎖および重鎖を含むHuL2G7またはHuA2T mAbの1つの単量体と対を形成して、IgG分子の通常の立体配置を有するヘテロ二量体を形成する。4つの鎖全てが、細胞内で発現されるとき、ホモ二量体の代わりに所望のヘテロ二量体二重特異性抗体の形成は、それぞれの重鎖のCH3領域に突起(knob)および空隙(hole)を挿入することによって促進されるが(Ridgway et al., Protein Eng 9:617−21, 1996; Atwell et al., J Mol Biol 270:26−35, 1997;および、米国特許第7,695,936号)、各HuVE1およびHuL2G7またはHuA2T単量体を形成するための軽鎖および重鎖の正確な対合は、単量体の1つ中の重鎖および軽鎖ドメインの“交差”によって促進される(Schaefer et al., Proc Natl Acad Sci USA 108:11187−92, 2011; WO2009/080251;WO2009/080252;WO2009/080253)。
本発明はまた、軽鎖および重鎖が、上記で具体的に記載したものと、通常C領域またはV領域フレームワークにおける、おそらくCDRにおける、数個の(例えば、一般的には、1個、2個、3個、5個または10個以下の)置換、欠失または挿入により異なる、変異型(variant)二重特異性抗体も提供する。変異体配列で行われる置換は、置換されたアミノ酸に関して保存的であることが多い。アミノ酸は、保存的置換、すなわち、グループ内の置換を決定するために、以下のようにグループ分けされ得る:グループI(疎水性側鎖):met、ala、val、leu、ile;グループII(中性親水性側鎖):cys、ser、thr;グループIII(酸性側鎖):asp、glu;グループIV(塩基性側鎖):asn、gln、his、lys、arg;グループV(鎖配向に影響を与える残基):gly、pro;および、グループVI(芳香族側鎖):trp、tyr、phe。
好ましくは、二重特異性抗体における置換は、抗体の結合親和性または効力に、すなわち、VEGFおよびHGFまたはAng−2などの第2の結合ドメインの標的の生物学的活性を中和するその能力に実質的に影響を及ぼさない。好ましくは、変異体配列は、元の配列と少なくとも90%、より好ましくは、少なくとも95%、最も好ましくは、少なくとも98%同一である。加えて、定常領域の他のアロタイプまたはイソ型を使用してもよい。
4.治療法
好ましい態様において、本発明は、本明細書に記載の抗体を含む医薬製剤を提供する。医薬製剤は、生理的に許容される担体中に、要すれば賦形剤または安定化剤と共に、凍結乾燥または水溶液の形態で、mAbを含む。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、用いられる用量および濃度でレシピエントに無毒であり、一般的にはpH5.0から8.0、最も多くはpH6.0から7.0のリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液等の緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;等張性にするための塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩類;抗酸化剤、防腐剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、ポリソルベート80などの親水性ポリマー、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖類、および当業者に知られている他の標準成分(Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. 1980)を含む。mAbは、一般的には、1−100mg/mlの濃度で存在し、最も多くは10−50mg/ml、例えば、10、20、30、40または50mg/mlの濃度で存在する。
好ましい態様において、本発明は、本明細書に記載の抗体を含む医薬製剤を提供する。医薬製剤は、生理的に許容される担体中に、要すれば賦形剤または安定化剤と共に、凍結乾燥または水溶液の形態で、mAbを含む。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、用いられる用量および濃度でレシピエントに無毒であり、一般的にはpH5.0から8.0、最も多くはpH6.0から7.0のリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液等の緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;等張性にするための塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩類;抗酸化剤、防腐剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、ポリソルベート80などの親水性ポリマー、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖類、および当業者に知られている他の標準成分(Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. 1980)を含む。mAbは、一般的には、1−100mg/mlの濃度で存在し、最も多くは10−50mg/ml、例えば、10、20、30、40または50mg/mlの濃度で存在する。
別の好ましい態様において、本発明は、医薬製剤中のVE1またはA2Tなどの本発明の抗VEGFまたは抗Ang−2 mAbあるいはそれらのヒト化形態および/または二重特異性形態を投与することにより、一般的には、疾患に関連する血管形成を阻害することによって、該疾患を有する患者を処置する方法を提供する。医薬製剤として調製されたmAbは、好適な経路で、とりわけ非経腸的に、静脈内点滴またはボーラス注射により、筋肉内または皮下注射により、患者に投与され得る。静脈内点滴は、わずか15分間で行われることもあるが、より多くは30分間で、または1、2もしくは3時間以上かけることもある。mAbはまた、疾患(例えば、腫瘍)の部位に直接注射されてもよく、またはリポソームなどの担持剤にカプセル化されてもよい。与えられる用量は、処置される状態を緩和するのに十分であり(“治療的に有効な用量”)、0.1〜5mg/kg体重、例えば、1、2、3、4または5mg/kgであることが多いが、10mg/kg、さらには15または20または30mg/kgの高用量、例えば1〜10mg/kgまたは1〜20mg/kgであってもよい。固定された単位用量、例えば、50、100、200、500または1000mgが与えられてもよいか、または用量は、患者の体表面積に基づいて計算されて、例えば1000mg/m2でもよい。通常、1から8用量(例えば、1、2、3、4、5、6、7または8)を投与して癌を処置するが、10、20またはそれ以上の用量が投与されてもよい。mAbは、毎日、隔週、毎週、隔週、毎月、または他の何らかの間隔で、例えば1週間、2週間、4週間、6週間、8週間、3〜6ヶ月もしくはそれ以上の間のmAbの半減期に対応して、投与され得る。長期投与と同様に、反復投与法も可能である。
本発明の抗VEGFおよび/または抗Ang−2 mAbによる処置に特に感受性の疾患としては、血管形成ならびに/または高レベルのVEGFおよび/もしくはAng−2に関連する疾患が挙げられ、固形腫瘍、例えば卵巣癌、乳癌、肺癌(小細胞または非小細胞)、大腸癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、肝癌(肝細胞癌)、腎癌(腎細胞癌)、頭頸部癌、黒色腫、肉腫および脳腫瘍(例えば、神経膠芽腫)が含まれる。白血病およびリンパ腫などの造血器腫瘍もまた感受性であり得る。好ましい態様において、mAbは、他の治療剤と組み合わせて(すなわち、共投与で、すなわち投与前に、投与中に、または投与後に)投与される。例えば、癌を処置するために、本発明のmAbは、公知の化学療法剤のいずれか1以上と共に、例えば、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジンおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤;フルオロウラシル、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサートおよびヒドロキシウレアなどの代謝拮抗剤;植物アルカロイドならびにブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エトポシド、マイトマイシン、ミトキサントロン、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびタキソール(パクリタキセル)などの抗生物質またはタキソテール(登録商標)等の関連化合物を含む天然産物;トポイソメラーゼ1阻害剤 イリノテカン;ならびに、Gleevec(登録商標)(イマチニブ)、Sutent(登録商標)(スニチニブ)、Nexavar(登録商標)(sorafenib)、Tarceva(登録商標)(エルロチニブ)、Tykerb(登録商標)(ラパチニブ)、Iressa(登録商標)(ゲフィチニブ)およびXalkori(登録商標)(crizotinib)などのチロシンキナーゼの阻害剤;ラパマイシン(登録商標)(シロリムス)および他のmTOR阻害剤;ならびに、血管形成の阻害剤;ならびに、WO2005/017107A2(引用により本明細書中に包含させる)に列記された全ての承認された試験的抗癌剤と共に投与され得る。本発明の抗体は、1、2、3またはそれ以上のこれらの他の薬剤と組み合わせて、好ましくは標準化学療法レジメンで用いることができる。通常、他の薬剤は、処置されている癌の種類に対して有効であると既に考えられているか、または知られている薬剤である。
癌を処置するために投与され得る本発明の抗VEGFおよび/または抗Ang−2 mAbには、HER2抗原に対するハーセプチン(登録商標)またはパージェタ(登録商標)(ペルツズマブ)を含むモノクローナル抗体;VEGFに対するアバスチン(登録商標);または、アービタックス(登録商標)(セツキシマブ)およびベクティビックス(登録商標)(パニツムマブ)などの上皮細胞増殖因子(EGF)受容体に対する抗体、ならびにKadcyla(商標)(ado−トラスツズマブ・エムタンシン)など抗体−薬剤複合体などの生物学的製剤が含まれる。HGFに対するmAbは、mAb L2G7(Kim et al., Clin Cancer Res 12:1292, 2006および米国特許第7,220,410号)ならびにHuL2G7などの特にそのキメラ形態およびヒト化形態(米国特許第7,632,926号)を含む、抗VEGF mAbまたは抗Ang−2 mAb;WO2005/017107A2に記載のヒト抗HGF mAb、特に2.12.1;および、WO07143090A2またはWO07143098A2に記載のHGF結合タンパク質;ならびに、上記のmAbの何れかと結合について競合する他の中和抗HGF mAbと共に使用するのに特に好ましい。HGFのRONまたはMet受容体に結合するmAb、例えば1個のみの“アーム”、すなわち結合ドメインを有するように遺伝子改変された抗cMet mAb OA−5D5(Martens et al., Clin cancer Res 12:6144, 2006)もまた好ましい。米国特許第8,101,725号に記載のGAL−F2のヒト化形態などのFGF2に結合するmAbもまた、好ましい。さらに、抗VEGF mAbまたは抗Ang−2 mAbは、あらゆる形態の外科手術および/または放射線療法と共に用いられ得る。
本発明の抗体である抗VEGF mAbおよび/または抗Ang−2 mAbを含む処置(例えば、標準的化学療法)は、上記のような特定のタイプの癌を有する患者の癌の進行のない生存期間または全生存期間の中央値を、mAbを含まない同じ処置(例えば、化学療法)と比較して、少なくとも20%または30%または40%、好ましくは50%、60%から70%、さらには100%またはそれ以上増加させるか、または(少なくとも)2、3、4、6もしくは12か月延長する。これに加えて、またはこれに代えて、mAbを含む処置(例えば、標準的化学療法)は、(特に、再発性または難治性のとき)患者の完全奏効率、部分奏効率、または客観的奏功率(完全+部分)を、抗VEGF mAbを含まない同じ処置(例えば、化学療法)と比較して、少なくとも30%または40%、好ましくは50%、60%から70%、さらには100%増加させ得る。
一般的には、臨床治験(例えば、第II相、第II/III相または第III相治験)において、化学療法単独(またはプラセボ添加)を受容している対照患者群と比較して、化学療法と本発明の抗VEGF mAbおよび/または抗Ang−2 mAbで処置した患者の無増悪期間または全生存期間の中央値および/または奏効率の上記の増加は、例えばp=0.05または0.01、さらには0.001のレベルで統計的に有意である。奏効率は、例えば、国立癌研究所および/または食品医薬品局(例えば、RECIST基準(固形腫瘍における応答評価基準))によって承認されているような、癌の臨床治験において一般的に使用される客観的基準によって判定されることも理解される。
本発明の抗VEGF mAbおよび/または抗Ang−2 mAbはまた、子宮内膜症および炎症性疾患および自己免疫性疾患、とりわけVEGFの役割が示されている炎症性腸疾患(クローン病および潰瘍性大腸炎)(Gorlatova et al., PLoS One 6:e27269, 2011およびHauser et al., Genes Immun 13:321−7, 2012)、関節リウマチ、乾癬、および糸球体腎炎などの腎疾患、ならびに加齢黄斑変性症または糖尿病関連網膜症などの眼疾患を含む、血管形成またはVEGFまたはAng−2と関連する疾患の処置にも使用され得る。眼疾患のためには、眼に直接点眼され得るFabまたは(Fab’)2のようなmAbのフラグメントが特に好適であり得る。
5.他の方法
本発明のmAbはまた、診断法、予後診断法および実験室的な方法に使用することができる。それらは、腫瘍内または腫瘍を有する患者の循環系内におけるVEGFまたはAng−2のレベルを測定するために用いられ、それ故に、腫瘍の処置を追跡し、または処置に繋ぐために用いられる。例えば、VEGF(各々、Ang−2)の上昇または高レベルに関連する腫瘍は、とりわけ抗VEGF(各々、抗Ang−2) mAbでの処置に感受性であり得る。特定の態様では、mAbは、例えば腫瘍生検標本においてまたは血清中またはVEGF分泌細胞の培地上清中の、VEGFまたはAng−2のレベルを測定するために、ELISAまたは放射免疫アッセイにおいて用いられ得る。異なるエピトープに結合する(すなわち、結合について競合しない)2つの抗VEGF(各々、抗Ang−2) mAbの使用は、VEGF(各々、Ang−2)を検出するための感受性“サンドイッチ”ELISAを開発するのに、特に有用である。種々のアッセイのために、mAbは、蛍光分子、スピン標識分子、酵素または放射性同位元素で標識されてよく、VEGFまたはAng−2のアッセイを実施するのに必要な全ての試薬を含むキットの形態で提供されてよい。他の用途では、抗VEGF(各々、抗Ang−2) mAbは、親和性クロマトグラフィーによりVEGF(各々、Ang−2)を精製するために用いられる。
本発明のmAbはまた、診断法、予後診断法および実験室的な方法に使用することができる。それらは、腫瘍内または腫瘍を有する患者の循環系内におけるVEGFまたはAng−2のレベルを測定するために用いられ、それ故に、腫瘍の処置を追跡し、または処置に繋ぐために用いられる。例えば、VEGF(各々、Ang−2)の上昇または高レベルに関連する腫瘍は、とりわけ抗VEGF(各々、抗Ang−2) mAbでの処置に感受性であり得る。特定の態様では、mAbは、例えば腫瘍生検標本においてまたは血清中またはVEGF分泌細胞の培地上清中の、VEGFまたはAng−2のレベルを測定するために、ELISAまたは放射免疫アッセイにおいて用いられ得る。異なるエピトープに結合する(すなわち、結合について競合しない)2つの抗VEGF(各々、抗Ang−2) mAbの使用は、VEGF(各々、Ang−2)を検出するための感受性“サンドイッチ”ELISAを開発するのに、特に有用である。種々のアッセイのために、mAbは、蛍光分子、スピン標識分子、酵素または放射性同位元素で標識されてよく、VEGFまたはAng−2のアッセイを実施するのに必要な全ての試薬を含むキットの形態で提供されてよい。他の用途では、抗VEGF(各々、抗Ang−2) mAbは、親和性クロマトグラフィーによりVEGF(各々、Ang−2)を精製するために用いられる。
6.実施例
実施例1:抗VEGF mAbの作製
ヒトVEGFに結合して、その活性を阻止するmAbを作製し、アッセイするために、グルタチオン合成酵素−VEGF融合タンパク質、GST−VEGFを最初に作製した。この目的のために、標準的な分子生物学的方法を用いて、完全長ヒトVEGF165をコードするcDNAを構築し、pGEX発現ベクター(Invitrogen)の誘導体中に挿入し、BL21(DE3)大腸菌細胞(Novagen)を形質転換して発現させた。GST−VEGFを、グルタチオン−アガロースカラム(Sigma−Aldrich)を用いて大腸菌溶解物から精製した。2つの他の融合タンパク質、VEGF−FLAG(各々、FLAG−VEGF)を、pCIベクターの誘導体(Invitrogen)中、FLAGタグ(アミノ酸DYKDDDDK)をヒトVEGF165のカルボキシ末端(各々、アミノ末端)に結合させて、哺乳動物の293F細胞中で発現させることで産生した。培養液中に分泌されたVEGF−FLAGまたはFLAG−VEGFの量を、VEGF特異的ELISAを用いて定量した。ブロッキングアッセイのために、ヒトVEGF受容体2(VEGFR2)の細胞外ドメイン(アミノ酸1から760)を、ヒトIgγ−1 Fc定常領域(ヒンジ−cH2−cH3)に結合させて、ヒトVEGFR−Fcを産生し、それを哺乳動物細胞中で産生させて、プロテインAカラムを用いて精製した。ヒトVEGF−121、VEGF−165、VEGF−186、VEGF−B、VEGF−C、VEGF−D、VEGFR1およびマウスVEGF−Aを購入した(R&D Systems)。
実施例1:抗VEGF mAbの作製
ヒトVEGFに結合して、その活性を阻止するmAbを作製し、アッセイするために、グルタチオン合成酵素−VEGF融合タンパク質、GST−VEGFを最初に作製した。この目的のために、標準的な分子生物学的方法を用いて、完全長ヒトVEGF165をコードするcDNAを構築し、pGEX発現ベクター(Invitrogen)の誘導体中に挿入し、BL21(DE3)大腸菌細胞(Novagen)を形質転換して発現させた。GST−VEGFを、グルタチオン−アガロースカラム(Sigma−Aldrich)を用いて大腸菌溶解物から精製した。2つの他の融合タンパク質、VEGF−FLAG(各々、FLAG−VEGF)を、pCIベクターの誘導体(Invitrogen)中、FLAGタグ(アミノ酸DYKDDDDK)をヒトVEGF165のカルボキシ末端(各々、アミノ末端)に結合させて、哺乳動物の293F細胞中で発現させることで産生した。培養液中に分泌されたVEGF−FLAGまたはFLAG−VEGFの量を、VEGF特異的ELISAを用いて定量した。ブロッキングアッセイのために、ヒトVEGF受容体2(VEGFR2)の細胞外ドメイン(アミノ酸1から760)を、ヒトIgγ−1 Fc定常領域(ヒンジ−cH2−cH3)に結合させて、ヒトVEGFR−Fcを産生し、それを哺乳動物細胞中で産生させて、プロテインAカラムを用いて精製した。ヒトVEGF−121、VEGF−165、VEGF−186、VEGF−B、VEGF−C、VEGF−D、VEGFR1およびマウスVEGF−Aを購入した(R&D Systems)。
Balb/cマウスを、各後足の足蹠に、Ribiアジュバント中の精製GST−VEGF(最初の注射については10μg、その後の注射では5μg)を用いて、週2回、16〜18回免疫化した。最後の免疫化の3日後、膝窩リンパ節細胞を、35%ポリエチレングリコールを用いてネズミ骨髄腫細胞P3X63AgU.1(ATCC CRL 1597)と融合させた。ハイブリドーマを、記載のようにHAT培地で選択した(Chuntharapai and Kim, J Immunol 163:766, 1997)。融合の10日後に、ハイブリドーマ培養上清を、VEGF結合ELISAでスクリーニングし、その後下記のVEGF/VEGFRブロッキングELISAでスクリーニングした。選択されたハイブリドーマを、VEGF結合ならびにVEGF/VEGFRブロッキングのスクリーニングによって2回クローニングした。13個の融合物から約2万個のハイブリドーマをスクリーニングした後、VE1.7を最良の抗VEGF抗体として選択した。この抗体は本明細書中VE1と記載する。VE1のイソ型は、アイソタイピングキットを用いてIgG2a、κであると決定された。
実施例2:抗VEGF mAbを特徴付けるために用いるアッセイ
本特許出願に記載の各ELISAアッセイの各工程を、最初のプレートコーティング工程(複数可)を4℃で一晩行った以外、好適な試薬を用いて室温で1時間インキュベートし、その後2% BSAで1時間ブロッキングすることにより実施した。各工程間で、プレートを、0.05% Tween 20を含むPBS中で3回洗浄した。データ点は、一般的にトリプリケートであった。一般的に、トリプリケートのデータ点間にはばらつきはほとんどなかった。VEGFへのmAbの直接結合を測定するために、最初に、プレートをヘパリン(50μg/ml)を用いて一晩コーティングし、次いで、ヒトVEGF165(0.3μg/ml)と共に一晩インキュベートし、その後、BSAでブロッキングした。ウェルを、スクリーニングのためにハイブリドーマ上清と共に、あるいは漸増濃度の試験すべき精製VE1 mAbまたは他の抗VEGF mAbと共にインキュベートし、結合したmAbを、HRPヤギ抗マウスIgGの添加、次いでTMB基質の添加により、検出した。溶液中でVEGFに結合するmAbの能力を測定するために(捕捉アッセイ)、最初に、プレートをヤギ抗mIgG−Fc(2μg/ml)でコーティングした。ウェルを、漸増濃度の試験すべき精製VE1 mAbまたは他の抗VEGF mAbと共にインキュベートし、その後、精製mAbについてはVEGF−Flag(0.5μg/ml)、またはハイブリドーマ上清についてはVEGF−FLAG+FLAG−VEGFと、マウスIgG(30μg/ml)共にインキュベートした。結合したVEGF−Flagを、マウスIgG(15μg/ml)の存在下で、次いでTMB基質の存在下で、HRP−抗Flag M2(Sigma)の添加により検出した。mAbのブロッキング活性を測定するために、プレートを、最初に、ヤギ抗hIgG−Fc(2μg/ml)でコーティングした。次いで、ウェルをVEGFR−Fc(0.5μg/ml)と共にインキュベートし、その後、スクリーニングのためにハイブリドーマ上清と共に、あるいはVEGF−Flag(0.5μg/m)と予め混合した、漸増濃度の処置すべき精製VE1 mAbまたは他の抗VEGF mAbと共にインキュベートした。結合したVEGF−Flagを、HRP−抗Flag M2を添加し、その後TMB基質を添加することによって検出した。
本特許出願に記載の各ELISAアッセイの各工程を、最初のプレートコーティング工程(複数可)を4℃で一晩行った以外、好適な試薬を用いて室温で1時間インキュベートし、その後2% BSAで1時間ブロッキングすることにより実施した。各工程間で、プレートを、0.05% Tween 20を含むPBS中で3回洗浄した。データ点は、一般的にトリプリケートであった。一般的に、トリプリケートのデータ点間にはばらつきはほとんどなかった。VEGFへのmAbの直接結合を測定するために、最初に、プレートをヘパリン(50μg/ml)を用いて一晩コーティングし、次いで、ヒトVEGF165(0.3μg/ml)と共に一晩インキュベートし、その後、BSAでブロッキングした。ウェルを、スクリーニングのためにハイブリドーマ上清と共に、あるいは漸増濃度の試験すべき精製VE1 mAbまたは他の抗VEGF mAbと共にインキュベートし、結合したmAbを、HRPヤギ抗マウスIgGの添加、次いでTMB基質の添加により、検出した。溶液中でVEGFに結合するmAbの能力を測定するために(捕捉アッセイ)、最初に、プレートをヤギ抗mIgG−Fc(2μg/ml)でコーティングした。ウェルを、漸増濃度の試験すべき精製VE1 mAbまたは他の抗VEGF mAbと共にインキュベートし、その後、精製mAbについてはVEGF−Flag(0.5μg/ml)、またはハイブリドーマ上清についてはVEGF−FLAG+FLAG−VEGFと、マウスIgG(30μg/ml)共にインキュベートした。結合したVEGF−Flagを、マウスIgG(15μg/ml)の存在下で、次いでTMB基質の存在下で、HRP−抗Flag M2(Sigma)の添加により検出した。mAbのブロッキング活性を測定するために、プレートを、最初に、ヤギ抗hIgG−Fc(2μg/ml)でコーティングした。次いで、ウェルをVEGFR−Fc(0.5μg/ml)と共にインキュベートし、その後、スクリーニングのためにハイブリドーマ上清と共に、あるいはVEGF−Flag(0.5μg/m)と予め混合した、漸増濃度の処置すべき精製VE1 mAbまたは他の抗VEGF mAbと共にインキュベートした。結合したVEGF−Flagを、HRP−抗Flag M2を添加し、その後TMB基質を添加することによって検出した。
実施例3:VE1抗体の結合活性およびブロッキング活性
VEGFに結合するVE1の能力を、上記の直接結合および捕捉アッセイにおいて実証した(図2A)。中和抗VEGF mAbの重要な特性である、VEGFのその受容体VEGFR(VEGFR2)への結合を阻害するVE1の能力を、上記のブロッキングアッセイを用いて、ベバシズマブを作製するためのヒト化したA4.6.1 mAbの能力と比較した。図2Bに示すように、VE1は、VEGFのVEGFRへの結合を、A4.6.1よりも実質的に低濃度で完全に阻害した。
VEGFに結合するVE1の能力を、上記の直接結合および捕捉アッセイにおいて実証した(図2A)。中和抗VEGF mAbの重要な特性である、VEGFのその受容体VEGFR(VEGFR2)への結合を阻害するVE1の能力を、上記のブロッキングアッセイを用いて、ベバシズマブを作製するためのヒト化したA4.6.1 mAbの能力と比較した。図2Bに示すように、VE1は、VEGFのVEGFRへの結合を、A4.6.1よりも実質的に低濃度で完全に阻害した。
実施例4:ヒト化VE1抗体の構築および特性化
VE1 mAbの軽鎖および重鎖可変領域のクローニング、キメラmAbの構築および発現、ならびにヒト化VE1 mAbの設計、構築、発現および精製は、全ての目的に関して引用により本明細書中に包含させる米国特許第7,632,926号にL2G7 mAbについて記載のように、分子生物学の標準的な方法を用いて全て行った。VE1の(成熟)軽鎖および重鎖可変(V)領域アミノ酸配列を、図3Aおよび3Bにそれぞれ示し、上列にVE1を示す。より具体的には、ヒト化VE1 mAbを設計するために、Queenらの、米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号に記載の方法を、一般的に実施した。図3Aおよび3Bの下列にそれぞれ示されているように、ヒトVK配列AAS01771およびVH配列AAC18292は、それらが特に高いフレームワーク相同性(すなわち、配列同一性)を有するために、VE1 VLおよびVH配列のアクセプター配列として機能するようにそれぞれ選択された。VE1可変ドメインのコンピューターにより作成した分子モデルを用いて、VE1フレームワーク内のアミノ酸が、CDRと十分に接近してそれらろ相互作用し得るように配置させた。ヒト化VE1軽鎖および重鎖可変領域を設計するために、マウスVE1 mAb由来のCDRを、最初は、構想上、アクセプターフレームワーク領域中に移植した。コンピュータモデルが、CDRコンフォメーションを維持するために必要であり得るCDRとの有意な接触を示唆するフレームワーク位置では、マウス抗体由来のアミノ酸が、ヒトフレームワークアミノ酸に代わって置換された。このようにして、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖のそれぞれの2バージョンを設計した。軽鎖については、そのような置換はされなかったか(HuVE1−L1)、または残基46および81で置換が行われた(HuVE1−L2);重鎖については、重鎖の残基46、69および71が置換されたか(HuVE1−H1)またはこれらの残基と、さらに残基2および67が置換された(HuVE1−H2)。これらの番号付けは全て、Kabatの番号付けを参照する。これらのヒト化軽鎖および重鎖V領域の配列を、それぞれ図3Aおよび3Bの中段に示し、それらは、それぞれVE1ドナーおよびヒトアクセプターV領域に対して整列され、CDR(Kabatによって定義される)に下線を付し、上記の置換アミノ酸に二重下線が付されている。V領域配列を、ヒトκおよびγ−1 C領域と連結させた。ヒト化軽鎖の各々をヒト化重鎖の各々と組み合わせることにより、以下の表に示すように、HuVE1 ♯1、♯2、♯3および♯4と呼ばれる4種類の異なるヒト化VE1抗体を作製した(各鎖の置換基の数を括弧内に示す)。さらに、ChVE1と命名されたキメラVE1 mAbを、(マウス)VE1のV領域をヒトκおよびγ−1 C領域と組み合わせることにより、構築した。
VE1 mAbの軽鎖および重鎖可変領域のクローニング、キメラmAbの構築および発現、ならびにヒト化VE1 mAbの設計、構築、発現および精製は、全ての目的に関して引用により本明細書中に包含させる米国特許第7,632,926号にL2G7 mAbについて記載のように、分子生物学の標準的な方法を用いて全て行った。VE1の(成熟)軽鎖および重鎖可変(V)領域アミノ酸配列を、図3Aおよび3Bにそれぞれ示し、上列にVE1を示す。より具体的には、ヒト化VE1 mAbを設計するために、Queenらの、米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号に記載の方法を、一般的に実施した。図3Aおよび3Bの下列にそれぞれ示されているように、ヒトVK配列AAS01771およびVH配列AAC18292は、それらが特に高いフレームワーク相同性(すなわち、配列同一性)を有するために、VE1 VLおよびVH配列のアクセプター配列として機能するようにそれぞれ選択された。VE1可変ドメインのコンピューターにより作成した分子モデルを用いて、VE1フレームワーク内のアミノ酸が、CDRと十分に接近してそれらろ相互作用し得るように配置させた。ヒト化VE1軽鎖および重鎖可変領域を設計するために、マウスVE1 mAb由来のCDRを、最初は、構想上、アクセプターフレームワーク領域中に移植した。コンピュータモデルが、CDRコンフォメーションを維持するために必要であり得るCDRとの有意な接触を示唆するフレームワーク位置では、マウス抗体由来のアミノ酸が、ヒトフレームワークアミノ酸に代わって置換された。このようにして、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖のそれぞれの2バージョンを設計した。軽鎖については、そのような置換はされなかったか(HuVE1−L1)、または残基46および81で置換が行われた(HuVE1−L2);重鎖については、重鎖の残基46、69および71が置換されたか(HuVE1−H1)またはこれらの残基と、さらに残基2および67が置換された(HuVE1−H2)。これらの番号付けは全て、Kabatの番号付けを参照する。これらのヒト化軽鎖および重鎖V領域の配列を、それぞれ図3Aおよび3Bの中段に示し、それらは、それぞれVE1ドナーおよびヒトアクセプターV領域に対して整列され、CDR(Kabatによって定義される)に下線を付し、上記の置換アミノ酸に二重下線が付されている。V領域配列を、ヒトκおよびγ−1 C領域と連結させた。ヒト化軽鎖の各々をヒト化重鎖の各々と組み合わせることにより、以下の表に示すように、HuVE1 ♯1、♯2、♯3および♯4と呼ばれる4種類の異なるヒト化VE1抗体を作製した(各鎖の置換基の数を括弧内に示す)。さらに、ChVE1と命名されたキメラVE1 mAbを、(マウス)VE1のV領域をヒトκおよびγ−1 C領域と組み合わせることにより、構築した。
ChVE1およびHuVE1の4つの変異体のVEGFへの結合能力を、上記の実施例2に記載の捕捉アッセイにおいて、mAbに結合するためにプレートに用いられた抗mIgG−Fcの代わりにヤギ抗hIgG−Fcを用いて、比較した。VE1の代わりにChVE1を用いて、すべてのmAbを同じ試薬を用いた1つのアッセイで比較することができた。ChVE1は、同じV領域を有するため、VE1と同じものに結合することが予期される。図4Aから明らかなように、全ての抗体がVEGFによく結合し、HuVE1 ♯3および♯4はChVE1とほぼ同じ程度結合し、一方、HuVE1 ♯1およびHuVE1 ♯2は、よく結合しなかった。ChVE1およびHuVE1の4つの変異体の、VEGFのVEGFRへの結合を阻止する能力を、上記の実施例2に記載のアッセイにおいて比較した。図4Bから明らかなように、全ての抗体がVEGFのVEGFRへの結合を阻止し、HuVE1 ♯3および♯4は、ChVE1とほぼ同じ程度阻害し、一方、HUVE1 ♯1およびHuVE1 ♯2は、よく阻害しなかった。これらの結果は、HuVE1−L2における2つのアミノ酸置換が、この軽鎖を含むヒト化mAbの活性を改善し、HuVE1−L2を軽鎖に使用した場合に、VE1をヒト化するとき親和性が失われないことを示す。さらなる試験は、主にHuVE1 ♯4を用いて行われ、以下ではHuVE1と称される。
HuVE1 ♯3およびHuVE1 ♯4のVEGFへの(捕捉)結合能力およびVEGFのVEGFRへの結合を阻止する能力を、in 上記で用いたのと同じアッセイを用いてベバシズマブと比較し、結合について図5Aに示し、阻止について、図5Bに示す。ソフトウェアを用いて、結合についての有効濃度50%(EC50)を、このデータから、ベバシズマブについて0.09μg/mL、HuVE1 ♯3およびHuVE1 ♯4の両方についてたった0.02μg/mLと計算した。同様に、ブロッキングの阻害濃度50%(IC50)を、ベバシズマブについて0.34μg/mL、HuVE1 ♯3についてたった0.05μg/mLおよびHuVE1 ♯4について0.06μg/mLと計算し、VEGFのVEGFRへの結合を阻害する臨界活性において、HuVE1 ♯3およびHuVE1 ♯4はそれぞれ、ベバシズマブよりも約7倍および6倍強力であった。
最後に、HuVE1 (HuVE1 ♯4)の、ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)のVEGF誘発性増殖を阻害する能力を、mAbの活性を中和するアッセイにより、ベバシズマブと比較して測定した。このアッセイを実施するために、1% FCSおよび0.1% BSAを含むEBM-2培地中、96ウェルELISAプレートの1ウェル当たり5,000HUVECを播種して一晩インキュベートし、その後、0.1% FCSおよび0.1% BSAを含むEBM-2中で24時間インキュベートした。その後、細胞を、20ng/mLのVEGFと漸増濃度のmAbを含む同じ培地中で3日間インキュベートした。WST−8を製造業者の指示書の通りに用いて増殖の程度を判定した。図6Aに示す通り、HuVE1は、ベバシズマブについて0.36μg/mLと比較して、0.057μg/mLと計算されたIC50を有するバックグラウンドレベル(VEGFなし)へ増殖を阻害することができ、すなわち、HuVE1は、受容体ブロッキングアッセイにおける上記の結果と完全に一致して、このバイオアッセイにおいてベバシズマブより約6倍高かった。
本発明者らはまた、上記のアッセイにおいてVEGFのVEGFR2への結合を阻害する能力によって測定されるように、HuVE1の活性を、高い結合親和性または活性を有すると主張されるいくつかの既報の抗VEGF mAbの活性と比較した。他のmAbは、それらの公表された配列:ヒト化ウサギmAb hEBV321(US 2012/0231011)、親和性成熟ヒト化mAb Y0317 (EP 1 787 999)、ならびにヒトmAb B20.4.1およびB20.4.1.1 (US 2009/0142343)に基づいて最初に合成された。図6Bから明らかな通り、これらのmAbのいずれも、アッセイにおいてHuVE1と同程度の活性であり、いくつかは顕著に低い活性であった。
HuVE1がVEGF−Aに特異的に結合することを示すために、0.2μg/mLのそのタンパク質、ならびにVEGF−B、VEGF−C、VEGF−Dならびに2つの他の増殖因子HGFおよびFGF2を、最初に、ヘパリン(50μg/mL)でコーティングしたELISAプレート上でインキュベートした。その後、ウェルを、2μg/mLのHuVE1または対照mAb ベバシズマブ、HuL2G7、ヒト化GAL−F2 抗FGF2、または陰性対照hIgGと共にインキュベートし、次いで、HRP−ヤギ抗ヒトIgGおよびその後TMB基質で検出した。図7Aに示す通り、対照mAb HuL2G7およびヒト化GAL−F2はそれぞれHGFおよびFGF2にのみ結合し、一方、HuVE1(および、ベバシズマブ)は、バックグラウンドレベル(hIgGの結合)を上回るレベルでVEGF−Aにのみ結合して、VEGF−Aに対するHuVE1の特異性を示す。(マウス)VE1は、そのヒト化形態と同じ様式で結合するため、VEGF−Aに対して特異的であるはずである。同様の方法であるが、VEGFを捕捉するためにヘパリンではなくA4.6.1(2μg/mL)でELISAプレートをコーティングする別の試験では、HuVE1(および、ベバシズマブ)は、VEGF−Aの3つの異なるイソ型:最も短い形態のVEGF121、最も豊富な形態のVEGF165、およびVEGF189に結合した(図7B)。
実施例5:HuVE1のエピトープ
HuVE1(および、従ってVE1)のエピトープを決定するために、本発明者らは、カルボキシ末端で、Flagペプチドがそれに続くヒトκ定常領域に結合したVEGF(VEGF−KF)の一連の誘導体に結合するその能力を測定した。この目的のために、ELISAウェルを、ヤギ抗ヒト−Ig−Fc(2μg/mL)でコーティングし、2% BSAでブロッキングし、0.1μg/mL HuVE1(HuVE1 ♯4)または比較のためのベバシズマブと共にインキュベートし、次いでVEGF−KFの好適な形態と共にインキュベートし、HRP−M2−抗Flagおよび基質で検出した。HuVE1およびベバシズマブは、マウスVEGFに結合しないことが最初に明らかにされた(図8Bの第2カラム)。当技術分野で広く用いられている手法にしたがって、本発明者らはヒトVEGFとマウスVEGFとの間に一連のキメラ分子を作製し(図8A)、HuVE1とベバシズマブとのそれぞれに対する結合を測定した。図8Bに示す通り、これらのmAbは、アミノ酸領域79−104(図8A中、短い両矢印で示す)がヒトVEGFに由来するキメラVEGFにのみ結合し、それ故に、この領域をmAbのエピソードを含むものと同定し、このことはベバシズマブに関する以前の報告と一致していた。
HuVE1(および、従ってVE1)のエピトープを決定するために、本発明者らは、カルボキシ末端で、Flagペプチドがそれに続くヒトκ定常領域に結合したVEGF(VEGF−KF)の一連の誘導体に結合するその能力を測定した。この目的のために、ELISAウェルを、ヤギ抗ヒト−Ig−Fc(2μg/mL)でコーティングし、2% BSAでブロッキングし、0.1μg/mL HuVE1(HuVE1 ♯4)または比較のためのベバシズマブと共にインキュベートし、次いでVEGF−KFの好適な形態と共にインキュベートし、HRP−M2−抗Flagおよび基質で検出した。HuVE1およびベバシズマブは、マウスVEGFに結合しないことが最初に明らかにされた(図8Bの第2カラム)。当技術分野で広く用いられている手法にしたがって、本発明者らはヒトVEGFとマウスVEGFとの間に一連のキメラ分子を作製し(図8A)、HuVE1とベバシズマブとのそれぞれに対する結合を測定した。図8Bに示す通り、これらのmAbは、アミノ酸領域79−104(図8A中、短い両矢印で示す)がヒトVEGFに由来するキメラVEGFにのみ結合し、それ故に、この領域をmAbのエピソードを含むものと同定し、このことはベバシズマブに関する以前の報告と一致していた。
HuVE1のエピトープとベバシズマブのエピトープをより正確に比較するために、VEGFの一連の変異体に対するこれらのmAbの結合を測定した(図9)。M81AおよびK84A(図9A)およびG88SまたはG88A(図9B)のような特定の突然変異は、HuVE1およびベバシズマブの両方の結合を実質的に減少させ、アミノ酸位置81、84および88が両方のこれらのmAbのエピトープに存在することを示した。しかしながら、アミノ酸83および92などのアミノ酸の変異は、ベバシツマブの結合を実質的に減少させたが、HuVE1の結合にはほとんどまたは全く影響を及ぼさなかった。これは、本質的にベバシズマブの結合を排除したが、HuVE1の結合にはほとんど影響を与えなかった、二重突然変異M83A/G92Aでさらに明確に見られた。本発明者らは、M83およびG92等の特定のアミノ酸が、ベバシズマブのエピトープ中にあるが、HuVE1のエピトープになく、従ってこれらのmAbは、VEGF上に重複するが同一ではないエピトープを有するはずであると結論付ける。
実施例6:抗Ang−2 mAbの作製
ヒトAng−2に結合してその活性を阻害するmAbを作製し、アッセイするために、標準的な分子生物学的方法を用いていくつかのFc融合タンパク質を構築した。この目的のために、ヒト、マウスおよびマウス−ヒトまたはヒト−マウスキメラ Ang−2(各々、hAng−2(F)、mAng−2(F)、ヒトAng−2のアミノ酸411−496に結合されたマウスAng−2のアミノ酸274−410、またはその逆からなるそれぞれのキメラ形態を含む、m/hAng−2(F)およびh/mAng−2(F)と示す)のフィブリノーゲン様(F)ドメイン(アミノ酸274から496)をコードするcDNAを構築した。これらのcDNAは、N末端またはC末端のいずれかでヒトIgγ−1 Fc領域(ヒンジ−cH2−cH3)に結合させるか(各々、適当な修飾を有して、Fc−Ang−2(F)およびAng−2(F)−Fcと示す)、またはC末端でFlagペプチドが続くヒトκ定常領域に結合させて(hAng−2(F)−KFなどと示す)、pCIベクター(Invitrogen)の誘導体中に挿入し、トランスフェクトして、293F哺乳動物細胞中で発現させた。Fc融合タンパク質を、プロテインAカラム(Sigma−Aldrich)を用いて293F培養上清から精製した。別の融合タンパク質であるFlag−m/hAng−2(F)を、pCIベクター(Invitrogen)の誘導体においてマウス/ヒトキメラAng−2(F)のN末端にFLAGタグ(アミノ酸DYKDDDDK)を連結させて、293F細胞で発現させて、抗FLAGカラムを用いて精製することにより作製した。別のタンパク質であるペプチド−KLHを、hAng−2由来のペプチド(アミノ酸464−483)をKLHに化学的に結合させることにより作製した。ブロッキングアッセイのために、ヒトTie−2受容体の細胞外ドメイン(アミノ酸1から760)を、ヒトIgγ−1 Fc定常領域(ヒンジ−cH2−cH3)に連結させて、ヒトTie−2−Fcを作製し、それを哺乳動物細胞で産生させ、プロテインAカラムを用いて精製した。
ヒトAng−2に結合してその活性を阻害するmAbを作製し、アッセイするために、標準的な分子生物学的方法を用いていくつかのFc融合タンパク質を構築した。この目的のために、ヒト、マウスおよびマウス−ヒトまたはヒト−マウスキメラ Ang−2(各々、hAng−2(F)、mAng−2(F)、ヒトAng−2のアミノ酸411−496に結合されたマウスAng−2のアミノ酸274−410、またはその逆からなるそれぞれのキメラ形態を含む、m/hAng−2(F)およびh/mAng−2(F)と示す)のフィブリノーゲン様(F)ドメイン(アミノ酸274から496)をコードするcDNAを構築した。これらのcDNAは、N末端またはC末端のいずれかでヒトIgγ−1 Fc領域(ヒンジ−cH2−cH3)に結合させるか(各々、適当な修飾を有して、Fc−Ang−2(F)およびAng−2(F)−Fcと示す)、またはC末端でFlagペプチドが続くヒトκ定常領域に結合させて(hAng−2(F)−KFなどと示す)、pCIベクター(Invitrogen)の誘導体中に挿入し、トランスフェクトして、293F哺乳動物細胞中で発現させた。Fc融合タンパク質を、プロテインAカラム(Sigma−Aldrich)を用いて293F培養上清から精製した。別の融合タンパク質であるFlag−m/hAng−2(F)を、pCIベクター(Invitrogen)の誘導体においてマウス/ヒトキメラAng−2(F)のN末端にFLAGタグ(アミノ酸DYKDDDDK)を連結させて、293F細胞で発現させて、抗FLAGカラムを用いて精製することにより作製した。別のタンパク質であるペプチド−KLHを、hAng−2由来のペプチド(アミノ酸464−483)をKLHに化学的に結合させることにより作製した。ブロッキングアッセイのために、ヒトTie−2受容体の細胞外ドメイン(アミノ酸1から760)を、ヒトIgγ−1 Fc定常領域(ヒンジ−cH2−cH3)に連結させて、ヒトTie−2−Fcを作製し、それを哺乳動物細胞で産生させ、プロテインAカラムを用いて精製した。
Balb/cメスマウスを、Ribiアジュバント中の抗原で週2回、各後肢足蹠にて免疫化した(最初の注射については10μg、その後の注射については5μg、または記載の通り)。1群のマウスを、hAng−2(F)−Fcで12回免疫化し、最後にFc−hAng−2(F)で追加免疫した。第2の群のマウスをhAng−2(F)−FcとmAng−2(F)−Fcで交互に6回免疫化し、その後Flag−m/hAng−2(F)で3回、hAng−2(F)−FcとmAng−2(F)−Fcで交互に3回、次いで、ペプチド−KLH(6μg)で2回、最後にm/hAng−2(F)−Fcで追加免疫した。この最後の追加免疫の3日後、膝窩リンパ節細胞をマウスミエローマ細胞P3X63AgU.1と融合させ、ハイブリドーマを上記の通りにHAT培地中で選択した。ハイブリドーマ培養上清を、最初に、hAng2(F)−KF捕捉ELISAでスクリーニングし、次いで、下記のようにAng−2 Tie2ブロッキングELISAを行った。選択されたハイブリドーマを、Ang2(F)−KF結合ならびにAng−2/Tie2ブロッキング活性についてスクリーニングすることにより2回クローン化した。26個の融合物から約26,000個のハイブリドーマをスクリーニングした後、それらの高い結合活性およびブロッキング活性に基づいて、mAb A2B14.6(本明細書中A2Bと称する)を、第1群のマウスの1つの融合物から選択し、mAb A2T.10.2(本明細書中、A2Tと称する)を、第2群のマウスの1つの融合物から選択した。A2BおよびA2Tは、アイソタイピングキットを用いてIgG2bおよびIgG2aイソ型のそれぞれであると決定された。
A2BおよびA2Tと強力な抗血管新生効果を有することが以前に示された他の抗Ang−2 mAbとを比較するために、本発明者らは、それらの公表された配列:Ab356(上記のJ. Olinerらの、国際公開第03/030833号に記載の配列番号11および配列番号12);REGN910(上記のC. Dalyらの、NCI Drug Dictionaryのネズバクマブとして同定されたREGN910 http://www.cancer.gov/publications/dictionaries/ cancer−drug−cdrid=693224、およびその後得られた配列 http://www.genome.jp/dbget by search for nesvacumab);MEDI−3167(上記のA. Buchananらの、図1Aおよび要約およびテキスト)、ならびにLC06(上記のM. ThomasらおよびS. Fennらの、Plos One 8: e61953−e61953、2013; タンパク質データバンク中、4IMK)に基づいて、いくつかのそのようなmAbの可変ドメイン遺伝子を合成した。本発明者らはまた、構築および発現のための標準的な方法を用いて、各mAbのヒトV領域がマウスC領域に連結された、ヒト−マウスキメラ抗体muAb356、muMEDI−3167およびmuREGN910を作製し、これらのmAbを、同じアッセイにおいてマウス抗体A2BおよびA2Tと比較することができた。もちろん、キメラmAbは、それぞれのヒトmAbと同じ結合活性およびブロッキング活性を有することが予期される。
実施例8:抗Ang−2 mAbの特性化
Ang−2に結合する抗Ang−2 mAbの能力を測定するために、ヤギ抗マウスIgG−Fc(2μg/mL)でコーティングしたプレートを、ハイブリドーマ上清または試験されるべき精製したmAb(2μg/mL)と共にインキュベートし、その後hAng−2(F)−KF(1μg/mL)と共にインキュベートした。結合したhAng2(F)−KFを、HRP−ヤギ抗IgG−κ(Sigma)を添加し、その後、TMB基質を添加して検出した。mAbのマウスAng−2への結合およびカニクイザルのAng−2への結合もまた、適当なAng−2(F)−KF構築物を用いて、この方法で測定した。以前に報告された抗体Ab536、MEDI−3167およびREGN910とは異なり、mAb A2BおよびA2Tは両方とも、ヒトおよびカニクイザルAng−2に結合するが、マウスAng−2に検出可能に結合しない(図10A)。このため、A2BおよびA2Tは、これらの以前のmAbとは異なるエピトープを有しているはずである。同様のアッセイにおいて、これらのmAbのいずれもAng−1に結合しないことが示された。
Ang−2に結合する抗Ang−2 mAbの能力を測定するために、ヤギ抗マウスIgG−Fc(2μg/mL)でコーティングしたプレートを、ハイブリドーマ上清または試験されるべき精製したmAb(2μg/mL)と共にインキュベートし、その後hAng−2(F)−KF(1μg/mL)と共にインキュベートした。結合したhAng2(F)−KFを、HRP−ヤギ抗IgG−κ(Sigma)を添加し、その後、TMB基質を添加して検出した。mAbのマウスAng−2への結合およびカニクイザルのAng−2への結合もまた、適当なAng−2(F)−KF構築物を用いて、この方法で測定した。以前に報告された抗体Ab536、MEDI−3167およびREGN910とは異なり、mAb A2BおよびA2Tは両方とも、ヒトおよびカニクイザルAng−2に結合するが、マウスAng−2に検出可能に結合しない(図10A)。このため、A2BおよびA2Tは、これらの以前のmAbとは異なるエピトープを有しているはずである。同様のアッセイにおいて、これらのmAbのいずれもAng−1に結合しないことが示された。
抗Ang−2 mAbのエピトープを決定するために、本発明者らはまた、これらのmAbの、上記のキメラ m/hAng2(F)―KFおよびh/mAng2(F)―KFタンパク質への結合能力を測定するためにELISAアッセイを用いた。A2B mAbは、h/mAng−2−KFに結合したが、m/hAng−2−KFに結合せず、一方、A2T mAbは、m/hAng−2−KFに結合したが、h/mAng−2−KFに結合せず(図10B)、このことは、A2BおよびA2Tが異なるエピトープを有し、A2Tのエピトープがアミノ酸411−496領域に含まれることを示す。
A2BおよびA2Tの、(ヒト)Ang−2のその受容体(ヒト)Tie−2への結合を阻止する能力を測定するために、最初に、ELISAプレートをヤギ抗hIgG−Fc(2μg/mL)でコーティングし、その後Tie−2−Fc(0.3μg/mL)でコーティングし、次いで、50または100ng/mLのAng−2を、ハイブリドーマ上清または精製した抗Ang−2 mAbと混合した。結合したAng−2を0.5μg/mLのビオチニル化抗Ang−2抗体(R&D Systems)を用いて検出し、その後、HRP−ストレプトアビジンおよびTMB基質を添加した。このアッセイにおいて、A2BおよびA2Tの両方が、MEDI−3167およびREGN910よりも僅かに強力に、Ab536よりも顕著により強力に、Ang−2のTie−2への結合を完全に阻害した(図11)。
実施例9:ヒト化A2T抗体の構築および特性化
重鎖A2BおよびA2T mAbの軽鎖および重鎖可変領域を、VE1について上記の通りにクローニングし、配列決定し、A2Bの配列を図12に示す。キメラA2T mAbの構築および発現、ならびにヒト化A2T mAbの設計、構築、発現および精製もまた、VE1 mAbにちて上記の通り、標準的な分子生物学的方法を用いて行った。A2Tの(成熟)軽鎖および重鎖可変(V)領域のアミノ酸配列をそれぞれ図13Aおよび13Bに示し、上列にA2Tを示す。図13Aおよび13Bにそれぞれ下線を付して示される、ヒトVK配列AIT39024およびVH配列AIT38751は、A2T VLおよびVH配列との高いフレームワーク相同性のために、それらのアクセプター配列として機能するようにそれぞれ選択された。軽鎖について、マウス配列からの置換を、残基49 (HuA2T−L1)、または残基43および49(HuA2T−L2)で行った。重鎖について、重鎖の残基28、48および49が置換されるか(HuA2T−H1)、またはこれらの残基に加えて残基37および66が置換された(HuA2T−H2)(これらの番号は全てKabatの番号付けに従う)。加えて、各重鎖の2つのバージョンを構築した:パターンN−X−S/Tから予測される位置58の可能性のあるN−結合グリコシル化部位を排除するための、マウス配列由来の位置60のT(重鎖CDR2中)、またはヒトアクセプター配列由来の位置60のAのいずれか。これらのヒト化軽鎖および重鎖V領域配列をそれぞれ図13Aおよび13Bの中レーンに示し(重鎖の位置60にAを有する)、ここで、それらは、それぞれのVE1ドナーおよびヒトアクセプターV領域に対して整列され、CDR(Kabatにより定義される)に下線を引き、上記に列挙した置換アミノ酸に二重下線を引いた。V領域配列は、ヒトκおよびγ−1 C領域と連結させた。ヒト化軽鎖の各々とヒト化重鎖の各々とを組合ることにより、4つの異なるヒト化A2T抗体の2セットを作成し、位置60にTを有するHuA2T ♯1、♯2、♯3および♯4ならびに位置60にAを有するHuA2T #1(d)、#2(d)、#3(d)および#4(d)と命名した(下表に示す通り、各鎖における置換数を括弧内に示す)。さらに、ChA2Tと命名したキメラA2T mAbを、(マウス)VE1のV領域とヒトκおよびγ−1 C領域とを組合せることにより構築した。
重鎖A2BおよびA2T mAbの軽鎖および重鎖可変領域を、VE1について上記の通りにクローニングし、配列決定し、A2Bの配列を図12に示す。キメラA2T mAbの構築および発現、ならびにヒト化A2T mAbの設計、構築、発現および精製もまた、VE1 mAbにちて上記の通り、標準的な分子生物学的方法を用いて行った。A2Tの(成熟)軽鎖および重鎖可変(V)領域のアミノ酸配列をそれぞれ図13Aおよび13Bに示し、上列にA2Tを示す。図13Aおよび13Bにそれぞれ下線を付して示される、ヒトVK配列AIT39024およびVH配列AIT38751は、A2T VLおよびVH配列との高いフレームワーク相同性のために、それらのアクセプター配列として機能するようにそれぞれ選択された。軽鎖について、マウス配列からの置換を、残基49 (HuA2T−L1)、または残基43および49(HuA2T−L2)で行った。重鎖について、重鎖の残基28、48および49が置換されるか(HuA2T−H1)、またはこれらの残基に加えて残基37および66が置換された(HuA2T−H2)(これらの番号は全てKabatの番号付けに従う)。加えて、各重鎖の2つのバージョンを構築した:パターンN−X−S/Tから予測される位置58の可能性のあるN−結合グリコシル化部位を排除するための、マウス配列由来の位置60のT(重鎖CDR2中)、またはヒトアクセプター配列由来の位置60のAのいずれか。これらのヒト化軽鎖および重鎖V領域配列をそれぞれ図13Aおよび13Bの中レーンに示し(重鎖の位置60にAを有する)、ここで、それらは、それぞれのVE1ドナーおよびヒトアクセプターV領域に対して整列され、CDR(Kabatにより定義される)に下線を引き、上記に列挙した置換アミノ酸に二重下線を引いた。V領域配列は、ヒトκおよびγ−1 C領域と連結させた。ヒト化軽鎖の各々とヒト化重鎖の各々とを組合ることにより、4つの異なるヒト化A2T抗体の2セットを作成し、位置60にTを有するHuA2T ♯1、♯2、♯3および♯4ならびに位置60にAを有するHuA2T #1(d)、#2(d)、#3(d)および#4(d)と命名した(下表に示す通り、各鎖における置換数を括弧内に示す)。さらに、ChA2Tと命名したキメラA2T mAbを、(マウス)VE1のV領域とヒトκおよびγ−1 C領域とを組合せることにより構築した。
位置60にTを有するHuA2Tバージョンを、結合および阻止アッセイにおいて位置60にAを有するそれぞれのバージョンと比較したところ、例えば結合については図14Aに、ブロッキングについては図14Bに見られる通り、有意な差異は観察されなかった。さらに、HuA2Tバージョンは、Ang−2に結合し、ならびにChA2Tも結合したが(図14A)、実際に、アッセイにおいて、ChA2Tよりも僅かに多くTie−2へのAng−2の結合を阻止し(図14B)、このことは、ヒト化により活性が失われなかったことを示した。可能性のあるタンパク質の不均一性および他の問題のために抗体V領域にグリコシル化を有しないことが好ましいので、HuA2Tの脱グリコシル化(d)バージョンでさらなる試験を行った。4つ全てのmAb HuA2T ♯1(d)、♯2(d)、♯3(d)および♯4(d)が、同じ程度に結合し(図15A)、阻止し(図15B)、おそらくHuA2T ♯4(d)が他のものよりわずかに優れていた。従って、以下の全てにおいて、HuA2T ♯4(d)を単にHuA2Tと称する。本発明者らはまた、Tie−2へのAng−2の結合を阻止するHuA2Tの活性が、以前に報告されたヒト抗Ang−2 mAb REGN910およびLC06と同程度であることも示した(図16A)。
最後に、本発明者らは、HuA2T、REGN910およびLC06の活性をより生物学的なアッセイで比較した:Ang−2の阻害は、Tie−2リン酸化を誘導した。初めに、HEK293ヒト胎児腎細胞(ATCC CRL 1573)を、発現ベクター中のTie−2遺伝子でトランスフェクションし、そうしてこれらのHEK293−Tie−2細胞は、完全長ヒトTie−2受容体を発現した。細胞を、24ウェルプレート中、10%ウシ胎仔血清を含むDMEM培地中で増殖させた。培地を血清不含有のDMEM−0.1%BSAと交換し、細胞を18時間インキュベートした。種々の濃度のmAbの存在下で、ヒト組換えAng−2(R&D Systems;1μg/mL)で細胞を20分間(37℃、5%CO2)刺激した。リン酸化されたTie−2のレベルを、製造業者の指示書に従ってELISAキット(R&D Systems #DYC2720)により判定した。3つのmAbが、同程度にリン酸化を阻害し、HuA2TはLC06より僅かに強力に阻害した(図16B)。
実施例10:二重特異性HuVE1/HuA2T抗体
B−HuA2T/HuVE1と称される二重特異性抗体を、図1に概略的に示されるBs(scFv)4−IgGフォーマットを用いて、HuVE1 抗VEGF mAbおよびHuA2T 抗Ang−2 mAb由来の結合ドメインを含んで構築した。図1Aの表記に関して、VL1およびVH1はそれぞれ、HuVE1−L1およびHuVE1−H2であり(図3)、一方、VL2およびVH2はそれぞれ、HuA2T−L1およびHuA2T−H2であり(図13)、それぞれの重鎖および軽鎖ドメイン間のリンカーは(G4S)3GSであり、そして定常領域は、ヒトIgG1、κアイソタイプのものである。二重特異性B−HuA2T/HuVE1 mAbがVEGFおよびAng−2に同時に結合することができることを示すために、ELISAプレートをGST−VEGF(グルタミン合成酵素とVEGFの融合タンパク質)でコーティングし、その後、漸増濃度の二重特異性mAbまたは対照mAb HuVE1と共に、次いでhAng−2(F)−KFと共にインキュベートし、HRP−抗Flag M2およびTMB基質を用いて検出した。プレート上のGST−VEGFおよび溶液中のAng−2の両方に結合し得る分子のみが、このアッセイにおいて陽性シグナルを生じ得る。B−HuA2T/HuVE1の場合が陽性であったが、VEGFのみに結合できるHuVE1は陽性ではなかった(図17A)。
B−HuA2T/HuVE1と称される二重特異性抗体を、図1に概略的に示されるBs(scFv)4−IgGフォーマットを用いて、HuVE1 抗VEGF mAbおよびHuA2T 抗Ang−2 mAb由来の結合ドメインを含んで構築した。図1Aの表記に関して、VL1およびVH1はそれぞれ、HuVE1−L1およびHuVE1−H2であり(図3)、一方、VL2およびVH2はそれぞれ、HuA2T−L1およびHuA2T−H2であり(図13)、それぞれの重鎖および軽鎖ドメイン間のリンカーは(G4S)3GSであり、そして定常領域は、ヒトIgG1、κアイソタイプのものである。二重特異性B−HuA2T/HuVE1 mAbがVEGFおよびAng−2に同時に結合することができることを示すために、ELISAプレートをGST−VEGF(グルタミン合成酵素とVEGFの融合タンパク質)でコーティングし、その後、漸増濃度の二重特異性mAbまたは対照mAb HuVE1と共に、次いでhAng−2(F)−KFと共にインキュベートし、HRP−抗Flag M2およびTMB基質を用いて検出した。プレート上のGST−VEGFおよび溶液中のAng−2の両方に結合し得る分子のみが、このアッセイにおいて陽性シグナルを生じ得る。B−HuA2T/HuVE1の場合が陽性であったが、VEGFのみに結合できるHuVE1は陽性ではなかった(図17A)。
個々のmAbとしてのHuVE1およびHuA2Tの活性をB−HuA2T/HuVE1の一部分としてのそれらの活性と比較するために、本発明者らは、初めに、実施例2に記載のVEGF捕捉アッセイを用いてHuVE1およびB−HuA2T/HuVE1の結合活性を比較した。B−HuA2T/HuVE1の結合活性は、EC50による測定としてHuVE1の結合活性より約2倍だけ低下し、重要なことには、ヒトの癌に対して当然ながら有効であることが知られているベバシズマブよりも依然として強い(図17B)。同様に、実施例8に記載の結合アッセイを用いて、B−HuA2T/HuVE1のAng−2に対する結合活性は、HuA2Tの結合活性よりも約3倍低下した。最後に、実施例8に記載の阻止アッセイを用いて、B−HuA2T/HuVE1がVEGFのVEGFR2への結合を阻害する能力(図18A)およびAng−2のTie−2への結合を阻害する能力(図18B)を測定した。B−HuA2T/HuVE1は、VEGFおよびAng−2の両方のそれらの受容体への結合を本質的に完全に阻害することができたが、それぞれHuVE1およびHuA2Tよりも約2倍低い活性であった。HuVE1およびHuA2Tの結合ドメインは、B−HuA2T/HuVE1において一本鎖形態であるため、いくらかの活性低下が予想されない訳ではない。
実施例11:VE1およびHuVE1の、腫瘍異種移植片の増殖を阻害する能力
異種移植実験は、既報のように(Kim et al., Nature 362:841, 1993)、種々の投与レジメンで行われる。一般的には、完全DMEM培地中で増殖させたヒト腫瘍細胞をHBSS中で回収する。メスの胸腺欠損ヌードマウス(5−6週齢)に、背部領域に、0.1mlのHBSS中の2−10×106細胞を皮下注射した。一般的には腫瘍サイズが100mm3に達すると、マウスを無作為に分類し、5mg/kg(合計100μg)のmAbを容量0.1mlで週2回腹腔内投与するか、または示されている他の投与量レジメンを用いて投与する。腫瘍サイズを、2次元[長さ(a)と幅(b)]で測定することにより週に2回測定する。腫瘍体積は、V=ab2/2に従って計算され、平均腫瘍体積±SEMとして表される。各処置群におけるマウスの数は、一般的に、5〜7匹である。統計分析は、例えば、最終データ点についてスチューデントのt検定を用いて行うことができる。
異種移植実験は、既報のように(Kim et al., Nature 362:841, 1993)、種々の投与レジメンで行われる。一般的には、完全DMEM培地中で増殖させたヒト腫瘍細胞をHBSS中で回収する。メスの胸腺欠損ヌードマウス(5−6週齢)に、背部領域に、0.1mlのHBSS中の2−10×106細胞を皮下注射した。一般的には腫瘍サイズが100mm3に達すると、マウスを無作為に分類し、5mg/kg(合計100μg)のmAbを容量0.1mlで週2回腹腔内投与するか、または示されている他の投与量レジメンを用いて投与する。腫瘍サイズを、2次元[長さ(a)と幅(b)]で測定することにより週に2回測定する。腫瘍体積は、V=ab2/2に従って計算され、平均腫瘍体積±SEMとして表される。各処置群におけるマウスの数は、一般的に、5〜7匹である。統計分析は、例えば、最終データ点についてスチューデントのt検定を用いて行うことができる。
図19Aは、VE1(5mg/kg、週2回)による処置が、COLO 205結腸腫瘍(ATCC CCL−222)異種移植片の増殖を阻害したことを示す。同様に、図19Bは、同じ投与量レジメンでのHuVE1 ♯3による処置が、VE1とほぼ同様に、COLO 205異種移植片の増殖を阻害したことを示す。いくつかのモデルにおいてHuVE1が腫瘍異種移植の阻害についてベバシズマブより優れていることを示すために、より高用量ではベバシズマブ自体が非常に有効であるため、低用量の2つのmAbを用いた。ヒト腫瘍をマウスに継代し、細胞系に変換されない、原発性肝腫瘍モデルにおいて、mAbを2.5mg/kgの用量で週2回投与したとき、ベバシズマブと比較してHuVE1の有効性がより優れる傾向があった(図20A、p=0.1)。一方で、ベバシズマブは、6日目および9日目に1mg/kgで投与されたとき、RPMI4788結腸腫瘍細胞の異種移植片に対して有効でなかったのに対し(Roswell Park Institute, M. Aonuma et al., Anticancer Res 19:4039−4044, 1999)、HuVE1は部分的に有効であった(図20B、HuVE1 対 ベバシズマブについて、p=0.01)。
同様に、原発性乳癌異種移植モデルにおいて、mAbを5mg/kgの用量で週に1回投与したとき、ベバシズマブと比較してHuVE1の有効性がより優れる傾向があった(図21)。
本発明は、現在好ましい態様を参照して説明されているが、本発明から逸脱することなく種々の変更が可能であることが理解されるべきである。文脈から特にこれと異なることが明らかでない限り、本発明の任意の工程、要素、態様、特徴または局面は、他のいずれかと共に用いられ得る。受託番号などを含む引用された全ての文献、特許および特許出願は、各個々の文献、特許および特許出願が全ての目的に関して引用によりその内容全体を本明細書中に包含されるように具体的かつ個別に示されているのと同程度に、全ての目的に関してその内容全体を引用により本明細書中に包含させる。用語“本明細書中”とは、該用語“本明細書中”が出現するセクション内のみでなく、本特許出願のどこにでも示されるものとする。2以上の配列が異なる時間に受託番号で関連するとき、本願の有効な出願日における受託番号に関連する配列が意図され、有効な出願日とは、実際の出願日または問題の受託番号を開示する優先権主張出願の出願日より前の日を意味する。
Claims (20)
- VEGFに結合してこれを中和するモノクローナル抗体(mAb)であって、VE1抗体と同じエピトープを有する、モノクローナル抗体。
- 図3Aに記載のVE1の軽鎖可変領域配列由来の3つのCDRを有する軽鎖可変領域および図3Bに記載のVE1の重鎖可変領域配列由来の3つのCDRを有する重鎖可変領域を含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- ヒト化抗体である、請求項2に記載のモノクローナル抗体。
- 図3Aに記載のHuVE1−L1またはHuVE1−L2の配列を有する軽鎖可変領域および図3Bに記載のHuVE1−H1またはHuVE1−H2の配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項2に記載のモノクローナル抗体。
- Fv、FabもしくはF(ab’)2断片または一本鎖抗体である、請求項2に記載のモノクローナル抗体。
- マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する、請求項2に記載のモノクローナル抗体。
- 二重特異性抗体である、請求項2に記載のモノクローナル抗体。
- VEGFに結合する第1の結合ドメインおよびHGFまたはFGF2またはAng−2に結合する第2の結合ドメインを含む、請求項7に記載のモノクローナル抗体。
- VEGFに結合する第1の結合ドメインおよびHGFまたはFGF2またはAng−2に結合する第2の結合ドメインをそれぞれ含む、モノマーからなるホモダイマーである、請求項7に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項2に記載のモノクローナル抗体を含む、医薬組成物。
- 請求項10に記載の医薬組成物を、疾患を有する患者に投与することを含む、該患者の処置法。
- 前記疾患が癌である、請求項11に記載の方法。
- Ang−2に結合してこれを中和するモノクローナル抗体(mAb)であって、A2T抗体と同じエピトープを有する、モノクローナル抗体。
- 図13Aに記載のA2Tの軽鎖可変領域配列由来の3つのCDRを有する軽鎖可変領域および図13Bに記載のA2Tの重鎖可変領域配列由来の3つのCDRを有する重鎖可変領域を含む、請求項13に記載のモノクローナル抗体。
- ヒト化抗体である、請求項14に記載のモノクローナル抗体。
- 図13Aに記載のHuA2T−L1またはHuA2T−L2の配列を有する軽鎖可変領域および図13Bに記載のHuA2T−H1またはHuA2T−H2の配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項15に記載のモノクローナル抗体。
- 二重特異性抗体である、請求項14に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項14に記載のモノクローナル抗体を含む、医薬組成物。
- 請求項18に記載の医薬組成物を投与することを含む、疾患を有する患者の処置法。
- 前記疾患が癌である、請求項19に記載の方法。
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