JP2011510677A - 発酵培地、及びそのプロセス - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、メタノール誘導性菌類発現系(例えば、ピキア属(Pichia))を用いる生物学的変換率の向上を実現した組換えタンパク質や、インシュリン、インシュリンの類似体、エキセンディン等のペプチドや、リパーゼ等の酵素の生産のための発酵培地において、窒素補助剤として尿素あるいはその誘導体等の炭酸アミド、カルバミン酸塩、カルボジイミド及びチオカルバミドの有用性を示す。本発明の重要な態様は、特に、より短い生産期間で、より高い生産量を産出するための、最適化された栄養性媒体パラメータを有する即席の発酵プロセスに関する。本発明の原理は、適切な発現微生物の発酵による広範囲なタンパク質及び二次代謝物の生産に適用することができる。
ピキア・パストリス(P. pastoris)のような発現系に基づく酵母は、組換えタンパク質を発現するために一般的に用いられる(非特許文献1)。ピキア・パストリス発現系は、メタノール誘導性アルコール・オキシダーゼ(AOX1)プロモータ(アルコール・オキシダーゼ(メタノールの代謝の第一段階に触媒作用を及ぼす酵素)の発現をコードする遺伝子を制御する)を使用する(非特許文献2)。ピキア・パストリスは、バイオリアクタ培養における最少培地で、高発現レベルや、細胞外タンパク質の効果的な分泌や、グリコシル化のような翻訳後修飾や、高細胞密度への成育に対する潜在能力を有する。
本発明の主な目的は、メタノール誘導性菌類種の発酵による、組換えタンパク質、その誘導体又はその類似体を生産するための発酵培地を得ることである。
従って、本発明は、メタノール誘導性菌類種を用いる発酵によって、組換えタンパク質、その誘導体、類似体を生産するための、炭酸アミドに有効濃度が存在することに特徴づけられる発酵培地に関する。また、本発明は、微生物を用いる発酵によって、組換えタンパク質、その誘導体、類似体を生産するための、炭酸アミドに有効濃度が存在することに特徴づけられる発酵培地に関する。また、本発明は、微生物を用いる二次代謝物の生産のための、炭酸アミドに有効濃度が存在することに特徴づけられる発酵培地に関する。また、本発明は、炭酸アミドに有効濃度が存在することに特徴づけられる発酵培地において、メタノール誘導性菌類種を増やすことを含む組換えタンパク質、その誘導体、類似体を生産するための生産方法に関する。また、本発明は、炭酸アミドに有効濃度が存在することに特徴づけられる発酵培地において、誘導又は非誘導タンパク質発現微生物を増やすことを含む、組換え、非組換えタンパク質生成物、それらの誘導体、類似体の生産方法に関する。また、本発明は、炭酸アミドに有効濃度が存在することに特徴づけられる発酵培地で、微生物を増やすことを含む二次代謝物の生産方法に関する。また、本発明は、炭酸アミドに有効濃度が存在することに特徴づけられる発酵培地でその変換が実現される、コンパクチンのプロバスタチンへの生物学的変換方法に関する。 また、本発明は、前述の請求項のいずれかによって得られる組換えタンパク質生成物に関する。
本発明は、メタノール誘導性菌類種を用いる発酵による組換えタンパク質、その誘導体又はその類似体の生産の発酵培地に関する。前記培地は、炭酸アミドに有効濃度があるという特徴がある。
本発明のさらにもう一つの実施例において、炭酸アミドは尿素である。
本発明のさらに別の実施例において、炭酸アミドは、液状、散布液、粉末又はペレット形で加えられる。
本発明のさらに別の実施例において、炭酸アミドの残留濃度は、多くとも1Mまでである。
本発明のさらに別の実施例において、炭酸アミドの残留濃度を多くとも1Mまでに保ち、かつ基礎塩類や微量元素の濃度を、対照培地の0.1Xから5Xまでの変更とする。
本発明のさらに別の実施例において、リン酸塩の取り込みが改善される。
本発明のさらに別の実施例において、組換えインシュリン生成物を発現するメタノール誘導性菌類種は、ピギア・パトリス、ピキア属種、サッカロミセス属(Saccharomyces)種、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)種、又はハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)からなる群から選択される。
本発明は、微生物を用いる発酵による二次代謝物の生産の発酵培地に関する。前記培地は、炭酸アミドに有効濃度があるという特徴がある。
本発明の他の実施例において、炭酸アミドは、尿素又はその誘導体(例えば、ジメチル尿素、ジエチル尿素、N−アセチルフェニル尿素、イソプロピルピリデン尿素、フェニル尿素又はそれらの組み合わせ)からなる群から選択される。
本発明のさらにもう一つの実施例において、炭酸アミドは尿素である。
本発明のさらに別の実施例において、炭酸アミドは、液状、散布液、粉末又はペレット形で加えられる。
本発明の別の実施例において、炭酸アミドの残留濃度は、10g/Lまでである。
本発明の他の実施例において、炭酸アミドは、尿素又はその誘導体(例えば、ジメチル尿素、ジエチル尿素、N−アセチルフェニル尿素、イソプロピルピリデン尿素、フェニル尿素、又はそれらの組み合わせ)からなる群から選択される。
本発明の更に別の実施例において、炭酸アミドは尿素である。
本発明の更に別の実施例において、生産される組換えインシュリン生成物は、インシュリン前駆体、インシュリン、その類似体又は誘導体である。
本発明の更に別の実施例において、組換えインシュリン生成物は、インスリングラルギンである。
本発明の更に別の実施例において、組換えペプチドはエキセンディンである。
本発明の更に別の実施例において、生産される組換えタンパク質は酵素である。
本発明の更に別の実施例において、生産される組換え酵素生成物はリパーゼである。
本発明の更に別の実施例において、生産される組換えタンパク質は、インシュリン前駆体、インシュリン、その類似体又はその誘導体、インスリングラルギン、エキセンディン、カルボキシペプチダーゼ、及びリパーゼからなる群から選択される。
本発明の更に別の実施例において、組換えインシュリン生成物を示すメタノール誘導性菌類種は、ピキア・パストリス、ピキア属種、サッカロミセス属種、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイヴェロマイシス種、又はハンゼヌラ・ポリモルファからなる群から選択される。
本発明の更に別の実施例において、メタノール誘導性菌類種は、ピキア・パストリスである。
本発明の他の実施例において、炭酸アミドは、尿素又はその誘導体(例えば、ジメチル尿素、ジエチル尿素、N−アセチルフェニル尿素、イソプロピルピリデン尿素、フェニル尿素又はそれらの組み合わせ)からなる群から選択される。
本発明の更に別の実施例において、炭酸アミドは尿素である。
本発明の更に別の実施例において、生産される組換えタンパク質生成物は、G−CSFである。
本発明の更に別の実施例において、生産される組換え生産物は、ストレプトキナーゼである。
本発明の更に別の実施例において、タンパク質生成物はリパーゼである。
本発明の他の実施例において、生産される二次代謝物は、プラバスタチンである。
本発明はプラバスタチンのコンパクチンへの生物学的変換の方法に関する。前記転換は、炭酸アミドの有効濃度があることに特徴づけられる培地で実現される。
本発明の他の実施例において、炭酸アミドは、尿素又はその誘導体(例えば、ジメチル尿素、ジエチル尿素、N−アセチルフェニル尿素、イソプロピルピリデン尿素、フェニル尿素又はそれらの組み合わせ)からなる群から選択される。
本発明の更に別の実施例において、コンパクチンのプラバスタチンへの生物学的変換は、少なくとも35%である。
本発明の他の実施例において、得られた組換えタンパク質生成物は、インシュリン前駆体、インシュリン、その類似体又はその誘導体、インスリングラルギン、エキセンディン、カルボキシペプチダーゼ、及びリパーゼからなる群から選択される。
従って、成長プロフィールに影響を及ぼさずにタンパク質やペプチドの発現率を上昇させて、発酵時間が短縮したのは、リン酸塩と共に新たに観測された尿素の代謝物である。
D−ビオチン 0.2 g/L
ビオチンは、上水に溶かされ、殺菌している等級濾過装置で濾過することにより殺菌された。
さらに、供給された酵母抽出物と大豆ペプトン(YEP)は、発酵の間も加えられた。以下の表のように準備する。
微量塩類溶液の12ml、D−ビオチン溶液の12mL、及び尿素の40gが、供給前にメタノールのリットル当たりに対して加えられた。
発酵プロセスは、バッチ細胞増殖段階、オプションのグリセロール・フェッドバッチ段階、及びメタノール誘導段階を含む。
生産物の発酵体パラメータは、まず、以下の通りにセットされ、制御される。
温度 : 30o ± 2oC
pH : 5±0.2
DO : >10%
実行時間 : 22-24hr
メタノール供給は、バッチ段階の終了後、直ちに開始した。メタノールは、市販の殺菌している勾配フィルタを用いる濾過によって、殺菌された(オンライン)。
温度 :18 to 30oC (クローンと同様に生成物によって変わる)
pH : 3.0 to 7.0
DO : >1% (液体培地のメタノール濃度を制御するために用いた)
実行時間 : 5 - 8 days (クローンによって変わる)
分析 pH : 1 - 9.5 (タンパク質の型に依存)
発酵基材礎塩培地:
1リットルに対して以下の成分を混ぜる:
リン酸 : 85% (26.7 ml)
硫酸カルシウム : 0.93 g
硫酸カリウム :18.2 g
硫酸マグネシウム-7H2O :14.9 g
水酸化カリウム : 4.13 g
グリセロール : 40.0 g
1リットルに対する水
発酵槽に水を加えて、適当な容積とし、殺菌する。
以下の成分を混ぜる:
硫酸第二銅5H2O 6.0 g
ヨウ化ナトリウム 0.08 g
硫酸マンガン-H2O 3.0 g
モリブデン酸塩ナトリウム-2H2O 0.2 g
ホウ酸 0.02 g
塩化コバルト 0.5 g
塩化亜鉛 20.0 g
硫酸鉄(II)-7H2O 65.0 g
ビオチン 0.2 g
塩酸 5.0 ml
1リットルの最終量に対する水
濾過し、殺菌し、常温で保存する。
本発明の更に別の態様によれば、バッチ段階のバイオマス生成は、グリセロールが初期培地に存在するまでである。更に、バイオマス成育は、決定的ではなく、わずかなケースにおいてなされる。
本発明の別の態様では、生産生物として好適な酵母は、例えばピキア・パストリス、ピキア属種、サッカロミセス属種、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイヴェロマイシス種、又はハンセヌラ・ポリモルファを含む。
開示発明の趣旨内における様々な変更や変形例は、以下の説明や現在開示されている他のものを参照することによって当業者にとって直ちに明らかになるであろう。
実施例1
2つの発酵槽バッチが、IN105前駆体の発現のために、ピギア・パトリスを用いて実施された。1つのバッチ(実験#1)において、対照培地力価の半分は、グリセロールを除く初期培地とする。バッチ操作後、メタノールが約8g/L/hで供給される。発酵は、8日間行った。最大生成物濃度は、7日以内に3.0g/Lに達し安定した。別のバッチ(実験#2)においては、同じ培地組成物が用いられ、さらに0.1M尿素を発酵槽に加える。バッチ操作後、4%w/v尿素と共にメタノールが供給される。発酵は8日間行った。最大生成物濃度は、7日で3.5に達した。細胞増殖プロフィールに有意差はなかった。上記実験から得られるバイオマスと生成物濃度のプロフィールを、それぞれ図1及び図2に示す。
生産物の発現率を確認するため、尿素添加系のインシュリン前駆体の発現が、ピギア・パトリス発酵を使用して検討された。この試験において、対照培地組成物が用いられ、4%の尿素を有するメタノールが、20g/L/hのより高い率で供給された。尿素が発酵槽に加えられない時の最大生成物濃度が、182時間で4.26g/Lに比較して、この試験では、137での4.21g/Lを達成した。細胞増殖プロフィールの違いは観察されなかった。発酵槽への尿素添加により、発育プロフィールに影響を与えることなしに、生成物率が増加し、かつ発酵時間が減少した。上記実験から得られるバイオマス及び生成物濃度のプロフィールを、それぞれ図3及び図4に示す。
2つの発酵槽バッチが、インスリングラルギン前駆体の発現のために、ピギア・パトリスを用いて実施された。1つのバッチ(実験#1)において、対照培地力価の半分は、グリセロールを除く初期の培地とする。バッチ操作後、メタノールが8g/L/hの供給率で供給される。発酵は、10日間行った。最大生成物濃度は、10日以内に1.03g/Lに達し安定した。別のバッチ(実験#2)においては、同じ培地組成物が用いられ、さらに0.1M尿素を初期の発酵培地に加える。バッチ操作後、4%尿素のメタノールが供給される。発酵は9日間行った。最大生成物濃度は、9日で1.75に達した。細胞増殖プロフィールに有意差はなかった。上記実験から得られるバイオマスと生成物濃度のプロフィールを、それぞれ図5及び図6に示す。
2つの発酵槽バッチが、エキセンディン前駆体の発現のために、ピキア・パストリスを用いて実施された。1つのバッチ(実験#1)において、対照培地力価の半分は、グリセロール・フェッドバッチで、グリセロールを除く初期培地が使われる。グリセロール・フェッドバッチ操作後、メタノールは、供給率11g/L/hで供給される。発酵は6日間行った。最大生成物濃度は、6日で0.74g/Lに達し安定した。別のバッチ(実験#2)において、同じ培地組成物が用いられ、さらに、0.1M尿素が発酵槽に加えられる。バッチ操作後、4%尿素のメタノールが供給される。発酵は、5日間行った。最大生成物濃度は、5日間で0.78に達した。細胞増殖プロフィールにおいて、観察される有意差はなかった。上記実験から得られるバイオマスと生成物濃度のプロフィールを、それぞれ図7及び図8に示す。
2つの発酵槽バッチが、酵素であるリパーゼの発現のために、ピギア・パトリスを用いて実施された。1つのバッチ(実験#1)において、対照培地力価の半分は、グリセロールを除く初期の培地とする。バッチ操作後、メタノールが供給率、約6g/L/hで供給される。発酵は、8日間行った。最大生産物は、7日間で約1650×106リパーゼユニットに達し安定した。別のバッチ(実験#2)において、同じ培地組成物が用いられ、さらに、0.1M尿素が発酵槽に加えられる。バッチ操作後、メタノール4%w/vと共に、尿素が供給される。発酵は8日間行った。最大生産物量は、7日で約2500×106リパーゼユニットに達し安定した。細胞増殖プロフィールに有意差はなかった。上記実験から得られる総生産物プロフィールを、図9に示す。
メタノール・フェッドバッチの間、1、2、3及び5%の尿素含有メタノールによって、IN105前駆体の生産のために必要とされるメタノール・バッチの尿素濃度効果が検討された。残留パラメータは、実施例1と同様に維持された。最大生成物濃度は、最大生成物濃度は、バッチ中、7日間で、メタノール中における尿素0、1、2、3、4、及び5それぞれにおいて、3.0、3.2、2.5、3.3、3.5、及び2.8g/l0に達した。より良い生産性は、メタノール誘導段階の間、メタノール中で、4%尿素が用いられた時に観察された。バイオマスと生成物濃度のプロフィールを、それぞれ図10及び図11に示す。
メタノール供給率の20g/L/hの他の試験において、最大インシュリン前駆体濃度を可能にする、最も有効な尿素濃度を確認するために、尿素の濃度を変化させた。最大生成物濃度は、0、1、2、3、4、及び5%の尿素濃度メタノールが供給されるバッチ中、それぞれ182、166、140、164、137、及び170時間で、4.26、4.03、3.39、4.16、4.21、及び5.31g/Lに達した。バイオマスと生成物濃度のプロフィールを、それぞれ図12及び図13に示す。その試験は、尿素の追加がインシュリン前駆体生産率を上昇させることを示し、5%の尿素濃度のメタノールが供給されるときに、発現率が最も高かった。
メタノール誘導段階において、残留尿素濃度を、細胞フリーの上清中で、0.1、0.3、0.5、0.7、1.2、及び1.5Mの異なるレベルで維持する試験バッチを検討し、生産性の効果を検討した。全てのバッチは、実施例1のように同様のパラメータと培地組成物とした。残留尿素は、別に尿素ストックを供給することによって維持された。結果は、バッチの全体にわたって発酵の間、尿素が、細胞フリーな上澄み中で1Mの範囲が維持されるときに、最大の生産物が達成できることを示す。残留尿素が約0.5Mのときに、最大生成物濃度4.46g/Lが達成される。この実験において、供給される全尿素は、残留尿素がそれぞれ0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2、及び1.5Mに維持された試験における最終液体培地容積に対して0、0.2、0.5、0.9、1.2、1.8、2.3及び2.9Mであった。この結果を図14に示す。
インシュリン前駆体発酵の試験も行った。この試験において、メタノールは、20g/L/hの割合で供給された。インシュリン前駆体発酵において、0.7Mの残留濃度が維持されるときに、生成物濃度が最も高いことが観察された。この試験において、残留尿素がそれぞれ0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2、及び1.5Mに維持された試験において、全尿素は、最終的な液体培地量の0.0、1.6、2.7、3.5、7.0、8.8、11.7、及び13.3Mに等しく供給された。結果は、図15に示すように、培養物が有意な量の尿素を消費することを示す。
IN105の別のバッチは、標準対照培地と、それに4%の尿素を有するメタノールを〜20g/L/h供給したもので実施した。尿素が発酵槽に供給されなかった場合の183時間、3.76g/Lの収率に比較して、この試験においては、3.71g/Lの生成物濃度が、113時間において達成した。研究の結果は、図16及び図17に示す。
更なる実験において、尿素は、発酵生産性に対するそれらの効果を観察するために、さまざまな他の合成物と置き換えられた。別々のバッチにおいて、チオ尿素、ジイミド、カルボジイミド、チオカルバミドは、1%の濃度で試験された。これらの全部が、図18に示すように、対照に対して生産性を改善することがわかった。
実験において、発酵中の尿素供給が、酵母によるリン酸の取り込みが増加し、尿素を供給しないバッチより早く培地におけるリン酸の消費が生じることが観察された。したがって、より速いリン酸消費とより高い生産性(g/L/h)は、ペプチド及びタンパク質の生産のための標準、あるいは改質したピキア属発酵手順の中で、尿素の取り込みに起因して達成される代謝シフトの結果である。
成育培地は、水1000mlに、大豆粉5.0g、ブドウ糖一水和物20.0g、大豆ペプトン5.0g、CaCO31.0g、K2HPO40.1gを含有して、準備された。種培地のpHは、NaOH溶液を用いて6.8±0.1に調製した。殺菌された接種原培地は、培養(ストレプトマイセス属種(BICC 6826))の胞子バイアル懸濁液を植え付けて、好気性条件で、48時間28±1℃で培養された。成育種は、水1000ml(phは7.0±0.1に合致した)に、大豆粉37.5g、ブドウ糖一水和物22.5g、綿種粉3.75g、穀物浸出液7.5g、NaCl7.5g、及び消泡剤SAG0.5gを含有する発酵培地へ転移される。48時間の培養後、殺菌されたコンパクチン溶液が、少量のブドウ糖と共に加えられた。24時間毎に、いくつかの同様のフラスコの1つが、コンパクチンのプラバスタチンへの生物学的変換について調べるために集められる。コンパクチンが合計3.0g/Lが供給されるまで、上記手順が24時間毎に繰り返された。
生成物発現率を確認するために、大腸菌発酵を用いて、尿素有りの顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)の発現が検討された。試験に用いられる培地は、プレ・シード培地、シード培地、及び生産培地から成る。プレ・シード培地は、水1000mlに対して、大豆ペプトン10.0g、NaCl10.0g、イースト抽出物10.0gを含む。シード培地は、水1000mlに対して、1.2gの硫酸アンモニウム、2.4gの硫酸マグネシウム、10gのイースト抽出物、11gのDMH、5gのK2HPO4、40mlの微量塩類を含む。生産培地は、水1000mlに対して、ブドウ糖一水和物11g、硫酸アンモニウム2.4g、硫酸マグネシウム4.8g、イースト抽出物20g、K2HPO410g、微量塩類40mlを含む。phは、アンモニアで7.0に調整される。バッチ段階完了後、バイオマスは、発酵体であるブドウ糖とイースト抽出物の連続供給によって上昇させる。"ceel mass"は、誘導され、生成物の生産のために、さらに8時間実施される。
同様の実験は、ストレプトキナーゼの生産のために発現系として大腸菌を用いて実施された。用いられる培地は実施例13に記載したものと同じである、そして、濃度がテストした尿素濃度も同じである。実施例14において説明されるように、同様の3つのバッチは尿素の0g/L、1g/Lおよび2g/Lによって行われた。尿素なしの対照バッチ(実験#1)は、0.026g/wcwの具体的な生産性を有する誘導の8時間後、7.06g/Lの最終的な生産性を与えた。最大力価は、10.5g/Lの生産性と0.041g/wcwの具体的な生産性を有する1g/L尿素バッチ(実験#2)において達成された。驚くべきことに、2g/Lの尿素(実験#3)を有するバッチは、0.022g/wcwの具体的な生産性と、わずか6.56g/Lの生成物を与えた。この生成物において、1g/L以上の尿素濃度の増加は、具体的な生産性と力価の急激な低下をもたらした。
リパーゼ酵素を生産することが知られているリゾムコール属種(BICC 362)においても、培地において、尿素添加で生産性が改善することを示した。この培養物から生じるリパーゼは、エステル化および加水分解のような生物学的変換反応のために広範囲に用いられる。2つの発酵バッチ(10Lの容積)は、尿素添加なしのものと、尿素を0.5g/L添加したもので行った。より高い尿素濃度(1g/l)を有する試験も、行ったところ、pHを維持するために苛性アルカリの消費が大変高く、生産性がより低いという結果となった。リゾムコール属種(BICC 362)のための成育培地は、マイーダ(Maida)41.4g、サッカロース10g、ペプトン3.06g、硫酸アンモニウム2g、イースト抽出物2g、リン酸カリウム、0.85gと、塩化カルシウム、硫酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを其々1g含む。培地全体は、多くとも水1Lとされる。育てられたシード(10%のv/v)は、水1000ml中、ブドウ糖12.5g、大豆ペプトン37.5g、大豆粉25、リン酸カリウム2.5、硫酸マグネシウム0.625、大豆油12.5gを含んでいる生産培地へ移転される。培地のpHは、6.0に調整され、苛性アルカリ添加でバッチにわたって、6.0に維持された。
Claims (43)
- 炭酸アミドの有効濃度が存在することに特徴づけられる、メタノール誘導性菌類種を用いる発酵によって、組換えタンパク質、その誘導体又はその類似体の生産のための発酵培地。
- 前記炭酸アミドは、尿素又は、ジメチル尿素、ジエチル尿素、N−アセチルフェニル尿素、イソプロピルピリデン尿素(isopropylpylideneurea)、フェニル尿素又はそれらの組み合わせのような誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の発酵培地。
- 前記炭酸アミドは、尿素であることを特徴とする請求項1に記載の発酵培地。
- 前記炭酸アミドは、液状、散布液、粉末又はペレット形で加えられることを特徴とする請求項1に記載の発酵培地。
- 炭酸アミドの残留濃度は、多くとも1Mまでであることを特徴とする請求項1に記載の発酵培地。
- 前記炭酸アミドの残留濃度は、1Mまでに保ち、かつ基礎塩類や微量元素の濃度は、対照培地の0.1Xから5Xまで可変されることを特徴とする請求項1に記載の発酵培地。
- リン酸塩の取り込みは、改善されることを特徴とする請求項1に記載の発酵培地。
- 組換えインシュリン生成物を発現するメタノール誘導性菌類種は、ピギア・パトリス(Pichia pastoris)、ピキア属(Pichia)種、サッカロミセス属(Saccharomyces)種、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)種、又はハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)からなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の発酵培地。
- 炭酸アミドの有効濃度が存在することに特徴づけられる、微生物を用いる発酵による組換えタンパク質、その誘導体又はその類似体の生産のための発酵培地。
- 炭酸アミドの有効濃度が存在することに特徴づけられる、微生物を用いる発酵による二次代謝物の生産のための発酵培地。
- 前記炭酸アミドは、尿素又はジメチル尿素、ジエチル尿素、N−アセチルフェニル尿素、イソプロピルピリデン尿素、フェニル尿素又はそれらの組み合わせのような誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項9又は10に記載の発酵培地。
- 前記炭酸アミドは、尿素であることを特徴とする請求項9又は10に記載の発酵培地。
- 前記炭酸アミドは、液状、散布液、粉末又はペレット形で加えられることを特徴とする請求項9又は10に記載の発酵培地。
- 炭酸アミドの残留濃度は、多くとも10g/Lまでであることを特徴とする請求項9又は10に記載の発酵培地。
- 前記微生物は、大腸菌(E.coli)、ストレプトマイセス(Streptomyses)種、アスペルギルス属(Aspergillus)種、リゾプス属(Rhizopus)種、ペニシリウム属(Penillium)種、及びリゾムコール属(Rhizomucor)種からなる群から選択されることを特徴とする請求項9又は10に記載の発酵培地。
- 炭酸アミドに有効濃度が存在することに特徴づけられる発酵培地において、メタノール誘導性インシュリン発現菌類種を増殖することを含む、組換えタンパク質、その誘導体、その類似体の生産方法。
- 前記炭酸アミドは、尿素又はジメチル尿素、ジエチル尿素、N−アセチルフェニル尿素、イソプロピルピリデン尿素、フェニル尿素又はそれらの組み合わせのような誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項16に記載の生産方法。
- 炭酸アミドは、尿素であることを特徴とする請求項16に記載の生産方法。
- 生産される前記組換えインシュリン生成物は、IN−105であることを特徴とする請求項16に記載の生産方法。
- 生産される前記組換えインシュリン生成物は、インシュリン前駆体、インシュリン又はその類似体又は誘導体であることを特徴とする請求項17に記載の生産方法。
- 前記組換えインシュリン生成物は、インスリングラルギンであることを特徴とする請求項20に記載の生産方法。
- 生産される前記組換えタンパク質は、環状、若しくは非環状ペプチドであることを特徴とする請求項16に記載の生産方法。
- 前記組換えペプチドは、エキセンディンであることを特徴とする請求項22に記載の生産方法。
- 生産される前記組換えタンパク質は、酵素であることを特徴とする請求項16に記載の生産方法。
- 生産される前記組換え酵素生成物は、リパーゼであることを特徴とする請求項24に記載の生産方法。
- 生産される前記組換えタンパク質は、インシュリン前駆体、インシュリン又はその類似体又はその誘導体、グラルギン、エキセンディン、カルボキシペプチダーゼ及びリパーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項16に記載の生産方法。
- 組換えインシュリン生成物を示すメタノール誘導性菌類種は、ピキア・パストリス、ピキア属種.サッカロミセス属種、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイヴェロマイシス種.又はハンゼヌラ・ポリモルファからなる群から選択されることを特徴とする請求項16に記載の生産方法。
- 前記メタノール誘導性菌類種は、ピキア・パストリスであることを特徴とする請求項27に記載の生産方法。
- メタノール供給率は、1時間あたり液体培地で、多くとも20g/Lとすることを特徴とする請求項16に記載の生産方法。
- 得られる最大生成物力価は、0.1g/Lを超えることを特徴とする請求項16に記載の生産方法。
- 炭酸アミドの有効濃度が存在することに特徴づけられる発酵培地において、誘導性、非誘導性タンパク質発現微生物が増殖することを含む、組換え、若しくは非組換えタンパク質生成物、それらの誘導体、若しくは類似体の生産方法。
- 炭酸アミドは、尿素又はジメチル尿素、ジエチル尿素、N−アセチルフェニル尿素、イソプロピルピリデン尿素、フェニル尿素又はそれらの組み合わせのような誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項31に記載の生産方法。
- 前記炭酸アミドは、尿素であることを特徴とする請求項31に記載の生産方法。
- 生産される前記組換えタンパク質生成物は、G−CSFであることを特徴とする請求項31に記載の生産方法。
- 生産される前記組換え生成物は、ストレプトキナーゼであることを特徴とする請求項31に記載の生産方法。
- 前記タンパク質生成物は、リパーゼであることを特徴とする請求項31に記載の生産方法。
- 炭酸アミドに有効濃度が存在することに特徴づけられる発酵培地において、微生物を増殖することを含む二次代謝物の生産方法。
- 生産される前記二次代謝物は、プラバスタチンであることを特徴とする請求項37に記載の生産方法。
- プラバスタチンのコンパクチンへの生物学的変換方法であって、
前記変換は、炭酸アミドに有効濃度が存在することに特徴づけられる培地において達成される生物学的変換方法。 - 前記炭酸アミドは、尿素又はジメチル尿素、ジエチル尿素、N−アセチルフェニル尿素、イソプロピルピリデン尿素、フェニル尿素又はそれらの組み合わせのような誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項39に記載の生物学的変換方法。
- コンパクチンのプラバスタチンへの生物学的変換は、少なくとも35%であることを特徴とする請求項40に記載の生物学的変換方法。
- 上記請求項のいずれかの請求項から得られる組換えタンパク質生成物。
- インシュリン前駆体、インシュリン又はその類似体又は誘導体、グラルギン、エキセンディン、カルボキシペプチダーゼおよびリパーゼからなる群から選らばれる上記請求項のいずれかに記載の組換えタンパク質生成物。
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