JP2011062197A - 生体試料定量方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生体試料定量用チップは、検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップであって、複数の反応容器を含み、複数の反応容器は、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能であって、標的核酸とは異なる配列を有する既知量の競合核酸と、標的核酸および競合核酸に共通のプライマーと、標的核酸および競合核酸の増幅産物の一部に結合し、標的核酸の増幅産物と競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、を含み、各々の反応容器に含まれる競合核酸の量が異なる。
【選択図】図1
Description
ゲットのDNAおよび試薬を混合したものをチューブに入れ、サーマルサイクラーという温度制御装置で、例えば55℃、72℃、94℃の3段階の温度変化を数分の周期で繰り返し反応させるもので、酵素(DNAポリメラーゼ)の作用により温度サイクル1回あたり、ターゲットDNAだけを約2倍に増幅することができる。
検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップであって、
複数の反応容器を含み、
前記複数の反応容器は、
前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する既知量の競合核酸と、
前記標的核酸および前記競合核酸に共通のプライマーと、
前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
各々の前記反応容器に含まれる前記競合核酸の量が異なる。
前記複数の反応容器に接続された反応容器導入流路と、前記反応液導入用流路に接続された反応液収容部と、廃液収容部と、をさらに含むことができる。
検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップであって、
第1の反応容器と、
第2の反応容器と、
を備え、
前記第1の反応容器は、
前記標的核酸を増幅させるプライマーと、
前記プライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する第1の量の競合核酸と、
前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
前記第2の反応容器は、
前記第1の量とは異なる第2の量の前記競合核酸と、
前記プライマーと、
前記蛍光プローブと、
を含む。
上記第1の態様に係る生体試料定量用チップを用いて、検体に含まれる標的核酸の定量を行う生体試料定量方法であって、
前記複数の反応容器にそれぞれ検体を導入する工程と、
前記複数の反応容器内で核酸増幅反応を行う工程と、
各々の前記反応容器内において、増幅された核酸の一部に結合した前記蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する工程と、
各々の前記反応容器内で測定された前記蛍光強度および各々の前記反応容器で用いた前記競合核酸の量に基づいて、下記式(1)で表される回帰曲線を求める工程と、
前記回帰曲線に基づいて、前記検体に含まれる標的核酸の量を推定する工程と、
を含む。
(式中、Fは蛍光強度を示し、Cは競合核酸の量を示し、bは検体に含まれる標的核酸の量を示し、aおよびcは所定の値を示す。)。
前記回帰曲線を求める工程では、前記核酸増幅反応の前に測定された蛍光強度と、前記核酸増幅反応の後に測定された蛍光強度との比と、各々の前記反応容器で用いた前記競合核酸の量との関係に基づいて該回帰曲線を求めることができる。
検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップを用いて、前記検体に含まれる標的核酸の定量を行う生体試料定量方法であって、
前記生体試料定量用チップは、第1の反応容器と第2の反応容器とを備え、前記第1の反応容器は、前記標的核酸を増幅させるプライマーと、前記プライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する第1の量の競合核酸と、前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、を含み、前記第2の反応容器は、前記第1の量とは異なる第2の量の前記競合核酸と、前記プライマーと、前記蛍光プローブとを含み、
前記第1および第2の反応容器に前記検体を導入することと、
前記第1および第2の反応容器で核酸増幅反応を行うことと、
前記第1および第2の反応容器において、増幅された核酸の一部に結合した前記蛍光プローブが発する蛍光強度を測定することと、
前記第1および第2の反応容器で測定された前記蛍光強度並びに前記第1および第2の反応容器に含まれる前記競合核酸の量に基づいて、下記式(1)で表される回帰曲線を求めることと、
前記回帰曲線に基づいて、前記検体に含まれる標的核酸の量を推定することと、
を含む。
(式中、Fは前記蛍光強度を示し、Cは前記競合核酸の量を示し、bは前記検体に含まれる前記標的核酸の量を示し、aおよびcは所定の値を示す。)。
1.1.生体試料定量用チップの構成
図1(A)は、本発明の一実施形態に係るマイクロリアクターアレイ(生体試料定量用チップ)10の概略構成を示す平面図であり、図1(B)は、図1(A)のC−C断面図である。
本発明の一実施形態に係る生体試料定量方法は、本実施形態に係るマイクロリアクターアレイ(生体試料定量用チップ)10を用いて、検体に含まれる標的核酸の定量を行う生体試料定量方法であって、複数の反応容器104にそれぞれ検体を導入する工程と、複数の反応容器104内で核酸増幅反応を行う工程と、各々の反応容器104内において、増幅された核酸の一部に結合した蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する工程と、各々の反応容器104内で測定された蛍光強度および各々の反応容器104で用いた競合核酸の量に基づいて、下記式(1)で表される回帰曲線を求める工程と、回帰曲線に基づいて、検体に含まれる標的核酸の量を推定する工程と、を含む。
(式中、Fは蛍光強度を示し、Cは競合核酸の量を示し、bは検体に含まれる標的核酸の量を示し、aおよびcは所定の値を示す。)。
まず、マイクロリアクターアレイ10の反応容器104に検体を導入する工程について説明する。本実施形態においては、検体から調製された反応液を反応容器104に充填する方法を説明する。最初に、反応液供給口109から、ピペット等を用いて反応液収容部107に反応液を供給する。
本実施形態に係る生体試料定量方法はさらに、複数の反応容器104内で核酸増幅反応を行う工程と、各々の反応容器104内において、増幅された核酸の一部に結合した蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する工程と、各々の反応容器104内で測定された蛍光強度および各々の反応容器104で用いた競合核酸の量に基づいて、上記式(1)で表される回帰曲線を求める工程と、回帰曲線に基づいて、検体に含まれる標的核酸の量を推定する工程と、を含む。
=〔X(Ft−Fc)/(X+C)〕+Fc ・・・・・(2)
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
リアクターアレイ10を用いてPCR法により検体中の標的核酸を定量する方法について説明する。
する。よって、標的核酸および競合核酸の両方にQ-Probeが結合できるようにし、
さらに、Q-Probeがどちらか一方と結合した際に蛍光の消光が発生するようにして
おくことにより、既知の競合核酸の量に対する標的核酸の相対量を推定することができる。
Cl2:1.5mMの混合液を使用した。
eが結合する。図6に示されるように、蛍光プローブの結合部分(下線部分)の直後が、標的核酸は「TTTT」、競合核酸は「GGGT」となっている。したがって、Q-Pr
obeは競合核酸と結合した際に、結合部分のグアニン(G)と反応するため、蛍光が消光する。
PY FL( Molecular probes社製)を用いて蛍光標識したものを使用
した。
配列番号2は、競合核酸の配列である。
配列番号3は、フォワードプライマーの配列である。
配列番号4は、リバースプライマーの配列である。
配列番号5は、Q−Probeの配列である。
Claims (8)
- 検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップであって、
複数の反応容器を含み、
前記複数の反応容器は、
前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する既知量の競合核酸と、
前記標的核酸および前記競合核酸に共通のプライマーと、
前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
各々の前記反応容器に含まれる前記競合核酸の量が異なる、生体試料定量用チップ。 - 請求項1において、
前記複数の反応容器に接続された反応容器導入流路と、
前記反応液導入用流路に接続された反応液収容部と、
廃液収容部と、
をさらに含む、生体試料定量用チップ。 - 請求項1または2において、
前記複数の反応容器から構成される反応容器群を複数含み、
1の反応容器群を構成する前記複数の反応容器には、同一の標的核酸を増幅させる同一のプライマーが配置され、
別の1の反応容器群を構成する前記複数の反応容器には、前記1の反応容器群を構成する反応容器にて増幅される標的核酸とは異なる標的核酸を増幅させる、異なるプライマーが配置されている、生体試料定量用チップ。 - 検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップであって、
第1の反応容器と、
第2の反応容器と、
を備え、
前記第1の反応容器は、
前記標的核酸を増幅させるプライマーと、
前記プライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する第1の量の競合核酸と、
前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
前記第2の反応容器は、
前記第1の量とは異なる第2の量の前記競合核酸と、
前記プライマーと、
前記蛍光プローブと、
を含む、生体試料定量用チップ。 - 請求項1ないし3のいずれか1項に記載の生体試料定量用チップを用いて、検体に含まれる標的核酸の定量を行う生体試料定量方法であって、
前記複数の反応容器にそれぞれ検体を導入する工程と、
前記複数の反応容器内で核酸増幅反応を行う工程と、
各々の前記反応容器内において、増幅された核酸の一部に結合した前記蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する工程と、
各々の前記反応容器内で測定された前記蛍光強度および各々の前記反応容器で用いた前記競合核酸の量に基づいて、下記式(1)で表される回帰曲線を求める工程と、
前記回帰曲線に基づいて、前記検体に含まれる標的核酸の量を推定する工程と、
を含む、生体試料定量方法。
F=a/(C+b)+c ・・・・・(1)
(式中、Fは蛍光強度を示し、Cは競合核酸の量を示し、bは検体に含まれる標的核酸の量を示し、aおよびcは所定の値を示す。)。 - 請求項5において、
前記回帰曲線を求める工程では、前記核酸増幅反応の前に測定された蛍光強度と、前記核酸増幅反応の後に測定された蛍光強度との比と、各々の前記反応容器で用いた前記競合核酸の量との関係に基づいて該回帰曲線を求める、生体試料定量方法。 - 請求項6において、
前記回帰曲線を求める工程では、前記核酸増幅反応後において前記蛍光プローブが増幅された核酸の一部に結合している第1の状態で測定された蛍光強度と、前記核酸増幅反応後において前記蛍光プローブが増幅された核酸から解離している第2の状態で測定された蛍光強度との比と、各々の前記反応容器で用いた前記競合核酸の量との関係に基づいて該回帰曲線を求める、生体試料定量方法。 - 検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップを用いて、前記検体に含まれる標的核酸の定量を行う生体試料定量方法であって、
前記生体試料定量用チップは、第1の反応容器と第2の反応容器とを備え、前記第1の反応容器は、前記標的核酸を増幅させるプライマーと、前記プライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する第1の量の競合核酸と、前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、を含み、前記第2の反応容器は、前記第1の量とは異なる第2の量の前記競合核酸と、前記プライマーと、前記蛍光プローブとを含み、
前記第1および第2の反応容器に前記検体を導入することと、
前記第1および第2の反応容器で核酸増幅反応を行うことと、
前記第1および第2の反応容器において、増幅された核酸の一部に結合した前記蛍光プローブが発する蛍光強度を測定することと、
前記第1および第2の反応容器で測定された前記蛍光強度並びに前記第1および第2の反応容器に含まれる前記競合核酸の量に基づいて、下記式(1)で表される回帰曲線を求めることと、
前記回帰曲線に基づいて、前記検体に含まれる標的核酸の量を推定することと、
を含む、生体試料定量方法。
F=a/(C+b)+c ・・・・・(1)
(式中、Fは前記蛍光強度を示し、Cは前記競合核酸の量を示し、bは前記検体に含まれる前記標的核酸の量を示し、aおよびcは所定の値を示す。)。
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