JP5202686B2 - 酸素反応及び/又は分子生物学反応を実施するための装置および核酸を増幅するための方法および充填のためのプロセス - Google Patents
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Description
Xn−1は、先行サイクルにおいて得られた産物の数量であり、rnはサイクルn(0<rn≦1)内のPCR収率である。
Xn=X0(1+r)n (A)
log(Xn)=log(X0)+ n log(1+r)
・ 複数の反応チャンバ(13)及びタンク(11)を有し、この反応チャンバが流路(12)を介してタンクに連結されている、少なくとも1つのプレート又はカートリッジ(1);
・ 少なくとも2つの異なる温度まで加熱され得る少なくとも2つの別個のゾーンを有する少なくとも1つの加熱用プレート(2);
・ 反応チャンバの温度の周期的変動を可能にする、前記カートリッジと前記プレートの間の相対的変位用手段、
を含むことを特徴とする装置に関する。
・ 複数の反応チャンバ(13)及びタンク(11)を有し、この反応チャンバが流路(12)を介してタンクに連結されている、少なくとも1つのカートリッジ(1);
・ 前記標的核酸のための増幅サイクルに対応する、少なくとも2つの異なる温度まで加熱され得る少なくとも2つの別個のゾーンを有する少なくとも1つの加熱用プレート(2);
・ 反応チャンバの温度の周期的変動を可能にする、前記カートリッジと前記プレートとの間の相対的変位用手段(3)、
を含むことを特徴とする装置に関する。
・ 増幅すべき標的配列に特異的なプライマーが、反応チャンバ(13)内で予め分配されること、
・ タンク(11)は、分析対象核酸の標本と、プライマーを除いて、ポリメラーゼ連鎖増幅反応のために必要とされる試薬とで構成された流体を収容することを意図されたものであること;
・ 加熱用プレート(2)が、ポリメラーゼ連鎖増幅サイクルの3つの段階、に対応する3つの異なる温度まで加熱できる3つの別個のゾーンを有すること。
・ 各反応チャンバが直径3mm未満の円内に含まれた断面を有する流路(12)を介してタンクに接続されていること;
・ タンクの容量が10ml未満であること;
・ タンクとの関係における反応チャンバと流路との配置が、タンクから反応チャンバ内に流体を均等に分配できるようにしていること、
を特徴とする反応カートリッジを提供する。
・ タンク(11)に少なくとも部分的に流体を充填する段階;
・ 圧力を調整するための手段(4)にカートリッジ(1)を接続する段階;
・ カートリッジの内部に負圧を加え、次に圧力を回復する段階、
を含む方法、にも関する。
・ プライマーそして任意には蛍光挿入剤を除いて、増幅反応のために必要とされる全てのもの及び分析対象核酸標本を含む流体をタンク(11)に少なくとも部分的に充填する段階;
・ プライマーそして任意には標識核酸配列に特異的な1以上の標識づけされたプローブが中に分配されているカートリッジ(1)内に設けられた反応チャンバ(13)内にまで前記流体を分配する段階;
・ カートリッジと加熱用プレートとの間の相対的変位のための手段(3)を利用して、所望の回数だけ前記加熱用プレートの2つ、3つ又はそれ以上のゾーンにより画定された温度まで各チャンバの中味を連続的に誘導する段階、
を含むことを特徴とするプロセスにも関する。
図1に示されている標的核酸配列を検出しかつ定量するためのシステムは、直径5cmで厚み2mmのプラスチック材料の円形カートリッジを含む。このカートリッジ(1)には中央タンク(11)が設けられており、これについては、図3及び4を参考にしてより詳しく記述する。当該実施形態においては、タンクの容量は400μlである。その底は平坦であるが、その他の実施形態においては、特にタンクがほぼ空になる分配の終りで気泡が形成されることなく流路内に流体が容易に通過できるように半球形をしていてもよい。
dNTP: 200μM
Taq緩衝液: 1x
MgCl2 : 15mM
Taq: 4U
SybrGreen(登録商標): 1x
H2O: 充分量
図5〜10は、例1のカートリッジに対するいくつかの修正を伴う円形カートリッジの例を示している。
DUTP: 400μM
dNTPs: 200μM
Taq緩衝液: 1x
MgCl2 : 3mM
Taq: 15U
TWEEN(登録商標):0.007%
SybrGreen(登録商標): 0.1x
Salmonella enteritidisからのゲノミックDNA:1ng
H2O: 充分量
図11に例示されているこの例においては、タンクはもはや中央にはなく、一方の側にあり、カートリッジの運動はもはや必ずしも回転運動ではなく並進運動でもあり得る。
Claims (41)
- 少なくとも2つの異なるインキュベーション温度を必要とする、酵素反応及び/又は分子生物学反応を実施するための装置において:
複数の反応チャンバ、タンク、流路を備える円形カートリッジであって、
(i)前記円形カートリッジは、回転幾何学的配置を有し、前記タンクは、前記カートリッジの中心に配置され、前記反応チャンバは、前記タンクの周りで円状に配置され、前記チャンバに前記タンクを連結させる前記流路は、放射状になっており、
(ii)前記流路と前記タンクとの間の接合部は、前記タンクの周りで形成され、
(iii)各反応チャンバは、前記流路を介して前記タンクに連結され、前記流路は、3mm未満の直径に嵌合し、
(iv)前記タンクの容量は、10ml未満である;
前記円形カートリッジと;
少なくとも2つの異なる温度まで加熱され得る少なくとも2つの別個のゾーンを有する固定された加熱用プレートと;
前記カートリッジを回転させ、前記反応チャンバの温度の周期的変動を可能にする、相対的変位用手段と;
を含む、装置。 - 前記酵素反応は、核酸配列の熱依存性連鎖増幅であり、かつ、加熱用プレートのゾーンは、核酸増幅サイクル内の段階に対応する少なくとも2つの異なる温度まで加熱され得る、請求項1に記載の装置。
- 前記反応チャンバ内で予め分配される、増幅すべき標的配列に特異的なプライマーを含み、
前記タンクは、分析対象核酸の標本、プライマーを除いてポリメラーゼ連鎖増幅反応のために必要とされる試薬で構成された流体を収容し、
前記加熱用プレートは、ポリメラーゼ連鎖増幅サイクルの3つの段階に対応する3つの異なる温度まで加熱できる3つの別個のゾーンを含む、請求項2に記載の装置。 - 各サイクル内で前記反応チャンバの中味の蛍光を励起しかつ測定するべく配置された蛍光励起/測定用の光学手段を含む、核酸配列の実時間熱依存性連鎖増幅のための、請求項2又は3に記載の装置。
- 前記プレートを加熱するための別個のゾーンが、少なくとも2つの円盤部分に対応して配置される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の装置。
- 前記プレートを加熱するための別個のゾーンが、少なくとも2つ又は3つの円盤部分に対応して配置される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の装置。
- 前記カートリッジが加熱用プレートと直接接触している、請求項1〜6のいずれか一項に記載の装置。
- 前記加熱用プレートは、前記カートリッジと前記プレートとの間の相対的変位を促進するコーティングを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の装置。
- 前記加熱用プレートは、その温度を定めるための手段に接続された2つ又は3つの別個のサーモブロックを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の装置。
- 前記カートリッジの底面は、切欠きを含む中央突出部分を有し、かつ、前記変位用手段は、前記カートリッジを回転運動で移動させるように前記切欠きと連動する少なくとも1つの駆動機構を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の装置。
- 前記カートリッジの上に又は側面に配置された蛍光励起/測定のための光学手段を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の装置。
- 前記タンク内に存在する流体を前記反応チャンバに供給するための手段をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の装置。
- 前記供給するための手段がピストン装置を含み、かつ、圧力を増大させることにより前記反応チャンバに対し前記流体が供給される、請求項12に記載の装置。
- 前記供給するための手段がポンプを含み、かつ、負圧を確立した後に前記圧力を回復することにより前記反応チャンバに前記流体が供給される、請求項13に記載の装置。
- 前記カートリッジの前記反応チャンバが閉鎖される、請求項14に記載の装置。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載の装置を用いて核酸を増幅するための方法であって、
プライマーそして任意には蛍光核酸リポーターを除いて、増幅反応を実施するのに必要な成分及び分析対象核酸標本を含む流体をタンクに少なくとも部分的に充填する段階と;
プライマー及び任意の1以上の標識づけされたプローブが中で位置付けられたカートリッジの反応チャンバまで前記流体を分配する段階と;
カートリッジと加熱用プレートとの間の相対的変位のための手段を利用して、所望の回数だけ前記加熱用プレートの2つ、3つ又はそれ以上のゾーンにより画定された2つ、3つ又はそれ以上の温度まで各反応チャンバの中味を連続的に導く段階と;
を含む、核酸を増幅するための方法。 - 前記反応チャンバに流体を分配するための段階が、前記カートリッジ内部で負圧を加え、その後、圧力を回復することによって実施される、請求項16に記載の核酸を増幅するための方法。
- 閉鎖システムにおいて請求項1に記載の装置に含まれる円形カートリッジ内の反応チャンバの充填のためのプロセスであって、
前記タンクに少なくとも部分的に流体を充填する段階と;
圧力を調整するための手段に前記円形カートリッジを接続する段階と;
前記円形カートリッジの内部に負圧を加え、次に圧力を回復する段階と;
を含む、充填のためのプロセス。 - 少なくとも2つの異なるインキュベーション温度を必要とする、酵素反応及び/又は分子生物学反応を実施するための装置であって:
(i)プライマーが予め堆積される複数の反応チャンバを備える円形カートリッジと、
(ii)タンク及び流路であって、前記円形カートリッジは、回転幾何学的配置を有し、前記タンクは、前記カートリッジの中心に設置され、前記反応チャンバは、前記タンクの周りで円状に配置され、前記チャンバに前記タンクを連結させる前記流路は、放射状になっている、前記タンク及び流路と、
(iii)少なくとも2つの異なる温度まで加熱され得る少なくとも2つの別個のゾーンを有する固定された加熱用プレートと、
(iv)前記カートリッジを回転させ、前記反応チャンバの温度の周期的変動を可能にする、相対的変位用手段と、
を備える、前記装置。 - 前記カートリッジの流路の直径は、0.2mm以下である、請求項1に記載の装置。
- 前記カートリッジのタンクの容量は、0.1mlから1mlの範囲内にある、請求項1又は20に記載の装置。
- 20から500個のカートリッジの反応チャンバを備える、請求項1,20〜21のいずれか一項に記載の装置。
- 前記カートリッジの反応チャンバの容積が、0.2μl〜50μlの範囲内にある、請求項1,20〜22のいずれか一項に記載の装置。
- 前記タンクのベースは、円錐形である、請求項1,20〜23のいずれか一項に記載の装置。
- 前記反応チャンバは、前記カートリッジの周りで配置される、請求項1,20〜24のいずれか一項に記載の装置。
- 1cmから10cmの範囲内の直径を有する、請求項1,20〜25のいずれか一項に記載の装置。
- 前記タンクが2〜8個のサブタンクに分割され、かつ、前記反応チャンバの各々が流路を介して前記サブタンクの1つのみに連結されている、請求項1,20〜26のいずれか一項に記載の装置。
- 前記反応チャンバの深さが0.5〜1.5mmの範囲内にある、請求項1,20〜27のいずれか一項に記載の装置。
- プラスチック材料から製造されている、請求項1,20〜28のいずれか一項に記載の装置。
- 厚みが0.5〜5mmの範囲内にある、請求項1,20〜29のいずれか一項に記載の装置。
- 前記反応チャンバの底が0.05〜0.5mmの範囲内の厚みをもつ、請求項1,20〜30のいずれか一項に記載の装置。
- 前記反応チャンバが上部透明壁によって閉じられる、請求項1,20〜31のいずれか一項に記載の装置。
- 前記反応チャンバにはベントが設けられている、請求項1,20〜32のいずれか一項に記載の装置。
- 前記反応チャンバが閉じられている、請求項1,20〜33のいずれか一項に記載の装置。
- 前記タンクが、前記タンク内の圧力を調整するための手段に適合されうる開口部を含む、請求項1,20〜34のいずれか一項に記載の装置。
- 各流路が、異なる直径を有する少なくとも第1の部分と第2の部分によって構成され、前記第2の部分の直径が、前記流路内で圧力降下が生じるように前記第1の部分の直径よりも小さい、請求項1,20〜35のいずれか一項に記載の装置。
- タンクとの接合部で各流路に逆流防止キャビティが具備され、前記逆流防止キャビティが前記流路の直径以上の直径を備えた実質的に垂直な流路部分により構成されている、請求項1,20〜36のいずれか一項に記載の装置。
- 前記反応チャンバの少なくとも一部分がオリゴヌクレオチドを含む、請求項1,20〜37のいずれか一項に記載の装置。
- 各反応チャンバが、増幅すべき核酸配列に特異的な2つのプライマーを含む、請求項1,20〜38のいずれか一項に記載の装置。
- 前記反応チャンバの少なくとも1部分は、液体を置いた後に乾燥させることで内部に置かれている試薬を収容しており、かくして前記反応チャンバ内に流体が到達したことで前記試薬が再び溶液内に取込まれるようになっている、請求項1,20〜39のいずれか一項に記載の装置。
- 各反応チャンバが、前記配列に特異的な標識付けされたプローブを更に含む、請求項39に記載の装置。
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