JP2011057556A - 新規なCa2+シグナル伝達阻害剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】琥珀の抽出物を有効成分とすることを特徴とするCa2+シグナル伝達阻害剤。具体的にはデヒドロアビエチン酸および/またはピマール酸、或いは次式(1)
で示される化合物を有効成分とする。
【選択図】なし
Description
また、Ca2+の細胞内への流入の調節機能の一つに、電位依存型L型Ca2+チャネルがある。このチャンネルに結合してCa2+の細胞内への流入を抑制する物質は、心筋や血管などの平滑筋細胞でCa2+と拮抗し、虚血性心疾患、高血圧、末梢血管障害、脳血管障害、心不整脈などに対する予防薬や治療薬として有用である。
さらに、Ca2+シグナル伝達系は、MAPキナーゼ(Mitogen Activated Protein kinase)であるMpk1を活性化することから、Ca2+シグナル伝達を抑制する物質は、その活性化調節が異常となった各種の癌に対する予防薬や治療薬として有用である。また、Ca2+シグナル伝達系は、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ-3(GSK-3:Glycogen Synthase Kinase-3)と関連していることから、Ca2+シグナル伝達を抑制する物質は、糖尿病、認知症などに対する予防薬や治療薬として有用である。
このように、生命の根幹を成すシグナル伝達系の一つであるCa2+シグナル伝達系を抑制する物質は、Ca2+シグナル伝達の亢進により引き起こされる様々な疾病(過剰免疫反応、アレルギー、癌、認知症、2型糖尿病、高血圧、狭心症など)を、そのシグナルを阻害することで、予防や改善や治療できることから注目されている。Ca2+シグナル伝達阻害剤の、免疫抑制剤や抗アレルギー剤への適用例としては、サイクロスポリンA、FK506がある。また、Ca2+シグナル伝達阻害剤の、高血圧や狭心症に対する予防薬や治療薬への適用例としては、ニフェジピン、バラパミル、ジルチアゼムがある。しかしながら、これらは活性の点においては満足できるものの、副作用の点において改善の余地があり、副作用が少ないまたは皆無のCa2+シグナル伝達阻害剤の天然資源からの探索はたいへん意義深い活動である。
そこで本発明は、新規なCa2+シグナル伝達阻害剤を提供することを目的とする。
また、本発明のCa2+シグナル伝達阻害剤の調製方法は、請求項2記載の通り、琥珀からの抽出操作によってデヒドロアビエチン酸および/またはピマール酸を単離取得することを特徴とする。
また、本発明のCa2+シグナル伝達阻害剤の調製方法は、請求項3記載の通り、琥珀からの抽出操作によって下記の構造式(1)で表される化合物を単離取得することを特徴とする。
また、本発明の化合物は、請求項5記載の通り、下記の構造式(1)で表されることを特徴とする。
基本となる系の有用性は、微生物培養液や合成化合物ライブラリーを用いて既に実証済みであり、既知化合物であるラディシコールのCa2+シグナル伝達阻害作用がこの系により発見されている(生物工学, 77, 406-408, 1999)。この系は、高濃度のCa2+を含む培地では、Ca2+シグナルが超活性化され酵母は生育しないが、培地中にその経路を阻害する物質が含まれている場合には、酵母を生育させる(酵母の生育円が生じる)というポジティブスクリーニングである(図1参照)。そのため、毒性が無く、特異性の高い化合物の発見が可能である(Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(9), 1942-1946, 2000)。実際に、この系を用いて、医薬品として実用化されている免疫抑制剤のFK506やサイクロスポリンA、Ca2+拮抗剤のニフェジピンなどのCa2+シグナル伝達阻害作用が確認されている。さらに、図2に示した通り、この系によれば、Ca2+拮抗剤やカルシニューリン阻害剤以外にも、論理的にはMpk1阻害剤、GSK-3阻害剤も選択が可能であり、実際に、GSK-3β阻害剤は、酵母の生育円を生じさせることから、本発明者らは、この系を用いて、GSK-3阻害剤の評価を行えることを確認している(J. Antibiotics., 61(8), 496-502, 2008)。
この実施例において用いた改良系は、遺伝子zds1Δerg3Δpdr1/3Δ破壊酵母を用いたものである。この遺伝子4重破壊酵母は、遺伝子1重破壊酵母の薬剤の膜透過性を高めるために、さらに膜成分と薬剤排出ポンプの遺伝子を自体公知の方法で破壊したものであり、薬剤感受性に優れることから、遺伝子1重破壊酵母を用いた基本系よりも精度よくCa2+シグナル伝達阻害作用の評価を行うことができる。
遺伝子4重破壊酵母をYPD培地(イーストエキストラクト10g/l、ペプトン20g/l、デキストロース20g/l、pH6.5)で28℃、一晩前培養し、A590=1.0の培養液を6ml、5MのCaCl2を3ml、YPD寒天培地41mlをよく懸濁し、シャーレに12.5mlずつ分注した。測定用の各種濃度のサンプルをペーパーディスク(8mm、thick)に40μlしみ込ませてシャーレの上に載せ、28℃で3日間培養した後、生育円の大きさを測定し、Ca2+シグナル伝達阻害活性を評価した。
ロシア産と久慈産のそれぞれの琥珀を粉末化し、メタノールを加えて抽出操作を行った後、濾液からメタノールを除去することで、油状のメタノール抽出物を得た。このメタノール抽出物にメタノールを加えて10mg/ml溶液を調製した後、さらにメタノールで希釈して調製した種々の濃度の溶液をペーパーディスクにしみ込ませ、そのCa2+シグナル伝達阻害活性を酵母の生育円の大きさで評価した。結果を表1に示す。
ロシア産の琥珀の粉末60.80 gからメタノール抽出物を12.09 g得、得られたメタノール抽出物に水と酢酸エチルを加えて抽出操作を行った後、酢酸エチル層から酢酸エチルを除去することで、油状の酢酸エチル抽出物を5.95 g得た。こうして得られた酢酸エチル抽出物にメタノールを加えて100mg/ml溶液を調製した後、ヘキサン:酢酸エチル=3:1の展開溶媒を用いてシリカゲルTLCで展開し、活性バンドをRf=0.38近辺に得た。活性バンドをかきとり、メタノールで活性成分を溶出した後、いったんメタノールを除去してから再びメタノールを加えて100mg/ml溶液を調製し、その一部をHPLC分析した(カラム:CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm (4.6 φ x 150 mm)、溶媒:80 % MeOH-0.1 % CH3COOH、流速:1 ml/min)。HPLC分析チャートを図3に示す。このチャートにおいて特徴的な約15分の時点で溶出するピークAと約24分の時点で溶出するピークBのそれぞれの単離精製を行い(溶媒:80 % MeOH-0.1 % CH3COOH)、その構造をUV測定、1H-NMR測定、13C-NMR測定、質量分析によって解析した。その結果、前者がデヒドロアビエチン酸、後者がピマール酸であることを同定するとともに、それぞれのCa2+シグナル伝達阻害作用を確認した。
久慈産の琥珀の粉末64.20 gからメタノール抽出物を7.39 g得、得られたメタノール抽出物に水と酢酸エチルを加えて抽出操作を行った後、酢酸エチル層から酢酸エチルを除去することで、油状の酢酸エチル抽出物を5.24 g得た。こうして得られた酢酸エチル抽出物にメタノールを加えて100mg/ml溶液を調製した後、ヘキサン:酢酸エチル=3:1の展開溶媒を用いてシリカゲルTLCで展開し、活性バンドをRf=0.38近辺に得た。活性バンドをかきとり、メタノールで活性成分を溶出した後、いったんメタノールを除去してから再びメタノールを加えて100mg/ml溶液を調製し、その一部をHPLC分析した(カラム:CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm (4.6 φ x 150 mm)、溶媒:80 % MeOH-0.1 % CH3COOH、流速:1 ml/min)。HPLC分析チャートを図4に示す。このチャートにおいて特徴的な約12分の時点で溶出するピークCの単離精製を行い(溶媒:75 % MeOH-0.1 % CH3COOH)、その構造をUV測定、1H-NMR測定、13C-NMR測定、質量分析によって解析した。UVスペクトルのチャートを図5に(50 μg/ml in MeOH)、1H-NMRスペクトルのチャートを図6に(CDCl3、600MHz)、13C-NMRスペクトルのチャートを図7に(CDCl3、150MHz)、EI-MSスペクトルのチャートを図8にそれぞれ示す。構造解析の結果から、このピークが下記の構造式(1)で表される新規なラブダン型様化合物に由来することを明らかにするとともに(HREI-MSにて分子量260、C18H28O、Calcd. 260.2141, Obsrb. 260.2140、1H-NMRスペクトルと13C-NMRスペクトルの帰属をそれぞれ図9と図10に示す)、そのCa2+シグナル伝達阻害作用を確認した(酵母の生育円の大きさで評価した結果を表2に示す)。
下記の構造式(1)で表される化合物のナトリウム塩1.5gを生理食塩水100mlに溶解し(合計1.5g/100ml)、バイアルに充填した後、加熱殺菌を行って、静注用注射剤を製造した。
以下の組成で各成分を混合し、打錠して、実施例1で得たロシア産の琥珀のメタノール抽出物を50mg含む500mgの錠剤400個を製造した。
ロシア産の琥珀のメタノール抽出物 ・・・ 20g
馬鈴薯澱粉 ・・・ 6g
ステアリン酸タルク ・・・ 4g
6%HPC乳糖 ・・・ 170g
(合計200g)
以下の組成で各成分を混合し、圧縮成形し、粉砕し、整粒して、20〜50メッシュの5%顆粒剤を製造した。
久慈産の琥珀のメタノール抽出物 ・・・ 10g
乳糖 ・・・ 187g
ステアリン酸マグネシウム ・・・ 3g
(合計200g)
以下の組成で各成分をよく混合し、混合物を1号カプセルに充填して、カプセル剤300個を製造した。
久慈産の琥珀のメタノール抽出物 ・・・ 5g
乳糖 ・・・ 40g
馬鈴薯澱粉 ・・・ 50g
ヒドロキシプロピルメチルセルロース ・・・ 3.5g
ステアリン酸マグネシウム ・・・ 1.5g
(合計100g)
以下の各成分を滅菌精製水100mlに溶解し、常法により点眼剤を製造した。
下記の構造式(1)で表される化合物 ・・・ 0.1g
塩化ナトリウム ・・・ 0.9g
塩化ベンザルコニウム ・・・ 微量
1N水酸化ナトリウム ・・・ 適量
1N塩酸 ・・・ 適量
Claims (5)
- 琥珀の抽出物を有効成分とすることを特徴とするCa2+シグナル伝達阻害剤。
- 琥珀からの抽出操作によってデヒドロアビエチン酸および/またはピマール酸を単離取得することを特徴とするCa2+シグナル伝達阻害剤の調製方法。
- 琥珀からの抽出操作によって下記の構造式(1)で表される化合物を単離取得することを特徴とするCa2+シグナル伝達阻害剤の調製方法。
- 下記の構造式(1)で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とするCa2+シグナル伝達阻害剤。
- 下記の構造式(1)で表される化合物。
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