CN102046803B - 碱性成纤维细胞生长因子的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及碱性成纤维细胞生长因子的中和性单克隆抗体、包含它们的药物组合物以及包括向患者施用此类药物组合物的治疗方法。

Description

碱性成纤维细胞生长因子的单克隆抗体
相关申请的交叉引用
依据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2008年5月29日提交的美国专利申请号61/057,183和于2009年4月17日提交的美国专利申请号61/170,561的权益，所述专利申请以其整体并入本文用于所有目的。
对以计算机可读格式提交的“序列表”、表格、或计算机程序列表的引用
写入文件022382-000820US_SEQLIST.TXT中的序列表为12,406字节，创建于2009年5月28日，用于随同提交的Kyung Jin Kim等人″碱生成纤维细胞生长因子的单克隆抗体″的申请。该文件中所包含的信息特此并入作为参考。
对于在联邦政府资助的研究或开发下取得的发明的权利申明
本申请中所描述的工作部分地得到美国国立卫生研究院的Grant5R44CA101283-03资助。美国政府在本发明中拥有一定的权利。
发明领域
本发明一般地涉及组合单克隆抗体(mAb)和重组DNA技术用于开发新的生物学，更具体地，例如涉及生产能够与碱性成纤维细胞生长因子结合并将其中和的单克隆抗体。
发明背景
原型成纤维细胞生长因子(FGF)、酸性FGF(也称为FGF1)和碱性FG F(也称为FGF2)首次分离于20世纪70年代(FGF2由Gospodarowicz等人，J.Biol.Chem.250：2515，1975分离)。目前有22个已知的FGF家族成员，基于其活性和序列的相似性，可分成7个亚家族(Ornitz等人，Genome Biol.2：3005.1，2001)。然而，FGF家族成员仅与以组织特异性方式表达的4种酪氨酸激酶受体(FGFR14)及其同种型结合。FGF1亚组由FGF1和FGF2组成，其结合所有4种FGFR，其中FGF2与FGFR1c特别强地结合(Ornitz等人，J.Biol.Chem.271：15292，1996)。
成熟形式的人FGF2是18kDa非糖基化多肽，其由衍生自155aa前体的146个氨基酸组成(Ornitz等人，Genome Biol.2：3005.1，2001；Okada-Ban等人，Int.J.Biochem.Cell.Biol.32：263，2000)。该18kDa形式的FGF2不编码信号序列，但是可以通过不依赖ER-Golgi复合物的非常规能量依赖性通道分泌(Mignatti等人，J.Cell Physiol.151：81，1992；Florkiewicz等人，J.Cell Physiol.162：388，1995)。除该18kDa形式之外，单拷贝的FGF2基因还编码该蛋白质的4个高分子量(HMW)形式，通过利用4个可选CUG起始位点(提供各种大小的N-末端延伸)，产生22kDa(196个aa)、22.5kDa(201个aa)、24kDa(210个aa)和34kDa(288个aa)的蛋白质(Florkiewicz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3978，1989；Prats等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1836，1989)。HMW形式不分泌，但被转运到细胞核，在细胞核中其可以以胞内分泌方式调节细胞生长或行为(Dclrieu，FEBS Lett.468：6，2000)。
除了以高亲和性结合FGFR1-4之外，FGF2还以较低的亲和性与硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)结合。尽管FGF2以单体形式分泌，但是细胞表面HSPG使FGF2以非共价的并排构型二聚化，随后这种构型能够使FGF受体二聚化并活化(Mohammadi等人，Cytokine Growth Factor Rev16：107，2005)。FGF和HSPG与FGFR的胞外结构域的结合诱导受体二聚化、活化和自磷酸化。
FGF、特别是FGF2具有在各种细胞类型上的广谱活性(Ornitz等人，Genome Biol.2：3005.1，2001)。FGF2刺激包括成纤维细胞和内皮细胞在内的某些细胞增殖(即，促有丝***的)，并且是某些细胞例如神经细胞的存活因子(抗细胞凋亡)(Okada-Ban，参见上文所引文献)。其还刺激内皮细胞的分化(形态发生)和迁移(运动性)(Dow等人，Urology 55：800，2000)。FGF2参与发育，尤其是神经***的发育。重要的是，FGF2是强效的生血管因子(Presta等人，Cytokine and Growth Factor Rev.16：159，2005)。
据认为，FGF2和其它FGF通过刺激血管生成和直接地刺激肿瘤细胞，在癌症中起作用(Presta等人，参见上文所引文献)。在肿瘤进展期间，癌症细胞可以响应从基质细胞分泌(旁分泌)的胞外FGF2，然后这些肿瘤细胞自身可以分泌FGF2，并以自分泌方式响应FGF2。已经显示FGF2或其受体FGFR1在大多数神经胶质瘤中被表达或过表达(Takahashi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：5710，1990；Morrison等人Cancer Res.54：2794，1994)。FGF2参与***瘤的进展(Dow等人，Urology 55：800，2000)，并且是恶性黑素瘤增殖的关键介质(Wang等人，Nature Med.3：887，1997)。对于唾液腺瘤(Myoken等人，J.Path.178：429，1996)、食管癌(Barclay等人，Clin.Cancer Res.11：7683，2005)和甲状腺癌(Boelaert等人，J.Clin.Endocrin.Metabol.88：2341，2003)，也已报导FGF2或FGFR1的过表达和/或其参与肿瘤进展。
已报导，FGF2的多克隆抗体(抗血清)可以抑制小鼠内可移植软骨肉瘤的肿瘤生长(Baird等人，J.Cell Biochem.30：79，1986)，体外中和FGF2的各种活性(Kurokawa等人，J.Biol.Chem.264：7686，1989)，以及当被局部应用时可以抑制U87神经胶质瘤细胞颅内异种移植物的生长(Stan等人，J.Neurosurg.82：1044，1995)。在单克隆抗体中，已报导DG2mAb可以在体外和在体内中和FGF2的活性(Reilly等人，Biochem.Biophys.Res.Com.164：736，1989；WO 91/06668)，适度抑制裸鼠中大鼠C6神经胶质瘤异种移植物的生长(Gross等人，J.Nat.Cancer Inst.85：121，1993)，以及当损伤内递送而非腹膜内或静脉内递送时适度抑制大鼠软骨肉瘤的生长(Coppola等人，Anticancer Res.17：2033，1997)。类似地，已报导抗-FGF2mAb DE6体外抑制神经胶质瘤细胞的生长(Morrison等人，J.NeuroscienceRes.34：502，1993)。在另一方面，报导抗-FGF2mAb bFM-1和bFM-2体外抑制内皮细胞的生长，但是不体内阻断肿瘤血管生成(Matsuzaki等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9911，1989)。已报导中和性抗-FGF2mAb1E6抑制RPMI4788结肠瘤异种移植物的生长(Aonuma等人，19：4039，1999)。已报导抗-FGF2mAb 254F1抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖，也已报导mAb FB-8体外抑制非小细胞肺癌细胞系增殖(Kuhn等人，LungCancer 44：167，2004)。曾报导抗-FGF2mAb 3H3抑制U87MG和T98G神经胶质瘤以及HeLa细胞异种移植物的生长(Takahashi等人，FEBS Let.288：65，1991)，并且抑制小鼠内K1000FGF2转染的3T3细胞系的生长(Hori等人，Cancer Res.51：6180，1991)。
本文所描述的GAL-F2抗-FGF2mAb在AACR 2009年会上于海报#1236中述及，其为了所有目的整体并入本文。
发明简述
在一个实施方案中，本发明提供了人碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)的中和性mAb。该mAb抑制FGF2的至少一种、优选几种或所有生物学活性，包括与4种FGF受体FGFR1-4中的一种或多种的结合；诱导成纤维细胞、内皮细胞、Mv 1Lu貂肺上皮细胞和/或各种人肿瘤细胞的增殖；和诱导血管生成。该抗-FGF2mAb当被用作单一活性剂时可以抑制此类活性。优选的抗-FGF2mAb抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。优选地，本发明的mAb被遗传工程化，例如嵌合、人源化或人mAb。示例性抗体是GAL-F2及其嵌合形式和人源化形式，以及与GAL-F2具有相同表位或与GAL-F2发生竞争结合的mAb。还提供了产生此类抗体的细胞系。在另一个实施方案中，提供了含有中和性抗-FGF2抗体例如嵌合或人源化GAL-F2的药物组合物。在第三实施方案中，将药物组合物施用于患者以治疗癌症或其它疾病。
附图简述
图1.GAL-F2与对照小鼠mAb(mIgG)和人FGF2(hFGF2)与小鼠FGF29(mFGF2)的结合ELISA。
图2.FGFR-Fc/FGF2-Flag结合ELISA显示，GAL-F2而非对照小鼠mAb 5G8对4种FGF受体FGFR1-4中的每种具有抑制作用。
图3.生物素化GAL F2与各种抗-FGF2mAb对人FGF2的竞争结合测定试验。
图4.GAL-F2或对照mAb 5G8对FGF2诱导的BaF3细胞增殖的抑制，所述BaF3细胞用FGFR1或FGFR2稳定转染。“无(None)”表示没有FGF2(或mAb)施用于细胞上。
图5.GAL-F2或对照mAb 5G8对FGF2诱导的Mv 1Lu貂肺上皮细胞增殖的抑制。“无(None)”表示没有FGF2(或mAb)施用于细胞上。
图6.在对照小鼠mAb(mIgG)、GAL-F2或bFM-1抗-FGF2mAb的存在下克隆在软琼脂中的SMCC-7721细胞的显微照片。
图7.从肿瘤接种后5天开始，用GAL-F2(100μg，每周两次)或PBS单独处理的小鼠中RPMI 4788人结肠瘤异种移植物的生长。
图8.从肿瘤接种后6天开始，用GAL-F2或bFM-1抗-FGF2mAb(100μg，每周两次)或PBS单独处理的小鼠中RPMI 4788人结肠瘤异种移植物的生长。
图9.用PBS单独、GAL-F2(100μg，每周两次)、顺铂(100μg，每周一次)或用GAL-F2和顺铂处理的小鼠中SMMC-7721人肝瘤异种移植物的生长。每组5只小鼠。
图10.从接种后6天开始，用PBS单独、GAL-F2或M225抗-EGFRmAb(100μg，每周两次)或用GAL-F2和M225处理的小鼠中HepG2人肝瘤异种移植物的生长。每组6只小鼠。
图11A和11B.显示HuGAL-F2轻链(A)(SEQ ID NO：2)和重链(B)成熟可变区(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列与小鼠GAL-F2(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4)及人受体V区(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6)进行比对。GAL-F2序列中的CDR用下划线标出，HuGAL-F2序列中用小鼠L2G7氨基酸置换的氨基酸用双下划线标出。对于轻链和重链，均使用1字母氨基酸代码和Kabat编号***。
图12.如本说明书所述进行的人源化(HuGAL-F2)和嵌合(ChGAL-F2)mAb与对照人抗体hIgG的竞争结合。
图13.完整成熟HuGAL-F2抗体轻链(A)(SEQ ID NO：7)和重链(B)(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列。对每行上的第1个氨基酸编号；编号是连续的。在轻链中，Cκ区域的第1个氨基酸用下划线标出，而在重链中，CH 1区、铰链区、CH2和CH3区的第1个氨基酸用下划线标出。
发明详述
本发明提供了中和性抗-FGF2单克隆抗体、含有它们的药物组合物以及使用它们治疗疾病的方法。
1.抗体
抗体是非常大的复杂分子(分子量为～150,000或约1320个氨基酸)，具有复杂的内部结构。天然抗体分子含有相同的两对多肽链，每对具有一条轻链和一条重链。每个轻链和重链又由两个区域构成：参与结合靶抗原的可变区(″V″)，和与免疫***的其它组分相互作用的恒定区(″C″)。轻链和重链可变区在3维空间中靠在一起，形成与抗原(例如在细胞表面上的受体)结合的可变区。在每个轻链或重链可变区内，有3个短片段(长度平均为10个氨基酸)，被称为互补决定区(″CDR″)。抗体可变结构域中的6个CDR(3个来自轻链，3个来自重链)在3-D空间中折叠在一起，形成了锁定在靶抗原上的实际抗体结合位点。CDR的位置和长度已由Kabat，E.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学重要的蛋白质的序列)，U.S.Department of Health and Human Services，1983，1987精确地确定。未包含在CDR中的可变区部分被称为构架，其形成了CDR的环境。Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901，1987已定义了由结构决定的超变区或环的相关概念。
人源化抗体是遗传工程化抗体，其中来自小鼠抗体(″供体抗体″，也可以是大鼠、仓鼠或其它非人物种)的CDR被移植到人抗体(″受体抗体″)上。受体抗体的序列可以是例如，成熟人抗体序列、人抗体序列的共有序列或种系序列。因此，人源化抗体是具有来自供体抗体的CDR和来自人抗体的可变区构架和恒定区的抗体。此外，为了保留高的结合亲和性，可以使用两个额外的结构要素中的至少一个。参考美国专利号5,530,101和5,585,089(并入本文作为参考)，其提供了构建人源化抗体的详细说明。人源化抗体通常具有人源化重链和人源化轻链。通常，人源化重链的重链可变区构架和人源化轻链的轻链可变区构架不包括超过10或12个置换，所述置换产生不存在于受体人重链或轻链可变区构架(包括人共有可变区构架和复合人可变区构架)中的残基。
尽管人源化抗体通常掺入小鼠抗体的所有6个完整CDR(如Kabat所定义)，但是它们也可用少于小鼠抗体的全部CDR来制备(例如Pascalis等人，J.Immunol.169：3076，2002)。在科学文献中已记载过很多抗体，其中对于结合，可以省却1个或2个CDR。Padlan等人，FASEB Journal9：133-139(1995)；Vajdos等人，Journal of Molecular Biology，320：415-428(2002)；Iwahashi等人，Mol.Immunol.36：1079-1091，(1999)；Tamura等人，Journal of Immunology，164：1432-1441(2000)。类似地，仅掺入CDRs的一部分，即结合所需的CDR残基子集(称作SDR)，到人源化抗体中可能是必要的。
可以基于先前的研究(例如CDRH2中的残基H60-H65通常是不需要的)，通过分子建模和/或根据经验，或如Gonzales等人，Mol.Immunol.41：863，2004所述，从位于Chothia超变环之外的Kabat CDR区域中鉴定不接触抗原且不在SDR中的CDR残基。如果省略CDR或其残基，那么其通常用在人受体序列中占据相应位置的氨基酸置换，从而供给可变区构架序列。待包括的此类置换的数目反映竞争考虑的平衡。此类置换对减少人源化抗体中的小鼠氨基酸的数目以及由此减少潜在的免疫原性，可能是有益的。然而，置换也可能引起亲和性的变化，优选避免亲和性的显著减少。也可根据经验选择CDR中置换的位置以及待置换的氨基酸。
在上文提及的用于在人源化抗体中保留高结合亲和性的第一结构要素中，通过在很多已知的人抗体中适当地选择受体抗体，选择人源化抗体的重链可变区的构架，使得与供体抗体的重链可变区的构架具有最高序列同一性(65％～95％)。在第二结构要素中，在构建人源化抗体时，依照规定的规则，将人受体抗体的构架中的选定氨基酸(CDR之外)用来自供体抗体的相应氨基酸取代。具体来说，选择构架中待取代的氨基酸是以其与CDR相互作用的能力为基础的。例如，如在3维空间中测量，被取代的氨基酸可以在供体抗体序列中与CDR邻近，或在人源化抗体中位于CDR的4-6埃内。
嵌合抗体是其中小鼠(或其它啮齿类动物)抗体的可变区与人抗体的恒定区组合的抗体；通过遗传工程的方法构建它们是众所周知的。此类抗体尽管约2/3为人的，但保留小鼠抗体的结合特异性。存在于小鼠、嵌合和人源化抗体中的非人序列的比例表明，嵌合抗体的免疫原性介于小鼠与人源化抗体之间。与小鼠抗体相比可以具有降低的免疫原性的其它遗传工程化抗体类型包括利用噬菌体展示方法(Dower等人，WO91/17271；McCafferty等人，WO92/001047；Winter，WO92/20791；和Winter，FEBSLett.23：92，1998，其各自并入本文作为参考)或使用转基因动物(Lonberg等人，WO93/12227；Kucherlapati WO91/10741，其各自并入本文作为参考)制备的人抗体。
如本文所用，术语″人样″抗体指的是1条或2条链的氨基酸序列的相当部分(例如约50％或以上)源自人免疫球蛋白基因的mAb。因此，人样抗体包括但不限于嵌合、人源化和人抗体。如本文所用，具有″降低的免疫原性″的mAb是当施用于人患者时预期具有比小鼠抗体显著更低的免疫原性的mAb。此类抗体包括嵌合、人源化和人mAb以及通过取代小鼠抗体中可能对B-细胞或T-细胞表位作出贡献的特定氨基酸(例如暴露的残基(Padlan，Mol.Immunol.28：489，1991))而制备的mAb。如本文所用，″遗传工程化″mAb是已借助于重组DNA技术将其编码基因构建或放置到非天然环境中(例如小鼠中或噬菌体上的人基因)的mAb，因而不包括例如用常规杂交瘤技术制备的小鼠mAb。
mAb的表位是与mAb结合的抗原的区域。两种抗体如果彼此一个竞争性抑制(阻断)另一个与抗原的结合，那么它们结合相同的或重叠的表位。也就是说，在竞争结合分析试验中测量时(参见例如Junghans等人，CancerRes.50：1495，1990)，1x、5x、10x、20x或100x过量的一种抗体可以抑制另一种抗体的结合达至少50％，但优选75％、90％或甚至99％。或者，如果两者抗体结合抗原的相同区域，或者如果抗原中导致一种抗体的结合减少或消除的基本上所有氨基酸突变都可以导致另一种抗体的结合减少或消除，则这两种抗体具有相同的表位。如果降低或消除了一种抗体的结合的某些氨基酸突变可以降低或消除另一种抗体的结合，那么这两种抗体具有重叠的表位。
2.中和性抗-FGF2抗体
对于与FGF2结合的单克隆抗体(mAb)(即抗-FGF2mAb)，如果其结合部分地或完全地抑制了FGF2的一种或多种生物学活性(即当mAb作为单一活性剂使用时)，则其被称为可以中和FGF2，或是中和性的。中和性抗体可以抑制的FGF2生物学活性包括：FGF2与4种FGF受体中的一种或多种结合的能力；刺激包括成纤维细胞、内皮细胞、Mv 1Lu貂肺上皮细胞和各种人肿瘤细胞在内的某些细胞增殖(即促有丝***)的能力；刺激细胞例如内皮细胞的分化和迁移或刺激血管生成的能力，例如通过刺激人血管内皮细胞(HUVEC)增殖或管形成、或通过施加于鸡胚尿囊绒膜(CAM)时诱导血管而测量。
当通过在实施例中描述的方法或本领域已知的方法进行测定时，浓度为例如0.01、0.1、0.5、1、2、5、10、20或50μg/ml的本发明中和性mAb抑制FGF2的生物学功能约至少50％、但优选75％、更优选90％或95％或甚至99％、最优选约100％(基本上完全抑制)。通常，在使用的FGF2的量刚好足以完全刺激生物学活性或者为1、2或5ng/ml或0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、3或10μg/ml时，测量抑制程度。优选地，mAb当作为单一活性剂使用时是中和性的，即抑制生物学活性，但是任选地可以2种mAb一起使用以产生抑制。最优选地，mAb中和不仅仅1种而是2种、3种或几种上面列出的生物学活性；对本发明的目的而言，作为单一活性剂使用时中和FGF2的所有生物学活性的抗-FGF2mAb被称为“完全中和性的”，这种mAb是最优选的。本发明的mAb优选对FGF2具有特异性，即它们将不结合或仅仅以小得多的程度(例如小至少10倍)结合与FGF2有关的蛋白质，例如另一种FGF如FGF1，和血管内皮生长因子(VEGF)。本发明的某些mAb结合人FGF2和小鼠FGF2，或结合人FGF2以及小鼠、大鼠、兔、鸡、狗和/或猴(例如食蟹猴)FGF2中的1种、2种或更多或所有。其它mAb对人FGF2具有特异性。本发明的mAb通常对FGF2的结合亲和性(Ka)为至少107M-1，但优选108M-1或更高，最优选109M-1或更高或甚至1010M-1或更高。
本发明的mAb包括天然四聚体形式的抗-FGF2抗体(2条轻链和2条重链)，可以是任何已知的同种型IgG、IgA、IgM、IgD和IgE及它们的亚型，即人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。本发明的mAb也意在包括抗体片段，例如Fv、Fab和F(ab′)2；双功能杂交抗体(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17：105，1987)、单链抗体(Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879，1988；Bird等人，Science 242：423，1988)；单臂抗体(Nguyen等人，Cancer基因Ther.10：840，2003)；和恒定区改变的抗体(例如美国专利号5,624,821)。mAb可以是动物来源(例如小鼠、大鼠、仓鼠或鸡)，或者它们可以被遗传工程化。啮齿动物mAb可以通过本领域众所周知的标准方法来制备，包括用适当佐剂中的FGF2通过腹膜内、静脉内或脚垫内进行多次免疫，然后提取脾脏或***细胞，并与适合的永生化细胞系融合，然后筛选产生结合FGF2的抗体的杂交瘤，例如参见下面实施例。通过上面述及的本领域已知方法制备的嵌合和人源化mAb是本发明的优选实施方案。人抗体，例如通过噬菌体展示或转基因小鼠方法制备的人抗体，也是优选的(参见例如Dower等人，McCafferty等人，Winter，Lonberg等人，Kucherlapati，同上)。
下文所述的中和性抗-FGF2mAb GAL-F2是本发明的实施例。一旦具有本文所述的中和FGF2的期望性质的单个原型抗-人-FGF2mAb例如GAL-F2已被分离，那么通过使用本领域已知方法产生具有类似性质的其它mAb是简单的。例如，可以如上所述用FGF2免疫小鼠，产生杂交瘤，并且对所得mAb与原型mAb竞争结合FGF2的能力进行筛选。也可以用含有与GAL-F2结合的表位的更小FGF2片段，免疫小鼠。可以通过例如筛选与跨FGF2的一系列重叠肽的结合来定位该表位。或者，Jespers等人，Biotechnology 12：899，1994(其并入本文作为参考)的方法可以用于指导选择与原型mAb例如GAL-F2具有相同表位因而具有类似性质的mAb。采用噬菌体展示法，首先将原型抗体的重链与一个(优选人)轻链库进行配对来选择FGF2-结合性mAb，然后将新轻链与一个(优选人)重链库进行配对来选择与原型mAb具有相同表位的(优选人)FGF2-结合性mAb。或者GAL-F2的变体可以通过对得自杂交瘤的编码GAL-F2的重链和轻链的cDNA进行诱变而获得。
与GAL-F2具有相同或重叠表位的中和性mAb(例如与GAL-F2竞争结合FGF2的中和性mAb)提供了其它实施例。GAL-F2的嵌合或人源化形式是特别优选的实施方案。本发明还包括在重链和/或轻链可变区的氨基酸序列上与GAL-F290％、95％或99％相同且保持其功能性质的mAb、和/或与GAL-F2相差少数个功能上不重要的氨基酸置换(例如保守性置换)、缺失或***的mAb。还包括具有与GAL-F2的相应CDR 90％、95％或99％或100％相同的至少1个CDR、优选所有6个CDR的mAb。在这里以及在本申请的其它地方，序列同一性百分比用通过Kabat编号规则进行最大比对的抗体序列来确定。在比对后，如果主题抗体区域(例如重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区域正被相比，那么主题与参考抗体区域之间的序列同一性百分比是在主题与参考抗体区域两者中被相同氨基酸占据的位置的数目除以两个区域的比对位置的总数(不算空位)，再乘以100转化为百分比。
可以由杂交瘤生产本发明的天然mAb。遗传工程化mAb例如嵌合或人源化mAb可以通过多种本领域已知的方法来表达。例如，编码其轻链和重链V区的基因可以由重叠寡核苷酸合成，并与可得C区一起***到表达载体(例如，可从Invitrogen商购)中，所述表达载体提供必要的调控区例如启动子、增强子、plyA位点等。优选使用CMV启动子-增强子。然后使用各种众所周知的方法例如脂转染或电穿孔，将表达载体转染到各种哺乳动物细胞系例如CHO或非生产性骨髓瘤(包括Sp2/0和NS0)中，并且通过适合的抗生素筛选来选择表达抗体的细胞。参见例如，美国专利号5,530,101。更大量的抗体可以通过在商购的生物反应器中生长细胞来产生。
本发明的mAb或其它抗体一旦被表达，可以根据本领域的标准程序进行纯化，例如微滤、超滤、蛋白A或G亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法和/或基于有机染料的其它亲和色谱形式等。对于药物应用来说，具有至少约90或95％同质性的基本上纯的抗体是优选的，98％或99％或以上的同质性是最优选的。
3.治疗方法
本发明提供了治疗方法，其中将本发明的mAb(例如抗-FGF2)施用于患有疾病(治疗疗法)或处于疾病发生或复发的危险中(预防疗法)的患者。术语″患者″包括人患者；兽患者，例如猫、狗和马；家畜，例如牛、羊和猪；和用于试验目的的实验室动物，例如小鼠和大鼠。该方法特别适合于治疗人患者。治疗人患者的方法中所用的mAb与人FGF2蛋白结合，所述人FGF2蛋白的序列由例如Ornitz等人，Genome Biol.2：3005.1，2001或Okada-Ban等人，Int.J.Biochem.Cell.Biol.32：263，2000以及Swiss-Prot数据库的Locus P09038提供。针对人蛋白的mAb还可用于其它物种，其中该物种同源物与该人蛋白具有抗原交叉反应性。在缺乏这种交叉反应性的物种中，使用对存在于该物种中的物种同源物具有适当特异性的抗体。然而，在实验室动物的异种移植物实验中，通常使用对由异种移植物表达的人蛋白具有特异性的mAb。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了含有本文所述的抗体的药物制剂。该抗体的药物制剂在生理可接受的载体中含有mAb，任选带有赋形剂或稳定剂，采用冻干形式或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受体没有毒性，并包括pH通常为5.0～8.0、最通常为6.0～7.0的缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐或乙酸盐；造成等渗的盐例如氯化钠、氯化钾等；抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水性聚合物例如聚山梨醇酯80、氨基酸、碳水化合物、螯合剂、糖类，以及其它本领域技术人员已知的标准成分(《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Science)第16版，Osol，A.编辑.1980)。mAb通常以1-100mg/ml的浓度存在，例如10mg/ml。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了使用药物制剂中的抗-FGF2mAb治疗患者疾病的方法。制备成药物制剂的mAb可以通过任何适当的途径、特别是通过静脉内输注或者肌内或皮下推注的胃肠外途径施用于患者。静脉内输注可以在少至15分钟内给予，但是更通常进行30分钟，或历经1、2或甚至3小时。mAb也可以被直接注射到疾病部位(例如肿瘤)中，或包囊在携带剂如脂质体中。给予的剂量足以至少部分减轻所治疗的病症(″治疗有效剂量″)，任选为0.1～5mg/kg体重，例如1、2、3或4mg/kg，但是可以高达10mg/kg或甚至15、20或30mg/kg。也可以给予固定的单位剂量，例如100、200、500、1000或2000mg，或剂量也可以基于患者的表面积，例如1000mg/m2。通常施用1～8个剂量(例如1、2、3、4、5、6、7或8个剂量)来治疗癌症，但是也可以给予10、20个或更多的剂量。mAb可以根据例如mAb的半衰期，以每天、一周两次、每周、每两周、每月、或某些其它的时间间隔，施用1周、2周、4周、8周、3-6个月或更长时间、或直到疾病进展。对于长期施用来说，重复的治疗过程也是可能的。
可以有效地至少部分减轻存在于待治疗患者中的疾病的剂量、施用频率和施用途径的组合，被称作是治疗有效方案。有效地抑制或延缓患者疾病发作的剂量、施用频率和施用途径的组合，被称作是预防有效方案。
对于使用本发明的抗-FGF2mAb治疗特别敏感的疾病包括据认为需要血管生成或与FGF2水平升高有关或与FGF2表达有关的实体肿瘤。适合于用抗-FGF2mAb治疗的此类肿瘤包括例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌(小细胞或非小细胞)、结肠癌、***癌、***、子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌、或肝癌、头颈部肿瘤、黑素瘤、肉瘤、癌和脑瘤(例如神经胶质瘤例如胶质母细胞瘤)。恶性血液病例如白血病和淋巴瘤和多发性骨髓瘤也可对此类治疗敏感。适合于用本发明的抗-FGF mAb治疗的其它与血管生成有关的疾病包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、新生血管性青光眼和其它眼睛疾病；银屑病和其它皮肤疾病；和类风湿性关节炎。
在一个优选的实施方案中，抗-FGF2mAb与其它疗法组合(即一起，也就是说，之前、期间或之后)施用。例如，为治疗癌症，抗-FGF2mAb可以与任何一种或多种已知的化疗药物一起施用，例如烷化基，例如卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、卡铂、奥沙利铂、丙卡巴肼和环磷酰胺；抗代谢药例如氟尿嘧啶、氟脲苷、氟达拉滨、吉西他滨、氨甲喋呤和羟基脲；天然产物，包括植物生物碱和抗生素例如博来霉素、多柔比星、柔红霉素、伊达比星、依托泊苷、丝裂霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春花新碱和泰素(Taxol，紫杉醇)或相关的化合物例如拓扑异构酶1抑制剂伊立替康；特别批准用于脑肿瘤的药剂，包括替莫唑胺和含有卡莫司汀的wafer；酪氨酸激酶抑制剂例如(甲磺酸伊马替尼)、(苹果酸舒尼替尼)、(索拉非尼)、(埃罗替尼)和(吉非替尼)；血管生成抑制剂；以及在WO 2005/017107A2(在此并入本文作为参考)中列出的所有被批准的和实验的抗癌药。抗-FGF2mAb可以与用于标准化疗方案的这些其它药剂中的1、2、3种或更多种组合使用。通常，该其它药剂是早就已知对正在治疗的特定癌症类型有效的那些药剂。抗-FGF2mAb尤其可以用于克服对化疗药物的耐药性，因而增加其有效性(参见Song等人Proc.Natl.Acad.Sci USA 97：8658，2000)。
为治疗癌症可以与抗-FGF2mAb一起施用的其它药剂包括生物药例如单克隆抗体，包括针对HER2抗原的HerceptinTM；针对VEGF的或针对表皮生长因子(EGF)受体的抗体例如(西妥昔单抗)和(帕尼单抗)。尤其优选针对肝细胞生长因子(HGF)的抗体与抗-FGF2mAb一起使用，包括mAb L2G7(Kim等人，Clin Cancer Res12：1292，2006和美国专利号7,220,410)、特别是其嵌合和人源化形式例如HuL2G7(WO 07115049A2)；在WO 2005/017107A2中、特别是在2.12.1中所述的人抗-HGF mAb；和在WO 07143090A2或WO 07143098A2中所述的HGF结合蛋白；以及其它与任意前述mAb竞争结合的中和性抗-HGF mAb。与HGF的cMet受体结合的mAb也是优选的，例如已被遗传工程化成仅含有一个″臂″，即结合结构域，的抗-cMet mAbOA-5D5(Martens等人，Clin.Cancer Res.12：6144，2006)。而且，抗FGF2mAb可以与任何形式的外科手术和/或放射疗法，包括外线束放射、调强放射疗法(IMRT)和任何形式的放射外科手术例如伽玛刀，一起使用。
包括抗-FGF2mAb抗体的治疗(例如标准化疗)，与不使用抗-FGF2mAb的同样治疗(例如化疗)相比，可以通过增加癌症患者的中位无进展存活时间或总存活时间至少30％或40％，但是优选50％、60％至70％或甚至100％或以上来减轻疾病。此外或备选地，包括抗-FGF2mAb的治疗(例如标准化疗)，与不使用抗-FGF2mAb的同样治疗(例如化疗)相比，可以增加患有这些肿瘤(例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和胶质母细胞瘤，特别是在复发或难治疗的时候)的患者的完全应答率、部分应答率或客观应答率(完全+部分)至少30％或40％，但是优选50％、60％至70％或甚至100％。
通常，在临床试验中(例如II期、II/III或III期临床试验)，上面提到的与接受仅化疗(或加上安慰剂)的患者的对照组相比，用化疗加上抗-FGF2mAb治疗的患者的中位无进展存活和/或应答率的增加，是有统计学意义的，例如在p＝0.05或0.01或甚至0.001水平上。完全和部分应答率通过癌症临床试验中常用的客观标准(例如美国国家癌症研究所和/或美国食品与药品管理局所列出的或接受的客观标准)来确定。
4.其它方法
本发明的抗-FGF2mAb也在诊断、预后和实验室方法中有用。它们可以用于测量肿瘤中或肿瘤患者的循环中FGF2的水平，以确定是否该水平是可测量的或甚至升高的，从而跟踪并指导肿瘤的治疗，这是因为与可测量的或升高的FGF2水平有关的肿瘤将对于使用抗-FGF2mAb的治疗是最敏感的。例如，与高水平FGF2有关的肿瘤将对于使用抗-FGF2mAb的治疗特别敏感。在特定的实施方案中，mAb可以用于ELISA或放射性免疫分析，以测量例如肿瘤活检标本或血清中或FGF2分泌性细胞的细胞培养物的培养基上清液中的FGF2水平。使用与不同表位结合(即非竞争结合)的两个抗-FGF2mAb将在开发检测FGF2的灵敏性″三明治″ELISA中特别有用。对于各种分析方法来说，mAb可以用荧光分子、自旋标记分子、酶或放射性同位素进行标记，并且可以以带有所有进行FGF2分析所必需的试剂的试剂盒形式供应。在其它应用中，抗-FGF2mAb可以用于例如通过亲和色谱法纯化FGF2。
实施例
实施例1：试剂和分析试验
GST-FGF2、FGF2-Fc和FGF2-Flag的制备。合成人FGF2的cDNA序列(具有155个氨基酸的前体形式；Sommer等人，1987)(GenScript，Inc)，进行PCR扩增，并克隆到pDisplay载体(Invitrogen)的衍生物中。将这些质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞，使用1mM IPTG诱导FGF2表达。FGF2表达的水平用FGF2特异性ELISA试剂盒(R&D Systems)来测定；如所述(Wiedlocha等人，Mol.Cell Biol.16：270，1996)，用肝素SepharoseCL-6B珠(Amersham Biosciences)纯化FGF2。FGF2分别与谷氨酰胺合成酶(GST-FGF2)、Flag肽(FGF2-Flag)和人IgG1Fc结构域(氨基酸216至446；FGF2-Fc)的融合蛋白(其用于FGF2/FGFR结合分析试验以及用于免疫)，用标准分子生物学技术由适当的遗传构建体，类似地制得。GST-FGF2用抗-GST柱纯化，FGF2-Fc用蛋白A/G柱纯化，而在测定FGF2-Flag浓度之后使用培养物上清液中的FGF-Flag。此外，购买纯化的人FGF2(QEDBioscience Inc.)和鼠FGF2(ProSpec-Tany Technogene Ltd.)。
FGFR-Fc蛋白的制备。人FGFR1α(IIIc)(被命名为FGFR1c)和人FG FR2Cα(IIIc)(被命名为FGFR2c)的胞外结构域(ECD)被表达成免疫粘附素分子。将编码FGFR1c和FGFR2c的整个ECD的DNA片段通过多肽接头与人Fc融合。通过转染人293F细胞、在293表达培养基(Invitrogen)中在G418(1mg/ml)的存在下选择稳定的293转染子，表达这些FGFR-Fc分子。使用蛋白A/G柱纯化由293F转染细胞分泌的FGFR-Fc。此外，人FG FR3c-Fc和人FGFR4-Fc融合物得自R&D Systems。
FGF2片段的合成。通过SynBioSci合成了由FGF2的氨基酸残基29-44(肽#1)、101-118(肽#3)和137-155(肽#4)组成的肽。额外的半胱氨酸残基被加至肽#1与#3的C-末端和肽#4的N-末端。然后将这些肽片段与钥孔傶血兰蛋白(KLH)缀合。
FGF2结合性ELISA。在4℃将ELISA孔用50μg/ml肝素(Sigma)包被过夜，然后在室温(RT)与0.3-1μg/ml人或小鼠FGF2孵育1小时，以使肝素能捕获FGF2。在RT用2％BSA封闭1小时后，在RT加入杂交瘤培养物上清液或纯化过的mAb达1小时。通过在RT加入HRP-山羊抗-小鼠IgG Fc达1小时、然后洗涤、加入TMB底物(Sigma)并在450nm读数，检测结合的抗-FGF2抗体。
FGFR-Fc/FGF2-Flag结合性ELISA。在FGFR-Fc/FGF2-Flag结合性ELISA中测定抗-FGF2mAb的阻断活性。在4℃将ELISA孔用2μg/ml对人IgG-Fc具有特异性的山羊抗体包被过夜。在RT用2％BSA封闭1小时后，将各孔用0.Sμg/ml FGFR1c-Fc、FGFR2c-Fc、FGFR3c-Fc或FGFR4-Fc孵育1小时。在洗涤后，在各种浓度的mAb的存在下各孔用FGF2-Flag(0.2μg/ml)孵育1小时。通过加入HRP-抗-Flag M2抗体(Sigma)来检测结合的FGF2-Flag。
实施例2：单克隆抗体的产生
Balb/c小鼠(5-6周龄，雌性)通过下述进行免疫：如下表所示，在小鼠后脚垫中，用重新悬浮于MPL/TDM(Sigma-Aldrich)中的GST-FGF2、FGF2-Fc和/或KLH缀合的FGF2合成肽，按1周的间隔注射14次。最后一次注射后3天，使用标准融合方法用35％聚乙二醇将腿弯部的淋巴细胞与P3/X63-Ag8U1小鼠骨髓瘤细胞融合，方法如所述(Chuntharapai等人，Methods Enzymol 288：15，1997)。融合后10天，利用上述的FGF2结合性ELISA对杂交瘤培养物上清液结合FGF2的能力进行筛选。然后在FGFR1-Fc/FGF-Flag结合性ELISA中对选择的mAb的阻断活性进行筛选。然后用有限稀释技术，如所述(Harlow等人，1988)，将所选杂交瘤克隆两次。
表：免疫方案
  注射次数   抗原(在MPL/TDM中)/脚垫
1 GST-FGF210μg
  2   GST-FGF25μg
  3   GST-FGF22.5μg
  4-7   GST-FGF25μg
  8-9   GST-FGF210μg
  10   GST-FGF2(5μg)+FGF2-Fc(5μg)
  11   FGF2-Fc(2μg)+肽#1&#3(2μg)
  12   FGF2-Fc(2μg)+肽#1，#3&#4(3μg)
  13   FGF2-Fc(2μg)+肽#1，#3&#4(3μg)
  14   FGF2-Fc 2μg
图1显示，用这种方法产生的mAb GAL-F2近乎同等良好地与人FGF2和小鼠FGF2结合，而阴性对照小鼠IgG mAb不与FGF2结合。图2显示，GAL-F2、而不是对照mAb 5G8能抑制人FGF2与4种FGF受体FGFR1-4之每种的结合。在使用上述的FGFR-Fc/FGF2-Flag结合性ELISA的另一个实验中，GAL-F2(以10μg/ml的浓度)完全抑制了FGF2与4种FGFR——FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4——之每种的结合，即，将信号降低到在实验误差内的背景水平，而抗-FGF2mAb bFM-1和3H3使结合大幅度但未完全降低。
实施例3：GAL-F2的表位
购买了已报导具有某些中和活性的数种市售可得的抗-FGF2mAb-3H3(Calbiochem)、mAb bFM-1(Millipore)和mAb FB-8(Abcam)。进行竞争结合ELISA，以确定是否GAL-F2具有与任何这些mAb相同的表位。将ELISA板用50μl/孔肝素(50μg/ml)包被过夜，轻轻倒出，用50μl/孔FGF2孵育1小时。用2％BSA封闭后，在待测试的不同浓度的各抗-FGF2mAb的存在下用0.5μg/ml生物素化GAL-F2mAb孵育各孔。通过加入HRP-链霉亲和素、然后加入TMB底物来检测各孔中与FGF2结合的生物素化GAL-F2的水平。图3显示，虽然当然GAL F2与自身竞争，但是mAb 3H3、bFM-1和FB-8以及阴性对照小鼠mAb(mIgG)无一与GAL-F2竞争结合FGF2。因此，所测试的已有抗-FGF2mAb无一与GAL-F2在FGF2上具有相同或重叠的表位。
实施例4：GAL-F2抑制FGF2诱导的增殖
将BaF3细胞(DSMZ，Germany)保持在补充有10％FCS、10％WEHI-3条件培养基和抗生素的RPMI 1640培养基(GIBCO)中。如所述(Ornitz等人，1996)，通过线性化FGFR1c和FGFR2c表达载体DNA的电穿孔，产生稳定的FGFR1c或FGFR2c表达性Ba/F3细胞。使用G418(600μg/ml)对稳定的转染细胞进行10天选择。表达FGFR1c或FGFR2c的稳定Ba/F3转染子显示出在缺乏WEHI-3培养基下响应于FGF2而增殖。为了测定GAL-F2mAb的阻断(中和)活性，洗涤FGFR1c-或FGFR2c-表达性BaF3细胞(10,000细胞/孔)，在各种浓度的GAL-F2的存在下将其重新悬浮于具有10％FCS+2μg/ml肝素和20ng/ml FGF-2的RPMI中。在37℃和5％CO2孵育36-48小时后，通过加入WST-1(RocheApplied Science)2小时，测定增殖水平。图4显示，GAL F2抑制FGF2诱导的增殖，在10μg/ml mAb时达到几乎完全抑制。
使用Mv 1Lu貂肺上皮细胞(来自ATCC的CCL-64)测定GAL-F2在正常上皮细胞上的阻断活性。将生长于含有10％FCS的DMEM中的Mv1Lu细胞(2×103细胞/100μl/孔)重新悬浮于无血清DMEM中，在各种浓度的mAb的存在下用1-2ng/ml FGF2+1ng/ml TGF-β(以抑制背景增殖)刺激24小时。通过加入WST-1(Roche Applied Science)24～48小时来测定细胞增殖的水平。图5显示，GAL-F2抑制FGF2诱导的Mv 1Lu细胞的增殖，在1μg/ml mAb时几乎完全抑制。在类似的实验中，GAL-F2抑制由10ng/ml FGF2诱导的HUVEC增殖，在0.1μg/ml的浓度时(即在与FGF2约等摩尔比值时)抑制约75％，而在1.0μg/ml的浓度时完全抑制。这有几分好于bFM-1抗-FGF2mAb的抑制程度，明显好于3H3抗-FGF2mAb，并且表明GAL-F2抑制血管生成，因为内皮细胞的增殖是血管生成的必要步骤。
实施例5：产克隆试验
通过GAL-F2对软琼脂中人肿瘤细胞的集落形成的影响，对GAL-F2的抗-肿瘤活性进行了体外研究。如下进行试验：用在含有10％FCS的DMEM中的1.5ml/孔0.6％琼脂包被6孔板，然后层叠上在含有10％FCS的DMEM中的1.5ml 0.3％琼脂。将上层琼脂与2×104SMMC-7721人肝瘤细胞+10μg/ml mAb混合。在37℃、在潮湿培养箱中将板孵育10至14天，然后用0.005％结晶紫染色1小时，经显微照相术检查。图6显示，与存在无关对照小鼠IgG mAb时的细胞相比，存在GAL-F2时的细胞形成了很多更少的集落，而bFM-1抗-FGF2mAb并未使集落数目减少。因此，GAL-F2抑制软琼脂中人肿瘤细胞的集落形成。
实施例6：血管生成测定试验
在BALB/c小鼠中后背注射含有或未含30ng FGF2和/或3μg GAL-F2的0.4ml Matrigel(BD Biosciences)，测定了GAL-F2的抗-血管生成活性。第6天收获Matrigel样本(plug)用于摄影术。在此测定试验中FGF2刺激血管形成，然而GAL-F2至少部分抑制了这种刺激作用。
实施例7：异种移植物模型
如先前所述(Kim等人，Nature 362：841，1993)，进行异种移植物实验。在HBSS中收集通常生长于完全DMEM培养基中的人肿瘤细胞。用0.1mlHBSS中的2～10×106个细胞在背部区域中对雌性无胸腺裸鼠或NIH-IIIXid/Beige/裸鼠(4-6周龄)进行皮下注射。当肿瘤尺寸达到50-100mm3时，将小鼠随机分组，每周两次以0.1ml的体积腹膜内施用5mg/kg(总共100μg)mAb。每周通过测量两个维度[长度(a)和宽度(b)]两次来确定肿瘤尺寸。根据V＝ab2/2计算肿瘤的体积，其被表示为平均肿瘤体积±SEM。每个处理组中的小鼠数目通常为5-7个小鼠。可以例如使用Student t检验进行统计学分析。
图7显示，GAL-F2强烈地抑制RPMI 4788结肠瘤异种移植物的生长，而图8显示，bFM-1抗-FGF2mAb抑制异种移植物生长的程度小于GAL-F2。图9显示，GAL-F2抑制Xid/Beige/裸鼠中的SMMC-7721肝瘤异种移植物，而每周1次5mg/kg的化疗药顺铂抑制异种移植物生长的程度较小。GAL-F2与顺铂的组合比单独任一种药剂的抑制作用更强，显示这些药剂的加和效应或协同效应。图10显示，GAL-F2比所源自的抗-EGF受体mAb M225更强地抑制裸鼠中的HepG2肝瘤异种移植物，但是GAL-F2与M225的组合比任单一种药剂的抑制作用都强些，再次显示这些药剂的加和效应或协同效应。但是，GAL F2不能抑制所测试的所有异种移植物的生长，这可能是因为它们的生长不依赖于FGF2。
实施例8：GAL-F2的人源化
使用分子生物学的标准方法，进行GAL-F2mAb的轻链和重链可变区的克隆、嵌合mAb的构建和表达、以及人源化GAL-F2mAb的设计、构建、表达和纯化，例如如美国专利申请11/731,774中针对L2G7mAb所述的方法，所述专利申请为了所有目的并入本文作为参考。GAL-F2的(成熟)轻链和重链可变(V)区的氨基酸序列分别示于图11A和11B，顶行标记GAL-F2。更具体地，为了设计人源化GAL-F2mAb，通常遵照Queen等人、美国专利号5,530,101和5,585,089的方法。人Vκ序列ABA70776和VH序列AAL04519分别示于图11A和11B(末行)，它们分别被选择用作GAL-F2VL和VH序列的受体序列，因为它们与GAL-F2VL和VH序列具有特别高的构架同源性(即序列同一性)。使用计算机产生的GAL-F2可变结构域的分子模型来定位GAL-F2构架中与CDR足够靠近以致于有可能与CDR相互作用的氨基酸。为了设计人源化GAL-F2轻链和重链可变区，将来自小鼠GAL-F2mAb的CDR首先概念性地移植到受体构架区中。在计算机模型表明与CDR有明显接触、可能是维持CDR构象所需的构架位置上，用来自小鼠抗体的氨基酸取代人构架氨基酸。对于命名为HuGAL-F2的人源化GAL-F2mAb来说，使用Kabat编号，这在重链的残基1、27和30(残基27和30在Chothia超变环H1中)、48、67、71和94上进行，而在轻链上没有残基进行这种取代。HuGAL-F2的轻链和重链V区序列分别示于图11A和11B，中间行标记HuGAL-F2，其中它们与相应的GAL-F2供体和人受体V区比对——CDR(按Kabat定义)用下划线标出，而上文列出的取代氨基酸用双下划线标出。
本发明不仅提供了包括示于图11的轻链和重链V区的人源化GAL-F2mAb HuGAL-F2，而且提供变体人源化GAL-F2mAb，其轻链和重链可变区与HuGAL-F2的序列相差少数个(例如通常不超过1、2、3、5或10个)取代、缺失或***——通常在构架中但也可以在CDR中。特别地，可以在受体构架中进行仅仅上述置换的子集，或者可以进行另外的置换，例如小鼠GAL-F2VH氨基酸69L可以取代受体氨基酸69I，或小鼠氨基酸可以在人源化轻链中于Kabat编号的位置1、3、60和/或67中的任一个或所有位置上取代相应的氨基酸。另一方面，VH氨基酸1E(GIu)可以被替换为Q(Gln)。实际上，HuGAL-F2中很多未与CDR接触的构架残基可以接受来自GAL-F2或其它小鼠或人抗体的相应位置的氨基酸的置换，甚至许多可能的CDR接触性残基也适于置换，或者甚至可以改变CDR中的氨基酸。CDR置换的一个实例是用占据人受体序列(其用于提供可变区构架)相应位置的残基置换CDR中的残基。
最为常见地，变体人源化GAL-F2序列中进行的置换就所取代的HuGAL-F2氨基酸而言是保守性的。可以如下分组氨基酸，以确定保守性置换，即，组内置换：I组(疏水侧链)：met、ala、val、leu、ile；II组(中性亲水侧链)：cys、ser、thr；III组(酸性侧链)：asp、glu；IV组(碱性侧链)：asn、Gln、his、lys、arg；V组(影响链取向的残基)：gly、pro；和VI组(芳香族侧链)：trp、tyr、phe。
优选地，HuGAL-F2中的置换(不管是不是保守性的)对该人源化mAb的结合亲和性或效能(即其中和FGF2的生物学活性的能力)没有实质性影(例如，在一些或所有本文所述的测定试验中变体人源化GAL-F2mAb的效能与HuGAL-F2的效能基本上相同，即在实验误差内)。优选，成熟变体轻链和重链V区序列分别与HuGAL-F2成熟轻链和重链V区至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％相同。或者，与GAL-F2的可变区具有高序列同一性的其它人抗体可变区也适于提供人源化抗体构架，尤其是来自人I亚组的κV区和来自人I亚组的重链V区，或这些亚组的共有序列。
在其它人源化抗体中，与示例性抗体相关提及的受体到供体置换的位置(即H1、H27、H30、H48、H67、H71和94)中，至少1、2、3、4、5、6个或所有7个优选被占据小鼠供体抗体重链的相应位置的残基所占据。如果重链受体序列不是AAL04519，对于所述的特定可变构架区位置的占据，受体到供体的置换可能是或可能不是必须的，这取决于占据该所述位置的残基在受体与供体之间是否已经是相同的。
这里讨论的示例性mAb HuGAL-F2具有人κ和γ1恒定区(例如如美国专利申请11/731,774中所示)，因此是IgG1。HuGAL-F2的(成熟)轻链和重链的完全序列示于图13。因此，示例性人源化抗体包括SEQ ID NO：7的轻链和SEQ ID NO：8的重链。尽管这些序列分别为Km(3)和G1m(3)同种异型，但是应理解的是，名称HuGAL-F2涵盖任何(IgG1、κ)同种异型的IgG1mAb。还应理解的是，当通过常规操作制备HuGAL-F2时，在轻链和/或重链的氨基或羧基端上的1个至几个氨基酸，例如重链的C-末端赖氨酸，可以在一部分或所有分子中失去或被衍生化，并且此类组合物仍被名称HuGAL-F2所涵盖，被认为是人源化GAL-F2mAb。其它同种型(例如IgG2、IgG3和IgG4)的人源化mAb可以通过将HuGAL-F2可变区与适当人恒定区组合来制备。可以在HuGAL-F2恒定区中进行置换以减少或增加效应子功能例如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见例如，Winter等人，美国专利号5,624,821；Tso等人，美国专利号5,834,597；和Lazar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：4005，2006)，或者以延长在人中的半衰期(参见例如，Hinton等人，J.Biol.Chem.279：6213，2004)。特别地但非限制性地，在IgG恒定区中位置250突变为Gln和/或位置428突变为Leu的HuGAL-F2是本发明的实施方案。
为了将HuGAL-F2的结合亲和性与小鼠-人嵌合mAb ChGAL-F2的结合亲和性相比较，使用标准ELISA技术进行了竞争结合实验。具体来说，将人FGF2固定在肝素包被的ELISA板上。在增加浓度的未标记ChGAL-F2、HuGAL-F2或对照人抗体hIgG的存在下用生物素化GAL-F2mAb(0.5μg/ml)孵育各孔。通过加入HRP-链霉亲和素和底物来测定所结合的生物素化GAL-F2的水平。如图12所示，HuGAL-F2和ChGAL-F2接近同等良好地竞争，其中HuGAL-F2可能略好，说明HuGAL-F2对FGF2的结合亲和性至少与ChGAL-F2一样高，因而与最初的小鼠GAL-F2mAb一样高。根据HuGAL-F2抑制标记的mAb的50％结合所需的浓度，可以估计出HuGAL-F2对FGF2的结合亲和性Ka为至少约109M-1。也可以在任何生物测定试验中针对本文所述的FGF2活性，测试HuGAL-F2，HuGAL-F2将与GAL-F2mAb可比地抑制FGF2活性。
尽管已经参考目前优选的实施方案对本发明进行了描述，但是应理解，可以作出各种修改而不背离本发明。除非与上下文明显不同，否则本发明的任何步骤、要素、实施方案、特征或方面可和任何其它的一起使用。所有引用的出版物、专利和专利申请(包括登录号等)为了所有目的以其全文在此并入作为参考，其程度等同于明确地且单独地指明每个单独的出版物、专利和专利申请为了所有目的以其全文在此并入作为参考。如果1个以上的序列与在不同时间与一个登录号相关，那么旨在指截止到2008年5月29日前与该登录号相关的序列。如果附图和序列表中的相应序列之间有任何不一致，则以附图为准。
产生单克隆抗体GAL-F2的杂交瘤已经按照布达佩斯协议在2008年1月8日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，P.O.Box 1549Manassas，VA 20108)，ATCC保藏号PTA-8864。自该保藏机构收到提供保藏物样品的最近申请之后起为期至少5年，自保藏日起为期至少30年、或在相关专利的法律期限内(以最长的期限为准)，该保藏在授权的保藏机构维持，并在突变、失活或毁坏时进行替换。对于公众获得这些细胞系的所有限制将在该申请被授予专利权时不可逆地消除。

Claims (10)

1.单克隆抗体，其结合并中和人碱性成纤维细胞生长因子FGF2，包含：含有来自图11A中所示GAL-F2序列的3个CDRs的轻链，和含有来自图11B中所示GAL-F2序列的3个CDRs的重链。
2.权利要求1的单克隆抗体，其是嵌合的。
3.权利要求1的单克隆抗体，其是人源化的。
4.权利要求1的单克隆抗体，其是Fab或F(ab′)2片段或单链抗体。
5.人源化抗体，其包含人源化轻链和人源化重链，所述人源化轻链含有来自图11A中GAL-F2序列的3个CDR，所述人源化重链含有来自图11B中GAL-F2序列的3个CDR，其中Kabat编号的残基H1、H27、H30、H48、H67、H71和H94被占据图11B中所示GAL-F2重链的相应位置的残基占据。
6.权利要求5的人源化抗体，其中轻链可变区与图11A中所示HuGAL-F2序列具有至少95％序列同一性，且所述重链可变区与图11B中所示HuGAL-F2序列具有至少95％序列同一性。
7.权利要求5的人源化抗体，其含有图11A和图11B中所示HuGAL-F2的3个轻链CDR和3个重链CDR。
8.药物组合物，其包含权利要求1-7之任一项的抗体。
9.权利要求1-7之任一项的抗体在制备治疗癌症的药物中的用途。
10.权利要求9的用途，其中所述癌症是肝细胞癌。
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