JP2011144167A

JP2011144167A - 血糖値降下剤及び血糖値降下飲食品組成物

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Publication number: JP2011144167A
Application number: JP2010280267A
Authority: JP
Inventors: Katsuyuki Uchida; 勝幸内田; Yukio Oshiba; 幸男大柴; Orie Mogami; おりえ最上
Original assignee: Meiji Co Ltd
Current assignee: Meiji Co Ltd
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2011-07-28
Anticipated expiration: 2030-12-16
Also published as: JP6026720B2

Abstract

【課題】食品由来の物質で安全性が高く、高い血糖値降下作用のある血糖値降下剤及び血糖値降下飲食品組成物を提供する。
【解決手段】Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドを含有する、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害剤及び血糖降下剤並びに該ペプチドを用いた食品の製造方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、ＤＰＰ４阻害剤、血糖値降下剤、血糖値降下方法、ＤＰＰ４を阻害する方法、及び血糖値降下飲食品組成物に関する。

糖尿病は現代における最も一般的な慢性疾患の一つであり、心血管疾患の発生の主要因の一つである。糖尿病は、食餌中の糖を消費するという、インスリンの正常な活性が損なわれることによって引き起こされる。糖尿病にはインスリン依存型糖尿病（所謂Ｉ型糖尿病）とインスリン非依存型糖尿病（所謂II型糖尿病）とに主に分類され、近年、インスリン非依存型糖尿病の患者数は生活習慣の変化、肥満の増加、及び人口集団の加齢によって急激に増加している。

一般的に糖尿病においては、体内でのインスリン産生能が極めて低下しているか、又は作られたとしても、インスリン感受性の低下等によりそのインスリンが有効ではなく、これを原因として血糖値上昇が起き、それに伴う種々の高血糖症状を引き起こす。現在広く行われている治療としては、インスリン投与以外に、血糖値降下剤の投与によって血糖値をコントロールする方法が用いられている。

近年、こうしたII型糖尿病患者の増加に伴い、従来のインスリン投与以外の種々の治療法が探索されている。その中で生体から分泌されるインクレチンに注目が集まっている。

インクレチンは消化管ホルモンの総称であり、インスリン分泌を刺激することで血糖値を下げる作用があることが判っている。インクレチンの中でもＧＬＰ−１アナログ等が医薬品として開発されている。さらには、ＧＬＰ−１はペプチド分解酵素であるジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）によって分解され失活することから、インクレチンの構造中のＤＰＰ４により攻撃を受ける部位を修飾して誘導体とする物質や、ＤＰＰ４自身の作用を阻害する物質などについても今後の新しい糖尿病治療薬となることが期待されている。

これまでも様々なＤＰＰ４阻害を目的とした化合物が提案されている。例えば、特定のロイシン誘導体やメチオニン誘導体（特許文献１）、ピロリジン誘導体、Ｎ−オキシド体又はそれらのプロドラッグ（特許文献２、特許文献３）、アダマンチルグリシン誘導体（特許文献４）、ピロピロリジン誘導体（特許文献５）、特定基や特定構造を有する加水分解型タンニン（特許文献６）、ビルダグリプチン及びメトホルミンを含む製剤（特許文献７）、またタンパク質の加水分解物（特許文献８）等が挙げられる。

しかし、これら従来のＤＰＰ４阻害剤としての化合物などは、特異的な立体構造を制御した合成を要するため、複雑な合成経路を経なければならず、またそれに伴い合成コストがかかる可能性がある（特許文献１、２，３、４、５、７）。また植物からの抽出物である場合には、大量安定供給が出来ない可能性がある（特許文献６）。またその効果については未だ不十分である。特に安全性の高い食品由来でその様な有効かつ十分な作用を発揮する素材についての探索は継続して行われているのが現状であった。

国際公開第２００６／１１８１９６号特開２００７−３１３９６号明細書特表２００７−１９４６号明細書特表２００７−５０１２３１号明細書特表２００８−５４０６５１号明細書特開２００８−２８０２９１号明細書特表２００９−５１００６８号明細書米国特許出願公開第２００９／００７５９０４号明細書

このように安全性の高い食品由来でその様な有効かつ十分な作用を発揮する素材を用いた血糖値降下剤及び血糖値降下飲食品組成物はこれまでに見出されていなかった。

上記従来の問題点に鑑み、本発明者等は鋭意研究を進めたところ、β−ラクトグロブリンの分解物由来の化合物にＤＰＰ４（ジペプチジルペプチダーゼ４）阻害作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、食品由来の物質で安全性が高く、高い血糖値降下作用のある血糖値降下剤、血糖値降下方法、ＤＰＰ４を阻害する方法、及び血糖値降下飲食品組成物を提供する。

本発明は以下の態様を包含する。
[1] Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害剤。
一態様では、このＤＰＰ４阻害剤に含まれる前記ペプチドは、配列番号１のＮ末端から４残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドであることがより好ましい。
一態様では、このＤＰＰ４阻害剤に含まれる前記ペプチドは、配列番号１のＮ末端から５残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドであることがさらに好ましい。
一態様では、このＤＰＰ４阻害剤に含まれる前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドであることが特に好ましい。
一態様ではまた、このＤＰＰ４阻害剤に含まれる前記ペプチドは、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるペプチドであることが特に好ましい。
[2] Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドを含有するβ−ラクトグロブリン加水分解物を有効成分として含有する、ＤＰＰ４阻害剤。
[3] [1]又は[2]のＤＰＰ４阻害剤を含む、血糖値降下剤。
[4] Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチド又は該ペプチドを含有するβ−ラクトグロブリン加水分解物を、前記ペプチドの含量が添加後の全体量に対して０．０１重量％以上となる量で、飲食品組成物に添加することを含む、飲食品組成物の製造方法。
この方法の一態様では、飲食品組成物は発酵乳飲食品である。またこの方法は、ＤＰＰ４阻害用又は血糖値降下用の飲食品組成物を製造するためのものであり得る。
[5] Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチド又は該ペプチドを含有するβ−ラクトグロブリン加水分解物を、前記ペプチドの含量が添加後の全体量に対して０．０１重量％以上となる量で含む、食品組成物。
この飲食品組成物の一態様は、発酵乳飲食品である。
[6] Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチド又は該ペプチドを含有するβ−ラクトグロブリン加水分解物、及び製剤補助剤からなる、ＤＰＰ４阻害用又は血糖値降下用食品組成物。
[7] [1]又は[2]のＤＰＰ４阻害剤を非ヒト哺乳動物に投与することを含む、ＤＰＰ４活性を阻害する方法。
[8] [1]又は[2]ＤＰＰ４阻害剤又は[3]の血糖値降下剤を高血糖症の非ヒト哺乳動物に投与することを含む、血糖値を降下させる方法。

本発明はさらに以下の態様をも包含する。

本発明の一態様は、少なくともＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒのアミノ酸配列を有するペプチド化合物からなる血糖値降下剤である。

また、本発明の別の態様は、少なくともＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒのアミノ酸配列を有するペプチド化合物の有効量を哺乳動物に投与することからなる血糖値降下方法である。

さらに、本発明の別の態様は、少なくともＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒのアミノ酸配列を有するペプチド化合物の有効量を哺乳動物に投与することからなるＤＰＰ４を阻害する方法である。

上記いずれかの態様において、前記ペプチド化合物はβ−ラクトグロブリンの分解物由来の化合物であることが好ましい。

また、上記ペプチド化合物はＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒのアミノ酸配列のみからなることが好ましい。

また上記いずれかの方法においては、有効量が１〜３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであることが好ましい。

また、本発明の別の態様は、少なくともＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒのアミノ酸配列を有するペプチド化合物を含んでなる血糖値降下飲食品組成物である。

上記血糖値降下飲食品組成物においては、前記ペプチド化合物はβ−ラクトグロブリンの分解物由来の化合物であることが好ましい。

また上記血糖値降下飲食品組成物においては、上記ペプチド化合物はＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒのアミノ酸配列のみからなることが好ましい。

また上記血糖値降下飲食品組成物においては、上記ペプチド化合物は全体量に対して０．０１〜１０ｗｔ％含んでいることが好ましい。

また血糖値降下飲食品組成物が発酵乳飲食品であることが好ましく、ヨーグルト、ヨーグルト飲料等のヨーグルト飲食品であることが更に好ましい。

本発明に係るペプチドは、製造容易でありながら、強力なＤＰＰ４阻害作用を有し、その作用により血糖上昇レベルを抑制し血糖値を効果的に降下させることができる。本発明による血糖値降下剤及び血糖値降下飲食品組成物はβ−ラクトグロブリンの分解物由来の化合物であるために安全性も高く、また高い高血糖値降下作用を示す。

ペプチドＶＡＧＴＷＹを用いたＤＰＰ４酵素阻害活性を示したグラフ図である。ＳＴＺ糖尿病マウスを用いた血糖降下作用を示したグラフ図である。

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に述べる個々の形態には限定されない。なお本明細書では、アミノ酸配列及びそれを構成するアミノ酸残基を、通常のアミノ酸一文字表記又は三文字表記で表している。

本発明は、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドが、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害作用を有するという知見に基づく。すなわち本発明は、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドを含有する、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害剤を提供する。

ここで、「Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列」とは、配列番号１のアミノ酸配列上の、Ｎ末端のＶａｌ（バリン）を含む３アミノ酸残基長以上の部分配列又は全長配列を意味する。具体的には、配列番号１のＮ末端から３残基の連続したアミノ酸配列は、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（一文字表記：ＶＡＧ）であり、同様にＮ末端から４残基の連続したアミノ酸配列は、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（一文字表記：ＶＡＧＴ）であり、Ｎ末端から５残基の連続したアミノ酸配列は、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ（一文字表記：ＶＡＧＴＷ）である。配列番号１のＮ末端から６残基の連続したアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列（全長配列）である。

本発明に係る上記ペプチドのうち、ＤＰＰ４阻害活性の点では、本発明に係るＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から４残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドがより好ましく、同Ｎ末端から５残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドがさらに好ましく、同Ｎ末端から６残基の連続したアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸配列）を含むペプチドがさらに好ましく、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドが特に好ましい。

配列番号１のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドは、３残基長以上であるが、４残基長以上であることが好ましく、５残基長以上であることがさらに好ましく、６残基長以上であることが特に好ましい。該ペプチドは、例えば、３残基長〜３０残基長であってよい。該ペプチドは、好ましくは１５残基長以下であり、より好ましくは１０残基長以下であり、例えば８残基長以下又は６残基長以下である。

配列番号１のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドは、ペプチド固相合成法やペプチド液相合成法等の当業者に周知のペプチド合成法によって常法により合成することができ、例えば市販の自動ペプチド合成機等を用いて容易に合成することができる。

Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチド、例えば配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、タンパク質加水分解物（例えば、β−ラクトグロブリン加水分解物）中に含まれ得る。したがってＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドは、タンパク質加水分解物、例えばβ−ラクトグロブリン加水分解物（β−ラクトグロブリン分解物）由来のペプチドであってよい。タンパク質加水分解物は、例えば、当業者には周知の塩酸分解法等の化学的分解法、熱水抽出法、又はプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）等の酵素を用いた酵素分解法によってタンパク質から調製することができるが、医薬品や食品に使用する場合にはプロテアーゼ処理（酵素分解法）によって調製することが好ましい。タンパク質加水分解物（例えばβ−ラクトグロブリン加水分解物）は、プロテアーゼ、例えばトリプシン、ペプチターゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、アスパルティックプロテイナーゼ、ペプシン、金属プロテイナーゼ、セリンプロテイナーゼキモトリプシン、チオールプロテイナーゼ、パパイン、フィシン、ブロメライン、酸性プロテーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ等でタンパク質（例えばβ−ラクトグロブリン）を処理することによって得ることができる。プロテアーゼは、ウシ、ブタ、ヒト等の各種由来のものを使用することができる。また、β−ラクトグロブリンは、ウシ、水牛、羊、ヤギ、ラクダ、インド牛、ヤク牛、馬、ロバ、トナカイ等の哺乳動物のβ−ラクトグロブリンであってよい。

β−ラクトグロブリン（本明細書では、「β−ＬＧ」と略称する場合がある）は、分子量約１８．３ｋＤａのタンパク質である。ウシβ−ラクトグロブリンのアミノ酸配列は、例えば山内邦男、横山健吉編、ミルク総合事典、朝倉書店、１９９２年、３４頁（アイソフォームＢ）やＮＣＢＩのプロテインデータベースのアクセッション番号１ＱＧ５＿Ａ（アイソフォームＡ；配列番号５）に開示されている。ホエイからβ−ラクトグロブリンを分画する方法については多くの報告〔例えば、桑田有：月刊フードケミカル，２月号，６８（１９９１）；米国特許第５，４２０，２４９号；特開平０７−１２３９２７号公報；特開平０７−２０３８６３号公報等〕があり、また、市販品として数々上市もされている。

例えば、その一例を挙げると、ホエイを限外濾過し、低分子量ホエイタンパク質濃縮物（ＬＷＰＣ）を得た後、ゲル濾過（例えば、ＳｅｐａｃｒｙｌＳ１００やＳｕｐｅｒｄｅｘ７５）に供して、分子サイズに基づき分離する方法がある。

β−ラクトグロブリン加水分解物は、β−ラクトグロブリンの調製物を酵素的もしくは化学的加水分解することにより、又は化学合成、酵素や微生物を利用した生物化学的合成等で調製又は製造することができる。

一態様では、本発明で好ましく使用されるペプチド化合物は少なくともＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒのアミノ酸配列を一部に有するものであり、さらに好ましくはβ−ラクトグロブリンの分解物由来であるペプチド化合物であり、さらには上記Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒのアミノ酸配列のみからなる（以下、ＶＡＧＴＷＹと略称する）ペプチド化合物が最も好ましい。

本発明に係るＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含む上記ペプチドのジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害活性は、当業者に周知のＤＰＰ４活性アッセイ法やＤＰＰ４阻害アッセイ法（Gotoh H. et al., Clin Chem (1988) 34(12):2499-501; Augeri D.J. et al., J Med Chem. (2005) 48(15):5025-5037）を用いて評価することができる。そのようなアッセイを実施するためのキットとして、例えばDPPIV-Glo^TM Protease Assay（Promega）、DPPIV Drug Discovery Kit（Enzo Life Sciences International, Inc.）、DPP (IV) Inhibitor Screening Assay Kit（Cayman Chemical Company）等が市販されており、本発明においてもそれらを使用することができる。具体的には、実施例２に記載のようにしてＤＰＰ４阻害活性を測定することができる。

本発明に係るペプチド、すなわちＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含む上記ペプチドは、そのＤＰＰ４阻害作用に基づき、血糖降下作用を発揮する。具体的には本発明に係るペプチドは、ＤＰＰ４活性の阻害により、インクレチンの分解を抑制して血中インクレチンレベルを上昇させ、インクレチンによるインスリン分泌を増強させ、その結果、血糖値を降下させることができる。したがって本発明に係るペプチドはＤＰＰ４阻害剤又は血糖降下剤として使用することができる。同様の機構に基づくＤＰＰ４阻害剤としては、すでにシタグリプチンやビルダグリプチン等が知られており、血糖降下剤として利用されている。インクレチンによるインスリン分泌はグルコース依存性であり血糖値が低いときはインスリン分泌を促進しないことから、ＤＰＰ４阻害剤（ＤＰＰ４阻害薬）は、高血糖時に選択的に作用し、低血糖を引き起こしにくいという利点を有する。ＤＰＰ４阻害剤はまた、経口投与でき服用容易であること、β細胞保護作用を有すること等の利点を有することも知られている。本発明に係るペプチドはこのようなＤＰＰ４阻害剤の一般的利点に加えて、短いペプチドであるため調製が容易であるという大きな利点も有する。したがって本発明に係るペプチドはＤＰＰ４阻害剤として有用であり、このＤＰＰ４阻害剤は血糖降下剤として非常に有効に使用できる。この血糖降下剤は、高血糖症の被験体（例えば、哺乳動物）に適用するものであることが好ましい。本発明は、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含む上記ペプチドを有効成分として含有するＤＰＰ４阻害剤又は血糖降下剤を提供する。

本発明に係るペプチドの血糖降下活性は、当業者に周知の方法により測定することができ、例えばストレプトゾトシン誘発糖尿病マウス等の糖尿病モデルマウスに本発明に係るペプチドを経口投与し、その後の血糖レベルが、当該ペプチドを投与しない対照の血糖値と比較してどれほど低下したかを測定することにより評価することができる。具体的には、実施例３に記載のようにして行えばよい。実施例３に記載の方法は、ＤＰＰ４の反応基質であるＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡにＤＰＰ４が作用すると、４０５ｎｍで吸光度を有するｐ−ニトロアニリン（以下、ｐ−ＮＡともいう）が遊離することに基づくものである。この酵素反応の系にＤＰＰ４阻害作用を有する物質を添加した場合、遊離するｐ−ＮＡ量の減少を４０５ｎｍの吸光度の減少で検出することができるので、これをもってＤＰＰ４阻害作用を評価することができる。

本発明に係るペプチドを含むＤＰＰ４阻害剤又は血糖降下剤は医薬組成物であり得る。本発明のＤＰＰ４阻害剤又は血糖値降下剤や医薬組成物は、経口投与又は非経口投与（筋肉内、皮下、静脈内、坐薬、経皮等）のいずれでも投与できる。

本発明のＤＰＰ４阻害剤又は血糖値降下剤は、これを含有する医薬品組成物として提供することができる。医薬品の投与形態としては、例えば錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、溶液、シロップ剤、乳液等による経口投与を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って本発明の血糖値降下剤に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、溶媒などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤（製剤補助剤）を用いて製剤化することができる。製剤補助剤は有効成分の活性レベルに本質的に影響を及ぼさない不活性成分であることが好ましい。

本発明の血糖値降下剤は、これを含有する血糖値降下飲食品組成物としても提供することができる。

本発明は、本発明に係るペプチド（Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチド）又は該ペプチドを含有するβ−ラクトグロブリン加水分解物を、前記ペプチドの含量が添加後の全体量に対して０．０１重量％（ｗｔ％）以上（例えば、０．０１重量％〜３０重量％、好ましくは０．０５重量％〜１０重量％、より好ましくは０．０８重量％〜１０重量％、さらに好ましくは０．１重量％〜７重量％、とりわけ好ましくは０．１重量％〜１重量％、例えば０．５重量％〜５重量％）となる量で含む、食品組成物を提供する。なお「添加後の全体量」とは、本発明に係るペプチドを含めた食品組成物の全体の重量（質量）をいう。

本発明はまた、本発明に係る上記ペプチド又は該ペプチドを含有するβ−ラクトグロブリン加水分解物を、前記ペプチドの含量が添加後の全体量に対して０．０１重量％以上（例えば、０．０１重量％〜３０重量％、好ましくは０．０５重量％〜１０重量％、より好ましくは０．０８重量％〜１０重量％、さらに好ましくは０．１重量％〜７重量％、とりわけ好ましくは０．１重量％〜１重量％、例えば０．５重量％〜５重量％）となる量で、飲食品組成物に添加することを含む、飲食品組成物の製造方法も提供する。

飲食品組成物に用いる本発明に係るペプチドは、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上（好ましくは４残基以上、より好ましくは５残基以上、さらに好ましくは配列番号１）の連続したアミノ酸配列を含む本発明に係るペプチドであり、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドも好ましい。

本発明に係る「飲食品組成物」は、任意の飲料、食品及び機能性食品並びにそれらの原料組成物を包含する。本発明に係る「飲食品組成物」は通常は生鮮食品を含まない。本発明の飲食品組成物は、ＤＰＰ４阻害用又は血糖値降下用のものであってよい。血糖値降下用の本発明に係る飲食品組成物を、本明細書では血糖値降下飲食品組成物とも称する。

本発明における「飲食品組成物」の種類は、特に限定されない。例えば本発明に係るペプチドを含む飲料として、発酵乳（ヨーグルトなど）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳など）、お茶系飲料（緑茶、紅茶及びウーロン茶など）、果物・野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどうなどの果汁や、トマト、ニンジンなどの野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ワインなど）、炭酸飲料及び清涼飲料等の飲料を例示することができる。本発明に係るペプチドを含む飲料の原料組成物として、そのような飲料を凍結乾燥等により乾燥させて粉末状にしたもの等も挙げられる。各種飲料の製造法等については、既存の参考書、例えば「最新・ソフトドリンクス」(2003)（株式会社光琳）等を参考にすることができる。

本発明に係るペプチドを含有する食品は、特に限定されず、菓子、チーズやヨーグルト等の乳製品、調味料等であってもよい。とりわけ好適な食品としては、発酵乳飲食品が挙げられる。本発明に係る発酵乳飲食品は、ヨーグルト、ヨーグルト含有食品、又はヨーグルト飲料であってよく、発酵乳の製造用のスターターであってもよい。

また、本発明に係るペプチドを含有する飲食品として、機能性食品も好ましい。本発明の「機能性食品」は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ[特定保健用食品]を含む）及び栄養機能食品を含む保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤などの各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）などのいわゆる健康食品全般を包含する。本発明の機能性食品はまた、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim）が適用される健康食品を包含する。

本発明の機能性食品として好ましいより具体的な例には、病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品等の特別用途食品がある。本発明に係るペプチドは、低血糖等の副作用を低減しながら血糖値上昇を効果的に抑制することができるため、体力の弱い乳幼児、妊婦、授乳婦、高齢者等の高血糖症の軽減のための使用に特に好適である。

本発明の好適な機能性食品としては、乳幼児用サプリメント、妊産婦・授乳婦用サプリメント、高齢者用サプリメント及び病者用サプリメント等が挙げられる。また本発明に係るペプチドを含有する機能性食品の好ましい例として、保健機能食品が挙げられる。保健機能食品は、特定保健用食品（個別許可型）であっても、栄養機能食品（規格基準型）であってもよい。

本発明の機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤、あるいはジェル剤などの製剤の形状であってもよいし、通常の飲食品の形状（例えば、発酵乳、飲料、粉状茶葉、菓子など）であってもよい。

本発明はまた、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチド又は該ペプチドを含有するβ−ラクトグロブリン加水分解物、及び製剤補助剤からなる、ＤＰＰ４阻害用又は血糖値降下用食品組成物も提供する。このようなＤＰＰ４阻害用又は血糖値降下用食品組成物は、好ましくは、上述のような機能性食品（例えば、保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤、ドリンク剤などの各種剤形のもの）及び美容食品等）である。ここで用いる製剤補助剤は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、溶媒などの医薬又は食品製剤の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤（製剤補助剤）である。製剤補助剤は有効成分の活性レベルに本質的に影響を及ぼさない不活性成分であることが好ましい。

本発明の飲食品組成物、例えば血糖値降下飲食品組成物は、カテゴリーや種類に制限はないが特に糖尿病患者用食品に適用することができる。したがって本発明の血糖値降下剤を含有する特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品、介護用食品として直接摂取することにより血糖値コントロール治療を簡便に行うことができる。また、菓子、乳酸菌飲料、チーズやヨーグルト等の乳製品、調味料等であっても良い。

飲食品の形状についても制限はなく、固形、液状、流動食状、ゼリー状、タブレット状、顆粒状、カプセル状など、通常流通し得るあらゆる飲食品形状をとることができる。上記飲食品の製造は、当業者の常法によって行うことができる、糖質、タンパク質、脂質、食物繊維、ビタミン類、生体必須微量金属（硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化マグネシウム、炭酸カリウム等）、香料やその他の配合物を添加することもできる。

また本発明の飲食品組成物、例えば血糖値降下飲食品組成物は、具体的には、各種飲食品、飲食品組成物（例えば、牛乳、清涼飲料、発酵乳（ヨーグルト、ヨーグルト飲料）、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、栄養食品等）に本発明の血糖値降下剤を添加し、これを摂取してもよい。また、その性状についても、通常用いられる飲食品の状態、例えば、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよい。

その他の成分についても特に限定されないが、本発明に係るペプチドを本発明のＤＰＰ４阻害剤又は血糖値降下剤（有効成分）として飲食品組成物に含ませて用いる場合には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を有効成分以外の主成分として使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物；バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。糖質としては一般の糖類、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラルなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、単独でも２種以上を組み合わせても使用することができ、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。

本発明のＤＰＰ４阻害剤又は血糖値降下剤は、その目的、用途（飲食品組成物、治療薬などの医療品組成物）に応じて組成物中の含有量を任意に定めることができる。本発明はこれに限定されないがその含量としては、全体量に対して本発明に係るペプチドの添加量が通常、０．０１〜１０ｗｔ％（重量％）、より好ましくは０．１〜１ｗｔ％となる量であり得る。

本発明はまた、本発明に係るＤＰＰ４阻害剤を被験体に投与することを含む、被験体においてＤＰＰ４活性を阻害する方法も提供する。被験体は、哺乳動物であることが好ましく、非ヒト哺乳動物であり得る。非ヒト哺乳動物は、例えば、チンパンジー等の非ヒト霊長類、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類の他、イヌ、ネコ、ウサギ等であってもよい。

本発明はまた、本発明に係るＤＰＰ４阻害剤又は血糖値降下剤を被験体に投与することを含む、血糖値を降下させる方法も提供する。投与を受ける被験体は、高血糖症であることが好ましい。被験体はまた、哺乳動物であることが好ましく、非ヒト哺乳動物であることがより好ましい。本発明に係るペプチドは、高血糖症の非ヒト哺乳動物を投与対象としたＤＰＰ４阻害剤又は血糖値降下剤に用いるのに好適である。

本発明において「高血糖症」とは、健康個体（対照）と比較して、被験体の空腹時の血中グルコース濃度が継続的に高い（過剰）状態を呈していることを意味する。例えばヒト成人の場合、正常な血糖値は８０〜１１０ｍｇ／ｄｌ（４〜６ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、継続して１２６ｍｇ／ｄｌ（７ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の空腹時血糖値を示す患者は高血糖症と判断され得る。よって例えば、被験体が、健康個体（対照）と比較して１４．５％以上高い血糖値を示す場合、当該被験体は高血糖症であると判断することができる。高血糖症は、糖尿病の他、脳卒中や心筋梗塞、さらに敗血症等の感染症及び／又は炎症の際にも発症する。高血糖状態が継続すると臓器が傷害されるため、迅速かつ効果的に血糖値を降下させることが求められる。したがって本発明において、高血糖症の被験体（好ましくは、高血糖症の非ヒト哺乳動物）は、II型糖尿病、脳卒中、心筋梗塞、又は敗血症等の感染症及び／若しくは炎症性疾患を有していてもよい。高血糖症の被験体は、典型的には、II型糖尿病患者でありうる。

本発明のＤＰＰ４阻害剤又は血糖値降下剤の摂取量及び投与量は、投与経路、ヒトを含む投与対象哺乳動物の年齢、体重、症状など、種々の要因を考慮して、適宜設定することができる。本発明はこれに限定されないが、成人一日あたり、当該血糖値降下剤を好ましくは１〜３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、より好ましくは１００〜３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量を摂取あるいは投与する。しかしながら、長期間に亘って予防及び／又は治療の目的で摂取する場合には、上記範囲よりも少量であってもよい。これにより、ＤＰＰ４を阻害し、血糖値を効果的に下げることができる。

以下、本発明を例を挙げて説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。なお、本明細書において％表示は明示しない場合には重量％を示す。

［実施例１］本発明のペプチド化合物の製造
原料となるβ−ラクトグロブリン（β−ＬＧ）としては、ウシβ−ＬＧであるＢｉｏＰＵＲＥβ−ＬＧ（ＪＥ−００３−３−９２２、ＤＡＶＩＳＣＯ社製）を用いた。またトリプシンはウシ膵臓製ＷＡＰ７９９１（和光純薬製、２００−１３９５３、CAS No. 9002-07-7）を用いた。

[β−ＬＧ分解物の調製]
まずＢｉｏＰＵＲＥβ−ＬＧを５０ｍＬ容のファルコンチューブに１ｇ量り入れた。ついで、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液２０ｍＬを加え溶解した。これにトリプシン１０ｍｇを加え３７℃で２４時間インキュベートした。その後、外温約９０℃で５分間加熱することで、トリプシンを失活させる。得られた溶液を凍結させ凍結乾燥を行った。

[β−ＬＧ分解物の分画]
得られたβ−ＬＧトリプシン分解物（以下、β−ＬＧ分解物とも称する）の凍結乾燥物を溶解し、以下の条件で分画を行った。
Ｃｏｌｕｍｎ：ＸＢｒｉｄｅＢＥＨ１３０ＰＲＥＰＣ１８５μｍ１０×１５０ｍｍ（ｗａｔｅｒｓ）
溶出液Ａ：０．１％ＴＦＡ
溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡ，９０％アセトニトリル
グラジエント：以下の表の条件で変化させた。

１６〜２２分まで溶出した画分を分取後、減圧下濃縮し乾燥した。

得られた分取画分を以下の条件にて再度分画を行った。
Ｃｏｌｕｍｎ：ＸＢｒｉｄｅＢＥＨ１３０ＰＲＥＰＣ１８５μｍ１０×１５０ｍｍ（ｗａｔｅｒｓ）
溶出液Ａ：０．１％ＴＦＡ
溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡ，９０％アセトニトリル
グラジエント：以下の表の条件で変化させた。

１６〜１８．５分まで溶出した画分を分取後、減圧下濃縮し乾燥した。

得られた成分はＬＣ／ＭＳにて分子量を決定した。その結果、当該画分より得られた分析対象物の分子量は６９６．６であった。

β−ＬＧのアミノ酸配列から分子量が６９６．６と同程度になるβ−ＬＧ由来ペプチド断片を予測したところ、上記画分中のペプチドの配列はＶＡＧＴＷＹ（分子量６９５．７９；アミノ酸一文字表記）と推定された。推定された配列を有するペプチドを合成し、先述の分画条件と同じ条件にて分析したところ、保持時間が上記で得た未知化合物と同一であることが判った。この結果と分子量とにより、β−ＬＧ分解物中の当該ペプチド化合物がＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒのアミノ酸配列を有するペプチド化合物であることを確認した。

［実施例２］試験例（１）ＶＡＧＴＷＹ又はβ−ＬＧ分解物のＤＰＰ４阻害作用評価
実施例１で得られたＶＡＧＴＷＹまたはβ−ＬＧ分解物について、下記の方法でＤＰＰ４阻害作用の評価を行った。

本方法は、ＤＰＰ４の反応基質であるＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡにＤＰＰ４が作用すると、４０５ｎｍでの吸光度を有するｐ−ＮＡが遊離することに基づくものである。この酵素反応の系にＤＰＰ４阻害作用を有する物質を添加した場合、遊離するｐ−ＮＡ量の減少を４０５ｎｍの吸光度の減少で検出することができるので、これをもってＤＰＰ４阻害作用を評価することができる。

［酵素阻害活性測定］
［１．試薬］
＜酵素反応用の緩衝液＞
・１Ｍ塩酸：塩酸（和光純薬製、特級、Ｌｏｔ．ＰＫＦ５７８５）９ｍＬに水を加えて１００ｍＬとした。
・０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液：トリスヒドロキシアミノメタン（ＦＷ１２１．１２，和光純薬製、特級、Ｌｏｔ．ＣＥＦ１８９７）を用いて０．１Ｍトリス溶液を調製し、１Ｍ塩酸でｐＨ８．０とした。

＜検量線作成用の標準品＞
・１ｍＭｐ−ニトロアニリン溶液：ｐ−ニトロアニリン（ＦＷ１３８．１２，和光純薬製、特級、Ｌｏｔ．ＡＬＧ００９２）１．３８ｍｇを０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液１０ｍＬで溶解した。

＜ＤＰＰ４の反応基質＞
・１ｍＭＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ溶液：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（ＦＷ３２８．７５，シグマ社製）３．２８ｍｇを０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液１０ｍＬで溶解した。

＜ＤＰＰ４を含有する試薬＞
・人血清：液状コントロール血清１ワコー（和光純薬製）を用いた。

＜試料溶液＞
・合成ペプチド（配列：ＶＡＧＴＷＹ）：０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中に溶解して調製した。
・β−ＬＧ分解物（実施例１で調製したもの）：０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中に溶解して調製した。

なお、試料溶液の調製において、合成ペプチドはＶＡＧＴＷＹの分子量（ＭＷ６９６）、β−ＬＧ分解物はβ−ＬＧの分子量（ＭＷ１８３００）を用いてモル濃度を算出した。

［２．試験方法］
＜ｐ−ＮＡ検量線の作成＞
１ｍＭｐ−ニトロアニリン溶液１０、２０、３０、４０、５０μＬをウェルに入れ、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にて全量を１００μＬとした。さらに１ｍＭＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ溶液１００μＬを各ウェルに加えた。各ウェルについて、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。この値によりｐ−ＮＡの検量線を作成した。

＜ＤＰＰ４酵素反応＞
（１．試験液の調製：人血清中のＤＰＰ４活性測定用）
人血清５０μＬをウェルに入れ、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液５０μＬを加えて全量を１００μＬとした。さらに１ｍＭＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ溶液１００μＬを各ウェルに加えた。このウェルを阻害率０％の対照として用いた。また、１ｍＭＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ溶液の代わりに０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００μＬを加えたブランクを調製したウェルも設けた。

（２．試験液の調製：試料の酵素阻害試験用）
試料溶液５０μＬ（濃度は任意に調整）をウェルに入れ、人血清５０μＬを各ウェルに加えて全量を１００μＬとした。さらに１ｍＭＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ溶液１００μＬを各ウェルに加えた。このとき各ウェルの試料濃度は、合成ペプチド（配列：ＶＡＧＴＷＹ）は１０、５０、２５０、１２５０μＭ、β−ＬＧ分解物（実施例１で調製したもの）は１１．１２、５５．６、２７８μＭであった。

（３．酵素反応）
試料溶液に人血清とＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ溶液を加えた後、３７℃でこの試料を３０分間インキュベートして酵素反応させた。

＜遊離したｐ−ＮＡの算出〜ＤＰＰ４阻害活性の評価＞
酵素反応後すみやかに、各ウェルについて４０５ｎｍの吸光度を測定した。この測定値に基づき、ｐ−ＮＡについて上記のように作成した検量線を用いて、試験において遊離したｐ−ＮＡ量を算出した。得られたｐ−ＮＡ量からＤＰＰ４阻害活性を評価した。具体的には、人血清とＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡのみで酵素反応させたウェルの値[A]、ブランクのウェルの吸光度[B]、人血清、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡおよび試料で酵素反応させたウェルの値[C]を次式に当てはめてＤＰＰ４抑制率（％）を算出した。さらに、各試料の濃度とＤＰＰ４抑制率の関係から、各試料のＩＣ₅₀値を算出した。

[結果]
得られた結果を図１にグラフとして示す。なお本試験に使用した試料には前記実施例１で得られたペプチドＶＡＧＴＷＹとβ−ＬＧ分解物とを用いた。また、グラフ中の印の黒三角はペプチドＶＡＧＴＷＹ、黒四角はβ−ＬＧ分解物の結果を示す。

上記の方法によりｉｎｖｉｔｒｏでヒト型ＤＰＰ４（ジペプチジルペプチダーゼ４）阻害作用を評価したところ、ペプチド及びβ−ＬＧ分解物のＩＣ₅₀値（酵素活性を５０％阻害する濃度）がそれぞれ１７４μＭ、２１０μＭであることが明らかになった（図１）。ＩＣ₅₀値が近似した値であることから、β−ＬＧ分解物における効果発現はペプチドＶＡＧＴＷＹによるものと推察される。すなわち、β−ＬＧ分解物のＤＰＰ４（ジペプチジルペプチダーゼ４）阻害活性は、ほぼペプチドＶＡＧＴＷＹの阻害活性で担保できると考えられる。

以上より、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−ＴｙｒのペプチドがＤＰＰ４（ジペプチジルペプチダーゼ４）阻害活性を有することが示された。このペプチドは、インスリン分泌を刺激するインクレチンのＤＰＰ４による分解を抑制し、血糖値降下作用を有すると考えられた。

［実施例３］試験例（２）
ＳＴＺ糖尿病マウス（ストレプトゾトシン誘発糖尿病マウス）を用いてペプチドＶＡＧＴＷＹの血糖降下作用について調べた。

[ＳＴＺ糖尿病マウスの作製]
6週齢の雄性ddy系マウスを１週間訓化飼育し、体重測定の後にストレプトゾトシン（Sigma社）を尾静脈より４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。ストレプトゾトシン投与から２日後に、摂食時の血糖値を測定し、血糖値が１５０〜２５０ｍｇ／ｄｌのマウスを選抜した。このようにして糖尿病の発症を確認できたマウス（全４群、各群１０匹）を１晩絶食し、後述の試験に用いた。

[血糖降下試験]
前記ＳＴＺ糖尿病マウスに、実施例１で得られたβ−ＬＧ分解物（ペプチド化合物ＶＡＧＴＷＹを含む）１００、３００、１０００ｍｇを実施例２に記載の０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に溶解し、投与容量１０ｍＬ／ｋｇで経口投与を行った。β−ＬＧ分解物を１００、３００、１０００ｍｇ投与した群を、以降、それぞれ100mg/kg投与群、300mg/kg投与群、1,000mg/kg投与群とする。また、対照（Control）群には、前記０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を１０ｍＬ／ｋｇ投与した。β−ＬＧ分解物又は０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液（対照）を投与後すみやかに、スターチ２ｇ／ｋｇを１０ｍＬ／ｋｇの容量で経口投与した。スターチの投与後３０分、６０分、９０分及び１２０分に採血を行い、各時点における血糖値を測定した。

[結果]
得られた結果を図２に示す。図２において、値は全て平均値±標準誤差で示した（ｎ＝１０）。β−ＬＧ分解物（ペプチドＶＡＧＴＷＹを含む）1,000mg/kg投与群では、＊印で示すように、対照群に比較して危険率５％で有意差が認められた。さらに300mg/kg投与群では、（＊）印で示すように、対照群に比較して危険率１０％で血糖値低下傾向が認められた。このように、本発明のペプチドＶＡＧＴＷＹを含むβ−ＬＧ分解物は有意に血糖値降下作用を示すことが示された。

［実施例４］試験例（３）
ＶＡＧＴＷＹ由来の部分ペプチド（３残基長：ＶＡＧ、ＡＧＴ、ＧＴＷ、ＴＷＹ、４残基長：ＶＡＧＴ、ＡＧＴＷ、ＧＴＷＹ）について、実施例２と同様の方法に従ってジペプチジルペプチダーゼ４阻害活性を評価した。

[被検物質]
それぞれのペプチド（ＶＡＧ、ＡＧＴ、ＧＴＷ、ＴＷＹ、ＶＡＧＴ、ＡＧＴＷ、ＧＴＷＹ）は、ベックス社への委託合成により入手した。ペプチドＩＰＩ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、Sigma-Aldrich社）は、Pascal Rigoletらの報告（FEBS Journal, 272,pp.2050-2059(2005)）に記載されたジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害活性ペプチドであり、陽性対照として使用した。

［酵素阻害活性測定］
実施例２と同様の方法によりｉｎｖｉｔｒｏでヒト型ジペプチジルペプチダーゼ４阻害作用を評価した。

[結果]
結果を表３に示す。ＶＡＧ及びＶＡＧＴのＩＣ₅₀値がそれぞれ１１３６μＭ、４８４μＭであることが示された。他のペプチドではｐ−ＮＡ測定値が減少せず、ＩＣ₅₀値の測定が不能であった（表３中、n.d.として表記した）。すなわち、Ｎ末端を有しない部分ペプチドはＤＰＰ４阻害活性を示さなかった。

この結果、ペプチドＶＡＧＴＷＹのＮ末端を含むペプチド断片はジペプチジルペプチダーゼ４阻害作用を保持することが示された。また、ペプチドＶＡＧＴＷＹのＮ末端含有断片の中では、断片長が長くなるほど阻害活性が高いことが示された。

本発明に係るペプチドを用いれば、副作用が軽減されるＤＰＰ４阻害に基づく血糖値降下剤を、簡便に製造することができる。本発明による血糖値降下剤及び血糖値降下飲食品組成物はβ−ラクトグロブリンの分解物由来の化合物であるために安全性も高く、また高い血糖値降下作用を示すことから、その利用価値は高い。

Claims

Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害剤。
前記ペプチドが配列番号１のＮ末端から４残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載のＤＰＰ４阻害剤。
前記ペプチドが配列番号１のＮ末端から５残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１又は２に記載のＤＰＰ４阻害剤。
前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＰＰ４阻害剤。
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害剤。
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチドを含有するβ−ラクトグロブリン加水分解物を有効成分として含有する、ＤＰＰ４阻害剤。
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＰＰ４阻害剤を含有する、血糖値降下剤。
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチド又は該ペプチドを含有するβ−ラクトグロブリン加水分解物を、前記ペプチドの含量が添加後の全体量に対して０．０１重量％以上となる量で、飲食品組成物に添加することを含む、飲食品組成物の製造方法。
飲食品組成物が発酵乳飲食品である、請求項８に記載の方法。
飲食品組成物がＤＰＰ４阻害用又は血糖値降下用のものである、請求項８又は９に記載の方法。
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチド又は該ペプチドを含有するβ−ラクトグロブリン加水分解物を、前記ペプチドの含量が添加後の全体量に対して０．０１重量％以上となる量で含む、食品組成物。
飲食品組成物が発酵乳飲食品である、請求項１１に記載の食品組成物。
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号１）のＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチド又は該ペプチドを含有するβ−ラクトグロブリン加水分解物、及び製剤補助剤からなる、ＤＰＰ４阻害用又は血糖値降下用食品組成物。
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＰＰ４阻害剤を非ヒト哺乳動物に投与することを含む、ＤＰＰ４活性を阻害する方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＰＰ４阻害剤又は請求項７に記載の血糖値降下剤を高血糖症の非ヒト哺乳動物に投与することを含む、血糖値を降下させる方法。