JP2011178759A5 - - Google Patents
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本出願人は、細胞又は細胞小器官内等のプロトン濃度を調節する働きを担うプロトンポンプ阻害剤が、メラノサイト内の酸性化作用(プロトンポンプ阻害作用)を介するチロシナーゼ活性の低下によるメラニン産生抑制効果を発揮することにより、美白効果をはじめとする皮膚色素異常関連疾患に有用であることを見出している。プロトンポンプ阻害剤は、細胞内における環境的な要因、即ち、細胞内酸性化作用によりチロシナーゼ活性を抑制することによりメラニン産生を抑制し美白効果を発揮する点において、従前のメラニン産生抑制剤に属するチロシナーゼの酵素活性を低下させるチロシナーゼ直接阻害剤、チロシナーゼファミリータンパク質を減少させるチロシナーゼファミリータンパク減少剤等とは全く異なる作用機序を有する美白剤であると言える。言い換えれば、従前のメラニン産生抑制剤とプロトンポンプ阻害剤は、メラニン産生抑制作用を有する物質としては共通するが、その作用機作により明確に区別されるものである。加えて、従前のメラニン産生抑制剤とは異なった作用機序によりメラニン産生抑制作用を発揮するので、プロトンポンプ阻害作用を有するメラニン産生抑制剤と、従前のメラニン産生抑制剤との併用は、少なくとも相加的効果を奏する。この様な背景からも、プロトンポンプ阻害剤は、高い効果が期待出来る新たな作用機作を有するメラニン産生抑制剤である。
一方、ショウガ科に属する植物には、ジンゲロール誘導体又はショウガオール誘導体が含有され、該誘導体が、角層修復促進作用(例えば、特許文献3を参照)、皮膚角質層水分量増加作用(例えば、特許文献4を参照)、血行促進作用(例えば、特許文献5を参照)、メラニン産生抑制作用(例えば、特許文献6を参照)を有することが知られている。また、前記誘導体とは別に、化学合成されたショウガオール及びジンゲロールと類似構造を有する化合物が、チロシナーゼ阻害作用(例えば、特許文献7を参照)を有することも既に知られている。しかしながら、ショウガオール誘導体が、プロトンポンプ阻害作用を有することは知られていない。さらに、ショウガオール誘導体のプロトンポンプ阻害作用に関する構造活性相関は全く明らかにされておらず、プロトンポンプ阻害作用の発現が、ショウガオール誘導体の化学構造に制約を受けることも知られていなかった。加えて、前記のプロトンポンプ阻害作用を有するショウガオール誘導体を含有する皮膚外用剤が、プロトンポンプ阻害作用を介し、美白をはじめとする色素異常疾患の予防又は治療に有効であることも全く知られていなかった。
<製造例1: 本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物、及び、前記一般式(1)に表される化合物(化合物1〜4)の単離精製方法>
本発明のショウガ科ショウガ属ショウガ(ショウキョウ)より得られる植物抽出物の製造方法を示す。本抽出物は、ショウガZingiber officinale Roscoe( Zingiberaceae ) の根茎をエタノールに浸漬し製造した。具体的には、ショウガ科ショウガ属ショウガ(ショウキョウ)を粗粉末にしたもの200gに、薄めたエタノール(37〜50%)約600mLを加え、時々かき混ぜながら可溶性成分が充分に溶けるまで放置し、布ごしし、残留物を薄めたエタノール(37〜50%)少量で洗い、圧搾し、浸出液及び洗液をあわせ、2日間放置し、濾過し、さらに薄めたエタノール(37〜50%)を加え、本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物全量1000mLを製造した。本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物は、上記の製造例に記載の方法に準じ製造することも出来るし、丸善株式会社、一丸ファルコス株式会社などにより市販されている抽出物を購入し、使用することも出来る。
前記一般式(1)に表される化合物の内の化合物1〜4と化合物5の単離精製を行った。市販のショウキョウ(乾燥品、刻み、ウチダ和漢薬)1.8kgを9リットルのメタノール中で2時間加熱還流抽出を2回行い、ろ過後2回分の濾液をあわせたものを減圧下濃縮、乾燥し、ショウキョウメタノールエキス159gを得た。ショウキョウメタノールエキス159gを10%の水を含んだメタノール溶液に溶解させ、n−ヘキサンで液液分配抽出を行い、得られたn−ヘキサン画分を減圧下濃縮・乾燥し、n−ヘキサンエキス61.8gを得た。n−ヘキサンエキス61.8gをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(Fuji Silysia PSQ100B、600g)に付し、n−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液の比率を変えながら溶出させ、28のフラクションに分画した。このうち20番目のフラクション4gをさらにTSK-gel ODS-80Ts(東ソー株式会社)カラムを装着した分取HPLCにて分画、精製を行い、化合物1〜4を得た。各化合物はNMRスペクトルデータ解析を行い、それぞれ4−ショウガオール(4−shogaol、化合物1)、6−ショウガオール(6−shogaol、化合物2)、8−ショウガオール(8−shogaol、化合物3)、10−ショウガオール(10−shogaol、化合物4)、メチル−6−ショウガオール(化合物5)と同定した。
本発明のショウガ科ショウガ属ショウガ(ショウキョウ)より得られる植物抽出物の製造方法を示す。本抽出物は、ショウガZingiber officinale Roscoe( Zingiberaceae ) の根茎をエタノールに浸漬し製造した。具体的には、ショウガ科ショウガ属ショウガ(ショウキョウ)を粗粉末にしたもの200gに、薄めたエタノール(37〜50%)約600mLを加え、時々かき混ぜながら可溶性成分が充分に溶けるまで放置し、布ごしし、残留物を薄めたエタノール(37〜50%)少量で洗い、圧搾し、浸出液及び洗液をあわせ、2日間放置し、濾過し、さらに薄めたエタノール(37〜50%)を加え、本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物全量1000mLを製造した。本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物は、上記の製造例に記載の方法に準じ製造することも出来るし、丸善株式会社、一丸ファルコス株式会社などにより市販されている抽出物を購入し、使用することも出来る。
前記一般式(1)に表される化合物の内の化合物1〜4と化合物5の単離精製を行った。市販のショウキョウ(乾燥品、刻み、ウチダ和漢薬)1.8kgを9リットルのメタノール中で2時間加熱還流抽出を2回行い、ろ過後2回分の濾液をあわせたものを減圧下濃縮、乾燥し、ショウキョウメタノールエキス159gを得た。ショウキョウメタノールエキス159gを10%の水を含んだメタノール溶液に溶解させ、n−ヘキサンで液液分配抽出を行い、得られたn−ヘキサン画分を減圧下濃縮・乾燥し、n−ヘキサンエキス61.8gを得た。n−ヘキサンエキス61.8gをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(Fuji Silysia PSQ100B、600g)に付し、n−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液の比率を変えながら溶出させ、28のフラクションに分画した。このうち20番目のフラクション4gをさらにTSK-gel ODS-80Ts(東ソー株式会社)カラムを装着した分取HPLCにて分画、精製を行い、化合物1〜4を得た。各化合物はNMRスペクトルデータ解析を行い、それぞれ4−ショウガオール(4−shogaol、化合物1)、6−ショウガオール(6−shogaol、化合物2)、8−ショウガオール(8−shogaol、化合物3)、10−ショウガオール(10−shogaol、化合物4)、メチル−6−ショウガオール(化合物5)と同定した。
<試験例2: 本発明のプロトンポンプ阻害剤である化合物1〜4、植物抽出物のメラニン産生抑制作用の検討>
前記化合物1〜5及び本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物に関し、以下に記載の方法に従い、メラニン産生抑制作用を評価した。同時に、陽性対象としてハイドロキノンを用い、メラニン産生抑制作用を評価した。24穴プレートにヒト正常メラノサイト(クラボウ株式会社)を22500(cells/cm2)播種する。翌日、評価物質を含有する培地 0.5(mL/well)に交換し、0.25(μCi)2−[2−14C]チオウラシル(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を添加し培養を継続した。播種4日後、培地を除去しPBSで1回プレートを洗浄した後、細胞生存率を評価するため生細胞数測定試薬SF(ナカライテスク社)溶液を添加した培地に交換し、37℃、3時間呈色反応を行った。反応後、450(nm)の吸光度をマイクロプレートリーダーBenchmark Plus(Bio-Rad Laboratories)を用い測定した。コントロールとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロールに対する評価物質を含むサンプルの吸光度の百分率を求め細胞生存率とした。
メラニン量測定のため吸光度測定後、PBSで1回プレートを洗浄し、TCAを添加し、細胞を溶解した後、蒸留水 を加え溶液をバイアルに移した。氷上に放置後、15000rpm、5分間遠心した後、上清を除去した。再度、各バイアルに10%TCA500(μL)を添加し、氷上15分間放置した。15000rpm、5分間遠心した後、上清を除去した。残渣にアクアゾール−2(パーキンエルマー社)1(mL)を添加し、液体シンチレーションカウンター LSC−6100(アロカ社製)にて放射線量を測定した。コントロールとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロールに対する評価物質を含むサンプルの放射線量の百分率を求めメラニン量(%)とした。メラニン産生量の50%阻害濃度(IC50値)は、細胞毒性の認められない範囲でSAS software version 9.1.3(SAS Institute Inc.)を用い算出した。結果を表1及び表2に示す。
前記化合物1〜5及び本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物に関し、以下に記載の方法に従い、メラニン産生抑制作用を評価した。同時に、陽性対象としてハイドロキノンを用い、メラニン産生抑制作用を評価した。24穴プレートにヒト正常メラノサイト(クラボウ株式会社)を22500(cells/cm2)播種する。翌日、評価物質を含有する培地 0.5(mL/well)に交換し、0.25(μCi)2−[2−14C]チオウラシル(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を添加し培養を継続した。播種4日後、培地を除去しPBSで1回プレートを洗浄した後、細胞生存率を評価するため生細胞数測定試薬SF(ナカライテスク社)溶液を添加した培地に交換し、37℃、3時間呈色反応を行った。反応後、450(nm)の吸光度をマイクロプレートリーダーBenchmark Plus(Bio-Rad Laboratories)を用い測定した。コントロールとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロールに対する評価物質を含むサンプルの吸光度の百分率を求め細胞生存率とした。
メラニン量測定のため吸光度測定後、PBSで1回プレートを洗浄し、TCAを添加し、細胞を溶解した後、蒸留水 を加え溶液をバイアルに移した。氷上に放置後、15000rpm、5分間遠心した後、上清を除去した。再度、各バイアルに10%TCA500(μL)を添加し、氷上15分間放置した。15000rpm、5分間遠心した後、上清を除去した。残渣にアクアゾール−2(パーキンエルマー社)1(mL)を添加し、液体シンチレーションカウンター LSC−6100(アロカ社製)にて放射線量を測定した。コントロールとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロールに対する評価物質を含むサンプルの放射線量の百分率を求めメラニン量(%)とした。メラニン産生量の50%阻害濃度(IC50値)は、細胞毒性の認められない範囲でSAS software version 9.1.3(SAS Institute Inc.)を用い算出した。結果を表1及び表2に示す。
前記化合物1〜4及び本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物は、細胞毒性を示さない濃度において顕著なメラニン産生抑制作用を示した。このことは、本発明の前記一般式(1)に表される化合物(化合物1〜4)及び本発明のショウガ科ショウガ属ショウガより得られる植物抽出物が示すメラニン産生抑制作用は、前記のメラノソーム内酸性化検出(プロトンポンプ阻害作用)に特異的に作用することによるものであると考えられる。
<製造例2: 本発明のプロトンポンプ阻害剤を含有する皮膚外用剤の製造1>
表3及び表4に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である、エッセンス化粧料を作製した。即ち、イ、ロ及びハの成分をそれぞれ75℃に加熱し、イにロを徐々に加え乳化し、更に、ハを加え中和、増粘させ、攪拌冷却してエッセンスエマルション(化粧料)を得た。また、表3の処方成分中、「本発明のプロトンポンプ阻害剤」を「アルブチン」に置換した比較例1、「本発明のプロトンポンプ阻害剤」を水に置換した比較例2を作製した。
表3及び表4に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である、エッセンス化粧料を作製した。即ち、イ、ロ及びハの成分をそれぞれ75℃に加熱し、イにロを徐々に加え乳化し、更に、ハを加え中和、増粘させ、攪拌冷却してエッセンスエマルション(化粧料)を得た。また、表3の処方成分中、「本発明のプロトンポンプ阻害剤」を「アルブチン」に置換した比較例1、「本発明のプロトンポンプ阻害剤」を水に置換した比較例2を作製した。
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