JP2011520129A - Ｍｓ／ｍｓデータ処理 - Google Patents

Abstract

前駆体イオン種をそれらのフラグメントから同定する方法が、複数の前駆体イオン種およびそれらのフラグメントの質量スペクトルを高質量精度で得るステップを含む。次いで、複数の前駆体イオン種のフラグメント化から得られたフラグメント質量スペクトルが走査され、合算した質量が前駆体イオン種の１つの質量と合致するフラグメントの対を同定する。フラグメントイオンの対が前駆体イオンに合致された後、複合のフラグメントイオンスペクトルがいくつかの部分に分解され、フラグメントの対ごとに１つの部分である。分析は、さらなる対が同定されなくなるまで続く。次いで、複合のフラグメントスペクトルの分解された区域を一体に継ぎ合わせることによって、各前駆体試料イオンごとに単純化されたフラグメントイオンスペクトルが再構成される。得られた再構成されて単純化されたフラグメントスペクトルが、サーチエンジンに送られ、サーチエンジンは、各合成フラグメントイオンスペクトルごとに有力候補のスコアソートリストを返す。

Description

本発明は、一般に、質量分析法の分野に関し、より詳細には、前駆体イオン種をそれらのフラグメントから同定する方法（ＭＳ／ＭＳデータ処理）に関する。

分子の質量分析は、非常に似た質量電荷比を有する多くの異なる分子の存在によって複雑になる。異なる親分子をそれらの特徴的なフラグメントの質量電荷比を測定することによって同定する一助となるように、フラグメント化技法が開発されている。対象の分子のイオンが、非常に似た質量電荷比の他の分子イオンと共に、質量選択イオン光学デバイスによって質量電荷選択される。これらのイオンは、親イオンまたは前駆体イオンと呼ばれる。これらの親イオンは、次いで、１つまたは複数のプロセスを使用してフラグメント化され、フラグメントイオンが質量分析されて、いわゆるＭＳ／ＭＳ質量スペクトルを提供する。典型的には、異なる構造の分子は、フラグメント化して異なるフラグメントイオンを生成し、それらのフラグメントイオンの質量電荷比を調べることによって親分子を同定することができる。フラグメント質量スペクトルが干渉も含む場合、またはＭＳ／ＭＳで得られるよりも多くの情報が必要とされる場合、さらなる段階のフラグメント化が使用されることがあり、ＭＳ＾ｎ（ＭＳ^ｎ）質量スペクトルを生成する。タンパク質配列のライブラリが開発されており、これらは、フラグメントイオンスペクトルを妥当な親分子に合致させるために、その目的で開発されたアルゴリズムを使用してサーチされる。

これは、有機質量分析法において有力であり広く使用されている方法である。しかし、複数の質量選択ステップの必要性に関係していくつかの欠点がある。この要件は、本方法を行うのに必要な設備をより複雑にし、分析時間を延ばす。

親分子イオンを同定できるようにイオンフラグメント化の技法を使用することに加えて、非常に似た質量電荷比の分子イオンを区別するために、高質量分解能の質量分析計を使用することができる。しかし、典型的には、そのような高質量分解能の分析計はより高価であり、より低い分解能の同等の分析計に比べて、（測定時間がより長いため）はるかに遅いことが多い。

フラグメントイオン質量スペクトルが高分解能であり高質量精度である場合、フラグメントイオンと妥当な親分子との合致をより高い信頼性で行うことができる。したがって、高分子イオンを最も効果的に同定するために、分析者は、高分解能の質量分析法とフラグメント化法との組合せを使用することが多い。しかし、２つの方法の組合せにより、分析時間がさらに長くなる。

上に概説したような方法は、タンパク質を含む試料に関して慣行的に使用されている。典型的には、タンパク質は、消化されてペプチドを生成し、これらのペプチドがイオン化されて、質量分析計に導入される。

標的タンパク質または混合物（例えば細胞可溶化物）は前処理される。前処理は、フィルタリングおよび洗浄を含むことができる。次いで、適切な開裂試薬を用いて消化される。最も頻繁に使用されるのは酵素トリプシンであるが、キモトリプシン、臭化シアン、ヨードソ安息香酸など他のものも使用される。消化後、および場合によっては洗浄後、混合物は、通常はクロマトグラフィ分離の後に質量分析計に供給される。通常、クロマトグラフィ分離は、タンデム質量分析法プロセスに利用可能な時間を制限する。クロマトグラフィは、ピーク当たり３０秒〜１秒未満の範囲の時間がかかり、傾向としてはより速くなっている。

初めに、完全な質量スペクトルが取られ、いわゆる前駆体イオンスペクトルを生成する。前駆体イオンスペクトル中のあらゆるイオン種に関して、フラグメントイオンスペクトルを得ることができる（データ独立ＭＳ／ＭＳ）。別の方法として、頻繁に使用される手法は、「データ依存」ＭＳ／ＭＳである。この方法では、完全なスペクトルが獲得され、その後、１つまたは複数の最も強いピークが通常は自動的に選択され、１つずつＭＳ／ＭＳフラグメント化を施される。前駆体およびフラグメントスペクトルが記憶される。これに対する様々な機能向上法として、以下のことが挙げられる。強いイオンの再測定を回避するために前駆体を一時的にブラックリストに入れること；よく知られているペプチドまたは溶媒成分のＭＳ／ＭＳデータの収集を回避するために前駆体を永久的にブラックリストに入れること；最も強い基準が満たされないときでさえフラグメント化を可能にするために、対象の質量をホワイトリストに入れること。しかし、このデータ依存ＭＳ／ＭＳ手法には２つの問題がある。第１に、同じ試料に対する分析実施ごとに、非常に異なる結果が得られることがある。なぜなら、例えば前駆体イオンスペクトルのピーク高さの小さな変化によってさえも、異なる決定が自動的に下されることがあり、これが、フラグメント化に関する異なる前駆体イオン種の選択をもたらすからである。第２に、多くの場合、先立って行われるクロマトグラフィプロセスにより、利用可能な時間窓内で対象のすべてのイオンをフラグメント化するのに十分な時間がないことがある。

ＭＳ／ＭＳに関して２つの前駆体イオンが選択される先行技術のデータ依存プロセスが、一例として図１の流れ図に示される。

測定後、または時として測定中に、獲得されたデータが評価される。これについて、例えば以下のような多くの方法が知られている。（１）「デノボシーケンシング（ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」。この方法では、アミノ酸配列がスペクトルから直接推定される。（２）「配列タグ付け（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｇｉｎｇ）」。この方法では、アミノ酸配列の一部のみがスペクトルから直接推定され、これらの小さな区域（「タグ」）がデータベースサーチルーチンで使用される。（３）フラグメントイオンスペクトルのみを使用して、直接データベースサーチが行われる。

データベースサーチは、フラグメントイオンをそれらの妥当なペプチド前駆体に合致させるために行われる。サーチを行うために、いくつかの自動ルーチンが開発されている。その結果、合致の信頼性を表すスコアを有する妥当な前駆体のリストが得られる。任意選択で、サーチすべきデータベースを使用者が事前に選択することができ、関連があると分かっているペプチド前駆体にサーチを限定することができる。例えば、試料が酵母から発生したものであると分かっている場合に酵母に限定することができる。任意選択で、コンピュータサーチは、事前に消化された試料に含まれる可能性が高いタンパク質を示すために、ペプチドスコアから計算されたタンパク質スコアを提供することもできる。典型的には、サーチアルゴリズムは、スコアを伴うタンパク質またはペプチド候補のスコアソートリストを返す。次いで、解釈は、典型的には使用者に任せられる。

標準的な手法は、データベースと比較するために、「サーチエンジン」に、それぞれの前駆体質量（通常、これは、データ依存セットアップにおいてＭＳ／ＭＳイベントをトリガした質量である）と共に各ＭＳ／ＭＳスペクトルのピークリストを提示するものである。普通は、質量選択窓内の複数の前駆体に関するチェックは行われない。タンパク質の多くのデータベースが公に利用されている。それらのデータベースのいくつかは、前の分析からのタンパク質を含み、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｒｏｔ／）など他のものは、ゲノム配列のコンピュータ翻訳である。

サーチエンジン使用の最終的な目標は、分析物混合物中にあると決定される１つまたは複数のタンパク質を見出すことであるので、データベース中のタンパク質は、使用者が選択した開裂試薬に合致する性質を有するペプチドに「電子的に消化」される。この「インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）消化」は、実行中に、または実際のサーチが行われる前に「索引付け（ｉｎｄｅｘｉｎｇ）」ステップとして行われることがある。使用者が定義した、またはデータから推定される許容窓内の前駆体質量に合致するすべてのペプチドが、「候補」とみなされる。次いで、これらの候補からのフラグメントイオンが予測される。ＭＳ／ＭＳデータに基づいて、これらの候補にスコアが関連付けられ、より高いスコアは、ＭＳ／ＭＳフラグメントイオンスペクトルが、予測される候補の予測されるフラグメントを含むときに得られる。

先行技術のデータベースサーチプロセスが、一例として図２の流れ図に示される。

意図的に、または意図せずに、フラグメント化のために同時に複数の前駆体イオン種が選択される場合、フラグメントイオンスペクトルはより複雑であり、データベースサーチエンジンからの結果はあまり正確でなくなる。

図１および図２に記載される先行技術プロセスには、これらのデータ依存方法が使用される場合でさえも、妥当なペプチドのスコアソートリストを得るための時間が遅いという欠点がある。なぜなら、標準のサーチエンジン技法を使用して処理することができるようにするまでに、対象の各前駆体イオンのみを選択して個々にフラグメント化し、得られたイオンを順次に質量分析しなければならないからである。これは、計器時間がかかるので費用がかかり、（非常に少量しか存在しないことがある）試料の比較的多くの部分がプロセス中に消費されるので浪費が多い。

スループットを改善する１つの特定の方法が、ＭａｓｓｅｌｏｎおよびＳｍｉｔｈによってＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ７２，Ｎｏ．８，ｐｐ１９１８−１９２４，２０００に記載されている。この方法では、一形態の多重化が行われる。複数の前駆体からのフラグメントイオンが、意図的に、非常に高い質量精度で取られた単一の質量スペクトル内で測定される。このとき、フラグメントイオンスペクトルは、複数の前駆体イオン種からのフラグメントを含む。このスペクトルは、通常の様式でデータベースサーチエンジンに送られ、この方法は、フラグメントスペクトルの高質量精度に依拠する。これにより、あらゆるフラグメントイオン種を親ポリペプチドに割り当てることができるわけではない場合もあるが、ほとんどのフラグメントイオンを特定の親ポリペプチドに帰属させることができる。

ＭａｓｓｅｌｏｎおよびＳｍｉｔｈの方法にはいくつかの欠点がある。上述したように、複数の前駆体イオン種からのフラグメントイオンスペクトルが標準のサーチエンジン法によって処理されるとき、フラグメントイオンスペクトルがより複雑であるので、データベースサーチエンジンからの結果は、高質量精度が使用されたとしても、あまり正確でない。さらに、スコアがあまり正確でないだけでなく、より多数の偽陽性同定が生じる。フラグメントイオンスペクトルの複雑さにより、サーチエンジンの速度が大幅に低下する。

Ｍａｓｓｅｌｏｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ７２，Ｎｏ．８，ｐｐ１９１８−１９２４，２０００

本発明の目的は、先行技術のＭＳ／ＭＳデータ処理に関わるこれらおよび他の問題に対処することである。

この背景に対して、本発明の第１の態様によれば、前駆体イオン種をそれらのフラグメントから同定するための方法であって、
（ａ）複数の前駆体イオン種の質量を示す量を求めるステップと、
（ｂ）複数の前駆体イオンに由来する複数のフラグメントイオンを形成するために、複数の前駆体イオン種のイオンをフラグメント化するステップと、
（ｃ）複数の前駆体イオン種に由来するフラグメントイオンを一緒に／同時に質量分析するステップと、
（ｄ）複数のフラグメントイオン種の１つまたは複数の試料セットを複数の前駆体イオン種の特定の１つに割り当てるステップであって、上記または各試料セットが、ステップ（ｃ）で求められた合算した質量が前駆体試料イオン種の特定の１つの質量に対応するフラグメントイオン種を含み、それらのフラグメントイオン種がその前駆体試料イオン種に割り当てられるステップと、
（ｅ）前駆体イオン種の１つまたは複数に関して、（ｉ）ステップ（ａ）で識別された特定の前駆体試料イオン種の質量と、（ｉｉ）その特定の前駆体イオン種に関する上記または各割り当てられた試料セット中の複数のフラグメントイオン種の質量とを識別する試料データを比較手段に転送するステップであって、それにより、前駆体イオン種および割り当てられたフラグメントイオン種の質量を示す量を、それぞれ、基準フラグメントイオンデータおよび基準前駆体イオンデータの１つまたは複数の基準セット中のイオンの質量を示す量と比較するステップと、
（ｆ）比較手段から、複数のフラグメント試料イオン種が割り当てられた前駆体イオン種を同定することを目的とした前記比較の結果を示す情報を受け取るステップと
を含む方法が提供される。

したがって、ここでも、スループットを改善する方法として多重化が使用され、複数の前駆体イオン種に由来するフラグメントイオンから、フラグメント質量スペクトルなどのフラグメントイオンデータが得られる。フラグメントイオンデータと前駆体イオンデータはどちらも、高質量精度（フラグメントおよび前駆体試料イオンデータに関して、ＦＷＨＭでの１００，０００の分解能で、例えば＜５ｐｐｍ、最も好ましくは＜２ｐｐｍ）で得られることが好ましい。しかし、この得られたフラグメントイオンデータに対してデータベースサーチエンジンを利用するのではなく、このデータがさらに処理される。この追加の処理ステップでは、フラグメントイオンデータは、特定の精度限界内で、合算した質量が前駆体イオンデータ中にある前駆体イオン質量に合致する複数のフラグメントを求めてサーチされる。精度限界は、例えば、フラグメントおよび親イオンデータの質量精度から決定されることがある。複数のフラグメントイオンの１つまたは複数の組を前駆体イオン種に合致させた後、フラグメントイオンデータはいくつかの部分に分解され、１つの部分が、各前駆体イオン種に関するものであり、その特定の前駆体イオン種に割り当てられたフラグメントイオン種の組のみを含む。このプロセスは、好ましい実施形態では、前駆体イオン種からの単純化されたフラグメント試料イオンスペクトルの再構成を効果的に可能にする。例えば、ＭＳ／ＭＳスペクトルが一度に１つずつ各前駆体イオン種ごとに得られたかのように、各前駆体イオン種ごとに１つのフラグメントイオンスペクトルを生成することができる。このプロセスは、多重化プロセスをデコンボリューションするが、多重化プロセスによって得られるすべての速度的利点を保つ。次いで、得られたフラグメントイオンデータの試料セット（例えばデコンボリューションされたフラグメントイオンスペクトル）が、好ましくはデータベースサーチエンジンに１つずつ送られ、このサーチエンジンは、それぞれに対して標準的なデータベースサーチを行い、好ましい実施形態では、各デコンボリューションされたフラグメントイオンスペクトルごとに有力候補のスコアソートリストを与える。

それにより、本発明の方法は、データベースサーチエンジンからの結果の精度を大幅に改善する。また、サーチの速度も大幅に改善する。

用語「一緒に／同時に分析する」とは、本方法が、同じ時点または実質的に同じ時点で、複数の前駆体試料イオンからのフラグメントイオンに対してサーチを行うステップを含むことを意味する（複数の前駆体を同時にフラグメント化することによって、または１つまたは複数の前駆体を順次にフラグメント化して得られるフラグメントを一緒に蓄積することによって、それらのフラグメントイオンが同時に生成される）。より詳細には、フラグメントイオンの実際の検出／同定が単一のイベントとして行われることを示唆することは意図されていない。ＦＴ−ＩＣＲまたはＯｒｂｉｔｒａｐ（商標）ＭＳなど特定のタイプの質量分析法の場合には、フラグメントイオンが一緒に検出されるが、ＴＯＦ−ＭＳなど他のものでは、イオンは検出器に順次に放出される。それにも関わらず、分析自体（検出前）は、複数の前駆体からのフラグメントイオンに対してタンデム式に行われて、上述した多重化を可能にする。

さらに、いくつかの好ましい実施形態では、前駆体および／またはフラグメントイオンの質量（さらには質量電荷比ｍ／ｚ）が求められるが、これは、本発明の良好な動作に不可欠というわけではないことを理解されたい。飛行時間、頻度、電圧、磁場偏向など（しかしそれらに限定されない）多くの異なる物理的なパラメータを（例えば選択されたイオン検出法に依存して）測定することができ、それらの各パラメータは、イオン質量またはｍ／ｚに関係付けられる、またはイオン質量またはｍ／ｚの導出を可能にする。しかし、各場合に質量自体が計算される必要はなく、非質量空間で測定されたパラメータを質量に変換しないことが計算的により効率的であることがある。さらに、比較用データベースに記憶された量は、それ自体、質量として保持されず、質量に関係付けられる別の量として保持されることがある。したがって、用語「質量を示す量」は、質量および他の量を包含するものと広く解釈すべきである。

好ましくは、この方法は、フラグメントイオンの１つまたは複数の対を特定の前駆体イオン種に割り当てるステップを含む。このステップは、２つのフラグメントイオン種の合算した質量がその割り当てられた前駆体イオン種の質量に対応することに基づくものであることがあり、この対応は、前駆体イオン種の質量と等しい総質量を有することによる、または（例えばフラグメント化中の水分子の中性ロスにより）その前駆体からの所定のオフセット質量を有することによる。割り当てられるフラグメント化の対は、様々なフラグメント化技法によって同定されるイオンのいわゆる「絶好の対（ｇｏｌｄｅｎ ｐａｉｒｓ）」となりえる。

また、本発明の方法は、前駆体イオンスペクトル内の前駆体イオン種に割り当てることができないフラグメント試料イオンデータ中のイオン種を示す。このとき、これらのフラグメントイオン種は、データベースサーチエンジンに送られることも、送られないこともある。送られる場合、それらは単に送られるだけであることがあり、このとき、先行技術の方法の場合と同様に、試料セット中の他のデコンボリューションされたフラグメント試料イオンデータの複雑さに寄与しない。

また、本発明は、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ技法、またはＭＳ^ｎでの速度および精度的利点を得るために使用することもできる。ＭａｓｓｅｌｓｏｎおよびＳｍｉｔｈの先行技術の多重化構成は、実際には、前駆体とフラグメントイオンの両方に関して高質量精度を必要とするので、本発明の実施形態の方法は、その先行技術に比べて、（データ収集に関して）追加の時間的不利を有さず、その一方で、対照的にかなり高い精度をもつ。当然、前駆体を多重化することを試みなかった先行の方法に比べて、本発明の実施形態は、かなりの時間節約をもたらす。

本発明のさらなる特徴および利点は、添付の特許請求の範囲および以下の説明から明らかになろう。

ＭＳ／ＭＳ分析に関して２つの前駆体イオン種を選択するための先行技術データ依存プロセスの流れ図である。 先行技術のデータベースサーチ手順の流れ図である。 本発明の実施形態の方法を実施するのに適した１つの例示的な質量分析計の概要を示すブロック図である。 本発明の実施形態の方法を実施するのに適した第２の例示的な質量分析計の機能概略図である。 本発明の実施形態の方法を実施するのに適した別の例示的な質量分析計の機能概略図である。 同様に本発明の実施形態の方法を実施するのに適したさらなる例示的な質量分析計の機能概略図である。 分子Ｃ_２２Ｈ_４２Ｎ_９Ｏ_６およびそのフラグメントに関する質量スペクトルの一部を示す図である。 それぞれ先行技術の方法および本発明による方法を採用したときの、多重化された試料フラグメントデータセットの数の関数としての、実験的なフラグメントデータからの前駆体イオン種の同定の精度に関する性能指数のプロットを示す図である。 本発明の一実施形態による４つのフラグメント試料イオンデータセットの群を個別に得るとき、および多重化することによって一緒に得るときの、１０００個のＭＳ／ＭＳスペクトルの同定の精度に関する実験的に求められた性能指数の分布を示す図である。 複数の段階のフラグメント化（ＭＳ^ｎ）に関して本発明の実施形態の方法を採用する手順の流れ図である。

本発明の好ましい実施形態は、前駆体イオン種をそれらのフラグメントから同定する方法を提供する。フラグメントイオンを生成する方法自体は重要ではない（実際、任意選択で、同じ前駆体イオンに対して、異なるフラグメントイオン種を得るために異なるフラグメント化技法およびエネルギーを採用することができる）が、それにも関わらず、本発明をより良く理解できるように、前駆体試料イオンのフラグメント化およびそのようなプロセスからの質量分析データの収集に関する１つの適切な技法をまず説明する。それにも関わらず、前駆体イオンをフラグメント化するための構成の好ましい一実施形態の以下の説明は、それを行う多くの異なる方法のうちの１つを示すにすぎず、さらに、イオンを検出する方法も、同様に様々な異なる方法で実施することができることを強調しておく。

まず図３を参照すると、質量分析計１０が示されている。質量分析計１０は、質量分析すべきイオンを発生するためのイオン源２０を備える。図３に示されるイオン源２０は、パルスレーザ源（好ましくは、パルスレーザ源２２からの照射によってイオンが発生されるマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）源）や、連続イオン源、例えば大気圧エレクトロスプレー源などでよい。

イオン源２０からのイオンは、イオントラップ３０に入れられ、イオントラップ３０は、例えば国際公開第２００５／１２４８２１号パンフレットおよびより最近では国際公開第２００８／０８１３３４号パンフレット（それらの内容を参照により援用する）などに記載されているようなガス充填ＲＦ多重極または湾曲型四重極でよい。

イオンはイオントラップ３０内に貯蔵され、例えば本出願人らの同時係属出願である国際公開第２００６／１０３４４５号パンフレット（その内容も参照により本明細書に援用する）に記載されているように、イオンの衝突冷却が行われることがある。貯蔵は、ＲＦがオフに切り替えられ、ＤＣ電圧がロッドの両端間に印加されるまで、イオントラップ３０内で行われる。この技法は、英国特許出願公開第２４１５５４１号明細書および国際公開第２００５／１２４８２１号パンフレットとして公開されている本出願人らの同時係属出願に詳細に記載されており、それらの詳細の全体を本明細書に援用する。

第１のサイクルでは、ある範囲の前駆体イオン（ある範囲のｍ／ｚにわたって連続の、または一連の隣接しない質量の前駆体イオン）が、イオントラップ３０から質量分析器７０、例えばＯｒｂｉｔｒａｐ、ＦＴ−ＩＣＲ、または他の高質量精度の分析器に放出される。質量分析器７０は、第１のサイクルでイオントラップ３０から放出された前駆体イオンに関する高質量精度の前駆体試料イオン質量スペクトルを生成する。前駆体試料イオン質量スペクトルは、いくつかの目的に役立つ。第１に、この質量スペクトルは、（分析対象である可能性が高いのは、すべての前駆体イオンではないので）分析すべき前駆体イオンのサブセットを同定するために利用することができる。第２に、前駆体スペクトルを高精度で得ることによって、以下でさらに説明するように、フラグメントイオンデータと共に、測定された前駆体質量ピークを分析のために送ることができる。

第２のサイクルでは、イオントラップ３０がイオン源２０からイオンを再び充填される。やはりイオンが冷却される。しかし、このとき、すべての前駆体イオンを一緒に質量分析するのではなく、前に得られた前駆体試料イオン質量スペクトルから、個々の前駆体イオンがさらなる分析のために同定される。そのような同定された前駆体イオンを隔離するために、イオントラップ３０内のイオンは、好ましくは静電トラップ４０であるイオン選択デバイスに向けてパルス放出される。パルス放出は、狭いイオンパケットを生成する。これらのイオンパケットは、静電トラップ４０内に捕捉され、本出願人らの同時係属出願である英国特許出願第０７２５０６６．５号明細書および国際公開第２００７／１２２３７８号パンフレットに記載されているように静電トラップ４０内で複数回反射される。

イオントラップ３０から静電トラップ４０への放出は、後で生じる空間電荷に関わる問題を回避するために任意選択でイオンの数を制御しながら、イオン光学系（図３には図示せず）によって行われる。

イオン光学系によって加速した後、イオンは、各ｍ／ｚごとに１０〜１００ｎｓの短いパケットに集束されて、静電トラップ４０に入る。静電トラップ４０内での反射の度に、または特定の回数の反射の後に、望ましくないイオンは、パルス偏向されて静電トラップ４０から出て、例えば検出器７５またはフラグメント化セル５０に入る。イオン検出器７５は、イオンミラーの飛行時間焦点面に近接して位置されることが好ましく、その焦点面ではイオンパケットの期間が最短である。こうして、分析対象のイオンのみが静電トラップ４０内に残される。引き続きさらなる反射が行われ、隣接する質量の間の分離を高め、それにより選択窓をさらに狭めることができる。最終的に、対象の質量電荷比ｍ／ｚに隣接する質量電荷比を有するすべてのイオンがなくされ、トラップ内には、第１の分析サイクルで得られた前駆体質量スペクトルから同定されたただ１つの前駆体試料イオン種が残る。

次いで、静電トラップ内のそのただ１つの前駆体試料イオン種が、フラグメント化セル５０に放出される。好ましくは、フラグメント化セル５０は、セグメント化されたＲＦのみの多重極であり、そのセグメントに沿って軸方向ＤＣ磁場が生成される。選択された前駆体試料イオンは、それらがフラグメント化セル５０内でフラグメント化できるようにするのに十分なエネルギーで、静電トラップ４０からフラグメント化セル５０に放出される。

フラグメント化セル５０内でのフラグメント化の後、第１の前駆体イオン種からのイオンフラグメントは、補助イオン貯蔵デバイス６０に移送される。ここでイオンフラグメントが貯蔵され、以下に説明するように後続のサイクルが行われる。

第１の前駆体試料イオン種からのフラグメントイオンが補助イオン貯蔵デバイス６０内に貯蔵された後、第２の前駆体試料イオン種に関してステップが繰り返される。具体的には、（やはり好ましくは前に得られた前駆体試料イオン質量スペクトルに基づいて選択される）第２の前駆体試料イオン種が、静電トラップ４０内で隔離され、次いでフラグメント化セル５０に送られ、フラグメント化され、次いでフラグメントが、前のサイクルと同様に補助イオン貯蔵デバイス６０に送られ、補助イオン貯蔵デバイス６０内で、第２の前駆体試料イオンからのフラグメントは、第１の前駆体試料イオンからのフラグメントと共に貯蔵される。

上述したのと同様にさらなるサイクルを行うことができ、これらのサイクルは、データ処理の限界（これに関する説明は以下を参照されたい）と、空間電荷限界と、補助イオン貯蔵デバイス６０内での複数のフラグメントイオンに関する総イオン貯蔵時間との影響を受ける。

複数のフラグメントイオンが補助イオン貯蔵デバイス６０内に蓄積された後、それらのフラグメントイオンは、放出されてイオントラップ３０に戻され、その際、前述の国際公開第２００７／１２２３７８号パンフレットに詳述されているように、フラグメントイオンは、元々それらの前駆体が放出された開口とは別の開口を通ってトラップ３０に入る。それらのフラグメントイオンは、トラップ３０から、質量分析のために高質量精度の質量分析器（例えばＯｒｂｉｔｒａｐ）７０に放出される。質量分析が完了した後、以下に説明するように、すべてのフラグメントイオンの質量分析から得られたデータと共に、前駆体イオンの質量分析から得られたデータが一緒に処理される。処理は、例えば質量分析計１０を制御する、または質量分析計１０にリンクされたローカルコンピュータ（図示せず）の処理装置でローカルで行われることがあり、および／または後の分析のためにローカルで記憶されることがあり、および／または１つまたは複数のデータファイルとして遠隔位置に、そこでの後の処理のために送られることがあり、その処理の結果は、その後、質量分析計１０の使用者に返される。

第１のサイクルで複数の前駆体試料イオンから質量分析データを捕捉し、次いで次のサイクルで、（対象となるものとしてその前駆体試料イオンの質量スペクトルから同定された）各前駆体イオン種を隔離し、各前駆体イオン種からのフラグメントイオンすべてを、それらのフラグメントの質量電荷比の同時／並列分析のために一緒に貯蔵することによって蓄積することを上述した。しかし、当然、これは、以下に説明する技法を使用して一度に複数の前駆体およびフラグメントイオンを分析することができる方法の１つにすぎないことを理解されたい。例えば、個々の前駆体種を隔離し、次いでフラグメント化のためにこれらを一緒に蓄積するのではなく、例えば国際特許第２００８／０５９２４６号パンフレット（その内容の全体を参照により援用する）に記載されている手順を使用して、すべての前駆体イオンを１つのステップで一緒に隔離することもできる。

前駆体の選択は、多くの異なる方法で実現することができ、それらの方法は、データ依存またはデータ独立に分類することができる。例えば、データ独立モードでは、隣接する質量範囲を選択することができる（この質量範囲は、複数のイオン種を含むことも、含まないこともある）。別の方法として、隣接しない質量範囲を選択することができ、すなわち、複数の隣接しない質量窓からの前駆体を選択することができる。データ依存モードでは、所定の数（例えば４つ）の前駆体イオン種を選択することができ、これらを、例えば強度によってソートすることができる。前駆体の選別に関して「包含」および「除外」リスト（これらのリストは当業者によく知られている）が採用されることがあり、任意選択で、これらのリストは動的なリストでよい。Ｋｅｎｄｒｉｃｋ質量オフセット（「質量欠損」）や、ＭＳ^３に関する中性ロスなど、他の前駆体同定基準を採用することもできる。最後に、初めに特定の基準に基づいて前駆体を選択し、次いで、残っている前駆体イオンの追加の「安全」ＭＳ^ｎ走査を行うこともできることがある。

同様に、多重化の実現の仕方に関して、この方法が、単一の前駆体イオンの逐次分析およびフラグメント化（上述したようにすべてのフラグメントが補助イオン貯蔵デバイス６０内に一緒に収集される）にも、（ただ１つのサイクルで選択される、または例えば複数の連続するサイクルで補助イオン貯蔵デバイス６０内に蓄積されることによる）複数の前駆体イオンの並列分析にも適用可能であることを理解されたい。並列分析は、複数の前駆体試料イオン種を一緒にフラグメント化し、それにより生成された複数のフラグメント試料イオン種を並列分析することによって行われる。

同様に、前駆体およびフラグメントイオンの両方の質量分析を高質量精度で行うことも望まれるが、それにも関わらず、これは、図３の例示的構成において、様々な位置で様々な方法で実現することができる。例えば、イオントラップ３０内に貯蔵された前駆体イオンは、それらをイオントラップ３０からＯｒｂｉｔｒａｐまたは他の質量分析器７０に渡すのではなく、質量をイオントラップ３０から静電トラップ４０に放出し、そこで前駆体イオンを隔離し、それらのイオンを検出器７５に放出することによって、静電トラップ４０において質量分析することができる。単に例として、検出器７５は、電子増倍管またはマイクロチャネル／マイクロスフェアプレートでよく、これは、単一イオン感度を有し、弱い信号を検出するために使用することができる。別の方法として、検出器は、コレクタでよく、それにより非常に強い信号（ことによるとピークで１０^４個よりも多いイオン）を測定することができる。２つ以上の検出器を採用することもでき、変調器が、例えば前の獲得サイクルから得られたスペクトル情報に従ってイオンパケットを１つの検出器または別の検出器に向ける。このようにして、静電トラップ４０によって、前駆体試料イオン種からの高質量精度データを得ることができる。さらに、検出の方法は、採用される質量分析技法の性質に依存することも理解されたい。例えば、飛行時間質量分析が行われる場合、典型的には、より高いｍ／ｚのイオンが、例えばマイクロチャネルプレートによって時間的に順次に検出される。他方、ＯｒｂｉｔｒａｐまたはＦＴ−ＭＳ分析が行われる場合、（時間領域過渡によって）実質的にすべてのイオンの同時検出を行い、その後、続いて周波数領域へのフーリエ変換を行うことができる。ここから、さらにイオン質量を求めることができる。したがって、イオン検出から質量自体を求める必要はないことを理解されたい。（飛行）時間、周波数、電圧、磁場、および他の物理的パラメータが初期測定量となることがあり、それらの初期測定パラメータをイオン質量に変換することは必ずしも不可欠ではない。そうせずに、イオン質量の計算を回避し、（以下にさらに説明する）後の分析のいくつかを、元々検出された量の空間内で直接行うことが、計算的に効果的であることがある。したがって、以下、用語「質量」（または質量電荷比）を使用するが、実際には、計算は、イオン質量に単に関係付けられる量、またはイオン質量を直接は表さない量に対して行われることがあることを理解されたい。また、多くの質量分析計は、いずれにせよイオンの質量電荷比を検出する。この測定されたｍ／ｚから分子質量を求めるために、様々な既知の方法が存在する（米国特許出願第５０７２１１５号明細書およびＨｏｒｔらのＪ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０００，１１，３２０−３３２参照）。以下に説明する計算のほとんどは、最も簡便には、場合によっては荷電付加物が既に補償されている質量空間内で行われる。いずれにせよ、必要な変換は、当技術分野で知られている、および／または容易に把握することができる。

複数の前駆体試料イオンおよびそれらのフラグメントから質量分析データを得る１つの例示的な方法を説明したが、次に、複数の前駆体試料イオン（またはその誘導物／親イオン）を実質的に同時に同定できるようにそのデータを並列に処理する（多重化する）ことを含む、本発明を具現化する一方法を説明する。

得られた複合の高質量精度のフラグメント試料イオン質量スペクトルと、前駆体質量スペクトルはどちらも、まず、単純化されたスペクトルを生成するために電荷除去および同位体除去される。次いで、合算した質量が前駆体イオン種の１つの質量に合致するフラグメントの対を同定するために、フラグメント質量スペクトルが走査される。他の形態のフラグメント化を同様に採用することもできるが、補完し合うフラグメントイオンの対は、衝突活性化解離（ＣＡＤ）によって発生されるすべてのタイプのフラグメントの中で一意の特異性を有することが分かっている。

前駆体およびフラグメントイオンの質量はどちらも高質量精度で測定されるが、それにも関わらず、それらは依然として、質量測定の有限の精度により、ある度合いの誤差を受ける。フラグメント質量情報の処理に情報提供するために、この測定誤差を使用することができる。すなわち、２つのフラグメントイオンの合算した質量が前駆体の１つの質量と所定の誤差限界範囲内で同じであるとき（または、Ｈ_２Ｏの中性ロスなどにより、前駆体からの一定の所定オフセットと同じであるとき）のみ、合致するものと特定することができる。

フラグメントイオンの対を前駆体イオン種に合致させた後、（複合の）フラグメントイオンスペクトルはいくつかの部分に分解され、１つの部分が、各フラグメント対に関するものであり、各フラグメント対のみを含む。複合のフラグメント質量スペクトルの分析は、さらなる対が規定の精度限界範囲内で同定されなくなるまで続けられる。前駆体イオン種に割り当てられずに残っている単一フラグメントイオンがあればそれを除外することができ、または含めておくこともできるが、（以下に述べる）後続の同定分析では無視される。

複合のフラグメントスペクトルの分析が完了した後、特定の前駆体試料イオン種に関連付けられたすべてのフラグメントイオン対に関して、複合のフラグメントスペクトルのそれぞれ単一の分解された部分を継ぎ合わせることによって、または他の方法で連結させることによって、それぞれ各前駆体試料イオンごとに１つの（単純化された）フラグメントイオンスペクトルが再構成される。すなわち、一緒に分析された「ｎ」個の前駆体試料イオンに関して、（同時に、または順次に、しかしすべてのフラグメントを一緒に分析して）それらの「ｎ」個の前駆体イオン種をフラグメント化することによって得られた複合のフラグメント試料イオン質量スペクトルを用いて、（合算した質量が「ｎ」個の前駆体の特定の１つと同じであるフラグメント対からのデータのみを含む）「ｎ」個の別個の単純化されたフラグメント質量スペクトルが、上の分析から得られる。

次いで、得られたデコンボリューションされたフラグメントイオンスペクトルが、１つずつ、関連の前駆体試料イオン種の測定された質量電荷比と共に、Ｍａｓｃｏｔｔ（商標）やＳｅｑｕｅｓｔ（商標）などのサーチエンジンに送られる。サーチエンジンは、各合成フラグメントスペクトルに対して標準のデータベースサーチを行い、各そのようなデコンボリューションされた（合成）フラグメントイオン質量スペクトルごとに有力候補のスコア（任意選択でスコアソート）リストを返す。合成フラグメント質量スペクトルの質量のみに基づく前駆体イオンの同定が現在好ましいが、それにも関わらず、任意選択で同定をさらに補助するために、それぞれの（相対）存在比を採用することもできる。

この技法は、多重化プロセスをデコンボリューションするが、この多重化プロセスによって得られるすべての速度的利点を保つ。ＭａｓｓｅｌｓｏｎおよびＳｍｉｔｈの先行技術技法では、実際には、前駆体イオンが前駆体質量スペクトルで正確に同定されるときに最も正確な結果が得られ、これを行うために、前駆体イオンが高質量分解能で分析されることが望ましい（また、先行技術の方法に関しては、良好に機能するには、前述したようにフラグメントイオンの最大の質量精度が必要である）。すなわち、本発明のいくつかの実施形態は、ＭａｓｓｅｌｓｏｎおよびＳｍｉｔｈの方法に関わる追加の時間的不利を何ら持ち込まず、かつ非多重化ＭＳ／ＭＳ技法に勝るかなりの時間的利点を提供する。さらに、本発明の実施形態は、非多重化技法に比べて、結果の精度が大幅に低下することがない。しかし、ＭａｓｓｅｌｓｏｎおよびＳｍｉｔｈの多重化技法とは対照的に、ここで説明する方法では、多重化される前駆体の数が２よりも多く増加するとき、フラグメントスペクトルの同定の精度の重大な低下がない。

上述した原理、特にフラグメントイオン質量を前駆体イオン質量に合致させる方法をさらに示すために、図７に、分子Ｃ_２２Ｈ_４２Ｎ_９Ｏ_６およびそのフラグメントに関する質量スペクトルの一部を示す。上述した技法によれば、最初に、前駆体イオン種（Ｃ_２２Ｈ_４２Ｎ_９Ｏ_６）が、付加物補正される（付加物は、１．００７８２５ａｍｕの（既知の）質量を有するＨ^＋である）。すなわち、付加物補正された前駆体の質量ｐは、５２８．３２５２６−１．００７８２５＝５２７．３１７９８４ａｍｕである。

次に、第１のフラグメントピーク（図７ではＢ_１［Ｒ］として識別される）が選択され、その測定された質量が再び付加物補正される。（補正された）質量Ｍ_１が記憶される（図７では、１５７．１０８３９−１．００７８２５＝１５６．１０１１１４と表される）。次に、すべての他のピークが質量Ｍ_２に関してサーチされ、この質量Ｍ_２は、付加物補正を行って、Ｍ_１＋Ｍ_２＝ｐとなるような質量Ｍ_２（＝Ｍ_２’−１．００７８２５）である。Ｍ_２が特定されると、Ｍ_１が、検証されたフラグメント質量のリストに入れられる。このプロセスが、他のフラグメントイオンに関して繰り返される。表１および表２は、それぞれフラグメントイオン［Ｐ］、［Ｒ］、［ＲＫ］、［ＱＰ］、［ＲＫＱ］、および［ＫＱＰ］に関する補正されていない結果および付加物補正された結果を示す（分子構造は、各フラグメントイオンごとに図７に示されているが、ここでは分かりやすくするために省く）。各場合に、付加物補正されたフラグメントイオン質量の対は、合計で、付加物補正されたときの前駆体イオン質量になることが分かる。

検証されたフラグメント質量のリストが編集されると、例えば前述したサーチエンジンによって、さらなる分析のために（前駆体イオン質量の詳細と共に）リストを提示することができる。

図４は、本発明の好ましい実施形態を実施するための好ましい質量分析計構成の機能概略図を示す。図４で、まず、試料準備機構５で任意選択の試料準備が行われる。次いで、段階１５で、クロマトグラフィ（特に液体クロマトグラフィＬＣ）が行われ、得られた分子がイオン源２０内でイオン化される。次いで、イオンセレクタ２５内で、これらのイオンから第１の組のイオンが選択される。選択後、イオンは、衝突セル５０内でフラグメント化され、次いで、その下流でイオンコレクタ３５内に収集される。

イオンセレクタ２５内で選択し、衝突セル５０内でフラグメント化し、イオンコレクタ３５内に収集するプロセスは、イオンコレクタ３５内でイオンの所望の組合せが得られるまで繰り返される。その後、イオンは、質量分析器４５（例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）質量分析器でよい）に放出され、質量分析器４５の出力がデータ処理システム５５で処理される。データ処理システム５５で行われるステップは、上で概説したものであり、フラグメントイオンを、それぞれの親イオンに関する個別のデータセットにデコンボリューションするステップと、任意選択のデータベースサーチおよび順序付けのステップとを含む。

イオン選択およびフラグメント化プロセスをさらに制御するために、データ処理システム５５からの任意選択のフィードバックを使用することができる。

図４の構成は、本発明の実施形態を実施するための質量分析計システムの好ましい構成要素の機能表現となるように意図されていることを理解されたい。単一のハードウェア要素で様々な操作段階を実行することができ、したがって、例えば、選択、フラグメント化、および収集のステップはすべて、ＬＴＱフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＬＴＱ ＦＴ ＩＣＲ）質量分析計のリニアトラップ四重極（「ＬＴＱ」）リニアイオントラップなど単一のイオントラップで実行することができ、正確な質量分析のみが、別個の質量分析装置で行われる。理論的には、質量分析さえも同じイオントラップで行うことができる。例えば米国特許出願第４７５５６７０号明細書を参照されたい。また、複数のイオンの選択が順次のものである必要はないことを理解されたい。イオントラップ内ですべての所望のイオンを同時に選択するために、例えば米国特許出願第４７６１５４５号明細書に記載されているものなど適切な波形を使用することができる。質量フィルタに関しても同様の概念がある。

次に図５を見ると、代替の質量分析計構成の機能概略図が示され、この構成もやはり本発明の好ましい実施形態を実施するのに適している。図４の構成と同様に、試料分子は、液体クロマトグラフィ構成１５に結合された任意選択の試料準備装置５によって提供することができ、液体クロマトグラフィ構成１５が試料分子をイオン源２０に供給する。

図５で見られるように、イオン源２０は、イオンを質量選択四重極Ｑ２７に提供し、そこから、選択されたイオンが衝突セルｑ５０に進み、さらにそこから四重極イオンコレクタＱ２９に進む。四重極イオンコレクタ２９の下流には、データ処理システム５５に接続された任意選択の飛行時間質量分離器４７がある。

図５の構成の典型的な動作では、質量選択四重極２７を走査することによって、または四重極イオンコレクタ２９内にイオンを収集し、その後、検出器に対して質量選択走査を行うことによって、または四重極イオンコレクタ２９内にイオンを収集し、その後、飛行時間分析器４７において質量分析を行うことによって、「通常の」質量スペクトルが獲得される。

任意選択で、以下の質量分析ステップに関する決定は、前に獲得されたスペクトルに基づくものであるが、最終的な目標がすべてのイオンをフラグメント化することであるときにはこの手順は当然必要ない。

次に、所望の前駆体質量または質量範囲を順に選択するために、質量選択四重極Ｑ２７が動作される。このとき、質量選択四重極Ｑ２７を通過するイオンが、衝突セルｑ５０内でフラグメント化され、得られたフラグメントが、その衝突セルｑ５０内で直接収集されて、それにより後続の四重極イオンコレクタ２９の必要をなくすか、またはその四重極イオンコレクタ２９内で収集される。

得られたフラグメントは、飛行時間分析器４７において質量分析される。次いで、獲得された質量情報に、前述したような、本発明の実施形態によるデータ処理が施される。

図６は、本発明の実施形態を実施するのに適した質量分析計のさらに別の構成をやはり機能概略図で示す。図６において、ここでもまた、試料分子をイオン源２０に提供するために、任意選択の試料準備および液体クロマトグラフィステップを行うことができる。次いで、イオン源２０からのイオンが、リニアイオントラップ２６に向けられる。リニアイオントラップの下流にイオンコレクタ３１があり、イオンコレクタ３１は、イオンフラグメント化手段５０’（衝突セルでよい）と連絡可能であり、また、別個にＯｒｂｉｔｒａｐ（商標）トラップ質量分析器７０と連絡可能である。Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）質量分析器７０は、データ処理システム５５に接続される。

図６の構成は、複数の動作モードを提供する。第１のモードでは、通常の質量走査に続いて、前駆体イオンが選択され、リニアイオントラップ２６内でフラグメント化される。次いで、得られたフラグメントが、中間イオン貯蔵装置３１に送られる。次の前駆体イオンが同様に処理され、中間イオン貯蔵装置３１に注入されて、前に貯蔵されたフラグメントイオンと共に貯蔵される。異なる前駆体イオンからのすべての所望のフラグメントが中間イオントラップ３１内に収集された後、それらのフラグメントは、質量分析および検出のためにＯｒｂｉｔｒａｐ（商標）軌道トラップ質量分析器７０に一緒に送られる。処理は、前述した原理に従ってデータ処理システム５５で行われる。

図６の構成の代替の動作モードでは、例えば、リニアイオントラップ２６において、何らかの他の形状の「鋸歯状（ｎｏｔｃｈｅｄ）」波形の記憶波形逆フーリエ変換（ＳＷＩＦＴ）励起によって、複数の前駆体イオンが同時に選択される。次いで、イオンは、例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）または電子移動解離（ＥＴＤ）によってリニアイオントラップ２６内で、または高エネルギー衝突活性化解離（ＨＣＤ）を行うことができる別個のフラグメント化手段５０’内で一緒にフラグメント化され、フラグメント化手段５０’は中間イオントラップ３１を介してアクセスされる。次いで、フラグメントは、イオンフラグメント化手段５０’から送り返され、中間イオン貯蔵装置３１内に収集される。その後、それらのフラグメントを、分析のためにＯｒｂｉｔｒａｐ（商標）７０に注入することができる。

図６の構成のさらなる動作モードでは、上述した第１のモードと第２のモードを組み合わせることができる。例えば、１つの質量範囲を隔離することができ、または様々な質量範囲を隔離および追加することができる。

図６の構成のさらなる動作モードでは、リニアイオントラップ２６内で順次の前駆体イオン選択を行うことができ、そのイオンを中間イオン貯蔵装置３１に移送し、その後、すべてのイオンがイオンフラグメント化手段５０’内で一緒にフラグメント化される。次いで、得られたフラグメントイオンが、再び中間イオン貯蔵装置３１内に収集され、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）７０で質量分析される。

当然、各場合に、質量データが得られた後、本発明を具現化する前述した原理に従って、データ処理システム５５を使用してその質量データを処理することができる。

ＭＳ／ＭＳ実験からの実際のデータは、本発明を具現化する方法を使用して得られた。前駆体スペクトルとフラグメントスペクトルはどちらも、ＦＴ−ＩＣＲ質量分析器を使用して、１０００００の半値全幅（ＦＷＨＭ）の質量分解能で、高質量精度（１σで２ｐｐｍの質量精度）で得られた。この方法の後半の段階を成すデータベースサーチは、Ｍａｓｃｏｔサーチシステムを使用して５ｐｐｍ（３σ）および１０ｐｐｍ（６σ）のしきい値で行われた。

図８は、そのようにして得られたデータを使用して、かつ本発明の方法を適用して、一緒に多重化された前駆体イオンおよびそれらのフラグメントスペクトルの数の関数として平均Ｍａｓｃｏｔスコアのプロットを示す。比較のために、先行技術のＭａｓｓｅｌｓｏｎおよびＳｍｉｔｈ技法を使用して得られる平均Ｍａｓｃｏｔスコアが示される（実際には、データベースサーチの目的のためにＭａｓｃｏｔシステムと同様のＳｅｑｕｅｓｔシステムを採用した）。

どちらの方法でも、多重化ピークの数が増加すると共にスコアが減少するが、先行技術の方法では、多重化ピークが２つのみの場合でさえ、（Ｍａｓｃｏｔを使用した）予想スコアが急激に低下する。通常、約３０のスコアが、許容できると考えられるものである。図８から、許容できる同じスコアに関して、本発明の実施形態の方法によって、先行技術の方法よりも多くの前駆体イオン種を多重化できることを見ることができる。これにより、スループットが大幅に改善される。また、しばしば質量分析法に先立って行われるクロマトグラフィ分離から、利用可能な時間窓内の試料に関するはるかに有用な情報を得ることができる。

１つのスペクトルを獲得するにつき約０．５秒かかるＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳまたはＯｒｂｉｔｒａｐＭＳなどの高質量精度の分光技法を使用して４つの前駆体イオン種からＭＳ／ＭＳデータを得るためには、個別に選択し、フラグメント化し、質量分析するのにかかる時間は２．５秒であり、すなわち１つの前駆体イオンスペクトルおよび４つのフラグメントスペクトルの獲得からなる。本発明を使用する時間は１秒にすぎず、すなわち１つの前駆体イオンスペクトルおよび１つのフラグメントイオンスペクトルの獲得からなる。受け入れることができるレベル３０を十分に超えるＭａｓｃｏｔ予想スコアを保ちながら、時間を２．５分の１に短縮することができる。

図８に関して上述したように、本発明の方法は、多重化される前駆体イオン種の数が増加すると共にＭａｓｃｏｔスコアが減少するが、この減少は適度なものである。これをさらに示すために、多重化されていない結果との直接の比較が行われている。ＣＡＤ ＭＳ／ＭＳスペクトルのデータベースから１０００個の質量スペクトルが選択された。４つのスペクトルからなる群が合計されて、多重化されたフラグメントイオンスペクトルをシミュレートし、このスペクトルは、４つの前駆体イオン種がフラグメント化され、それらのフラグメントが一緒に組み合わされて質量分析されるたびに得られた。この結果、シミュレートされた２５０個の多重化ＭＳ／ＭＳスペクトルが得られた。次いで、本発明の処理方法が続いて行われ、その結果が、多重化せずに得られた結果と比較された。

上述した本発明を具現化する方法の後、各シミュレートされた多重化フラグメント質量スペクトルが同位体除去および電荷除去されて、中性フラグメント質量のリストに変換された。４つの前駆体質量Ｍ_ｍそれぞれに関して、元のスペクトルの質量精度に関係付けられる±１５ｍＤａの質量不確定性範囲内でｍ_ｉ＋ｍ_ｊ＝Ｍ_ｍとなるように、フラグメント質量の対ｍ_ｉとｍ_ｊが選択された。そのようにして、各シミュレートされた多重化質量スペクトルが、４つのデコンボリューションされたＭＳ／ＭＳスペクトルに分離された。

元の１０００個のＭＳ／ＭＳスペクトルがＭａｓｃｏｔに提示され、その結果、９８０個の超しきい値ペプチド同定が得られた。残りの２０個の質量スペクトル（０．２％）は同定されなかった。この理由は、主に、同定されたスペクトルがＭＳ／ＭＳデータベースに入れられた後に、タンパク質データベースが変わったからである。Ｍａｓｃｏｔスコアの分布は、図９に白の棒グラフで示されている。また、１０００個のデコンボリューションされた質量スペクトルもＭａｓｃｏｔに提示された。総計で８９９個のペプチドが同定された（９１％）。得られたＭａｓｃｏｔスコアの分布は、図９にハッチングの棒グラフで示されている。デコンボリューションされた８９９個のペプチドのうち２個の配列のみは、正常に同定された配列と合致しなかった。これは０．２２％の偽陽性率に対応する。

前駆体イオンをフラグメント化するためのＣＡＤの使用、およびＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析器内でのイオンの検出に基づいて、非多重化ＭＳ／ＭＳ実験に比べてスループットの改善を推測することができる。フラグメント検出を伴わないＣＡＤを行うのに１単位時間かかり、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出に４単位時間かかる場合、「通常の」（非多重化）モードでの１：８サイクルにかかる全体の時間は、１×４（ＭＳ）＋８×４（ＭＳ／ＭＳ）＝３６単位時間である。多重化モードでは、かかる時間は、１×４（ＭＳ）＋２×４（ＭＳ／ＭＳ）＝１２単位時間である。したがって、非多重化技法に比べてスループットが約３倍高まり、試料イオン種の同定の精度の減少は最小限である。

上述した技法に対する様々な修正、代替、および追加が想定される。例えば、フラグメントイオン種の対をそれらの前駆体に合致させるプロセスをさらに補助するために、以下の方法を使用することもできる。

（１）前駆体スペクトルおよびフラグメントイオンスペクトルから同位体除去する前に、同位体ピークの微細構造、例えば^１３Ｃや^３２Ｓの存在に注目することができる。前駆体種中のそのような同位体は、それらの対応するフラグメントでも観察される。これを使用して、割当てを確認する、または割当ての誤りを証明する、またはフラグメント対の合算だけでは同定することができない前駆体とフラグメントの関係の同定を補助することができる。

（２）フラグメントの質量が前駆体の１つのみに適合するとき、例えばより低い質量の前駆体から生じるにはフラグメントが大きすぎるとき、フラグメントを特定の前駆体に直接割り当てる。

（３）特定のフラグメントを除外／包含するために、任意選択で物質クラスに関する情報（例えば、試料がペプチドであるという知識）と共に、正確な質量情報を使用する。いくつかのフラグメントは、それらの正確な質量と、前駆体の正確な質量と、取り得る中性ロスの選択とだけによって、特定の前駆体のみからのものとなりえる。

（４）試料分析を進めながらデコンボリューションを行う。分解されていない前駆体イオン種を二度目に含むことによって、生じ得る干渉が、同じ試料の分析の次のサイクルで識別されて解消される。後続のこのサイクルは、１つを除くすべての前駆体イオン種が異なるので、異なる多重化フラグメントスペクトルを生成する。このデータセットに対して、またはこのセットと前のセットの組合せに対して、前に分解されていない前駆体イオン種のフラグメントの同定を試みることができる。

以上、ＭＳ／ＭＳ実験での前駆体およびフラグメントイオンの多重化分析に関する技法を説明した。しかし、本発明が、１段階のみのフラグメント化に限定されないことを理解されたい。特に、上述した方法を、同様にＭＳ^３、さらにはＭＳ^ｎ実験に適用することもできる。

図１０は、ＭＳ^３を行うことができる方法、特に、本発明の実施形態の方法を第１および第２世代フラグメント（「孫フラグメント」）イオンにも適用することができる方法を示す流れ図である。ステップ１００で、図３に関連して前述したのと同様に、前駆体質量スペクトルが、ＭＳ／ＭＳの場合と同様に高精度で得られる。ステップ２００で、静電トラップ４０内で異なる前駆体イオン種を隔離する複数のサイクルによって、または別の方法として静電トラップ４０内で複数の前駆体イオン種のより狭い「窓」を選択することによって、対象の前駆体イオン種が一緒に蓄積される。次いで、蓄積された前駆体イオン種は、フラグメント化デバイス５０内で一緒にフラグメント化され（ステップ３００）、複数のイオン前駆体イオン種からの複数のフラグメントイオン種が補助イオン貯蔵デバイス６０内に一緒に蓄積される（ステップ４００）。フラグメント化を一緒に行う前に対象の前駆体イオン種すべてを一緒に蓄積する代わりに、前駆体イオン種を一度に隔離して、個々にフラグメント化することもできるが、それでも、各前駆体イオンからのフラグメントイオンは、やはり前述したのと同様に一緒に蓄積される。

次に、ステップ５００で、質量分析器７０によって、フラグメントの質量スペクトルが高質量精度で得られる。得られたフラグメントの質量スペクトルは、以下に説明するステップ６００およびステップ７００での処理のために送られる。

次に、第１のループで、前駆体イオンのさらなる組が蓄積される（再びステップ２００）。これらは一緒にフラグメント化されて（ステップ３００）、第１世代のフラグメントイオンの蓄積された組を形成し、これら第１世代のフラグメントイオンが補助イオン貯蔵デバイス６０内に貯蔵される（再びステップ４００）。しかし、このとき、これらのフラグメントの質量スペクトルを得るのではなく、フラグメントが補助イオン貯蔵デバイス６０からフラグメント化デバイス５０に戻され、フラグメント化デバイス５０で、それらのフラグメントがもう一度フラグメント化される。これは、図１０にステップ８００として示される。次いで、ステップ９００で、得られた第２世代のフラグメントイオン（孫フラグメント）を、イオントラップ３０を通して質量分析器７０に送ることによって質量分析する。

本発明を具現化する上述した方法が、ステップ５００で得られた第１世代の質量スペクトルに適用されて、フラグメントイオンを前駆体イオン種に割り当てる（ステップ６００）。ステップ７００で、その割当ての結果が記憶される。同様に、第２世代（孫）のフラグメントイオンの質量スペクトルが、本発明の実施形態の技法を使用して分析されて、第２世代のフラグメントイオンを第１世代のフラグメントイオン種に割り当てる。これは、ステップ１０００で示される。その分析の結果が、やはりステップ７００で記憶される。

本発明の技法を質量分析法の複数の段階（ＭＳ^ｎ）に適用することにより、先行技術に比べて、非常に大きな時間節約の可能性が得られる。前駆体イオンのスペクトルを得るステップ１００にかかる時間は、約０．５秒である。第１世代のフラグメントイオンの質量スペクトルを得るステップ（ステップ５００）にかかる時間も同様に０．５秒であり、さらに、ＭＳ^３が採用されるときにはこのステップを完全になくすこともできることがある。最後に、ステップ９００での第２世代のフラグメントイオンの質量スペクトルにかかる時間は約０．５秒である。

したがって、最悪でも、総データ収集時間は１．５秒である。先行技術の技法は、少なくとも１０．５秒かかる。なぜなら、４つの別個のフラグメントイオンスペクトルを得るのに約２秒かかり、その結果得られる１６個の第２世代のフラグメントスペクトルを得るのに計８秒かかるからである。

明らかに、この技法は、さらなる世代のフラグメントが得られることがあるのでより複雑になるが、同様に時間の節約もより大きくなる。ＭＳ^３実験の目的の１つは、水、アンモニア、リン酸化または他の側鎖脱離、およびグリコペプチドからの糖の脱離など、中性フラグメントを明確化することである。

さらに、ＣＡＤによって発生されるフラグメントイオンの分析を上述したが、例えばＥＣＤ、ＥＴＤ、準安定イオン衝撃、ＣＩＤ（トラップＣＩＤおよびＨＣＤ）、およびＩＲＭＰＤなど、しかしそれらに限定されない多くの他の形態のイオンフラグメント化にもこの技法を同様に適用可能であることを理解されたい。実際、上述した方法のさらに別の変形形態として、さらなる情報をもたらすために、同じ前駆体イオン種に対して、フラグメント化方法および／またはフラグメント化エネルギーを変えて、前駆体イオン種の隔離および後続のフラグメント化を繰り返すことができる。この技法は、フラグメントのいわゆる「絶好の対」を同定できる可能性を生み出し、ここで、異なるフラグメント化技法が異なる開裂メカニズムをもたらし、これらのメカニズムは、多少は把握されている。例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって生成されるＢ２フラグメントは、ＥＴＤでの対応するＣ２フラグメントと合致することがあり、一定の質量差１７．０２６５が、アンモニア（ＮＨ_３）の質量である。

本発明の方法は、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ／ＲＮＡ、脂質、およびこれらの修飾体などポリマーおよびバイオポリマーの分析に適用することができる。

Claims (35)

1. 前駆体イオン種をそれらのフラグメントから同定する方法であって、
   （ａ）複数の前駆体イオン種の質量を示す量を求めるステップと、
   （ｂ）複数の前駆体イオンに由来する複数のフラグメントイオンを形成するために、複数の前駆体イオン種のイオンをフラグメント化するステップと、
   （ｃ）複数の前駆体イオン種に由来するフラグメントイオンを一緒に／同時に質量分析するステップと、
   （ｄ）複数のフラグメントイオン種の１つまたは複数の試料セットを複数の前駆体イオン種の特定の１つに割り当てるステップであって、前記または各試料セットが、ステップ（ｃ）で求められた合算した質量が前駆体試料イオン種の特定の１つの質量に対応するフラグメントイオン種を含み、前記フラグメントイオン種が前記前駆体試料イオン種に割り当てられるステップと、
   （ｅ）前駆体イオン種の１つまたは複数に関して、（ｉ）ステップ（ａ）で識別された特定の前駆体試料イオン種の質量と、（ｉｉ）前記特定の前駆体イオン種に関する前記または各割り当てられた試料セット中の複数のフラグメントイオン種の質量とを識別する試料データを比較手段に転送するステップであって、それにより、前駆体イオン種および割り当てられたフラグメントイオン種の質量を示す量を、それぞれ、基準フラグメントイオンデータおよび基準前駆体イオンデータの１つまたは複数の基準セット中のイオンの質量を示す量と比較するステップと、
   （ｆ）比較手段から、複数のフラグメント試料イオン種が割り当てられた前駆体イオン種を同定することを目的とした前記比較の結果を示す情報を受け取るステップと
   を含む方法。
2. フラグメントイオン種の前記または特定の試料セットが由来する可能性が高い候補前駆体イオン種であると考えられる前駆体イオン種を示すステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
3. 特定の試料セット中のフラグメントイオン種が由来すると考え得る複数の前駆体イオン種を、前記フラグメントイオン試料セットが当該の複数の前駆体イオン種それぞれに合致する可能性の順序と共に示すステップをさらに含む請求項２に記載の方法。
4. 複数の前駆体イオン種の質量を示す量を求める前記ステップ（ａ）が、
   第１の前駆体イオン種のイオンを隔離するステップと、
   少なくとも１つのさらなる前駆体イオン種のイオンを隔離するステップと、
   前記複数の前駆体イオンに由来する前記複数のフラグメントイオンを形成するために、隔離された各前駆体イオン種のイオンの少なくともいくつかをフラグメント化するステップと
   を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 第１の前駆体イオン種のイオンを隔離する前記ステップが、前記または各さらなる前駆体イオン種のイオンを隔離する前記ステップとは異なる時点に行われる請求項４に記載の方法。
6. 前記第１の前駆体イオン種の前記隔離されたイオンを、前記または各さらなる前駆体イオン種の前記隔離されたイオンと共に貯蔵するステップと、前記複数の異なるイオン種のイオンが貯蔵された後、各前駆体イオン種のイオンの少なくともいくつかを実質的に同時にフラグメント化するステップとをさらに含む請求項５に記載の方法。
7. 前記第１の前駆体イオン種のイオンの少なくともいくつかを、前記または各さらなる前駆体イオン種のイオンのフラグメント化とは別個にフラグメント化するステップと、前記複数の前駆体イオンに由来する前記複数のフラグメントイオンとして、各前駆体イオン種から得られたフラグメントを一緒に貯蔵するステップとをさらに含む請求項４に記載の方法。
8. 複数のフラグメントイオン種の１つまたは複数の試料セットを割り当てる前記ステップ（ｄ）の後、各前駆体イオン種に関するフラグメントイオンの部分質量スペクトルを、前記前駆体イオン種に関するフラグメントイオンの前記割り当てられた試料セットから構成するステップをさらに含み、基準フラグメントイオンデータの前記または各基準セットが、基準フラグメントイオン質量スペクトルであり、前記試料データを転送する前記ステップ（ｅ）が、前記前駆体イオン種を同定することを目的として、フラグメントイオンの部分質量スペクトルを転送して、前記部分質量スペクトルと前記または各基準フラグメントイオン質量スペクトルとを比較するステップと、それぞれの前駆体イオン種の質量または質量に関連付けられる値を転送するステップとを含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記複数の前駆体イオン種の前駆体質量スペクトルを得るステップと、
   前記構成されたフラグメントイオン質量スペクトル微細構造の特定の１つを前記前駆体質量スペクトルの特定の１つと相関させることを目的として、前記前駆体試料の質量スペクトルの微細構造を、前記構成されたフラグメントイオンの質量スペクトルの微細構造と比較するステップと
   をさらに含む請求項８に記載の方法。
10. 前記前駆体およびフラグメントイオンの一方または両方から同位体除去および電荷除去するステップをさらに含む請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 複数のフラグメントイオン種を割り当てる前記ステップ（ｄ）が、総質量が前駆体イオン種の１つの質量に前記前駆体イオン種質量の周りの質量窓内で対応する、または総質量が前駆体イオン種の１つからの所定のオフセットでの質量に前記オフセットされた前駆体イオン種質量の周りの質量窓内で対応する複数のフラグメントイオン種を同定するステップを含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記質量窓が、２０ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、５ｐｐｍ、２ｐｐｍ、１ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、および０．２ｐｐｍを含むリストから選択される請求項１１に記載の方法。
13. 前記ステップ（ａ）〜（ｆ）が第２のサイクルで繰り返され、前記第２のサイクルに先立つ第１のサイクルでのステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）から得られた第１のデータセットに対して、複数のフラグメントイオンを割り当てる前記ステップ（ｄ）および比較のために試料セットを転送する前記ステップ（ｅ）が行われ、その一方で、第２のサイクルのステップ（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の１つまたは複数の少なくとも一部が行われる請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 同じ同定された前駆体イオンに関して、１つまたは複数の後続のサイクルでステップ（ａ）〜（ｆ）を繰り返すステップをさらに含み、しかし各場合に、前記同じ前駆体イオンをフラグメント化するステップ（ｂ）が、異なるフラグメント化エネルギーおよび／またはフラグメント化メカニズムを採用することを含む請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. ステップ（ｄ）の後に割り当てられずに残っているフラグメントイオンがあればそれを無視する、または除外するステップをさらに含む請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 任意の単一のフラグメントイオン種の質量が、前記単一のフラグメントイオン種が特定の前駆体イオン種からしか生じる可能性がないことを示すようなものであるときに、前記単一のフラグメントイオン種を前記特定の前駆体イオン種に直接割り当てるステップをさらに含む請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記前駆体およびフラグメント試料イオンの質量が、５０００以上の分解能で、２０ｐｐｍ以下の質量精度で決定される請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記前駆体およびフラグメントイオンの質量が、５０００以上、１００００以上、２５０００以上、５００００以上、１０００００以上の分解能で、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、１ｐｐｍ以下、０．５ｐｐｍ以下、０．２ｐｐｍ以下、および０．１ｐｐｍ以下を含むリストから選択される質量精度で決定される請求項１７に記載の方法。
19. 前記フラグメントイオンデータおよび前記前駆体イオンデータを前記比較手段に転送する前記ステップ（ｅ）と、前記比較手段から情報を戻して受け取る前記ステップ（ｆ）との間に、
    複数の割り当てられたフラグメントイオン種が由来する前駆体イオン種および／または前記前駆体イオン種に関係付けられた材料を同定することを目的として、前記前駆体イオン種の特定の１つに割り当てられた複数のフラグメントイオン種の１つまたは複数の試料セットの質量（または関連の量）を、基準フラグメントイオンデータの前記１つまたは複数の基準セット中のイオンの質量（またはそれぞれの関連の量）と比較するステップをさらに含み、各基準セットが、既知の同定および／または質量のそれぞれの前駆体イオン種に由来する請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記比較ステップに続いて、複数のフラグメントイオンが関連付けられている前記前駆体イオン種および／または前記前駆体イオン種に関係付けられた材料を同定するステップをさらに含む請求項１９に記載の方法。
21. 前記比較ステップに続いて、前記比較に基づいて、考え得る候補前駆体イオン種のリストを生成するステップをさらに含む請求項１９に記載の方法。
22. 前記比較ステップが、フラグメントイオンの複数の個別の試料セットであって、特定の試料セットに関して複数の前駆体イオンのそれぞれ１つに由来しているものと同定された複数のフラグメントイオン種の質量に関するデータがそれぞれ集められている複数の個別の試料セットそれぞれに関して、
    各試料セットがそれぞれ由来する可能性が最も高い前駆体イオン種または前記前駆体イオン種に関係付けられる分子を個別に同定することを目的として、各前記試料セット中の前記フラグメントイオンの質量（または質量に関係付けられる量）を、基準フラグメントイオンデータの複数の基準セット中のイオンの質量（または質量に関係付けられる量）と比較するステップを含む請求項１９、２０、または２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記比較ステップが、
    （ｎ＋１）個の各試料セットがそれぞれ由来する可能性が最も高い前駆体イオン種または前記前駆体イオン種に関係付けられた分子を同定することを目的として、第１の試料セット中のイオンの質量（または関連の量）を複数の基準セット中のイオンの質量（または関連の量）と比較し、次いで、さらなるｎ（≧１）個の試料セット中のイオンの質量（または関連の量）を順次に、複数の基準セット中のイオンの質量（または関連の量）とそれぞれ比較するステップを含む請求項２２に記載の方法。
24. 前記比較ステップが、先行するステップ（ａ）〜（ｅ）および後続のステップ（ｆ）から離して行われる請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記前駆体および／またはフラグメントイオンの質量に関する情報を、前記比較手段によって好まれる形式で前記比較手段に提供するステップをさらに含む請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記前駆体および／またはフラグメントイオンの質量に関する情報を、前記比較手段に前記情報を提供する前に第１の形式から第２の形式に変換するステップをさらに含む請求項２５に記載の方法。
27. 前記前駆体および／またはフラグメントイオンの質量に関する情報が、前記前駆体および／またはフラグメントイオンの質量あるいは質量電荷比のいずれかである請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記前駆体および／またはフラグメントイオンの質量に関する情報を質量単位に変換するステップをさらに含み、任意選択で、付加物または中性ロスに関して質量を調節するステップをさらに含む請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
29. 複数のフラグメントイオン種の１つまたは複数の試料セットを割り当てる前記ステップ（ｄ）が、前記複数の前駆体イオンに由来する前記複数のフラグメントイオンから、フラグメントイオン種の対の１つまたは複数の試料セットを割り当てるステップを含み、前記または各試料セット中のフラグメントイオン種の対が、前記複数の前駆体イオン種の１つの質量に対応する合算した質量を有する請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記または各対の質量が１つまたは複数の前駆体イオン種の質量に対応するときにフラグメントイオン種の対の前記または各試料セットを割り当てる前記ステップが、前記または各対の質量が前記複数の前駆体イオン種の１つから所定の量だけオフセットされるときにフラグメントイオン種の対の前記または各試料セットを割り当てるステップを含む請求項２９に記載の方法。
31. 前記複数の前駆体イオン種のイオンをフラグメント化する前記ステップ（ｂ）の後に、
    （ｇ）複数の孫フラグメントイオンを形成するために前記複数のフラグメントイオンをフラグメント化する追加のステップと、
    （ｈ）複数のフラグメントイオン種に由来する前記孫フラグメントイオンを一緒に／同時に質量分析する追加のステップと、
    （ｉ）複数の孫フラグメントイオン種の１つまたは複数の試料セットを、前記孫フラグメントイオンが形成された複数のフラグメントイオン種の特定の１つに割り当てる追加のステップであって、複数の孫フラグメント化種の前記または各試料セットが、ステップ（ｈ）で決定された合算した質量がフラグメントイオン種の特定の１つの質量に対応する孫フラグメントイオン種を含み、前記孫フラグメントイオン種が前記フラグメントイオン種に割り当てられる追加のステップと、
    （ｊ）前記フラグメントイオン種の１つまたは複数に関して、（ｉ）識別された特定のフラグメントイオン種の質量と、（ｉｉ）前記特定のフラグメントイオン種に関する前記または各割り当てられた試料セット中の複数の孫フラグメントイオン種の質量とを識別する試料データを比較手段に転送するステップであって、それにより、フラグメントおよび割り当てられた孫フラグメントイオン種の質量を示す量を、それぞれ、基準孫フラグメントイオンデータおよび基準フラグメントイオンデータの１つまたは複数の基準セット中のイオンの質量を示す量と比較する追加のステップと、
    （ｋ）前記比較手段から、複数の孫フラグメントイオン種が割り当てられたフラグメントイオン種を同定することを目的とした前記比較の結果を示す情報を受け取る追加のステップと
    をさらに含む請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 分析に利用可能な前駆体イオン種すべてのサブセットを形成する第１の複数の前駆体イオン種を同定するステップと、
    前記同定された第１の複数の前駆体イオン種に対して前記方法ステップを実施するステップと、
    分析に利用可能であり、前記サブセット中に含まれていなかった前駆体イオン種すべてのうちの前記前駆体イオンの少なくともいくつかに関して前記方法ステップを繰り返すステップと
    をさらに含む請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 実行されたときに、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のステップを１つまたは複数の処理装置に行わせるコンピュータプログラム。
34. 請求項３３に記載のコンピュータプログラムをロードされたときの質量分析計用の制御装置。
35. 請求項３４に記載の制御装置を含む質量分析計。