DE102014001003B3

DE102014001003B3 - Aufnahme von Fragment-lonen-Massenspektren von Biopolymeren in Gemischen

Info

Publication number: DE102014001003B3
Application number: DE102014001003.1A
Authority: DE
Inventors: Jens Decker; Ralf Hartmer
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2014-01-29
Filing date: 2014-01-29
Publication date: 2015-07-02
Anticipated expiration: 2034-01-30
Also published as: CN104807875A; GB201500816D0; US9595427B2; GB2527166B; US20150214020A1; CN104807875B; GB2527166A

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Auswahl der günstigsten Ionensorten für eine Aufnahme von Fragment-Ionen-Massenspektren, wenn durch die Ionisierung Biopolymere in verschiedenen Ladungszuständen auftreten. In der Erfindung wird ein Verfahren vorgeschlagen, mit dem in besonders schneller Weise aus Massenspektren, die durch Elektrosprühen (ESI) oder ähnlich vielfältige Ladungszustände erzeugende Ionisierungsverfahren ionisiert werden und für jedes Biopolymer viele Signalmuster von Ionen der verschiedenen Ladungszustände und verschiedenen Isotopenzusammensetzungen enthalten, die günstigsten Eltern-Ionen der verschiedenen Biopolymere für eine Fragmentierung so herausgesucht werden, dass von einem Biopolymer nicht mehrere Ionensorten gemessen werden. Außerdem kann die jeweils günstigste Durchlassbreite des Filters für die Isolierung einer Ionensorte, die der Fragmentierung zugeführt werden soll, angegeben werden.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Auswahl der günstigsten Ionensorten für eine Aufnahme von Fragment-Ionen-Massenspektren, wenn durch die Ionisierung Biopolymere in verschiedenen Ladungszuständen auftreten.
In mit der Erfindung wird ein Verfahren vorgeschlagen, mit dem in besonders schneller Weise aus Massenspektren, die durch Elektrosprühen (ESI) oder ähnliche Ionisierungsverfahren ionisiert werden und für jedes Biopolymer viele Signalmuster von Ionen der verschiedenen Ladungszustände und verschiedenen Isotopenzusammensetzungen enthalten, die günstigsten Ionensorten der verschiedenen Biopolymere für eine Fragmentierung so herausgesucht werden, dass von einem Biopolymer nicht mehrere Ionensorten gemessen werden. Außerdem kann die jeweils günstigste Durchlassbreite des Filters für die Isolierung einer Ionensorte, die der Fragmentierung zugeführt werden soll, angegeben werden.
Anmerkungen und Definitionen
In dieser Schrift wird statt der gesetzlichen „vereinheitlichten atomaren Masseneinheit” (u) die Einheit „Dalton” (Da) verwendet, die in der letzten (achten) Ausgabe 2006 der Schrift „The International System of Units (SI)” des „Bureau International des Poids et Mesures” der vereinheitlichten atomaren Masseneinheit gleichwertig beigestellt wurde; vor allem, wie dort angemerkt, um die Einheiten Kilodalton, Millidalton und Ähnliche verwenden zu können.
Unter einer „Ionensorte” werden hier die Ionen einer Substanz S in einem Ladungszustand z verstanden, also S^z+. Dabei werden jeweils alle Ionen der verschiedenen Isotopenzusammensetzungen eingeschlossen, da die Substanz alle diese Isotopenzusammensetzungen enthält. Eine Ionensorte kann durch die Angabe eines Wertes für M/z charakterisiert werden, wobei M aber nicht, wie häufig in der Massenspektrometrie üblich, die mono-isotopische Masse (meist mit m bezeichnet), sondern die über die Isotopenzusammensetzungen gemittelte Molekülmasse M (früher: Molekulargewicht) bedeutet.
Stand der Technik
Die Identifizierung von Biopolymeren, insbesondere Proteinen, mit Molekülmassen M zwischen 5 und 100 Kilodalton in Körperflüssigkeiten ist pharmakologisch, biologisch und medizinisch von hohem Interesse. Im Folgenden wird hauptsächlich auf Proteine eingegangen. Beispiele für stark interessierende Proteine sind Antikörper, meist enzymatisch zerlegt in drei Teilmoleküle mit Massen von etwa 50, 50 und 25 Kilodalton. Die Identifizierung wird vorzugsweise durch massenspektrometrische Analyse von Fragment-Ionen-Spektren nach flüssigkeits-chromatographischer Trennung vorgenommen, wobei aber oft viele Proteine chromatographisch nicht vollständig separiert werden können. In der Regel wird die Ionisierung durch Elektrosprühen (ESI) vorgenommen. Im Massenspektrum gibt es dabei für jedes Protein regelmäßige Muster aus vielfach geladenen Ionen mit einer breiten, meist relativ glatten Verteilung der Intensitäten für die Ionen mit verschiedenen Ladungszahlen z, wobei die intensivsten Ionensorten in der Regel bei ladungsbezogenen Massen M/z zwischen 600 und 1200 Dalton liegen. Jede der durch die ladungsbezogene Masse M/z charakterisierten Ionensorten zeigt wiederum eine schmale Verteilung von Ionen verschiedener Isotopenzusammensetzung. Dabei gibt es bei Anwesenheit vieler verschiedener Substanzen viele Überlappungen der Isotopenverteilungen.
Wird ein Protein durch eine Ionisierung mit Elektrosprühen versprüht, dann hängt die Anzahl der auftretenden Ionensorten verschiedener Ladungszustände z von der Masse M des Proteins ab, für hohe Massen ergibt sich generell eine höhere Anzahl verschiedener Ladungszustände als für niedrige. Ein kleines Protein wie beispielsweise Ubiquitin mit der mittleren Molekülmasse M = 8564,76 Da liefert im Elektrosprühverfahren typischerweise acht verschiedene Ladungszustände mit Ladungszahlen z = 7, 8, 9, ..., 14, wenn es mit einem typischen Lösungsmittelgemisch aus Wasser, Acetonitril und Ameisensäure versprüht wird ( ). Rinderserumalbumin mit einer mittleren Masse von M = 66,4 kDa erscheint im Massenspektrum in 32 verschiedenen Ladungszuständen z ( ). Die Struktur des Proteins, die Verwendung von denaturierenden Lösungsmitteln und die Existenz von Disulfidbrücken innerhalb des Proteins kann die Ladungsverteilung beeinflussen; die starke Vernetzung innerhalb des Rinderserumalbumins bewirkt, dass während der Ionisierung relativ wenige Protonen als Ladungsträger aufgenommen werden können, was dazu führt, dass die intensivsten Ionensorten relativ schwer sind und bei etwa M/z = 1200 Da erscheinen.
Die Identifizierung eines Proteins erfordert die Aufnahme eines Massenspektrums der Fragment-Ionen einer ausgewählten Ionensorte dieses Proteins mit einer ladungsbezogenen Masse M/z, wobei in der Regel alle Isotopensignale dieser Ionensorte in die Fragmentierung einbezogen werden. Die massenspektrometrische Analyse wird meist in Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF) vorgenommen, wobei die Isolierung der ausgewählten Ionensorte und ihre Fragmentierung üblicherweise in Quadrupol-Massenfiltern und Ionenspeichern durchgeführt werden. In der Regel werden die mehrfach geladenen Proteinmoleküle durch Übertragung von Elektronen aus geeigneten, negativ geladenen Donor-Molekül-Ionen fragmentiert (ETD = electron transfer dissociation). Da die Aufnahmen eines guten Massenspektrums der Fragment-Ionen etwa fünf bis zehn Sekunden dauert, und die Proteine im Chromatogramm nur innerhalb von etwa 30 bis 45 Sekunden eluieren und damit massenspektrometrisch verwertbar sind, kommt es darauf an, aus einem nicht fragmentierten Massenspektrum schnell und automatisch die für die einzelnen Proteine richtigen, nicht mit anderen Protein-Ionen überlappenden Ionensorten für die Fragmentierung heraussuchen zu können.
Wie in zu ersehen ist, lässt sich aus einem ESI-Massenspektrum eines Gemisches visuell nicht mehr erkennen, welches Ionensignal zu welchem Protein gehört, obwohl dieses Gemisch nur vier Proteine enthält. Es gibt jedoch Verfahren zur Ladungs-Dekonvolution, beispielsweise das bekannte Programm „MaxEnt” (maximum entropy charge deconvolution), das anhand einer Entropiedefinition das für das gemessene Massenspektrum wahrscheinlichste entfaltete Massenspektrum berechnet. Das Ergebnis einer solchen Dekonvolution des massenspektrometrischen Messspektrums der ist in gezeigt; es sind die vier Proteine des Gemischs deutlich erkennbar. Leider braucht das Programm „MaxEnt” auf schnellen Rechnern ein bis zwei Minuten für die Dekonvolution, es kann daher hier nicht für eine schnelle Suche nach geeigneten Kandidaten für die Fragmentierung verwendet werden, vor allem dann nicht, wenn Substanzen eines Gemischs etwa gleiche Retentionszeiten haben und somit zeitgleich ungetrennt aus dem Chromatographen eluieren.
Für die Fragmentierung wird im einfachsten Verfahren nach bisheriger Technik einfach zunächst die Ionensorte mit höchster Intensität fragmentiert und deren Fragment-Ionen-Massenspektrum aufgenommen, dann die Ionensorte mit zweithöchster Intensität, und so weiter. Dadurch werden aber vielfach immer wieder Ionen verschiedener Ladungszahlen der gleichen Proteine gemessen, bevor endlich ein zweites Protein gefunden wird, das sich von dem ersten unterscheidet. Proteine geringerer Intensität (wie beispielsweise die Insulin-Ionen in und ) werden dabei häufig gar nicht gefunden. Ein zweites Verfahren nach dem Stand der Technik sucht ebenfalls die Ionensorten in der Reihenfolge der Intensitäten aus, bestimmt aber durch Analyse der Abstände der Isotopensignale die Ladung z dieser Ionensorte und daraus über das bekannte M/z die Masse M des Proteins. Hat die zweithöchste Ionensorte die gleiche Masse M, so wird sie nicht für die Fragmentierung ausgesucht, sondern es wird die dritthöchste Ionensorte untersucht, usw. Dieses Verfahren ist aber nur anwendbar, wenn die einzelnen Isotopensignale gut voneinander getrennt sind, also die Massenauflösung des verwendeten Massenanalysators hinreichend groß ist; es versagt in Massenspektrometern, die nicht extrem hohe Auflösungsvermögen besitzen. Für Massen über 30 Kilodalton ist das Verfahren kaum mehr anwendbar, da hier Auflösungsvermögen über R = 60000 erforderlich sind, deren Realisierung mit Flugzeitmassenspektrometern eine Herausforderung darstellt.
Die Patentanmeldung DE 10 2005 061 425 A1 beschreibt Aufnahmeverfahren für Fragment-Ionenspektren von Peptiden in Hochfrequenz-Ionenfallen-Massenspektrometern, in der Regel mit separierenden Trennverfahren wie Chromatographie oder Kapillarelektrophorese gekoppelt, gemäß denen jedes gemessene Fragment-Ionenspektrum auf das Auftreten einer dominanten Ionensorte untersucht wird, wobei dieses Auftreten zu einer Wiederholung der Messung führt, jedoch mit einer zusätzlichen Stoßanregung der dominanten Ionensorte. Die anfängliche Fragmentierung soll dabei durch Stöße oder Elektronen induziert werden.
Es besteht also ein Bedarf für Verfahren, die aus einem komplexen Massenspektrum von gemischten Proteinen, wie es in beispielhaft dargestellt ist, in schneller Weise für jedes beteiligte Biopolymer, zumindest aber für so viele Biopolymere wie möglich, die am besten geeigneten Ionensorten für eine Fragmentierung heraussuchen können. Eine vollständige Dekonvolution ist nicht erforderlich. Günstig ist es, auch die Breite der Isotopenverteilung Δ(M/z) zu bestimmen, beispielsweise, um das Massenfilter für die Isolierung dieser Ionensorte optimal einstellen zu können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
In der Erfindung wird ein Verfahren vorgeschlagen, mit dem in besonders schneller Weise aus Massenspektren von Biopolymeren, die viele Signalmuster von Ionen der verschiedenen Ladungszustände und verschiedenen Isotopenzusammensetzungen enthalten, wie sie beispielsweise aus der Elektrosprüh-Ionisierung resultieren, die günstigsten Ionensorten der beteiligten Biopolymere für eine Fragmentierung herausgesucht werden, ohne dass Ionen eines Biopolymers mehrfach mit unnötig vielen verschiedenen Ladungszuständen der Messung zugeführt werden. Außerdem kann die jeweils günstigste Durchlassbreite des Filters für die Isolierung eines Isotopen-Signalmusters, also für die Isolierung der ausgewählten Ionensorte, angegeben werden.
Für dieses Verfahren wird zunächst ein Ausgangsbereich im gemessenen Massenspektrum, beispielsweise 600 < M/z < 1200 Dalton, und ein Zielbereich für ein Zielspektrum festgelegt, beispielsweise 5000 < M < 60 000 Dalton. Der Zielbereich wird vorzugsweise in kleine Teilkanäle („Bins”) eingeteilt, beispielsweise zu je 5 Dalton. Des Weiteren kann der Bereich der Ladungszahlen z festgelegt werden, beispielsweise 5 ≤ z ≤ 60. Der Bereich kann dabei als jede ganze Zahl zwischen der Obergrenze und der Untergrenze umfassend definiert werden. mit manchen Ausführungsformen kann es auch sinnvoll sein, einen Bereich zu definieren, der nicht alle ganzen Zahlen zwischen der Obergrenze und der Untergrenze umfasst sondern manche überspringt, oder eine diskontinuierliche Menge an Ladungszahlen. Das massenspektrometrische Messspektrum kann nun mit einem schnellen Algorithmus geglättet und auf eine geringere Anzahl Datenpunkte i(M/z) mit äquidistanten M/z-Werten reduziert, also von einer Messparameterskala (zum Beispiel der Flugzeit) auf eine Massenskala transformiert, werden. Dabei ist es vorteilhaft, wenn danach die Isotopensignale nicht mehr getrennt erscheinen, da nur die Einhüllenden gebraucht werden. Alternativ werden zuvor aus einem massenspektrometrischen Messspektrum mittels eines Peak-Picking-Algorithmus gewonnene Strichspektren auf ein Spektrum mit äquidistanten M/z-Werten abgebildet.
Nunmehr wird der M/z-Wert eines jeden Ionensignals des Auswahlbereichs im ggfs. geglätteten und reduzierten Spektrum nacheinander mit den ganzen Zahlen n aus dem Bereich der Ladungszahlen z, also beispielsweise mit n = 5, 6, 7, ..., 60 multipliziert und durch Abzug der Masse n × p der n Ladungsträger korrigiert. Für positive Ionen sind die Ladungsträger Protonen mit positiver Protonenmasse p. Die Intensität i(M/z) wird im Kanal (Bin) des Zielspektrums für das jeweilige Ergebnis M_n = (M/z) × n – n × p zu einer Intensitätssumme Σi addiert, solange die berechnete Masse M_n noch in den Zielbereich fällt. Fällt die berechnete Masse M_n nicht mehr in den Zielbereich, wird die Multiplikationsreihe für dieses Ionensignal abgebrochen. In einer begleitenden Tabelle wird für jeden Kanal (Bin) die ladungsbezogene Masse M/z des Signals und seine Intensität i(M/z) vermerkt. Alternativ dazu kann auch nur die Intensität i(M/z) und das M/z des dominierenden Summanden vermerkt werden. Dieses Zielspektrum enthält nun viele völlig unsinnige Einträge; aber es hat sich überraschender Weise gezeigt, dass die Summenintensitäten Σi an den Stellen real vorhandener Biopolymere der Masse M deutlich herausragen, da sich hier die Signale aller Ladungszustände z dieses Biopolymers addieren. Aus diesen herausragenden Signalen können nun, beispielsweise in der Reihenfolge fallender Gesamtintensitäten Σi, jeweils geeignete Ionensorten für die Fragmentierung ausgesucht werden, beispielsweise die Ionensorte M/z mit jeweils größter Intensität i(M/z) aus dem Kanal (Bin).
Die Ladungsträger können im Sinne der Erfindung auch eine negative Masse haben, wenn die Biopolymere beispielsweise mittels negativem Elektrosprühverfahren ionisiert werden und die Substanz mehrfach deprotoniert wird. Der Bereich oder die Menge der Ladungszahlen würde in diesem Fall negative Einträge n beinhalten. Biopolymere, die sich besonders gut für eine Ionisierung mit negativer Polarität eignen, sind Desoxyribonukleinsäuren (DNS) oder Glykosaminoglykane. Für mehrfach negativ geladene, deprotonierte Ionen sind die Ladungsträger sozusagen (fehlende) Protonen mit negativer Protonenmasse –p. Die Rechenvorschrift bleibt aber prinzipiell die gleiche wie oben beschrieben.
Es ist dabei noch zu prüfen, ob die ausgewählte Ionensorte alleine steht oder von anderen, insbesondere intensiveren Ionensorten überlappt erscheint. Liegt eine Überlappung vor, so sucht man die jeweils nächstintensivste Ionensorte aus dem Kanal (Bin) für dieses Protein aus und prüft auf Überlappung, bis eine überlappungsfreie Ionensorte gefunden ist. Wird nur der dominierende Summand gespeichert, wird die Überlappung wie oben anhand des reduzierten M/z-Spektrums geprüft; im Falle einer gravierenden Überlappung mit einem starken Signal werden für das Protein der Masse M zur ursprünglich ausgewählten Ionensorte benachbarte Ionensorten M/z auf geeignete Intensität i(M/z) und Überlappung geprüft, bis eine geeignete Ionensorte gefunden ist.
Vorzugsweise kann auch ein iteratives Verfahren angewendet werden, in dem nach Wahl einer Ionensorte für ein erstes Biopolymer alle Ionensorten M/z des ausgewählten Biopolymers aus dem geglätteten und reduzierten Spektrum gelöscht werden und dann der Vorgang der Multiplikationen und Speicherungen erneut ausgeführt wird. Mit diesem iterativen Verfahren lassen sich auch Biopolymere sehr geringer Konzentration finden.
Die Breite der Isotopenverteilung für die ausgewählte Ionensorte kann durch die Annahme einer durchschnittlichen Zusammensetzung der Biopolymere aus Wasserstoff (H), Kohlenstoff (C), Stickstoff (N), Sauerstoff (O), Schwefel (S) und Phosphor (P) berechnet werden, wie sie dem statistischen Mittelwert für die betreffenden Biopolymere entspricht. Dabei stellt sich heraus, dass die Isotopenverteilung verschiedener Ionensorten bei einer ladungsbezogenen Masse M/z umso schmaler wird, je größer die Masse M des Biopolymers ist. Die Breite kann sowohl für das Löschen der Ionensorten im iterativen Verfahren, wie auch für die Einstellung des Massenfilters für die Isolierung dieser Ionensorte verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
zeigt ein ESI-Massenspektrum von Ubiquitin (m = 8,564 kDa) mit sieben Ionensorten M/z, deren Ladungszahlen von z = 14 bis z = 7 reichen.
gibt ein ESI-Massenspektrum von Rinderserumalbumin wieder (m = 66,4 kDa), mit einer Verteilung der Ionensorten verschiedener Ladungszustände, deren Maximum wegen starker innerer Vernetzung etwas über M/z = 1200 Da liegt. Das volle Spektrum zeigt 32 Ionensorten. Die einzelnen Ionensignale sind jeweils durch mehrere Addukte verbreitert.
zeigt ein gemessenes Massenspektrum eines Gemisches von Insulin (~5,74 kDa), Ubiquitin (~8,564 kDa), Cytochrom C (~12,38 kDa) und Myoglobin (~17,05 kDa), ionisiert durch Elektrosprühen. Die vielfach geladenen Ionen der nur vier Proteine überlagern sich so, dass sie mit dem Auge nicht mehr zuzuordnen sind.
zeigt eine Entfaltung des massenspektrometrischen Messspektrums aus durch das bekannte Programm MaxEnt, das die vier Hauptbestandteile sehr gut wiedergibt. Die Entfaltung nimmt aber selbst mit schnellen Rechnern einige Minuten in Anspruch.
gibt ein Zielspektrum wieder, wie es durch ein Verfahren gemäß den Prinzipien der Erfindung aus dem massenspektrometrischen Messspektrum der erzeugt werden kann.
stellt oben einen engen Ausschnitt von nur 12 Dalton aus dem hochaufgelöst gemessenen Massenspektrum der dar, mit Ubiquitin 9+ (links, M/z ≈ 951,5 Da), Cytochrom C 13+ (M/z ≈ 952,5 Da) und, etwa in Bildmitte, Insulin 6+ (M/z ≈ 956,2 Da). Darunter ist ein massenspektrometrisches Messspektrum wiedergegeben, das man erhält, wenn mit einem Massenfilter nur die sechsfach geladenen Insulin-Ionen ausgefiltert werden. So ausgefilterte Ionen können für eine Fragmentierung verwendet werden.
zeigt ein Massenspektrum einer Kalibrierlösung mit den einfach geladenen Ionen der Massen m = 622, 922, 1222, 1522, 1822, 2122 Da (jeweils z = 1), worin ein Massenspektrum von Ubiquitin mit seinen vielfach geladenen Ionensorten eingebettet ist.
zeigt in höherer graphischer Auflösung die Umgebung der Masse m = 1222 Da aus dem Spektrum der mit dem Isotopensignal m = 1223 Da und der Isotopenverteilung von Ubiquitin 7+.
Besondere Ausführungsformen
Wie schon oben erläutert, werden in der Erfindung Verfahren vorgeschlagen, mit denen sehr schnell aus Massenspektren von Biopolymer-Gemischen, die für mindestens ein Biopolymer ein Signalmuster von Ionen der verschiedenen Ladungszustände und verschiedenen Isotopenzusammensetzungen enthalten, die günstigsten Ionensorten der beteiligten Biopolymere für deren Fragmentierung herausgesucht werden. Solche Signalmuster von Ionen der verschiedenen Ladungszustände und verschiedenen Isotopenzusammensetzungen können beispielsweise aus Elektrosprüh-Ionisierung resultieren Auf diese Weise kann vermieden werden, dasselbe Biopolymer mehrmals über Ionensorten mit verschiedener Ladung zu messen, was letztlich nur Messzeit kostet, ohne neue Informationen über die Zusammensetzung des Biopolymergemischs zu liefern. Das Rechenverfahren dauert mit Rechnern, wie sie zur Ausstattung leistungsfähiger Massenspektrometer gehören, nur etwa 10 bis 100 Millisekunden; die Suche kann somit in Echtzeit anhand eines massenspektrometrischen Messspektrums nach jeweils drei oder vier Aufnahmen von Fragment-Ionen-Spektren durchgeführt werden. Außerdem lässt sich die jeweils günstigste Durchlassbreite des Massenfilters für die Isolierung einer Ionensorte für deren Fragmentierung angeben. Ein ESI-Massenspektrum eines Gemischs aus vier Proteinen mit Signalen von über 50 Ionensorten ist in wiedergegeben.
Statt auf ESI-Massenspektren kann das Verfahren auch auf Spektren aus anderen Ionisierungsverfahren angewendet werden, wenn diese Ionisierungsverfahren Muster von Ionen verschiedener Ladungszustände erzeugen. Ein Beispiel dafür ist DESI (Desorptions-Elektrosprüh-Ionisierung), bei dem ein Elektrosprühstrahl auf eine feste Probe gerichtet wird.
Für das Rechenverfahren wird bevorzugt zunächst ein Ausgangsbereich der ladungsbezogenen Massen im gemessenen Massenspektrum, beispielsweise 600 < M/z < 1200 Dalton, und ein Zielbereich der Massen in einem Zielspektrum festgelegt, beispielsweise 5000 < M_ziel < 60000 Dalton. Der Zielbereich wird vorzugsweise in kleine Kanäle („Bins”) eingeteilt, beispielsweise in 11000 Bins zu je 5 Dalton. Des Weiteren kann der Bereich der Ladungszahlen z festgelegt werden, die in einem Ausführungsbeispiel als ganze Zahlen n für die Multiplikation dienen, beispielsweise 5 ≤ z ≤ 60. Das massenspektrometrische Messspektrum kann nun einem Untergrundabzug unterworfen und mit einem schnellen Algorithmus geglättet werden, wobei es durchaus günstig ist, wenn danach die Isotopensignale nicht mehr getrennt erscheinen, da nur die Einhüllenden gebraucht werden. Das Spektrum wird dann auf eine geringere Anzahl Datenpunkte i(M/z) mit äquidistanten M/z-Werten reduziert; also von einer Messparameterskala, beispielsweise einer Flugzeitskala, in eine Massenskala transformiert. In diesem transformierten und reduzierten Massenspektrum ohne Untergrund überlagern sich immer noch die Muster der Ladungsverteilungen der beteiligten Biopolymere, wobei, je nach den chromatographischen Bedingungen, auch noch Addukte der Biopolymer-Ionen, beispielsweise mit Na⁺-, K⁺- oder anderen Ionen, vorhanden sein können.
Nunmehr wird der M/z-Wert des ersten Ionensignals des geglätteten und reduzierten Spektrums, der sich über die Nulllinie erhebt, nacheinander mit allen ganzen Zahlen n des festgelegten Bereichs der Ladungszahlen z, also beispielsweise mit n = 5, 6, 7, ..., 60, multipliziert und durch Abzug der Masse der Ladungsträger, also der Masse p der Protonen bei positiven Ionen, korrigiert. Das jeweilige Ergebnis M_n = (M/z) × n – n × p wird im richtigen Bin M_ziel des Zielspektrums eingetragen. Dabei werden in den Bins die Intensitäten i(M/z) aller Einträge zu einer Summe Σi(M_ziel) addiert. In einer zugehörigen Tabelle werden für jedes Bin die ladungsbezogenen Massen M/z und Intensitäten i(M/z) aller eingetragenen Signale vermerkt; alternativ kann in einem schnelleren Verfahren, das insbesondere auch weniger Speicherplatz benötigt, nur die Intensität i(M/z) und die ladungsbezogene Masse M/z des dominierenden Summanden vermerkt werden. Das Verfahren für das erste Ionensignal wird abgebrochen, wenn die berechnete Masse M_n = (M/z) × n – n × p nicht mehr in den Zielbereich fällt. Das Multiplikations- und Speicherverfahren wird dann für das zweite Ionensignal des geglätteten Massenspektrums, also den zweiten M/z-Wert, sodann für den dritten, vierten, fünften, ... M/z-Wert durchgeführt, bis alle Ionensignale, also alle M/z-Werte des geglätteten und reduzierten Spektrums diesem Multiplikations- und Speicherverfahren unterworfen wurden.
Dieses Zielspektrum mit Herkunftstabelle enthält nun viele völlig unsinnige Einträge; aber die Intensitätssummen Σi(M_ziel) ragen an den Stellen real vorhandener Proteine der Masse M in überraschender Weise weit und deutlich heraus, da sich hier die Signale aller Ladungszustände z eines Proteins der Masse M = M_ziel addieren. zeigt das Zielspektrum, wie es aus dem massenspektrometrischen Messspektrum der unter Anwendung der oben beschriebenen Rechenvorschrift gewonnen wird.
In einer ersten Ausführungsform werden nun anhand dieser herausragenden Signale die Proteine herausgesucht, die der Fragmentierung zugeführt werden sollen, beispielsweise in der Reihenfolge fallender Intensitätssummen Σi(M_ziel). Für jedes dieser Proteine wird dann aus den Einträgen in der begleitenden Tabelle jeweils die geeignetste Ionensorte aus dem Bin für die Fragmentierung ausgesucht, beispielsweise die Ionensorte M/z mit der größten Intensität i(M/z), oder einfach die dort als dominant eingetragene Ionensorte. Für jede zunächst ausgewählte Ionensorte M/z ist dann noch zu prüfen, ob sie alleine steht oder von anderen Ionensorten überlappend gestört wird. Liegt eine Überlappung vor, so sucht man die jeweils nächstintensivste Ionensorte dieses Proteins aus dem Bin aus und prüft auf Überlappung, bis eine nicht überlappende Ionensorte gefunden ist.
Damit nicht zwischen der Aufnahme eines Massenspektrums für die Auswahl der Ionensorten und der nachgelagerten Aufnahme von Fragment-Ionen-Spektren zu viel ungenutzte Zeit vergeht, kann man nach der Bestimmung der ersten Ionensorte bereits mit der Aufnahme des Fragment-Ionen-Massenspektrums beginnen, und dann die Bestimmung weiterer Ionensorten fortsetzen. Auch kann man die Auswahl zumindest der ersten Ionensorte an einem Massenspektrum vornehmen, dass in verkürzter Zeit mit geringerer Qualität aufgenommen wurde.
In einer zweiten und bevorzugten Ausführungsform wird der hier beschriebene Algorithmus iterativ durchgeführt. Hierfür wird zunächst nur eine Ionensorte für das Biomolekül der Masse M = M_ziel mit der höchsten Intensität Σi(M_ziel) ausgewählt. Ist diese ausgewählte Ionensorte M/z nicht von anderen Signalen überlagert und somit für die Fragmentierung brauchbar, werden alle Ionensorten dieses Biomoleküls aus dem geglätteten und reduzierten Spektrum gelöscht. Für diese Löschung werden alle entsprechenden Werte M/z berechnet. Für die Verteilungsbreiten der Isotopensignale kann ein geeigneter durchschnittlicher Wert angenommen werden; günstiger ist es jedoch, die Verteilungsbreite Δy(M/z) der Isotopensignale für die Ionensorte M/z aus der Masse M nach dem unten beschrieben Verfahren zu berechnen. Aus dem so durch Löschen modifizierten Spektrum wird nach dem beschriebenen Algorithmus ein neues Zielspektrum erstellt, aus dem dann wieder eine geeignete Ionensorte des nunmehr stärksten Biomoleküls ausgesucht wird. Dieses Verfahren wird iterativ fortgesetzt, bis eine vorgegebene Anzahl von Biomolekülen gefunden ist, oder die verfügbaren Ionensignale abgearbeitet sind.
Die Breite Δ_i(M/z) der Isotopenverteilung für die ausgewählte Ionensorte kann durch die Annahme einer durchschnittlichen Zusammensetzung der Biopolymere aus H, C, N, O, S und P berechnet werden, wie sie dem statistischen Mittelwert entspricht. Für Proteine entspricht die gemittelte Zusammensetzung der Bruttoformel C_4,9384H_7,7583N_1,3577O_1,4773S_0,0417. Daraus lässt sich für jede Masse M eine Zahl k_i(M, s) berechnen, die angibt, wie viele Isotopenlinien eines Proteins dieser Masse M über einer prozentualen Intensitätsschwelle s liegen. Für eine Intensitätsschwelle von fünf Prozent der maximalen Intensität gilt die Formel k_i(M, 5%) = √(a × M/m_u – b), mit m_u = 1 Da als angenähertem Abstand zwischen den Isotopenmassen und den Konstanten a = 0,016955 und b = 2,77. Für andere Arten von Biopolymeren gibt es leicht verschiedene Konstanten a und b, wie dem Fachmann bekannt ist. Die Breite der Ionensorte M/z ergibt sich zu Δ_i(M/z) = (k_i(M, s) – 1) × m_u/z.
Einer Auswahl von geeigneten Ionensorten folgt die Messung der Fragment-Ionen-Massenspektren. Die ausgewählte Ionensorte wird, weiterhin aus der Ionenquelle strömend, im Massenspektrometer in einem Massenfilter isoliert und in einer geeigneten Zelle fragmentiert, und es wird das Massenspektrum der Fragment-Ionen gemessen. In der Regel werden die mehrfach geladenen Proteinmoleküle durch Übertragung von Elektronen aus geeigneten, negativ geladenen Donor-Molekül-Ionen fragmentiert (ETD = electron transfer dissociation). Für Protein-Identifizierungen wird aus dem Fragment-Ionen-Massenspektrum in an sich bekannter Weise eine möglichst lange Teilsequenz der Aminosäuren bestimmt und damit das Protein identifiziert. Bei veränderten Proteinen wird aus dem Fragment-Ionenspektrum die Veränderung gegenüber Normalformen bestimmt. Auf die verschiedenen Aufgabenstellungen werde hier nicht näher eingegangen.
Auch für die günstigste Einstellung des Massenfilters für die Isolierung der ausgewählten Ionensorte kann die Bestimmung der Breite Δ_i(M/z) der Isotopenverteilung verwendet werden.
Es soll hier noch angemerkt werden, dass es sich nicht immer um Gemische mehrerer schwerer Biomoleküle handeln muss, deren vielfältige Ionensorten sich überlagern. Das Verfahren ist auch anwendbar, wenn in einem Massenspektrum, das im Wesentlichen aus mehreren einfach geladenen Ionen besteht, nur eine Verteilung von mehrfach geladenen Ionensorten eines schwereren Moleküls liegt, wie das in dargestellt ist. Hier liegt im Massenspektrum einer Kalibrierlösung mit den Ionen der monoisotopischen Massen m = 622, 922, 1222, 1522, 1822, 2122 Da (jeweils z = 1) ein Massenspektrum mit Ubiquitin mit seinen vielfach geladenen Ionen. zeigt in einer vergrößerten Darstellung die Umgebung der Masse m = 1222 Da mit dem Isotopensignal m = 1223 Da und der Isotopenverteilung von Ubiquitin 7+.
Es wurde oben bereits angemerkt, dass die Ionensorten bestimmter Substanzen durch Salze in der Chromatographie-Flüssigkeit auch Addukte mit Alkali-Ionen bilden, insbesondere Na⁺ und K⁺. Meist bilden nur wenige Prozent der Substanzmoleküle solche Addukte aus. In den Addukten wird ein Proton durch das Alkali-Ion ersetzt. In der Regel wird jeweils nur ein Alkali-Ion angelagert, und zwar meist an jeweils alle Ionensorten dieser Substanz. Diese Addukte erscheinen somit als neue Substanzen des Substanzgemisches, die um 22 bzw. 38 Dalton schwerer sind als ihre adduktfreien Ausgangssubstanzen. Sie werden durch das beschriebene Verfahren genauso aufgefunden wie die übrigen Substanzen des Gemischs.
Das erfindungsgemäße Verfahren bezieht sich grundsätzlich auf die Analyse der verschiedenen Biopolymere mit verschiedenen Molekülmassen M eines Gemisches, das durch eine Ionisierung mit Elektrosprühen oder einer ähnlich viele Ladungszustände erzeugenden Ionisierungsmethode jeweils viele Ionensorten der einzelnen Proteine mit jeweils verschiedenen Ladungszahlen z liefert, wobei die Analyse anhand der Massenspektren von Fragment-Ionen einer jeweils ausgewählten Ionensorte einer ladungsbezogenen Masse M/z des Ionengemisches durchgeführt werden soll. Das Verfahren besteht im Wesentlichen darin, die Auswahl der Protein-Ionensorten M/z für die Fragmentierung anhand eines berechneten Zielspektrums mit vorgewähltem Massenbereich M_min < M < M_max vorzunehmen, wobei das Zielspektrum durch die Addition aller Intensitäten i(M/z) an den Stellen im Zielspektrum gebildet wird, die durch Multiplikation der ladungsbezogenen Massen M/z aller im gemessenen Massenspektrum vorkommenden Ionensorten mit jeweils allen ganzen Zahlen n und Abzug der Masse der Ladungsträger n × p errechnet werden, soweit die Ergebnismasse M_n = (M/z) × n – n × p in den vorgewählten Massenbereich des Zielspektrums fällt. Es werden also jeweils an der Stelle M_n die Intensitäten i(M/z) der beteiligten Ionensorten aufaddiert. p ist die Masse der Ladungsträger der Ionensorten, für positive Ionen ist p die Masse eines Protons. Das Zielspektrum kann insbesondere in Bins aufgeteilt sein, wobei die Intensitäten i(M/z) jeweils in dem Bin addiert werden, in das die berechnete Ergebnismasse M_n = (M/z) × n – n × p fällt. Besonders günstig ist es, für jedes Bin in einer zum Zielspektrum zugehörigen Tabelle die ladungsbezogene Masse M/z und Intensität i(M/z) aller beteiligten Ionensorten zu notieren. Sparsamer in Bezug auf Speicherplätze und Rechenzeit ist es aber, nur die Intensitäten i und ladungsbezogenen Massen M/z der dominanten Ionensorte zu notieren.
Bei diesem Verfahren müssen nicht immer alle Ionensorten des gemessenen Massenspektrums verwendet werden, sondern es können die Ionensorten M/z auf einen Massenbereich (M/z)_min < M/z < (M/z)_max eingeschränkt werden. Besonders bevorzugt ist es, nur die ganzen Zahlen eines vorgewählten Bereichs z_min < n < z_max oder auch nur eine diskontinuierliche Liste aus ganzen Zahlen zu berücksichtigen.
Die Auswahl der zu fragmentierenden Ionensorten M/z kann durch die Größe der Intensitätssummen Σi(M_ziel) des Zielspektrums und durch die Größe i(M/z) der Intensitäten der einzelnen Ionensorten M/z erfolgen, beispielsweise in abnehmender Reihenfolge der Intensitäten Σi(M_ziel) und i(M/z).
Für die Erzeugung sauberer Fragment-Ionen-Massenspektren ist es günstig, die ausgewählten Ionensorten vor ihrer Verwendung für eine Fragmentierung auf ihre Überlappung mit anderen, stärkeren Ionensorten zu überprüfen. Im Falle einer Überlappung sollte eine andere Ionensorte M/z ausgewählt werden.
Die Breite Δ_i(M/z) der Isotopenverteilung für die ausgewählte Ionensorte kann, wie oben beschrieben, durch die Annahme einer durchschnittlichen Zusammensetzung der Biopolymere aus H, C, N, O, S und P, wie sie dem statistischen Mittelwert entspricht, berechnet werden. Dabei stellt sich heraus, dass die Isotopenverteilung an der Stelle einer Ionensorte der ladungsbezogenen Masse M/z umso schmaler wird, je größer die Masse m des Proteins ist. Die berechnete Breite Δ_i(M/z) kann sowohl für die Einstellung des Massenfilters für die Isolierung der ausgewählten Ionensorte, wie auch für das Löschen aller M/z-Beiträge eines Biopolymers der Masse m im iterativen Verfahren angewendet werden.

Claims

Verfahren zur Analyse von Biopolymeren eines Gemisches mit den Schritten: (a) Ionisieren der Biopolymere des Gemisches, so dass jeweils mehrere Ionensorten der einzelnen Biopolymere mit jeweils verschiedenen ladungsbezogenen Massen M/z geliefert werden, wobei M eine über die Isotopenzusammensetzungen gemittelte Molekülmasse und z einen Ladungszustand darstellen, (b) Aufnehmen eines massenspektrometrischen Messspektrums des Ionensortengemisches, (c) Auswählen von Ionensorten M/z des Ionensortengemisches im massenspektrometrischen Messspektrum für eine Fragmentierung, (d) Fragmentieren der ausgewählten Ionensorten, (e) Aufnehmen von Massenspektren der resultierenden Fragment-Ionen, und (f) Identifizieren der Biopolymere des Gemisches anhand der Massenspektren der Fragment-Ionen, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswahl in Schritt (c) derart vorgenommen wird, dass jeweils nur eine Ionensorte M/z für ein zu identifizierendes Biopolymer für die Fragmentierung anhand eines berechneten Zielspektrums mit vorgewähltem Massenbereich M_min < M_ziel < M_max ausgewählt wird, wobei das Zielspektrum durch Multiplikation der ladungsbezogenen Massen M/z der in dem massenspektrometrischen Messspektrum vorkommenden Ionensorten mit jeweils allen ganzen Zahlen n einer vorgewählten Menge und Abzug der Masse n × p der Ladungsträger entsteht, soweit die Ergebnismassen M_n = (M/z) × n – n × p in den vorgewählten Massenbereich des Zielspektrums fallen, wobei jeweils an der Stelle M_n die Intensitäten i(M/z) der beteiligten Ionensorten (M/z) aufaddiert werden und wobei p eine Ladungsträgermasse ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das massenspektrometrische Messspektrum vor der Erstellung eines Zielspektrums einem Untergrundabzug, einer Glättung und einer Transformation von einer Messparameterskala auf eine Massenskala unterworfen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielspektrum in Kanäle aufgeteilt wird, und dass die Intensitäten i(M/z) jeweils in dem Kanal addiert werden, in den die Ergebnismasse M_n = (M/z) × n – n × p fällt.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass für jeden Kanal in einer zum Zielspektrum zugehörigen Tabelle die ladungsbezogenen Massen M/z und Intensitäten i(M/z) aller beteiligten Ionensorten notiert werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass für jeden Kanal in einer zum Zielspektrum zugehörigen Tabelle die ladungsbezogene Masse M/z und die Intensität i(M/z) der intensivsten Ionensorte notiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass nicht alle Ionensorten des massenspektrometrischen Messspektrums verwendet werden, sondern nur die Ionensorten M/z eines Massenbereichs (M/Z)_min < M/z < (M/z)_max.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zu fragmentierenden Ionensorten M/z der Größe der Intensitätssummen Σi(M_ziel) des Zielspektrums nach und dann der Größe i(M/z) der Intensitäten der einzelnen Ionensorten M/z nach ausgewählt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine ausgewählte Ionensorte auf Überlappung der Isotopenverteilung mit der anderer Ionensorten geprüft wird, und dass im Falle einer Überlappung eine andere Ionensorte M/z für die Fragmentierung ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass iterativ nach Auswahl einer Ionensorte M/z für ein Biopolymer alle Ionensorten dieses Biopolymers aus dem massenspektrometrischen Messspektrum gelöscht werden, und dass in jedem Iterationsschritt aus dem so reduzierten massenspektrometrischen Messspektrum ein neues Zielspektrum gebildet wird, bis eine vorgegebene Anzahl von Biopolymeren gefunden ist oder die Ionensignale des massenspektrometrischen Messspektrums abgearbeitet sind.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass für das Löschen einer Ionensorte eine Breite Δ_i(M/z) der Isotopenverteilung verwendet wird, die aus der mittleren Element-Zusammensetzung der untersuchten Biopolymere berechnet wird.