JP2011232164A - Liver disease marker, method and device for measuring the same, and method for verifying medicine - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、肝臓疾患マーカー、その測定方法、装置及び医薬品の検定方法に係り、特に、各種肝臓疾患の患者を健常者と識別してスクリーニング可能な肝臓疾患マーカー、その測定方法、装置及び該肝臓疾患マーカーを用いた医薬品の検定方法に関する。 The present invention relates to a liver disease marker, a measurement method, an apparatus thereof, and a pharmaceutical assay method, and in particular, a liver disease marker capable of distinguishing and screening a patient with various liver diseases from a healthy person, a measurement method, an apparatus thereof, and the liver The present invention relates to a method for testing pharmaceuticals using a disease marker.
肝臓疾患は、薬剤性肝炎、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型などのウイルス性肝炎、肝硬変、肝臓がん、非アルコール性脂肪肝疾患など多様であり、また無症状ウイルスのキャリヤも存在する。特にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染者の７割は、慢性的な肝臓の炎症のため、除々に正常な肝細胞が失われ、肝臓が線維化して、肝硬変に進行し、さらには肝臓がんまで発展する。Ｃ型慢性肝炎患者の１０−１５％、肝硬変患者の８０％に肝臓がんが発生することが報告されている。Ｃ型肝炎は、症状も無く肝硬変、肝臓がんと進行し、肝臓の機能が極度に低下して倦怠感や黄疸、意識障害など様々な障害がおこるが、この段階では現在有効な治療法はない。したがって、肝臓の機能が悪化する前に、なるべく早く症状の進行を診断し、インターフェロン投与などの治療などを施すことが必要である。日本では、Ｃ型肝炎キャリヤは２００万人であり、その後、自覚症状が無いまま疾患が進行し、最終的に４０万人が肝疾患で死亡すると推定されている。肝硬変になる前にＣ型肝炎キャリヤであることが判明すれば、そのうちの７０％（２８万人）がインターフェロン等の投与によって治癒すると言われている。しかしながら、肝臓病の診断は、数多くの検査を受けなければならず、時間やコストもかかる。また受診できる機関が限られるため、未受診者が多い。現在、各種の肝障害を正確かつ迅速に特定する診断法は未だ確立されていない。 Liver diseases are various such as drug-induced hepatitis, viral hepatitis such as A, B, and C, cirrhosis, liver cancer, nonalcoholic fatty liver disease, and carriers of asymptomatic viruses. In particular, 70% of people infected with hepatitis C virus (HCV) gradually lose normal liver cells due to chronic liver inflammation, and the liver becomes fibrotic and progresses to cirrhosis. To develop. Liver cancer has been reported in 10-15% of chronic hepatitis C patients and 80% of cirrhosis patients. Hepatitis C progresses to liver cirrhosis and liver cancer with no symptoms, and liver function is extremely reduced, causing various disorders such as malaise, jaundice, and disturbance of consciousness. Absent. Therefore, before the liver function deteriorates, it is necessary to diagnose the progression of symptoms as soon as possible and to perform treatment such as interferon administration. In Japan, there are 2 million hepatitis C carriers, and after that, it is estimated that the disease progresses without subjective symptoms and eventually 400,000 people die from liver disease. It is said that 70% (280,000) of those who are found to be hepatitis C carriers before cirrhosis is cured by administration of interferon or the like. However, diagnosis of liver disease requires many examinations, and takes time and cost. In addition, there are many unexamined people because the institutions that can receive medical examinations are limited. At present, a diagnostic method for accurately and rapidly identifying various liver disorders has not been established yet.
また最近問題となっている非アルコール性脂肪肝疾患では、肝硬変、肝がんへと進行する非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）と、良好な経過をたどる単純脂肪肝（ＳＳ）が存在することが知られている（非特許文献１）。欧米の成人の２０％が非アルコール性脂肪肝、４％がＮＡＳＨと見積もられている。ＮＡＳＨは、早期に発見し食事療法などを行い、肝硬変や肝がんになる前に疾患の進行を止める必要があるが、ＳＳとＮＡＳＨの区別は、有効なバイオマーカーが存在せず、肝生検によって診断せざるを得なかった（非特許文献２）。 In non-alcoholic fatty liver disease, which has recently become a problem, there may be non-alcoholic steatohepatitis (NASH) that progresses to cirrhosis and liver cancer, and simple fatty liver (SS) that has a good course. It is known (Non-Patent Document 1). It is estimated that 20% of Western adults are non-alcoholic fatty liver and 4% are NASH. NASH needs to be detected early, dieted, etc., and the progression of the disease must be stopped before becoming cirrhosis or liver cancer. However, there is no effective biomarker to distinguish SS from NASH, Diagnosis by inspection was unavoidable (Non-Patent Document 2).
一般に肝臓疾患が疑われると、問診、視診、触診とともに血中のＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−ＧＴＰ、アルカリフォスファターゼ（ＡＬ−Ｐ）、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、ビリルビンなどの肝機能マーカーを測定する。これらの生化学検査値に異常があった場合は、Ｂ型やＣ型肝炎ウイルス検査、超音波検査、Ｘ線、ＣＴなどの画像診断が行われる。がんの診断には、血中のＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−II、ＣＥＡなどのタンパク質の腫瘍マーカーを測定する。さらには、肝硬変、肝臓がん、非アルコール性脂肪肝炎など正確な診断が必要な場合は、腹腔鏡検査や肝生検を行う（非特許文献３）。 In general, when a liver disease is suspected, blood function markers such as AST, ALT, γ-GTP, alkaline phosphatase (AL-P), cholinesterase (ChE), and bilirubin in blood are measured together with inquiry, visual inspection, and palpation. When these biochemical test values are abnormal, image diagnosis such as B-type or hepatitis C virus test, ultrasonic test, X-ray, CT, etc. is performed. For cancer diagnosis, protein tumor markers such as AFP, PIVKA-II, and CEA in blood are measured. Furthermore, when accurate diagnosis such as cirrhosis, liver cancer, non-alcoholic steatohepatitis is required, laparoscopic examination or liver biopsy is performed (Non-patent Document 3).
このように肝臓病を特定するには、多くの検査を受けなければならず、診断がつくまでに何日も費やす。また腹腔鏡検査や肝生検は、患者に肉体的な苦痛を与える。さらに肝生検は、患者を危険に曝す。また肝生検は、１−３週間の入院が必要であり、病態のチェックなどのために肝生検を頻繁に行うことはできない。また肝生検は、ごく微小の組織しか採取しないため、病変組織から採取できなかった場合は、正確な診断ができない。さらに従来の肝臓疾患の診断法では、多くの検査が必要でありコストも高い。さらに診断は専門医でなければ行うことはできず、不足している医療関係者に負担を強いる。したがって、患者に肉体的、精神的、金銭的な負担がかからず、迅速で、正確かつ簡便な肝臓疾患の特定方法が強く望まれている。 In order to identify liver disease in this way, many tests are required, and many days are spent before a diagnosis is made. Laparoscopy and liver biopsy also cause physical pain to the patient. In addition, liver biopsy puts patients at risk. Liver biopsy requires hospitalization for 1 to 3 weeks, and liver biopsy cannot be performed frequently to check the pathological condition. In addition, since liver biopsy only collects very small tissue, accurate diagnosis cannot be made if it cannot be collected from the diseased tissue. Furthermore, the conventional methods for diagnosing liver diseases require many tests and are expensive. Furthermore, diagnosis can only be made by a specialist, and it places a burden on the lack of medical personnel. Therefore, there is a strong demand for a rapid, accurate and simple method for identifying a liver disease that does not impose a physical, mental and financial burden on the patient.
他方、キャピラリ電気泳動（capillary electrophoresis, ＣＥ）−質量分析（mass spectrometry，ＭＳ）（ＣＥ−ＭＳ）法による細胞内の代謝物質の網羅的な測定方法は、非特許文献４に記載され、キャピラリ電気泳動−飛行時間型質量分析（time-of-flight mass spectrometry，ＴＯＦＭＳ）（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）の方法論およびこの方法を用いてグルタチオンの枯渇を示すオフタルミン酸バイオマーカーを発見した詳細は、非特許文献５に記載されている。 On the other hand, a comprehensive method for measuring intracellular metabolites by capillary electrophoresis (CE) -mass spectrometry (MS) (CE-MS) is described in Non-Patent Document 4, and capillary electrophoresis Non-patent document 5 describes the method of time-of-flight mass spectrometry (TOFMS) (CE-TOFMS) and the discovery of an ophthalmic acid biomarker that indicates glutathione depletion using this method. It is described in.
これまでに発明者らは、肝炎、肝硬変、肝がんなど多くの肝障害患者の血液測定によって、各肝炎患者の血清中で著しく増加する物質を発見し、それらがγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類（注：Ｘはアミノ酸を示す）であることを同定した。さらに血清中の肝機能マーカーであるＡＳＴとＡＬＴの値とγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類を用いて多重ロジスティック回帰モデルによる多変量解析を行うことにより、各種の肝炎患者を他と高精度に区別することに成功した（出願時未公開のＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６９９５０）。 So far, the inventors have discovered substances that remarkably increase in the serum of each hepatitis patient by blood measurement of many patients with hepatic disorders such as hepatitis, cirrhosis, liver cancer, etc., and these have been identified as γ-Glu-X peptides. (Note: X represents an amino acid). Furthermore, multivariate analysis using multiple logistic regression models using AST and ALT values and γ-Glu-X peptides, which are liver function markers in serum, is performed to accurately distinguish various hepatitis patients from others. (PCT / JP2009 / 069950, unpublished at the time of filing).
本発見により、血液中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度およびＡＳＴ、ＡＬＴの値を測定することによって、健常者、薬剤性肝障害、無症状Ｂ型肝炎キャリヤ、無症状Ｃ型肝炎キャリヤ、Ｂ型慢性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、肝臓がん患者を迅速に診断することが可能になった。 Through this discovery, by measuring the concentration of γ-Glu-X peptides in blood and the values of AST and ALT, healthy subjects, drug-induced liver damage, asymptomatic hepatitis B carrier, asymptomatic hepatitis C carrier, It has become possible to quickly diagnose patients with chronic hepatitis B, chronic hepatitis C, and liver cancer.
しかし、血液中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度は、１ｍＭ以下である場合がほとんどであり、高速液体クロマトグラフィ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の多重反応モニタリング（multiple reaction monitoring, ＭＲＭ）法などの高感度な測定法でないと検出できなかった。またＡＳＴとＡＬＴの値とγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類を用いて多重ロジスティック回帰分析を用いて選んだバイオマーカーによる各種の肝臓疾患の判別の精度を、受信者動作特性曲線（receiver operating curve, ＲＯＣ曲線）によって評価したところ、Ｂ型慢性肝炎のＲＯＣ曲線以下の面積（the area under the ROC, ＡＵＣ）は０．８５９、Ｃ型慢性肝炎のＡＵＣは０．８１１であり、他の疾患に比べて、診断精度が劣っていた。またγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類に加えて、血中のＡＳＴ、ＡＬＴも測定しなければならなかった。 However, in most cases, the concentration of γ-Glu-X peptides in the blood is 1 mM or less, and multiple reaction monitoring (MRM) of high performance liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS / MS). It could not be detected unless it was a highly sensitive measurement method such as In addition, the accuracy of discriminating various liver diseases by biomarkers selected using multiple logistic regression analysis using AST and ALT values and γ-Glu-X peptides is expressed as a receiver operating curve (ROC). The area under the ROC (AUC) is 0.859, and the AUC of chronic hepatitis C is 0.811, compared to other diseases. The diagnostic accuracy was poor. In addition to γ-Glu-X peptides, AST and ALT in the blood had to be measured.
そこで、本発明者らは、各種の肝臓疾患および健常者の血液をＣＥ−ＴＯＦＭＳ(非特許文献６)で網羅的に測定し、血液中に高濃度に存在している代謝物を用いて、多重ロジスティック回帰分析を行い、各種の肝臓疾患を区別するバイオマーカーを発見した。 Therefore, the present inventors comprehensively measured the blood of various liver diseases and healthy individuals with CE-TOFMS (Non-Patent Document 6), and using metabolites present in high concentration in the blood, Multiple logistic regression analysis was performed to find biomarkers that distinguish between various liver diseases.
即ち、本発明は、血液中の代謝物である低分子化合物のいずれかのみ、又は、同じく低分子化合物のみの組合せであることを特徴とする肝臓疾患マーカーを提供するものである。 That is, the present invention provides a liver disease marker characterized in that it is only one of low-molecular compounds that are metabolites in blood or a combination of low-molecular compounds.
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、メチオニンスルホキシド（Methionine sulfoxide）、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、サルコシン（Sarcosine）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、Ｎ−アセチルオルニチン（N-Acetylornithine）、インドール−３−アセトアミド（Indole-3-acetamide）、グルコサミン（Glucosamine）、Ｐｈｅ、ホモアルギニン（Homoarginine）、Ｐｒｏ、クレアチン（Creatine）、Ｖａｌ、クレアチニン（Creatinine）、Ｇｌｕ、ヒポキサンチン（Hypoxanthine）、５−オキソプロリン（5-Oxoproline）、Ｌｙｓ、タウリン（Taurine）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、キヌレニン（Kynurenine）、Ｎ−γ−エチルグルタミン（N-γ-Ethylglutamine）、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｎのいずれか、又は、クレアチン、Ｇｌｕ、メチオニンスルホキシド、Ｐｈｅ、ホモアルギニン、５−メトキシ−３−インドールアセテート（5-Methoxy-3-indoleaceate）の組合せであることを特徴とする健常者識別用の肝臓疾患マーカーを提供するものである。 In addition, the liver disease markers are methionine sulfoxide, Asn, Tyr, sarcosine, N, N-dimethylglycine, N-acetylornithine (N-Acetylornithine). , Indole-3-acetamide, Glucosamine, Phe, homoarginine, Pro, creatine, Val, creatinine, Glu, hypoxanthine, 5 -Oxoproline (5-Oxoproline), Lys, Taurine (Haudroxyproline), Kynurenine, N-γ-ethylglutamine (N-γ-Ethylglutamine), Ile + Leu, Gly-Gly, Gln Or creatine, Glu, methionine sulfoxide, Phe There is provided a homoarginine, 5-methoxy-3- liver disease marker for a healthy person identification which is a combination of indole acetate (5-Methoxy-3-indoleaceate).
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、グリセロホスホリルコリン（Glycerophsphorylcholine）、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、キヌレニン、Ｇｌｕ、グルコサミン、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、メチオニンスルホキシド、Ｎ−γ−エチルグルタミン、オルニチン（Ornithine）、Ａｓｎ、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、インドール−３−アセトアミド、ピペコレート（Pipecolate）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、ホモアルギニン、Ｓｅｒ、γ−ブチロベタイン（γ-Butyrobetaine）のいずれか、又は、トリメチルアミンＮ−オキシド（Trimethylamine N-oxide）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、クレアチニン、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、オルニチン、グリセロホスホリルコリンの組合せであることを特徴とする単純脂肪肝（ＳＳ）識別用の肝臓疾患マーカーを提供するものである。 In addition, the liver disease marker may be glycerophosphorylcholine, Gln, Gly-Gly, kynurenine, Glu, glucosamine, Met, His, methionine sulfoxide, N-γ-ethylglutamine, ornithine, Asn, Ile + Leu, indole-3-acetamide, pipecolate, N, N-dimethylglycine, Tyr, Trp, Gly, homoarginine, Ser, γ-butyrobetaine (γ-Butyrobetaine), or trimethylamine N-oxide ( The present invention provides a liver disease marker for identifying simple fatty liver (SS), which is a combination of Trimethylamine N-oxide), N, N-dimethylglycine, creatinine, Ile + Leu, ornithine, and glycerophosphorylcholine.
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、ピペコレート、オルニチン、グリセロホスホリルコリン、ホモアルギニン、インドール−３−アセトアミド、Ａｓｎ、γ−ブチロベタイン、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、グルコサミン、キヌレニン、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、グアニドアセテート（Guanidoacetate）、タウリン、Ｎ−アセチルオルニチン、カルニチン（Carnitine）、シトルリン（Citrulline）のいずれか、又は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、５−オキソプロリン、ピペコレート、カルニチン、ホモアルギニンの組合せであることを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）識別用の肝臓疾患マーカーを提供するものである。 The liver disease marker is His, Ser, Gly-Gly, Gly, pipecolate, ornithine, glycerophosphorylcholine, homoarginine, indole-3-acetamide, Asn, γ-butyrobetaine, Lys, Arg, Phe, glucosamine , Kynurenine, Thr, Met, guanidoacetate, taurine, N-acetylornithine, carnitine, citrulline, or Ala, Ser, 5-oxoproline, pipecolate, carnitine, homo The present invention provides a liver disease marker for identifying nonalcoholic steatohepatitis (NASH), which is a combination of arginine.
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、５−メトキシ−３−インドールアセテート、シトルリン、グリセロホスホリルコリン、α−アミノアジぺート（α-Aminoadipate）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、オルニチン、Ｎ−アセチルオルニチン、ベタイン（Betaine）、３−メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）、Ｎ−γ−エチルグルタミン、トリメチルアミンＮ−オキシド、メチオニンスルホキシド、１−メチルニコチンアミド（1-Methylnicotinamide）、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、カルニチン、γ−ブチロベタイン、グルコサミン、ホモアルギニン、キヌレニン、クレアニチン、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、５−オキソプロリンのいずれか、又は、α−アミノアジペート、Ｎ−アセチルオミシン（N-Acetylomithine）、５−メトキシ−３−インドールアセテートの組合せであることを特徴とする薬剤性肝障害（ＤＩ）識別用の肝臓疾患マーカーを提供するものである。 In addition, the liver disease marker may be 5-methoxy-3-indole acetate, citrulline, glycerophosphorylcholine, α-aminoadipate, N, N-dimethylglycine, ornithine, N-acetylornithine, Betaine, 3-methylhistidine, N-γ-ethylglutamine, trimethylamine N-oxide, methionine sulfoxide, 1-Methylnicotinamide, Met, Phe, Tyr, carnitine, γ -Butyrobetaine, glucosamine, homoarginine, kynurenine, creatinine, Thr, Asn, 5-oxoproline, or α-aminoadipate, N-acetylcetine, 5-methoxy-3-indole acetate This is a combination of There is provided a liver disease marker for drug-induced liver injury (DI) identification, characterized in.
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、Ｖａｌ、α−アミノアジペート、インドール−３−アセトアミド、γ−ブチロベタイン、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、グアニドアセテート、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、サルコシン、カルニチン、１−メチルニコチンアミド、３−メチルヒスチジン、Ｇｌｎ、クレアチニン、Ｌｙｓ、Ａｌａのいずれか、又は、クレアチニン、Ｖａｌ、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ａｒｇの組合せであることを特徴とする無症状Ｂ型肝炎キャリヤ（ＡＨＢ）識別用の肝臓疾患マーカーを提供するものである。 In addition, the liver disease marker is Val, α-aminoadipate, indole-3-acetamide, γ-butyrobetaine, His, Trp, guanidoacetate, Ile + Leu, Tyr, sarcosine, carnitine, 1-methylnicotinamide, Asymptomatic hepatitis B carrier (AHB) characterized by being any one of 3-methylhistidine, Gln, creatinine, Lys, Ala, or a combination of creatinine, Val, Ile + Leu, Asn, Gly-Gly, Phe, Arg ) It provides a liver disease marker for identification.
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、Ｔｙｒ、サルコシン、γ−ブチロベタイン、メトホルミン（Metformin）、Ｔｒｐ、１−メチルニコチンアミド、α−アミノアジテート、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、プソドペレチエリン（Pseudopelletierine）、メチオニンスルホキシド、Ｌｙｓ、アセチルコリン（Acetylcholine）、ピペリジン（Piperidine）、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、Ｖａｌ、クレアチニン、ベタイン、Ａｌａ、Ｔｈｒ、タウリン、Ｐｈｅ、グアニドアセテート、ピペコレート、Ｓｅｒ、ヒドロキシプロリン、Ｐｒｏ、キヌレニンのいずれか、又は、サルコシン、クレアチニン、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、アセチルコリン、３−メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）の組合せであることを特徴とする無症状Ｂ型慢性肝炎（ＣＨＢ）識別用の肝臓疾患マーカーを提供するものである。 In addition, the liver disease marker may be Tyr, sarcosine, γ-butyrobetaine, metformin, Trp, 1-methylnicotinamide, α-amino agitate, N, N-dimethylglycine, psodoperetellin ( Pseudopelletierine), methionine sulfoxide, Lys, Acetylcholine, piperidine, His, Ile + Leu, Val, creatinine, betaine, Ala, Thr, taurine, Phe, guanidoacetate, pipecolate, Ser, hydroxyproline, Pro, quinololein Or a liver disease marker for identifying asymptomatic chronic hepatitis B (CHB), characterized by being a combination of sarcosine, creatinine, Ile + Leu, acetylcholine, and 3-methylhistidine (3-Methylhistidine) It is intended to provide.
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、Ａｒｇ、タウリン、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、カルニチン、シトルリン、ベタイン、５−メトキシ−３−インドールアセテート、Ｈｉｓ、γ−ブチロベタイン、ヒポキサンチン、クレアチン、Ｔｙｒ、Ｖａｌのいずれか、又は、Ｇｌｙ、トリメチルアミンＮ−オキシド、タウリン、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、Ａｓｎ、オルニチン、Ｇｌｕ、プソイドペレチエリン、インドール−３−アセトアミド、Ｎ−γ−エチルグルタミン（N-γ-Ethylglutamine）、グルコサミン、Ｔｙｒの組合せであることを特徴とする無症状Ｃ型肝炎キャリヤ（ＡＨＣ）識別用の肝臓疾患マーカーを提供するものである。 The liver disease marker is Arg, taurine, Asp, Ser, Gly, carnitine, citrulline, betaine, 5-methoxy-3-indole acetate, His, γ-butyrobetaine, hypoxanthine, creatine, Tyr, Val. Or Gly, trimethylamine N-oxide, taurine, Ile + Leu, Asn, ornithine, Glu, pseudopeltierelin, indole-3-acetamide, N-γ-ethylglutamine (N-γ-Ethylglutamine), glucosamine And a liver disease marker for identifying asymptomatic hepatitis C carrier (AHC), which is a combination of Tyr.
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、メチオニンスルホキシド、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、グルコサミン、Ｇｌｎ、グリセロホスホリルコリン、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、ヒポキサンチン、グアニドアセテート、キヌレニン、ピペコレート、５−メトキシ−３−インドールアセテート、メトホルミンのいずれか、又は、トリメチルアミンＮ−オキシド、クレアチニン、Ｐｒｏ、グアニドアセテート、ベタイン、Ｔｈｒ、タウリン、メトホルミン、ヒドロキシプロリン、クレアチン、Ａｓｐ、ヒポキサンチン、１−メチルニコチンアミド、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、メチオニンスルホキシド、３−メチルヒスチジン、Ｎ−アセチルオルチニン、Ａｒｇ、シトルリン、Ｔｙｒ、５−メトキシ−３−インドールアセテート、グリセロホスホリルコリンの組合せであることを特徴とするＣ型慢性肝炎（ＣＨＣ）識別用の肝臓疾患マーカーを提供するものである。 In addition, the liver disease marker is methionine sulfoxide, Met, Glu, glucosamine, Gln, glycerophosphorylcholine, Asn, Phe, Lys, Pro, hypoxanthine, guanide acetate, kynurenine, pipecolate, 5-methoxy-3- Either indole acetate, metformin, or trimethylamine N-oxide, creatinine, Pro, guanidoacetate, betaine, Thr, taurine, metformin, hydroxyproline, creatine, Asp, hypoxanthine, 1-methylnicotinamide, Gln, Glu , Met, His, methionine sulfoxide, 3-methylhistidine, N-acetylortinin, Arg, citrulline, Tyr, 5-methoxy-3-indole acetate, glycerophos There is provided a chronic hepatitis C (CHC) liver disease marker for identification, which is a combination of Rirukorin.
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、シトルリン、オルニチン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｔｙｒ、タウリン、１−メチルニコチンアミド、Ｎ−γ−エチルグルタミン、Ｎ−アセチルオルニチン、ホモアルギニン、グアニドアセテートのいずれか、又は、Ｇｌｙ、トリメチルアミンＮ−オキシド、タウリン、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、Ａｓｎ、オルニチン、Ｇｌｕ、プソイドペレチエリン、インドール−３−アセトアミド、Ｎ−γ−エチルグルタミン、グルコサミン、Ｔｙｒの組合せであることを特徴とする肝硬変（ＣＩＲ）識別用の肝臓疾患マーカーを提供するものである。 The liver disease marker is citrulline, ornithine, N, N-dimethylglycine, Tyr, taurine, 1-methylnicotinamide, N-γ-ethylglutamine, N-acetylornithine, homoarginine, guanide acetate. Or a combination of Gly, trimethylamine N-oxide, taurine, Ile + Leu, Asn, ornithine, Glu, pseudopeltierelin, indole-3-acetamide, N-γ-ethylglutamine, glucosamine, Tyr A liver disease marker for identifying cirrhosis (CIR) is provided.
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、ジメチルグリシン、シトルリン、アセチルオルニチン、トリメチルアミンＮ−オキシド、ホモアルギニン、ベタイン、２ＡＢ、オルニチン、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、３−メチルヒスチジン、クレアチニン、５−オキソプロリンのいずれか、又は、トリメチルアミンＮ−オキシド（Trimethylamine N−Oxide）、Ｐｒｏ、ベタイン、タウリン、メトホルミン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、Ａｓｐ、ヒポキサンチン、１−メチルニコチンアミド、γ−ブチロベタイン（γ−Ｂutyrobetaine）、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、メチオニンスルホキシド、Ｐｈｅ、Ｎ−アセチルオルニチン、Ａｒｇ、シトルリン、ホモアルギニン、Ｔｒｐ、５−メトキシ−３−インドールアセテートの組合せであることを特徴とする肝臓がん（ＨＣＣ）識別用の肝臓疾患マーカーを提供するものである。 The liver disease marker is any one of dimethylglycine, citrulline, acetylornithine, trimethylamine N-oxide, homoarginine, betaine, 2AB, ornithine, Tyr, Lys, 3-methylhistidine, creatinine, and 5-oxoproline. Or Trimethylamine N-Oxide, Pro, betaine, taurine, metformin, hydroxyproline, ornithine, Asp, hypoxanthine, 1-methylnicotinamide, γ-butyrobetaine, Lys, Identification of liver cancer (HCC) characterized by a combination of His, methionine sulfoxide, Phe, N-acetylornithine, Arg, citrulline, homoarginine, Trp, 5-methoxy-3-indole acetate A liver disease marker is provided.
本発明は、又、前記の肝臓疾患マーカーを測定することを特徴とする肝臓疾患マーカーの測定方法を提供するものである。 The present invention also provides a method for measuring a liver disease marker, characterized by measuring the above-mentioned liver disease marker.
又、サンプルから分析に適した試料を作成する手段と、試料中の前記の肝臓疾患マーカーを測定するための分析手段と、を備えたことを特徴とする肝臓疾患マーカーの測定装置を提供するものである。 Also provided is an apparatus for measuring a liver disease marker comprising means for preparing a sample suitable for analysis from a sample and analysis means for measuring the liver disease marker in the sample. It is.
又、医薬品の投与前及び投与後に採取された哺乳動物の血液において、前記の肝臓疾患マーカーの濃度を測定する工程と、前記測定の結果を、前記医薬品の投与前の血液と投与後の血液とで比較する工程と、を含むことを特徴とする医薬品の検定方法を提供するものである。 Further, in the blood of a mammal collected before and after the administration of the pharmaceutical, the step of measuring the concentration of the liver disease marker, and the result of the measurement, the blood before the administration of the pharmaceutical and the blood after the administration And a step of comparing with each other.
又、哺乳動物において、医薬品を投与された一以上の個体からなる第１の群から採取された血液、及び、前記医薬品を投与されていない一以上の個体からなる第２の群から採取された血液について、前記の肝臓疾患マーカーの濃度を測定する工程と、第１の群と第２の群との間で、測定された前記肝臓疾患マーカーの濃度を比較する工程と、を含むことを特徴とする医薬品の検定方法を提供するものである。 Further, in mammals, blood collected from a first group consisting of one or more individuals administered with a pharmaceutical agent, and a second group consisting of one or more individuals not administered with the pharmaceutical agent Measuring the concentration of the liver disease marker with respect to blood, and comparing the measured concentration of the liver disease marker between the first group and the second group. It provides a method for testing pharmaceutical products.
本発明によれば、血液中の幾つかの代謝物質をのみを例えばＣＥ−ＴＯＦＭＳで測定することによって、健常者、単純脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、薬剤性肝障害、無症状Ｂ型肝炎キャリヤ、無症状Ｃ型肝炎キャリヤ、Ｂ型慢性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がん患者を高精度(ＡＵＣ：０．９３０−０．９９４)で診断することが可能になった。また本発明は、血中の逸脱酵素であるＡＳＴ、ＡＬＴの測定値は必要とせず、代謝物（低分子化合物）の測定だけで、各種の肝臓疾患を特定することが可能である。 According to the present invention, only some metabolites in blood are measured by, for example, CE-TOFMS, so that healthy individuals, simple fatty liver, nonalcoholic steatohepatitis, drug-induced liver injury, asymptomatic hepatitis B It has become possible to diagnose carriers, asymptomatic hepatitis C carriers, chronic hepatitis B, chronic hepatitis C, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma with high accuracy (AUC: 0.930-0.994). Moreover, the present invention does not require the measurement values of AST and ALT, which are the deviating enzymes in blood, and can identify various liver diseases only by measuring metabolites (low molecular compounds).
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
各種肝炎患者を区別する血液バイオマーカーを発見するため、健常者（control：Ｃ）３５名、単純脂肪肝（ＳＳ）９名、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）１１名、薬剤性肝障害(drug induced liver injury：ＤＩ)３１名、無症状Ｂ型肝炎キャリヤ（asymptomatic hepatitis B carrier：ＡＨＢ）８名、無症状Ｃ型肝炎キャリヤ（asymptomatic hepatitis C carrier：ＡＨＣ）８名、Ｂ型慢性肝炎（chronic hepatitis B carrier：ＣＨＢ）１０名、Ｃ型慢性肝炎（chronic hepatitis C carrier：ＣＨＣ）３３名、肝硬変（ＣＩＲ）１７名、肝臓がん（hepatocellular carcinoma：ＨＣＣ）３３名、合計１９５名の血清を測定して、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）法を用いて、血中の低分子化合物を測定し、５３種類の物質を同定、定量した。 In order to discover blood biomarkers that distinguish hepatitis patients, 35 healthy controls (control: C), 9 simple fatty liver (SS), 11 nonalcoholic steatohepatitis (NASH), drug-induced liver injury (drug) induced liver injury (DI) 31 people, asymptomatic hepatitis B carrier (AHB) 8 people, asymptomatic hepatitis C carrier (AHC) 8 people, chronic hepatitis B B carrier (CHB) 10 people, chronic hepatitis C carrier (CHC) 33 people, liver cirrhosis (CIR) 17 people, liver cancer (hepatocellular carcinoma: HCC) 33 people, total 195 sera was measured Then, using a capillary electrophoresis-time-of-flight mass spectrometry (CE-TOFMS) method, low molecular compounds in blood were measured, and 53 kinds of substances were identified and quantified.
１．血清から代謝物質の抽出
健常者および各種肝炎患者から採取した血清（４０μｌ）を標準物質入りのメタノール４００μｌに入れ、酵素を失活させ、代謝の亢進を止めた。１２０μｌの超純水、４００μｌのクロロホルムを加えた後、４℃で５分間、４６００ｇで遠心分離した。静置後、分離した水−メタノール相３００μｌを分画分子量５ｋＤａの遠心限外ろ過フィルターを通過し、除タンパクした。ろ液を凍結乾燥後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水２０μｌを加え、それをＣＥ−ＴＯＦＭＳ測定に供した。
1. Extraction of Metabolites from Serum Serum (40 μl) collected from healthy subjects and various hepatitis patients was placed in 400 μl of methanol containing standard substances to inactivate the enzyme and stop the metabolism. 120 μl of ultrapure water and 400 μl of chloroform were added, followed by centrifugation at 4600 g for 5 minutes at 4 ° C. After standing, 300 μl of the separated water-methanol phase was passed through a centrifugal ultrafiltration filter with a molecular weight cut off of 5 kDa to deproteinize. After freeze-drying the filtrate, 20 μl of Milli-Q water was added and subjected to CE-TOFMS measurement.
２．キャピラリー電気泳動−質量分析装置（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）による血清中の代謝物測定
ＣＥ−ＴＯＦＭＳを用いて、健常者および肝炎患者の血清中の低分子代謝産物を一斉に測定した。
2. Serum Metabolite Measurement Using Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometer (CE-TOFMS) CE-TOFMS was used to simultaneously measure low molecular weight metabolites in the serum of healthy subjects and hepatitis patients.
ＣＥ−ＴＯＦＭＳ分析条件（非特許文献６）
ａ．キャピラリー電気泳動（ＣＥ）の分析条件
キャピラリーには、フューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、外径３５０μｍ、全長１００ｃｍ）を用いた。緩衝液には、１Ｍギ酸（ｐＨ約１．８）を用いた。印加電圧は、＋３０ｋＶ、キャピラリー温度は２０℃で測定した。試料は、加圧法を用いて５０ｍｂａｒで３秒間（約３ｎｌ）注入した。
CE-TOFMS analysis conditions (Non-Patent Document 6)
a. Analysis conditions for capillary electrophoresis (CE) A fused silica capillary (inner diameter 50 μm, outer diameter 350 μm, total length 100 cm) was used as the capillary. As the buffer, 1M formic acid (pH about 1.8) was used. The applied voltage was +30 kV, and the capillary temperature was 20 ° C. Samples were injected for 3 seconds (about 3 nl) at 50 mbar using the pressure method.
ｂ．飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）の分析条件
正イオンモードを用い、イオン化電圧は４ｋＶ、フラグメンター電圧は７５Ｖ、スキマー電圧は５０Ｖ、ＯｃｔＲＦＶ電圧は１２５Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度３００℃、圧力１０ｐｓｉｇに設定した。シース液は５０％メタノール溶液を用い、質量較正用にレゼルピン（ｍ／ｚ ６０９．２８０７）を０．５μＭとなるよう混入し１０μｌ／ｍｉｎで送液した。レゼルピン（ｍ／ｚ ６０９．２８０７）とメタノールのアダクトイオン（ｍ／ｚ８３．０７０３）の質量数を用いて、得られた全てのデータを自動較正した。
b. Analysis conditions of time-of-flight mass spectrometer (TOFMS) The positive ion mode was used, the ionization voltage was set to 4 kV, the fragmentor voltage was set to 75 V, the skimmer voltage was set to 50 V, and the OctRFV voltage was set to 125 V. Nitrogen was used as the drying gas, and the temperature was set to 300 ° C. and the pressure was set to 10 psig. A 50% methanol solution was used as the sheath liquid, and reserpine (m / z 609.2807) was mixed at 0.5 μM for mass calibration, and the solution was fed at 10 μl / min. All the data obtained were automatically calibrated using the mass numbers of reserpine (m / z 609.2807) and the adduct ion of methanol (m / z 83.0703).
各種肝臓疾患患者および健常者の血清中の各代謝物の定量結果を表１に示す。 Table 1 shows the quantitative results of each metabolite in the serum of various liver disease patients and healthy subjects.
３．肝障害バイオマーカーの探索および評価
図１に健常者と各種肝臓疾患患者の血清中の代謝物質をＣＥ−ＴＯＦＭＳを用いて測定した結果を示す。図の上の方にクラスタリングされたグルコサミン（Glucosamine）、メチオニンスルホキシド（Methionine Sulfoxide）、インドール−３−アセトアミド（Indole 3 - acetamide）などは、健常者に比べ、肝臓疾患患者で顕著に増加する傾向があり、反対に、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎなどは肝臓疾患患者で減少した。また各疾患に対して各代謝物の変動は様々であった。
3. Search and Evaluation of Liver Disorder Biomarkers FIG. 1 shows the results of measuring the metabolites in the serum of healthy subjects and patients with various liver diseases using CE-TOFMS. Glucosamine, Methionine Sulfoxide, and Indole 3-acetamide, which are clustered in the upper part of the figure, tend to increase significantly in patients with liver disease compared to healthy individuals. On the contrary, Gly-Gly, Asn, Gln etc. decreased in patients with liver disease. Moreover, the variation of each metabolite varied with each disease.
各代謝物とも健常者の濃度の平均値で各疾患患者の濃度の平均値の比を算出後、ピアソン相関（Pearson Correlation）を用いて系統樹を作成した。 A phylogenetic tree was created using Pearson Correlation after calculating the ratio of the average concentration of each diseased patient with the average concentration of healthy subjects for each metabolite.
図１、表１のように、各疾患によって、各代謝物の血中濃度が異なっているため、これらの成分の値を用いれば、各疾患を分けられるはずである。そこで、各肝臓疾患を区別するためのバイオマーカーの選定を目的に多変量解析手法の多重ロジスティック回帰分析を行った。結果を図２、得られた予測精度を表２に示す。 As shown in FIG. 1 and Table 1, the blood concentration of each metabolite varies depending on each disease. Therefore, using these component values, each disease should be separated. Therefore, we performed multi-logistic regression analysis of multivariate analysis method for the purpose of selecting biomarkers to distinguish each liver disease. The results are shown in FIG. 2, and the obtained prediction accuracy is shown in Table 2.
また、多重ロジスティック回帰分析の結果が、偶然今回用いたデータだけで精度よく予測できただけでなく、同じ施設の別の症例や他の施設の症例でも高精度に分離が可能かを評価するため、各症例を、重複を許してランダムに抽出し、仮想的に作ったデータセットで多重ロジスティック回帰分析を行い、ＡＵＣ値のばらつきを調べた（ブートストラップ試験）。この試験を疾患ごとに200回ずつ繰り返した結果、ＡＵＣ値の平均値が大きく悪化しているものもなく、標準偏差も小さな値であり、最初の解析で得られた多重ロジスティック回帰が偶然良い結果を出していた可能性を否定する結果となった。この結果も合わせて表２に示す。また、各モデルの変数やオッズ比を表３、表４に示す。 In addition, to evaluate whether the results of multiple logistic regression analysis could be predicted with accuracy only by accidentally using the data used this time, and whether it can be separated with high accuracy in other cases in the same facility or in other facilities. Each case was randomly extracted with duplication allowed, and multiple logistic regression analysis was performed on a virtually created data set to examine variations in AUC values (bootstrap test). As a result of repeating this test 200 times for each disease, the average AUC value was not greatly deteriorated, the standard deviation was small, and the multiple logistic regression obtained in the first analysis was a good result by chance. It was the result that denied the possibility of having issued. The results are also shown in Table 2. Tables 3 and 4 show the variables and odds ratios of each model.
また図３にロジスティック回帰モデルと各代謝物が各肝臓疾患の特定を、どの程度の精度でできるか示す。 FIG. 3 shows the degree of accuracy with which the logistic regression model and each metabolite can identify each liver disease.
多重ロジスティック回帰分析では、目的変数である比率ｐに対して、ｋ個の説明変数ｘ1、ｘ2、ｘ3、…、ｘkを使って、
ｌｎ(ｐ／１−ｐ)＝ｂ0＋ｂ1ｘ1＋ｂ2ｘ2＋ｂ3ｘ3＋ … ＋ｂkｘk ・・・（１）
というｐの回帰式を求めるが、表３、表４中のパラメータの値が、（１）式のｂ0、ｂ1、…ｂkに入る具体的な値となる。切片は、定数項（ｂ０）の値を指す。
In the multiple logistic regression analysis, k explanatory variables x 1 , x 2 , x 3 ,..., X k are used for the ratio p which is an objective variable,
ln (p / 1−p) = b 0 + b 1 x 1 + b 2 x 2 + b 3 x 3 +... + b k x k (1)
In this case, the values of the parameters in Tables 3 and 4 are specific values that fall within b 0 , b 1 ,. The intercept refers to the value of the constant term (b 0 ).
また、症例ごとに確率を計算するときは、例えば単純脂肪肝ＳＳのグループでは、表中の切片の値２４．２をｂ0、トリメチルアミンＮ−オキシド（Trimethylamine N- oxide）の値−０．６４をｂ1、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（N , N - Dimethylglycine）の値３．４９をｂ2、…、グリセロホスホリルコリン（Glycerophsphorylcholine）の値−０．３９をｂ6とし、トリメチルアミンＮ−オキシドの定量値をｘ1、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンの定量値をｘ2、…、グリセロホスホリルコリンの定量値をｘ6に代入して具体的な値を出す。推定したパラメータの標準誤差及び９５％信頼区間も表中に示す。 When calculating the probability for each case, for example, in the group of simple fatty liver SS, the intercept value 24.2 in the table is b 0 , and the value of trimethylamine N-oxide is −0.64. , B 1 , N, N-dimethylglycine (N, N-Dimethylglycine) value 3.49 as b 2 ,..., Glycerophsphorylcholine value −0.39 as b 6 and determination of trimethylamine N-oxide Substituting the value into x 1 , the quantitative value of N, N-dimethylglycine into x 2 ,..., And the quantitative value of glycerophosphorylcholine into x 6 gives specific values. The standard error of estimated parameters and 95% confidence intervals are also shown in the table.
また、説明変数ｘは、ステップワイズ変数選択法の変数増減法によって選択する。これは変数が０の状態からスタートして、変数の追加と除去を繰り返し、多重ロジスティック回帰分析に必要な変数の組み合わせを探す方法である。Ｐ＜０．２５を満たす変数を変数のうちでＰ値が最小のものを追加し、Ｐ＞０．２５を満たす変数のうちでＰ値が最大のものを除去する。変数を除去する処理は、全ての変数が有意になるまで行い、有意な変数だけが残った時点で、変数を追加する処理に切り替わる。 The explanatory variable x is selected by the variable increase / decrease method of the stepwise variable selection method. This is a method of starting from a state where the variable is 0, repeatedly adding and removing the variable, and searching for a combination of variables necessary for the multiple logistic regression analysis. Among variables satisfying P <0.25, those having the smallest P value are added, and among variables satisfying P> 0.25, those having the largest P value are removed. The process of removing variables is performed until all variables become significant, and when only significant variables remain, the process is switched to a process of adding variables.
これらの解析結果から、健常者（Ｃ）も含めてすべての種類の肝炎患者を非常に高い精度（ＡＵＣ ０．９３０以上）で選択的に区別できるバイオマーカー候補が見つかった(図２および表２)。例えば、ＮＡＳＨを他の肝臓疾患および健常者から識別するバイオマーカーはＡｌａ、Ｓｅｒ、５−オキソプロリン（5-oxoproline）、ピペコレート（Pipecolate）、カルニチン（Carnitine）、ホモアルギニン（Homoarginine）であり（表３）、特にオッズ比の高いホモアルギニンの濃度が、ＮＡＳＨを他の肝臓疾患と区別することに寄与していることが判明した。 From these analysis results, biomarker candidates capable of selectively distinguishing all types of hepatitis patients including healthy subjects (C) with very high accuracy (AUC 0.930 or more) were found (FIG. 2 and Table 2). ). For example, biomarkers that distinguish NASH from other liver diseases and healthy individuals are Ala, Ser, 5-oxoproline, Pipecolate, Carnitine, Homoarginine (Table) 3) It was found that the concentration of homoarginine with a particularly high odds ratio contributed to distinguishing NASH from other liver diseases.
他の肝臓疾患も同様に多重ロジスティック回帰分析を行うことによって、表３、表４に示した幾つかの代謝物を用いることによって、ＡＵＣ ０．９３０以上で各疾患を高精度に区別することが可能である。 Similarly, by performing multiple logistic regression analysis for other liver diseases, each metabolite shown in Tables 3 and 4 can be used to accurately distinguish each disease with AUC 0.930 or higher. Is possible.
図３に多重ロジスティック回帰分析（ＭＬＲ）および個々の代謝物によるＡＵＣ値を示した。例えば健常者の場合は、予想通り多重ロジスティック回帰分析（ＭＬＲ）が最も高く０．９９４であるが、次にメチオニンスルホキシド（methionine sulfoxide）（ＡＵＣ ０．８８７）、Ａｓｎ（ＡＵＣ ０．７８５）、Ｔｙｒ（ＡＵＣ ０．７８３）と続き、２６位のＧｌｎ（ＡＵＣ 約０．６５）までの代謝物が、その物質一個で健常者と他の肝臓疾患を有意に区別することが可能であった。図３中の有意差はマン−ホイットニー（Man-Whitney）検定を用い、＊＊＊はＰ値＜０．００１、＊＊はＰ値＜０．０１、＊はＰ値＜０．０５を示す。 FIG. 3 shows the multiple logistic regression analysis (MLR) and the AUC values by individual metabolites. For example, in the case of healthy subjects, the multiple logistic regression analysis (MLR) is 0.994 as expected, but next, methionine sulfoxide (AUC 0.887), Asn (AUC 0.785), Tyr. Subsequent to (AUC 0.783), metabolites up to position 26 Gln (AUC approximately 0.65) were able to significantly distinguish healthy individuals from other liver diseases with a single substance. Significant differences in FIG. 3 are determined using the Man-Whitney test, *** indicates P value <0.001, ** indicates P value <0.01, and * indicates P value <0.05. .
同様に他の疾患も、多重ロジスティック回帰分析（ＭＬＲ）が最も高いＡＵＣ値を示したが、個々の代謝物を用いても、他の疾患と区別することが可能である。 Similarly, other diseases also showed the highest AUC values in multiple logistic regression analysis (MLR), but individual metabolites can be used to distinguish them from other diseases.
本発明による血清中の低分子代謝物質による診断法は、単純脂肪肝（ＳＳ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、薬剤性肝障害（ＤＩ）、Ｂ型キャリヤ（ＡＨＢ）、Ｃ型キャリヤ（ＡＨＣ）、Ｂ型慢性肝炎（ＣＨＢ）、Ｃ型慢性肝炎（ＣＨＣ）、肝硬変（ＣＩＲ）、肝臓がん（ＨＣＣ）、肝硬変（cirrhosis）などの各種の肝障害および健常者の診断が可能である。 The diagnostic method using low molecular weight metabolites in serum according to the present invention includes simple fatty liver (SS), nonalcoholic steatohepatitis (NASH), drug-induced liver injury (DI), type B carrier (AHB), type C carrier ( Diagnosis of various hepatic disorders such as AHC), chronic hepatitis B (CHB), chronic hepatitis C (CHC), cirrhosis (CIR), liver cancer (HCC), cirrhosis, and normal subjects is possible. .
多重ロジスティック回帰分析では、幾つかの代謝物の組み合わせの例を記したが、それらに特定されるわけではなく、有意差がある代謝物質などに置き換えて診断することも可能である。 In the multiple logistic regression analysis, examples of combinations of several metabolites have been described. However, the metabolites are not specified, and can be diagnosed by replacing them with metabolites having a significant difference.
また今回は血清中の代謝物の測定に、キャピラリー電気泳動―質量分析（ＣＥ−ＭＳ）法を用いたが、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、チップＬＣや、チップＣＥ、それらに質量分析計（ＭＳ）を組み合わせたＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＣＥ−ＭＳ法、各種のＭＳ単独の測定法、ＮＭＲ法、代謝物質を蛍光物質やＵＶ吸収物質に誘導体化してから測定する方法、抗体を作成してＥＬＩＳＡ法などで測定するなど、測定法にこだわらず、あらゆる分析法で測定することが可能である。 In addition, this time, capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS) method was used to measure serum metabolites, but high performance liquid chromatography (LC), gas chromatography (GC), chip LC, and chip CE. After derivatizing GC-MS, LC-MS, CE-MS methods, various MS independent methods, NMR methods, and metabolites into fluorescent substances and UV-absorbing substances in combination with mass spectrometers (MS) Measurement can be performed by any analysis method, regardless of the measurement method, such as measurement method, antibody preparation, and ELISA method.
本発明に係る医薬品の検定方法は、哺乳動物において、その医薬品が投与された哺乳動物から採取された血液と、投与されていない哺乳動物から採取された血液について、本発明のマーカーの濃度を測定する方法のことである。なお、この検定方法に用いられる血液を採取する哺乳動物は特に制限がないが、上記マーカーのうち少なくとも一つがその血液中に存在する哺乳動物であることが好ましく、マウスやラットなどのげっ歯類や、ヒト、サル、犬であることが、より好ましい。 In the method for assaying a pharmaceutical product according to the present invention, in a mammal, the concentration of the marker of the present invention is measured for blood collected from a mammal administered with the pharmaceutical product and blood collected from a mammal not administered with the pharmaceutical product. It is a method of doing. There are no particular restrictions on the mammal from which the blood used in this assay method is collected, but at least one of the markers is preferably a mammal present in the blood, such as rodents such as mice and rats. It is more preferable that they are humans, monkeys, and dogs.
ここで、医薬品の肝臓疾患に対する治療薬としての有効性を検定する場合、医薬品の適用となる対象疾病は、肝臓疾患マーカーの使用対象となる疾病と同様である。 Here, when the effectiveness of a pharmaceutical as a therapeutic agent for liver disease is tested, the target disease to which the pharmaceutical is applied is the same as the disease for which the liver disease marker is used.
なお、本発明に係る検定方法の目的は、肝臓疾患に対する治療薬として医薬品の有効性を検定することであるが、具体的には、様々な局面で用いられる。以下に、代表的な使用例を述べるが、本発明の検定方法は、これらの例に限定されない。 The purpose of the test method according to the present invention is to test the effectiveness of a pharmaceutical agent as a therapeutic agent for liver disease, but specifically, it is used in various aspects. Although typical examples of use are described below, the assay method of the present invention is not limited to these examples.
（１）治療薬としての有効性の検定
以下に、肝炎に対する使用例を述べるが、本発明の検定方法は、これらの例に限定されない。
(1) Examination of effectiveness as therapeutic agent Examples of use for hepatitis will be described below, but the assay method of the present invention is not limited to these examples.
（１−１）特定個体における薬効検定
例えば、本発明の検定方法を用い、ある肝炎治療薬が、特定の患者の肝炎を治療するのに有効であるかどうか、判定することができる。まず、肝炎に罹患した患者に肝炎治療薬を投与する前後で、その患者から血液を採取する。続いて、その血液において、肝炎診断マーカーの濃度を測定する。こうして得られた血液中のマーカー濃度を、肝炎治療薬の投与前後で比較する。この時、肝炎治療薬投与後の血液中マーカー濃度が、投与前と比較して有意に低下していれば、肝炎治療薬がその患者の肝炎を治療するのに有効であると判断できる。
(1-1) Drug efficacy test in specific individuals For example, by using the test method of the present invention, it is possible to determine whether a certain hepatitis therapeutic drug is effective in treating hepatitis in a specific patient. First, blood is collected from a patient suffering from hepatitis before and after administration of a therapeutic agent for hepatitis. Subsequently, the concentration of the hepatitis diagnostic marker is measured in the blood. The marker concentration in the blood thus obtained is compared before and after administration of the therapeutic agent for hepatitis. At this time, if the blood marker concentration after administration of the therapeutic agent for hepatitis is significantly lower than that before administration, it can be determined that the therapeutic agent for hepatitis is effective for treating hepatitis in the patient.
（１−２）一般的な薬効検定
さらに、本発明の検定方法を複数のヒト個体に適用することにより、その医薬品の、肝炎治療薬としての一般的な有効性を検定することも可能である。
(1-2) General drug efficacy test Furthermore, by applying the test method of the present invention to a plurality of human individuals, it is also possible to test the general effectiveness of the drug as a therapeutic agent for hepatitis. .
例えば、肝炎を患った複数のヒトにおいて、肝炎治療薬の投与前後で肝炎診断マーカーの濃度を比較することにより、その物質の治療薬としての普遍的効果を調べることができる。 For example, in a plurality of humans suffering from hepatitis, by comparing the concentration of a hepatitis diagnostic marker before and after administration of a therapeutic agent for hepatitis, the universal effect of the substance as a therapeutic agent can be examined.
あるいは、別態様として、２つの群の間で医薬品としての効果を比較してもよい。まず、肝炎に罹患している患者を２つの群に分ける。一方の群の患者には肝炎治療薬を投与し、もう一方の群の患者にはその治療薬を投与しないか、またはプラセボを投与する。これらの２つの群の患者から血液を採取する。続いて、その血液において、肝炎診断マーカーの濃度を測定する。さらに、この測定により得られた、血液中のマーカー濃度を、２つの群の間で比較する。 Or you may compare the effect as a pharmaceutical between two groups as another aspect. First, patients suffering from hepatitis are divided into two groups. One group of patients will receive a hepatitis drug and the other group will not receive the drug or will receive a placebo. Blood is collected from these two groups of patients. Subsequently, the concentration of the hepatitis diagnostic marker is measured in the blood. Furthermore, the marker concentration in the blood obtained by this measurement is compared between the two groups.
なお、「群」は一個体しか含まなくても、複数の個体を含んでもよく、２つの群の個体数が同じであっても、異なっていてもよい。測定は、同じ群の個体から採取した血液をプールし、その血液中のマーカー濃度を測定してもよいが、各個体の血液において別々にマーカー濃度を測定することが好ましい。 The “group” may include only one individual or a plurality of individuals, and the number of individuals in the two groups may be the same or different. In the measurement, blood collected from individuals of the same group may be pooled and the marker concentration in the blood may be measured, but it is preferable to measure the marker concentration separately in the blood of each individual.
医薬品の投与の前後や投与の有無といった、複数の血液を含むグループ間でのマーカー濃度の比較は、一血液ずつを対にして比較しても、同じグループに属する複数の血液におけるマーカー濃度の積算値や平均値をグループ間で比較してもよい。この比較は当業者に周知のいずれの統計学的方法を用いて行うことができる。このように比較した結果、治療薬の投与後において、投与前と比較して血液中マーカー濃度が有意に低下していたり、治療薬の投与群において、非投与群と比較して有意に低下していたりすれば、その治療薬が肝炎の治療に有効であると判断できる。また、低下の度合いによって、どの程度の有効性を有するかも判断できる。 Comparison of marker concentrations between groups containing multiple bloods, such as before and after administration of pharmaceuticals and whether or not they are administered, is an accumulation of marker concentrations in multiple blood belonging to the same group, even if each blood is compared in pairs Values and average values may be compared between groups. This comparison can be made using any statistical method known to those skilled in the art. As a result of the comparisons, after administration of the therapeutic agent, the marker concentration in the blood was significantly reduced compared to before administration, or in the therapeutic agent administration group, compared with the non-administration group, it was significantly reduced. If so, it can be determined that the therapeutic agent is effective in treating hepatitis. Moreover, it can also be judged how effective it is by the degree of the decrease.
このように、肝炎治療薬としての一般的な有効性を検定することによって、肝炎治療薬のスクリーニングを行うことができる。また、複数の肝炎治療薬を用い、各肝炎治療薬の異なる濃度について治療効果を調べ、濃度に依存した薬効の違いを比較することにより、各肝炎治療薬の強さを調べることも可能である。 Thus, screening for hepatitis therapeutic agents can be performed by examining the general effectiveness as hepatitis therapeutic agents. It is also possible to investigate the strength of each hepatitis drug by using multiple hepatitis drugs and examining the therapeutic effect at different concentrations of each hepatitis drug and comparing the difference in drug effect depending on the concentration. .
上述したように、本発明の肝臓疾患マーカーは、肝臓疾患治療用医薬品の検定あるいは疾病の診断などに用いることができる。その時、複数のマーカーを用いることによって、検定精度や診断精度を上げることができる。また、本発明のマーカー以外の検定方法や診断方法を組み合わせても構わない。 As described above, the liver disease marker of the present invention can be used for assay of drugs for treating liver diseases or diagnosis of diseases. At that time, by using a plurality of markers, it is possible to improve the test accuracy and the diagnostic accuracy. Moreover, you may combine the test methods and diagnostic methods other than the marker of this invention.
本発明で発見した血液中の代謝物は、各種の肝障害患者の迅速なスクリーニング法として有用であるばかりでなく、マウス、ラット、サル、イヌなどの実験動物の各種の肝障害を把握するマーカーとして使用することが可能である。 The metabolite in the blood discovered in the present invention is not only useful as a rapid screening method for various hepatic disorder patients but also a marker for grasping various hepatic disorders in experimental animals such as mice, rats, monkeys, and dogs. It can be used as
Claims (15)
メチオニンスルホキシド（Methionine sulfoxide）、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、サルコシン（Sarcosine）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、Ｎ−アセチルオルニチン（N-Acetylornithine）、インドール−３−アセトアミド（Indole-3-acetamide）、グルコサミン（Glucosamine）、Ｐｈｅ、ホモアルギニン（Homoarginine）、Ｐｒｏ、クレアチン（Creatine）、Ｖａｌ、クレアチニン（Creatinine）、Ｇｌｕ、ヒポキサンチン（Hypoxanthine）、５−オキソプロリン（5-Oxoproline）、Ｌｙｓ、タウリン（Taurine）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、キヌレニン（Kynurenine）、Ｎ−γ−エチルグルタミン（N-γ-Ethylglutamine）、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｎのいずれか、又は、
クレアチン、Ｇｌｕ、メチオニンスルホキシド、Ｐｈｅ、ホモアルギニン、５−メトキシ−３−インドールアセテート（5-Methoxy-3-indoleaceate）の組合せであることを特徴とする健常者識別用の肝臓疾患マーカー。 The liver disease marker according to claim 1,
Methionine sulfoxide, Asn, Tyr, Sarcosine, N, N-dimethylglycine, N-acetylornithine, indole-3-acetamide (Indole-3-) acetamide), glucosamine (Glucosamine), Phe, homoarginine (Homoarginine), Pro, creatine (Creatine), Val, creatinine (Creatinine), Glu, hypoxanthine (5-Oxoproline), Lys, Taurine, hydroxyproline, kynurenine, N-γ-ethylglutamine, Ile + Leu, Gly-Gly, Gln, or
A liver disease marker for identifying a healthy person, characterized by being a combination of creatine, Glu, methionine sulfoxide, Phe, homoarginine and 5-methoxy-3-indoleaceate.
グリセロホスホリルコリン（Glycerophsphorylcholine）、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、キヌレニン、Ｇｌｕ、グルコサミン、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、メチオニンスルホキシド、Ｎ−γ−エチルグルタミン、オルニチン（Ornithine）、Ａｓｎ、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、インドール−３−アセトアミド、ピペコレート（Pipecolate）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、ホモアルギニン、Ｓｅｒ、γ−ブチロベタイン（γ-Butyrobetaine）のいずれか、又は、
トリメチルアミンＮ−オキシド（Trimethylamine N-oxide）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、クレアチニン、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、オルニチン、グリセロホスホリルコリンの組合せであることを特徴とする単純脂肪肝（ＳＳ）識別用の肝臓疾患マーカー。 The liver disease marker according to claim 1,
Glycerophsphorylcholine, Gln, Gly-Gly, kynurenine, Glu, glucosamine, Met, His, methionine sulfoxide, N-γ-ethylglutamine, ornithine (Ornithine), Asn, Ile + Leu, indole-3-acetamide, pipecolate ), N, N-dimethylglycine, Tyr, Trp, Gly, homoarginine, Ser, γ-butyrobetaine, or
A liver disease marker for identifying simple fatty liver (SS), which is a combination of trimethylamine N-oxide, N, N-dimethylglycine, creatinine, Ile + Leu, ornithine and glycerophosphorylcholine.
Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、ピペコレート、オルニチン、グリセロホスホリルコリン、ホモアルギニン、インドール−３−アセトアミド、Ａｓｎ、γ−ブチロベタイン、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、グルコサミン、キヌレニン、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、グアニドアセテート（Guanidoacetate）、タウリン、Ｎ−アセチルオルニチン、カルニチン（Carnitine）、シトルリン（Citrulline）のいずれか、又は、
Ａｌａ、Ｓｅｒ、５−オキソプロリン、ピペコレート、カルニチン、ホモアルギニンの組合せであることを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）識別用の肝臓疾患マーカー。 The liver disease marker according to claim 1,
His, Ser, Gly-Gly, Gly, pipecolate, ornithine, glycerophosphorylcholine, homoarginine, indole-3-acetamide, Asn, γ-butyrobetaine, Lys, Arg, Phe, glucosamine, kynurenine, Thr, Met, guanide acetate ( Guanidoacetate), taurine, N-acetylornithine, carnitine, citrulline, or
A liver disease marker for identifying nonalcoholic steatohepatitis (NASH), which is a combination of Ala, Ser, 5-oxoproline, pipecolate, carnitine, and homoarginine.
５−メトキシ−３−インドールアセテート、シトルリン、グリセロホスホリルコリン、α−アミノアジぺート（α-Aminoadipate）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、オルニチン、Ｎ−アセチルオルニチン、ベタイン（Betaine）、３−メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）、Ｎ−γ−エチルグルタミン、トリメチルアミンＮ−オキシド、メチオニンスルホキシド、１−メチルニコチンアミド（1-Methylnicotinamide）、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、カルニチン、γ−ブチロベタイン、グルコサミン、ホモアルギニン、キヌレニン、クレアニチン、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、５−オキソプロリンのいずれか、又は、
α−アミノアジペート、Ｎ−アセチルオミシン（N-Acetylomithine）、５−メトキシ−３−インドールアセテートの組合せであることを特徴とする薬剤性肝障害（ＤＩ）識別用の肝臓疾患マーカー。 The liver disease marker according to claim 1,
5-methoxy-3-indole acetate, citrulline, glycerophosphorylcholine, α-aminoadipate, N, N-dimethylglycine, ornithine, N-acetylornithine, betaine, 3-methylhistidine (3 -Methylhistidine), N-γ-ethylglutamine, trimethylamine N-oxide, methionine sulfoxide, 1-methylnicotinamide, Met, Phe, Tyr, carnitine, γ-butyrobetaine, glucosamine, homoarginine, kynurenine, cleanitine , Thr, Asn, 5-oxoproline, or
A liver disease marker for identifying drug-induced liver injury (DI), which is a combination of α-aminoadipate, N-acetylmythine, and 5-methoxy-3-indole acetate.
Ｖａｌ、α−アミノアジペート、インドール−３−アセトアミド、γ−ブチロベタイン、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、グアニドアセテート、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、サルコシン、カルニチン、１−メチルニコチンアミド、３−メチルヒスチジン、Ｇｌｎ、クレアチニン、Ｌｙｓ、Ａｌａのいずれか、又は、
クレアチニン、Ｖａｌ、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ａｒｇの組合せであることを特徴とする無症状Ｂ型肝炎キャリヤ（ＡＨＢ）識別用の肝臓疾患マーカー。 The liver disease marker according to claim 1,
Val, α-aminoadipate, indole-3-acetamide, γ-butyrobetaine, His, Trp, guanidoacetate, Ile + Leu, Tyr, sarcosine, carnitine, 1-methylnicotinamide, 3-methylhistidine, Gln, creatinine, Lys, Either Ala, or
A liver disease marker for identifying asymptomatic hepatitis B carrier (AHB), which is a combination of creatinine, Val, Ile + Leu, Asn, Gly-Gly, Phe, and Arg.
Ｔｙｒ、サルコシン、γ−ブチロベタイン、メトホルミン（Metformin）、Ｔｒｐ、１−メチルニコチンアミド、α−アミノアジテート、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、プソドペレチエリン（Pseudopelletierine）、メチオニンスルホキシド、Ｌｙｓ、アセチルコリン（Acetylcholine）、ピペリジン（Piperidine）、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、Ｖａｌ、クレアチニン、ベタイン、Ａｌａ、Ｔｈｒ、タウリン、Ｐｈｅ、グアニドアセテート、ピペコレート、Ｓｅｒ、ヒドロキシプロリン、Ｐｒｏ、キヌレニンのいずれか、又は、
サルコシン、クレアチニン、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、アセチルコリン、３−メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）の組合せであることを特徴とする無症状Ｂ型慢性肝炎（ＣＨＢ）識別用の肝臓疾患マーカー。 The liver disease marker according to claim 1,
Tyr, sarcosine, γ-butyrobetaine, metformin, Trp, 1-methylnicotinamide, α-amino agitate, N, N-dimethylglycine, Pseudopelletierine, methionine sulfoxide, Lys, acetylcholine (Acetylcholine) ), Piperidine, His, Ile + Leu, Val, creatinine, betaine, Ala, Thr, taurine, Phe, guanide acetate, pipecolate, Ser, hydroxyproline, Pro, any of kynurenine, or
A liver disease marker for identifying asymptomatic chronic hepatitis B (CHB), which is a combination of sarcosine, creatinine, Ile + Leu, acetylcholine, and 3-methylhistidine (3-Methylhistidine).
Ａｒｇ、タウリン、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、カルニチン、シトルリン、ベタイン、５−メトキシ−３−インドールアセテート、Ｈｉｓ、γ−ブチロベタイン、ヒポキサンチン、クレアチン、Ｔｙｒ、Ｖａｌのいずれか、又は、
Ｇｌｙ、トリメチルアミンＮ−オキシド、タウリン、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、Ａｓｎ、オルニチン、Ｇｌｕ、プソイドペレチエリン、インドール−３−アセトアミド、Ｎ−γ−エチルグルタミン（N-γ-Ethylglutamine）、グルコサミン、Ｔｙｒの組合せであることを特徴とする無症状Ｃ型肝炎キャリヤ（ＡＨＣ）識別用の肝臓疾患マーカー。 The liver disease marker according to claim 1,
Arg, taurine, Asp, Ser, Gly, carnitine, citrulline, betaine, 5-methoxy-3-indole acetate, His, γ-butyrobetaine, hypoxanthine, creatine, Tyr, Val, or
Gly, trimethylamine N-oxide, taurine, Ile + Leu, Asn, ornithine, Glu, pseudopeltierelin, indole-3-acetamide, N-γ-ethylglutamine, glucosamine, Tyr A liver disease marker for identifying asymptomatic hepatitis C carrier (AHC).
メチオニンスルホキシド、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、グルコサミン、Ｇｌｎ、グリセロホスホリルコリン、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、ヒポキサンチン、グアニドアセテート、キヌレニン、ピペコレート、５−メトキシ−３−インドールアセテート、メトホルミンのいずれか、又は、
トリメチルアミンＮ−オキシド、クレアチニン、Ｐｒｏ、グアニドアセテート、ベタイン、Ｔｈｒ、タウリン、メトホルミン、ヒドロキシプロリン、クレアチン、Ａｓｐ、ヒポキサンチン、１−メチルニコチンアミド、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、メチオニンスルホキシド、３−メチルヒスチジン、Ｎ−アセチルオルチニン、Ａｒｇ、シトルリン、Ｔｙｒ、５−メトキシ−３−インドールアセテート、グリセロホスホリルコリンの組合せであることを特徴とするＣ型慢性肝炎（ＣＨＣ）識別用の肝臓疾患マーカー。 The liver disease marker according to claim 1,
Methionine sulfoxide, Met, Glu, glucosamine, Gln, glycerophosphorylcholine, Asn, Phe, Lys, Pro, hypoxanthine, guanide acetate, kynurenine, pipecolate, 5-methoxy-3-indole acetate, metformin, or
Trimethylamine N-oxide, creatinine, Pro, guanide acetate, betaine, Thr, taurine, metformin, hydroxyproline, creatine, Asp, hypoxanthine, 1-methylnicotinamide, Gln, Glu, Met, His, methionine sulfoxide, 3- A liver disease marker for identifying chronic hepatitis C (CHC), which is a combination of methylhistidine, N-acetylortinin, Arg, citrulline, Tyr, 5-methoxy-3-indole acetate and glycerophosphorylcholine.
シトルリン、オルニチン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｔｙｒ、タウリン、１−メチルニコチンアミド、Ｎ−γ−エチルグルタミン、Ｎ−アセチルオルニチン、ホモアルギニン、グアニドアセテートのいずれか、又は、
Ｇｌｙ、トリメチルアミンＮ−オキシド、タウリン、Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ、Ａｓｎ、オルニチン、Ｇｌｕ、プソイドペレチエリン、インドール−３−アセトアミド、Ｎ−γ−エチルグルタミン、グルコサミン、Ｔｙｒの組合せであることを特徴とする肝硬変（ＣＩＲ）識別用の肝臓疾患マーカー。 The liver disease marker according to claim 1,
Citrulline, ornithine, N, N-dimethylglycine, Tyr, taurine, 1-methylnicotinamide, N-γ-ethylglutamine, N-acetylornithine, homoarginine, guanide acetate, or
Cirrhosis characterized by a combination of Gly, trimethylamine N-oxide, taurine, Ile + Leu, Asn, ornithine, Glu, pseudopeltierelin, indole-3-acetamide, N-γ-ethylglutamine, glucosamine and Tyr ( CIR) A liver disease marker for identification.
ジメチルグリシン、シトルリン、アセチルオルニチン、トリメチルアミンＮ−オキシド、ホモアルギニン、ベタイン、２ＡＢ、オルニチン、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、３−メチルヒスチジン、クレアチニン、５−オキソプロリンのいずれか、又は、
トリメチルアミンＮ−オキシド（Trimethylamine N−Oxide）、Ｐｒｏ、ベタイン、タウリン、メトホルミン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、Ａｓｐ、ヒポキサンチン、１−メチルニコチンアミド、γ−ブチロベタイン（γ−Ｂutyrobetaine）、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、メチオニンスルホキシド、Ｐｈｅ、Ｎ−アセチルオルニチン、Ａｒｇ、シトルリン、ホモアルギニン、Ｔｒｐ、５−メトキシ−３−インドールアセテートの組合せであることを特徴とする肝臓がん（ＨＣＣ）識別用の肝臓疾患マーカー。 The liver disease marker according to claim 1,
Dimethylglycine, citrulline, acetylornithine, trimethylamine N-oxide, homoarginine, betaine, 2AB, ornithine, Tyr, Lys, 3-methylhistidine, creatinine, 5-oxoproline, or
Trimethylamine N-Oxide, Pro, betaine, taurine, metformin, hydroxyproline, ornithine, Asp, hypoxanthine, 1-methylnicotinamide, γ-butyrobetaine, Lys, His, methionine sulfoxide , Phe, N-acetylornithine, Arg, citrulline, homoarginine, Trp, and a combination of 5-methoxy-3-indole acetate, a liver disease marker for liver cancer (HCC) identification.
試料中の請求項１乃至１１のいずれかに記載の肝臓疾患マーカーを測定するための分析手段と、
を備えたことを特徴とする肝臓疾患マーカーの測定装置。 A means for preparing a sample suitable for analysis from a sample;
Analytical means for measuring the liver disease marker according to any one of claims 1 to 11 in a sample;
An apparatus for measuring a liver disease marker, comprising:
前記測定の結果を、前記医薬品の投与前の血液と投与後の血液とで比較する工程と、
を含むことを特徴とする医薬品の検定方法。 Measuring the concentration of the liver disease marker according to any one of claims 1 to 11, in the blood of a mammal collected before and after administration of the pharmaceutical;
Comparing the results of the measurement between blood before administration of the pharmaceutical and blood after administration;
A method for testing a pharmaceutical product characterized by comprising:
第１の群と第２の群との間で、測定された前記肝臓疾患マーカーの濃度を比較する工程と、
を含むことを特徴とする医薬品の検定方法。 In mammals, blood collected from a first group consisting of one or more individuals administered with a drug and blood collected from a second group consisting of one or more individuals not administered with the drug Measuring the concentration of the liver disease marker according to any one of claims 1 to 11,
Comparing the measured concentration of said liver disease marker between a first group and a second group;
A method for testing a pharmaceutical product characterized by comprising:
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