KR20230165901A - Vegfa-결합 분자 - Google Patents

Vegfa-결합 분자 Download PDF

Info

Publication number
KR20230165901A
KR20230165901A KR1020237031774A KR20237031774A KR20230165901A KR 20230165901 A KR20230165901 A KR 20230165901A KR 1020237031774 A KR1020237031774 A KR 1020237031774A KR 20237031774 A KR20237031774 A KR 20237031774A KR 20230165901 A KR20230165901 A KR 20230165901A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
misc
feature
antigen
vegfa
binding molecule
Prior art date
Application number
KR1020237031774A
Other languages
English (en)
Inventor
이그나시오 아샬
Original Assignee
도트바이오 피티이. 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 도트바이오 피티이. 리미티드 filed Critical 도트바이오 피티이. 리미티드
Publication of KR20230165901A publication Critical patent/KR20230165901A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Abstract

VEGFA-결합 분자가 개시된다. 또한, VEGFA-결합 분자를 코딩하는 핵산 및 발현 벡터, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 사용하는 방법이 개시된다.

Description

VEGFA-결합 분자
본 출원은 2022년 2월 19일자로 출원된 SG 10202101681W의 우선권을 주장하며, 이의 내용 및 요소는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 통합된다.
기술 분야
본 개시내용은 분자 생물학 (molecular biology)의 분야, 보다 구체적으로는 항원-결합 분자 기술 (antigen-binding molecule technology)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의학적 치료 및 예방 방법에 관한 것이다.
항-VEGF 요법 (Anti-VEGF therapies)은 특히 종양학 및 안과학 분야에서 다양한 병태를 치료하는데 사용된다 (1-3). VEGF에 대한 인간화 및 안정화된 항체 도메인을 개발하는 것은 이의 작은 크기와 모듈성 (modularity)으로 인해 바람직하다. 작은 크기와 높은 안정성을 갖는 것이 안과학 적용에서 바람직하며, 이는 약물의 국소 전달을 가능하게 할 수 있기 때문이다 (4,5). 모듈성, 즉 도메인 항체가 이의 완전성 (integrity)을 손상시키지 않으면서, 자율적으로 폴딩되고 다른 도메인 항체 또는 다른 단백질에 융합하는 능력은 다가 (multi-valent) 및 다중-특이적 (multi-specific) 분자의 개발에 있어서 매우 바람직하다. 실제로 이는 항체 도메인을 모노클로날 항체 또는 임의의 다른 융합 단백질에 직렬로 (in tandem) 융합시킴으로써 원자가 (valency) 및 특이성 (specificity)을 증가시키는 방법을 단순화한다 (6-8).
요약
제1 양상에서, 본 개시내용은 VEGFA에 결합하는, 선택적으로 단리된, 항원-결합 분자 (antigen-binding molecule)를 제공하며, 상기 항원-결합 분자는 하기 CDR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열을 포함한다:
서열 번호: 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1
서열 번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2
서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 하기 FR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열을 포함한다:
서열 번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 FR1
서열 번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 FR2
서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 FR3
서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 FR4.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 하기 CDR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열을 포함한다:
서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1
서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2
서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 하기 CDR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열을 포함한다:
서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR1
서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR2
서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR3.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 VEGFA와 VEGFR 간의 상호작용을 억제한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 VEGFA 이외의 표적 항원에 특이적인 항원-결합 도메인을 추가로 포함하는 다중특이적 항원-결합 분자 (multispecific antigen-binding molecule)이다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 항원-결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor: CAR)를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 항원-결합 분자 또는 CAR를 코딩하는, 선택적으로 단리된, 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터 (expression vector)를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시내용은 또한 VEGFA에 결합하는 항원-결합 분자를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기재된 세포에 의한 항원-결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터 또는 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 아쥬반트를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 의학적 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달이 병리학적으로 관련된 질병의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달이 병리학적으로 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서, 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달이 병리학적으로 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물의 치료적 또는 예방적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 질병은 병리학적 혈관형성 (pathological angiogenesis)을 특징으로 하는 질병, 암, VEGFA-발현 암, VEGFR-발현 암, 안구 질환, 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 노화-관련 황반 변성, 습성 노화-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐색, 근시성 맥락막 신생혈관, 미숙아 망막병증, 신생혈관 녹내장, 중심 장액성 망막병증, 안구 종양, 각막 신생혈관, 염증성 질환, 자가면역 질환, 관절염, 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 운동 신경 질환 및 근위축성 측삭 경화증으로부터 선택된다.
본 개시내용은 또한 VEGFA에 결합된 본원에 기재된 항원-결합 분자를 포함하는, 선택적으로 단리된, 인 비트로 (in vitro) 복합체를 제공한다.
본 개시내용은 또한 샘플에서 VEGFA를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 VEGFA를 함유하거나 또는 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 본원에 기재된 항원-결합 분자와 접촉시키는 단계, 및 항원-결합 분자와 VEGFA의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 VEGFA, 또는 VEGFA를 포함하거나 또는 발현하는 세포를 검출, 국소화 또는 영상화하는 방법에서 본원에 기재된 항원-결합 분자의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한 VEGFA-표적화제 (VEGFA-targeted agent)로 치료하기 위한 대상체를 선택하거나 또는 계층화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체 유래의 샘플을 본원에 기재된 항원-결합 분자와 인 비트로 접촉시키는 단계, 및 항원-결합 분자와 VEGFA의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 인 비트로 또는 인 비보 진단제 (diagnostic agent) 또는 예후제 (prognostic agent)로서 본원에 기재된 항원-결합 분자의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한 VEGFA의 발현을 특징으로 하는 질병/병태를 검출, 국소화 또는 영상화하는 방법에서 본원에 기재된 항원-결합 분자의 용도를 제공한다.
설명
본 발명자들은 본원에서 VEGF-VEGFR 상호작용을 높은 역가로 차단할 수 있는, 인간 (human) 및 뮤린 (murine) VEGFA를 높은 친화도로 표적화하는 인간화, 안정화 및 자율적 VH 도메인 항체의 생성을 설명한다. 이들 VEGF-결합 분자는 다가 및 다중-특이적 분자, 예를 들어 2개의 VH 도메인 항체를 직렬로 구축한 2가 항-VEGFA 분자를 생성하기 위한 빌딩 블록으로 사용될 수 있다.
VEGFA
VEGFA (Vascular endothelial growth factor A)는 UniProt P15692에 의해 확인된 단백질이다. 인간 VEGFA 유전자에 의해 코딩된 mRNA의 대안적 스플라이싱은 4개의 주요 VEGFA 이소형인 VEGF206 (서열 번호: 17), VEGF189 (서열 번호: 18), VEGF165 (서열 번호: 19) 및 VEGF121 (서열 번호: 20)을 수득한다. N-말단의 26개 아미노산 신호 펩티드 (서열 번호: 25)를 제거하기 위한 처리 후에, VEGF206, VEGF189, VEGF165 및 VEGF121은 각각 서열 번호: 21 내지 24에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. VEGF165는 우세한 VEGFA 이소형인 것으로 보인다.
VEGFA는 성장 인자이고, 예를 들어 Holme and Zachary Genome Biol. (2005) 6(2): 209, 및 Claesson-Welsh and Welsh, J Intern Med. (2013) 273(2):114-27에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
VEGF (Vascular endothelial growth factor)는 수용체-결합 시스틴-노트 구조 (receptor-binding cystine-knot structure)가 보존된 분비 폴리펩티드 (secreted polypeptides)의 패밀리이다. VEGFA 모노머는 사슬간 이황화 결합을 통해 회합하여 호모다이머 (homodimers)를 형성한다. VEGFA는 내피 세포에 의해 발현되는 동족 수용체 키나제 (cognate receptor kinases)의 패밀리를 통해 작용하여 혈관 형성을 자극한다.
VEGFA는 정상적인 혈관 발달에 중요한 역할을 하며, 또한 혈관의 비정상적 성장과 관련된 질병 (예: 암)에서도 중요한 역할을 한다. VEGFA는 동맥, 정맥 및 림프계로부터 유래된 혈관 내피 세포의 성장을 자극하고, 다양한 인 비보 모델에서 혈관형성 (즉, 얇은 벽의 내피로 둘러싸인 구조 (thin-walled endothelium-lined structures)의 형성)을 유도하여, 미세혈관 투과성의 급격한 상승을 유도한다.
본 명세서에서, 'VEGFA'는 임의의 종 유래의 VEGFA를 지칭하며, 임의의 종으로부터의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체를 포함한다. 일부 구체예에서, VEGFA는 포유동물 (예: 테리안 (therian), 태반 (placental), 에피테리안 (epitherian), 프렙토테리아 (preptotheria), 아르콘탄 (archontan), 영장류 (레수스 (rhesus), 시노몰구스 (cynomolgous), 비-인간 영장류 또는 인간)) 유래의 VEGFA이다. 일부 구체예에서, VEGFA는 인간 또는 마우스 VEGFA이다.
본원에서 사용된, 해당 참조 단백질의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체는 참조 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. '단편 (fragment)'은 일반적으로 참조 단백질의 소부분 (fraction)을 지칭한다. '변이체 (variant)'는 일반적으로 참조 단백질의 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 다른 변형을 포함하는 아미노산 서열을 갖지만, 참조 단백질의 아미노산 서열에 대해 상당한 정도의 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 60%)을 유지하는 단백질을 지칭한다. '이소형 (isoform)'은 일반적으로 참조 단백질의 종과 동일한 종에 의해 발현되는 참조 단백질의 변이체를 지칭한다. '동족체 (homologue)'는 일반적으로 참조 단백질의 종과 비교하여 다른 종에 의해 생성된 참조 단백질의 변이체를 지칭한다. 동족체는 오소로그 (orthologues)를 포함한다.
VEGFA의 이소형은 물론 VEGF206 (UniProt P15692-1), VEGF189 (UniProt P15692-2), VEGF165 (UniProt P15692-4) 및 VEGF121 (UniProt P15692-9)을 포함한다. VEGFA의 이소형은 또한 VEGF183 (UniProt P15692-3), VEGF148 (UniProt P15692-5), VEGF145 (UniProt P15692-6), VEGF165B (UniProt P15692-8), VEGF111 (UniProt P15692-10), L-VEGF165 (UniProt P15692-11), L-VEGF121 (UniProt P15692-12), L-VEGF189 (UniProt P15692-13), L-VEGF206 (UniProt P15692-14), VEGFA 이소형 15 (UniProt P15692-15), VEGFA 이소형 16 (UniProt P15692-16), VEGFA 이소형 17 (UniProt P15692-17), 및 VEGFA 이소형 18 (UniProt P15692-18)을 포함한다.
VEGFA의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체는 선택적으로 해당 종, 예를 들어 인간으로부터의 미성숙하거나 또는 성숙한 VEGFA 이소형의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 구체예에서, VEGFA는 인간 VEGFA이다. 일부 구체예에서, VEGFA는 마우스 VEGFA이다.
이소형, 단편, 변이체 또는 동족체는 선택적으로 기능적 특성/활성에 대한 적합한 분석법에 의한 분석으로 결정 시에, 예를 들어 참조 VEGFA (예: 인간 VEGF165)의 기능적 특성/활성을 갖는 기능적 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체일 수 있다. 예를 들어, VEGFA의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체는 VEGF 수용체 (예: VEGFR1, VEGFR2 및/또는 VEGFR3)와의 회합을 나타낼 수 있다.
일부 구체예에서, VEGFA는 서열 번호: 17, 18, 19 또는 20에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일부 구체예에서, VEGFA 또는 이의 단편은 서열 번호: 21, 22, 23 또는 24에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
VEGF는 VEGF 수용체 (VEGFR)인 VEGFR1 (AAH39007.1 GI: 24660372), VEGFR2 (P35968.2 GI: 9087218) 및 VEGFR3 (AAA85215.1 GI: 1150991)과의 결합을 통해 이의 생물학적 효과를 발휘한다. 각 수용체는 VEGF에 대한 세포외 결합 도메인, 막횡단 서열 및 세포내 티로신 키나제 모이어티를 갖는다. 세포외 수용체 도메인에 결합하는 VEGF는 수용체를 이량체화하고, 세포내 티로신 키나제 모이어티의 인산화를 초래한다. VEGFA는 주로 VEGFR1 및 VEGFR2를 통해 이의 생물학적 효과를 발휘하는 것으로 나타났다.
본 명세서에서, 'VEGFR1', 'VEGFR2' 및 'VEGFR3'은 임의의 종으로부터의 VEGFR1/VEGFR2/VEGFR3을 각각 지칭하고, 임의의 종으로부터의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체를 포함한다. 일부 구체예에서, VEGFR1/VEGFR2/VEGFR3은 포유동물 (예를 들어, 테리안, 태반, 에피테리안, 프렙토테리아, 아르콘탄, 영장류 (레수스, 시노몰구스, 비-인간 영장류 또는 인간))로부터 유래한다. 일부 구체예에서, VEGFR1/VEGFR2/VEGFR3은 인간 또는 마우스 VEGFR1/VEGFR2/VEGFR3이다.
VEGFR1/VEGFR2/VEGFR3의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체는 선택적으로 해당 종, 예를 들어 인간으로부터의 관련 분자의 미성숙하거나 또는 성숙한 이소형의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에서, 'VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 (VEGFA/VEGFR-mediated signalling)'은 VEGFA가 VEGF 수용체에 결합함으로써 개시되는 신호전달을 지칭한다. '신호전달 (signalling)'은 신호 전달 (signal transduction) 및 세포 활동을 관장하는 기타 세포 과정을 지칭한다.
VEGFA/VEGFR-매개 신호전달은 예를 들어 Geindreau et al., Int J Mol Sci. (2021) 22(9): 4871에 기재되어 있고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다. VEGFA/VEGFR-매개 신호전달은 PI3K/AKT, MAPK/ERK 및 PLC-γ 경로와, 또한 SCR 및 FAK를 통해 세포 내에서 진행되어, 세포 생존, 증식, 세포골격 재배열을 촉진하고, 혈관 투과성의 변화, 혈관 확장에 영향을 주며, 혈관형성을 촉진한다.
항원-결합 분자
본 개시내용은 VEGFA에 결합할 수 있는 (즉, 결합하는) 항원-결합 분자를 제공한다. 본 개시내용은 VEGFA에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자를 제공한다. 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 정제된 형태 또는 단리된 형태, 즉 다른 자연-발생 생물학적 물질로부터 정제된 형태 또는 단리된 형태로 제공될 수 있다.
본원에서 사용된, '항원-결합 분자 (antigen-binding molecule)'는 표적 항원에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 용어 '항원-결합 분자'는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일특이적 및 다중특이적 항체 (예: 이중특이적 항체), 및 항체 단편 (예: Fv, scFv, Fab, scFab, F(ab')2, Fab2, 디아바디 (diabodies), 트리아바디 (triabodies), scFv-Fc, 미니바디 (minibodies), 단일 도메인 항체 (VHH) 등) 및 압타머 (aptamers)를 포함한다.
보다 구체적으로, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 항원-결합 폴리펩티드 모이어티를 포함하며, 이는 '항원-결합 도메인 (antigen-binding domains)'으로 지칭될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체를 포함하거나 또는 이로 구성된다.
단일 도메인 항체 (single domain antibodies: sdAbs)는 또한 당해 기술 분야에서 '중쇄 항체 상의 단일 가변 도메인', 'VHH', '나노바디' 및 '중쇄 단독 항체 (HcAbs)'로 다양하게 지칭되며, 때때로 본원에서는 'DotBodies'로 지칭되고, 예를 들어 Henry and MacKenzie, Front Immunol. (2018) 9:41 및 Bever et al., Anal Bioanal Chem. (2016) 408(22): 5985-6002에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
단일-도메인 항체는 단일의 모노머 항체 가변 도메인으로 형성된다. 최초의 단일-도메인 항체는 낙타류 (camelids)에서 발견된 중쇄 항체로부터 조작되었으며, 연골 어류 (cartilaginous fishes)가 또한 중쇄 항체를 가지고 있다.
본 개시내용에 따른 단일-도메인 항체는 일반적으로 3개의 상보성-결정 영역 (complementarity-determining region: CDR): CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 3개의 CDR은 함께 분자의 파라토프 (paratope)를 정의하며, 이는 이의 표적 항원에 결합하는 부분이다.
단일 도메인 항체는 각 CDR의 양쪽에 프레임워크 영역 (framework regions: FRs)을 추가로 포함하며, 이는 CDR에 스캐폴드를 제공한다. N-말단에서 C-말단까지, 단일-도메인 항체는 하기 구조를 포함한다: N term-[FR1]-[CDR1]-[FR2]-[CDR2]-[FR3]-[CDR3]-[FR4]-C term.
문헌 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)에 기재된 항체 CDRs 및 FRs, 및 문헌 Retter et al., Nucl. Acids Res. (2005) 33 (suppl 1): D671-D674에 기재된 VBASE2를 정의하는 몇가지 서로 다른 규칙이 있다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 본원에 기재된 VEGFA-결합 단일 도메인 항체의 CDR을 포함하거나, 또는 본원에 기재된 VEGFA-결합 단일 도메인 항체로부터 유래된 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 본원에 기재된 VEGFA-결합 단일 도메인 항체의 FR을 포함하거나, 또는 본원에 기재된 VEGFA-결합 단일 도메인 항체로부터 유래된 FR을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 본원에 기재된 VEGFA-결합 단일 도메인 항체의 CDR 및 FR을 포함하거나, 또는 본원에 기재된 VEGFA-결합 단일 도메인 항체로부터 유래된 CDR 및 FR을 포함한다. 즉, 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 본원에 기재된 VEGFA-결합 단일 도메인 항체의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 본원에 기재된 VEGFA-결합 단일 도메인 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 언급된 항원-결합 분자의 CDR 및 FR은 IMGT 정보 시스템 (international IMGT (ImMunoGeneTics) information system (described in LeFranc et al., Nucleic Acids Res. (2015) 43 (Database issue):D413-22), which uses the IMGT V-DOMAIN numbering rules as described in Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. (2003) 27:55-77), Kabat 시스템 (described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) 또는 Chothia 시스템 (described in Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))에 따라 정의된다.
일부 구체예에서, 본원에서 언급된 항원-결합 분자 (예를 들어, 단일 도메인 항체)의 CDR 및 FR은 Kabat 시스템에 따라 정의된다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 1, 5 및 16의 아미노산 서열에서: FR1은 위치 1 내지 31에서의 아미노산 서열에 의해 형성되고; CDR1은 위치 32 내지 36에서의 아미노산 서열에 의해 형성되며; FR2는 위치 37 내지 50에서의 아미노산 서열에 의해 형성되고; CDR2는 위치 51 내지 67에서의 아미노산 서열에 의해 형성되며; FR3은 위치 68 내지 99에서의 아미노산 서열에 의해 형성되고; CDR3은 위치 100 내지 119에서의 아미노산 서열에 의해 형성되며; FR4는 위치 120 내지 130에서의 아미노산 서열에 의해 형성된다.
본원에서 사용된, 참조 아미노산 서열/도메인으로부터 "유래된" 아미노산 서열/도메인은 참조 서열에 대해 적어도 60%, 예를 들어 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 16C2.1 및 21A5.1로부터 선택된 VEGFA-결합 단일 도메인 항체의 CDR, FR 및/또는 완전한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 1, 5 또는 16 중 하나에 따른 아미노산 서열을 갖는 VEGFA-결합 단일 도메인 항체의 CDR, FR 및/또는 완전한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 1, 5 또는 16 중 하나에 따른 아미노산 서열을 갖는 VEGFA-결합 단일 도메인 항체의 CDR (즉, CDR 1, 2 및 3)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 1, 5 또는 16 중 하나에 따른 아미노산 서열을 갖는 VEGFA-결합 단일 도메인 항체의 FR (즉, FR 1, 2, 3 및 4)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 1, 5 또는 16 중 하나에 따른 아미노산 서열을 갖는 VEGFA-결합 단일 도메인 항체의 CDR (즉, CDR 1, 2 및 3) 및 FR (즉, FR 1, 2, 3 및 4)을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 하기 (1) 내지 (3) 중 하나에 따른 단일 도메인 항체 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다:
(1) (Con) 하기 CDR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열:
서열 번호: 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1
서열 번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2
서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3,
또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 하나 이상에서 1개 또는 2개 또는 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체.
(2) (16C2.1) 하기 CDR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열:
서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1
서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2
서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3,
또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 하나 이상에서 1개 또는 2개 또는 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체.
(3) (21A5.1) 하기 CDR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열:
서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR1
서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR2
서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR3,
또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 하나 이상에서 1개 또는 2개 또는 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 하기 (4)에 따른 단일 도메인 항체 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다:
(4) 하기 FR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열:
서열 번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 FR1
서열 번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 FR2
서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 FR3
서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 FR4,
또는 FR1, FR2, FR3 또는 FR4 중 하나 이상에서 1개 또는 2개 또는 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 상기 (1) 내지 (3) 중 하나에 따른 CDR, 및 상기 (4)에 따른 FR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 하기 (5) 내지 (7) 중 하나에 따른 단일 도메인 항체 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다:
(5) (Con) (1)에 따른 CDR 및 (4)에 따른 FR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열.
(6) (2) (2)에 따른 CDR 및 (4)에 따른 FR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열.
(7) (3) (3)에 따른 CDR 및 (4)에 따른 FR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 하기 (8) 내지 (10) 중 하나에 따른 단일 도메인 항체 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다:
(8) (Con) 서열 번호: 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단일 도메인 항체 서열.
(9) (16C2.1) 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단일 도메인 항체 서열.
(10) (21A5.1) 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단일 도메인 항체 서열.
하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 본 개시내용에 따른 구체예에서, 치환은 예를 들어 하기 표에 따른 보존적 치환 (conservative substitutions)일 수 있다. 일부 구체예에서, 중간 열의 동일한 블록에 있는 아미노산이 치환된다. 일부 구체예에서, 최우측 열의 동일한 라인에 있는 아미노산이 치환된다:
일부 구체예에서, 치환은 기능적으로 보존적일 수 있다. 즉, 일부 구체예에서, 치환은 동등한 비치환된 분자와 비교하여 치환을 포함하는 항원-결합 분자의 하나 이상의 기능적 특성 (예를 들어, 표적 결합)에 영향을 미치지 않을 수 있다 (또는 실질적으로 영향을 미치지 않을 수 있다).
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항원-결합 분자는 면역글로불린 중쇄 불변 서열의 하나 이상의 영역 (예를 들어, CH1, CH2 및/또는 CH3)을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA (예를 들어, IgA1, IgA2), IgD, IgE 또는 IgM, 예컨대 인간 IgG (예를 들어, hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4), hIgA (예를 들어, hIgA1, hIgA2), hIgD, hIgE 또는 hIgM의 중쇄 불변 서열이거나, 또는 이로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 인간 IgG1 알로타입 (allotype) (예를 들어, G1m1, G1m2, G1m3 또는 G1m17)의 중쇄 불변 서열이거나, 또는 이로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 26의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CH1 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CH2 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 30의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CH3 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항원-결합 분자는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역은 하나의 폴리펩티드 유래의 CH2 및 CH3 영역, 및 다른 폴리펩티드 유래의 CH2 및 CH3 영역으로 구성된다. 2개의 폴리펩티드 유래의 CH2 및 CH3 영역은 함께 Fc 영역을 형성한다.
Fc 영역은 Fc 수용체 및 면역계의 다른 분자와의 상호작용을 위해 제공되어 기능적 효과를 가져온다. IgG Fc-매개 이펙터 기능은 예를 들어 Jefferis et al., Immunol Rev 1998 163:59-76 (본원에 그 전문이 참조로 통합됨)에서 검토되었고, Fc 영역과 면역 세포에 의해 발현되는 Fc 수용체 간의 상호작용, 보체 단백질 C1q에 대한 Fc 영역의 결합을 통한 보체 경로 성분의 동원, 및 그에 따른 보체 캐스케이드의 활성화를 통해, Fc-매개 동원 및 면역 세포 (예를 들어, 대식세포, 수지상 세포, 호중구, 호염구, 호산구, 혈소판, 비만 세포, NK 세포 및 T 세포)의 활성화를 초래한다. Fc-매개 기능에는 Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포 독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC), 항체-의존성 세포-매개 포식작용 (antibody-dependent cell-mediated phagocytosis: ADCP), 보체-의존성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity: CDC), 막 공격 복합체 (membrane attack complex: MAC)의 형성, 세포 탈과립화 (cell degranulation), 사이토카인 및/또는 케모카인의 생성, 항원 처리 및 제시를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA를 포함/발현하는 세포 (예를 들어, VEGFA를 발현하는 세포, 및/또는 세포 표면에 VEGFA를 포함하는 복합체)에 대한 ADCC, ADCP, CDC 중 하나 이상을 강화/지시할 수 있고, 및/또는 상기 세포 상에 MAC 형성 또는 세포 탈과립화를 강화할 수 있는 Fc 영역을 포함한다.
Fc-매개 기능에 영향을 미치는 항체 Fc 영역에 대한 변형은 당해 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들어 Wang et al., Protein Cell (2018) 9(1):63-73에 기재되어 있고, 이는 본원에 그 전체가 참조로 통합된다. 항체 이펙터 기능에 영향을 미치는 것으로 알려진 예시되는 Fc 영역 변형은 Wang et al., Protein Cell (2018) 9(1):63-73의 표 1에 요약되어 있다.
다중특이적 항원-결합 분자가 또한 고려된다. "다중특이적 (multispecific)"은 항원-결합 분자가 하나 초과의 표적에 대한 특이적 결합을 나타내는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 이중특이적 항원-결합 분자이다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 적어도 2개의 상이한 항원-결합 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 VEGFA 및 다른 표적 (예를 들어, VEGFA 이외의 항원)에 결합하므로 적어도 이중특이적이다. 용어 "이중특이적 (bispecific)"은 항원-결합 분자가 적어도 2개의 별개의 항원 결정기 (antigenic determinants)에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다.
본 개시내용에 따른 항원-결합 분자 (예를 들어, 다중특이적 항원-결합 분자)는 항원-결합 분자가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, VEGFA 및 VEGFA 이외의 항원에 결합하는 항원-결합 분자는 하기를 포함할 수 있다: (i) VEGFA에 결합하는 항원-결합 분자, 및 (ii) VEGFA 이외의 항원에 결합하는 항원-결합 분자. 일부 구체예에서, 더 큰 항원-결합 분자 (예를 들어, 다중특이적 항원-결합 분자)의 성분 항원-결합 분자는 예를 들어 더 큰 항원-결합 분자의 "항원-결합 도메인 (antigen-binding domain)" 또는 "항원-결합 영역 (antigen-binding region)"으로 지칭될 수 있다.
또한, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자 (예를 들어, 다중특이적 항원-결합 분자)는 항원-결합 분자가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항원-결합 폴리펩티드 또는 항원-결합 폴리펩티드 복합체를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 구체예에서, 다중특이적 항원-결합 분자에서 VEGFA 이외의 항원은 면역 세포 표면 분자이다. 일부 구체예에서, 항원은 암 세포 항원이다. 일부 구체예에서, 항원은 수용체 분자, 예를 들어 세포 표면 수용체이다. 일부 구체예에서, 항원은 세포 신호전달 분자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 인터페론, 인터루킨 또는 림포카인이다. 일부 구체예에서, 항원은 성장 인자 또는 호르몬이다.
암 세포 항원 (cancer cell antigen)은 암 세포에 의해 발현되거나 또는 과발현되는 항원이다. 암 세포 항원은 임의의 펩티드/폴리펩티드, 당단백질, 지질단백질, 글리칸, 당지질, 지질 또는 이의 단편일 수 있다. 암 세포 항원의 발현은 암과 관련될 수 있다. 암 세포 항원은 암 세포에 의해 비정상적으로 발현될 수 있거나 (예를 들어, 암 세포 항원은 비정상적 국소화로 발현될 수 있음), 또는 암 세포에 의해 비정상적 구조로 발현될 수 있다. 암 세포 항원은 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 구체예에서, 항원은 암 세포의 세포 표면에서 발현된다 (즉, 암 세포 항원은 암 세포 표면 항원이다). 일부 구체예에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자에 의해 결합되는 항원의 일부는 암 세포의 외부면에 표시된다 (즉, 세포외이다). 암 세포 항원은 암-관련 항원일 수 있다. 일부 구체예에서, 암 세포 항원은 그의 발현이 암 증상의 발달, 진행 또는 중증도와 관련된 항원이다. 상기 암-관련 항원은 암의 원인 또는 병리와 관련될 수 있거나, 또는 암의 결과로서 비정상적으로 발현될 수 있다. 일부 구체예에서, 암 세포 항원은 그의 발현이 예를 들어 비교 가능한 비-암성 세포 (예를 들어, 동일한 조직/세포 타입으로부터 유래된 비-암성 세포)에 의한 발현 수준과 비교하여 암 세포에 의해 (예를 들어 RNA 및/또는 단백질 수준에서) 상향 조절되는 항원이다. 일부 구체예에서, 암-관련 항원은 암성 세포에 의해 우선적으로 발현될 수 있고, 비교 가능한 비-암성 세포 (예를 들어, 동일한 조직/세포 타입으로부터 유래된 비-암성 세포)에 의해 발현되지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 암-관련 항원은 돌연변이된 종양유전자 또는 돌연변이된 종양 억제인자 유전자의 산물일 수 있다. 일부 구체예에서, 암-관련 항원은 과발현된 세포 단백질, 종양유전자 바이러스 (oncogenic virus)에 의해 생성된 암 항원, 종양태아 항원 (oncofetal antigen), 또는 세포 표면 당지질 또는 당단백질의 산물일 수 있다.
면역 세포 표면 분자 (immune cell surface molecule)는 면역 세포의 세포 표면에서 발현되는 임의의 펩티드/폴리펩티드, 당단백질, 지질단백질, 글리칸, 당지질, 지질 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시내용의 항원-결합 분자에 의해 결합되는 면역 세포 표면 분자의 일부는 면역 세포의 외부면에 존재한다 (즉, 세포외이다). 면역 세포 표면 분자는 임의의 면역 세포의 세포 표면에서 발현될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역 세포는 조혈 기원의 세포, 예를 들어 호중구, 호산구, 호염구, 수지상 세포, 림프구 또는 단핵구일 수 있다. 림프구는 예를 들어 T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포 또는 선천성 림프구 세포 (ILC), 또는 이의 전구체 (예를 들어 흉선세포 또는 pre-B 세포)일 수 있다. 일부 구체예에서, 항원은 CD3 폴리펩티드 (예를 들어, CD3ε, CD3δ, CD3γ 또는 CD3ζ)이다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 다중특이적 항원-결합 분자는 VEGFA에 대해 적어도 1가 결합을 나타내고, 또한 VEGFA 이외의 항원에 대해 적어도 1가 결합을 나타낸다. 결합 원자가 (binding valency)는 해당 항원 결정기에 대한 항원-결합 분자의 결합 부위의 수를 지칭한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 VEGFA (예를 들어, 본원에 기재된 VEGFA)에 결합할 수 있는 단일 도메인 항체, 및 VEGFA 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 영역 (예를 들어, 폴리펩티드 (예: 단일 도메인 항체), Fv, Fab 또는 항체)을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 면역 세포-인게이징 모이어티 (immune cell-engaging moiety)를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 면역 세포 인게이저 (immune cell engager)이다. 면역 세포 인게이저는 예를 들어 Goebeler and Bargou, Nat. Rev. Clin. Oncol. (2020) 17: 418-434 및 Ellerman, Methods (2019) 154:102-117에서 검토되었고, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
면역 세포 인게이저 분자 (immune cell engager molecules)는 관심 표적 항원에 대한 항원-결합 영역, 및 관심 면역 세포를 동원/인게이징하기 위한 항원-결합 영역을 포함한다. 면역 세포 인게이저는 면역 세포 표면 분자에 특이적인 항원-결합 영역을 통해 면역 세포를 동원/인게이징한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 CD3 폴리펩티드-결합 모이어티 (예를 들어, CD3 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인)를 포함한다. 가장 잘 연구된 면역 세포 인게이저는 이중특이적 T 세포 인게이저 (bispecific T cell engagers: BiTEs)로, 표적 항원 결합 도메인 및 CD3 폴리펩티드 (전형적으로 CD3ε)-결합 도메인을 포함하며, 이를 통해 BiTE가 T 세포를 동원한다. BiTE가 이의 표적 항원 및 T 세포에 의해 발현되는 CD3 폴리펩티드에 결합하면 T 세포가 활성화되고, 궁극적으로 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 T 세포 이펙터 활성이 유도된다. 다른 종류의 면역 세포 인게이저는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 자연 살해 세포 인게이저 (natural killer cell engagers) 예컨대 이중특이적 살해 인게이저 (bispecific killer engagers: BiKEs)를 포함하며, 이는 NK 세포를 동원하고 활성화한다.
일부 구체예에서, 면역 세포 인게이저에 의해 인게이징되는 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 일부 구체예에서, 면역 세포 인게이저는 T 세포-인게이저이다.
항원-결합 분자의 특정 예시되는 구체예
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항원-결합 분자는 서열 번호: 16에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항원-결합 분자는 서열 번호: 1에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항원-결합 분자는 서열 번호: 5에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
링커 및 추가 서열
항원-결합 분자는 표적 항원에 결합하는데 필요한 아미노산 서열에 추가하여 추가 아미노산/아미노산의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 추가 아미노산/아미노산의 서열은 본 개시내용에 따른 단일 도메인 항체 서열의 N-말단에 제공된다. 일부 구체예에서, 이러한 추가 아미노산/아미노산의 서열은 본 개시내용에 따른 단일 도메인 항체 서열의 C-말단에 제공된다. 일부 구체예에서, 이러한 추가 아미노산/아미노산의 서열은 본 개시내용에 따른 단일 도메인 항체 서열의 N-말단 및 C-말단에 제공된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 아미노산 부분서열들 (subsequences) 간에 하나 이상의 링커 서열 (linker sequences)을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인의 한쪽 단부 또는 양쪽 단부들에 링커 서열이 제공될 수 있다.
링커 서열은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 Chen et al., Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 통합된다. 일부 구체예에서, 링커 서열은 가요성 링커 서열 (flexible linker sequence)일 수 있다. 가요성 링커 서열은 링커 서열에 의해 연결된 아미노산 서열의 상대적 이동을 가능하게 한다. 가요성 링커는 당업자에게 알려져 있고, 몇몇은 Chen et al., Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369에서 확인된다. 가요성 링커 서열은 종종 글리신 및/또는 세린 잔기를 높은 비율로 포함한다.
일부 구체예에서, 링커 서열은 적어도 하나의 글리신 잔기 및/또는 적어도 하나의 세린 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 잔기로 구성된다. 일부 구체예에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 잔기로 구성된 서열 모티프, 예를 들어 G4S의 하나 이상 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 중 하나)의 카피를 (예를 들어 직렬로) 포함한다. 일부 구체예에서, 링커 서열은 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 또는 1-30개의 아미노산 길이를 갖는다.
본 개시내용의 항원-결합 분자 및 폴리펩티드는 추가의 아미노산 또는 아미노산의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원-결합 분자 및 폴리펩티드는 항원-결합 분자/폴리펩티드의 발현, 폴딩, 트래피킹, 프로세싱, 정제 또는 검출을 용이하게 하는 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원-결합 분자/폴리펩티드는 선택적으로 항원-결합 분자/폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에, His (예: 6XHis), Myc, GST, MBP, FLAG, HA, E, 또는 비오틴 태그 (tag)를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자/폴리펩티드는 검출 가능한 모이어티, 예를 들어 형광, 발광, 면역-검출 가능, 방사성 (radio), 화학물질, 핵산 또는 효소 표지를 포함한다.
본 개시내용의 항원-결합 분자 및 폴리펩티드는 신호 펩티드 (또한 선도 서열 (leader sequence) 또는 신호 서열 (signal sequence)로 알려져 있음)를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 통상 단일 알파 나선 (single alpha helix)을 형성하는 5-30개의 소수성 아미노산의 서열로 구성된다. 분비 단백질 및 세포 표면에서 발현되는 단백질은 종종 신호 펩티드를 포함한다.
신호 펩티드는 항원-결합 분자/폴리펩티드의 N-말단에 존재할 수 있다. 신호 펩티드는 항원-결합 분자/폴리펩티드의 효율적인 트래피킹 및 분비를 위해 제공될 수 있다. 신호 펩티드는 전형적으로 절단에 의해 제거되므로, 항원-결합 분자를 발현하는 세포로부터 분비되는 성숙한 항원-결합 분자/폴리펩티드에는 포함되지 않는다.
많은 단백질에 대한 신호 펩티드가 알려져 있으며, GenBank, UniProt, Swiss-Prot, TrEMBL, Protein Information Resource, Protein Data Bank, Ensembl, 및 InterPro와 같은 데이터베이스에 기록되어 있고, 및/또는 예를 들어 아미노산 서열 분석 툴 예컨대 SignalP (Petersen et al., 2011 Nature Methods 8: 785-786) 또는 Signal-BLAST (Frank and Sippl, 2008 Bioinformatics 24: 2172-2176)를 사용하여 규명/예측할 수 있다.
표지 및 접합체
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항원-결합 분자는 검출 가능한 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 검출 가능한 모이어티, 예를 들어 형광 표지, 인광 표지, 발광 표지, 면역-검출 가능한 표지 (예: 에피토프 태그), 방사성표지, 화학물질, 핵산 또는 효소 표지를 포함한다. 항원-결합 분자는 검출 가능한 모이어티와 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 표지될 수 있다.
형광 표지에는 예를 들어 플루오레세인, 로다민, 알로피코시아닌, 에오신 및 NDB, 녹색 형광 단백질 (GFP), 유로퓸 (Eu), 테르븀 (Tb) 및 사마륨 (Sm)과 같은 희토류의 킬레이트, 테트라메틸 로다민, Texas Red, 4-메틸 움벨리페론, 7-아미노-4-메틸 쿠마린, Cy3, 및 Cy5를 포함한다. 방사성표지는 방사성동위원소 예컨대 요오드123, 요오드125, 요오드126, 요오드131, 요오드133, 브롬77, 테크네튬99m, 인듐111, 인듐113m, 갈륨67, 갈륨68, 루테늄95, 루테늄97, 루테늄103, 루테늄105, 수은207, 수은203, 레늄99m, 레늄101, 레늄105, 스칸듐47, 텔루륨121m, 텔루륨122m, 텔루륨125m, 툴륨165, 툴륨167, 툴륨168, 구리67, 불소18, 이트륨90, 팔라듐100, 비스무트217 및 안티몬211을 포함한다. 발광 표지는 방사성발광, 화학발광 (예: 아크리디늄 에스테르, 루미놀, 이소루미놀) 및 생물발광 표지를 포함한다. 면역-검출 가능한 표지는 합텐, 펩티드/폴리펩티드, 항체, 수용체 및 리간드 예컨대 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 디곡시게닌을 포함한다. 핵산 표지는 압타머를 포함한다. 효소 표지는 예를 들어 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제 및 루시퍼라제를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항원-결합 분자는 화학적 모이어티에 접합된다. 화학적 모이어티는 치료 효과를 제공하기 위한 모이어티일 수 있다. 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugates)는 예를 들어 Parslow et al., Biomedicines. 2016 Sep; 4(3):14에서 검토되었다. 일부 구체예에서, 화학적 모이어티는 항원-결합 분자가 VEGFA를 포함/발현하는 세포 (예를 들어, VEGFA를 발현하는 세포 및/또는 세포 표면에서 VEGFA를 포함하는 복합체)에 대해 세포독성을 나타내도록 하는 약물 모이어티 (예를 들어, 세포독성제)일 수 있다. 일부 구체예에서, 약물 모이어티는 화학요법제일 수 있다. 일부 구체예에서, 약물 모이어티는 칼리케아미신, DM1, DM4, 모노메틸아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F (MMAF), SN-38, 독소루비신, 듀오카르마이신, D6.5 및 PBD로부터 선택된다.
항원-결합 분자의 기능적 특성
본원에 기재된 항원-결합 분자는 소정의 기능적 특성을 참조하여 특성화될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자는 하기 특성들 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
VEGFA (예: 인간 VEGFA 및/또는 마우스 VEGFA)에의 결합;
VEGFA 및 VEGFR (즉, VEGFA에 대한 수용체, 예를 들어 VEGFR1) 간의 상호작용의 억제;
VEGFA/VEGFR에 의해 매개되는 신호전달의 억제;
열처리 후 VEGFA에 대한 결합의 유지;
VEGFA를 발현하는 세포의 수/비율의 감소;
VEGFA를 발현하는 세포의 세포 사멸의 증가.
해당 항원-결합 분자는 이전 문단에서 인용된 특성들 중 하나 초과를 나타낼 수 있다는 것을 이해할 것이다. 해당 항원-결합 분자는 적합한 분석법을 사용하여 이전 문단에서 인용된 특성들에 대해 평가할 수 있다. 분석법은 예를 들어 무세포 또는 세포-기반 분석법일 수 있는 인 비트로 분석법일 수 있다. 대안으로서, 분석법은 예를 들어 인 비보 분석법일 수 있으며, 즉 비-인간 동물에서 수행될 수 있다. 분석법은 검출을 용이하게 하기 위해 검출 가능한 엔티티 (detectable entities)로 표지된 종을 사용할 수 있다.
이러한 분석법의 결과의 분석은 관련 활성의 최대 수준의 50%가 달성되는 농도를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 관련 활성의 최대 수준의 50%가 달성되는 항원-결합 분자의 농도는 관련 활성에 대한 항원-결합 분자의 '반수-최대 유효 농도 (half-maximal effective concentration)'로서 지칭될 수 있으며, 이는 또한 'EC50'으로 지칭될 수 있다. 예시로서, VEGFA에 결합하기 위한 해당 항원-결합 분자의 EC50은 관련 종에 대한 결합의 최대 수준의 50%가 달성되는 농도일 수 있다.
특성에 따라, EC50은 '반수-최대 억제 농도 (half-maximal inhibitory concentration)' 또는 'IC50'으로 지칭될 수 있으며, 이는 해당 특성의 최대 억제 수준의 50%가 관찰되는 항원-결합 분자의 농도이다. 예시로서, VEGFA 및 VEGFR (예를 들어, VEGFR1) 간의 상호작용을 억제하기 위한 해당 항원-결합 분자의 IC50은 최대 억제 수준의 50%가 달성되는 농도일 수 있다.
본원에 기재된 항원-결합 분자 및 항원-결합 도메인은 바람직하게는 VEGFA에 대한 특이적 결합을 나타낸다. 본원에서 사용된, "특이적 결합 (specific binding)"은 항원에 대해 선택적인 결합을 지칭하며, 비-표적 항원에 대한 비-특이적 결합과 구별될 수 있다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자/도메인은 바람직하게는 다른 비-표적 분자에 결합하는 것보다 표적에 더 큰 친화도 및/또는 더 긴 기간으로 결합한다.
해당 분자에 특이적으로 결합하는 해당 폴리펩티드의 능력은 당해 기술 분야에 알려진 방법, 예컨대 ELISA, 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance) (SPR; 예를 들어 Hearty et al., Methods Mol Biol (2012) 907:411-442 참조), 생물층 간섭계 (Bio-Layer Interferometry) (예를 들어, Lad et al., (2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507 참조), 유세포 측정법 (flow cytometry), 또는 방사성표지된 항원-결합 분석 (radiolabelled antigen-binding assay: RIA) 효소-연결된 면역흡착 분석 (enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 분석을 통해 해당 분자에 대한 결합을 측정하고 정량화할 수 있다. 일부 구체예에서, 결합은 해당 분석에서 검출된 반응일 수 있다.
일부 구체예에서, 비-표적 분자에 대한 항원-결합 분자의 결합 정도는 예를 들어 ELISA, SPR, 생물층 간섭계 또는 RIA에 의해 측정 시에, 항체의 표적 분자에의 결합의 약 10% 미만이다. 대안으로서, 결합 특이성 (binding specificity)은 결합 친화도 (binding affinity)의 측면에서 반영될 수 있으며, 여기서 항원-결합 분자는 비-표적 분자에 대한 항원-결합 분자의 해리 상수 (KD)보다 적어도 0.1 차수 (즉, 0.1 x 10n, 여기서 n은 차수를 나타내는 정수임) 더 큰 해리 상수 (KD)로 결합한다. 이는 선택적으로 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 또는 2.0 중 하나일 수 있다.
VEGFA에 대한 결합은 예를 들어 본 개시내용의 실시예 8에 기재된 바와 같이 생물층 간섭계에 의해 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA에 결합한다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA를 포함하는 폴리펩티드 복합체에 결합한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자는 서브-마이크로몰의 친화도 (sub-micromolar affinity), 즉 KD ＜ 1 x 10-6 M으로 VEGFA에 결합한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자는 나노몰 범위 (nanomolar range)의 친화도, 즉 KD = 9.9 x 10-7 내지 1 x 10-9 M으로 VEGFA에 결합한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자는 서브-나노몰의 친화도 (sub-nanomolar affinity), 즉 KD < 1 x 10-9 M으로 VEGFA에 결합한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자는 피코몰 범위 (picomolar range)의 친화도, 즉 KD = 9.9 x 10-10 내지 1 x 10-12 M으로 VEGFA에 결합한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자는 서브-피코몰의 친화도 (sub-picomolar affinity), 즉 KD < 1 x 10-12 M으로 VEGFA에 결합한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자는 VEGFA (예를 들어, 인간 VEGF165)에 KD 5 μM 이하, 바람직하게는 ≤5 μM, ≤2 μM, ≤1 μM, ≤500 nM, ≤100 nM, ≤75 nM, ≤50 nM, ≤40 nM, ≤30 nM, ≤20 nM, ≤15 nM, ≤12.5 nM, ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM, ≤6 nM, ≤5 nM, ≤4 nM, ≤3 nM, ≤2 nM, ≤1 nM, ≤500 pM, ≤400 pM, ≤300 pM, ≤200 pM, ≤100 pM, ≤75 pM, ≤50 pM, ≤45 pM, ≤40 pM, ≤35 pM, ≤30 pM, ≤25 pM, ≤20 pM, ≤15 pM 또는 ≤10 pM으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 VEGFA (예를 들어, 인간 VEGF165)에 친화도 KD = ≤1 nM, ≤500 pM, ≤400 pM, ≤300 pM, ≤200 pM, ≤100 pM, ≤75 pM, ≤50 pM, ≤45 pM, ≤40 pM, ≤35 pM, ≤30 pM, ≤25 pM, ≤20 pM, ≤15 pM 또는 ≤10 pM으로 결합한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 KD (예를 들어, 본 개시내용의 실시예 8에 기재된 바와 같이, 예를 들어 BLI에 의해 결정 시에)가 동일한 분석법에서 라니비주맙 (ranibizumab) (즉, 서열 번호: 74 및 75의 폴리펩티드의 회합에 의해 형성된 분자)에 대해 결정된 KD와 유사하게 VEGFA (예를 들어, 인간 VEGF165)에 결합하고, KD (예를 들어, 본 개시내용의 실시예 8에 기재된 바와 같이, 예를 들어 BLI에 의해 결정 시에)가 동일한 분석법에서 라니비주맙에 대해 결정된 KD의 ≥ 0.5배 내지 ≤ 2배, 예를 들어 ≥ 0.55배 내지 ≤ 1.9배, ≥ 0.6배 내지 ≤ 1.8배, ≥ 0.65배 내지 ≤ 1.7배, ≥ 0.7배 내지 ≤ 1.6배, ≥ 0.75배 내지 ≤ 1.5배, ≥ 0.8배 내지 ≤ 1.4배, ≥ 0.85배 내지 ≤ 1.3배, ≥ 0.9배 내지 ≤ 1.2배, ≥ 0.95배 내지 ≤ 1.1배로 VEGFA (예를 들어, 인간 VEGF165)에 결합한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 KD (예를 들어, 본 개시내용의 실시예 8에 기재된 바와 같이, 예를 들어 BLI에 의해 결정 시에)가 동일한 분석법에서 라니비주맙에 대해 결정된 KD보다 더 낮게 VEGFA (예를 들어, 인간 VEGF165)에 결합한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 KD (예를 들어, 본 개시내용의 실시예 8에 기재된 바와 같이, 예를 들어 BLI에 의해 결정 시에)가 동일한 분석법에서 라니비주맙에 대해 결정된 KD보다 1배 미만, 예를 들어 ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배 또는 ≤0.5배로 VEGFA (예를 들어, 인간 VEGF165)에 결합한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 KD (예를 들어, 본 개시내용의 실시예 8에 기재된 바와 같이, 예를 들어 BLI에 의해 결정 시에)가 동일한 분석법에서 베바시주맙 (bevacizumab) (즉, 서열 번호: 76 및 77의 폴리펩티드의 회합에 의해 형성된 분자)에 대해 결정된 KD와 유사하게 VEGFA (예를 들어, 인간 VEGF165)에 결합하고, KD (예를 들어, 본 개시내용의 실시예 8에 기재된 바와 같이, 예를 들어 BLI에 의해 결정 시에)가 동일한 분석법에서 베바시주맙에 대해 결정된 KD의 ≥ 0.5배 내지 ≤ 2배, 예를 들어 ≥ 0.55배 내지 ≤ 1.9배, ≥ 0.6배 내지 ≤ 1.8배, ≥ 0.65배 내지 ≤ 1.7배, ≥ 0.7배 내지 ≤ 1.6배, ≥ 0.75배 내지 ≤ 1.5배, ≥ 0.8배 내지 ≤ 1.4배, ≥ 0.85배 내지 ≤ 1.3배, ≥ 0.9배 내지 ≤ 1.2배, ≥ 0.95배 내지 ≤ 1.1배로 VEGFA (예를 들어, 인간 VEGF165)에 결합한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 KD (예를 들어, 본 개시내용의 실시예 8에 기재된 바와 같이, 예를 들어 BLI에 의해 결정 시에)가 동일한 분석법에서 베바시주맙에 대해 결정된 KD보다 더 낮게 VEGFA (예를 들어, 인간 VEGF165)에 결합한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 KD (예를 들어, 본 개시내용의 실시예 8에 기재된 바와 같이, 예를 들어 BLI에 의해 결정 시에)가 동일한 분석법에서 베바시주맙에 대해 결정된 KD보다 1배 미만, 예를 들어 ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배 또는 ≤0.5배로 VEGFA (예를 들어, 인간 VEGF165)에 결합한다.
본 개시내용의 항원-결합 분자는 VEGFA의 특정 관심 영역에 결합할 수 있다. 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 인접한 아미노산 서열 (즉, 아미노산 1차 서열)로 구성된 VEGFA의 선형 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 아미노산 서열의 아미노산의 불연속 서열로 구성된 VEGFA의 입체형태 에피토프 (conformational epitope)에 결합할 수 있다.
항원-결합 분자가 결합하는 해당 표적 분자의 영역은 항체-항원 복합체의 X선 공결정학 분석 (X-ray co-crystallography analysis), 펩티드 스캐닝 (peptide scanning), 돌연변이 유발 맵핑 (mutagenesis mapping), 질량 분석법에 의한 수소-중수소 교환 분석 (hydrogen-deuterium exchange analysis by mass spectrometry), 파지 디스플레이 (phage display), 경쟁 ELISA (competition ELISA) 및 단백질분해-기반 '보호' 방법 (proteolysis-based 'protection' methods)을 포함하는 당해 기술 분야에 잘 알려진 다양한 방법을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 Gershoni et al., BioDrugs, 2007, 21(3):145-156에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA의 동일한 영역, 또는 VEGFA의 중복 영역, 16C2.1 및 21A5.1로부터 선택된 VEGFA-결합 단일 도메인 항체의 CDR, FR 및/또는 완전한 아미노산 서열을 포함하는 항원-결합 분자에 의해 결합된 VEGFA의 영역에 결합한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA가 VEGFR (예를 들어, VEGFR1 및/또는 VEGFR2)에 결합하는 VEGFA의 영역에 결합한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 VEGFR (예를 들어, VEGFR1)에 의해 결합되는 영역에서 VEGFA에 결합한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 VEGFR (예를 들어, VEGFR1) 및 VEGFA 간의 상호작용을 억제한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 VEGFA에 대한 VEGFR (예를 들어, VEGFR1)의 결합의 경쟁적 억제제이다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 VEGFA가 VEGFR (예를 들어, VEGFR1)에 결합하는 것을 차단한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 VEGFR (예를 들어, VEGFR1)이 결합하는 VEGFA의 영역을 점유함으로써, VEGFR (예를 들어, VEGFR1) 및 VEGFA 간의 상호작용을 억제한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 VEGFA 및 VEGFR (예를 들어, VEGFR1)을 포함하는 복합체로부터 VEGFR (예를 들어, VEGFR1)을 대체한다.
2개의 인자들 간의 상호작용을 억제하는 항원-결합 분자의 능력은 예를 들어 항체/단편의 존재 시에, 또는 항체/단편과 상호작용 파트너들 중 하나 또는 둘 모두와의 인큐베이션 후에 상호작용의 분석에 의해 결정될 수 있다. 해당 항원-결합 분자가 2개의 상호작용 파트너들 간의 상호작용을 억제하는지 여부를 결정하기 위한 적합한 분석법의 예는 경쟁 ELISA 분석법이다. 해당 상호작용 (예를 들어, VEGFA 및 VEGFR 간의 상호작용)을 억제하는 항원-결합 분자는 항원-결합 분자의 부재 (또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재) 시의 상호작용 수준과 비교하여, 항원-결합 분자의 존재 시에, 또는 항원-결합 분자와 상호작용 파트너들 중 하나 또는 둘 모두와의 인큐베이션 후에 상호작용 파트너들 간의 상호작용 수준의 감소/줄어듦의 관찰로 확인된다. 적절한 분석은 예를 들어 재조합 상호작용 파트너를 사용하거나 또는 상호작용 파트너를 발현하는 세포를 사용하여 인 비트로 수행할 수 있다. 상호작용 파트너를 발현하는 세포는 내인성으로 발현할 수 있거나, 또는 세포에 도입된 핵산으로부터 발현할 수 있다. 이러한 분석법의 목적을 위해, 상호작용 파트너 및/또는 항원-결합 분자 중 하나 또는 둘 모두는 상호작용의 수준을 검출 및/또는 측정할 목적으로 검출 가능한 엔티티로 표지되거나 또는 이와 함께 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA 및 VEGFR1 (예를 들어, 인간 VEGF121 및 인간 VEGFR1) 간의 상호작용을, IC50 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 예를 들어 본 개시내용의 실시예 9에 기재된 경쟁 ELISA로 결정 시에) 10 μM 이하, 바람직하게는 ≤5 μM, ≤2 μM, ≤1 μM, ≤500 nM, ≤100 nM, ≤75 nM, ≤50 nM, ≤40 nM, ≤30 nM, ≤20 nM, ≤15 nM, ≤12.5 nM, ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM, ≤6 nM, ≤5 nM, ≤4 nM 또는 ≤3 nM로 억제한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 IC50 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 예를 들어 본 개시내용의 실시예 9에 기재된 경쟁 ELISA로 결정 시에)이 동일한 분석법에서 라니비주맙 (즉, 서열 번호: 74 및 75의 폴리펩티드의 회합에 의해 형성된 분자)에 대해 결정된 이러한 상호작용의 억제에 대한 IC50과 유사하게 VEGFA 및 VEGFR1 (예를 들어, 인간 VEGF121 및 인간 VEGFR1) 간의 상호작용을 억제한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 IC50 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 예를 들어 본 개시내용의 실시예 9에 기재된 경쟁 ELISA로 결정 시에)이 동일한 분석법에서 라니비주맙에 의한 이러한 상호작용의 억제에 대한 IC50 값에 대해 ≥ 0.5배 내지 ≤ 2배, 예를 들어 ≥ 0.55배 내지 ≤ 1.9배, ≥ 0.6배 내지 ≤ 1.8배, ≥ 0.65배 내지 ≤ 1.7배, ≥ 0.7배 내지 ≤ 1.6배, ≥ 0.75배 내지 ≤ 1.5배, ≥ 0.8배 내지 ≤ 1.4배, ≥ 0.85배 내지 ≤ 1.3배, ≥ 0.9배 내지 ≤ 1.2배, ≥ 0.95배 내지 ≤ 1.1배로 VEGFA 및 VEGFR1 (예를 들어, 인간 VEGF121 및 인간 VEGFR1) 간의 상호작용을 억제한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 IC50 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 예를 들어 본 개시내용의 실시예 9에 기재된 경쟁 ELISA로 결정 시에)이 동일한 분석법에서 라니비주맙에 대해 결정된 이러한 상호작용의 억제에 대한 IC50보다 더 낮게 VEGFA 및 VEGFR1 (예를 들어, 인간 VEGF121 및 인간 VEGFR1) 간의 상호작용을 억제한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 IC50 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 예를 들어 본 개시내용의 실시예 9에 기재된 경쟁 ELISA로 결정 시에)이 동일한 분석법에서 라니비주맙에 의한 이러한 상호작용의 억제에 대한 IC50 값에 대해 1배 미만, 예를 들어 ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배 또는 ≤0.5배로 VEGFA 및 VEGFR1 (예를 들어, 인간 VEGF121 및 인간 VEGFR1) 간의 상호작용을 억제한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 IC50 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 예를 들어 본 개시내용의 실시예 9에 기재된 경쟁 ELISA로 결정 시에)이 동일한 분석법에서 베바시주맙 (즉, 서열 번호: 76 및 77의 폴리펩티드의 회합에 의해 형성된 분자)에 대해 결정된 이러한 상호작용의 억제에 대한 IC50과 유사하게 VEGFA 및 VEGFR1 (예를 들어, 인간 VEGF121 및 인간 VEGFR1) 간의 상호작용을 억제한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 IC50 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 예를 들어 본 개시내용의 실시예 9에 기재된 경쟁 ELISA로 결정 시에)이 동일한 분석법에서 베바시주맙에 의한 이러한 상호작용의 억제에 대한 IC50 값에 대해 ≥ 0.5배 내지 ≤ 2배, 예를 들어 ≥ 0.55배 내지 ≤ 1.9배, ≥ 0.6배 내지 ≤ 1.8배, ≥ 0.65배 내지 ≤ 1.7배, ≥ 0.7배 내지 ≤ 1.6배, ≥ 0.75배 내지 ≤ 1.5배, ≥ 0.8배 내지 ≤ 1.4배, ≥ 0.85배 내지 ≤ 1.3배, ≥ 0.9배 내지 ≤ 1.2배, ≥ 0.95배 내지 ≤ 1.1배로 VEGFA 및 VEGFR1 (예를 들어, 인간 VEGF121 및 인간 VEGFR1) 간의 상호작용을 억제한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 IC50 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 예를 들어 본 개시내용의 실시예 9에 기재된 경쟁 ELISA로 결정 시에)이 동일한 분석법에서 베바시주맙에 대해 결정된 이러한 상호작용의 억제에 대한 IC50보다 더 낮게 VEGFA 및 VEGFR1 (예를 들어, 인간 VEGF121 및 인간 VEGFR1) 간의 상호작용을 억제한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 IC50 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 예를 들어 본 개시내용의 실시예 9에 기재된 경쟁 ELISA로 결정 시에)이 동일한 분석법에서 베바시주맙에 의한 이러한 상호작용의 억제에 대한 IC50 값에 대해 1배 미만, 예를 들어 ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배 또는 ≤0.5배로 VEGFA 및 VEGFR1 (예를 들어, 인간 VEGF121 및 인간 VEGFR1) 간의 상호작용을 억제한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 (즉, VEGFA의 VEGFR에의 결합에 의해 매개되는 신호전달)을 억제한다. VEGFA/VEGFR-매개 신호전달은 예를 들어 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달을 검출 및/또는 정량화하기 위한 분석법에서 VEGFR-발현 세포를 사용하여 분석될 수 있다.
VEGFA/VEGFR-매개 신호전달을 조사하기 위한 적합한 분석법은 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달의 결과로서 인산화/활성화/발현되는 인자의 인산화/활성/발현을 검출하는 분석법을 포함한다. 이러한 분석법은 VEGFA의 존재하에 VEGFR-발현 세포를 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. VEGFA/VEGFR-매개 신호전달을 조사하기 위한 분석법은 PI3K/AKT, MAPK/ERK 및/또는 PLC-γ 경로, 및/또는 SCR 및/또는 FAK를 통한 신호전달을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 항원-결합 분자는 항원-결합 분자의 부재 (또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재) 시에 이러한 신호전달 수준의 1배 미만, 예를 들어 ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배, ≤0.05배 또는 ≤0.01배로 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 (예를 들어, 인간 VEGF121의 인간 VEGFR1에의 결합에 의해 매개되는 신호전달)을 억제할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 IC50이 동일한 분석법에서 라니비주맙 (즉, 서열 번호: 74 및 75의 폴리펩티드의 회합에 의해 형성된 분자)에 대해 결정된 이러한 상호작용의 억제에 대한 IC50과 유사하게 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 (예를 들어, 인간 VEGF121의 인간 VEGFR1에의 결합에 의해 매개되는 신호전달)을 억제한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 IC50이 동일한 분석법에서 라니비주맙에 의한 이러한 신호전달의 억제에 대한 IC50 값에 대해 ≥ 0.5배 내지 ≤ 2배, 예를 들어 ≥ 0.55배 내지 ≤ 1.9배, ≥ 0.6배 내지 ≤ 1.8배, ≥ 0.65배 내지 ≤ 1.7배, ≥ 0.7배 내지 ≤ 1.6배, ≥ 0.75배 내지 ≤ 1.5배, ≥ 0.8배 내지 ≤ 1.4배, ≥ 0.85배 내지 ≤ 1.3배, ≥ 0.9배 내지 ≤ 1.2배, ≥ 0.95배 내지 ≤ 1.1배로 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 (예를 들어, 인간 VEGF121의 인간 VEGFR1에의 결합에 의해 매개되는 신호전달)을 억제한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 IC50이 동일한 분석법에서 라니비주맙에 대해 결정된 이러한 상호작용의 억제에 대한 IC50보다 더 낮게 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 (예를 들어, 인간 VEGF121의 인간 VEGFR1에의 결합에 의해 매개되는 신호전달)을 억제한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 IC50이 동일한 분석법에서 라니비주맙에 의한 이러한 신호전달의 억제에 대한 IC50 값에 대해 1배 미만, 예를 들어 ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배 또는 ≤0.5배로 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 (예를 들어, 인간 VEGF121의 인간 VEGFR1에의 결합에 의해 매개되는 신호전달)을 억제한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 IC50이 동일한 분석법에서 베바시주맙 (즉, 서열 번호: 76 및 77의 폴리펩티드의 회합에 의해 형성된 분자)에 대해 결정된 이러한 상호작용의 억제에 대한 IC50과 유사하게 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 (예를 들어, 인간 VEGF121의 인간 VEGFR1에의 결합에 의해 매개되는 신호전달)을 억제한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 IC50이 동일한 분석법에서 베바시주맙에 의한 이러한 신호전달의 억제에 대한 IC50 값에 대해 ≥ 0.5배 내지 ≤ 2배, 예를 들어 ≥ 0.55배 내지 ≤ 1.9배, ≥ 0.6배 내지 ≤ 1.8배, ≥ 0.65배 내지 ≤ 1.7배, ≥ 0.7배 내지 ≤ 1.6배, ≥ 0.75배 내지 ≤ 1.5배, ≥ 0.8배 내지 ≤ 1.4배, ≥ 0.85배 내지 ≤ 1.3배, ≥ 0.9배 내지 ≤ 1.2배, ≥ 0.95배 내지 ≤ 1.1배로 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 (예를 들어, 인간 VEGF121의 인간 VEGFR1에의 결합에 의해 매개되는 신호전달)을 억제한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 IC50이 동일한 분석법에서 베바시주맙에 대해 결정된 이러한 상호작용의 억제에 대한 IC50보다 더 낮게 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 (예를 들어, 인간 VEGF121의 인간 VEGFR1에의 결합에 의해 매개되는 신호전달)을 억제한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 IC50이 동일한 분석법에서 베바시주맙에 의한 이러한 신호전달의 억제에 대한 IC50 값에 대해 1배 미만, 예를 들어 ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배 또는 ≤0.5배로 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 (예를 들어, 인간 VEGF121의 인간 VEGFR1에의 결합에 의해 매개되는 신호전달)을 억제한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 열 처리 전 및 후에 유사한 친화도로 VEGFA (예를 들어, 인간 VEGFA)에 결합한다. 열 처리는 실온, 60℃, 70℃ 또는 80℃에서 적절한 버퍼 (예를 들어, PBS 중 0.1% BSA 및 0.01% Tween-20을 포함하는 버퍼)에서 1시간 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 열 처리는 본 개시내용의 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 열 처리 전, 및 실온에서 1시간 동안 열 처리 후에, VEGFA에 대해 유사한 친화도를 나타낸다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 열 처리 전, 및 60℃에서 1시간 동안 열 처리 후에, VEGFA에 대해 유사한 친화도를 나타낸다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 열 처리 전, 및 70℃에서 1시간 동안 열 처리 후에, VEGFA에 대해 유사한 친화도를 나타낸다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 열 처리 전, 및 80℃에서 1시간 동안 열 처리 후에, VEGFA에 대해 유사한 친화도를 나타낸다.
본원에서, 참조 결합 친화도와 '유사한 (similar)' 결합 친화도 (binding affinity)는 동일한 분석법에서 결정 시에, 참조 결합 친화도의 50% 이내, 예를 들어 40%, 45%, 30%, 25%, 20% 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이내인 결합 친화도를 의미한다.
VEGFA (예를 들어, 인간 VEGFA)에의 결합에 대한 KD는 열 처리 전 및 후에 유사할 수 있다. 본원에서, 참조 값과 '유사한 (similar)' KD 값은 참조 값의 ≥ 0.5배 내지 ≤ 2배, 예를 들어 ≥ 0.7배 내지 ≤ 1.5배, ≥ 0.75배 내지 ≤ 1.25배, ≥ 0.8배 내지 ≤ 1.2배, ≥ 0.85배 내지 ≤ 1.15배, ≥ 0.9배 내지 ≤ 1.1배, ≥ 0.91배 내지 ≤ 1.09배, ≥ 0.92배 내지 ≤ 1.08배, ≥ 0.93배 내지 ≤ 1.07배, ≥ 0.94배 내지 ≤ 1.06배, ≥ 0.95배 내지 ≤ 1.05배, ≥ 0.96배 내지 ≤ 1.04배, ≥ 0.97배 내지 ≤ 1.03배, ≥ 0.98배 내지 ≤ 1.02배, 또는 ≥ 0.99배 내지 ≤ 1.01배일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA를 포함/발현하는 세포의 세포 사멸을 강화 (즉, 상향조절, 증진)할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA를 포함/발현하는 세포의 수/비율을 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 이러한 세포를 고갈/고갈 증진시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA를 포함/발현하는 세포의 수/비율을 해당 분석법에서 항원-결합 분자의 부재 시에, 또는 동일한 양의 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재 시에 관찰되는 그러한 세포의 수/비율의 1배 미만, 예를 들어 ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배, ≤0.05배 또는 ≤0.01배로 감소시킨다.
본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA를 포함/발현하는 세포의 수/비율의 감소를 강화하기 위한 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 예를 들어 Fc 영역 및/또는 약물 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA를 포함/발현하는 세포에 대한 ADCC, ADCP, CDC 중 하나 이상을 강화/지시할 수 있고, 및/또는 상기 세포 상에 MAC 형성 또는 이의 세포 탈과립화를 강화할 수 있는 Fc 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA를 포함/발현하는 세포에 대해 ADCC를 강화/지시할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 약물 모이어티를 포함한다. 항원-결합 분자는 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 항체-약물 접합체는 예를 들어 Parslow et al., Biomedicines. 2016 Sep; 4(3):14 (본원에 참조로 통합됨)에서 검토되었다. 일부 구체예에서, 약물 모이어티는 항원-결합 분자가 VEGFA를 포함/발현하는 세포에 대해 세포독성을 나타내도록 하는 세포독성제이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 약물 모이어티는 화학요법제이거나 또는 이를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 면역 세포-인게이징 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 분자는 CD3 폴리펩티드-결합 모이어티 (예를 들어, CD3 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인)를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA를 포함/발현하는 세포에 대한 T 세포-매개 세포용해 활성을 강화/지시할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA를 포함/발현하는 세포의 수/비율을 해당 분석법에서 항원-결합 분자의 부재 시에, 또는 동일한 양의 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재 시에 관찰되는 그러한 세포의 수/비율의 1배 미만, 예를 들어 ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배, ≤0.05배 또는 ≤0.01배로 감소시킨다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자는 VEGFA를 포함/발현하는 세포의 사멸 수준을 해당 분석법에서 항원-결합 분자의 부재 시에, 또는 동일한 양의 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재 시에 관찰되는 그러한 세포의 사멸 수준의 1배 초과, 예를 들어 ≥1.5배, ≥2배, ≥3배, ≥4배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배, ≥10배, ≥15배, ≥20배, ≥30배, ≥40배 또는 ≥50배로 증가시킨다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor: CAR)를 제공한다.
CAR는 항원-결합 및 T 세포 활성화 기능을 모두 제공하는 재조합 수용체이다. CAR 구조 및 공학은 예를 들어 Dotti et al., Immunol Rev (2014) 257(1)에서 검토되었고, 그 전체 내용이 본원에 참조로 통합된다. CAR는 신호전달 영역 및 세포막 앵커 영역 (cell membrane anchor region)에 연결된 항원-결합 영역을 포함한다. 선택적 힌지 영역은 항원-결합 영역 및 세포막 앵커 영역 간의 분리를 제공할 수 있으며, 가요성 링커로 작용할 수 있다.
본 개시내용의 CAR는 본 개시내용의 항원-결합 분자를 포함하거나 또는 이로 구성되거나, 또는 본 개시내용에 따른 단일 도메인 항체 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 항원-결합 영역을 포함한다. 즉, 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자/단일 도메인 항체 서열은 CAR의 항원 결합 영역에 포함되거나 또는 이를 구성한다.
세포막 앵커 영역은 CAR의 신호전달 영역과 항원-결합 영역 사이에 제공되며, CAR를 발현하는 세포의 세포막에 CAR를 고정하기 위해 제공되며, 여기서 항원-결합 영역은 세포외 공간에, 신호전달 영역은 세포 내부에 존재한다. 일부 구체예에서, CAR는 CD3-ζ, CD4, CD8 또는 CD28 중 하나에 대한 막횡단 영역 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 세포막 앵커 영역을 포함한다. 본원에서 사용된, 참조 아미노산 서열로부터 '유래된' 영역은 참조 서열에 대해 적어도 60%, 예를 들어 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
CAR의 신호전달 영역은 T 세포의 활성화를 가능하게 한다. CAR 신호전달 영역은 CD3-ζ의 세포내 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 CAR-발현 T 세포의 인산화 및 활성화를 위한 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM)를 제공한다. FcγRI와 같은 다른 ITAM-함유 단백질의 서열을 포함하는 신호전달 영역이 또한 CAR에 사용되었다 (Haynes et al., 2001 J Immunol 166(1):182-187). CAR의 신호전달 영역은 또한 표적 단백질에 결합 시에 CAR-발현 T 세포의 활성화를 촉진하기 위해, 공동-자극 분자의 신호전달 영역으로부터 유래된 공동-자극 서열을 포함할 수 있다. 적합한 공동-자극 분자는 CD28, OX40, 4-1BB, ICOS 및 CD27을 포함한다. 일부 경우에, CAR는 상이한 세포내 신호전달 경로의 공동-자극을 제공하도록 조작된다. 예를 들어, CD28 공동-자극과 관련된 신호전달은 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (phosphatidylinositol 3-kinase: PI3K) 경로를 우선적으로 활성화하는 반면에, 4-1BB-매개 신호전달은 TNF 수용체 관련 인자 (TNF receptor associated factor: TRAF) 어댑터 단백질을 통해 수행된다. 그러므로, CAR의 신호전달 영역은 때때로 하나 초과의 공동-자극 분자의 신호전달 영역으로부터 유래된 공동-자극 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, 본 개시내용의 CAR는 CD28, OX40, 4-1BB, ICOS 및 CD27 중 하나 이상의 세포내 도메인의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 하나 이상의 공동-자극 서열을 포함한다.
선택적 힌지 영역은 항원-결합 도메인 및 막횡단 도메인 간의 분리를 제공할 수 있으며, 가요성 링커로 작용할 수 있다. 힌지 영역 (hinge regions)은 IgG1로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시내용의 CAR는 IgG1의 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 힌지 영역을 포함한다.
또한, 본 개시내용에 따른 CAR를 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시내용에 따른 CAR는 CAR-발현 면역 세포, 예를 들어 CAR-T 또는 CAR-NK 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. CAR의 면역 세포로의 조작은 배양 중에 인 비트로 수행될 수 있다.
본 개시내용의 CAR의 항원-결합 영역은 임의의 적합한 포맷, 예를 들어 scFv, scFab 등으로 제공될 수 있다.
핵산 및 벡터
본 개시내용은 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자 및 CAR를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 구체예에서, 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함하거나 또는 이로 구성된다.
본 개시내용은 또한 이전 문단에 따른 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시내용에 따른 핵산 및 벡터는 정제되거나 또는 단리된 형태, 즉 다른 핵산 또는 자연 발생 생물학적 물질로부터 정제되거나 또는 단리된 형태로 제공될 수 있다.
본 개시내용에 따른 핵산의 뉴클레오티드 서열은 벡터, 예를 들어 발현 벡터에 함유될 수 있다. 본원에서 사용된 "벡터 (vector)"는 외인성 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 비히클로 사용되는 핵산 분자이다. 벡터는 세포에서 핵산의 발현을 위한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 발현될 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 종결 코돈 및 발현 인핸서를 포함할 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 임의의 적합한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 종결 코돈을 사용하여 본 개시내용에 따른 벡터로부터 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된 (operably linked)"은 선택된 핵산 서열 및 조절 핵산 서열 (예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서)이 핵산 서열의 발현을 조절 서열의 영향 또는 제어하에 두는 방식 (이에 의해 발현 카세트를 형성함)으로 공유결합으로 연결된 상황을 포함할 수 있다. 따라서, 조절 서열이 핵산 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우 조절 서열은 선택된 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 생성된 전사체는 그 다음에 목적하는 펩티드(들)/폴리펩티드(들)로 번역될 수 있다.
적합한 벡터는 플라스미드, 이진 벡터 (binary vectors), DNA 벡터, mRNA 벡터, 바이러스 벡터 (예를 들어, 감마레트로바이러스 벡터 (예: 뮤린 백혈병 바이러스 (murine Leukemia virus: MLV)-유래 벡터), 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 헤르페스바이러스 벡터), 트랜스포존-기반 벡터 (transposon-based vectors) 및 인공 염색체 (예: 효모 인공 염색체)를 포함한다.
일부 구체예에서, 벡터는 진핵 벡터 (eukaryotic vector), 예를 들어 진핵 세포에서 벡터로부터의 단백질 발현에 필요한 요소를 포함하는 벡터일 수 있다. 일부 구체예에서, 벡터는 단백질 발현을 유도하기 위한 포유동물 발현 벡터, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus: CMV) 또는 SV40 프로모터를 포함하는 포유동물 발현 벡터일 수 있다.
항원-결합 분자/CAR를 포함/발현하는 세포
본 개시내용은 또한 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자 및 CAR를 포함하거나 또는 발현하는 세포를 제공한다. 또한, 본 개시내용에 따른 핵산 또는 벡터를 포함하거나 또는 발현하는 세포를 제공한다.
세포는 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포일 수 있다. 포유동물은 영장류 (레수스, 시노몰구스, 비-인간 영장류 또는 인간) 또는 비-인간 포유동물 (예를 들어, 토끼, 기니피그, 래트 (rat), 마우스 (mouse) 또는 기타 설치류 (로덴티아 목 (order Rodentia)의 모든 동물 포함), 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 소 (cattle) (암소, 예를 들어 젖소, 또는 Bos 목 (order Bos)의 모든 동물 포함), 말 (에퀴다에 목 (order Equidae)의 모든 동물 포함), 당나귀 및 비-인간 영장류)일 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 인간에서 요법 (therapy)에 사용하기 위한 폴리펩티드의 발현에 통상적으로 사용되는 세포 타입이거나 또는 이로부터 유래된다. 예시되는 세포는 예를 들어 Kunert and Reinhart, Appl Microbiol Biotechnol. (2016) 100:3451-3461 (그 전체가 본원에 참조로 통합됨)에 기재되어 있으며, 예를 들어 CHO, HEK 293, PER.C6, NS0 및 BHK 세포를 포함한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용에 따른 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시내용에 따른 핵산 또는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 단리된 핵산(들) 또는 벡터(들)을 세포 내로 도입하는 것은 형질전환, 형질감염, 전기천공 또는 형질도입 (예를 들어, 레트로바이러스 형질도입)을 포함한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용에 따른 항원-결합 분자/CAR를 발현/포함하는 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시내용에 따른 핵산 또는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 세포에 의한 핵산/벡터의 발현에 적합한 조건하에 상기 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 인 비트로 수행된다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용에 따른 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능한 세포를 제공한다.
항원-결합 분자 및 폴리펩티드의 생성
본 개시내용에 따른 항원-결합 분자 및 폴리펩티드는 당업자에게 알려진 폴리펩티드의 생성 방법에 따라 제조될 수 있다.
폴리펩티드는 화학적 합성, 예를 들어 액상 또는 고상 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩티드/폴리펩티드는 예를 들어 Chandrudu et al., Molecules (2013), 18: 4373-4388에 기재된 방법을 사용하여 합성할 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
대안으로서, 항원-결합 분자 및 폴리펩티드는 재조합 발현에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩티드의 재조합 생성에 적합한 분자 생물학 기술은 당해 기술 분야에 잘 알려진 기술, 예컨대 Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Edition), Cold Spring Harbor Press, 2012, 및 Nat Methods. (2008); 5(2): 135-146에 제시된 기술이며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다. 항원-결합 분자의 재조합 생성 방법은 또한 Frenzel et al., Front Immunol. (2013); 4: 217 및 Kunert and Reinhart, Appl Microbiol Biotechnol. (2016) 100: 3451-3461에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
본 개시내용에 따른 재조합 생성을 위해, 폴리펩티드의 발현에 적합한 임의의 세포가 사용될 수 있다. 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 원핵 세포, 예컨대 고세균 또는 박테리아의 세포이다. 일부 구체예에서, 박테리아는 그람-음성 박테리아, 예컨대 엔테로박테리아세에 과 (family Enterobacteriaceae)의 박테리아, 예를 들어 대장균 (Escherichia coli)일 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 진핵 세포, 예컨대 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포, 예를 들어 상기 기재된 세포이다.
일부 경우에, 일부 원핵 세포는 진핵 세포와 동일한 폴딩 또는 번역 후 변형이 가능하지 않기 때문에 상기 세포는 원핵 세포가 아니다. 또한, 진핵세포에서는 매우 높은 발현 수준이 가능하며, 적절한 태그 (tags)를 사용하여 진핵세포로부터 단백질을 더 용이하게 정제할 수 있다. 단백질을 배지로의 분비를 증진시키는데 특정 플라스미드가 또한 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 무세포 단백질 합성 (cell-free-protein synthesis: CFPS)에 의해, 예를 들어 Zemella et al. Chembiochem (2015) 16(17): 2420-2431에 기재된 시스템에 따라 제조될 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
생성에는 관심 폴리펩티드(들)를 발현하도록 변형된 진핵 세포의 배양 또는 발효를 포함할 수 있다. 배양 또는 발효는 영양소, 공기/산소 및/또는 성장 인자의 적절한 공급이 제공된 생물반응기에서 수행될 수 있다. 분비된 단백질은 세포로부터 배양 배지/발효액을 분할하고, 단백질 내용물을 추출하고, 개별 단백질을 분리하여 분비된 폴리펩티드(들)를 단리함으로써 수집할 수 있다. 배양, 발효 및 분리 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Edition; 본원에 참조로 통합됨)에 기재되어 있다.
생물반응기는 세포가 배양될 수 있는 하나 이상의 용기 (vessels)를 포함한다. 생물반응기에서의 배양은 반응물들의 반응기로의 연속 유동, 및 반응기로부터 배양된 세포의 연속 유동으로 연속적으로 발생할 수 있다. 대안으로서, 배양은 회분식 (batches)으로 발생할 수 있다. 생물반응기는 배양 중인 세포에 최적의 조건이 제공되도록 용기내 환경적 조건 예컨대 pH, 산소, 유입 및 유출 속도, 및 교반을 모니터링하고 제어한다.
항원-결합 분자를 발현하는 세포를 배양한 후에, 항원-결합 분자를 (예를 들어, 세포 배양 상등액으로부터) 단리 또는 정제할 수 있다. 배양 중인 세포로부터 발현에 의해 생성된 관심 폴리펩티드를 단리/정제하기 위한 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다.
폴리펩티드를 단리하기 위해서는 영양 배지로부터 세포를 분리하는 것이 필요할 수 있다. 폴리펩티드가 세포로부터 분비되는 경우, 세포는 분비된 관심 폴리펩티드를 함유하는 배양 배지로부터 원심분리에 의해 분리될 수 있다. 관심 폴리펩티드가 세포 내에서 수집되는 경우, 단백질 단리는 세포 배양 배지로부터 세포를 분리하기 위한 원심분리, 세포 펠렛을 용해 버퍼로 처리, 및 세포 파괴, 예를 들어 초음파 처리, 급속 동결-해동 또는 삼투 용해에 의한 세포 파괴를 포함할 수 있다.
그 다음에 다른 단백질 및 비-단백질 성분을 함유할 수 있는 상등액 또는 배양 배지로부터 관심 폴리펩티드를 단리하는 것이 바람직할 수 있다. 상등액 또는 배양 배지로부터 단백질 성분을 분리하는 일반적인 방법은 침전에 의한 것이다. 용해도가 서로 다른 단백질들은 서로 다른 농도의 침전제 (precipitating agent) 예컨대 황산암모늄으로 침전된다. 예를 들어, 저농도의 침전제에서, 수용해성 단백질이 추출된다. 따라서, 상이한 증가하는 농도의 침전제를 첨가함으로써, 서로 다른 용해도를 갖는 단백질들을 구별할 수 있다. 후속하여 분리된 단백질로부터 황산암모늄을 제거하기 위해 투석을 사용할 수 있다.
서로 다른 단백질들을 구별하기 위한 다른 방법, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 크로마토그래피가 당해 기술 분야에 알려져 있다. 이들은 침전에 대한 대안으로 사용될 수 있거나 또는 침전 이후에 수행될 수 있다.
관심 폴리펩티드가 배양물로부터 단리되면 폴리펩티드를 농축하는 것이 바람직하거나 또는 필요할 수 있다. 한외여과 또는 동결건조와 같은 단백질을 농축하기 위한 다수의 방법이 당해 기술 분야에 알려져 있다.
조성물
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터 및 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터 및 세포는 임상 사용을 위한 약학 조성물 또는 약제로 제제화될 수 있고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 아쥬반트를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 (예를 들어, 리포솜, 미셀, 미소구체, 나노입자), 희석제/부형제 (예를 들어, 전분, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 폴리올, 덱스트로스, 말토덱스트린, 마그네슘 스테아레이트), 아쥬반트, 충전제, 완충제, 보존제 (예를 들어, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 레티닐 팔미테이트, 셀레늄, 시스테인, 메티오닌, 시트르산, 소듐 시트레이트, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤), 항산화제 (예를 들어, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 레티닐 팔미테이트, 셀레늄), 활택제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 실리카, 스테아르산, 식물성 스테아린), 결합제 (예를 들어, 수크로스, 락토스, 전분, 셀룰로스, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 크실리톨, 소르비톨, 만니톨), 안정화제, 가용화제, 계면활성제 (예를 들어, 습윤제), 차폐제 또는 착색제 (예를 들어, 산화티탄)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 '약학적으로 허용 가능한 (pharmaceutically-acceptable)'은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 해당 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 합리적인 유익/위험 비율에 상응하는, 화합물, 성분, 물질, 조성물, 제형 등에 관한 것이다. 본 개시내용에 따른 조성물 중 각 담체, 희석제, 부형제, 아쥬반트, 충전제, 완충제, 보존제, 항산화제, 활택제, 결합제, 안정화제, 가용화제, 계면활성제, 차폐제, 착색제, 풍미제 또는 감미제는 또한 제제의 다른 성분들과 적합하다는 의미에서 '허용 가능'해야 한다. 적합한 담체, 희석제, 부형제, 아쥬반트, 충전제, 완충제, 보존제, 항산화제, 활택제, 결합제, 안정화제, 가용화제, 계면활성제, 차폐제, 착색제, 풍미제 또는 감미제는 표준 약학 문헌, 예를 들어 Remington's 'The Science and Practice of Pharmacy' (Ed. A. Adejare), 23rd Edition (2020), Academic Press에서 찾을 수 있다.
조성물은 국소, 비경구, 전신, 강내 (intracavitary), 정맥내, 동맥내, 근육내, 경막내 (intrathecal), 안구내, 결막내, 종양내, 피하, 피부내, 경막내 (intrathecal), 경구 또는 경피 투여 경로용으로 제제화될 수 있다. 일부 구체예에서, 약학 조성물/약제는 주사 (injection) 또는 주입 (infusion)에 의한 투여, 또는 섭취 (ingestion)에 의한 투여를 위해 제제화될 수 있다.
적합한 제제는 멸균 또는 등장성 매질에 항원-결합 분자를 포함할 수 있다. 약제 및 약학 조성물은 겔을 포함하는 유체 형태로 제제화될 수 있다. 유체 제제는 인간 또는 동물 신체의 선택된 영역에 주사 또는 주입에 의한 (예를 들어, 카테터를 통한) 투여를 위해 제제화될 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 예를 들어 관심 혈관 또는 조직/기관으로의 주사 또는 주입을 위해 제제화된다.
본 개시내용은 또한 약학적으로 유용한 조성물의 제조 방법을 제공하며, 이러한 제조 방법은 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터 또는 세포를 생성하는 단계; 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터 또는 세포를 단리하는 단계; 및/또는 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터 또는 세포를 약학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트, 부형제 또는 희석제와 혼합하는 단계로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 개시내용의 추가 양상은 질병/병태 (예를 들어, 본원에 기재된 질병/병태)의 치료에 사용하기 위한 약제 또는 약학 조성물을 제제화 또는 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터 또는 세포를 약학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트, 부형제 또는 희석제와 혼합함으로써 약학 조성물 또는 약제를 제제화하는 단계를 포함한다.
치료 및 예방 적용
본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 조성물은 치료 및 예방 방법에서의 용도를 발견하였다.
본 개시내용은 의학적 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물을 제공한다. 또한, 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물의 용도를 제공한다. 또한, 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물의 치료적 또는 예방적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용에 따른 치료적 또는 예방적 중재적 시술은 질병/병태의 발달 또는 진행의 감소, 질병/병태의 증상의 완화, 또는 질병/병태의 병리의 감소에 효과적일 수 있다. 상기 중재적 시술은 질병/병태의 진행의 방지, 예를 들어 질병/병태의 악화 방지, 또는 질병/병태의 발달 속도의 지연에 효과적일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 질병/병태의 개선, 예를 들어 질병/병태의 증상의 감소 또는 질병/병태의 중증도/활성의 일부 다른 상관관계의 감소를 유도할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 후기 단계 (예를 들어, 보다 심각한 단계 또는 만성 단계)로의 질병/병태의 발달을 방지할 수 있다.
본원에서 사용된, 예를 들어 장애의, 용어 '발달하다 (develop)', '발달하는 (developing)' 및 '발달 (development)'은 질병의 발병 뿐만 아니라 질병 상태/이의 상관관계의 진행, 증악 또는 악화를 모두 지칭한다.
본 개시내용의 물품은 VEGFA, VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 수준의 감소, VEGFA를 포함/발현하는 세포수의 감소, 및/또는 VEGFR을 발현하는 세포 활성의 감소로부터 치료적 또는 예방적 유익을 유도할 수 있는 임의의 질병/병태의 치료/예방에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기 질병/병태는 예를 들어 VEGFA, VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 및/또는 VEGFA/VEGFR을 포함/발현하는 세포가 병리학적으로 관련된 질병/병태, 예를 들어 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달의 수준 증가 및/또는 VEGFA/VEGFR을 포함/발현하는 세포수의 증가가 질병/병태의 발병, 발달 또는 진행, 및/또는 질병/병태의 하나 이상의 증상의 중증도와 명확하게 관련된 질병/병태, 또는 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달의 수준 증가 및/또는 VEGFA/VEGFR을 포함/발현하는 세포수의 증가가 질병/병태의 발병, 발달 또는 진행에 대한 위험 인자인 질병/병태일 수 있다.
본원에 개시된 양상 및 구체예에 따른 요법 및 예방은 주로 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달을 특징으로 하는 질병/병태와 관련된다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따라 치료/예방될 질병/병태는 예를 들어, 질병/병태의 부재하에 VEGFA의 발현 수준과 비교하여, VEGFA의 발현 수준의 증가를 특징으로 하는 질병/병태이다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에 따라 치료/예방될 질병/병태는 예를 들어 질병/병태의 부재하에 VEGFR을 발현하는 세포의 수/비율/활성과 비교하여, VEGFR을 발현하는 세포의 수/비율/활성의 증가를 특징으로 하는 질병/병태이다.
VEGFA/VEGFR-매개 신호전달 및 질병에서 그의 역할은 예를 들어 Karaman Development (2018) 145(14):dev151019, Ferrara and Adamis, Nat Rev Drug Discov. (2016) 15(6):385-403, and Claesson-Welsh and Welsh, J Intern Med. (2013) 273(2):114-27에서 검토되었고, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
VEGFA/VEGFR-매개 신호전달은 여러 질병의 병인과 관련이 있다. VEGFA는 안구 질환 예컨대 당뇨병성 망막병증 및 습성 노화-관련 황반 변성이 있는 개인의 혈관형성, 혈액-망막 장벽의 파괴, 염증 및 시력 상실을 촉진한다.
VEGF 및 VEGF 수용체는 또한 일부 종양 세포를 포함하는 비-내피 세포 (non-endothelial cells)에서 발현된다. 종양 세포에 의해 분비되는 VEGFA는 내피 세포의 증식 및 생존을 자극하여, 새로운 혈관의 형성을 유도하여 종양 성장을 촉진한다. VEGFA에 대한 중화 항체의 발달 및 사용은 종양 성장이 혈관형성에 의존한다는 첫 번째 직접적인 증거를 제시하였으며, 이 과정에서 VEGFA의 중요성을 확인하였다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따라 치료될 질병/병태는 병리학적 (즉, 과도한) 혈관형성을 특징으로 하는 질병, 암, VEGFA-발현 암 (즉, VEGFA를 발현하는 세포를 포함하는 암; 예를 들어, 동등한 비-암성 세포에 의한 발현 수준과 비교하여 상승된 수준의 VEGFA 발현을 갖는 세포를 포함하는 암), VEGFR-발현 암 (즉, VEGFR을 발현하는 세포를 포함하는 암; 예를 들어 동등한 비-암성 세포에 의한 발현 수준과 비교하여 상승된 수준의 VEGFA 발현을 갖는 세포를 포함하는 암), 안구 질환, 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 노화-관련 황반 변성, 습성 (즉, 신생 혈관) 노화-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐색, 근시성 맥락막 신생혈관, 미숙아 망막병증, 신생혈관 녹내장, 중심 장액성 망막병증, 안구 종양, 각막 신생혈관, 염증성 질환, 자가면역 질환, 관절염, 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 운동 신경 질환 및 근위축성 측삭 경화증으로부터 선택된다.
이전 문단에 언급된 소정의 질병은 서로 관련되어 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 병리학적 혈관형성을 특징으로 하는 질병에는 암 및 안구 질환을 포함한다.
본원에서 사용된, '병리학적 혈관형성 (pathological angiogenesis)'은 혈관형성 (즉, 기존 혈관 신경총으로부터 새로운 혈관의 성장)을 지칭하며, 여기서 혈관형성은 질병의 발달 및/또는 진행에 기여한다.
일부 구체예에서, 본 개시내용에 따라 치료/예방될 질병/병태는 암이다. 암은 원치 않는 세포 증식 (또는 원치 않는 세포 증식에 의해 나타나는 질병), 신생물 또는 종양일 수 있다. 암은 양성 또는 악성일 수 있으며, 원발성 또는 속발성 (전이성)일 수 있다. 신생물 또는 종양은 세포의 비정상적인 성장 또는 증식일 수 있으며, 모든 조직에 위치할 수 있다. 암은 예를 들어 부신, 부신 수질, 항문, 충수 (appendix), 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 맹장, 중추 신경계 (뇌의 포함 또는 제외), 소뇌, 자궁경부, 결장, 십이지장, 자궁내막, 상피 세포 (예: 신장 상피), 담낭, 식도, 신경아교세포, 심장, 회장, 공장, 신장, 눈물샘, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 림프모세포, 상악골, 종격동, 장간막, 자궁근층, 비인두, 대망, 구강, 난소, 췌장, 귀밑샘, 말초신경계, 복막, 흉막, 전립선, 침샘, 구불결장, 피부, 소장, 연조직, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 혀, 편도선, 기관, 자궁, 외음부, 백혈구로부터 유래된 조직/세포의 암일 수 있다.
치료할 종양은 신경계 또는 비-신경계 종양일 수 있다. 신경계 종양은 중추 또는 말초 신경계에서 기원한 종양, 예를 들어 신경아교종, 수모세포종, 수막종, 신경섬유종, 상의세포종, 신경초종, 신경섬유육종, 성상세포종 및 희소돌기아교세포종일 수 있다. 비-신경계 암/종양은 임의의 다른 비-신경 조직에서 기원할 수 있으며, 예를 들어 흑색종, 중피종, 림프종, 골수종, 백혈병, 비-호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma: NHL), 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphoma), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 골수성 백혈병 (AML), 골수이형성 증후군 (MDS), 피부 T-세포 림프종 (CTCL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 간암종, 표피양 암종, 전립선 암종, 유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 췌장암, 흉선 암종, NSCLC, 혈액암 및 육종을 포함한다.
치료/예방은 하기 중 하나 이상을 목표로 할 수 있다: 암 증상의 발병/진행의 지연/방지, 암 증상 중증도의 감소, 암 세포의 생존/성장/침입/전이의 감소, 암 세포 수의 감소 및/또는 대상체의 생존율 증가.
일부 구체예에서, 치료/예방할 암은 VEGFA를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 치료/예방할 암은 VEGFR을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 치료/예방할 암은 VEGFA에 대해 양성인 암이다. 일부 구체예에서, 치료/예방할 암은 VEGFR에 대해 양성인 암이다. 일부 구체예에서, 암은 VEGFA를 과발현한다. 일부 구체예에서, 암은 VEGFR을 과발현한다. VEGFA 및/또는 VEGFR의 과발현은 동등한 비-암성 세포/비-종양 조직에 의한 발현 수준보다 더 큰 발현 수준의 관련 인자의 검출에 의해 결정될 수 있다.
VEGFA 및/또는 VEGFR 발현은 임의의 적합한 수단에 의해 결정될 수 있다. 발현은 유전자 발현 또는 단백질 발현일 수 있다. 유전자 발현은 예를 들어 VEGFA 및/또는 VEGFR을 코딩하는 mRNA의 검출에 의해, 예를 들어 정량적 실시간 PCR (quantitative real-time PCR: qRT-PCR)에 의해 결정될 수 있다. 단백질 발현은 예를 들어 VEGFA 및/또는 VEGFR의 검출에 의해, 예를 들어 항체-기반 방법 (antibody-based methods), 예를 들어 웨스턴 블롯 (western blot), 면역조직화학 (immunohistochemistry), 면역세포화학 (immunocytochemistry), 유세포 측정법 (flow cytometry) 또는 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, 예를 들어 대상체로부터 수득한 샘플에서 VEGFA 및/또는 VEGFR을 발현하거나, 또는 VEGFA 및/또는 VEGFR을 과발현하는 암의 검출에 기반하여 본원에 기재된 치료를 위한 환자가 선택될 수 있다.
VEGFA/VEGFR 길항제가 예를 들어 Kieran et al., Cold Spring Harb Perspect Med. 2012 Dec; 2(12): a006593 (그 전체가 본원에 참조로 통합됨; 예를 들어 표 2 참조)에 기재된 바와 같이, 다양한 암의 치료/예방을 위한 약제로서 조사되었다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에 따라 치료/예방될 암은 고형 종양, 혈액 악성종양, 골수 혈액 악성종양, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 유방암, 신장암, 신장 세포 암종, 폐암, 비-소세포 폐암, 갑상선암, 갑상선 수질암, 뇌/척수 암, 교모세포종, 신경교종, 고도 신경교종, 두경부암, 피부암, 흑색종, 편평세포암, 간암, 간세포 암종, 췌장암, 위암, 대장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 담관암, 담관암종, 골암, 육종, 난소암, 자궁경부암, 복막암, 전립선암, 요로상피암, 신경내분비암으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 치료/예방할 암은 원발성 암이다. 일부 구체예에서, 치료/예방할 암은 속발성 암 (즉, 전이암)이다.
VEGFA/VEGFR-표적 중재적 시술은 또한 예를 들어 Cornel et al., Rom J Ophthalmol. (2015) 59(4): 235-242 (그 전체가 본원에 참조로 통합됨)에 기재된 바와 같이, 안구 질환의 치료/예방을 위해 조사되었다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에 따라 치료/예방될 질병/병태는 안구 질환, 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 노화-관련 황반 변성, 습성 (즉, 신생혈관) 노화-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐색, 근시성 맥락막 신생혈관, 미숙아 망막병증, 신생혈관 녹내장, 중심 장액성 망막병증, 안구 종양 및 각막 신생혈관으로부터 선택된다.
VEGFA/VEGFR-매개 신호전달은 또한 예를 들어 Le and Kwon, Int J Mol Sci. (2021) 22(10):5387, Marina et al., Clujul Med. (2015) 88(3): 247-252, Ferrara, Endocr Rev. (2004) 25(4):581-611 및 Azimi et al., Neurol Sci. (2020) 41(6):1459-1465 (이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 통합됨)에 기재된 바와 같이, 염증성 및 자가면역 병태의 병리와 관련되어 있다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에 따라 치료/예방될 질병/병태는 염증성 질환, 자가면역 질환, 관절염, 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 다발성 경화증 및 패혈증으로부터 선택된다.
VEGFA/VEGFR-매개 신호전달은 또한 예를 들어 Lambrechts et al., Nat Genet. (2003) 34(4):383-94에 기재된 바와 같이, 운동 신경 질환 예컨대 근위축성 측삭 경화증의 병리와 관련되어 있다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에 따라 치료/예방될 질병/병태는 운동 신경 질환 또는 근위축성 측삭 경화증이다.
본 개시내용의 다양한 양상에 따라, (예를 들어, 본원에 기재된 치료/예방적 중재적 시술의 맥락에서), VEGFA 및 VEGFR (즉, VEGFA에 대한 수용체, 예를 들어 VEGFR1) 간의 상호작용의 억제, 및/또는 VEGFA/VEGFR-매개 신호전달의 억제를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 이러한 방법에 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 제제, 및 이러한 방법에 사용하기 위한 조성물 (예를 들어, 약제)의 제조에 있어서 본 개시내용에 따른 제제의 용도를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 치료/예방적 중재적 시술은 이전 문단에 기재된 하나 이상의 효과와 '관련된' 것으로 기재될 수 있다. 당업자는 당해 기술 분야에서 일상적으로 실시되는 기술을 사용하여 이러한 특성을 쉽게 평가할 수 있다.
본 개시내용의 물품의 투여는 바람직하게는 "치료적으로 유효한 (therapeutically effective)" 또는 "예방적으로 유효한 (prophylactically effective)" 양으로, 이는 대상체에게 치료적 또는 예방적 유익을 나타내기에 충분한 양으로 수행된다. 투여되는 실제 양, 투여 속도 및 시간 경과는 질병/병태의 특성 및 중증도 및 투여되는 특정 물품에 따라 달라질 것이다. 치료 처방, 예를 들어 투여량 결정 등은 일반의 및 다른 의사의 책임 내에 있으며, 전형적으로 치료할 질병/장애, 개별 대상체의 병태, 전달 부위, 투여 방법, 및 실무자에게 알려진 기타 요인을 고려한다. 상기 언급한 기술 및 프로토콜의 예는 Remington's 'The Science and Practice of Pharmacy' (ed. A. Adejare), 23rd Edition (2020), Academic Press에서 찾을 수 있다.
투여는 단독으로, 또는 다른 치료와 병용하여 치료할 병태에 따라 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 항원-결합 분자 또는 조성물 및 치료제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
동시 투여 (simultaneous administration)는 본 개시내용의 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물 및 다른 치료제를 함께, 예를 들어 제제들을 모두 함유하는 약학 조성물로서 (즉, 조합된 제제의 경우에), 또는 서로 투여한 직후, 및 선택적으로 동일한 투여 경로를 통해, 예를 들어 동일한 동맥, 정맥 또는 다른 혈관으로의 투여를 지칭한다. 순차적 투여 (sequential administration)는 제제들 중 하나를 투여하고, 일정 시간 간격 후에 다른 제제를 개별 투여하는 것을 지칭한다. 2개의 제제들이 동일한 경로로 투여되는 것이 요구되지는 않지만, 일부 구체예에서는 그러한 경우가 있다. 시간 간격은 임의의 시간 간격일 수 있다.
항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물의 다회 용량이 제공될 수 있다. 하나 이상의 용량 또는 각 용량은 또 다른 치료제의 동시 또는 순차적 투여를 동반할 수 있다. 다회 용량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 중 하나로 선택될 수 있는, 미리 결정된 시간 간격으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 투여량은 7, 14, 21 또는 28일 (플러스 또는 마이너스 3, 2 또는 1일)마다 1회 제공될 수 있다.
검출 방법
본 개시내용은 또한 VEGFA를 검출하는 방법, 또는 VEGFA를 포함/발현하는 세포를 검출하는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 물품을 제공한다.
본원에 기재된 항원-결합 분자는 VEGFA에 대한 항원-결합 분자의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 항원-결합 분자와 VEGFA의 결합된 복합체의 검출을 포함할 수 있다.
이와 같이, VEGFA를 함유하거나 또는 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 접촉시키는 단계, 및 항원-결합 분자와 VEGFA의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, VEGFA를 포함/발현하는 세포를 함유하거나 또는 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 접촉시키는 단계, 및 항원-결합 분자와 VEGFA를 포함/발현하는 세포의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
면역분석 예컨대 샌드위치 분석, 예를 들어 ELISA를 포함하는 적합한 방법 형식이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 상기 방법은 검출 가능한 모이어티, 예를 들어 본원에 기재된 형광 표지, 인광 표지, 발광 표지, 면역-검출 가능한 표지, 방사성 표지, 화학물질, 핵산 또는 효소 표지로 항원-결합 분자 또는 표적(들) 또는 이들 모두를 표지화하는 단계를 포함할 수 있다. 검출 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고, 표지화제 (labelling agent)에 상응하도록 선택될 수 있다.
VEGFA 또는 VEGFA를 포함/발현하는 세포를 검출하는 단계를 포함하는 방법은 VEGFA 발현/활성이 병리학적으로 관련된 질병/병태를 진단/예후하는 방법을 포함한다.
이러한 종류의 방법은 환자 샘플에 대해 인 비트로 수행될 수 있거나, 또는 환자 샘플의 처리 후에 수행될 수 있다. 일단 샘플이 수집되면, 인 비트로 방법으로 수행되는 경우 환자가 제시될 필요가 없으므로, 상기 방법은 인간 또는 동물 신체에서 실시되지 않는 방법일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 인 비보 수행된다.
이러한 방법은 예를 들어 환자 샘플에서 VEGFA, VEGFA를 포함/발현하는 세포 중 하나 이상을 검출 또는 정량화하는 단계를 포함할 수 있다. 방법이 관련 인자를 정량화하는 단계를 포함하는 경우, 상기 방법은 진단 또는 예후 평가의 일부로서 표준 또는 참조 값에 대해 결정된 양을 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 진단 또는 예후의 정확성을 증진시키거나, 또는 본원에 기재된 테스트를 사용하여 수득된 결과를 확인하기 위해 본원에 기재된 진단/예후 테스트와 함께 다른 진단/예후 테스트를 사용할 수 있다.
샘플에서의 검출은 질병/병태 (예: 암)의 진단, 질병/병태에 대한 소인, 또는 질병/병태, 예를 들어 본원에 기재된 질병/병태에 대한 예후 제공 (예후)을 위해 사용될 수 있다. 상기 진단 또는 예후는 기존 (이전에 진단된) 질병/병태와 관련될 수 있다.
모든 조직 또는 체액으로부터 샘플을 채취할 수 있다. 샘플은 하기를 포함하거나 또는 그로부터 유래될 수 있다: 혈액의 양; 피브린 응고 및 혈구 제거 후에 수득된 혈액의 유체 부분을 포함할 수 있는 개인의 혈액으로부터 유래된 혈청의 양; 조직 샘플 또는 생검; 흉막액; 뇌척수액 (CSF); 또는 상기 개인으로부터 단리된 세포. 일부 구체예에서, 샘플은 질병/병태에 의해 영향을 받은 조직 또는 조직들 (예를 들어, 질병의 증상이 나타나거나, 또는 질병/병태의 병인에 관여하는 조직 또는 조직들)로부터 수득되거나 또는 유래될 수 있다.
본 개시내용은 또한 VEGFA-표적화제로 치료하기 위한 대상체를 선택/계층화하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 대상체는 본 개시내용에 따른 치료/예방을 위해 선택되거나, 또는 예를 들어, 개인으로부터 수득된 샘플 중에 VEGFA, 또는 VEGFA를 포함/발현하는 세포의 검출/정량화에 기반하여, 이러한 치료/예방으로부터 유익할 수 있는 대상체로서 확인된다.
대상체
본 개시내용에 따른 대상체는 임의의 동물일 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 포유동물일 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간일 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 비-인간 동물, 예를 들어 비-인간 포유동물일 수 있다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다.
대상체는 환자일 수 있다. 환자는 본원에 기재된 질병/병태를 가질 수 있다. 대상체는 본원에 기재된 질병/병태로 진단되었을 수 있거나, 본원에 기재된 질병/병태를 갖는 것으로 의심될 수 있거나, 또는 본원에 기재된 질병/병태가 발달할 위험이 있을 수 있다.
대상체/환자는 본원에 기재된 질병/병태의 마커에 대한 특성화에 기반하여 본 개시내용에 따른 치료/예방을 위해 선택될 수 있다.
본 개시내용에 따른 일부 구체예에서, 대상체는 바람직하게는 인간 대상체이다. 일부 구체예에서, 본 개시내용의 치료적 또는 예방적 방법에 따라 치료될 대상체는 본원에 기재된 질병을 갖거나, 또는 발달할 위험이 있는 대상체이다.
키트
본 개시내용의 일부 양상에서, 부품을 갖는 키트를 제공한다. 일부 구체예에서, 키트는 본원에 기재된 항원-결합 분자, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물의 미리 결정된 양을 갖는 적어도 하나의 용기를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 본원에 기재된 항원-결합 분자, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물을 생성하기 위한 물질을 포함할 수 있다.
키트는 특정 질병/병태를 치료하기 위해 환자에게 투여하기 위한 설명서와 함께, 항원-결합 분자, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물을 제공할 수 있다.
본 개시내용에 따른 키트는 예를 들어 설명서 소책자 (booklet) 또는 전단 (leaflet) 형태의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 본원에 기재된 방법 중 임의의 하나 이상을 수행하기 위한 프로토콜을 포함할 수 있다.
서열 동일성
본원에서 사용된, '서열 동일성 (sequence identity)'은 서열들을 정렬하고, 서열들 간의 최대 퍼센트의 서열 동일성을 달성하기 위해 필요한 경우 갭을 도입한 후에, 참조 서열의 뉴클레오티드/아미노산 잔기와 동일한 대상 서열의 뉴클레오티드/아미노산 잔기의 퍼센트를 지칭한다. 2개 이상의 아미노산 또는 핵산 서열들 간의 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 목적을 위한 쌍별 및 다중 서열 정렬은 당업자에게 알려진 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 ClustalOmega (Soding, J., Bioinformatics (2005) 21, 951-960), T-coffee (Notredame et al., J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217), Kalign (Lassmann and Sonnhammer, BMC Bioinformatics (2005) 6,298) and MAFFT (Katoh and Standley, Molecular Biology and Evolution (2013) 30(4) 772-780) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 그러한 소프트웨어를 사용하는 경우, 예를 들어 갭 패널티 (gap penalty) 및 확장 패널티 (extension penalty)에 대한 기본 파라미터 (default parameters)가 바람직하게 사용된다.
서열
***
본 개시내용은 설명된 양상 및 바람직한 특징의 조합을 포함하며, 단 이러한 조합이 명확하게 허용되지 않거나 또는 명시적으로 회피되는 경우는 제외한다.
본원에 사용된 섹션 제목은 구성 목적으로만 사용되며, 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 개시내용의 양상 및 구체예는 본원에 첨부된 도면을 참조하여 예로서 예시될 것이다. 추가 양상 및 구체예는 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 텍스트에 언급된 모든 문헌은 본원에 참조로 통합된다.
하기 청구범위를 포함하는 본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 '포함하다' 및 변형 예컨대 '포함한다' 및 '포함하는'은 명시된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지 않는다는 것을 이해할 것이다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수형 'a', 'an' 및 'the'는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 범위는 본원에서 '약' 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 '약' 또 다른 특정 값까지 표시될 수 있다. 이러한 범위가 표시되는 경우, 다른 구체예는 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 다른 특정 값까지 포함한다. 마찬가지로, 값이 선행하는 '약'을 사용하여 근사치로 표시되는 경우, 특정 값이 다른 구체예를 형성한다는 것을 이해할 것이다.
핵산 서열이 본원에 개시된 경우, 이의 역상보체 (reverse complement)가 또한 명시적으로 고려된다.
본원에 기재된 방법은 바람직하게는 인 비트로 수행될 수 있다. 용어 '인 비트로'는 배양 중인 세포로 수행되는 절차를 포함하는 반면에, 용어 '인 비보'는 온전한 다세포 유기체에서/이를 사용한 절차를 포함하는 것으로 의도된다.
본 개시내용의 원리를 설명하는 구체예 및 실험은 본원에 첨부된 도면을 참조하여 토의될 것이다.
도 1. 라이브러리 1 및 라이브러리 2, 4D5 (트라스투주맙) 및 출발 주형의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 차이를 요약한 표. "Xaa"는 무작위화된 아미노산을 나타낸다.
도 2A 및 2B. 생물층 간섭계 (BLI)에 의한 측정 시에, 인간 VEGFA에 대한 (2A) 16C2.1 및 (2B) 21A5.1의 결합을 나타내는 센서그램 (Sensorgrams). 각 DotBody에 대해 테스트한 농도는 결합 곡선 아래에 nM 단위로 명시되어 있다.
도 3A 및 3B. 생물층 간섭계 (BLI)에 의한 측정 시에, 마우스 VEGFA에 대한 (3A) 16C2.1 및 (3B) 21A5.1의 결합을 나타내는 센서그램. 각 DotBody에 대해 테스트한 농도는 결합 곡선 아래에 nM 단위로 명시되어 있다.
도 4. 경쟁적 ELISA에서 16C2.1 및 라니비주맙에 의한 인간 VEGFA 및 VEGFR1 간의 상호작용의 억제를 나타내는 그래프.
도 5A 내지 5C. 경쟁적 ELISA에서 (5A) 16C2.1, (5B) 21A5.1 및 (5C) 라니비주맙에 의한 인간 VEGFA 및 VEGFR1 간의 상호작용의 억제를 나타내는 그래프.
도 6A 및 6B. 실온, 60℃, 70℃ 또는 80℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에, 250 nM의 단일 농도에서 인간 VEGFA에 대한 항-VEGFA DotBodies (6A) 16C2.1 및 (6B) 21A5.1의 결합을 나타내는 센서그램. 측정은 실시예 8에 기재된 바와 같이 BLI로 수행하였다.
실시예
실시예 1: 나이브 합성 DotBody 파지 디스플레이 라이브러리의 생성
항-VEGF DotBodies의 확인을 위해 2개의 DotBody 파지 디스플레이 라이브러리 (phage display libraries)를 사용하였다. 이들 라이브러리는 트라스투주맙 VH 도메인 ("DotBody scaffold patents", 예를 들어 WO 2016/072938A1에 기재됨)으로부터 유래된 인간화, 안정화된 자율적인 VH 도메인 주형을 기반으로 하였다.
라이브러리 1은 하기 VH 도메인 주형 서열을 기반으로 한다 (라이브러리 형성을 위해 돌연변이된 위치는 밑줄 표시됨):
SEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSSAISGFSISSTSIDWVRQAPGKGLEWVARISPSSGSTSYADSVKGRFTISADTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYTGRSSSAMDYRGQGTLVTVSS
라이브러리 2는 하기 VH 도메인 주형 서열을 기반으로 한다 (라이브러리 형성을 위해 돌연변이된 위치는 밑줄 표시됨):
SEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAISGFSISSTSIDWVRQAPGKGLEWVARISPSSGSTSYADSVKGRFTISADTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCGRSSSAMDYRGQGTLVTVSS
VH 도메인 주형의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3은 Bostrom J. et al.(14,15) and Tonikian R. et al.(16)에 의한 절차에 따른 Kunkel 돌연변이 유발에 의해, 도 1에 제시된 디자인에 따라 무작위화하였다.
라이브러리 1에는 약 2.87 x 1010개의 클론을 함유하고 있는 반면에, 라이브러리 2에는 모든 CDR이 돌연변이된 약 1.37 x 1010개의 클론을 함유하였다. 상기 라이브러리는 라이브러리 형질전환 후 일련의 희석 및 콜로니 계수에 의해 평가하였다.
표 1. 라이브러리 1을 형성하는데 사용되는 프라이머. 프라이머 H1 및 H2는 VH 주형 서열에 Kunkel 돌연변이 유발을 수행하기 전에 프라이머 H3.6-H3.20과 혼합하여, 최종 라이브러리를 형성하기 위해 이후에 조합되는 15개의 서브-라이브러리 (sub-libraries)를 형성하였다. 코돈 [XYZ]은 하기와 같은 뉴클레오티드 빈도를 갖는다: X = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C, Y = 0.4A + 0.2T + 0.4C 및 Z = 0.1G + 0.9C.
표 2. 라이브러리 2를 형성하는데 사용되는 프라이머. 프라이머 H1 및 H2는 VH 주형 서열에 Kunkel 돌연변이 유발을 수행하기 전에 프라이머 H3.6-H3.20과 혼합하여, 최종 라이브러리를 형성하기 위해 이후에 조합되는 15개의 서브-라이브러리를 형성하였다. 코돈 [XYZ]은 하기와 같은 뉴클레오티드 빈도를 갖는다: X = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C, Y = 0.4A + 0.2T + 0.4C 및 Z = 0.1G + 0.9C.
실시예 2: 나이브 합성 DotBody 파지 디스플레이 라이브러리로부터 파지 디스플레이 선택
인간 VEGF-121 (Acro Biosystems)을 Maxisorp Immuno 튜브 (Thermo Scientific) 상에, 라운드 1의 경우 1 mL PBS 중 20 μg으로, 후속 라운드의 경우 1 mL PBS 중 10 μg으로, 4℃에서 밤새 고정하였다. 상기 튜브를 PBS에서 2회 세척하고, MBB (Milk Block Buffer: PBST 중 1% 탈지유, 즉 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS)에서 실온 (RT)에서 1시간 동안 차단하였다. 네가티브 선택 튜브는 VEGF-121에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 제조하였지만, VEGF-121 단백질 대신에 PBS를 사용하였다. 500 μL의 라이브러리 1 및 라이브러리 2 (~2 x 1013 pfu/mL)를 PEG/NaCl 버퍼 (20% PEG 8,000, 2.5M NaCl)로 침전시키고, MBB에 재현탁시킨 다음에, 네가티브 선택 튜브로 전달하여, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 파지를 VEGF-121로 코팅된 immuno 튜브로 전달하고, RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 상기 튜브를 MBB로 3회, PBST로 3회 및 PBS로 2회 세척하여 비-결합된 파지를 제거하였다. 결합된 파지는 트립신 버퍼 (TBS + 2 mM CaCl2) 중 1 mg/mL의 트립신으로 용출시켰다. 용출된 파지는 37℃에서 30분 동안 지수 성장기 (OD600 ~ 0.5)의 TG1 박테리아 세포 배양물 (2YT 배지에서) 5 mL을 감염시키는데 사용하였다. 라운드 2로부터, 감염된 TG1 세포 1.2 mL를 -80℃에서 20% 글리세롤과 함께 보관하고, 모노클로날 스크리닝 (모노클로날 스크리닝을 위한 글리세롤 스톡)에 사용하였다. 나머지 감염된 TG1 세포를 50 mL 2YT로 전달하였다. 상기 배양물을 37℃에서 진탕시키면서 OD600 ~ 0.5까지 인큐베이션한 다음에, 1x1010 pfu/mL M13K07 헬퍼 파지 (helper phage)로 37℃에서 30분 동안 감염시켰다. 감염된 TG1 세포를 4℃에서 20분 동안 3,900 g으로 펠렛화하고, 500 μL의 2YT 브로스 (broth)에 재현탁하고, 100 μg/mL 카르베니실린 및 50 μg/mL 카나마이신이 보충된 2x 15 cm 원형 2YT 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 30℃에서 밤새 인큐베이션한 후에, 박테리아-잔디 (bacterial-lawn)를 25 mL의 TBS에 재현탁하였다. 생성된 파지를 PEG/NaCl 버퍼로 침전시켜 정제하였다. PEG/NaCl 침전의 2회 라운드 후에, 파지를 PBS + 10% 글리세롤에 재현탁하였다. 정제된 파지를 후속 선택 라운드에 사용하였다.
VEGF-121에 대해 4회의 선택 라운드를 수행하였다. 제2 선택 라운드로부터, 세척 횟수는 하기와 같이 증가하였다:
Figure pct00006
라운드 2: MBB로 4회, PBST로 4회, PBS로 2회.
Figure pct00007
라운드 3: MBB로 6회, PBST로 6회, PBS로 2회
Figure pct00008
라운드 4: MBB로 7회, PBST로 7회, PBS로 2회
제2 선택 라운드로부터, 이전 선택 라운드로부터 정제된 파지 1 mL를 최종 농도 1×1012 pfu/mL로 사용하였다. 나머지 패닝 절차 (panning procedure)는 동일하게 수행하였다.
실시예 3: 모노클로날 파지 ELISA에 의한 고유한 결합체의 확인
모노클로날 파지 ELISA를 사용하여 나이브 라이브러리 및 친화도 성숙 라이브러리 (affinity maturation library)로부터 선택된 고유한 결합 DotBodies를 확인하였다. 모노클로날 스크리닝을 위한 글리세롤 스톡을 100 μg/mL 카르베니실린이 보충된 2YT 아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 개별 콜로니를 100 μg/mL 카르베니실린이 보충된 2YT 브로스 1 mL에서 2시간 동안 성장시킨 다음에, 1x 1010 pfu/mL M13K07 헬퍼 파지로 감염시켰다. 상기 배양물에 50 μg/mL 카나마이신을 추가로 보충하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
세포를 4℃에서 10분 동안 1,100 g으로 원심분리로 펠렛화하고, 상등액을 파지 모노클로날 ELISA에 사용하였다. 파지 모노클로날 ELISA에서, VEGF-121을 Maxisorp 96-웰 플레이트 (Thermo Scientific) 상에 1 μg/mL의 농도로 4℃에서 밤새 고정하고, PBS로 2회 세척하고, MBB로 RT에서 1시간 동안 차단하였다. 25 μL의 파지 배양 상등액을 25 μL의 MBB와 혼합하고, 플레이트에 첨가하고, RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 PBST로 8회 세척한 다음에, 50 μL의 항-M13 항체 HRP 접합체 (GE Healthcare)를 MBB에 1:7,000으로 희석하여 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 PBST로 8회 세척하고, 50 μL의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 (GeneTex)로 전개하였다. 5-15분 후에, 50 μL의 2M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지하고, 450 nm의 흡광도에서 신호를 측정하였다. VEGF-121에 결합하는 고유한 VH 도메인을 확인하기 위해 높은 신호 세기 (1보다 높은 흡광도)를 갖는 모노클로날 클론을 Sanger 시퀀싱으로 서열분석하였다.
실시예 4: 친화도 성숙 파지 디스플레이 라이브러리 제작
친화도 성숙을 위해 항-VEGF DotBody 13A6을 선택하였고, 이는 결합 친화도가 50 nM 이하이고, 또한 VEGFA와 VEGF 수용체 1 (VEGFR1) 간의 상호작용을 차단하였기 때문이다. 친화도 성숙 파지 디스플레이 라이브러리는 Bostrom J. et al. (14)에 따른 Kunkel 돌연변이 유발에 의해, 표 3에 제시된 프라이머를 사용하여 형성하였다. 상기 라이브러리에는 1.1 × 108개의 고유한 서열이 함유되어 있으며, 이는 라이브러리를 TG1 세포로의 전기천공 시에 연속 희석하고, 100 μg/mL 카르베니실린이 보충된 2YT 아가 상에 플레이팅한 후에, 30개 콜로니로부터 플라스미드를 서열분석하여 추정하였다.
표 3. 항-VEGF DotBody 13A6의 친화도 성숙 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위해 사용된 프라이머의 DNA 서열. 서열에서의 숫자는 올리고뉴클레오티드 서열에서 염기 A, T, C 및 G의 빈도를 나타낸다. 빈도 코드 5 = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T; 6 = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T; 7 = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T; 8 = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C.
실시예 5: 13A6-기반 친화도 성숙 파지 디스플레이 선택
뉴트라비딘 (Neutravidin)을 Maxisorp Immuno 튜브 (Thermo Scientific) 상에 1 mL PBS 중 10 μg으로 4℃에서 밤새 고정하였다. 상기 튜브를 PBS에서 2회 세척하고, MBB에서 실온 (RT)에서 1시간 동안 차단하였다. 비오티닐화 (biotinylated) VEGF-121 (Acro Biosystems)을 패닝 라운드에 따라 서로 다른 농도로 첨가하였다 (표 4 참조). 단백질을 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 비-결합된 단백질을 PBS로 2회 세척하여 제거하였다. 비오티닐화 VEGF-121에 대해 기재된 바와 같이 네가티브 선택 튜브를 제조하였지만, 비오티닐화 VEGF-121 대신에 PBS를 첨가하였다.
나머지 선택 절차는 나이브 합성 DotBody 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 파지 디스플레이 선택과 유사하며, 소정의 변경 사항은 표 4에 요약되어 있다.
표 4. 비오티닐화 VEGF-121에 대한 13A6-기반 파지 디스플레이 라이브러리의 친화도 성숙 선택 조건.
13A6-기반 친화도 성숙 파지 디스플레이 선택으로 16C2.1을 생성하였다.
실시예 6: 16C2.1-기반 친화도 성숙 파지 디스플레이 라이브러리 제작
친화도 성숙을 위해 항-VEGF DotBody 16C2.1을 선택하였고, 이는 결합 친화도가 5 nM 이하이고, 또한 VEGFA와 VEGF 수용체 1 (VEGFR1) 간의 상호작용을 차단하였기 때문이다. 친화도 성숙 파지 디스플레이 라이브러리는 Bostrom J. et al. (14)에 따른 Kunkel 돌연변이 유발에 의해, 표 5에 제시된 프라이머를 사용하여 형성하였다. 수득된 라이브러리에는 1.1 × 108개의 고유한 서열이 함유되어 있으며, 이는 라이브러리를 TG1 세포로의 전기천공 시에 연속 희석하고, 100 μg/mL 카르베니실린이 보충된 2YT 아가 상에 플레이팅한 후에, 돌연변이 비율을 결정하기 위해 여러 콜로니로부터 플라스미드를 서열분석하여 추정하였다.
표 5. 항-VEGF DotBody 16C2.1의 친화도 성숙 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위해 사용된 프라이머의 DNA 서열. 서열에서의 숫자는 올리고뉴클레오티드 서열에서 염기 A, T, C 및 G의 빈도를 나타낸다. 빈도 코드 5 = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T; 6 = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T; 7 = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T; 8 = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C.
실시예 7: 가열 챌린지를 사용한, 16C2.1-기반 친화도 성숙 파지 디스플레이 선택
16C2.1-기반 파지 디스플레이 라이브러리는 하기와 같이 패닝하였다.
뉴트라비딘을 Maxisorp Immuno 튜브 (Thermo Scientific) 상에 1 mL PBS 중 10 μg으로 4℃에서 밤새 고정하였다. 상기 튜브를 PBS에서 2회 세척하고, MBB에서 실온 (RT)에서 1시간 동안 차단하였다. 비오티닐화 VEGF-121 (Acro Biosystems)을 패닝 라운드에 따라 서로 다른 농도로 첨가하였다 (표 6 참조). 단백질을 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 비-결합된 단백질을 PBS로 2회 세척하여 제거하였다. 비오티닐화 VEGF-121에 대해 기재된 바와 같이 네가티브 선택 튜브를 제조하였지만, 비오티닐화 VEGF-121 대신에 PBS를 첨가하였다.
나머지 선택 절차는 나이브 합성 DotBody 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 파지 디스플레이 선택과 유사하며, 소정의 변경 사항은 표 6에 요약되어 있다.
표 6. 비오티닐화 VEGF-121에 대한 16A2.1-기반 및 16C2.1-기반 파지 디스플레이 라이브러리의 친화도 성숙 선택 조건.
가열 챌린지를 사용한 16C2.1-기반 친화도 성숙 파지 디스플레이 선택으로 21A5.1을 생성하였다.
실시예 8: 단백질 생성 및 생물층 간섭계에 의한 결합 키네틱스의 특성화
오픈 리딩 프레임 (open reading frame)의 5'에 ATG 코돈이 있고 3'에 헥사히스티딘 태그를 코딩하는 서열이 있는 pET-기반 발현 벡터로, VEGFA-결합 클론을 클로닝하였다. 이들은 대장균 (E. coli)에서 재조합으로 생성되고, 고정된-금속 친화도 크로마토그래피로 정제한 다음에, PBS로 탈염하였다. 2가 분자인 16A2.1x2를 또한 동일한 방식으로 생성하였다.
결합 특성화는 BLI (Satorius)를 사용하여 RT에서 1000 rpm 유속으로 수행하였다. 비오티닐화 인간 VEGF-165 (Acro Biosystem)는 BLI 버퍼 (PBS 중 0.1% BSA 및 0.01% Tween-20)에서 60초 동안 3 μg/mL의 농도로 스트렙타비딘-코팅된 팁 (Streptavidin-coated tips) 상에 고정하였다. 30초 기준선 후에, 항-VEGFA DotBodies는 60초 동안 BLI 버퍼에서 블랭크 참조 (blank reference)를 포함한 8개의 서로 다른 농도로 회합하였고, 그 다음에는 BLI 버퍼에서 400초 해리하였다. 0 nM 농도 참조를 사용하여 배경 버퍼 신호를 차감하고, 결합 키네틱스를 BLI 분석 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델에 따라 글로벌 피트 (global fit)를 사용하여 계산하였다. 2가 분자 16A2.1x2를 또한 본원에 설명된 바와 같이 특성화하였지만, 해리는 600초로 하였다. 뮤린 (murine) VEGFA에 대한 모든 클론의 결합을 특성화하기 위해, 동일한 절차를 사용하였지만, 고정된 표적을 비오티닐화 뮤린 VEGF-164 (Acro Biosystem)로 대체하였다.
센서그램을 도 2 및 3에 제시하고, 결합 데이터는 하기 표에 제시한다.
실시예 9: 경쟁적 ELISA
경쟁적 ELISA를 수행하기 위해, VEGFR1을 Maxisorp 96-웰 플레이트 (Thermo Scientific) 상에 2 μg/mL의 농도로 4℃에서 밤새 고정하고, PBS로 3회 세척하고, EBB (ELISA Block Buffer: PBST 중 0.2% BSA)로 RT에서 1시간 동안 차단하였다. 0.5 nM 농도의 인간 VEGF-121을, 500 nM에서 시작하여 0.008 nM로 끝나는 1:3 연속 희석 후 서로 다른 농도의 정제된 항-VEGFA DotBody와 혼합하고, 0 nM 대조군을 포함하였다. 또한, 라니비주맙을, 30 nM에서 시작하여 0.0005 nM로 끝나는 1:3 연속 희석을 사용한 인간 VEGF-121과 혼합하고, 0 nM 대조군을 포함하였다. 샘플을 RT에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 50 μL를 VEGFR1-코팅된 플레이트로 전달하였다. 2시간 인큐베이션 후에, 상기 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 50 μL의 스트렙타비딘-HRP 접합체 (Thermo Scientific)를 EBB에서 1:5,000으로 희석하여 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 PBST로 5회 세척하고, 50 μL의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 (GeneTex)로 전개하였다. 5-15분 후에, 50 μL의 2M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지하고, 450 nm의 흡광도에서 신호를 측정하였다.
Graphpad Prism 9 소프트웨어를 사용하여 데이터를 플로팅하고, IC50은 "[억제제] 대 반응 - 가변 기울기 (4개의 파라미터)" 비-선형 회귀 곡선을 사용하여 결정하였다.
결과는 도 4 및 5에 제시된다.
도 4의 데이터에 기반하여 인간 VEGF-121과 인간 VEGFR1 간의 상호작용의 억제를 위한 상이한 분자들에 대해 결정된 IC50 값은 하기와 같았다:
16C2.1 = 2.3 nM
라니비주맙 = 6.8 nM
도 5의 데이터에 기반하여 인간 VEGF-121과 인간 VEGFR1 간의 상호작용의 억제를 위한 상이한 분자들에 대해 결정된 IC50 값은 하기와 같았다:
16C2.1 = 1.8 nM
21A5.1 = 12.8 nM
라니비주맙 = 7.4 nM
실시예 10: 가열 챌린지 후 VEGFA에 대한 결합 분석에 의한 열안정성의 평가
VEGFA-결합 DotBodies를 250 nM의 농도로 BLI 버퍼에서 실온, 60℃, 70℃ 또는 80℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다 (가열 챌린지). 상기 가열 챌린지 후에, 샘플을 15,000 g으로 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 사용하여 상기 실시예 8에 기재된 바와 같이 BLI에 의해 인간 VEGF165에 대한 결합의 특성화를 수행하였다.
결과는 도 6에 제시되어 있다.
실시예 11: 결론
본 발명자들은 인간 VEGFA에 특이적으로 결합하고 뮤린 VEGFA와 교차-반응하는, 안정화된 VH 도메인 항체를 생성하였다.
16C2.1은 인간 VEGFA에 대한 친화도 3.0 nM, 및 뮤린 VEGFA에 대한 친화도 14.6 nM을 갖는다. 16C2.1은 2.3 nM로 추정되는 IC50으로 VEGFA-VEGFR1 상호작용을 차단하며, 이는 동일한 분석에서 IC50 = 6.8 nM을 갖는 FDA-승인된 항-VEGFA 항체 라니비주맙보다 2-3배 더 양호하게 차단한다.
추가 활성 개선을 위해 16C2.1을 선택하였다. 각 CDR 위치가 16C2.1에 존재하는 잔기의 대략 50% 및 임의의 다른 아미노산의 50%의 비율로 돌연변이된 새로운 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하였다. 인간 VEGFA에 대한 결합 및 안정성-기반 선택은 가장 안정하고 친화도가 높은 항-VEGF DotBodies를 확인하기 위해, 항원 농도를 낮추고 세척 횟수를 증가시키면서, 증가하는 온도에서 가열 챌린지를 사용하여 수행하였다. 가열-챌린지된 라이브러리는 클론 21A5.1을 확인하였다.
21A5.1은 인간 VEGFA에 친화도 3.37 nM로, 및 마우스 VEGFA에 친화도 15.3 nM로 결합을 유지하였다. VEGF-VEGFR 상호작용을 차단하는 21A5.1의 능력은 경쟁적 ELISA로 측정하였고, 12.8 nM로 추정되는 IC50으로 VEGFA-VEGFR1 상호작용을 차단하는 것으로 밝혀졌다. 라니비주맙은 대조군으로 사용하였고, 측정된 IC50은 7.4 nM이었다.
16C2.1 및 21A5.1 모두는 실온 내지 80℃ 범위의 온도에서 인큐베이션한 후에 VEGFA에 결합하는 능력을 유지하였다.
결론적으로, 일련의 맞춤형 파지 디스플레이 라이브러리 디자인 및 선택 전략을 통해, 본 발명자들은 항-VEGF DotBodies 16C2.1 및 21A5.1을 생성하였고, 이는 중간 내지 낮은 나노몰 친화도로 VEGFA에 결합하고, 또한 인간 VEGFA 및 뮤린 VEGFA 모두에 결합한다. 이러한 DotBodies는 낮은 나노몰 범위의 IC50으로 VEGF-VEGFR 상호작용을 차단하는 것으로 밝혀졌다. 16C2.1 및 21A5.1은 실온 내지 80℃ 범위의 온도에서 인큐베이션한 후에 인간 VEGFA에 대한 결합을 유지하는 높은 열안정성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
SEQUENCE LISTING <110> DotBio Pte. Ltd. CLEGG, Richard Ian <120> VEGFA-BINDING MOLECULES <130> 008192015 <140> PCT/EP2022/054123 <141> 2022-02-18 <150> SG10202101681W <151> 2021-02-19 <160> 82 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA-binding single domain antibody 16C2.1 <400> 1 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Ser Leu Ala Ala 20 25 30 Thr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Arg Ile Phe Ser Pro Ser Asp Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Gly Arg Pro Asp Thr Tyr Ala Tyr Asn Ile Phe Leu Asp Thr Pro 100 105 110 Thr Tyr Asn Ala Leu His Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA-binding single domain antibody 16C2.1 CDR1 <400> 2 Ser Leu Ala Ala Thr Asp 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA-binding single domain antibody 16C2.1 CDR2 <400> 3 Phe Ser Pro Ser Asp Phe Thr Asp 1 5 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA-binding single domain antibody 16C2.1 CDR3 <400> 4 Gly Arg Pro Asp Thr Tyr Ala Tyr Asn Ile Phe Leu Asp Thr Pro Thr 1 5 10 15 Tyr Asn Ala Leu His 20 <210> 5 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA-binding single domain antibody 21A5.1 <400> 5 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Ser Leu Val Glu 20 25 30 Thr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Arg Ile Phe Leu Pro Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Gly Ser Pro Asp Thr Tyr Ala Tyr Asn Ile Phe Leu Asp Thr Pro 100 105 110 Ala Tyr Lys Gly Leu Ser Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA-binding single domain antibody 21A5.1 CDR1 <400> 6 Ser Leu Val Glu Thr Asp 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA-binding single domain antibody 21A5.1 CDR2 <400> 7 Phe Leu Pro Ser Gly Ser Thr Tyr 1 5 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA-binding single domain antibody 21A5.1 CDR3 <400> 8 Gly Ser Pro Asp Thr Tyr Ala Tyr Asn Ile Phe Leu Asp Thr Pro Ala 1 5 10 15 Tyr Lys Gly Leu Ser 20 <210> 9 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FW_FR1 <400> 9 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe 20 25 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FW_FR2 <400> 10 Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 15 Arg Ile <210> 11 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FW_FR3 <400> 11 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 1 5 10 15 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FW_FR4 <400> 12 Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 Con <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Wherein Xaa = A or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Wherein Xaa = A or E <400> 13 Ser Leu Xaa Xaa Thr Asp 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 Con <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Wherein Xaa = S or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Wherein Xaa = D or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Wherein Xaa = F or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Wherein Xaa = D or Y <400> 14 Phe Xaa Pro Ser Xaa Xaa Thr Xaa 1 5 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 Con <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Wherein Xaa = R or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Wherein Xaa = T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Wherein Xaa = N or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Wherein Xaa = A or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Wherein Xaa = H or S <400> 15 Gly Xaa Pro Asp Thr Tyr Ala Tyr Asn Ile Phe Leu Asp Thr Pro Xaa 1 5 10 15 Tyr Xaa Xaa Leu Xaa 20 <210> 16 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Con Seq <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Wherein Xaa = A or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Wherein Xaa = A or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Wherein Xaa = S or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Wherein Xaa = D or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> Wherein Xaa = F or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> Wherein Xaa = D or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(99) <223> Wherein Xaa = R or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (113)..(113) <223> Wherein Xaa = T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (115)..(115) <223> Wherein Xaa = N or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (116)..(116) <223> Wherein Xaa = A or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (118)..(118) <223> Wherein Xaa = H or S <400> 16 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Ser Leu Xaa Xaa 20 25 30 Thr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Arg Ile Phe Xaa Pro Ser Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Gly Xaa Pro Asp Thr Tyr Ala Tyr Asn Ile Phe Leu Asp Thr Pro 100 105 110 Xaa Tyr Xaa Xaa Leu Xaa Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 17 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF206 <400> 17 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val 130 135 140 Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp 165 170 175 Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys 180 185 190 His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn 195 200 205 Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr 210 215 220 Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 225 230 <210> 18 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF189 <400> 18 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val 130 135 140 Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His 165 170 175 Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr 180 185 190 Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys 195 200 205 Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 210 215 <210> 19 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF165 <400> 19 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly 130 135 140 Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr 145 150 155 160 Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln 165 170 175 Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 180 185 190 <210> 20 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF121 <400> 20 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys 130 135 140 Pro Arg Arg 145 <210> 21 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature VEGF206 <400> 21 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys 115 120 125 Arg Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg 130 135 140 Cys Cys Leu Met Pro Trp Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro 145 150 155 160 Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys 165 170 175 Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu 180 185 190 Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 195 200 205 <210> 22 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature VEGF189 <400> 22 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys 115 120 125 Arg Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys 130 135 140 Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys 145 150 155 160 Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu 165 170 175 Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 180 185 <210> 23 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature VEGF165 <400> 23 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe 115 120 125 Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser 130 135 140 Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys 145 150 155 160 Asp Lys Pro Arg Arg 165 <210> 24 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature VEGF121 <400> 24 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg 115 120 <210> 25 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA Signal Peptide <400> 25 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala 20 25 <210> 26 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG1 constant region <400> 26 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 27 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 IgG1 <400> 27 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge IgG1 <400> 28 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 <210> 29 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 IgG1 <400> 29 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 IgG1 <400> 30 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 31 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ranibizumab Heavy Chain <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Leu 225 230 <210> 32 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ranibizumab Light Chain <400> 32 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 33 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bevacizumab Heavy Chain <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 34 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bevacizumab Light Chain <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 35 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Naove synthetic DotBody phage display Library 1 <400> 35 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Ser Ala Ile Ser Gly Phe Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Thr Ser Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Arg Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Thr Gly Arg Ser Ser Ser Ala Met Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Naove synthetic DotBody phage display Library 2 <400> 36 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Thr Ser Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Arg Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Gly Arg Ser Ser Ser Ala Met Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n is a, c, g, or t <400> 37 cctctgcaat ttctggcttc nnnnttnnnn nnactnnnat agactgggtg cgtcagg 57 <210> 38 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H2 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <400> 38 ctggaatggg ttgcaaggat tnnncctnnn nnnggtnnna ctnnntatgc cgatagcgtc 60 aaggg 65 <210> 39 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.6 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n is a, c, g, or t <400> 39 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnng stntkgacta ccggggtcaa 60 g 61 <210> 40 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.7 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n is a, c, g, or t <400> 40 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngstntkga ctaccggggt 60 caag 64 <210> 41 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.8 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n is a, c, g, or t <400> 41 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngstnt kgactaccgg 60 ggtcaag 67 <210> 42 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.9 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n is a, c, g, or t <400> 42 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngs tntkgactac 60 cggggtcaag 70 <210> 43 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.10 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n is a, c, g, or t <400> 43 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngstntkgac 60 taccggggtc aag 73 <210> 44 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.11 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n is a, c, g, or t <400> 44 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngstntk 60 gactaccggg gtcaag 76 <210> 45 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.12 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n is a, c, g, or t <400> 45 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnngst 60 ntkgactacc ggggtcaag 79 <210> 46 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.13 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n is a, c, g, or t <400> 46 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 gstntkgact accggggtca ag 82 <210> 47 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.14 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n is a, c, g, or t <400> 47 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnngstntkg actaccgggg tcaag 85 <210> 48 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.15 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 48 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnngstn tkgactaccg gggtcaag 88 <210> 49 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.16 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> n is a, c, g, or t <400> 49 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnng stntkgacta ccggggtcaa g 91 <210> 50 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.17 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> n is a, c, g, or t <400> 50 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nngstntkga ctaccggggt caag 94 <210> 51 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.18 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (79)..(79) <223> n is a, c, g, or t <400> 51 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnngstnt kgactaccgg ggtcaag 97 <210> 52 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.19 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (77)..(77) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> n is a, c, g, or t <400> 52 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnngs tntkgactac cggggtcaag 100 <210> 53 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.20 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (77)..(77) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (79)..(79) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (85)..(85) <223> n is a, c, g, or t <400> 53 gccgtctatt atactgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngstntkgac taccggggtc aag 103 <210> 54 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.1G + 0.9C <400> 54 cctgtgcaat ttctggcttc nnnnttnnnn nnactnnnat agactgggtg cgtcagg 57 <210> 55 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.6 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n is a, c, g, or t <400> 55 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnng stntkgacta ccggggtcaa 60 g 61 <210> 56 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.7 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n is a, c, g, or t <400> 56 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngstntkga ctaccggggt 60 caag 64 <210> 57 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.8 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n is a, c, g, or t <400> 57 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngstnt kgactaccgg 60 ggtcaag 67 <210> 58 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.9 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n is a, c, g, or t <400> 58 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngs tntkgactac 60 cggggtcaag 70 <210> 59 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.10 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n is a, c, g, or t <400> 59 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngstntkgac 60 taccggggtc aag 73 <210> 60 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.11 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n is a, c, g, or t <400> 60 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngstntk 60 gactaccggg gtcaag 76 <210> 61 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.12 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n is a, c, g, or t <400> 61 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnngst 60 ntkgactacc ggggtcaag 79 <210> 62 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.13 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n is a, c, g, or t <400> 62 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 gstntkgact accggggtca ag 82 <210> 63 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.14 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n is a, c, g, or t <400> 63 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnngstntkg actaccgggg tcaag 85 <210> 64 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.15 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 64 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnngstn tkgactaccg gggtcaag 88 <210> 65 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.16 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> n is a, c, g, or t <400> 65 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnng stntkgacta ccggggtcaa g 91 <210> 66 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.17 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> n is a, c, g, or t <400> 66 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nngstntkga ctaccggggt caag 94 <210> 67 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.18 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (79)..(79) <223> n is a, c, g, or t <400> 67 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnngstnt kgactaccgg ggtcaag 97 <210> 68 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.19 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (77)..(77) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> n is a, c, g, or t <400> 68 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnngs tntkgactac cggggtcaag 100 <210> 69 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3.20 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (77)..(77) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (79)..(79) <223> n = 0.2G + 0.2A + 0.5T + 0.1C <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> n = 0.4A + 0.2T + 0.4C <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> n = 0.1G + 0.9C <220> <221> misc_feature <222> (85)..(85) <223> n is a, c, g, or t <400> 69 gccgtctatt attgtgkccg cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngstntkgac taccggggtc aag 103 <210> 70 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aVEGF-13A6 CDR1 <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n= 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n= 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> n= 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n= 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n= 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n= 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n= 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n= 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <400> 70 tgtgcaattt ctggcttcnn nnnnnnnnnn nnnnnnatag actgggtgcg tcag 54 <210> 71 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aVEGF-13A6 CDR2 <220> <221> misc_feature <222> (19)..(21) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (33)..(34) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <400> 71 gaatgggttg caaggattnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nntatgccga tagcgtcaag 60 <210> 72 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aVEGF-13A6 CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (33)..(34) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (43)..(44) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (47)..(51) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (53)..(54) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (58)..(59) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (65)..(66) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (71)..(72) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (79)..(79) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <400> 72 actgccgtct attattgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntaccggggt caaggaaca 99 <210> 73 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aVEGF-16C2.1 CDR2 <220> <221> misc_feature <222> (19)..(22) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (34)..(36) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <400> 73 gaatgggttg caaggattnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nntatgccga tagcgtcaag 60 <210> 74 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aVEGF-16C2.1 CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (43)..(44) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (47)..(51) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (53)..(54) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (59)..(62) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (65)..(66) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (70)..(71) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> n = 70% G, 10% A, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> n = 70% T, 10% A, 10% G, 10% C <220> <221> misc_feature <222> (79)..(79) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> n = 70% A, 10% G, 10% C, 10% T <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> n = 70% C, 10% A, 10% G, 10% T <400> 74 actgccgtct attattgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntaccggggt caaggaaca 99 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 75 Cys Ala Ile Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile Asp Trp 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa = S/C <400> 76 Xaa Ala Ile Ser Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ile Asp Trp 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa = F/L/I/V <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 77 Ser Ala Ile Ser Gly Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Ile Asp Trp 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa = F/L/I/V <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 78 Cys Ala Ile Ser Gly Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Ile Asp Trp 1 5 10 15 <210> 79 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 79 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp 1 5 10 <210> 80 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 80 Ala Arg Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp 1 5 10 <210> 81 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 81 Ala Arg Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp 1 5 10 <210> 82 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 82 Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Phe Tyr Ala Met Asp 1 5 10

Claims (26)

  1. VEGFA에 결합하는, 선택적으로 단리된, 항원-결합 분자 (antigen-binding molecule)로서, 하기 CDR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열을 포함하는 항원-결합 분자:
    서열 번호: 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1
    서열 번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2
    서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열 번호: 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 항원-결합 분자.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 하기 FR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열을 포함하는 항원-결합 분자:
    서열 번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 FR1
    서열 번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 FR2
    서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 FR3
    서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 FR4.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 하기 CDR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열을 포함하는 항원-결합 분자:
    서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1
    서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2
    서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 항원-결합 분자.
  6. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 하기 CDR을 포함하는 단일 도메인 항체 서열을 포함하는 항원-결합 분자:
    서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR1
    서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR2
    서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR3.
  7. 청구항 1 내지 3 및 6 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 항원-결합 분자.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, VEGFA와 VEGFR 간의 상호작용을 억제하는 항원-결합 분자.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, VEGFA 이외의 표적 항원에 대해 특이적인 항원-결합 도메인을 추가로 포함하는 다중특이적 항원-결합 분자인 항원-결합 분자.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor: CAR).
  11. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자, 또는 청구항 10에 따른 CAR를 코딩하는, 선택적으로 단리된, 핵산 (nucleic acid).
  12. 청구항 11에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터 (expression vector).
  13. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자, 청구항 10에 따른 CAR, 청구항 11에 따른 핵산, 또는 청구항 12에 따른 발현 벡터를 포함하는 세포.
  14. 청구항 13에 따른 세포에 의한 항원-결합 분자 또는 CAR의 발현에 적합한 조건하에 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, VEGFA에 결합하는 항원-결합 분자를 생성하는 방법.
  15. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자, 청구항 10에 따른 CAR, 청구항 11에 따른 핵산, 청구항 12에 따른 발현 벡터, 또는 청구항 13에 따른 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 아쥬반트를 포함하는 조성물.
  16. 의학적 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자, 청구항 10에 따른 CAR, 청구항 11에 따른 핵산, 청구항 12에 따른 발현 벡터, 청구항 13에 따른 세포, 또는 청구항 15에 따른 조성물.
  17. VEGFA/VEGFR-매개 신호전달이 병리학적으로 관련된 질병의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자, 청구항 10에 따른 CAR, 청구항 11에 따른 핵산, 청구항 12에 따른 발현 벡터, 청구항 13에 따른 세포, 또는 청구항 15에 따른 조성물.
  18. VEGFA/VEGFR-매개 신호전달이 병리학적으로 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자, 청구항 10에 따른 CAR, 청구항 11에 따른 핵산, 청구항 12에 따른 발현 벡터, 청구항 13에 따른 세포, 또는 청구항 15에 따른 조성물의 용도.
  19. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자, 청구항 10에 따른 CAR, 청구항 11에 따른 핵산, 청구항 12에 따른 발현 벡터, 청구항 13에 따른 세포, 또는 청구항 15에 따른 조성물의 치료적 또는 예방적으로 유효한 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, VEGFA/VEGFR-매개 신호전달이 병리학적으로 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
  20. 청구항 17, 18 또는 19에 있어서, 상기 질병은 병리학적 혈관형성을 특징으로 하는 질병, 암, VEGFA-발현 암, VEGFR-발현 암, 안구 질환, 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 노화-관련 황반 변성, 습성 노화-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐색, 근시성 맥락막 신생혈관, 미숙아 망막병증, 신생혈관 녹내장, 중심 장액성 망막병증, 안구 종양, 각막 신생혈관, 염증성 질환, 자가면역 질환, 관절염, 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 운동 신경 질환 및 근위축성 측삭 경화증으로부터 선택되는, 항원-결합 분자, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물, 또는 이의 용도, 또는 방법.
  21. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자가 VEGFA에 결합된, 선택적으로 단리된, 인 비트로 복합체 (in vitro complex).
  22. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자와, VEGFA를 함유하거나 또는 이를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 접촉시키는 단계, 및 상기 항원-결합 분자와 VEGFA의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에서 VEGFA를 검출하는 방법.
  23. VEGFA, 또는 VEGFA를 포함하거나 또는 발현하는 세포를 검출, 국소화 또는 영상화하는 방법에서, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자의 용도.
  24. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자와 대상체 유래의 샘플을 인 비트로 접촉시키는 단계, 및 상기 항원-결합 분자와 VEGFA의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, VEGFA-표적화제 (VEGFA-targeted agent)로 치료하기 위한 대상체를 선택하거나 또는 계층화하는 방법.
  25. 인 비트로 또는 인 비보 진단제 (diagnostic agent) 또는 예후제 (prognostic agent)로서, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자의 용도.
  26. VEGFA의 발현을 특징으로 하는 질병/병태를 검출, 국소화 또는 영상화하는 방법에서, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자의 용도.
KR1020237031774A 2021-02-19 2022-02-18 Vegfa-결합 분자 KR20230165901A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SG10202101681W 2021-02-19
SG10202101681W 2021-02-19
PCT/EP2022/054123 WO2022175474A1 (en) 2021-02-19 2022-02-18 Vegfa-binding molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230165901A true KR20230165901A (ko) 2023-12-05

Family

ID=80685523

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237031774A KR20230165901A (ko) 2021-02-19 2022-02-18 Vegfa-결합 분자
KR1020237031776A KR20230165902A (ko) 2021-02-19 2022-02-18 Vegfa-결합 분자

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237031776A KR20230165902A (ko) 2021-02-19 2022-02-18 Vegfa-결합 분자

Country Status (8)

Country Link
EP (2) EP4294839A1 (ko)
JP (2) JP2024513644A (ko)
KR (2) KR20230165901A (ko)
CN (2) CN117279941A (ko)
AR (1) AR124917A1 (ko)
AU (2) AU2022222311A1 (ko)
CA (2) CA3208389A1 (ko)
WO (2) WO2022175481A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024055996A1 (zh) * 2022-09-14 2024-03-21 寻济生物科技（北京）有限公司 一种抗vegfa抗体或其抗原结合片段及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2009012968A (es) * 2007-06-06 2010-04-01 Domantis Ltd Polipeptidos, dominios variables de anticuerpo y antagonistas.
KR100883430B1 (ko) * 2007-06-13 2009-02-12 한국생명공학연구원 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 인간 단클론항체 및그 용도
US20120225081A1 (en) * 2010-09-03 2012-09-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Vegf-binding molecules
US9499612B2 (en) * 2011-07-27 2016-11-22 Glaxo Group Limited Antigen binding constructs
JP6921743B2 (ja) 2014-11-05 2021-08-18 ナンヤン テクノロジカル ユニヴァーシティー 安定化かつ自律性抗体ｖｈドメイン

Also Published As

Publication number Publication date
CN117279941A (zh) 2023-12-22
KR20230165902A (ko) 2023-12-05
AR124917A1 (es) 2023-05-17
AU2022222311A1 (en) 2023-09-21
WO2022175481A1 (en) 2022-08-25
EP4294838A1 (en) 2023-12-27
CN117242092A (zh) 2023-12-15
EP4294839A1 (en) 2023-12-27
CA3208389A1 (en) 2022-08-25
WO2022175474A1 (en) 2022-08-25
AU2022223337A1 (en) 2023-09-21
JP2024513644A (ja) 2024-03-27
CA3208368A1 (en) 2022-08-25
JP2024512260A (ja) 2024-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7295146B2 (ja) 抗－ｒｏｒ１抗体およびその用途
US11208498B2 (en) Treatment and prevention of cancer using HER3 antigen-binding molecules
US11780933B2 (en) HER3 antigen-binding molecules
KR20200079511A (ko) Cd47 항원-결합 분자
KR20190002644A (ko) FcγRIIA에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
WO2019086574A1 (en) Cd47 and cd33 antigen-binding molecules
CN115298216A (zh) 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途
KR20230165901A (ko) Vegfa-결합 분자
CN114437227A (zh) 双特异抗体及其应用
US20240132580A1 (en) Vegfa-binding molecules
US20240132579A1 (en) Vegfa-binding molecules