JP2010538138A - 酵素安定化剤としての多環式化合物 - Google Patents

Abstract

本発明は、プロテアーゼ阻害剤として作用し、そのため酵素安定化剤として適当な、多環式化合物を含有する、洗濯剤および清浄剤に関する。

Description

本発明は、プロテアーゼ阻害剤として働き、それにより酵素安定化剤として適当である、多環式化合物を含有する洗浄剤または清浄剤に関する。

洗浄剤および清浄剤における酵素の使用は、数十年間の先行技術において確立されている。酵素は、それらの特異的活性により関係する製剤の性能範囲を拡大するために使用される。これらは特に、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびセルラーゼのような加水分解酵素を含む。上述した初めの３つの酵素は、タンパク質、デンプンおよび脂肪を加水分解する結果、汚れの除去に直接的に貢献する。セルラーゼは、それらの構造効果のため特に使用される。洗剤および清浄剤酵素の他の群は、酸化酵素、特にオキシダーゼであり、それらは好ましくは、汚れを漂白するためまたは漂白剤そのものを作り出すために、必要に応じて他の成分と併用して用いられる。持続的な最適化を受けるこれらの酵素に加えて、特定のタイプの汚れに最適に対処できるように、洗浄剤および清浄剤に用いられるさらなる酵素が絶えず提供され、特に、例えばペクチナーゼ、β−グルカナーゼ、マンナーゼまたは、特に特定の植物由来ポリマーの加水分解のための他のヘミセルラーゼ（グルコシダーゼ）が利用可能である。

長い間に確立され、実際にすべての今日の高性能洗浄剤および清浄剤に含まれる酵素はプロテアーゼであり、中でも特にセリンプロテアーゼであり、本発明によるとスブチラーゼも含まれる。それらは、洗浄される物質上のタンパク質性の汚れの分解するために使用される。しかしながら、プロテアーゼは、自分自身を加水分解し（自己加水分解）、製剤中に含まれる全ての他のタンパク質（すなわち、特に他の酵素）を加水分解する。これは、比較的良好な反応条件である場合に、特に洗浄工程中、すなわち、水性洗浄溶液中で起こる。しかしながら、これはまた、それほどではないにしろ、関係する製剤の貯蔵の間にも起こり、プロテアーゼ活性および他の酵素の活性化の一定の損失が常に長期の貯蔵期間に関連している原因である。これは、反応媒体と加水分解試薬のいずれもが処方中に水とともに含まれるような、ゲル状または液状、特に水溶液処方において特に問題である。

洗浄剤および清浄剤処方の開発における１つの課題は、特に貯蔵中において、製剤に含まれる酵素を安定化させることである。これは様々な好ましくない影響、例えば物理的作用または酸化に起因する変性あるいは分解に対する保護を意味するものと理解される。これらの開発の１つの重点は、製剤に含まれるタンパク質および／または酵素のタンパク質分解切断に対する保護からなる。これは、例えば特異的酵素顆粒中の酵素のカプセル化あるいは２室系（two-chamber system）または多室系（multi-chamber system）で製剤をパッケージ化することで物理的障壁を作ることにより達成され得る。しばしば行われる他の手段は、プロテアーゼを阻害し、これにより全体的にみて、製剤に含まれるプロテアーゼおよび他のタンパク質ならびに酵素に対する安定化剤として働く化合物を加えることである。プロテアーゼ活性は、特に貯蔵の間に一時的に抑制されるべきであるが、洗浄工程では抑制されるべきではないため、これらは可逆的プロテアーゼ阻害剤でなければならない。

先行技術において、ポリオール、特にグリセロールおよび１，２−プロピレングリコール、ベンザミジン塩酸塩、ホウ砂、ホウ酸、ボロン酸あるいはその塩またはエステルが、可逆的プロテアーゼ阻害剤として確立している。そのうち主に芳香族基を有する誘導体、例えばオルト−、メタ−またはパラ−置換フェニルボロン酸が言及され、特に４−ホルミルフェニルボロン酸、または前述した化合物の塩あるいはエステルを特に言及すべきである（以下参照）。ホウ酸誘導体がポリオールとともに使用される場合に、それらは酵素を安定化させる複合体を形成し得るため、特に良好な保護が得られる。ペプチドアルデヒド、すなわち還元されたＣ末端を有するオリゴペプチド、特に２〜５０個のモノマーのオリゴペプチドが、この目的のために記載されている。とりわけ、ペプチド型可逆的プロテアーゼ阻害剤にはオボムコイドおよびロイペプチンが含まれる。特異的可逆的ペプチド阻害剤ならびにプロテアーゼの融合タンパク質および特異的ペプチド阻害剤が、この目的のために使用される。

確立されたさらなる酵素安定化剤は、アミノアルコール、例えばモノ−、ジ−およびトリエタノールアミンおよびプロパノールアミンならびにそれらの混合物など、Ｃ_１２までの脂肪族カルボン酸、例えばコハク酸、他のジカルボン酸または前記酸の塩である。末端キャップ脂肪酸アミドアルコキシレートも、この目的のために確立されている。ＷＯ９７／１８２８７に記載されるようなビルダーとして使用される特定の有機酸は、ビルダーとしてのそれらの機能に加えて、酵素を安定化することもできる。

様々な分類のプロテアーゼが、洗浄剤または清浄剤プロテアーゼ、例えば金属プロテアーゼとして確立される。しかしながら、それらの有利な酵素的特性（安定性や最適ｐＨなど）のため、スブチリシン型のプロテアーゼ（スブチラーゼ、スブチロペプチダーゼ、ＥＣ ３．４．２１．６２）が、洗浄剤または清浄剤プロテアーゼの中で重要な位置を占める。触媒的活性アミノ酸のため、スブチリシン型プロテアーゼはセリンプロテアーゼとして分類される。それらは、非特異的エンドペプチダーゼとして作用する。すなわち、ペプチドまたはタンパク質内に存在する全ての酸アミド結合を加水分解する。それらの最適ｐＨは、一般的に、明らかにアルカリ性範囲である。この群の検証は、例えば、R. BottおよびC. Betzel（ニューヨーク）により編集された「Subtilisin enzymes」（1996年）の第75〜95頁、R. Siezenによる論文「Subtilases: Subtilisin-like Proteases」に掲載されている。スブチラーゼは本来、微生物により形成される；中でも、Bacillus種により形成され、分泌されるスブチリシンを、スブチラーゼの中でも特に重要な群として言及すべきである。

したがって、まさにこの類の酵素からの可逆的阻害剤を提供するために、特別な取り組みがなされている。グリセロールおよび１，２−プロピレングリコールのようなポリオールは、高い濃度で使用しなければならないため、それに応じて、関係する製剤中の他の活性物質を小さな割合でのみ含み得るという点に関して不都合を有する。

比較的低い濃度でも効果的なセリンプロテアーゼ阻害剤の中では、ホウ酸誘導体が重要な位置を占める。これらの例として、ＷＯ９２／１９７０７Ａ１からメタ−置換フェニルボロン酸を取りあげることができる。プロテアーゼ阻害剤として、パラ−置換フェニルボロン酸が、ＥＰ４７８０５０Ａ１に開示されている。ホウ酸と芳香族化合物を有するホウ酸誘導体の複合体のプロテアーゼ阻害活性が、ＥＰ５１１４５６Ａ１に開示されている。芳香族化合物を含むボロン酸とボリン酸のプロテアーゼ阻害誘導体は、ＷＯ９５／０２０４６Ａ１に開示されている。ＷＯ９５／２９２２３Ａ１は、置換ナフタレンボロン酸の同様の活性を開示している。

さらに、特許出願ＷＯ９６／２１７１６Ａ１およびＷＯ９６／４１８５９Ａ１を言及すべきである。ＷＯ９６／２１７１６Ａ１は、洗浄剤および清浄剤において酵素安定化の特定の目的のために、そこに挙げられた全てのプロテアーゼ阻害剤が適当であるという事実を引用し、開示する５つの特許出願を引用している。これらの中の特に効果的な安定化剤の選択が、ＷＯ９６／４１８５９Ａ１に開示されている。

さらに、これらの安定化剤の活性のさらなる増加についての先行技術がある。それ故に、特許出願ＷＯ９３／１１２１５Ａ１は、液状洗浄剤処方を安定化するための１，２−プロパンジオールおよびホウ酸または種々のホウ酸誘導体の併用を記載し、ＥＰ４５１９２４Ａ２は、ヒドロキシプロピルカルボン酸、カルシウム塩および特定のホウ素化合物の併用により安定化された液状洗浄剤処方を記載する。

しかしながら、それらの安定化作用とは独立して、ホウ酸誘導体は決定的な不都合を示す：例えば、ホウ酸塩のようなホウ酸誘導体の多くは、いくつかの他の洗浄剤または清浄剤成分と望ましくない副産物を形成し、そのため、関係する製剤における所望する清浄目的に対してもはや有用性がなく、また洗浄される物質に汚れとして残留することさえある。

国際公開第９７／１８２８７号パンフレット 国際公開第９２／１９７０７号パンフレット 欧州特許出願第４７８０５０号明細書 欧州特許出願第５１１４５６号明細書 国際公開第９５／０２０４６号パンフレット 国際公開第９５／２９２２３号パンフレット 国際公開第９６／２１７１６号パンフレット 国際公開第９６／４１８５９号パンフレット 国際公開第９３／１１２１５号パンフレット 欧州特許出願第４５１９２４号明細書

したがって、本願発明の課題は、プロテアーゼ阻害剤として作用し、それにより洗浄剤および清浄剤において酵素安定化剤として適当なホウ素非含有化合物を特定することにある。

ここで、概して、液状、ゲル状またはペースト状の洗浄剤および清浄剤（特に水を含有する製剤を含む）における使用が特に興味深い。

該課題は、下記の製剤により解決できる：
プロテアーゼと一般構造式：

の化合物を含有する洗浄剤または清浄剤。
式中、Ａは、場合により少なくとも１つのヘテロ原子、特にＯまたはＮから選択されるヘテロ原子を含有していてよい、単不飽和または多不飽和の５または６員環を表し、Ａは、特にベンゾ基、チオフェノ基、ピリド基、ピリミジノ基、イミダゾ基、オキサゾ基、ピラゾ基およびピロロ基からなる群から選択される基であり、ＸおよびＹは、互いに独立して、Ｏ、ＮＲ^１またはＣＲ^１Ｒ^２を表し、好ましくはＯであり、Ｒ^１、Ｒ^２およびＺは、互いに独立して、水素、Ｃ_１〜６アルキル基、特にメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、フェニル基またはヘキシル基、Ｃ_１〜６アルケニル基、特にエテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基またはヘキセニル基、フェニル基、ベンジル基またはハロゲン、特にフッ素、塩素、臭素またはヨウ素を表し、特に水素であり、ｎは、１または２である。

好ましい実施態様において、
Ａは、ベンゾ基、チオフェノ基、ピリド基、ピリミジノ基、イミダゾ基、オキサゾ基、ピラゾ基およびピロロ基からなる群から選択される基であり、特に好ましくはベンゾ基、チオフェノ基またはピリド基であり、とりわけベンゾ基であり、Ｘは、ＯまたはＮＲ^１、特に好ましくはＯを表し、Ｙは、ＯまたはＮＨ、特に好ましくはＯを表し、Ｒ^１は、ベンジル基であり、Ｚは水素を表し、ｎは１である。

特に好ましい実施態様において、該化合物は、構造式：

を有する化合物（［１−（カルボキシメトキシ）−６−オキソ−６Ｈ−ベンゾクロメン−３−イル］オキソ}酢酸（ＣＡＳ：１３３５４０−７１−３））である。

本発明によれば、用語洗浄剤または清浄剤は、特に、布地および／または硬表面の洗浄または清浄に適当な全ての製剤をいうものと理解される。該洗浄剤または清浄剤に適当な成分を以下に詳細に記載する。

本発明によれば、用語プロテアーゼは、タンパク質中の酸アミド結合を加水分解することのできる全ての酵素をいうものと理解される。該プロテアーゼも以下に詳細に記載する。

この理論に制限されることなく、本発明によれば、本発明に関する化合物は、本発明の阻害される／安定化されるプロテアーゼと複合体を形成すると思われる。該複合体は、本発明に関する化合物がプロテアーゼの基質結合ポケットに挿入され、非共有状態で結合しているようである。このようにプロテアーゼの活性中心は、この酵素により加水分解できない化合物によってブロックされており、存在する他のタンパク質を加水分解に利用することはできない。これは、可逆的結合、すなわち会合と解離の平衡である。この反応の平衡定数は、阻害係数またはＫ_ｉで示される。

先行技術と比較した本発明に関する化合物の第一の有利点は、ポリオールと比較して必要とされる量がより低量であることに加えて、洗浄剤および清浄剤において使用され得るプロテアーゼに対して好ましい阻害定数を有しているという事実からなる。これは、例えばセリンプロテアーゼについても、また金属プロテアーゼについてもいえる。このように、該阻害剤は可逆的に結合する。すなわち、それらは酵素と、固定され過ぎることなくまた緩過ぎることのない一時的な相互関係を結ぶ。したがって、有利なことに、貯蔵中、本発明に関する大部分のプロテアーゼは、プロテアーゼ阻害複合体の形態で存在する。それらに含まれるプロテアーゼおよび任意の他のタンパク質、特に他の酵素は、このようにしてこの酵素によりタンパク質分解から保護される（タンパク質分解に対する安定化）。一方、清浄過程で水性洗浄溶液または清浄溶液を調製するために本発明の製剤が水で希釈される場合、結合平衡は解離の方向に移るので、複合体は分解し、本発明に関する大部分のプロテアーゼはタンパク質分解活性になる。したがって、本発明に関する化合物は、機能性プロテアーゼ阻害剤であり、それにより、該処方による洗浄剤および清浄剤のための酵素安定化剤である。

先行技術に対する本発明に関する化合物の第二の有利点は、該化合物が、元素としてＣ、Ｈ、ＮおよびＯならびに場合によりハロゲンおよび／または硫黄のみを含有し、特にホウ素を含まないという事実からなる。したがって、それらは、ホウ素に起因し得る他の洗浄剤または清浄剤成分と望ましくない副産物を形成しない。

さらに、特に各芳香族環に含まれるカルボキシル基により、それらは容易に水に溶解するため、適当な製剤中に容易に組み込むことができ、貯蔵中の沈殿を防止する。

したがって、原則として、前記化合物は、プロテアーゼの基質と同様に結合ポケットの条件と構造的に適合しているため、可逆的阻害剤として作用する。したがって、反対に、原則として全てのプロテアーゼは、本発明に関する化合物により阻害され得るため、本発明のプロテアーゼ阻害剤として適当である。これは、セリンプロテアーゼ、具体的にスブチラーゼまたはより具体的にスブチリシン、Bacillus lentus DSM 5483からのスブチリシンの変異体に基づくスブチリシンに基づいて、実験的に記載される化合物の有利な作用を含む本特許出願の実施例に基づき示されているように、特にセリンプロテアーゼについていえる。

また、本願発明は以下のものを提供する：
− 洗浄剤または清浄剤処方の範囲内におけるプロテアーゼの可逆的阻害剤および／または安定化剤としての前記化合物の使用；
− 前記化合物によりプロテアーゼを効果的に阻害および／または安定化する洗浄または清浄方法；
− 繊維製品および／または硬表面の洗浄および／または清浄のための本発明の洗浄剤または清浄剤の使用；ならびに
− 洗浄剤または清浄剤の製造のためのプロテアーゼおよび前記化合物の使用。

本発明によると、含まれるプロテアーゼに対して、０．０１〜１０ｍＭの、好ましくは０．１〜５の、特に好ましくは０．５〜２の阻害定数（Ｋ_ｉ）を有する安定化化合物である洗浄剤または清浄剤が好ましい。

阻害定数Ｋ_ｉは、下記の方法により測定し得る：
酵素活性の可逆的阻害剤の特徴化のために、阻害定数Ｋ_ｉは特徴的で決定的な数値である。Ｋ_ｉは、可逆的な結合に対する、酵素、阻害剤および酵素−阻害剤複合体間の平衡を表す。ここで、酵素−阻害剤複合体は触媒的活性ではなく、遊離酵素濃度の還元による反応を阻害し、それは基質の結合のためにさらに利用できる。Ｋ_ｉは、下記により定義付けられる。
Ｋ_ｉ＝［Ｉ］×［Ｅ］／［ＥＩ］

式中、［Ｅ］、［ＥＩ］および［Ｉ］は、それぞれ、酵素［Ｅ］、阻害剤［Ｉ］および酵素−阻害剤複合体［ＥＩ］のモル平衡濃度である。この定義によると、各試験条件下、低Ｋ_ｉを有する基質が良好な阻害剤である。

Ｋ_ｉの測定は、対応する阻害剤の存在下におけるプロテアーゼの活性試験に基づいて行われる。酵素的パラメーターＫ_ｍおよびｋ_ｃａｔは、様々な濃度の阻害剤の存在下、確立されたミカエリス−メンテン速度論を用いて測定される。種々の基質濃度［Ｓ］における加水分解の初期速度（ｖ_０）を測定し、該実験データを式１に当てはめることにより、Ｋ_ｉが得られる。

式１： ｖ_０＝ｋ_ｃａｔ×［Ｓ］×Ｅ_０／（Ｋ_ｍ×（１＋［Ｉ］／Ｋ_ｉ）＋Ｓ）

［Ｉ］は、この場合も阻害剤濃度を表す。

また、Ｋ_ｉは、ＩＣ_５０を用いてチェン−プルソフ式（式２）により測定してもよい。ＩＣ_５０値の測定は、種々の濃度の阻害剤の存在下において基質のタンパク質分解活性を測定し、勾配変化のある（疑似丘勾配）Ｓ字状用量反応式に実験データを当てはめることにより行われる。これは、完全な阻害を達成するために必要とされる阻害剤濃度の半分の値である。

したがって、Ｋ_ｉは、下記式２から得られる：
式２： Ｋ_ｉ＝ＩＣ_５０／（１＋［Ｓ］／Ｋ_ｄ）

式中、［Ｓ］は試験における基質濃度を表し、基質に対する平衡解離定数Ｋ_ｄは、ＩＣ_５０を使用する場合の基質に対するＫ_ｍと同一のものと見なすことができる。

このようにして決定されるＫ_ｉ値は、プロテアーゼに関する研究で試験において使用される化合物を特徴づける。実施例２において、これはBacillus lentusアルカリ性プロテアーゼＦ４９（ＷＯ９５／２３２２１Ａ１による）に対して行った。これは、典型的なスブチリシンプロテアーゼであるため、この酵素により得られる値は、他のセリンプロテアーゼ、特に他のスブチリシンプロテアーゼに典型的な値でもある。疑わしい場合には、関心のあるプロテアーゼに対する正確な値は、それぞれ特異的なプロテアーゼに基づいて測定されなければならない。

好ましい実施態様において主に固形状で存在し、第２の実施態様において主に液状、ペースト状またはゲル状で存在する本発明の洗浄剤または清浄剤において、プロテアーゼは、特に、製剤１ｇあたり２μｇ〜２０ｍｇ、好ましくは製剤１ｇあたり５μｇ〜１７．５ｍｇ、特に好ましくは製剤１ｇあたり２０μｇ〜１５ｍｇ、最も好ましくは製剤１ｇあたり５０μｇ〜１０μｇの量で含まれる。

安定化剤は、本発明の製剤に、製剤１ｇあたり５０ｍｇまでの量で、好ましくは１０ｍｇまでの量で、特に好ましくは７ｍｇまでの量で、最も好ましくは製剤１ｇあたり５ｍｇまでの量で含まれる。さらに、安定化剤が、（含まれるプロテアーゼに基づいて）０．０１〜１００×Ｋ_ｉの量で、好ましくは０．１〜１０×Ｋ_ｉの量で、特に好ましくは１〜５×Ｋ_ｉの量で含まれることが好ましい。

安定化剤とプロテアーゼのモル比は、好ましくは１：１〜１０００：１、特に１：１〜５００：１、特に好ましくは１：１〜１００：１、最も特に好ましくは１：１〜２０：１である。

上記一般式の安定化剤に加えて、本発明の製剤は、少なくとも１つの安定化剤、特にグリセロールまたは１，２−エチレングリコールのようなポリオール、および／または酸化防止剤を含有してよい。

本発明により安定化されるまたは可逆的に阻害されるプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、特にスブチラーゼ、特に好ましくはスブチリシンである。ここで、スブチリシンは、野生型酵素またはスブチリシン変異体であってよく、好ましくは下記から選択される変異体の野生型酵素または出発酵素であり得る：
−Bacillus amyloliquefaciensからのアルカリ性プロテアーゼ（BPN'）、
−Bacillus licheniformisからのアルカリ性プロテアーゼ（スブチリシンカールスバーグ）
−アルカリ性プロテアーゼＰＢ９２、
−スブチリシン１４７および／またはスブチリシン３０９（savinase）、
−Bacillus lentus好ましくはBacillus lentus（DSM 5483）からのアルカリ性プロテアーゼ、
−Bacillus alcalophilus（DSM 11233）からのアルカリ性プロテアーゼ、
−Bacillus gibsonii（DSM 14391）からのアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも７０％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
−Bacillus sp.（DSM 14390）からのアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも９８．５％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
−Bacillus sp.（DSM 14392）からのアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも９８．１％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
−Bacillus gibsonii（DSM 14393）からのアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも７０％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
−国際特許出願２００５／０６３９７４号パンフレットのシーケンス ＩＤ Ｎｏ．４に記載されたアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも４０％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
−国際特許出願２００５／１０３２４４号パンフレットのシーケンス ＩＤ Ｎｏ．４に記載されたアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも８０％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
−国際特許出願２００５／１０３２４４号パンフレットのシーケンス ＩＤ Ｎｏ．７に記載されたアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも８０％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、および
−独国特許出願１０２００５０２８２９５．４号のシーケンス ＩＤ Ｎｏ．２に記載されたプロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも６６％が同一のプロテアーゼ。

好ましい実施態様において、該プロテアーゼは、９５〜１０３位（スブチリシン３０９における番号付与）の領域における点突然変異による変異体であり、好ましくは９９〜１００位の間での特定のアミノ酸の挿入による変異体であり、特に好ましくはスブチリシン１４７および／または３０９（スブチリシン３０９）またはそれらの変異体から生じる変異体である。特に、該プロテアーゼは、２１７位（Bacillus amyloliquefaciensからの野生型プロテアーゼ；BPN'における番号付与）における点突然変異による変異体であり、好ましくはこの位置における特定のアミノ酸の置換による変異体であり、特に好ましくはアミノ酸置換Ｘ２１７Ｌによる変異体、最も好ましくはBacillus amyloliquefaciensからの野生型プロテアーゼ（BPN'）またはその変異体から生じる変異体である。好ましい実施態様において、該プロテアーゼは、Bacillus lentusからのアルカリ性プロテアーゼに対応し得る出発プロテアーゼと比較して、以下の１つまたはそれ以上の位置におけるアミノ酸変化による変異体である：Bacillus lentusからのアルカリ性プロテアーゼの番号付与における３、４、３６、４２、４３、４７、５６、６１、６９、８７、９６、９９、１０１、１０２、１０４、１１４、１１８、１２０、１３０、１３９、１４１、１４２、１５４、１５７、１８８、１９３、１９９、２０５、２１１、２２４、２２９、２３６、２３７、２４２、２４３、２５０、２５３、２５５および２６８位。好ましくは、該プロテアーゼは、出発分子と比較して、以下の１つまたはそれ以上の位置におけるアミノ酸変化による変異体である：３、４、４３、６１、１８８、１９３、１９９、２１１、２２４、２５０および２５３位。特に好ましくは、１つまたはそれ以上のアミノ酸交換Ｘ３Ｔ、Ｘ４Ｉ、Ｘ４３Ｖ、Ｘ６１Ａ、Ｘ１８８Ｐ、Ｘ１９３Ｍ、Ｘ１９９Ｉ、Ｘ２１１Ｄ、Ｘ２１１Ｅ、Ｘ２１１Ｇ、Ｘ２１１ＮまたはＸ２１１Ｑ、Ｘ２２４Ｖ、Ｘ２５０ＧおよびＸ２５３Ｎによる変異体、最も好ましくはBacillus lentus ＤＳＭ ５４８３からのアルカリ性プロテアーゼまたはそれらの変異体から生じる変異体である。

本発明の製剤は、プロテアーゼに加えて１つまたはそれ以上のさらなる酵素を含有していてよく、特に以下の群からの酵素を含有してよい：１つまたはそれ以上のさらなるプロテアーゼ、アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、リパーゼおよびオキシドレダクターゼ。アミラーゼは、好ましくはα−アミラーゼである。ヘミセルラーゼは、好ましくはβ−グルカナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼおよび／またはマンナーゼである。セルラーゼは、好ましくはセルラーゼ混合物または単一成分セルラーゼであり、好ましくはまたは主に、エンドグルカナーゼおよび／またはセロビオヒドロラーゼである。オキシドレダクターゼは、好ましくはオキシダーゼ、特にコリンオキシダーゼ、またはペルヒドロラーゼである。

本発明の製剤は、好ましくは、少なくとも１つの錯化剤および／またはビルダー物質（該ビルダーは、特にゼオライトビルダーである）、および／または非イオン性界面活性剤（該非イオン性界面活性剤は、特にヒドロキシ混合エーテルである）、および／または蛍光増白剤（該蛍光増白剤は、ビフェニル化合物、特にジスチリルビフェニル誘導体および／またはスチルベントリアゾン誘導体）を含有する。

〈実施例１〉
阻害剤の存在下における残存プロテアーゼ活性試験

本発明の化合物がプロテアーゼ活性阻害作用を有することを証明するため、Bacillus lentusアルカリ性プロテアーゼＦ４９（ＷＯ９５／２３２２１Ａ１による）の残存タンパク質分解活性をこれらの化合物の存在下で測定した。

反応バッチと並行して、０．１％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ ＴＭ３５、基質スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−パラニトロアニリド（ＡＡＰＦｐＮＡ；Bachem L-1400）および５×１０^−９および／または１×１０^−８Ｍのプロテアーゼを、１００ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ６．８）に加えた。試験される化合物を、最終濃度１０ｍＭとなるよう加えた。それぞれ、無水ＤＭＳＯに溶解し、該化合物を含まない同量のＤＭＳＯによる対応する対照を用いて、酵素活性におけるＤＭＳＯの影響を補正した。培養は、５分間、ｐＨ８．６、２５℃で行った。ここで、１Ｕは１分間あたりに分解される１μモルの基質に相当する。

［１−（カルボキシメトキシ）−６−オキソ−６Ｈ−ベンゾクロメン−３−イル］オキシ}酢酸（Ｃａｓ：１３３５４０−７１−３）の使用により、５０％未満の残存活性まで残存タンパク質分解活性の阻害を達成することが可能であった。

〈実施例２〉
プロテアーゼ阻害剤の存在下における、プロテアーゼ含有洗浄剤および清浄剤の貯蔵安定性試験

基本処方として、以下の成分を含む液状洗浄剤を調製した（全て重量％）：０．３〜０．５％のキサンタンガム、０．２〜０．４％の消泡剤、６〜７％のグリセロール、０．３〜０．５％のエタノール、４〜７％のＦＡＥＯＳ、２４〜２８％の非イオン性界面活性剤、１％のホウ酸、１〜２％のクエン酸ナトリウム（二水和物）、２〜４％のソーダ、１４〜１６％のヤシ脂肪酸、０．５％のＨＥＤＰ、０〜０．４％のＰＶＰ、０〜０．０５％の蛍光増白剤、０〜０．００１％の着色剤、残りは脱塩水。

１，２７５，０００ＨＰＵ／ｌの B. lentusアルカリ性プロテアーゼＦ４９とともに、試験する阻害化合物を該処方に添加した。ＨＰＵ（ヘンケルプロテアーゼ単位）で示されるプロテアーゼ活性は、Raay、SaranおよびVerbeekによる論文：Tenside（1970年）、第7巻、125〜132頁「Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivitaet in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spuel- und Reinigungsmitteln」の方法により測定した。

３０℃の気密性密閉容器内で、様々な期間貯蔵した。

評価のため、関係する製剤のタンパク質分解活性の初期値を貯蔵後の測定値と比較した。貯蔵後に残っている活性が高いほど、貯蔵中そこに含まれるプロテアーゼの不活化は良好であって、本発明の安定化剤としてより適当な化合物である。

Claims (36)

1. プロテアーゼおよび一般構造式：
   

   

   ［式中、Ａは、場合により少なくとも１つのヘテロ原子、特にＯまたはＮから選択されるヘテロ原子を含有していてよい、単不飽和または多不飽和の５または６員環を表し、
   ＸおよびＹは、互いに独立して、Ｏ、ＮＲ^１またはＣＲ^１Ｒ^２を表し、
   Ｒ^１、Ｒ^２およびＺは、互いに独立して、水素、Ｃ_１〜６アルキル基、Ｃ_１〜６アルケニル基、フェニル基、ベンジル基または水素を表し、
   ｎは、１または２である］
   で示される酵素安定化剤を含有する洗浄剤または清浄剤。
2. Ａが、ベンゾ基、チオフェノ基、ピリド基、ピリミジノ基、イミダゾ基、オキサゾ基、ピラゾ基およびピロロ基からなる群から選択される基である、請求項１に記載の洗浄剤または清浄剤。
3. Ｘが、ＯまたはＮＲ^１［式中、Ｒ^１はベンジル基である］である、請求項１または２に記載の洗浄剤または清浄剤。
4. Ｙが、ＯまたはＮＨである、請求項１〜３のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
5. 酵素安定化剤が構造式：
   

   

   で示される化合物である、請求項１〜４のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
6. 安定化化合物が、含まれるプロテアーゼに対して０．０１〜１０ｍＭ、好ましくは０．１〜５、特に好ましくは０．５〜２の阻害定数（Ｋ_ｉ）を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
7. 主に固形状である請求項１〜６のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
8. 主に、液状、ペースト状またはゲル状である、請求項１〜６のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
9. プロテアーゼを、製剤１ｇに対して２μｇ〜２０ｍｇ、好ましくは製剤１ｇに対して５μｇ〜１７．５ｍｇ、特に好ましくは製剤１ｇに対して２０μｇ〜１５ｍｇ、最も好ましくは製剤１ｇに対して５０μｇ〜１０μｇの量で含有する、請求項１〜８のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
10. 安定化剤を、製剤１ｇに対して５０ｍｇまで、好ましくは１０ｍｇまで、特に好ましくは７ｍｇまで、最も好ましくは製剤１ｇに対して５ｍｇまでの量で含有する、請求項１〜９のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
11. プロテアーゼに対する安定化剤のモル比が、１：１〜１０００：１、特に１：１〜５００：１、特に好ましくは１：１〜１００：１、最も好ましくは１：１〜２０：１の範囲にある、請求項１〜１０のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
12. 安定化剤を、（含まれるプロテアーゼに基づき）０．０１〜１００×Ｋ_ｉ、好ましくは０．１〜１０×Ｋ_ｉ、特に好ましくは１〜５×Ｋ_ｉの量で含有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
13. プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、好ましくはスブチラーゼ、特に好ましくはスブチリシンである、請求項１〜１２のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
14. スブチリシンが、野生型酵素またはスブチリシン変異体であり、該野生型酵素または変異体の出発酵素が、
    −Bacillus amyloliquefaciensからのアルカリ性プロテアーゼ（BPN'）、
    −Bacillus licheniformisからのアルカリ性プロテアーゼ（スブチリシンカールスバーグ）
    −アルカリ性プロテアーゼＰＢ９２、
    −スブチリシン１４７および／またはスブチリシン３０９（savinase）、
    −Bacillus lentus好ましくはBacillus lentus（DSM 5483）からのアルカリ性プロテアーゼ、
    −Bacillus alcalophilus（DSM 11233）からのアルカリ性プロテアーゼ、
    −Bacillus gibsonii（DSM 14391）からのアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも７０％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
    −Bacillus sp.（DSM 14390）からのアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも９８．５％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
    −Bacillus sp.（DSM 14392）からのアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも９８．１％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
    −Bacillus gibsonii（DSM 14393）からのアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも７０％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
    −国際特許出願２００５／０６３９７４号パンフレットのシーケンス ＩＤ Ｎｏ．４に記載されたアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも４０％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
    −国際特許出願２００５／１０３２４４号パンフレットのシーケンス ＩＤ Ｎｏ．４に記載されたアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも８０％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
    −国際特許出願２００５／１０３２４４号パンフレットのシーケンス ＩＤ Ｎｏ．７に記載されたアルカリ性プロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも８０％が同一のアルカリ性プロテアーゼ、
    −独国特許出願１０２００５０２８２９５．４号のシーケンス ＩＤ Ｎｏ．２に記載されたプロテアーゼまたは該プロテアーゼと少なくとも６６％が同一のプロテアーゼ
    から選択される、請求項１３に記載の洗浄剤または清浄剤。
15. プロテアーゼが、該酵素自身に由来しているか他の酵素に由来しているかにかかわらず、アミノ酸レベルで、変異体の全体の長さの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２．５％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７．５％が出発プロテアーゼと配列同一性を有する変異体である、請求項１〜１２のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
16. プロテアーゼが、９５〜１０３位（スブチリシン３０９における番号付与）の領域における点突然変異による変異体である、好ましくは９９位と１００位の間の特定のアミノ酸の挿入による変異体である、特に好ましくはスブチリシン１４７および／または３０９（スブチリシン３０９）またはそれらの変異体から生じる変異体である、請求項１〜１３のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
17. プロテアーゼが、２１７位（Bacillus amyloliquefaciensからの野生型プロテアーゼ；BPN'における番号付与）における点突然変異による変異体である、好ましくはこの位置における特定のアミノ酸の置換による変異体である、特に好ましくはアミノ酸置換Ｘ２１７Ｌによる変異体、最も好ましくはBacillus amyloliquefaciensからの野生型プロテアーゼ（BPN'）またはその変異体から生じる変異体である、請求項１〜１４のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
18. プロテアーゼが、Bacillus lentusからのアルカリ性プロテアーゼに対応し得る出発プロテアーゼと比較して、Bacillus lentusからのアルカリ性プロテアーゼの番号付与において、３、４、３６、４２、４３、４７、５６、６１、６９、８７、９６、９９、１０１、１０２、１０４、１１４、１１８、１２０、１３０、１３９、１４１、１４２、１５４、１５７、１８８、１９３、１９９、２０５、２１１、２２４、２２９、２３６、２３７、２４２、２４３、２５０、２５３、２５５および２６８位の１つまたはそれ以上の位置におけるアミノ酸変化による変異体である、好ましくは、出発分子と比較して、３、４、４３、６１、１８８、１９３、１９９、２１１、２２４、２５０および２５３位の１つまたはそれ以上の位置におけるアミノ酸変化による変異体である、特に好ましくは、１つまたはそれ以上のアミノ酸交換Ｘ３Ｔ、Ｘ４Ｉ、Ｘ４３Ｖ、Ｘ６１Ａ、Ｘ１８８Ｐ、Ｘ１９３Ｍ、Ｘ１９９Ｉ、Ｘ２１１Ｄ、Ｘ２１１Ｅ、Ｘ２１１Ｇ、Ｘ２１１ＮまたはＸ２１１Ｑ、Ｘ２２４Ｖ、Ｘ２５０ＧおよびＸ２５３Ｎによる変異体、最も好ましくはBacillus lentus DSM 5483またはその変異体から生じる変異体である、請求項１〜１５のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
19. 少なくとも１つのさらなる安定化剤を含有する請求項１〜１６のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
20. 少なくとも１つのさらなる安定化剤が、ポリオール、特にグリセロールまたは１，２−エチレングリコール、および／または酸化防止剤である、請求項１７に記載の洗浄剤または清浄剤。
21. プロテアーゼ、アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、リパーゼおよびオキシドレダクターゼからなる群から選択される１つまたはそれ以上のさらなる酵素を含有する、請求項１〜１８のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
22. アミラーゼがα−アミラーゼである、請求項１９に記載の洗浄剤または清浄剤。
23. ヘミセルラーゼが、β−グルカナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼおよび／またはマンナーゼである、請求項１９または２０に記載の洗浄剤または清浄剤。
24. セルラーゼが、セルラーゼ混合物または単一成分セルラーゼ、好ましくはまたは主に、エンドグルカナーゼおよび／またはセロビオヒドロラーゼである、請求項１９〜２１のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
25. オキシドレダクターゼが、オキシダーゼ、特にコリンオキシダーゼ、またはペルヒドロラーゼである、請求項１９〜２２に記載の洗浄剤または清浄剤。
26. 少なくとも１つの錯化剤および／またはビルダー物質を含有する、請求項１〜２３のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
27. ビルダーがゼオライトビルダーである請求項２４に記載の洗浄剤または清浄剤。
28. 非イオン性界面活性剤を含有する、請求項１〜２５のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
29. 非イオン性界面活性剤がヒドロキシ混合エーテルである、請求項２６に記載の製剤。
30. 蛍光増白剤を含有する、請求項１〜２７のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤。
31. 蛍光増白剤が、ビフェニル化合物、特にジスチリルビフェニル誘導体、および／またはスチルベントリアジン誘導体を含有する、請求項２８に記載の洗浄剤または清浄剤。
32. 一般構造式：
    

    

    ［式中、Ａは、場合により少なくとも１つのヘテロ原子、特にＯまたはＮから選択されるヘテロ原子を含有していてよい、単不飽和または多不飽和の５または６員環を表し、
    ＸおよびＹは、互いに独立して、Ｏ、ＮＲ^１またはＣＲ^１Ｒ^２を表し、
    Ｒ^１、Ｒ^２およびＺは、互いに独立して、水素、Ｃ_１〜６アルキル基、Ｃ_１〜６アルケニル基、フェニル基、ベンジル基または水素を表し、
    ｎは、１または２である］
    で示される化合物の、洗浄剤または清浄剤処方内におけるプロテアーゼの可逆的阻害剤としての使用。
33. プロテアーゼが、一般構造式：
    

    

    ［式中、Ａは、場合により少なくとも１つのヘテロ原子、特にＯまたはＮから選択されるヘテロ原子を含有していてよい、単不飽和または多不飽和の５または６員環を表し、
    ＸおよびＹは、互いに独立して、Ｏ、ＮＲ^１またはＣＲ^１Ｒ^２を表し、
    Ｒ^１、Ｒ^２およびＺは、互いに独立して、水素、Ｃ_１〜６アルキル基、Ｃ_１〜６アルケニル基、フェニル基、ベンジル基または水素を表し、
    ｎは、１または２である］
    で示される化合物により阻害されるおよび／または安定化される効果を発揮する洗浄または清浄方法。
34. 請求項１〜２９のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤を使用する、請求項３１に記載の洗浄または清浄方法。
35. 布地および／または硬表面を洗浄および／または清浄するための、請求項１〜２９のいずれかに記載の洗浄剤または清浄剤の使用。
36. 洗浄剤または清浄剤を製造するための、プロテアーゼおよび一般構造式：
    

    

    ［式中、Ａは、場合により少なくとも１つのヘテロ原子、特にＯまたはＮから選択されるヘテロ原子を含有していてよい、単不飽和または多不飽和の５または６員環を表し、
    ＸおよびＹは、互いに独立して、Ｏ、ＮＲ^１またはＣＲ^１Ｒ^２を表し、
    Ｒ^１、Ｒ^２およびＺは、互いに独立して、水素、Ｃ_１〜６アルキル基、Ｃ_１〜６アルケニル基、フェニル基、ベンジル基または水素を表し、
    ｎは、１または２である］
    で示される化合物の使用。