JP2023531042A - ４－１ｂｂ結合タンパク質及びその用途 - Google Patents

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Abstract

【要約】本発明は４－１ＢＢ結合タンパク質及びその用途を開示した。前記４－１ＢＢ結合タンパク質は、重鎖可変領域を含み；前記重鎖可変領域がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１５またはその変異体１、または配列番号１６に示す配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号６０またはその変異体２、または配列番号５０またはその変異体４に示す配列を含み、前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０３またはその変異体３、配列番号３３３またはその変異体５、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１６、配列番号３２６、配列番号３３１、配列番号３３４または配列番号９６に示す配列を含む。本発明の４－１ＢＢ結合タンパク質は、全ヒト由来抗体であり、ヒト４－１ＢＢおよびカニクイザル４－１ＢＢ結合との活性を有し、一部の４－１ＢＢ結合タンパク質の大きさは従来のＩｇＧ抗体の半分しかなく、二重特異性抗体によく使用できる。【選択図】無し

Description

本願は出願日が２０２０／６／３０の中国特許出願２０２０１０６１９５００．９の優先権を要求する。本願が前記中国特許出願の全文を引用している。
本願は生物医薬分野に係り、具体的に４－１ＢＢ結合タンパク質及びその用途に係る。
４－１ＢＢは、ＣＤ１３７、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ ９）とも呼ばれ、活性化誘導型の共刺激受容体分子である。４－１ＢＢは、活性化Ｔ細胞、活性化自然破壊（ＮＫ）細胞、活性化胸腺細胞、皮内リンパ細胞などのリンパ球系で主に発現する。また、４－１ＢＢは、樹状突起細胞、単核細胞、中性粒細胞、好酸性細胞にも発現する。Ｔ細胞の活性化には、Ｔ細胞表面の抗原識別受容体（ＴＣＲ）とＭＨＣ分子抗原ペプチドとの特異的結合に加えて、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面の共刺激分子とＴ細胞表面の対応する受容体との結合によって提供される共刺激信号が必要である。４－１ＢＢとそのリガンド４－１ＢＢＬの結合は、共刺激信号を提供してＴ細胞を活性化し、サイトカインと免疫機能を強化することができる。４－１ＢＢは中枢記憶Ｔ細胞反応を促進することも証明されており、これは４－１ＢＢアゴニスト治療の患者の腫瘍特異的Ｔ細胞に対する治療持続性と力尽きへの抵抗をサポートする可能性がある［１，２］。腫瘍上での抗４－１ＢＢ単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）の過発現はＣＤ４＋Ｔ細胞とＮＫ細胞依存の腫瘍除去［３、４、５］をもたらす。マウスモデルによる抗４－１ＢＢ抗体の全身性注射が腫瘍成長の遅延を引き起こすことも証明された［６］。
活性化性４－１ＢＢ抗体は、そのリガンドの代わりに４－１ＢＢ下流経路を活性化できることが実証されている。現在、臨床的に研究されている活性化４－１ＢＢ抗体には、Ｕｒｅｌｕｍａｂ（ＢＭＳ－６６３５１３）とＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ（ＰＦ－０５０８２５６６）がある。Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂはリガンド遮断のＩｇＧ２抗体であり、Ｕｒｅｌｕｍａｂは非リガンド遮断のＩｇＧ４抗体である。ＵｔｏｍｉｌｕｍａｂとＵｒｅｌｕｍａｂは体内とインビトロでもＴ細胞機能を増強し、抗腫瘍作用を促進することができる。しかし、臨床試験により、Ｕｒｅｌｕｍａｂの使用量が１ｍｇ／ｋｇより大きい場合、一部の患者は肺炎毒性が出現した（ＮＣＴ００３０９０２３、ＮＣＴ００６１２６６４、ＮＣＴ０１４７１２１０を参照）。Ｕｒｅｌｕｍａｂに比べて、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂの安全性は高いが、４－１ＢＢを活性化する活性は低い。そのため、より安全で効果的な４－１ＢＢを標的とした新しい治療法の開発が急がれている。
従来技術における抗腫瘍治療効果の欠如を解決し、安全性などの技術問題を解決するために、本発明は４－１ＢＢを標的とする全ヒト由来抗体、及びこの抗体と腫瘍特異的標的に基づく二重特異性抗体及びその用途を提供する。本出願は、下記性質における一種または複数種を有する抗４－１ＢＢ抗原結合タンパク質を提供し：１）ヒト及びサル由来の４－１ＢＢタンパク質を結合することができ；２）免疫細胞を刺激し、ＩＦＮ－γ、ＩＬ２および／またはＴＮＦαを分泌させることができ；３）腫瘍の成長及び／又は腫瘍細胞の増殖を抑制することができ；４）４－１ＢＢ信号経路を活性化することができる。本出願はまた、腫瘍の予防及び治療における抗原結合タンパク質の使用を提供する。
本発明が解決しようとする技術問題は、従来技術における抗体薬物の抗腫瘍治療効果の欠如、及び安全性の不良などの欠陥を克服するために、４－１ＢＢを標的とする結合タンパク質及びその用途、特に４－１ＢＢを標的とする全ヒト由来抗体、及びこの抗体と腫瘍特異的標的に基づく二重特異性抗体及びその用途を提供する。
本発明の第一態様は、４－１ＢＢ結合タンパク質を提供し、前記４－１ＢＢ結合タンパク質は重鎖可変領域を含み；前記重鎖可変領域がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１５またはその変異体１、または配列番号１６に示す配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号６０またはその変異体２、または配列番号５０またはその変異体４に示す配列を含み、前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０３またはその変異体３、配列番号３３３またはその変異体５、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１６、配列番号３２６、配列番号３３１、配列番号３３４または配列番号９６に示す配列を含み；
その中で：
前記変異体１の突然変異がＴ３Ｉ、Ｓ６Ｎ／Ｇ／Ｒ及びＹ７Ｆにおける１つまたは複数を含み；好ましく、前記変異体１の配列は好ましく配列表における配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３００または配列番号２４に示し；
前記変異体２の突然変異がＳ１Ｇ／Ｎ／Ｄ、Ｇ２Ｓ／Ａ、Ｓ３Ｄ、Ｇ５Ｄ／Ｎ／Ｆ／Ｓ／Ｖ及びＳ６Ｔ／Ｎ／Ｄにおける１つまたは複数を含み；前記変異体２の配列は好ましく配列表における配列番号５７－５９、配列番号６１、配列番号４９、配列番号３０８－３１７及び配列番号６３－７１におけるいずれの配列に示し；
前記変異体３の突然変異がＧ２Ｒ／Ｄ／Ａ／Ｋ、Ｓ３Ａ／Ｔ、Ｓ４Ｇ／Ｎ／Ａ／Ｔ／Ｈ、Ｅ５Ｔ／Ｖ／Ｍ／Ｇ、Ｔ６Ａ、Ｄ７Ｇ／Ｓ、Ｈ９Ｙ／Ｓ／Ｎ、Ｙ１０Ｈ、Ｙ１１Ｆ、Ｎ１２Ｇ／Ｄ及びＶ１３Ｉ／Ｍ／Ｔにおける１つまたは複数を含み；前記変異体３のアミノ酸配列は好ましく配列表における配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０４－１０６、配列番号１０８、配列番号１０９及び配列番号１１２－１１５におけるいずれの配列に示し；
前記変異体４の突然変異がＮ１ＩまたはＮ１Ｑを含み；前記変異体４のアミノ酸配列は好ましく配列表における配列番号５３または５４に示し；
前記変異体５の突然変異がＥ４Ａ／Ｐおよび／またはＮ１３Ｙを含み；前記変異体５のアミノ酸配列は好ましく配列表における配列番号３２７－３３０に示し；
前記変異体１、変異体２、変異体３、変異体５及び変異体４は少なくとも突然変異前の配列の機能を含む。
好ましく、前記ようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、それぞれ配列表における配列番号１６、配列番号５０および配列番号９６に示す配列、またはそれぞれ配列番号１６、配列番号５３および配列番号９６に示す配列、またはそれぞれ配列番号１６、配列番号５４および配列番号９６に示す配列、またはそれぞれ配列番号１９、配列番号５７および配列番号１０１に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号５８および配列番号１０２に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号５９および配列番号１０３に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号６０および配列番号１０４に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６１および配列番号１０５に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６０および配列番号１０６に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号６３および配列番号１０８に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号６０および配列番号１０８に示す配列、またはそれぞれ配列番号２２、配列番号６４および配列番号１０９に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６０および配列番号１１０に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６５および配列番号１１１に示す配列、またはそれぞれ配列番号２２、配列番号６６および配列番号１１２に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号４９および配列番号１１３に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号６０および配列番号１０３に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６３および配列番号１０４に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６０および配列番号１１４に示す配列、またはそれぞれ配列番号２３、配列番号６７および配列番号１０５に示す配列、またはそれぞれ配列番号２４、配列番号６８および配列番号１０３に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６０および配列番号１０５に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号６９および配列番号１１５に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号７０および配列番号１１６に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号７１および配列番号１１５に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３０８および配列番号３２６に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３０９および配列番号３２７に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１０および配列番号３２８に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３０８および配列番号３２９に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１１および配列番号３３０に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１２および配列番号３３１に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３０８および配列番号３３２に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１３および配列番号３３０に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１４および配列番号３２９に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１５および配列番号３３１に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１４および配列番号３２７に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１６および配列番号３３１に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３０８および配列番号３３３に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１７および配列番号３３４に示す配列を含む。下表ａを参照する。
前記重鎖可変領域のＦＲをコードする遺伝子は、好ましく胚系Ｖ遺伝子ＩＧＨＶ４－３４、ＩＧＨＶ３－２３、ＩＧＨＶ３－１１またはＩＧＨＶ３－７４に由来し；その中で：ＨＦＷＲ１は好ましく配列番号１、配列番号３、配列番号５－８、配列番号２９４－２９９及び配列番号１０－１３のいずれに示すアミノ酸配列を含み、ＨＦＷＲ２は好ましく配列番号２７、配列番号３２－３６、配列番号３０１－３０７及び配列番号３８－４６のいずれに示すアミノ酸配列を含み、ＨＦＷＲ３は好ましく配列番号７４、配列番号７９－８３、配列番号３１８－３２５及び配列番号８５－９２のいずれに示すアミノ酸配列を含み、ＨＦＷＲ４は好ましく配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号３３５、配列番号３３６または配列番号１２３に示すアミノ酸配列を含む。好ましく、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号３に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号２７に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号７４に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１８に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号５に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３２に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号７９に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号６に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３３に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８０に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号７に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３２に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８１に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号８に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３４に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８２に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号６に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３５に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８３に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号６に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３６に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８０に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号６に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３８に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８０に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号６に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３９に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８０に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号１に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号４０に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８５に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号１０に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号４１に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８６に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１８に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号６に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３５に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８０に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号１１に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号４２に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８７に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号５に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３２に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８０に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号８に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３４に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８８に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号１２に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３４に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８９に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１２３に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号６に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３４に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８８に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号６に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号４３に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号９０に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号６に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号４４に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号９１に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号１３に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３４に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号９０に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示し、前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号６に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号４５に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８０に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号１に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号４６に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号９２に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１８に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９４に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０１に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３１８に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号３３５に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９５に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０２に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３１９に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１８に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９４に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０２に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３２０に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１８に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９４に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０２に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３２１に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号３３５に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９６に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０２に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３２２に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号３３５に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９７に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０３に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３１８に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号３３５に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９４に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０１に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３２２に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１８に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９４に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０２に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３２３に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１８に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９８に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０２に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３２２に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１８に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９４に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０１に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３１８に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１２０に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９８に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０２に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３２２に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号３３５に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９４に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０１に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３１８に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１８に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９４に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０４に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３２４に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１８に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９４に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０５に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３２５に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号３３６に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号２９９に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０６に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号３１８に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号３３５に示す配列、または前記ＨＦＷＲ１のアミノ酸配列は配列番号６に示し、前記ＨＦＷＲ２のアミノ酸配列は配列番号３０７に示し、前記ＨＦＷＲ３のアミノ酸配列は配列番号８０に示し、且つ前記ＨＦＷＲ４のアミノ酸配列は配列番号１１９に示す。詳細は下表ｂを参照する。
本発明において、前記重鎖可変領域は好ましく配列表における配列番号１６８、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７５－１８０、配列番号１８２－１９６、配列番号３３７－３５２及び配列番号１９８におけるいずれに示すアミノ酸配列を含む。
前記ように、本発明に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質はさらに軽鎖可変領域を含有し、前記軽鎖可変領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１は配列番号１３３に示す配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１４５に示す配列を含み、前記ＬＣＤＲ３は配列番号１５８に示す配列を含む。好ましく、前記軽鎖可変領域のＦＲをコードする遺伝子は胚系Ｖ遺伝子ＩＧＫＶ３－１５に由来し；その中で：ＬＦＷＲ１は好ましく配列番号１２６または配列番号１２８に示すアミノ酸配列を含み、ＬＦＷＲ２は好ましく配列番号１４０に示すアミノ酸配列を含み、ＬＦＷＲ３は好ましく配列番号１５１に示すアミノ酸配列を含み、ＬＦＷＲ４は好ましく配列番号１６４に示すアミノ酸配列を含み；好ましく、前記軽鎖可変領域は、配列表における配列番号２０１に示す配列またはその変異体を含み、前記変異体が配列番号２０１に示す配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の突然変異が発生することに基づき；突然変異の後に得られた軽鎖可変領域の配列は好ましく配列番号２０４に示す。
本発明の一つの実施形態では、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６８に示し、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０１に示し；または、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７１に示し、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０４に示し；または、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７２に示し、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０４に示す。詳細は下表ｃを参照する。
さらに、本発明に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質は、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含むことができ、好ましくは、重鎖定常領域は、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４またはその変異体から選択され、軽鎖定常領域は、κ鎖またはλ鎖またはその変異体から選択される。
その中で、前記ｈＩｇＧ１の変異体の突然変異は好ましくＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｅ３４５ＲおよびＰ３２９Ｇにおける１つまたは複数であり、より好ましくＥ３４５Ｒ、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＥ３４５Ｒの組み合わせ、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇの組み合わせであり；前記ｈＩｇＧ４の変異体の突然変異は好ましくＳ２２８Ｐである。
本発明の好ましい実施形態では、前記４－１ＢＢ結合タンパク質の重鎖は、配列表における配列番号２０９、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１６－２２２、配列番号２２４－２３８、配列番号３５３－３６８及び配列番号２４０におけるいずれに示す配列を含み、および／またはその軽鎖は、配列表における配列番号２４６または配列番号２４３に示す配列を含む。例えば：前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号２０９に示し、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２４３に示し；または、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号２１２に示し、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２４６に示し；または、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号２１３に示し、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２４６に示し；または、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号２１６に示し、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２４６に示す。下表ｄに示す。
本発明における前記４－１ＢＢ結合タンパク質は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、重鎖抗体、単一ドメイン抗体または単一領域抗体の形態であってもよく、または前記抗体から得られたモノクローナル抗体またはマルチクローナル抗体であってもよい。
前記４－１ＢＢ結合タンパク質は全長抗体であれば、その重鎖は配列番号２０９に示す配列を含み、且つ軽鎖は配列番号２４３に示す配列を含み；または配列番号２１２に示す配列を含み、且つ軽鎖は配列番号２４６に示す配列を含み、または配列番号２１３に示す配列を含み、且つ軽鎖は配列番号２４６に示す配列を含み、または配列番号２１６に示す配列を含み、且つ軽鎖は配列番号２４６に示す配列を含む。
本発明の第二態様は、二重特異性抗体を提供し、前記二重特異性抗体は第一タンパク質機能領域および第二タンパク質機能領域を含み、前記第一タンパク質機能領域は前記ような４－１ＢＢ結合タンパク質であり、前記第二タンパク質機能領域は腫瘍抗原を標的とし；好ましくはＨＥＲ２抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体であり；その中で、前記ＨＥＲ２抗体は好ましくｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂまたはｐｅｒｔｕｚｕｍａｂであり、前記ＰＤ－Ｌ１抗体は好ましくａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂまたはＰＲ０００２６５であり、前記ＰＲ０００２６５の重鎖は配列番号２１１に示し、軽鎖は配列番号２４５に示す。その中で、前記ＰＲ０００２６５の詳細インフォメーションは出願ＣＮ２０１９１０９４４９９６．４を参照する。
具体的には、第一タンパク質機能領域または第二タンパク質機能領域は、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または重鎖可変領域の形態であってもよく、例えば、前記第一タンパク質機能領域はＦａｂであり、前記第二タンパク質機能領域はＶＨＨであり；あるいは、前記第一タンパク質機能領域はＦａｂであり、前記第二タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり；あるいは、前記第一タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第二タンパク質機能領域は重鎖可変領域である。
好ましくは、前記第一タンパク質機能領域と前記第二タンパク質機能領域との間および／または前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間は結合子によって連結され、前記結合子のアミノ酸配列はＧＳまたは配列表における配列番号２７３－２９３のいずれに示す。
本発明の特定の実施形態では、前記二重特異性抗体はポリペプチド鎖１とポリペプチド鎖２を含み、任意にポリペプチド鎖３をさらに含み；好ましく：
前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４４に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２５１－２６５のいずれに示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４５に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２７１に示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４９に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２７２に示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４５に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２７０に示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４５に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２６９に示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４５に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２６８に示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４５に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号３６９－３８２のいずれに示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２６７に示し、前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２６６に示し、且つ前記ポリペプチド鎖３のアミノ酸配列は配列番号２４６に示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２５０に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２４９に示し、且つ前記ポリペプチド鎖３のアミノ酸配列は配列番号２４６に示す。
本発明の第三態様は、本発明の第一態様に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質または本発明の第二態様に記載の二重特異性抗体をコードする、単離の核酸を提供する。
本発明の第四態様は、第三態様に記載の単離の核酸を含む、発現ベクターを提供する。
本発明の第五態様は、本発明の第四態様に記載の発現ベクターを含み；好ましく、前記宿主細胞は原核細胞または真核細胞を含む、宿主細胞を提供する。その中で、前記真核細胞は好ましく哺乳動物細胞である。
本発明の第六態様は、第五態様の宿主細胞を培養し、培養物から前記４－１ＢＢ結合タンパク質を獲得することを含む、４－１ＢＢ結合タンパク質の作製方法を提供する。
本発明の第七態様は、本発明の第一態様に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質または本発明の第二態様に記載の二重特異性抗体を含む、キメラ抗原受容体を提供する。
本発明の第八態様は、細胞毒性剤、及び本発明の第一態様に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質または本発明の第二態様に記載の二重特異性抗体を含む、抗体薬物複合物を提供する。
前記細胞毒剤は、好ましく細胞トキシン、化学治療剤、放射性同位素、治療性核酸、免疫調節剤、抗血チューブ生成剤、抗増殖アポトーシス剤または細胞溶存酵素である。より好ましく、前記細胞毒剤は、チューブリン合成酵素阻害剤であるメチルオレスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、またはメチルオレスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。
前記抗体薬物複合物の作製方法は、本分野の通常の作製方法であり、好ましくＤｏｒｏｎｉｎａ， ２００６， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７，１１４－１２４に記載の作製方法であるい。好ましく、前記作製方法は、最低限度の低複合画分（ＬＣＦ）が１０％未満の抗体薬物複合物を発生する。
前記抗体薬物複合物は、当該技術分野で知られている任意の物理的形態で存在することができ、好ましくは透明な溶液である。
本発明の第九態様は、本発明の第一態様に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、本発明の第二態様に記載の二重特異性抗体および／または本発明の第八態様に記載の抗体薬物複合物、および薬学的に許容可能なベクターを含む、薬物組成物を提供する。
前記薬物組成物は、好ましく活性成分として他の抗腫瘍抗体を含み、および／またはホルモン製剤、標的小分子製剤、プロテアーゼ体阻害剤、イメージング剤、診断剤、化学療法剤、溶腫薬物、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、抑制性分子の阻害剤及びワクチンからなる群における一種または複数種をさらにを含む。
薬学的に許容可能なベクターは、当該技術分野において通常のベクターであってもよく、このベクターは、任意の適切な生理学的または薬学的に許容可能な薬物添加剤であってもよい。前記薬物添加剤は、当該技術分野における従来の薬物添加剤であり、好ましくは薬学的に許容可能な賦形剤、充填剤、安定剤または希釈剤などを含む。より好ましくは、前記薬物組成物は、０．０１～９９．９９％の前記タンパク質および／または前記抗体薬物複合物と、０．０１～９９．９９％の薬物用ベクターとを含み、前記パーセンテージは前記薬物組成物に占める質量パーセンテージである。
好ましくは、前記薬物組成物は抗腫瘍薬である。より好ましくは、胃癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫、腎癌、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、頭頸癌、気管支癌、神経膠腫及び／又は白血病の薬物である。
本発明による薬物組成物の投与経路は、好ましくは腸胃外投与、注射投与または経口投与である。前記注射投与は、好ましくは静脈注射、筋肉注射、腹腔注射、皮内注射または皮下注射などの経路を含む。前記薬物組成物は、当該技術分野における従来の様々な剤形であり、好ましくは固体、半固体または液体の形態であり、すなわち水溶液、非水溶液または懸濁液であり、より好ましくは錠剤、カプセル、ペレット剤、注射剤または注入剤などである。より好ましくは、血管内、皮下、腹膜内または筋肉内を介して投与される。好ましくは、前記薬物組成物は、エアロゾルまたは粗い噴霧剤として、すなわち経鼻投与することができ、あるいは、鞘内、髄内または心室内で投与することができる。より好ましくは、薬物組成物は、透皮的、経皮的、局所的、腸内、膣内、舌下、または直腸的に投与することもできる。
本発明による薬物組成物の投与量レベルは、所望の診断または治療結果に達する組成物の量に応じて調整することができる。投与スキームは、単回注射または複数回注射であってもよく、または調整することもできる。選択された用量レベル及びスキームは、薬物組成物の活性及び安定性（すなわち、半減期）、製剤、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、検出及び／又は治療される疾患又は障害、及び治療される対象の健康状態及び以前の医療歴等を含む様々な要因に依存して合理的に調整される。
本発明の薬物組成物の治療上有効な用量は、最初に細胞培養実験又は動物モデル、例えばげっ歯類動物、ウサギ、犬、豚及び／又は霊長類動物において推定することができる。動物モデルはまた、適切な投与濃度範囲及び経路を決定するために使用することができる。その後、ヒトに投与される有用な用量および経路を決定するために使用することができる。一般的に、投与有効量または用量の決定および調整、およびそのような調整のタイミングおよび方法の評価は当業者に知られている。
組合せ療法では、前記４－１ＢＢ結合タンパク質、前記抗体薬物複合物、および／または追加の治療または診断剤は、それぞれ単一の薬剤として、所望の治療または診断を実行するのに適した任意の時間範囲で使用することができる。したがって、これらの単一薬剤は、実質的に同時に（すなわち、単一製剤として、または数分または数時間以内に）、または順番に連続的に投与することができる。例えば、これらの単一薬剤は、１年以内、または１０、８、６、４、または２ヶ月以内、または４、３、２、または１週間以内、または５、４、３、２、または１日以内に投与することができる。
製剤、用量、投与方法及び測定可能な治療結果の追加指導については、Ｂｅｒｋｏｗら（２０００）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｍｅｒｃｋ医学情報ハンドブック）及びＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．， Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， Ｅｂａｄｉ（１９９８）ＣＲＣ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（臨床薬理学ハンドブック）などの著作。
本発明の第十態様は、第一態様に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、本発明の第二態様に記載の二重特異性抗体および第七態様に記載の薬物組成物の、癌を治療および／または予防する薬物の作製における用途；前記癌は好ましくＨＥＲ２、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢにおける一種または複数種に関連の癌、乳癌、メラノーマ、肺癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘍または結腸直腸癌である。
いくつかの態様では、本開示は、ＨＥＲ２、ＰＤ－Ｌ１、および４－１ＢＢのうちの１つまたは複数に関連する疾患の治療方法を提供し、この方法は、被験者に医薬有効量の前記４－１ＢＢ結合タンパク質を投与し、または前記薬物組成物または前記核酸分子を含有し、ＨＥＲ２、ＰＤ－Ｌ１、および４－１ＢＢのうちの１つまたは複数に関連する疾患を治療することを含み、その疾患は好ましくは腫瘍または癌である。
ここで、前記腫瘍または癌は、当該技術分野における通常のＨＥＲ２、ＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢのうちの１つまたは複数の発現異常の腫瘍または癌であり、例えば、鱗状細胞癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭および頸鱗状細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、何傑金リンパ腫、非何傑金リンパ腫、びまん性大Ｂ－細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性髄細胞様白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性髄細胞様白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大Ｂ－細胞リンパ腫、套細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ－細胞／組織細胞を豊富に含む大Ｂ－細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、髄様細胞白血病－１タンパク質（Ｍｃｌ－１）、骨髄異常増殖症候群（ＭＤＳ）、胃腸（道）癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ球性白血病、リンパ球白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経母細胞腫、膵臓癌、多形性膠芽細胞腫、胃癌、骨癌、ユーイング肉腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、透明細胞腎細胞癌（ＲＣＣ）、頭と頸癌、咽頭癌、肝胆癌（ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、中枢神経系癌、食道癌、悪性胸膜間皮腫、全身性軽鎖アミロイド変性、リンパ球性リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、骨髄異常増殖症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メケル細胞癌、睾丸癌及び皮膚癌は、ＰＤ－Ｌ１陽性のうろこ状細胞癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭及び頸うろこ状細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、何傑金リンパ腫、非何傑金リンパ腫、弥漫性大Ｂ－細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性髄細胞様白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性髄細胞様白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大Ｂ－細胞リンパ腫、套細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ－細胞／組織細胞を豊富に含む大Ｂ－細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、髄様細胞白血病－１タンパク質（Ｍｃｌ－１）、骨髄異常増殖症候群（ＭＤＳ）、胃腸（道）癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ球性白血病、リンパ球白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経母細胞腫、膵臓癌、多形性膠芽細胞腫、胃癌、骨癌、尤因氏肉腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、透明細胞腎細胞癌（ＲＣＣ）、頭と頸部癌、咽頭癌、肝胆癌（ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、中枢神経系癌、食道癌、悪性胸膜間皮腫、全身性軽鎖アミロイド変性、リンパ球性リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、骨髄異常増殖症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルク細胞癌、睾丸癌、皮膚癌。
本発明の第十一態様は、本発明の第一態様に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、本発明の第二態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第七態様に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第八態様に記載の抗体薬物複合物および／または本発明の第九態様に記載の薬物組成物を含む、試薬キットを提供する。
好ましく、前記試薬キットは、さらに（ｉ）抗体またはその抗原結合フラグメントまたは抗体薬物複合物または薬物組成物を投与するデバイス；および／または（ｉｉ）使用説明を含む。
本発明の第十二態様は、薬カセットＡおよび薬カセットＢを含む薬キットを提供し、その中で：
前記薬カセットＡは、本発明の第一態様に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、本発明の第二態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第七態様に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第八態様に記載の抗体薬物複合物および／または本発明の第九態様に記載の薬物組成物を含み；
前記薬カセットＢは、他の抗腫瘍抗体または前記他の抗腫瘍抗体を含む薬物組成物、および／またはホルモン製剤、標的小分子製剤、プロテアーゼ体阻害剤、イメージング剤、診断剤、化学療法剤、溶腫薬物、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、抑制性分子の阻害剤及びワクチンからなる群における一種または複数種を含む。
前記技術問題を解決するために、本発明の第一態様に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、本発明の第二態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第七態様に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第八態様に記載の抗体薬物複合物および／または本発明の第九態様に記載の薬物組成物は、さらに他の薬物と併用することもでき、例えばホルモン製剤、標的小分子製剤、プロテアーゼ体阻害剤、イメージング剤、診断剤、化学療法剤、溶腫薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、抑制性分子の阻害剤、ワクチン等及び／又は他の抗腫瘍抗体（又は前記他の抗腫瘍抗体を含む薬物組成物）を併用して投与する。
本発明の第十三態様は、４－１ＢＢに媒介される疾患または障害を診断、治療および／または予防する方法を提供し、前記方法は、必要な患者に治療有効量の本発明の第一態様に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、本発明の第二態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第七態様に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第八態様に記載の抗体薬物複合物または本発明の第九態様に記載の薬物組成物を投与し、または本発明の第十二態様に記載の薬キットを用いて必要な患者を治療することを含む。
好ましく、前記疾患または障害は腫瘍であり、好ましく４－１ＢＢ陽性腫瘍であり、より好ましく胃癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫、腎癌、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、頭頸癌、気管支癌、神経膠腫および／または白血病。
本発明の第十四態様は、４－１ＢＢを免疫検出または測定する方法を提供し、当該方法は、本発明の第一態様に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、本発明の第二態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第七態様に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第八態様に記載の抗体薬物複合物または本発明の第九態様に記載の薬物組成物を用いることを含み；好ましく、前記検出は、診断および／または治療目的のものではない。
本発明の第十五態様は、併用療法を提供し、当該併用療法はそれぞれ必要な患者に本発明の第一態様に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、本発明の第二態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第七態様に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第八態様に記載の抗体薬物複合物または本発明の第九態様に記載の薬物組成物、および第二治療剤を投与することを含み；前記第二治療剤は、好ましく他の抗腫瘍抗体または前記他の抗腫瘍抗体を含む薬物組成物、および／またはホルモン製剤、標的小分子製剤、プロテアーゼ体阻害剤、イメージング剤、診断剤、化学療法剤、溶腫薬物、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、抑制性分子の阻害剤及びワクチンからなる群における一種または複数種を含む。
前記各好ましい条件は、当該分野の常識に合致する上で、任意に組み合わせてもよく、すなわち本発明の各好ましい例を得ることができる。
本発明に用いられる試薬及び原料はいずれも市販されている。
本発明の積極的な進歩効果は、下記の通りである。
１． 本出願は、少なくとも１つの下記性質を有する抗４－１ＢＢ結合タンパク質の全ヒト由来抗体を提供する。１）本願発明の抗４－１ＢＢ結合タンパク質の全ヒト由来抗体は、全長抗体と、「重鎖」のみを含む全く新しい全ヒト抗体とを含み、ヒト４－１ＢＢおよびカニクイザル４－１ＢＢと結合する活性を有し；その中で、当該４－１ＢＢ結合タンパク質の重鎖抗体の大きさは従来のＩｇＧ抗体の半分しかなく、軽鎖を含まないため、この抗体は二重特異性抗体に用いることができ、そして軽鎖ミスマッチと異種二量化の問題を解決した。ヒトとサル由来の４－１ＢＢタンパク質を結合することができる；２）結合エピトープは、Ｕｒｅｌｕｍａｂと異なる；３）４－１ＢＢ信号経路を活性化することができ、免疫細胞におけるＩＦＮγ、ＩＬ２および／またはＴＮＦαの分泌を刺激し、腫瘍の成長及び／又は腫瘍細胞の増殖を抑制する；活性はＵｔｏｍｉｌｕｍａｂより顕著に強かった。
２． 本発明が提供するＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、１つまたは複数の作用機構によって抗腫瘍効果と安全性を高める。第一に、ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１信号経路を遮断することによってＴ細胞を活性化することができる。第二に、腫瘍細胞表面に高発現するＰＤ－Ｌ１分子は、二重抗体分子を利用してＴ細胞表面の４－１ＢＢ分子の架橋及び三量化を促進し、下流信号伝導経路を活性化し、さらにＴ細胞の活性化及び増殖を促進し、そのＴ細胞を活性化する能力は、Ｕｒｅｌｕｍａｂよりも優れている。第三に、ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体のＴ細胞に対する活性化作用は、特異的にＰＤ－Ｌ１に依存する発現であり、二重抗体分子に媒介されるＴ細胞活性化は、腫瘍マイクロ環境内に限られている。本発明は、架橋された抗４－１ＢＢに依存する従来技術のＨＣＡｂモノクローナル抗体がＴ細胞を直接活性化することができないことに比べて、ＨＣＡｂモノクローナル抗体を用いて構築されたＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体は、ＰＤ－Ｌ１を高発現する細胞が存在する場合にＴ細胞を特異的に活性化することができ、これにより、Ｕｒｅｌｕｍａｂのようなモノクローナル抗体が正常組織でＴ細胞を過度に活性化することによる毒副作用を回避することができる。第四に、本実施例は、抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧ抗体の抗原結合ドメインＦａｂと抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体の抗原結合ドメインＶＨを利用して、多種構造の抗ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢの二重特異性抗体分子を構築した。ＨＣＡｂに基づいて二重特異性抗体の分子構造を構築するフレキシビリティを示し、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータによってＴ細胞を活性化する機能活性を調節した。ＨＣＡｂに基づく二重抗体構造、特にＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造の二重抗体分子とＦａｂ－ＨＣＡｂ構造の二重抗体分子は、ＰＤ－Ｌ１端の活性を保留し、ＭＬＲ実験において対応する抗ＰＤ－Ｌ１親モノクローナル抗体より強いＴ細胞活性化能力を体現した；一方で、標的細胞で高発現するＰＤ－Ｌ１分子は、４－１ＢＢの架橋及び三量化を媒介してＴ細胞活性化信号を伝達することができ、そのＴ細胞を活性化する能力は、Ｕｒｅｌｕｍａｂよりも優れている。また、ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造とＦａｂ－ＨＣＡｂ対称構造の二重抗体分子は、ＦＩＴ－Ｉｇ構造の二重抗体分子よりも強いＴ細胞活性化能力を示している。
３． 本発明が提供するＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、１つまたは複数の作用機序によって抗腫瘍効果と安全性を高める。第一に、ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体は、従来のＨＥＲ２阻害剤の作用機序を保持する（ＨＥＲ２の二量化を阻止し、ＨＥＲ２の内化と分解を促進し、下流のリン酸化信号を抑制する）。第二に、腫瘍細胞表面に高発現したＨＥＲ２分子は、Ｔ細胞表面の４－１ＢＢ分子の架橋と三量化を促進し、下流信号伝導経路を活性化し、さらにＴ細胞の活性化と増殖を促進し、そのＴ細胞を活性化する能力はＵｒｅｌｕｍａｂよりも優れている。第三に、ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体のＴ細胞に対する活性化作用は、ＨＥＲ２を特異的依存する発現であり、二重抗体分子に媒介されるＴ細胞活性化は腫瘍マイクロ環境内に限られている。架橋された抗４－１ＢＢに依存する従来技術のＨＣＡｂモノクローナル抗体がＴ細胞を直接活性化することができないことに比べて、本発明はＨＣＡｂモノクローナル抗体を用いて構築されたＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体は、ＨＥＲ２を高発現する細胞が存在する場合にＴ細胞を特異的に活性化することができ、これにより、Ｕｒｅｌｕｍａｂのようなモノクローナル抗体が正常組織でＴ細胞を過剰に活性化することによる毒副作用を回避することができる。第四に、本実施例は、ＩｇＧ－ＶＨとＩｇＧ－ｓｃＦｖの２つの構造の抗ＨＥＲ２×４－１ＢＢの二重特異性抗体分子を構築して、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータによってＴ細胞を活性化する機能活性を調節する。同時にＨＣＡｂに基づく二重特異性抗体分子構造の構築のフレキシビリティを示した。
図１Ａ－図１Ｂ：４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体とヒトまたはカニクイザル４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞との結合についてのＦＡＣＳ検出。 同上。 図２：４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体が４－１ＢＢリガンドとＣＨＯ－Ｋ１／ヒト４－１ＢＢ細胞との結合を遮断することについてのＦＡＣＳ検出。 図３Ａ－図３Ｂ：ＨＥＫ２９３／４－１ＢＢ／ＮＦ－ｋｂレポーター遺伝子細胞を用いて４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体の４－１ＢＢ信号経路に対する活性化を検出する。 同上。 図４：４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体は、インビトロで４－１ＢＢ経路を活性化し、Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γの分泌を誘導し活性化する。 図５Ａ－図５Ｂ：４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体は、インビトロで４－１ＢＢ経路を活性化し、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γの分泌を誘導し活性化する。 同上。 図６Ａ－図６Ｃ：４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体ＰＲ０００４４８の、Ｂ６－ｈ４－１ＢＢトランスジェニックマウスＭＣ３８皮下結腸癌モデルにおける腫瘍成長抑制活性。 同上。 同上。 図７：ＰＲ０００４４８の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける薬物動態学。 図８Ａ－図８Ｃ：ＰＲ０００９８０抗体は、インビトロで４－１ＢＢ経路を活性化し、Ｔ細胞のけるＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αとＩＬ－２の分泌を誘導し活性化する。 同上。 同上。 図９Ａ－図９Ｄ：４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体とヒト４－１ＢＢタンパク質またはサル４－１ＢＢタンパク質との親和性についてのＢＩＡＣＯＲＥ検出。 同上。 同上。 同上。 図１０Ａ－図１０Ｂ：４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体ＰＲ０００９８０の、Ｂ６－ｈ４－１ＢＢトランスジェニックマウスＭＣ３８皮下結腸癌モデルにおける腫瘍成長抑制活性。 同上。 図１１Ａ－図１１Ｍ：４－１ＢＢ ＨＣＡｂ抗体とヒト４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞との結合についてのＦＡＣＳ検出。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１２Ａ－図１２Ｌ：４－１ＢＢ ＨＣＡｂ抗体とカニクイザル４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞との結合についてのＦＡＣＳ検出。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１３Ａ－図１３Ｊ：ＨＥＫ２９３／４－１ＢＢ／ＮＦ－ｋｂレポーター遺伝子細胞を用いて４－１ＢＢ ＨＣＡｂ抗体の４－１ＢＢ信号経路に対する活性化を検出する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１４Ａ－図１４Ｋ：４－１ＢＢ ＨＣＡｂ抗体が４－１ＢＢリガンドとＣＨＯ－Ｋ１／ヒト４－１ＢＢ細胞との結合を遮断することについてのＦＡＣＳ検出。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１５Ａ－図１５Ｄ：４－１ＢＢ ＨＣＡｂ抗体は、インビトロで４－１ＢＢ経路を活性化し、Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γの分泌を誘導し活性化する。 同上。 同上。 同上。 図１６Ａ－図１６Ｂ：ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ架橋がある、またはＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ架橋がない場合、４－１ＢＢ ＨＣＡｂ抗体は、インビトロで４－１ＢＢ経路を活性化し、Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γの分泌を誘導し活性化する。 同上。 図１７Ａ－図１７Ｄ：４－１ＢＢ ＨＣＡｂ抗体とＣＨＯ－Ｋ１／ヒト４－１ＢＢ細胞との特異的結合についてのＦＡＣＳ検出。 同上。 同上。 同上。 図１８Ａ－図１８Ｃ：ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重特異性抗体の構造概略図。 同上。 同上。 図１９Ａ－図１９Ｃ：ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重特異性抗体とＳＫ－ＢＲ－３細胞との結合についてのＦＡＣＳ検出。 同上。 同上。 図２０Ａ－図２０Ｅ：ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重特異性抗体とヒト４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞との結合についてのＦＡＣＳ検出。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２１Ａ－図２１Ｂ：ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重特異性抗体とカニクイザル４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞との結合についてのＦＡＣＳ検出。 同上。 図２２Ａ－図２２Ｄ：ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、ＳＫ－ＢＲ－３細胞の架橋で、インビトロで４－１ＢＢ経路を活性化し、Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γの分泌を誘導し活性化する。 同上。 同上。 同上。 図２３Ａ－図２３Ｅ：ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体の構造概略図。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２４Ａ－図２４Ｅ：ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体とＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞との結合についてのＦＡＣＳ検出。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２５Ａ－図２５Ｅ：ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体とヒト４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞との結合についてのＦＡＣＳ検出。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２６Ａ－図２６Ｂ：ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体とカニクイザル４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞との結合についてのＦＡＣＳ検出。 同上。 図２７Ａ－図２７Ｉ：ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の架橋で、インビトロで４－１ＢＢ経路を活性化し、Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γの分泌を誘導し活性化する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２８Ａ－図２８Ｋ：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いてＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体分子のＴ細胞に対する活性化作用を研究する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２９：４－１ＢＢ二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける薬物動態学。
以下に、特定の技術用語と科学用語を具体的に定義する。本文において、別に明確な定義があることは明らかである場合以外、本文で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。
使用するアミノ酸の３文字コードと１文字コードは、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２４３， ｐ３５５８（１９６８）に記載されている。
「抗体」という用語は、免疫グロブリンを指し、２本の同じ重鎖と２本の同じ軽鎖が鎖間ジスルフィド結合によって結合されてなるテトラペプチド鎖構造である。免疫グロブリンの重鎖定常領域のアミノ酸組成と配列順序が異なるため、その抗原性も異なる。これにより、免疫グロブリンを５種類、または免疫グロブリンの同種、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡとＩｇＥに分類することができ、その対応する重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖とε鎖である。同じ種類のＩｇは、ヒンジ領域のアミノ酸組成と重鎖ジスルフィド結合の数と位置の違いに応じて、異なるサブ種類に分けることができ、例えば、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けることができる。軽鎖は、定常領域の違いによって、κ鎖またはλ鎖に分ける。５種類のＩｇのうち、各種類のＩｇはκ鎖またはλ鎖を有してもよい。
抗体軽鎖抗体は、軽鎖定常領域をさらに含むことができ、当該軽鎖定常領域はヒト由来のκ、λ鎖またはその変異体を含むことができる。
抗体重鎖抗体は、重鎖定常領域をさらに含むことができ、当該重鎖定常領域はヒト由来のＩｇＧ１、２、３、４またはその変異体を含むことができる。
抗体重鎖と軽鎖のＮ端に近いアミノ酸の配列変化は大きく、可変領域（Ｖ領域）であり；Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列は比較的安定であり、定常領域（Ｃ領域）である。軽鎖と重鎖可変領域は、それぞれ１１０個前後のアミノ酸から構成され、その中の一部の領域のアミノ酸残基の変化は可変領域の他の部位より大きく、例えば軽鎖の第２４－３４、５０－５６、８９－９７位と重鎖の第３１－３５、５０－６５、９５－１０２位である。これらの領域は高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＨＶＲ）と呼ばれ、高可変領域は抗体が抗原エピトープと直接接触する部位であるため、相補決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｔａｒｉｔｙ－ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）とも呼ばれる。可変領域における非高可変領域は、アミノ酸組成と配列の変化が比較的少なく、これらのアミノ酸残基は可変領域の安定な立体構造、すなわちフレーム構造またはステント構造（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）を構成する。可変領域は、３つの高可変領域（ＨＶＲ）と、４つの配列が比較的保存されているフレーム領域（ＦＲ）とを含む。各軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）は、３つのＣＤＲ領域と４つのＦＲ領域からなり、アミノ端からカルボキシル端まで順に配列される順序は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４である。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を指す。重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指す。本願では、Ｃｈｏｔｈｉａ定義規則を用いて区分する。しかし、当業者には、配列可変性に基づくＫａｂａｔ定義規則（Ｋａｂａｔら、免疫学的タンパク質配列、第５版、米国国立衛生研究院、ベセスダ、メリーランド州（１９９１）を参照）、および構造環領域位置に基づくＣｈｏｔｈｉａ定義規則（Ｊｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－４８，１９９７を参照）などの本分野における様々な方法で抗体のＣＤＲを定義することができる。本発明の態様では、可変ドメイン配列中のアミノ酸残基を決定するために、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義を含むＣｏｍｂｉｎｅｄ定義規則を使用することもできる。Ｃｏｍｂｉｎｅｄ定義規則は、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の範囲を組み合わせたものである。当業者は、特に規定がない限り、特定抗体またはその領域（例えば可変領域）の「ＣＤＲ」および「相補決定領域」という用語は、本発明に説明された既知の態様のいずれかによって規定された相補決定領域を包含するものと理解すべきである。本発明が請求する保護範囲は、Ｃｈｏｔｈｉａ定義規則に基づいて示される配列であるが、他のＣＤＲの定義規則に従って対応するアミノ酸配列も本発明の保護範囲に含まれるべきである。
本願において、「全ヒト由来抗体」という用語は、一般に、ヒトの抗体をコードする遺伝子を遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子欠損動物に全て移し、動物に発現させる抗体を指す。抗体のすべての部分（抗体の可変領域と定常領域を含む）は、ヒト由来の遺伝子によってコードされる。全ヒト由来抗体は、異種抗体による人体への免疫副反応を大幅に減少させることができる。当分野で全ヒト由来抗体を得る方法としては、ファージディスプレイ技術、トランスジェニックマウス技術などがある。
「単鎖抗体」という用語は、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とが接続ペプチドによって結合された単鎖組換えタンパク質であり、完全な抗原結合部位を有する最小の抗体断片である。
「エピトープ」という用語は、抗原における免疫グロブリンまたは抗体と特異的に結合する部位を指す。エピトープは、隣接するアミノ酸、またはタンパク質の三段折りによって並列された非隣接アミノ酸から形成することができる。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは、通常、変性溶媒に曝露された後に保持されるが、三次折畳みによって形成されるエピトープは、通常、変性溶媒の処理後に失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間立体配座で少なくとも３～１５個のアミノ酸を含む。どのエピトープが特定抗体と結合されるかを決定する方法は、本技術分野でよく知られ、免疫印影及び免疫沈殿検出分析などを含む。エピトープの空間立体配座を決定する方法において、本技術分野における技術と、本文に記載の技術、例えばＸ線結晶分析法と２次元核磁気共鳴などが含まれる。
「核酸」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を指す。一本鎖または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸を別の核酸配列と機能関係に置く場合、核酸は「効果的に結合されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコーディング配列の転写に影響を与える場合、プロモーターまたはエンハンサーは、コーディング配列に効果的に接続される。
本願において、「特異的に結合する」という用語は、一般に、抗体がその抗原結合領域を介してエピトープと結合することを意味し、且つ当該結合には抗原結合領域とエピトープとの間のある程度の相補性が必要である。この定義によれば、抗体がランダムに関連性のないエピトープと結合することより、抗体がその抗原結合領域を介してエピトープに結合しやすい場合は、当該抗原に「特異的に結合する」と呼ばれる。
本願において、「Ｆａｂ」という用語は、一般に、抗体の重鎖可変領域ＶＨ、軽鎖可変領域ＶＬ、重鎖定常領域ドメインＣＨ１及び軽鎖定常領域ＣＬを含む通常の抗体（例えばＩｇＧ）中の抗原と結合する部分を指す。通常の抗体では、ＶＨのＣ端はＣＨ１のＮ端に結合して重鎖Ｆｄフラグメントを形成し、ＶＬのＣ端はＣＬのＮ端に結合して軽鎖を形成し、ＣＨ１のＣ端はさらに重鎖のヒンジ領域とその他の定常領域ドメインに結合して重鎖を形成する。ある実施形態では、「Ｆａｂ」はまたＦａｂの変異体構造を指す。例えば、ある実施形態では、ＶＨのＣ端とＣＬのＮ端が結合して１つのポリペプチド鎖を形成し、ＶＬのＣ端とＣＨ１のＮ端が結合して別のポリペプチド鎖を形成し、Ｆａｂ（ｃｒｏｓｓ ＶＨ／ＶＬ）の構造を形成する；ある実施形態では、ＦａｂのＣＨ１はヒンジ領域に結合されず、ＣＬのＣ端は重鎖のヒンジ領域に結合され、Ｆａｂ（ｃｒｏｓｓ Ｆｄ／ＬＣ）の構造を形成する。
本願において、「ＶＨ」という用語は、通常、抗体の重鎖可変領域ＶＨドメインを指し、すなわち、ヒトまたは他の動物の通常の抗体（Ｈ２Ｌ２構造）の重鎖可変領域ＶＨであってもよく、ラクダ科などの動物の重鎖抗体（ＨＣＡｂ構造）の重鎖可変領域ＶＨＨであってもよく、Ｈａｒｂｏｕｒ ＨＣＡｂトランスジェニックマウスを用いて産生された全ヒト由来重鎖抗体（ＨＣＡｂ構造）の重鎖可変領域ＶＨであってもよい。
実施例１．全ヒト由来４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体の獲得
実施例１．１．モノクローナル抗体の作製
Ｈａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウス（Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＢＶ）はヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、その産生抗体は完全なヒト抗体可変ドメインとラット定常ドメインを有する。Ｈａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウスに対して、可溶性組換えヒト４－１ＢＢ－Ｆｃ融合タンパク質を用いて多ラウンド免疫を行った。マウス血清中の４－１ＢＢ特異的抗体価が特定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出し、骨髄腫細胞系と融合してハイブリドーマ細胞を得た；ハイブリドーマ細胞を多ラウンドスクリーニング及びクローニングした後、抗４－１ＢＢモノクローナル抗体分子を発現する２つのハイブリドーマ細胞株６５Ｄ４Ｇ５Ｇ１１及び７９Ｂ１０Ｇ８Ｄ４を単離した。抗体分子可変ドメインをコードするヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を、従来のハイブリドーマ配列決定手段を用いて得た。本実施例では、免疫のＨａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウスから得られたモノクローナル抗体分子可変ドメインの配列はヒト由来抗体配列である。抗体可変ドメインのＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＫａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義を組み合わせたＣｏｍｂｉｎｅｄ定義規則によって分析することができる。本発明の実施形態におけるＣＤＲ配列は、Ｃｈｏｔｈｉａ定義規則に従って区分される。
実施例１．２．組換え全ヒト由来抗体の作製
抗体分子をコードする軽、重鎖可変ドメイン配列を得た後、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて、軽、重鎖可変ドメイン配列と対応するヒトの抗体軽、重鎖定常ドメイン配列を融合発現し、組換え抗体分子を得ることができる。
６５Ｄ４Ｇ５Ｇ１１クローンの抗体番号はＰＲ０００１９６であり、７９Ｂ１０Ｇ８Ｄ４クローンの抗体番号はＰＲ０００１９７である。
同時に、本願は抗４－１ＢＢの陽性対照抗体ＵｒｅｌｕｍａｂとＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ類似体を製造し、Ｕｒｅｌｕｍａｂ対応の抗体番号はＰＲ０００６２８であり、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ対応の抗体番号はＰＲ０００４８３である。その対応するアミノ酸配列はＩＭＧＴデータベースに由来する。
本実施例では、抗体軽鎖可変ドメイン配列（ＶＬ）を遺伝子合成によりヒト抗体κ軽鎖の定常ドメイン配列をコードする哺乳動物細胞の発現プラスミドベクターにクローニングし、抗体の全長軽鎖をコードし産生する。本実施例では、抗体重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）を遺伝子合成によりヒトＩｇＧ４抗体重鎖定常ドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングし、ＩｇＧ４抗体の全長重鎖をコードし産生する。且つ、ＩｇＧ４重鎖定常領域にＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ番号による２２８位のセリンがプロリンに置換）を導入してＩｇＧ４抗体の安定性を高める。本実施例では、抗体重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）を遺伝子合成によりヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２抗体重鎖定常ドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングし、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体の全長重鎖をコードし産生する。本実施例では、免疫のＨａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウスから得られたモノクローナル抗体分子可変ドメインの配列がヒト由来抗体配列であるため、本実施例でも全ヒト由来の抗４－１ＢＢ組換え抗体を得た。
抗体重鎖をコードするプラスミドと抗体軽鎖をコードするプラスミドをヒト胚腎細胞ＨＥＫ２９３などの哺乳動物宿主細胞に同時にトランスフェクションし、従来の組換えタンパク質発現と精製技術を利用して、軽鎖及び重鎖が正しく組合せて組み立てられた精製された組換え抗体を得ることができる。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） Ｆ１７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｔｈｅｒｍｏ，Ａ１３８３５０４）で培養した。瞬時トランスフェクション開始前に、細胞濃度を６～８×１０５細胞／ｍｌに調整し、３７°Ｃで８％ＣＯ２ロッカ中で２４時間培養し、細胞濃度は１．２×１０６細胞／ｍｌである。培養した細胞を３０ｍｌ用意する。前記の抗体重鎖をコードするプラスミドと抗体軽鎖をコードするプラスミドの合計３０μｇのプラスミドを２：３の割合で混合して、１．５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ血清減少培地（Ｔｈｅｒｍｏ、３１９８５０８８）に溶解し、０．２２μｍ濾過膜で濾過除菌した。さらに１．５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭを１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ，２３９６６－２）１２０μｌに溶解し、５分間静置した。ＰＥＩをゆっくりとプラスミドに加え、室温で１０分間インキュベートし、培養瓶を揺らしながらプラスミドＰＥＩ混合溶液をゆっくり滴下し、３７°Ｃで８％ＣＯ２ロッキングベッドで５日間培養した。５日後に細胞生存率を観測した。培養物を収集し、３３００Ｇ回転速度で１０分間遠心分離した後、上清を採取した。その後、上清を高速遠心分離して不純物を除去した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７１－５０２０－９１ ＡＥ） を含む重力カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、７３１１５５０）を平衡化させ、２－５倍カラム体積で洗浄した。上清サンプルをカラムに通す。カラム体積の５～１０倍のＰＢＳでカラムを洗い流す。目的のタンパク質をｐＨ３．５の０．１Ｍグリシンで溶出した後、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌで中性に調整し、最後に限外ろ過管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ ９０１０２４）でＰＢＳ緩衝液に濃縮交換し、精製した抗体溶液を得た。そしてＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（商標） ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標） Ｏｎｅ）で濃度を測定し、分割し、予備に保存する。
実施例１．３．抗体の配列解析と最適化
抗体の重鎖可変ドメイン配列は、染色体上の重鎖遺伝子群の胚系遺伝子Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子フラグメントの遺伝子組み換えと体細胞の高周波突然変異などの事象に由来する；軽鎖可変ドメイン配列は、κまたはλ軽鎖遺伝子群の胚系遺伝子Ｖ、Ｊ遺伝子フラグメントの遺伝子組み換え、体細胞の高周波突然変異などの事象に由来する。遺伝子組み換えと体細胞の高周波突然変異は、抗体の多様性を増加させる主要な要素である。同じ胚系Ｖ遺伝子フラグメントに由来する抗体も異なる配列を産生する可能性があるが、全体的に類似性が高い。ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ．ｃｇｉ）またはＮＣＢＩ／ＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）などの計算方法により、抗体の可変ドメイン配列から遺伝子組み換えが発生した場合に可能な胚系遺伝子フラグメントを推定することができる。実施例１．１で得られた抗体配列を分析し、その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の胚系遺伝子Ｖ遺伝子断片を表１に示す。
タンパク質またはポリペプチドアミノ酸鎖は、細胞中で翻訳し合成されると、翻訳後修飾（ＰＴＭ）と呼ばれる化学修飾が導入されることがある。抗体にとって、いくつかのＰＴＭの部位は非常に保守的であり、例えば、ヒトのＩｇＧ１抗体の定常ドメインの第２９７位（ＥＵ番号）の保守的アミノ酸であるアスパラギンＡｓｎは通常グリコシル化修飾を起こして糖鎖を形成し、この糖鎖構造は抗体構造と関連するエフェクター機能にとって極めて重要である。しかし、抗体の可変ドメイン、特にＣＤＲなどの抗原結合領域にＰＴＭが存在する場合、これらのＰＴＭの存在は抗原結合に大きな影響を与える可能性があり、抗体の物理化学的特性にも変化をもたらす可能性がある。例えば、グリコシル化、脱アミド、異性化、酸化などはいずれも抗体分子の不安定性または異質性を増加させ、それによって抗体開発の難度とリスクを増加させる可能性がある。したがって、いくつかの潜在的なＰＴＭを回避することは、治療抗体の開発にとって非常に重要である。経験の蓄積に伴い、いくつかのＰＴＭがアミノ酸配列の組成、特に隣接するアミノ酸組成の「パターン」と高度に関連していることが発見され、これによりタンパク質の一級アミノ酸配列から潜在的なＰＴＭを予測することができる。例えば、Ｎ－ｘ－Ｓ／Ｔ（第１位はアスパラギンであり、第２位はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、第３位はセリンまたはトレオニンである）の配列パターンから、Ｎ－結合グリコシル化部位を予測する。ＰＴＭを引き起こすアミノ酸配列パターンは、胚系遺伝子配列に由来する可能性があり、例えば、ヒト胚系遺伝子フラグメントＩＧＨＶ３－３３は天然にＦＲ３領域にグリコシル化パターンＮＳＴが存在し；体細胞の高周波突然変異に由来する可能性もある。表１は、実施例１．１の抗体の可変ドメインＶＨ及びＶＬの予測ＰＴＭを示す。具体的には、ＮＨＳはグリコシル化部位であり、ＮＧは脱アミド部位である可能性がある。
アミノ酸突然変異によってＰＴＭのアミノ酸配列パターンを破壊し、それによって特定のＰＴＭの形成を低減または除去することができる。抗体配列とＰＴＭ配列パターンによって、異なる突然変異の設計方法がある。１つの方法は、「ホットスポット」アミノ酸（例えば、ＮＳモードにおけるＮまたはＳ）を物理化学的に類似したアミノ酸（ＮをＱに突然変異させるなど）に置換することである。ＰＴＭ配列パターンが体細胞の高周波変異に由来し、胚系遺伝子配列に存在しない場合、別の方法は、配列パターンを対応する胚系遺伝子配列に置換することである。実際の操作では、同じＰＴＭ配列パターンに対して複数の突然変異の設計方法を採用することができる。
抗体Ｆｃドメイン媒介のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣとＣＤＣにも非常に重要な生物学的機能があり、異なるＩｇＧサブタイプには異なるＡＤＣＣまたはＣＤＣ機能があり、例えばＩｇＧ１とＩｇＧ３には強いＡＤＣＣとＣＤＣ作用があり、ＩｇＧ２とＩｇＧ４には相対的に弱い。また、アミノ酸突然変異や修飾によるＦｃとＦｃ受容体の結合能力の変化もＦｃの本来のエフェクター機能を調節することができる。例えば、ＩｇＧ１における「ＬＡＬＡ」二重突然変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ Ａ）との親和性を低下し、さらにＡＤＣＣ作用を低下させることができる。本実施形態では、同じ抗体に由来する可変領域を、エフェクター機能を調節するために、異なるＩｇＧサブタイプまたは変異体に組み換えることができ、例えば、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）が挙げられる。
Ｄ． Ｚｈａｎｇらは、ヒトＩｇＧのＦｃのＥ３４５部位に突然変異Ｅ３４５Ｒを導入することで、アゴニスト型ＯＸ４０抗体の活性化作用を効果的に増加させることができることを発見した（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９１：２７１３４－２７１４６、２０１６）。
このＥ３４５Ｒ突然変異は、アゴニスト型４－１ＢＢ抗体の活性化作用を効果的に増加させることができることも本出願で見出された。本実施例では、ＩｇＧサブタイプ変換、可変領域突然変異、Ｆｃ突然変異により表１の抗４－１ＢＢハイブリドーマモノクローナル抗体を配列最適化し、一連の組換え抗体またはその変異体を得た（表２参照）。表３．１、表３．２及び表ａは、本実施例で得られた組換え抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列、軽鎖全長アミノ酸配列、重鎖全長アミノ酸配列、及びＣｈｏｔｈｉａ定義規則に従って定義されたＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
実施例１．４．４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体と細胞表面の４－１ＢＢ結合
ヒト４－１ＢＢを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞とカニクイザル４－１ＢＢを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を増幅培養した後、ＰＢＳで３回洗浄し、３×１０５／ウェルで９６ウェル板（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３７９９）に添加する。次に１００μｌの測定抗原結合タンパク質または陽性対照抗体ＵｔｏｍｉｌｕｍａｂまたはＵｒｅｌｕｍａｂを添加し、最高濃度２００ｎＭ、５倍希釈、４°Ｃで１時間育成する。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１：１０００で希釈されたヒツジ抗ヒトＩｇＧのＡＦ４８８コンジュゲーション抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃Ａ１１０１３）を加え、４°Ｃで１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳで再懸濁し、ＦＡＣＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｎｔｏ ＩＩ）テストを行い、蛍光信号を読み取る。測定結果から相対結合活性の評価根拠として、半数最大結合効果濃度（ＥＣ５０）を算出した。
結果を図１及び下表４に示す。図１Ａは抗原結合タンパク質とヒト４－１ＢＢとの結合活性を示し、図１Ｂは抗原結合タンパク質とサル４－１ＢＢとの結合活性を示す。ＰＲ０００４４７とＰＲ０００４４８はいずれもヒトとカニクイザルの４－１ＢＢを結合することができ、結合活性は陽性対照Ｕｒｅｌｕｍａｂより優れている。Ｕｒｅｌｕｍａｂはカニクイザル４－１ＢＢを交差結合することはできない。
実施例１．５．４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体が４－１ＢＢリガンドと４－１ＢＢとの結合を遮断すること
ヒト４－１ＢＢ結合タンパク質がインビトロでヒト４－１ＢＢとヒト４－１ＢＢＬとの結合を遮断する活性を研究するために、ヒト４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ）を用いて、細胞レベルでのヒト４－１ＢＢ／ヒト４－１ＢＢＬ結合遮断実験を行った。簡単に言えば、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ細胞を消化し、Ｆ－１２Ｋ完全培地で再懸濁し、細胞密度を１×１０６細胞／ｍＬに調整する。９６ウェルＶプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種し、次いで１００μＬ／ウェルで最終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗原結合タンパク質を添加し、均一に混合し、そのうち抗原結合タンパク質の最高最終濃度は１００ｎＭで、合計８濃度があり、ｈＩｇＧ１を対照とした。細胞を４°Ｃに置き、遮光して１時間インキュベートした。その後、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を捨て、その後、５０μＬ／ウェルで１μｇ／ｍＬ濃度のビオチン標識ヒト４－１ＢＢＬタンパク質（Ａｃｒｏ，＃４１Ｌ－Ｈ８２Ｆ９）を添加し、４°Ｃで遮光して３０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルで予冷のＰＢＳを添加し細胞を２回すすぎ、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。１００μＬ／ウェルで蛍光二次抗体（ＰＥ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＢＤ、＃５５４０６１、１：２００）を加え、４°Ｃで遮光して３０分間インキュベートした。２００μＬ／ウェルで予冷のＰＢＳで細胞を２回洗浄し、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μＬ／ウェルで予冷のＰＢＳを用いて細胞を再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ＩＣ５０を計算し、抑制率％＝１－ＭＦＩ（４－１ＢＢ Ａｂ）／ＭＦＩ（ｉｓｏ）。
結果を図２に示す。ＰＲ０００４４８は４－１ＢＢリガンドと４－１ＢＢとの結合を遮断し、遮断効果はＵｔｏｍｉｌｕｍａｂと似ている。
実施例１．６．レポーター遺伝子細胞系を用いた４－１ＢＢ信号経路への刺激作用の検出
ＣＤ３２ｂを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，＃Ｍ００５８７）またはＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ，＃ＣＣＬ－６１）を９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，＃６００５２２５）に敷き、細胞量を１．５×１０４／ウェル、１００μＬ／ウェルである。３７°Ｃで一晩５％ＣＯ２環境下でインキュベートした。上清を除去し、４０μＬ／ウェルの２倍の測定抗原結合タンパク質希釈液を加え、初期濃度が２００ｎＭであり、５倍濃度希釈で、ｈｌｇＧ１は対照群であった。４．５×１０４／ウェルの４－１ＢＢおよびＮＦ－Ｋｂ反応素子を連続発現できるルシフェラーゼレポーター遺伝子のＨＥＫ２９３レポーター細胞（ＨＥＫ２９３／４－１ＢＢ／ＮＦ－ｋｂレポーター細胞、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃７９２８９）４０μＬ／ウェルで添加する。３７°Ｃで５％ＣＯ２環境下で６時間培養した。ＯＮＥ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｅ６１１０）を加え、室温で５分間インキュベートし、マイクロプレートリーダー測定器で発光値を測定した。
図３Ａ、図３Ｂ及び下表５に示すように、本願の４－１ＢＢ抗原結合タンパク質ＰＲ０００４４８はＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ架橋依存型である。図３Ａに示すように、ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ架橋の下で、本願に記載されたＰＲ０００４４８の４－１ＢＢへの媒介のＮＦ－Ｋｂ信号経路の促進作用は、その濃度と正の相関関係で増加する。参照抗体（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）と比較して、この抗体のＥＣ５０は参照抗体より低く、最大発光値も参照抗体より高く、これは、この抗体がより低い濃度でＮＦ－Ｋｂの活性化を促進できることを示している。図３Ｂに示すように、参照抗体Ｕｒｅｌｕｍａｂは４－１ＢＢ信号経路の活性化は架橋に依存せず、ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ架橋がない場合、同様に４－１ＢＢ媒介のＮＦ－Ｋｂ信号経路を活性化することができる。一方、ＰＲ０００４４８は、ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ架橋がない場合、４－１ＢＢ媒介のＮＦ－Ｋｂ信号経路を活性化できない。
実施例１．７．４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体の体外機能検出
実施例１．７．１．４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体が４－１ＢＢ経路を体外活性化すること
１０μｇ／ｍｌのマイトマイシン（Ｒｕｉｔａｉｂｉｏ、１０１０７４０９００１）を用いてＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２ｂ（ヒトＣＤ３２ｂを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞）の細胞を処理し、３７°Ｃで３０分間放置した。その後、１０％ＦＢＳ のＦ－１２Ｋ培養液で４回洗浄した。処理した細胞を９６ウェルプレートに入れ、１ウェルに１．５×１０４個であり、３７°Ｃの保温箱を一晩培養した。翌日、ＭＡＣＳキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，＃１３０－０９６－５３５）を用いてヒトＰＢＭＣからヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離した。まず、細胞数を確認し、その後、細胞数に応じてＭＡＣＳ緩衝液とＰａｎ－Ｔ細胞ビオチン抗体を添加し、混合し、４°Ｃで５分間静置した。その後、対応する量のマイクロビーズを加え、４°Ｃで１０分間静置した。ＬＳカラムを通過したのはＣＤ３陽性のＴ細胞であった。前日の９６ウェルプレートの培養液を洗浄し、精製のＴ細胞を加え、ウェルあたり１×１０５個である。その後、対応する濃度の４－１ＢＢ抗原結合タンパク質または対照抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ、ＰＲ０００１９６を添加し、ＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃１６－００３７－８５）を添加し、最終濃度を０．３μｇ／ｍｌにした。３７°Ｃ保温箱で７２時間培養した。７２時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃８８－７３１６－８８）を用いてＩＦＮ－γの含有量を検出した。９６平底プレートにコーティング抗体を添加し、４°Ｃで一晩放置した。翌日、ＥＬＩＳＡ緩衝液を加え、室温で１時間置く。受け取った上清液を加え、室温で２時間培養した。プレートを２回洗浄し、検出抗体を加え、室温で１時間置く。プレートを２回洗浄し、ＨＲＰ－ストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした。次にＴＭＢ基質を加え、後でＥＬＩＳＡ停止液（ＢＢＩ，＃Ｅ６６１００６－０２００）を加えた。マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｅｍｅｒＥｎｓｐｉｒｅ）で４５０ｎｍと５７０ｎｍの吸光度値を読み取り、ＯＤ４５０－ＯＤ５７０を用いてＩＦＮ－γ濃度を計算した。
結果は、図４に示すように、ＰＲ０００１９７、ＰＲ０００４４７及びＰＲ０００４４８抗体はいずれも４－１ＢＢ経路を活性化し、Ｔ細胞を活性化しＩＦＮ－γの分泌を誘導することができる。そして、その活性化作用はいずれもＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ、ＰＲ０００１９６より強い。
実施例１．７．２．４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体がＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を誘導すること
実施例１．７．１の方法に従って、ＣＨＯ－Ｋ１またはＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂの細胞を処理し、プレートを敷き、３７°Ｃの保温箱で一晩培養した。翌日、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を選別するために、選別試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，＃１３０－０９６－４９５，＃１３０－０９６－５３３）を用いた。その後、対応する濃度の４－１ＢＢ抗体または対照抗体を加え、ＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃１６－００３７－８５）を加え、最終濃度を０．３μｇ／ｍｌにする。３７°Ｃ保温箱で７２時間培養した。７２時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃８８－７３１６－８８）を用いてＩＦＮ－γの含有量を検出した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞誘導は図５Ａに示し、ＣＤ４＋Ｔ細胞誘導は図５Ｂに示す。
その結果、ＰＲ０００４４７とＰＲ０００４４８はＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌を顕著に活性化でき、しかしＣＤ４＋Ｔ細胞に対する活性化機能は顕著ではなかった。これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞における４－１ＢＢの発現がＣＤ４＋Ｔ細胞よりも高いためかもしれない。
実施例１．８．４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体が体内腫瘍成長を抑制する活性
Ｂ６－ｈ４－１ＢＢ遺伝子組換えマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ、＃１１００４）ＭＣ３８皮下結腸癌モデルを構築した。まず、マウス結腸癌細胞ＭＣ３８（Ｋｅｒａｆａｓｔ，ＥＮＨ２０４－ＦＰ）の蘇生を行った。培養条件：ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、２２４０００８９）＋１００Ｕ／ｍＬペニシリン（ＡＭＲＥＳＣＯ（登録商標），＃０２４２－１００ＭＵ）＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＡＭＲＥＳＣＯ（登録商標），＃０３８２）＋１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），＃１００９９）；３７°Ｃで飽和湿度、５％ＣＯ２。対数成長期のＭＣ３８細胞（継代回数を記録）を収集し、培養液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後に接種（腫瘍前細胞生存率：９８．９％、腫瘍後細胞生存率：９２％）、接種量：５×１０５／１００μｌ／匹（マトリックス接着剤を添加しない）、接種位置：右側皮下。グループ分け基準に従ってマウスを５グループに分け、各グループは６匹で、各グループの平均値は近く、平均値の範囲は８０－１２０ｍｍ３で、グループ入り基準：各グループ内の単匹マウス腫瘍の体積はできるだけ１５０ｍｍ３を超えず、かつグループ内のＳＥＭはできるだけ平均値の１／１０を超えない。グループ分け当日を０日目と定義し、グループ分け当日としての０日目から投与を開始した。
測定対象サンプルはＰＢＳで調製し、投与方式は腹腔注射で、用量体積は１０μｌ／ｇで、投与量が５ｍｇ／ｋｇで、投与頻度が２回／週で、投与期間が３週間で、計６回投与した。投与当日にマウスの体重と腫瘍体積を測定し、腫瘍の平均体積が７００－８００ｍｍ３に達するまで週２回測定した；腫瘍の平均体積が７００～８００ｍｍ３を超える場合は、１週間に３回腫瘍体積を測定するように変更した。腫瘍体積の計算方法は：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×腫瘍長径×腫瘍短径２。
マウス体重モニタリングは図６Ａに示し、腫瘍体積モニタリングは図６Ｂに示し、２７日後にマウスを安楽死させ、腫瘍を取り出して写真を撮り、腫瘍サイズは図６Ｃに示した。
結果により、ＰＲ０００４４８は明らかな腫瘍抑制効果があり、実験過程において、各群の動体重量はいずれも増加し、動物の被験品に対する耐性が良好であることを表明した。動物に明らかな毒性作用はなく、安全性は比較的に良い。
実施例１．９．薬物動態学試験
雌性Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＰＲ０００４４８の薬物動態学を評価した。ＰＲ０００４４８とＵｔｏｍｉｌｕｍａｂを５ｍｇ／ｋｇで静脈内に単回投与し（ｎ＝５）、注射前と注射後１日、２日、４日、７日、１０日、１４日に採血した。採取した血液は直ちに４°Ｃで１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血漿を得て、－２０°Ｃ以下の冷蔵庫に保存した。ＥＬＩＳＡ法を用いて血漿中の測定抗体の濃度を測定した。ＰＲ０００４４８とＵｔｏｍｉｌｕｍａｂの血漿中の濃度変化を図７に示す。得られた血漿中の濃度変化データを薬物動力分析ソフトウェアＷｉｎＮｏｌｉｎにより分析し、薬物半減期（ｔ１／２）を算出した。ｔｌ／２は、最終３点またはソフトウェアによって自動的に設定される最終相血漿中の濃度により計算した。得られた末端ｔ１／２を図７及び下表６に示す。
その結果、ＰＲ０００４４８はＵｔｏｍｉｌｕｍａｂに比べて長い血液半減期を持っていることが明らかになった。
実施例１．１０．Ｆｃ点突然変異４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体の体外活性化機能
４－１ＢＢ経路に対するＦｃ突然変異抗体ＰＲ０００９８０の活性化効果を評価するために、実施例１．６．１の方法に従って、ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃８８－７３１６－８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃８８－７３４６－８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃８８－７０２５－７７）を用いてＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αとＩＬ－２の含有量を検出した。Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４を対照とした。
結果は、図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃに示すように、測定抗原結合タンパク質はいずれも活性化Ｔ細胞のサイトカイン分泌を刺激でき、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂより強い。そして、Ｆｃ突然変異後のＰＲ０００９８０は親抗体ＰＲ０００４４８のＴ細胞のサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２）分泌を刺激する能力を持つ。
実施例１．１１．抗原結合タンパク質のエピトープ同定
ＦｏｒｔｅＢｉｏＯｃｔｅｔプラットフォームを用いて、実施例１で得られた４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体（ＰＲ０００４４８及びＰＲ０００９８０）及びＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｕｒｅｌｕｍａｂをエピトープ同定した。ここで、ＵｒｅｌｕｍａｂはＢｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂの抗４－１ＢＢの抗体ＢＭＳ－６６３５１３（ＣＡＳ：９３４８２３－４９－１）であり、実施例１．２の方法に従って発現精製して得た。第一段階に、ヒスチジン標識４－１ＢＢ抗原をセンサで捕捉した後、センサを抗体に浸漬し、当該抗体の１００％信号を取得する。第二段階に、第一抗体を複数のＡＨＣ先端に担持し、次いで緩衝液ｐＨ７．５の測定において６０秒のベースラインを得た。次いで、抗原結合を可能にするために、先端をヒスチジン標識の４－１ＢＢに１８０秒間暴露した。先端を測定緩衝液中の第二抗体を含むウェルへに転移し９０秒間続け、最終的な信号を当該第二抗体の信号として記録した。抑制率は、下記の式で計算した：抑制率（％）＝（Ａ－Ｂ）／Ａ＊１００、Ａ：ある抗体の１００％信号（第一段階から得られる）、Ｂ：この抗体を第二抗体とする信号（第二段階から得られる）。
第二抗体が明らかな結合を示す（すなわち、抑制率が４０％未満）場合、それは非競合剤（すなわち、第一抗体とは異なるエピトープ区間にある）とみなされる。第二抗体が明らかな結合を示さない（すなわち、抑制率が４０％以上）場合、それは競合剤（すなわち、第一抗体と同じエピトープ区間にある）とみなされる。結合測定は、第一抗体の存在下での第二抗体と４－１ＢＢとの結合と、第一抗体の遮断自身との比較によって行った。
その結果、下表７に示すように、ＰＲ０００４４８及びＰＲ０００９８０とＵｔｏｍｉｌｕｍａｂとの４－１ＢＢの結合部位での重複性は高いが、Ｕｒｅｌｕｍａｂの結合部位での重複性は低い。
実施例１．１２．４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体とヒトまたはサル４－１ＢＢタンパク質との親和性試験
実施例１で得られた４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体（ＰＲ０００４４８およびＰＲ０００９８０）とＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｕｒｅｌｕｍａｂを、Ｂｉａｃｏｒｅプラットフォームを用いて親和性同定した。試験にはＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡと０．０５％Ｐ２０、ｐＨ７．４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ－１００６－６９）を運転緩衝液として使用し、シリーズＳ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ－１００５－３０）を実験チップとした。流速を１０μｌ／ｍｉｎに設定し、以下の手順によりＣＭ５の４つのチャンネルにＰｒｏｔｅｉｎＡをコンジュゲーションする：１）注入時間を８００ｓに設定し、５０ｍＭ ＮＨＳと２００ｍＭ ＥＤＣを１：１体積比で新鮮に混合した後、４チャンネルに注入する；２）ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ－１００３－５０）でＰｒｏｔｅｉｎＡを２０μｇ／ｍｌに希釈し、各チャンネルに８００ｓ注入する；３）チップ表面の残りの活性カルボキシル基を封止するために、１Ｍ ｐＨ８．５エタノールアミンを８００ｓ注入する。封止後も１×ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液で装置を２時間平衡化させ、ＰｒｏｔｅｉｎＡの最終コンジュゲーション量は約２０００ＲＵであった。さらに、多サイクル動力学モードを設定し、抗体とタンパク質の親和性測定を行い、各サイクルには抗体の捕捉、分析物の結合、チップの再生を含む。抗体をすべて１μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌ／ｍｉｎの流速で２、３、４チャンネルに３０ｓ注入し、予めコンジュゲーションされたＰｒｏｔｅｉｎＡによって各抗体を捕捉し、捕捉量は約１２０ＲＵであった。ヒトの４－１ＢＢまたはカニクイザル４－１ＢＢを順に０ｎＭ、０．３９１ｎＭ、０．７８１ｎＭ、１．５６２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭの濃度勾配で４つのチャンネルに注入し、流速が３０μｌ／ｍｉｎであり、ＰＲ０００４４８、ＰＲ０００９８０に対して解離時間を６００ｓに設定し、Ｕｒｅｍｕｌａｂ、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂに対して解離時間を８０ｓに設定し、注入時間はいずれも１２０ｓとする。最後に表面から試験抗体を除去するために、同様の流速で１０ｍＭグリシン－塩酸ｐＨ１．５（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢＲ－１００３－５４）を３０ｓ注入し、チップを再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００分析ソフトウェア２．０を用いて実験結果を分析し、１チャネルを参照チャネルとして控除し、分析モデルは１：１動力学フィッティングモデルを選択した。
結果は表８及び図９Ａ－図９Ｄに示すように、４－１ＢＢ Ｈ２Ｌ２抗体とヒスチジン標識ヒト４－１ＢＢタンパク質及びヒスチジン標識サル４－１ＢＢタンパク質との親和性結果である。その結果、ヒトまたはサルの４－１ＢＢタンパク質との結合親和性にかかわらず、抗体ＰＲ０００４４８とＰＲ０００９８０の結合親和性はいずれもＵｒｅｍｕｌａｂとＵｔｏｍｉｌｕｍａｂよりも高く、Ｕｒｅｌｕｍａｂはサルの４－１ＢＢタンパク質と結合していないことが明らかになった。
実施例１．１３．Ｆｃ点突然変異抗体による体内腫瘍成長抑制の活性
実施例５の方法に従って、Ｂ６－ｈ４－１ＢＢトランスジェニックマウスＭＣ３８皮下結腸癌モデルを構築した。平均腫瘍体積が９９．１４ｍｍ３に達した場合、マウスは腫瘍体積に基づいてランダムにグループ化され、各グループが６匹である。グループ分け当日を０日目と定義し、グループ分け当日としての０日目から投与を開始した。測定対象サンプルはＰＢＳで調製し、投与方式は腹腔注射であり、投与量は２ｍｇ／ｋｇであった。投与開始後、週に２回体重を計量した。週に２回腫瘍体積を測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×腫瘍長径×腫瘍短径２。
マウスの体重と腫瘍体積の変化を図１０Ａ、図１０Ｂの結果に示したように、投与２９日後に測定したところ、ＰＲ０００４４８のＦｃ変異体ＰＲ０００９８０は腫瘍成長抑制活性がより強いことが分かった。
まとめ
本出願は、１）ヒト及びサル由来の４－１ＢＢタンパク質を結合することができる；２）免疫細胞のＩＦＮ－γ、ＩＬ２および／またはＴＮＦαの分泌を刺激できる；３）腫瘍の成長及び／又は腫瘍細胞の増殖を抑制することができる；４）４－１ＢＢ信号経路を活性化することができる、という特性における一種又は多種を有する抗原結合タンパク質を提供する。本出願はまた、前記抗原結合タンパク質の腫瘍の予防及び治療における使用を提供する。
実施例２．全ヒト由来４－１ＢＢ ＨＣＡＢ抗体の獲得
実施例２．１．全ヒト由来ＨＣＡｂマウスの免疫と４－１ＢＢ抗体の獲得
Ｈａｒｂｏｕｒ ＨＣＡｂマウス（ＨａｒｂｏｕｒＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＢＶ、ＷＯ２００２／０８５９４５Ａ３）はヒト免疫グロブリン免疫バンクを持つトランスジェニックマウスであり、従来のＩｇＧ抗体の半分の大きさしかなく、全く新しい「重鎖」のみからなる抗体を産生することができる。その産生抗体はヒトの抗体「重鎖」可変ドメインとマウスＦｃ定常ドメインのみを有する。軽鎖を含まないという特徴のため、この抗体は軽鎖ミスマッチと異種二量化の問題をほとんど解決し、この技術プラットフォームは従来の抗体プラットフォームでは実現しにくい製品を開発することができる。
実施例２．１．１．免疫ＨＣＡｂマウス
６～８週齢のＨａｒｂｏｕｒヒト由来抗体トランスジェニックマウスは、２群の免疫スキームを用いてＨａｒｂｏｕｒ ＨＣＡｂマウスに多ラウンド免疫を行った。免疫スキーム１は、組換えヒト４－１ＢＢ－ＥＣＤ－Ｆｃ（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）抗原タンパク質で免疫する。各マウスが免疫するたびに、皮下で鼠径部注射または腹腔内注射によって受ける総注射量は１００マイクロリットルである。１回目の免疫において、各マウスは５０マイクログラムの抗原タンパク質と完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（Ｓｉｇｍａ，＃Ｆ５８８１）とを体積比１：１で混合して作製した免疫原試薬によって免疫を受けた。その後の各ラウンドの免疫増強において、各マウスは２５マイクログラムの抗原タンパク質とＲｉｂｉアジュバント（ＳｉｇｍａＡｄｊｕｖａｎｔＳｙｓｔｅｍ、Ｓｉｇｍａ、＃Ｓ６３２２）とを混合して作製した免疫原試薬によって免疫を受けた。免疫スキーム２は、ヒト４－１ＢＢを過発現するＮＩＨ３Ｔ３－ｈ４－１ＢＢ（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）を用いて細胞系を安定化させて免疫する。各マウスは免疫するたびに２×１０６細胞懸濁液を腹腔内注射する。１ラウンド当たりの免疫増強間隔は少なくとも２週間であり、通常は５ラウンドを超えない。免疫時間は０、１４、２８、４２、５６、７０日であり、そして４９、７７日目にマウス血清抗体価を測定した。ＨＣＡｂマウス脾臓Ｂ細胞分離を行う５日前に、各マウス２５マイクログラムの抗原タンパク質の用量で最後の免疫増強を行った。
実施例２．１．２．抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体配列の獲得
マウスの血液を採取し、血液を１０倍希釈して６つの濃度（１：１００、１：１０００、１：１００００、１：１０００００、１：１００００００）を採取し、ヒト４－１ＢＢ－ＥＣＤ－Ｆｃ（Ｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）を被覆したＥＬＩＳＡプレートでＥＬＩＳＡ検出を行い、マウスの血液中の抗ヒト４－１ＢＢの抗体価を確定し、そして、フローサイトメトリーにより２つの濃度のマウス血液（１：１００、１：１０００）の、４－１ＢＢ高発現ＣＨＯ－Ｋ１／ｈ４－１ＢＢ細胞（Ｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）とＣＨＯ－Ｋ１母細胞に対する特異反応性を測定した。空白対照群（ＰＢ）は免疫前マウスの血清であった。マウス血清中の４－１ＢＢ特異的抗体価が特定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出してＢ細胞を分離し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＣｅｌｌＳｏｒｔｅｒを用いてＣＤ１３８陽性の漿細胞とヒト４－１ＢＢ抗原陽性のＢ細胞群を選別した。Ｂ細胞のＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０９１２００）を逆転写し、次いで特異的プライマーＰＣＲを用いてヒトＶＨ遺伝子を増幅した。ＰＣＲプライマー５’－ＧＧＴＣＣＣＡＧＴＧＴＳＡＧＡＧＡＧＴＧＴＧ－３’、５’－ＡＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＣＣ－３’。増幅されたＶＨ遺伝子断片をヒトＩｇＧ１抗体重鎖Ｆｃドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドｐＣＡＧベクターに構築した。
構築されたプラスミドで哺乳動物宿主細胞（例えばヒト胚腎細胞ＨＥＫ２９３）をトランスフェクションし発現させ、ＨＣＡｂの抗体を得た。ＨＣＡｂを発現する上清とヒト４－１ＢＢを過発現したＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）安定細胞系の結合を検出し、同時にＣＨＯ－Ｋ１細胞を陰性対照として用い、Ａｃｕｍｅｎスクリーニングを行った。得られた陽性モノクローナル抗体は、カニクイザル４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ４－１ＢＢ（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）安定細胞系との結合交差結合活性をさらに検出した。ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ及びＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ４－１ＢＢを結合する６８３個のモノクローナルの発現上清を得てＮＦ－ｋｂ機能試験を行い、同時に従来の配列確認手段を用いて抗体分子可変ドメインをコードするヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を獲得した。繰り返し配列を除去した後、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢとＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ４－１ＢＢを同時に結合する３２３個の機能的な、独特な配列を有する全ヒト由来４－１ＢＢモノクローナル抗体を得た。ヒトサル細胞結合能力およびＮＦ－Ｋｂ機能試験の結果に基づいて、総合上位３８個の抗体を選択して組換え発現を行った。
実施例２．１．２に由来する潜在的なＰＴＭ部位を有する１つの抗体に対して、アミノ酸突然変異によって新しい抗体分子（ＰＴＭ変異体と呼ばれる）を得た。
実施例２．１．３．抗４－１ＢＢ全ヒト由来組換え抗体の作製
ＨＣＡｂ抗体をコードするプラスミドを哺乳動物宿主細胞（例えばヒト胚腎細胞ＨＥＫ２９３）にトランスフェクションし、従来の組換えタンパク質発現と精製技術を用いて、精製された抗４－１ＢＢ組換え重鎖抗体を得ることができる。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） Ｆ１７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｔｈｅｒｍｏ，Ａ１３８３５０４）で培養した。瞬時トランスフェクション開始前に細胞濃度を６×１０５細胞／ｍｌに調整し、３７°Ｃ、８％ＣＯ２ロッカ中で２４時間培養し、細胞濃度は１．２×１０６細胞／ｍｌであった。培養した細胞を３０ｍｌ準備し、前記ＨＣＡｂ重鎖をコードするプラスミド３０μｇを１．５ｍｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ血清減少培地（Ｔｈｅｒｍｏ，＃３１９８５０８８）に溶解し、さらに１．５ｍｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを１ｍｇ／ｍｌ ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，＃２３９６６－２）１２０μｌに溶解し、５分間静置した。ＰＥＩをゆっくりとプラスミドに加え、室温で１０分間インキュベートし、培養瓶を揺らしながらプラスミドＰＥＩ混合溶液をゆっくり滴下し、３７°Ｃ、８％ＣＯ２ロッキングベッドで５日間培養した。５日後に細胞生存率を観測した。培養物を収集し、３３００Ｇの回転速度で１０分間遠心分離した後、上清を採取した。その後、上清を高速遠心分離して不純物を除去した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，＃７１－５０２０－９１ＡＥ）を含む重力カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，＃７３１１５５０）を平衡化させ、カラム体積の２－５倍で洗浄した。上清サンプルをカラムに通す。カラム体積の５～１０倍のＰＢＳでカラムを洗い流する。目的のタンパク質をｐＨ３．５の０．１Ｍグリシンで溶出し、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌで中性に調整し、最後に限外ろ過管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ９０１０２４）でＰＢＳ緩衝液に濃縮し、精製した抗４－１ＢＢ重鎖抗体溶液を得た。抗体濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで２８０ｎｍ吸光度を測定して得て、抗体の純度はＳＥＣ－ＨＰＬＣとＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定して得た。
実施例２．１．４．ＨＰＬＣ－ＳＥＣを用いたタンパク質純度と多量体の分析
タンパク質サンプルの純度および多量体の形態を分析するために、分析型分子サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いた。分析型カラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０８５４１、５μｍ、７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（型番：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）に接続し、ＰＢＳ緩衝液で室温で少なくとも１時間平衡させた。適量のタンパク質サンプル（少なくとも１０μｇ、サンプル濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整）を０．２２μｍ濾過膜で濾過した後、システムに注入し、ＨＰＬＣプログラムを設定する：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝液でサンプルを１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速でカラムを流し、最長時間は２０分；検出波長が２８０ｎｍである。採取後、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いてクロマトグラムを積分し、関連データを計算し、分析報告書を生成し、サンプル内の異なる分子サイズ成分の滞留時間を報告した。
実施例２．１．５．ＨＰＬＣ－ＨＩＣを用いたタンパク質純度と疎水性の分析
分析型疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて、タンパク質サンプルの純度と疎水性を分析した。分析型カラムＴＳＫｇｅ１ Ｂｕｔｙ１－ＮＰＲ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１４９４７，４．６ｍｍ×３．５ｃｍ）高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（型番：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）に接続し、ＰＢＳ緩衝液を用いて室温で少なくとも１時間平衡させる。設定方法は、１６分間以内に１００％移動相Ａ（２０ｍＭヒスチジン、１．８Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．０）から１００％移動相Ｂ（２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０）までの線形勾配であった、流速を０．７ｍｌ／ｍｉｎに設定し、タンパク質サンプル濃度が１ｍｇ／ｍｌで、注入体積が２０μｌで、測定波長が２８０ｎｍである。採取後、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いてクロマトグラムを積分し、関連データを計算し、分析報告書を生成し、サンプル内の異なる分子サイズ成分の滞留時間を報告した。
実施例２．１．６．ＤＳＦを用いた抗体分子の熱安定性の測定
示差走査蛍光法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ、ＤＳＦ）は、タンパク質の熱安定性を測定するための一般的な高フラックス法である。リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ装置を用いて、折り畳み解除されたタンパク質分子と結合した染料の蛍光強度の変化を監視することにより、タンパク質の変性の過程を反映し、タンパク質分子の熱安定性を反映する。本実施例はＤＳＦ法を用いてタンパク質分子の熱変性温度（Ｔｍ）を測定した。１０μｇのタンパク質を９６ウェルＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ、ＡＢ－０７００／Ｗ）に添加し、次いで２μｌ １００Ｘ希釈の染料ＳＹＰＲＯＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２００８１３８）を添加し、次いで最終体積が４０μｌ／ウェルとなるように緩衝液を添加した。ＰＣＲプレートを密封し、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）に置き、２５°Ｃで５分間インキュベートした後、０．２°Ｃ／０．２分の勾配で２５°Ｃから９５°Ｃに徐々に昇温し、試験終了時に温度を２５°Ｃに下げた。ＦＲＥＴスキャンモードを使用し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアを使用してデータ分析を行い、サンプルのＴｍを算出した。
表１２は、４－１ＢＢ ＨＣＡＢの大部分が良好な物理化学的性質を有することを示している。
実施例２．２．４－１ＢＢ ＨＣＡｂ抗体と細胞表面４－１ＢＢとの結合
本実施例は、抗ヒト４－１ＢＢのＨＣＡｂモノクローナル抗体がヒトとカニクイザル４－１ＢＢとインビトロで結合する活性を研究するためである。ヒト４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）、カニクイザル４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ４－１ＢＢ、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）を用いて細胞レベルでの抗体結合実験を行った。簡単に言えば、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ細胞とＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ４－１ＢＢ細胞を消化し、Ｆ１２Ｋ完全培地で再懸濁し、細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍｌに調整した。９６ウェルＶプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種し、次いで１００μｌ／ウェルで添加し、最終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を添加した。細胞を４°Ｃに置き、遮光して１時間インキュベートした。その後、１００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳを添加し細胞を２回すすぎ、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μｌ／ウェルで蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９－５４５－０６、１：５００希釈）を添加し、４°Ｃで遮光し３０分間インキュベートした。細胞を１００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳで２回洗浄し、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳを用いて細胞を再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを用いて蛍光発光信号値を読み取った。
図１１Ａから図１１Ｍに示すように、本発明の抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体はいずれもヒト４－１ＢＢに結合することができ、検出された抗体結合能力は抗体濃度と正の相関関係になって増加する。これらの抗体は、参照抗体（ＵｒｅｌｕｍａｂおよびＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ）と比較して、より低い濃度でヒト４－１ＢＢをより鋭敏に結合することができ、ここでは、ＰＲ００１７５８－ＰＲ００１７６０、ＰＲ００１７６４、ＰＲ００１８３０、ＰＲ００１８３１、ＰＲ００１８３３、ＰＲ００１８３６、ＰＲ００１８３８が最適であり、そのＥＣ５０はいずれも０．３ｎＭ未満であり、参照抗体ＵｔｏｍｉｌｕｍａｂおよびＵｒｅｌｕｍａｂのＥＣ５０に相当する。ＰＲ００７２８７、ＰＲ００７２９２、ＰＲ００７２９３、ＰＲ００７２９４、ＰＲ００７２９８がＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ細胞と結合する蛍光最大値は、参照抗体ＵｔｏｍｉｌｕｍａｂとＵｒｅｌｕｍａｂと比較して高い。
図１２Ａ～図１２Ｌに示すように、本発明の抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体はいずれもサル４－１ＢＢに結合することができ、検出された抗体結合能力は抗体濃度と正の相関関係を持って増加する。これらの抗体は、参照抗体Ｔａｂ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）と比較して、より低い濃度でサル４－１ＢＢと鋭敏に結合することができ、参照抗体ＵｔｏｍｉｌｕｍａｂのＥＣ５０に相当または優れている。ＰＲ００７２８７、ＰＲ００７２９２、ＰＲ００７２９３、ＰＲ００７２９４、ＰＲ００７２９８がＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ細胞と結合する蛍光最大値は、参照抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ及びＵｒｅｌｕｍａｂと比較してより高い。一方、参照抗体Ｕｒｅｌｕｍａｂは、サル４－１ＢＢと交差結合する活性を有しない。
実施例２．３．レポーター遺伝子細胞系を用いた４－１ＢＢ信号経路への刺激作用の検出
ＣＤ３２ｂを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ）を９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，＃６００５２２５）に敷き、細胞量が１．５×１０４／ウェルで、１００μＬ／ウェルである。３７°Ｃで５％ＣＯ２環境下で一晩インキュベートした。上清を除去し、４０μＬ／ウェルで２倍の測定抗原結合タンパク質希釈液を添加し、初期濃度が２００ｎＭで、３倍濃度希釈または初期濃度が３０ｎＭで、５倍濃度希釈で、ｈｌｇＧ１が対照群である。４．５×１０４／ウェルで４－１ＢＢおよびＮＦ－Ｋｂ反応素子を連続発現可能なルシフェラーゼレポーター遺伝子のＨＥＫ２９３レポーター細胞（ＨＥＫ２９３／４－１ＢＢ／ＮＦ－ｋｂレポーター細胞、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃７９２８９）を４０μＬ／ウェルで添加した。３７°Ｃで５％ＣＯ２環境下で６時間培養した。ＯＮＥ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｅ６１１０）を加え、室温で５分間インキュベートし、マイクロプレートリーダー測定器で発光値を測定した。
結果は、図１３Ａから図１３Ｉに示すように、ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ架橋の下で、本願の４－１ＢＢ抗原結合タンパク質の大部分の４－１ＢＢ媒介のＮＦ－Ｋｂ信号経路への促進作用は、その濃度に正の相関関係を持って増加した。参照抗体Ｔａｂ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）と比較して、ＥＣ５０は参照抗体と相当またはより低く、最大蛍光値も参照抗体と相当またはより高く、これは、これらの抗体がより低い濃度でＮＦ－Ｋｂの活性化を促進できることを示し、ここでＰＲ００７５８、ＰＲ００１７５９およびＰＲ００１７６０、ＰＲ００７２８６、ＰＲ００７２９１、ＰＲ００７２９５、ＰＲ００７２９６、ＰＲ００７２９７、ＰＲ００７２９９、ＰＲ００７３００が最適であり、そのＥＣ５０はいずれも０．８ｎＭ未満であり、参照抗体のＥＣ５０と相当する。
結果は、図１３Ｊに示すように、ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ架橋なしでは、本願に記載されたすべての４－１ＢＢ抗原結合タンパク質は、４－１ＢＢ媒介のＮＦ－ＫＢ信号経路に対する活性化がなかった。参照抗体Ｔａｂ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）は依然として強い活性化作用を持っている。
実施例２．４．抗原結合タンパク質が４－１ＢＢリガンドと４－１ＢＢとの結合を遮断すること
ヒト４－１ＢＢ結合タンパク質がヒト４－１ＢＢとヒト４－１ＢＢＬとの結合をインビトロで遮断する活性を研究するために、ヒト４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ）を用いて細胞レベルでのヒト４－１ＢＢ／ヒト４－１ＢＢＬ結合遮断実験を行った。簡単に言えば、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ細胞を消化し、Ｆ－１２Ｋ完全培地で再懸濁し、細胞密度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。９６ウェルＶプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種し、続いて１００μＬ／ウェルで、最終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定抗原結合タンパク質を添加し、均一に混合し、そのうち抗原結合タンパク質の最高最終濃度は１００ｎＭで、８つの濃度があり、ｈＩｇＧ１を対照とした。細胞を４°Ｃに置き、遮光して１時間インキュベートした。その後、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を捨て、その後、５０μＬ／ウェルで、１μｇ／ｍＬ濃度のビオチン標識ヒト４－１ＢＢＬタンパク質（ＡＣＲＯ、４１Ｌ－Ｈ８２Ｆ９）を添加し、４°Ｃで遮光して３０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルで予冷のＰＢＳを添加し細胞を２回すすぎ、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。１００μＬ／ウェルで蛍光二次抗体（ＰＥＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＢＤ，＃５５４０６１，１：２００）を添加し、４°Ｃで遮光して３０分間インキュベートした。２００μＬ／ウェルで予冷のＰＢＳで細胞を２回洗浄し、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μＬ／ウェルで予冷のＰＢＳを用いて細胞を再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ＩＣ５０を計算し、抑制率％＝１－ＭＦＩ（４－１ＢＢＡｂ）／ＭＦＩ（ｉｓｏ）。
結果は、図１４Ａ～図１４Ｋに示す。本願の４－１ＢＢ抗原結合タンパク質は、２種類に分類される。一類は、ヒト４－１ＢＢＬと細胞表面のヒト４－１ＢＢとの結合を遮断することができ、参照抗体Ｔａｂ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）に相当する遮断効果（ＰＲ００１７５８、ＰＲ００１７５９、ＰＲ００１７６０、ＰＲ００１７６４、ＰＲ００１７６６、ＰＲ００１７７６、ＰＲ００１７７６、ＰＲ００１８３０、ＰＲ００１８３１、ＰＲ００１８３３、ＰＲ００１８３６、ＰＲ００１８３７、ＰＲ００１８３８、ＰＲ００７２８７、ＰＲ００７２８９、ＰＲ００７２９０、ＰＲ００７２９１、ＰＲ００７２９２、ＰＲ００７２９３、ＰＲ００７２９４、ＰＲ００７２９５、ＰＲ００７２９６、ＰＲ００７２９８、ＰＲ００７２９９、ＰＲ００７３００）を示した。別の一類は、参照抗体（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）と類似しており、遮断効果が弱く、または遮断効果がない（ＰＲ００１７６３、ＰＲ００１７６７、ＰＲ００１７６８、ＰＲ００１７７１、ＰＲ００１７７４、ＰＲ００１７８０、ＰＲ００１７８１、ＰＲ００１８４０、ＰＲ００１８４２、ＰＲ００７２８６、ＰＲ００７２９７）。
実施例２．５．抗原結合タンパク質はインビトロで４－１ＢＢ経路を活性化することができる
１０μｇ／ｍｌのマイトマイシン（北京中生瑞泰科技、＃１０１０７４０９００１）を用いてＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ、＃ＣＣＬ－６１）またはＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ（ヒトＣＤ３２ｂを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞）の細胞を３７°Ｃで３０分処理した。その後、１０％ＦＢＳのＦ－１２Ｋ培養液で４回洗浄した。処理した細胞を９６ウェルプレートに入れ、１ウェルあたり１．５×１０４個とし、３７°Ｃの保温箱を一晩培養した。翌日、ＭＡＣＳキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，＃１３０－０９６－５３５）を用いてヒトＰＢＭＣからヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離した。まず細胞数を確認し、その後、細胞数に応じてＭＡＣＳ緩衝液とＰａｎ－Ｔ細胞ビオチン抗体を添加し、混合し、４°Ｃで５分間静置した。その後、対応する量のマイクロビーズを加え、４°Ｃで１０分間静置した。ＬＳカラムを通過したのはＣＤ３陽性のＴ細胞であった。前日の９６ウェルプレートの培養液を洗浄し、精製Ｔ細胞をウェルあたり１×１０５個で添加した。その後、対応する濃度の４－１ＢＢ抗体または対照抗体を加え、ＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃１６－００３７－８５）を加え、最終濃度を０．３μｇ／ｍｌにする。３７°Ｃ保温箱で７２時間培養した。７２時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃８８－７３１６－８８）を用いてＩＦＮ－γの含有量を検出した。９６平底プレートにコーティング抗体を添加し、４°Ｃで一晩放置した。翌日、ＥＬＩＳＡ緩衝液を加え、室温で１時間置く。受け取った上清液を加え、室温で２時間培養した。プレートを２回洗浄し、検出抗体を加え、室温で１時間置く。プレートを２回洗浄し、ＨＲＰ－ストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした。次にＴＭＢ基質を加え、後でＥＬＩＳＡ停止液（ＢＢＩ、Ｅ６６１００６－０２００）を加えた。マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｅｍｅｒＥｎｓｐｉｒｅ）は４５０ｎｍ吸光度（ＯＤ４５０）値を読み取り、ＩＦＮ－γ濃度を算出した。
その結果、図１５Ａ～図１５Ｄに示すように、本例のほとんどの４－１ＢＢ ＨＣＡＢは、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂよりも強い活性化作用を有し、例えば、ＰＲ００１７５８、ＰＲ００１７５９、ＰＲ００１７６０、ＰＲ００１７６４、ＰＲ００１８３０、ＰＲ００１８３３、ＰＲ００１８３４、ＰＲ００１８３６、ＰＲ００１８３７、ＰＲ００１８３８は、１ｎＭ という低濃度である場合、参照抗体 Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ よりも強いＴ 細胞活性化能力を有する。
結果は、図１６Ａ～図１６Ｂに示すように、ＰＲ０００１７５８、ＰＲ００１７５９及びＰＲ００１７６０抗体はいずれもＣＤ３２ｂ架橋依存性活性化４－１ＢＢ経路であり、活性化Ｔ細胞の機能を誘導する。ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ細胞架橋では、その活性化作用はすべてＵｔｏｍｉｌｕｍａｂより強く、Ｕｒｅｌｕｍａｂよりやや弱い。ＣＨＯ－Ｋ１／ＣＤ３２ｂ細胞架橋がない場合、本実施例のＨＣＡｂ抗体はＴ細胞の機能を活性化することができず、ＵｒｅｌｕｍａｂはＴ細胞を活性化することができ、これもＵｒｅｌｕｍａｂ毒性の原因と考えられる。活性化作用は抗体濃度と正の相関関係で増加し、ＥＣ５０はいずれも参照抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂより小さく、４－１ＢＢ経路を低濃度で活性化できることを示し、サイトカインインターフェロンｇａｍｍａ放出の最大値もＵｔｏｍｉｌｕｍａｂより高かった。
実施例２．６．組換え４－１ＢＢタンパク質に対する４－１ＢＢ抗体の結合親和性測定
メーカーが提供する詳細な操作と方法に従って、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６機器（Ｆｏｒｔｉｅｂｉｏ）と抗ヒトＩｇＧＦｃ アビジンセンサ（ＡＨＣセンサ、ＰａｌｌＦｏｒｔｅＢｉｏ、＃１８－５０６０）を使用して親和性を測定した。具体的には、０．１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡと０．０２％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてヒトの４－１ＢＢタンパク質、Ｈｉｓタグ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，＃４１Ｂ－Ｈ５２２７）またはカニクイザルの４－１ＢＢタンパク質、ｈｉｓタグ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，＃４１Ｂ－Ｃ５２Ｈ４）を４００ｎＭに希釈し、ＡＨＣセンサとインキュベートした。４０ｎＭの４－１ＢＢ抗体を、ヒト４－１ＢＢタンパク質またはサル４－１ＢＢタンパク質を持つＡＨＣセンサと３０°Ｃで３分間インキュベートした。反応混合物を０．１％（ｖ／ｗ）ＢＳＡと０．０２％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で３０°Ｃで５分間インキュベートした。ＯｃｔｅｔＲｅｄ９６は、４－１ＢＢ抗体と４－１ＢＢタンパク質の結合及び分離信号をリアルタイムで記録する。親和性、相関、解離定数はＯｃｔｅｔ使用ソフトウェアによって確認され、結果は表１３と表１４に示されている。
その結果、ＰＲ００１８３６とＰＲ００１８３８抗体のＫＤ値は、検出された抗体の中で、人４－１ＢＢとの結合またはカニクイザル４－１ＢＢとの結合にかかわらずやや低く、より強い４－１ＢＢ結合親和性を示した。
実施例２．７．抗原結合タンパク質のエピトープ同定（Ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ）
ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔプラットフォームを用いて、実施例１で得られた抗原結合タンパク質とｕｔｏｍｉｌａｂ、ｕｒｅｌｕｍａｂをエピトープ同定した。簡単に言えば、第一抗体を複数のＡＨＣ先端に担持し、次いで緩衝液ｐＨ７．５の測定において６０秒ベースラインを得た。次いで、抗原結合を可能にするために、ヒスチジン標識の４－１ＢＢに先端を１８０秒間暴露した。測定緩衝液中の第二抗体を含むウェルに先端を９０秒間移した。第二抗体が明らかな結合を示す場合、それは非競合剤（すなわち、第一抗体とは異なるエピトープ区間）とみなされる。第二抗体が明らかな結合を示さない場合、それは競合剤（すなわち、第一抗体と同じエピトープ区間）とみなされる。結合アッセイは、第一抗体の存在下での第二抗体の４－１ＢＢとの結合と第一抗体遮断そのものとの比較によって行った。抑制率は式により計算し、抑制率（％）＝（Ａ－Ｂ）／Ａ＊１００（注：Ａ：ある抗体の１００％信号、Ｂ：この抗体を第二抗体の信号とする）。
抑制率が８０％を超えると、２つの抗体が非常に近いエピトープを有することを意味し、抑制率が４０～８０％の間であれば、２つの抗体が比較的近いが完全に重畳していないエピトープを有することを意味し、抑制率が４０％未満であれば、２つの抗体が重複しないエピトープを有することを意味する。
結果は、下表１５に示すように、ＰＲ００１７６０、ＰＲ００１７７９、ＰＲ００１８３８及びＰＲ００１８４０は、４－１ＢＢとの結合部位で、Ｕｔｏｍｉｌｕａｂと高い重複性を有するが、Ｕｒｅｌｕｍａｂと低い重複性を有し、一方、ＰＲ００１７６７の結合部位は、ＵｔｏｍｉｌｕａｂやＵｒｅｌｕｍａｂと異なる特異性を持っている。
実施例２．８．抗原結合タンパク質の４－１ＢＢとの特異的結合
４－１ＢＢがＴＮＦ腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属し、このファミリーは、免疫と非免疫細胞機能を媒介する多機能受容体の大きなクラスから構成されている。ＣＤ４０、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０を含む６種類の受容体が重要な役割を果たす免疫共通刺激者であることが同定された。同様に、誘導型Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）は、活性化されたＴ細胞または記憶型Ｔ細胞の機能および生存に重要な役割を果たす別の受容体である。
本実施例は、ＴＮＦ腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの３つの受容体とＩＣＯＳに対して、フローサイトメトリー検出することによって抗ヒト４－１ＢＢのＨＣＡｂモノクローナル抗体とのインビトロ結合の特異性を研究する。ヒト４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）、ヒトＣＤ４０を過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ＣＤ４０、北京康源博創、＃ＫＣ－１２８６）、ヒトＯＸ４０を過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ＯＸ４０、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、＃Ｍ００５６１）、ヒトＩＣＯＳを過発現するＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ／ＩＣＯＳ、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、＃ＫＣ－０２１０）を用いて細胞レベルでの抗体結合実験を行った。簡単に言えば、これらの細胞を消化し、Ｆ１２ＫまたはＤＭＥＭ完全培地で再懸濁し、細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍｌに調整する。９６ウェルＶプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種し、次いで１００μｌ／ウェルで添加し、最終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を添加した。細胞を４°Ｃに置き、遮光して１時間インキュベートした。その後、１００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳを添加し細胞を２回すすぎ、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μｌ／ウェルで蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，ＦｃγＦｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９－５４５－０６、１：１０００希釈）を添加し、４°Ｃで遮光し３０分間インキュベートした。細胞を１００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳで２回洗浄し、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳを用いて細胞を再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを用いて蛍光発光信号値を読み取った。
結果は、図１７Ａ～図１７Ｄに示すように、本願に記載されたＰＲ００１７５８、ＰＲ００１７６０、ＰＲ００１８３６及びＰＲ００１８３８がＴＮＦ腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの他のメンバーを結合することなく、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ細胞に特異的に結合する。
まとめ
本発明の積極的な進歩効果は、下記の通りである。
本発明の４－１ＢＢ抗体は、「重鎖」のみを含む全く新しい全ヒト抗体であり、ヒト４－１ＢＢ及びカニクイザル４－１ＢＢと特異的に結合する活性を有する。この４－１ＢＢ重鎖抗体の大きさは、従来のＩｇＧ抗体の半分しかなく、軽鎖を含まないため、この抗体は二重特異性抗体に用いることができ、軽鎖ミスマッチと異種二量化の問題を解決した。
実施例３．ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重特異性抗体
ヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）は、ＥＲＢＢ２、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＮＥＵ、ＮＧＬ、ＴＫＲ１およびｃ－ｅｒｂＢ２とも呼ばれ、ラットではＥｒｂＢ２またはｎｅｕとも呼ばれ、ＥｒｂＢタンパク質ファミリーの一員であり、通常は表皮成長因子受容体ファミリーと呼ばれる。乳癌において侵襲性の高いタンパク質である。ＨＥＲ２は、細胞膜表面に結合したチロシンキナーゼであり、通常は細胞の成長と分化をもたらす信号伝達経路に関与する。ＨＥＲ２は孤児受容体とされ、ＥＧＦリガンドファミリーによって活性化することはできない。約３０％の乳癌は、ＨＥＲ２遺伝子増幅またはそのタンパク質産物の過発現を有し、この受容体の乳癌における過発現は、疾患の再発と予後不良と関連している。ＨＥＲ２は発育、癌、神経筋接続部の通信及び細胞成長と分化の調節に役割を果たす。
ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体は、Ｔ細胞とＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を複合することにより４－１ＢＢ凝集を促進し、腫瘍抗原特異性Ｔ細胞に有効な共刺激信号を提供し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に媒介される活性をさらに増強し、腫瘍解体を引き起こすことを目的とする。したがって、ＨＥＲ２×４－１ＢＢに媒介される４－１ＢＢの活性化は、例えば原発性腫瘍と腫瘍浸潤リンパ細胞（ＴＩＬ）または腫瘍転移を含むリンパ節など、インビボでＴ細胞と腫瘍細胞の共局在化に偏っている。
本実施例では、ＨＥＲ２と４－１ＢＢを同時に標的とする二重特異性抗体を構築し、１つ以上の作用機序により抗腫瘍効果と安全性を高めることを目的としている。第一に、ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体はＨＥＲ２高発現の腫瘍組織に富化し、Ｔ細胞はＨＥＲ２陽性腫瘍細胞と複合して４－１ＢＢ凝集を促進し、腫瘍抗原特異性Ｔ細胞に有効な共刺激信号を提供し、さらにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に媒介されるＴ細胞の活性を増強し、抗腫瘍活性を高める。したがってＨＥＲ２×４－１ＢＢに媒介される４－１ＢＢの活性化は、例えば原発性腫瘍と腫瘍浸潤リンパ細胞（ＴＩＬ）または腫瘍転移を含むリンパ節など、インビボでＴ細胞と腫瘍細胞の共局在化に偏っている。第二に、本実施例で用いた抗４－１ＢＢのアゴニスト抗体の機能は、分子架橋に依存しており、それは腫瘍マイクロ環境境中で標的細胞を利用してＴ細胞の活性化を媒介することしかできず、Ｕｒｅｌｕｍａｂのようなモノクローナル抗体が正常組織中でＴ細胞を過度に活性化させることによる毒副作用を回避する。
実施例３．１．ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重特異性抗体の構造と設計
本実施例は、対応するアミノ酸配列がＩＭＧＴデータベースに由来する抗ＨＥＲ２のＩｇＧ抗体ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを使用した。製造された抗体番号はＰＲ０００２１０であった。
本実施例で用いた抗４－１ＢＢの全ヒト由来Ｈ２Ｌ２抗体ＰＲ０００４４８及び誘導されたｓｃＦｖは、実施例１に記載されているように、Ｈａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウスに由来する。
本実施例で用いた抗４－１ＢＢの全ヒト由来ＨＣＡｂ抗体は、実施例２で説明したように、Ｈａｒｂｏｕｒ ＨＣＡｂマウスに由来している。
本実施例及びその後の実施例において、陽性対照分子は抗ＨＥＲ２のＩｇＧモノクローナル抗体ＰＲ０００２１０（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ類似体）であり、ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体分子のＨＥＲ２端の親モノクローナル抗体である。
本実施例及びその後の実施例において、陽性対照分子は抗４－１ＢＢのＩｇＧモノクローナル抗体Ｕｒｅｍｕｌａｂ及びＵｔｏｍｉｌｕｍａｂである
実施例３．１．１．抗ＨＥＲ２のＩｇＧ抗体と抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体を用いてＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造の二重特異性抗体を構築する
ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造（図１８Ａに示す）の結合タンパク質は、二本のポリペプチド鎖を含み：短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端までＶＬ＿Ａ－ＣＬを含む、ポリペプチド鎖１；及び、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端までＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ－ＶＨ＿Ｂを含む、ポリペプチド鎖２。
一つの実施形態では、ポリペプチド鎖２のＣＨ３とＶＨ＿Ｂが直接に融合結合し、すなわちＬの長さは０である。別の実施形態では、ポリペプチド鎖２のＣＨ３は、接続ペプチドＬを介してＶＨ＿Ｂに結合し；Ｌは、表１７に列挙された配列であってもよい。
抗ＨＥＲ２のＩｇＧ抗体と抗４－１ＢＢのＨＣＡｂの重鎖抗体を用いて、ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造のＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体分子を設計し、表１８にまとめた；作製した二重抗体分子サンプルの物理化学的性質分析を表１９にまとめた。
実施例３．１．２．抗ＨＥＲ２のＩｇＧ抗体と抗４－１ＢＢのＨ２Ｌ２抗体を用いてＩｇＧ－ｓｃＦｖ四価対称構造の二重特異性抗体を構築する
ＩｇＧ－ｓｃＦｖ四価対称構造（図１８Ｂに示す）の結合タンパク質は、二本のポリペプチド鎖を含み：短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端までＶＬ＿Ａ－ＣＬを含む、ポリペプチド鎖１；及び、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端までＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ１－ＶＨ＿Ｂ Ｌ２－ＶＬ＿Ｂを含む、ポリペプチド鎖２。
または
ＩｇＧ－ｓｃＦｖ四価対称構造（図１８Ｃに示す）の結合タンパク質は、二本のポリペプチド鎖を含み：短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端までＶＬ＿Ａ－ＣＬを含む、ポリペプチド鎖１；及び、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端までＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ１－ＶＬ＿Ｂ Ｌ２－ＶＨ＿Ｂを含む、ポリペプチド鎖２。
ポリペプチド鎖２の接続ペプチドＬ１及び接続ペプチドＬ２は、表１７に列挙された配列であり得る。
抗ＨＥＲ２のＩｇＧ抗体と抗４－１ＢＢのＨ２Ｌ２抗体を用いてＩｇＧ－ｓｃＦｖ四価対称構造のＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体分子を設計し、表２０にまとめた；作製した二重抗体分子サンプルの物理化学的性質分析を表２１にまとめた。
実施例３．２．ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体とＳＫ－ＢＲ－３細胞との結合能力についてのＦＡＣＳ検出
本実施例は、４－１ＢＢの二重特異性抗体がＳＫ－ＢＲ－３とインビトロで結合する活性を研究するためである。ＳＫ－ＢＲ－３はＨＥＲ２を高発現する乳癌細胞であり、ＳＫ－ＢＲ－３を用いて細胞レベルでの抗体結合実験を行った。簡単に言えば、ＳＫ－ＢＲ－３細胞を消化し、完全培地で再懸濁し、細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍｌに調整する。９６ウェルＶプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種した後、最終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を１００μｌ／ウェルで添加した。細胞を４°Ｃに置き、遮光して１時間インキュベートした。その後、１００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳを添加し細胞を２回すすぎ、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μｌ／ウェルで蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ Ａｆｆｉｎｉ Ｐｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅｒａｃｈ，＃１０９－６０５－００６、１：１０００希釈）を添加し、４°Ｃで遮光し３０分間インキュベートした。細胞を１００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳで２回洗浄し、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳを用いて細胞を再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを用いて蛍光発光信号値を読み取った。
図１９に示すように、本発明のＨＥＲ２×４－１ＢＢの二重特異性抗体はいずれもヒトＳＫ－ＢＲ－３に結合することができ、検出された抗体結合能力は抗体濃度と正の相関関係を持って増加する。参照抗体（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）と比較して、同じ濃度では、ＰＲ００２８１３の方が参照抗体よりも低いＥＣ５０を示し、他の抗体は参照抗体に相当する。
実施例３．３．ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体とＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ細胞との結合能力についてのＦＡＣＳ検出
本実施例は、４－１ＢＢの二重特異性抗体が４－１ＢＢとインビトロで結合する活性を研究するためである。ヒト４－１ＢＢを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）を用いて細胞レベルでの抗体結合実験を行った。簡単に言えば、細胞ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ細胞を消化し、Ｆ１２Ｋ完全培地で再懸濁し、細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍｌに調整した。９６ウェルＶプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種し、次いで１００μｌ／ウェルで添加し、最終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を添加した。細胞を４°Ｃに置き、遮光して１時間インキュベートした。その後、１００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳを添加し細胞を２回すすぎ、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μｌ／ウェルで蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ Ａｆｆｉｎｉ Ｐｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅｒａｃｈ，＃１０９－６０５－００６、１：１０００希釈）を添加し、４°Ｃで遮光し３０分間インキュベートした。細胞を１００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳで２回洗浄し、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳを用いて細胞を再懸濁し、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメータ（ＡＣＥＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて蛍光発光信号値を読み出した。
図２０に示すように、本発明のＨＥＲ２×４－１ＢＢの二重特異性抗体はいずれもヒト４－１ＢＢによく結合し、検出された抗体結合能力は抗体濃度と正の相関関係を持って増加する。これらの抗体は、低濃度でヒト４－１ＢＢと鋭敏に結合することができ、そのなかでＰＲ００２８１１、ＰＲ００１２１２、ＰＲ００２８１３、ＰＲ００２８２４が最も好ましく、ＥＣ５０が参照抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂよりも優れていた。他の二重抗体は、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂと同等またはやや弱い。しかし、最大ＭＦＩはいずれも参照抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂより高い
実施例３．４．ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体とＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ４－１ＢＢ細胞との結合能力についてのＦＡＣＳ検出
本実施例は、４－１ＢＢの二重特異性抗体が４－１ＢＢとインビトロで結合する活性を研究するためである。カニクイザル４－１ＢＢを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ４－１ＢＢ、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）を用いて細胞レベルでの抗体結合実験を行った。簡単に言えば、細胞ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ４－１ＢＢ細胞を消化し、Ｆ１２Ｋ完全培地で再懸濁し、細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍｌに調整した。９６ウェルＶプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで接種し、次いで１００μｌ／ウェルで添加し、最終濃度の２倍の３倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を添加した。細胞を４°Ｃに置き、遮光して１時間インキュベートした。その後、１００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳを添加し細胞を２回すすぎ、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに１００μｌ／ウェルで蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ Ａｆｆｉｎｉ Ｐｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅｒａｃｈ，＃１０９－６０５－００６、１：１０００希釈）を添加し、４°Ｃで遮光し３０分間インキュベートした。細胞を１００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳで２回洗浄し、５００ｇ、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μｌ／ウェルで予冷のＰＢＳを用いて細胞を再懸濁し、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメータ（ＡＣＥＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて蛍光発光信号値を読み出した。
図２１に示すように、本発明のＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体はいずれもカニクイザル４－１ＢＢと良好に結合することができ、検出された抗体結合能力は抗体濃度と正の相関関係を持って増加する。参照抗体（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）と比較すると、ＰＲ００１２１２、ＰＲ００２８２４、ＰＲ００２８２６－ＰＲ００２８２９のカニクイザル４－１ＢＢとの結合は同等である。
実施例３．５．ＨＥＲ２／４－１ＢＢ二重抗体が体外でＴ細胞経路を活性化できる
１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃１６－００３７－８５）をＰＢＳで希釈し、ウェルあたり１００μＬの０．０８μｇ／ｍｌのＯＫＴ３を取り９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３５９９）を包み、最終濃度を１０μｇ／ｍｌとした。４°Ｃで一晩被覆した。翌日、ＳＫ－ＢＲ－３細胞を消化し、完全培地で再懸濁し、細胞密度をそれぞれ４×１０５細胞／ｍｌに調整し予備とする。ＭＡＣＳキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，＃１３０－０９６－５３５）を用いてヒトＰＢＭＣからヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離した。まず細胞数を確認し、その後、細胞数に応じてＭＡＣＳ緩衝液とＰａｎ－Ｔ細胞ビオチン抗体を添加し、混合し、４°Ｃで５分間静置した。その後、対応する量のマイクロビーズを加え、４°Ｃで１０分間静置した。ＬＳカラムを通過したのはＣＤ３陽性のＴ細胞であった。前日の９６ウェルのプレートを被覆したＯＫＴ３を洗い流し、５０μＬ精製Ｔ細胞を加え、ウェル当たり１×１０５個とした。さらに５０μＬのＳＫ－ＢＲ－３細胞を９６ウェルプレートに入れ、ウェルあたり２×１０４個とした。次いで、対応する濃度のＨＥＲ２／４－１ＢＢの二重特異性抗体または対照モノクローナル抗体を加え、３７°Ｃで５％ＣＯ２培養箱で培養した。７２時間培養後に上清を採取し、ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃８８－７３１６）を用いてＩＦＮ－γの含有量を検出した。メーカーの説明書に従ってＥＬＩＳＡ検査を行い、簡単に言えば、９６平底プレートにコーティング抗体を加え、４°Ｃで一晩過ごした。翌日、ＥＬＩＳＡ緩衝液を加え、室温で１時間置く。受け取った上清液を加え、室温で２時間培養した。プレートを２回洗浄し、検出抗体を加え、室温で１時間置く。プレートを２回洗浄し、ＨＲＰ－ストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした。次にＴＭＢ基質を添加し、１０～３０分でＥＬＩＳＡ停止液（ＢＢＩ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃Ｅ６６１００６－０２００）を添加した。ボードリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，＃ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｌｕｓ）を使用してＯＤ４５０－５７０値を読み込みます。Ｇｒａｐｈａｄ８．０を用いて値を分析し、図を作成した。
図２２Ａ～図２２Ｄに示すように、本発明のＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体は、腫瘍細胞ＳＫ－ＢＲ－３架橋下でいずれも４－１ＢＢ媒介のＴ細胞経路を活性化する能力を有する。ここで、ＰＲ００２８１３及びＰＲ００２８２７は、低いＥＣ５０及び高いＩＦＮガンマ放出値を示す。
まとめ
本実施例は、抗ＨＥＲ２のＩｇＧ抗体の抗原結合ドメインＦａｂと抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体の抗原結合ドメインＶＨを用いて、ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造のＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体分子を構築した。同時に、抗ＨＥＲ２のＩｇＧ抗体の抗原結合ドメインＦａｂと抗４－１ＢＢのＨ２Ｌ２抗体を用いて、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ四価対称構造の二重特異性抗体を構築した。
２つの構造の抗ＨＥＲ２×４－１ＢＢの二重特異性抗体分子は、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータによってＴ細胞を活性化する機能活性を調節する。また、ＨＣＡｂに基づく二重特異性抗体分子構造の構築のフレキシビリティを示した。
ＵｒｅｌｕｍａｂによるＴ細胞の活性化は標的特異性がないことは、臨床毒副作用の原因の一つである。しかし、ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体のＴ細胞活性化に対する作用は、特異的にＨＥＲ２の発現に依存する。ＨＥＲ２を高発現する細胞が存在する場合、ＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重抗体はＴ細胞を特異的に活性化することができる。
以上より、本実施例は、機能活性が突出し、分子安定性に優れたＨＥＲ２×４－１ＢＢ二重特異性抗体分子を構築した。
実施例４．ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体
プログラム死受容体１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １、ＰＤ－１）は主にＴ細胞などの免疫細胞に発現し、それは２つのリガンド、すなわちプログラム死リガンド－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤ－Ｌ１）とＰＤ－Ｌ２を有する。ＰＤ－Ｌ１は主に抗原提示細胞及び複数の腫瘍細胞に発現される。ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の相互作用はＴ細胞の活性を低下させ、サイトカインの分泌を弱め、免疫抑制作用を果たす。多くのヒト腫瘍組織においてＰＤ－Ｌ１タンパク質の発現が検出され、腫瘍部位のミクロ環境は腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の発現を誘導でき、発現されたＰＤ－Ｌ１は腫瘍の発生と成長に有利であり、抗腫瘍Ｔ細胞のアポトーシスを誘導し、さらに腫瘍細胞を保護して免疫攻撃から逃れる。
４－１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ ９、ＣＤ１３７）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質である。４－１ＢＢは、複数の免疫細胞上で発現される共刺激分子であり、免疫活性の多機能調節剤である。活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞などの免疫細胞に誘導し発現される。４－１ＢＢは、そのリガンド４－１ＢＢＬ媒介の三量化によりＴ細胞を活性化し、細胞増殖及びサイトカイン放出を促進する。抗４－１ＢＢのアゴニスト抗体は、腫瘍を抑制する機能があり、最初に臨床試験に入った４－１ＢＢ全ヒト由来モノコローナル抗体は、ブリストル マイヤーズ スクイブ（ＢＭＳ）社のＵｒｅｌｕｍａｂ（ＢＭＳ－６６３５１３）であった。Ｕｒｅｌｕｍａｂの最初の臨床結果は２００８年に発表され、一部の患者で鼓舞的な治療効果が観察されたが、データはＵｒｅｌｕｍａｂが肝臓毒性をもたらし、標的と用量と関係があることを示した。また、臨床試験で２人の患者が肝毒性で死亡したため、関連臨床試験は中止された。
本実施例では、ＰＤ－Ｌ１と４－１ＢＢを同時に標的とする二重特異性抗体を構築し、１つ以上の作用機序により抗腫瘍効果と安全性を向上させた。第一に、ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１信号経路を遮断することによってＴ細胞を活性化することができる。第二に、腫瘍細胞表面に高発現するＰＤ－Ｌ１分子は、二重抗体分子を利用することで、Ｔ細胞表面の４－１ＢＢ分子の架橋及び三量化を促進し、下流信号伝導経路を活性化し、さらにＴ細胞に対する活性化及び増殖を促進することができる。第三に、二重抗体分子媒介のＴ細胞活性化は腫瘍ミクロ環内に限られ、これにより、Ｕｒｅｌｕｍａｂのようなモノクローナル抗体が正常組織でＴ細胞を過度に活性化することによる毒副作用を回避することができる。
実施例４．１．ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体の構造と設計
本実施例は、対応するアミノ酸配列がＩＭＧＴデータベースに由来する抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧ抗体ＰＲ０００１５１（Ａｔｅｓｏｌｉｚｕｍａｂ類似体）を使用する。
本実施例で用いた抗ＰＤ－Ｌ１の全ヒト由来ＩｇＧ抗体ＰＲ０００２６５（表４．２）は、以下に説明するように、Ｈａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウスに由来する。
Ｈａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウス（ＨａｒｂｏｕｒＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＢＶ）はヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、その産生抗体は完全なヒト抗体可変ドメインとラット定常ドメインを有する。Ｈａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウスに可溶性組換えヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（ＮｏｖｏＰｒｏｔｅｉｎ，＃Ｃ７６４）を用いて多ラウンド免疫を行った。マウス血清中のＰＤ－Ｌ１特異的抗体価が特定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出し、骨髄腫細胞系と融合してハイブリドーマ細胞を得た、ハイブリドーマ細胞をマルチラウンドスクリーニングおよびクローニングした後、いくつかのＰＤ－Ｌ１を特異的に識別できるモノクローナル抗体分子を同定した。これらのモノクローナル抗体をさらに同定し、ヒトＰＤ－Ｌ１に対する結合能力、カニクイザルＰＤ－Ｌ１に対する結合能力、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の結合に対する抑制能力などのパラメータに基づいて、いくつかの好ましい候補抗体分子を選出した。その後、候補抗体分子の配列分析と最適化を行い、数個の変異体配列を得た。抗体のＶＬおよびＶＨ配列を対応するヒトのκ軽鎖定常領域とＩｇＧ１重鎖定常領域配列を融合発現し、組換え全ヒト由来抗体分子を得た。抗ＰＤ－Ｌ１の組換え全ヒト由来ＩｇＧ抗体を表２３に示す。
本実施例で使用した抗４－１ＢＢの全ヒト由来ＩｇＧ抗体ＰＲ０００１９７およびＰＲ０００４４８は、実施例１に記載されているように、Ｈａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウスに由来している。
本実施例で用いた抗４－１ＢＢの全ヒト由来ＨＣＡｂ抗体ＰＲ００１７５８、ＰＲ００１７６０及びＰＲ００１８３６は、実施例２で説明したように、Ｈａｒｂｏｕｒ ＨＣＡＢマウスに由来している。
本実施例及びその後の実施例では、陽性対照分子は抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧモノクローナル抗体ＰＲ０００２６５であった。
本実施例及びその後の実施例において、陽性対照分子は抗４－１ＢＢのＩｇＧモノクローナル抗体Ｕｒｅｍｕｌａｂ及びＵｔｏｍｉｌｕｍａｂである。
実施例４．１．１．抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧ抗体と抗４－１ＢＢのＩｇＧ抗体を用いてＦＩＴ－Ｉｇ構造を有する二重特異性抗体分子を構築する
本実施例は、抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧ抗体ＰＲ０００２６５またはＰＲ０００１５１（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ類似体）の抗原結合ドメインＦａｂと、抗４－１ＢＢのＩｇＧ抗体ＰＲ０００１９７またはＰＲ０００４４８の抗原結合ドメインＦａｂを用いて、ＦＩＴ－Ｉｇ構造を有する抗ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢの二重特異性抗体分子を構築する。ＦＩＴ－Ｉｇ構造の設計は、特許ＷＯ２０１５／１０３０７２Ａ１を参照することができ、構造は図２３Ａに示されている。
構築された分子を表２４にまとめた。そして、実施例１及び２に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表２５にまとめた。表２６は、ＦＩＴ－Ｉｇ構造の二重抗体分子のポリペプチド鎖配列に対応する配列番号を示す。
実施例４．１．２．抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧ抗体と抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体を用いてＦａｂ－ＨＣＡｂ構造の二重特異性抗体分子を構築する
本実施例は、抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧ抗体ＰＲ０００２６５の抗原結合ドメインＦａｂと、抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体ＰＲ００１７５８、ＰＲ００１７６０またはＰＲ００１８３６の抗原結合ドメインＶＨとを用いて、多種構造の抗ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢの二重特異性抗体分子を構築する。
本実施例及びその後の実施例において、陽性対照分子は抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧモノクローナル抗体ＰＲ０００２６５であり、ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体分子のＰＤ－Ｌ１端の親モノクローナル抗体である。
本実施例及びその後の実施例において、陽性対照分子は抗４－１ＢＢのＩｇＧモノクローナル抗体ｕｒｅｌｕｍａｂ（ＩｇＧ４）又はｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ（ＩｇＧ２）である。
図２３Ｂ及び図２３Ｃに示すように、Ｆａｂ端は、本実施形態に用いた抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧ抗体に由来する。ＶＨ末端は、抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体ＰＲ００１７５８、ＰＲ００１７６０またはＰＲ００１８３６の抗原結合ドメインＶＨに由来する。ＣＬは軽鎖定常領域ドメインである。ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３は、それぞれ重鎖定常領域の第一、第二及び第３のドメインである。Ｌ１及びＬ２はそれぞれ第一及び第二接続ペプチドである。
Ｆａｂ（ＣＬ）－ＶＨ－Ｆｃ
図２３Ｂ構造の結合タンパク質は両本のポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖１は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＶＨ＿Ａ－ＣＨ１を含み；ポリペプチド鎖２は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＶＬ＿Ａ－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ＿Ｂ－Ｌ２－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。構造Ｆａｂ（ＣＬ）－ＶＨ－Ｆｃにおいて、抗体ＡのＶＬ＿Ａ及び重鎖抗体ＢのＶＨ＿Ｂが同じ一つのポリペプチド鎖に融合し、それによってＶＬ＿Ａ及びＶＨ＿Ｂの会合で発生するミスマッチ副生成物を回避することができる。
ポリペプチド鎖２のＶＨ＿Ｂは接続ペプチドＬ２を介してＣＨ２に結合し；Ｌ２はＩｇＧのヒンジ領域またはヒンジ領域由来の接続ペプチド配列であってもよく、好ましくヒトＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＩｇＧ１ヒンジ（Ｃ２２０Ｓ）またはＧ５－ＬＨの配列である。
１つの実施形態において、ポリペプチド鎖２のＣＬとＶＨ＿Ｂは直接的に融合し結合して、すなわちＬ１の長さは０である。他の１つの実施形態において、ポリペプチド鎖２のＣＬは接続ペプチドＬ１を介してＶＨ＿Ｂに結合し；Ｌ１は表１７に挙げられた配列である。
Ｆａｂ（ＣＨ１）－ＶＨ－Ｆｃ
図２３Ｃ構造の結合タンパク質は両本のポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖１は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＶＬ＿Ａ－ＣＬを含み；ポリペプチド鎖２は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ＿Ｂ－Ｌ２－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。
ポリペプチド鎖２のＶＨ＿Ｂは接続ペプチドＬ２を介してＣＨ２に結合し；Ｌ２はＩｇＧのヒンジ領域またはヒンジ領域由来の接続ペプチド配列であってもよく、好ましくヒトＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＩｇＧ１ヒンジ（Ｃ２２０Ｓ）またはＧ５－ＬＨの配列である。
１つの実施形態において、ポリペプチド鎖２のＣＨ１とＶＨ＿Ｂは直接的に融合し結合して、すなわちＬ１の長さは０である。他の１つの実施形態において、ポリペプチド鎖２のＣＨ１は接続ペプチドＬ１を介してＶＨ＿Ｂに結合し；Ｌ１は表１７に挙げられた配列である。
抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧ抗体と抗４－１ＢＢの重鎖抗体を用いて、Ｆａｂ－ＨＣＡｂ対称構造のＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体分子を設計し、表２７にまとめた；作製した二重抗体分子の物理化学的特性分析を表２８にまとめた。
実施例４．１．３．ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造分子の構築
抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧ抗体と抗４－１ＢＢの重鎖抗体を用いて、実施例３．１．１に記載の構造に従ってＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造のＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体分子を設計した（図２３Ｄ）。
あるいは、抗４－１ＢＢ ＨＣＡｂ抗体のＶＨを接続ペプチドを介してＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ抗体の重鎖のＮ末端に接続する（図２３Ｅに示す）。図２３Ｅ構造の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖１は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＶＬ＿Ａ－ＣＬを含み；ポリペプチド鎖２は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＶＨ＿Ｂ－Ｌ－ＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。一つの実施形態では、ポリペプチド鎖２のＶＨ＿ＢとＶＨ＿Ａが直接に融合し結合し、すなわちＬの長さは０である。別の実施形態では、ポリペプチド鎖２のＶＨ＿Ｂは接続ペプチドＬを介してＶＨ＿Ａに結合し；Ｌは、表１７に列挙された配列であってもよい。
抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧ抗体と抗４－１ＢＢの重鎖抗体を用いて、ＩｇＧ－ＶＨ対称構造のＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体分子を設計し、表２９にまとめた；作製した二重抗体分子の物理化学的特性分析を表３０にまとめた。
実施例４．１．４．ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体分子及び対照分子の配列リスト
表３１に、本実施形態で構築されたＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体分子の配列に対応する配列番号を示す。
実施例４．２．ヒトＰＤ－Ｌ１を高発現する細胞との結合
本実施例は、ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体分子のＰＤ－Ｌ１に対する結合活性を研究するためのものである。
抗体分子とヒトＰＤ－Ｌ１を高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤＬ１（南京金斯瑞、Ｍ００５４３）またはヒトＰＤ－Ｌ１を高発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－２６）との結合能力を、フローサイトメトリー細胞法ＦＡＣＳを用いて試験した。具体的には、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤＬ１細胞またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１を消化し、完全培地で再懸濁する；細胞密度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。次いで細胞を９６ウェルＶプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に１００μＬ／ウェルで播種し、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度２００ｎＭから３倍濃度勾配で希釈された合計１２濃度であり、ｈＩｇＧ１ｉｓｏ（ＣｒｏｗｎＢｉｏ，＃Ｃ０００１）を同型対照とした。細胞を４°Ｃに置き、遮光して１時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルで予冷のＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液）を加えて細胞を２回すすぎ、４°Ｃで５００ｇを５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに１００μＬ／ウェルで蛍光二次抗体（ＧｏａｔｈｕｍａｎｌｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ，Ｔｈｅｒｍｏ，＃Ａ１１０１３，１：１０００希釈）を加え、４°Ｃに放置し、遮光して１時間インキュベートした。その後、２００μＬ／ウェルで予冷のＦＡＣＳ緩衝液を加えて細胞を２回すすぎ、その後４°Ｃで５００ｇを５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μＬ／ウェルで予冷のＦＡＣＳ緩衝液添加し細胞を再懸濁した。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取る。
ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８を用いてデータ処理と作図分析を行い、４パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びＥＣ５０値などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗ＰＤ－Ｌ１のモノクローナル抗体ＰＲ０００２６５であり、ＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢ二重抗体分子のＰＤ－Ｌ１端の親モノクローナル抗体でもある。
図２４Ａに示すように、ＩｇＧ－ＶＨ（Ｃ端）四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００３５４９、ＰＲ００３５５０、ＰＲ００３５５１）がＰＤ－Ｌ１を結合する能力は、親モノクローナル抗体ＰＲ０００２６５と類似しており、ＰＤ－Ｌ１を結合するＥＣ５０値とＭＦＩ最大値はＦＩＴ－Ｉｇ構造の二重抗体分子（ＰＲ０００７０１、ＰＲ００３０５２）よりやや優れている。
図２４Ｂに示すように、Ｆａｂ－ＨＣＡｂ対称構造の二重抗体分子ＰＲ００４２７０とＩｇＧ－ＶＨ（Ｎ端）四価対称構造の二重抗体分子ＰＲ００４２６８がＰＤ－Ｌ１を結合する能力は、親モノクローナル抗体と似ており、そのＰＤ－Ｌ１と結合するＥＣ５０値は親モノクローナル抗体よりやや弱いが、ＭＦＩと結合する最大値は親モノクローナル抗体よりも高い。
図２４Ｃ－図２４Ｅに示すように、ＩｇＧ－ＶＨ（Ｃ端）の四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００７１３０、ＰＲ００７１３２、ＰＲ００７１３３、ＰＲ００７１３５、ＰＲ００７１３６、ＰＲ００７１３７、ＰＲ００７１３８、ＰＲ００７１３９、ＰＲ００７１４１、ＰＲ００７１４２、ＰＲ００７１４３、ＰＲ００７１４５、ＰＲ００７１４６、ＰＲ００７１４９）がＰＤ－Ｌ１を結合する能力は、親モノコローナル抗体ＰＲ０００２６５と類似している。
実施例４．３．４－１ＢＢを過発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞との結合
本実施例は、ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体分子が４－１ＢＢと結合する活性を研究するためのものである。
抗体分子とヒト４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢ（南京金斯瑞、Ｍ００５３８）とカニクイザル４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ４－１ＢＢ（南京金斯瑞、Ｍ００５６９）などとの結合能力を、フローサイトメトリーＦＡＣＳを用いて試験した。具体的には、細胞を消化し、完全培地で再懸濁する；細胞密度を２×１０６細胞／ｍＬに調整した。次に細胞を１００μＬ／ウェル（２×１０５細胞／ウェル）で９６ウェルＶプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３８９４）に播種し、４°Ｃで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度２００ｎＭから３倍濃度勾配で希釈された合計１２濃度であり、ｈＩｇＧ１ｉｓｏ（ＣｒｏｗｎＢｉｏ，＃Ｃ０００１）を同型対照とした。細胞を４°Ｃに置き、遮光して１時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルで予冷のＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液）を加えて細胞を２回すすぎ、４°Ｃで５００ｇを５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに１００μＬ／ウェルで蛍光二次抗体（ＧｏａｔｈｕｍａｎｌｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ，Ｔｈｅｒｍｏ，＃Ａ１１０１３，１：１０００希釈）を加え、４°Ｃに放置し、遮光して１時間インキュベートした。その後、２００μＬ／ウェルで予冷のＦＡＣＳ緩衝液を加えて細胞を２回すすぎ、その後４°Ｃで５００ｇを５分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、２００μＬ／ウェルで予冷のＦＡＣＳ緩衝液を添加し細胞を再懸濁した。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取る。
ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８を用いてデータ処理と作図分析を行い、４パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びＥＣ５０値などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗４－１ＢＢのモノクローナル抗体Ｕｒｅｌｕｍａｂまたはｔｏｍｉｌｕｍａｂである。
実施例４．３．１．ヒト４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ ４－１ＢＢとの結合
図２５Ａに示すように、ＩｇＧ－ＶＨ（Ｃ端）四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００３５４９、ＰＲ００３５５０、ＰＲ００３５５１）は、ＦＩＴ－Ｉｇ構造の二重抗体分子（ＰＲ０００７０１、ＰＲ００３０５２）と比べて、ヒト４－１ＢＢを結合する能力が高く、ＭＦＩ最大値では陽性対照Ｕｒｅｌｕｍａｂよりも優れている。
図２５Ｂに示すように、Ｆａｂ－ＨＣＡｂ対称構造の二重抗体分子ＰＲ００４２７０とＩｇＧ－ＶＨ（Ｎ端）四価対称構造の二重抗体分子ＰＲ００４２６８がヒト４－１ＢＢを結合する能力は、ＭＦＩ最大値において陽性対照ＵｒｅｌｕｍａｂとＵｔｏｍｉｌｕｍａｂより優れている。
図２５Ｃから図２５Ｅに示すように、ＩｇＧ－ＶＨ（Ｃ端）四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００７１３０、ＰＲ００７１３２、ＰＲ００７１３３、ＰＲ００７１３５、ＰＲ００７１３６、ＰＲ００７１３７、ＰＲ００７１３８、ＰＲ００７１３９、ＰＲ００７１４１、ＰＲ００７１４２、ＰＲ００７１４３、ＰＲ００７１４５、ＰＲ００７１４６、ＰＲ００７１４９）のヒト４－１ＢＢとの結合は、ＭＦＩ最大値で陽性対照Ｕｒｅｌｕｍａｂより優れている。
実施例４．３．２．カニクイザル４－１ＢＢを高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏ４－１ＢＢとの結合
図２６Ａ及び図２６Ｂに示すように、本実施例の二重抗体分子はカニクイザル４－１ＢＢと結合することができることに対して、Ｕｒｅｌｕｍａｂはできない。ＰＲ００４２７０がカニクイザル４－１ＢＢを結合する能力は、ＭＦＩ最大値においてＵｔｏｍｉｌｕｍａｂよりやや優れている。
実施例４．４．ＰＤ－Ｌ１を高発現する標的細胞媒介のＴ細胞の特異的活性化
本実施例は、標的細胞におけるＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体分子の存在は４－１ＢＢを結合することによりＴ細胞の活性を活性化することを研究するためである。標的細胞は、ヒトＰＤ－Ｌ１を高発現するＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤＬ１（ＧＥＮＳＣＲＩＰＴ、Ｍ００５４３）、またはヒトＰＤ－Ｌ１を高発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－２６）などの、ＰＤ－Ｌ１を異なる程度に発現する細胞であってもよい。エフェクター細胞は、単離されたヒトＰＢＭＣまたはＴ細胞であってもよい。
具体的に、まず０．３μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（Ｔｈｅｒｍｏ，＃１６－００３７－８１）を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３５９９）に包接した。次に、ヒトＴ細胞（ヒトＰＢＭＣからＴ細胞選別キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，＃１３０－０９６－５３５）で分離して得た）の密度を２×１０６細胞／ｍＬに調整し、標的細胞の密度を３×１０５細胞／ｍＬに調整した後、２種類の細胞懸濁液をそれぞれ５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、最終的な標的比は２０：３であった。その後、１００μＬ／ウェルで異なる濃度の抗体分子を添加し、抗体最終濃度は（１０ｎＭ、１ｎＭ）、あるいは２０ｎＭ、あるいは最高最終濃度２０ｎＭから５倍濃度勾配で希釈した合計８つの濃度であってもよく、２つの複合ウェルに添加し；ｈＩｇＧ１ ｉｓｏ（ＣｒｏｗｎＢｉｏ，＃Ｃ０００１）とｈＩｇＧ４ ｉｓｏ（ＣｒｏｗｎＢｉｏ，＃Ｃ００４５）を対照とした。９６ウェルプレートを３７°Ｃ、５％ＣＯ２培養箱に３日間インキュベートした。４８時間培養後と７２時間培養後の上清をそれぞれ収集し、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ，＃８８－７０２５－８８）で４８時間後の上清中のＩＬ－２濃度を検出し、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ，＃８８－７３１６－７７）を用いて７２時間後の上清中のＩＦＮ－γ濃度を検出した。ＥＬＩＳＡの検出方法は関連キットの操作説明を参照する。
アプリケーションソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８でデータ処理と作図分析を行う。
本実施例において、陽性対照分子は抗４－１ＢＢのモノクローナル抗体Ｕｒｅｌｕｍａｂである。
実施例４．４．１．ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤＬ１媒介のＴ細胞特異的活性化
図２７Ａ－図２７Ｄに示すように、標的細胞ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤＬ１とＴ細胞を混合するシステムにおいて、架橋に依存しない抗４－１ＢＢモノクローナル抗体Ｕｒｅｌｕｍａｂは、Ｔ細胞のＩＦＮ－γ放出を活性化することができ、一方、架橋に依存する抗４－１ＢＢモノクローナル抗体（ＰＲ０００４４８、ＰＲ００１７５８、ＰＲ００１７６０、ＰＲ００１８３６）はＴ細胞をほとんど活性化できない。ＦＩＴ－Ｉｇ構造の二重抗体分子（ＰＲ００３０５２、ＰＲ０００７０１）とＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００３５４９、ＰＲ００３５５０、ＰＲ００３５５１、ＰＲ００４２６８、ＰＲ００７１３０、ＰＲ００７１３２、ＰＲ００７１３３、ＰＲ００７１３５、ＰＲ００７１３６、ＰＲ００７１３７、ＰＲ００７１３８、ＰＲ００７１３９、ＰＲ００７１４１、ＰＲ００７１４２、ＰＲ００７１４３、ＰＲ００７１４５、ＰＲ００７１４６、ＰＲ００７１４９）とＦａｂ－ＨＣＡｂ構造の二重抗体分子（ＰＲ００４２７０）はいずれもＴ細胞を活性化させ、サイトカインを放出することができる。これは、二重抗体分子のＴ細胞に対する活性化が標的細胞の特異的活性化に依存することを示している。また、ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００３５４９、ＰＲ００３５５０、ＰＲ００７１３０、ＰＲ００７１３２、ＰＲ００７１３３、ＰＲ００７１３５、ＰＲ００７１３６、ＰＲ００７１３７、ＰＲ００７１３８、ＰＲ００７１３９、ＰＲ００７１４１、ＰＲ００７１４２、ＰＲ００７１４３、ＰＲ００７１４５、ＰＲ００７１４６、ＰＲ００７１４９）とＦａｂ－ＨＣＡｂ構造の二重抗体分子（ＰＲ００４２７０）はＦＩＴ－Ｉｇ構造の二重抗体分子（ＰＲ００３０５２、ＰＲ０００７０１）と比べて、より高いサイトカイン放出レベルを引き起こすことができ、より強いＴ細胞活性化能力を示し、Ｕｒｅｌｕｍａｂより優れている。
実施例４．４．２．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１媒介Ｔ細胞特異的活性化
図２７Ｅに示すように、標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１とＴ細胞を混合するシステムにおいて、ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００３５４９）とＦａｂ－ＨＣＡｂ構造の二重抗体分子（ＰＲ００４２７０）は類似のＴ細胞活性化能力を有し、ＦＩＴ－Ｉｇ構造の二重抗体分子（ＰＲ００３０５２、ＰＲ０００７０１）より優れた。
図２７Ｆと図２７Ｇに示すように、標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１とＴ細胞を混合したシステムにおいて、ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００３５４９）はＵｒｅｌｕｍａｂよりもＴ細胞活性化能力が強く、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の生成をよりよく促進することができる。
図２７Ｈと図２７Ｉに示すように、標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１とＴ細胞が混合されたシステムにおいて、ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００７１３０、ＰＲ００７１３２、ＰＲ００７１３３、ＰＲ００７１３８、ＰＲ００７１３９、ＰＲ００７１４１、ＰＲ００７１４２、ＰＲ００７１４３、ＰＲ００７１４５、ＰＲ００７１４６、ＰＲ００７１４９）はＵｒｅｌｕｍａｂよりかなりのＴ細胞活性化能を有する。
実施例４．５．混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
本実施例は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いてＴ細胞に対するＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体分子の活性化作用を研究する。
第一段階に、ＣＤ１４ビーズ（Ｍｅｌｔｅｎｙｉ，＃１３０－０５０－２０１）を用いて第一ドナーＰＢＭＣ細胞（ＭＴ－ＢＩＯ）から単核細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）を単離する；具体的な操作は、関連キットの説明書を参照する。その後、５０ｎｇ／ｍＬ組換えヒト由来ＩＬ－４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，＃２００－０２－Ａ）と１００ｎｇ／ｍＬ組換えヒト由来ＧＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，＃３００－０３－Ａ）を加え、３７°Ｃで７日間誘導した後、未成熟樹状細胞（ｉＤＣ細胞）を得た。続いて、１μｇ／ｍｌのリポ多糖Ｌｉｐｏｐｏｌｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ、＃Ｌ ６５２９）を添加し、２４時間誘導した後、成熟樹状細胞（ｍＤＣ細胞）を得た。第二段階に、Ｔ細胞分離キット（Ｍｅｌｔｅｎｙｉ，＃１３０－０９６－５３５）を用いて第二ドナーＰＢＭＣ細胞（ＭＴ－ＢＩＯ）からＴリンパ細胞を分離する。第三段階に、得られたＴ細胞とｍＤＣ細胞を９６ウェルプレートに５：１の割合で播種した（１×１０５／ウェルのＴ細胞と２×１０４／ウェルのｍＤＣ細胞）。その後、５０μＬ／ウェルで異なる濃度の抗体分子を添加し、抗体最終濃度は（１０ｎＭ、１ｎＭ）、または最高最終濃度５０ｎＭから３倍濃度勾配で希釈した計８つの濃度であってもよく、２つの複合ウェルに添加し；ｈＩｇＧ１ ｉｓｏ（ＣｒｏｗｎＢｉｏ，＃Ｃ０００１）または空白ウェルを対照とした。３７°Ｃ、５％ＣＯ２培養箱で５日間インキュベートした。第四段階に、それぞれ３日目と５日目の上清を収集し、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ，＃８８－７０２５－８８）で３日目の上清中のＩＬ－２濃度を検出し、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ，＃８８－７３１６－７７）を用いて５日目の上清中のＩＦＮ－γ濃度を検出した。ＥＬＩＳＡ検出方法は関連キットの操作説明を参照する。
図２８に示すように、複数回の独立したＭＬＲ実験（異なるドナーペア）において、Ｔ細胞に対する抗４－１ＢＢモノクローナル抗体の活性化作用は限られており、サイトカインを産生する能力は弱い；抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は明らかな活性化作用を有する。二重抗体分子は、Ｔ細胞の機能をさらに向上させることができる。
図２８Ａから図２８Ｆに示すように、ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００３５４９、ＰＲ００３５５０、ＰＲ００３５５１、ＰＲ００７１３０、ＰＲ００７１３２、ＰＲ００７１３３、ＰＲ００７１３８、ＰＲ００７１３９、ＰＲ００７１４１、ＰＲ００７１４２、ＰＲ００７１４３、ＰＲ００７１４５、ＰＲ００７１４６、ＰＲ００７１４９）は母体ＰＤ－Ｌ１抗体ＰＲ０００２６５よりも高いサイトカイン放出レベルを引き起こし、より強いＴ細胞活性化能力を示し、二重抗体分子が抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体より優れていることを示している。
図２８Ａ及び図２８Ｄに示すように、ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００３５４９、ＰＲ００３５５０、ＰＲ００３５５１）はＦＩＴ－Ｉｇ構造の二重抗体分子（ＰＲ００３０５２、ＰＲ０００７０１）よりも高いサイトカイン放出レベルを引き起こし、より強いＴ細胞活性化能力を示すことができる；また、二重抗体分子はＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体より優れている。
図２８Ｇ及び図２８Ｈに示すように、ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００３５４９、ＰＲ００３５５０）とＦａｂ－ＨＣＡｂ構造の二重抗体分子（ＰＲ００４２７０）はＦＩＴ－Ｉｇ構造の二重抗体分子（ＰＲ００３０５２、ＰＲ０００７０１）よりも高いサイトカイン放出レベルを引き起こすことができ、より強いＴ細胞活性化能力を示す。
図２８Ｉから図２８Ｋに示すように、ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造の二重抗体分子（ＰＲ００３５４９、ＰＲ００３５５０、ＰＲ００３５５１）とＦａｂ－ＨＣＡｂ構造の二重抗体分子（ＰＲ００４２７０）は強いＴ細胞活性化能力を示している。
実施例４．６．薬物動態学の研究
本実施例は、マウス体内におけるＦａｂ－ＨＣＡｂ対称構造を有するＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体分子ＰＲ００４２７０の薬物動態学特性を研究した。
実施方法：各試験抗体分子に対して、体重１８～２２グラムの雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹を選択し、５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射により二重特異性抗体を投与した。１群３匹は投与前及び投与後１５分、２４時間（１日）、４日目、及び１０日目に全血を採取し、別の１群３匹は投与前及び投与後５時間、２日目、７日目、及び１４日目に全血を採取した。全血を３０分間静置して凝固させ、その後遠心分離し、分離した血清サンプルを分析するまで－８０°Ｃで凍結保存した。本実施例は２種類のＥＬＩＳＡ方法を用いてマウス血清中の薬物濃度を定量的に測定した。ＥＬＩＳＡ方法１、つまりＦｃ端検出（全体検出）方法であり、９６ウェルプレートに包接されたヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル抗体によりマウス血清中のヒトＦｃ含有抗体を捕獲し、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ第２抗体を加えて検出する；ＥＬＩＳＡ方法２、すなわちＰＤ－Ｌ１端検出（機能ドメイン検出）方法であり、９６ウェルプレートに包接されたヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質によりマウス血清中のＰＤ－Ｌ１を特異的に識別する抗体を捕獲し、その後ＨＲＰ標識されたヤギ抗ヒトＦｃ第２抗体を加えて検出する。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアバージョン８．２を使用して、非房室モデル（ＮＣＡ）を選択して薬物動態学パラメータを分析した。
図２９及び表３２に示すように、Ｆａｂ－ＨＣＡｂ構造の二重抗体分子ＰＲ００４２７０は従来のＩｇＧ抗体と類似した血清半減期ｔ１／２値を有し、機能ドメイン検出方法はそのｔ１／２値が１０日を超えることを示した。
まとめ
本実施例は、抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＧ抗体の抗原結合ドメインＦａｂと抗４－１ＢＢのＨＣＡｂ抗体の抗原結合ドメインＶＨを用いて、多種類の構造の抗ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢの二重特異性抗体分子を構築した。ＨＣＡｂに基づいて二重特異性抗体分子構造を構築するフレキシビリティを示し、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータによってＴ細胞を活性化する機能活性を調節した。
ＵｒｅｌｕｍａｂのＴ細胞に対する活性化は標的特異性がないことが臨床毒副作用の原因の一つである。ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抵抗のＴ細胞に対する活性化作用は、ＰＤ－Ｌ１の発現に特異的に依存する。架橋された抗４－１ＢＢに依存するＨＣＡｂモノクローナル抗体はＴ細胞を直接活性化することはできないが、これらのＨＣＡｂモノクローナル抗体を用いて構築されたＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重抗体は、ＰＤ－Ｌ１を高発現する細胞が存在する場合にＴ細胞を特異的に活性化することができる。
ＨＣＡｂに基づく二重抗構造、特にＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造の二重抗体分子とＦａｂ－ＨＣＡｂ構造の二重抗体分子は、ＰＤ－Ｌ１端の活性を保留し、ＭＬＲ実験において対応する抗ＰＤ－Ｌ１親モノクローナル抗体より強いＴ細胞活性化能力を体現した；一方、標的細胞上で高発現するＰＤ－Ｌ１分子は、４－１ＢＢの架橋及び三量化を媒介してＴ細胞の活性化信号を伝達することができ、そのＴ細胞を活性化する能力は、Ｕｒｅｌｕｍａｂよりも優れている。また、ＩｇＧ－ＶＨ四価対称構造とＦａｂ－ＨＣＡｂ対称構造の二重抗体分子はＦＩＴ－Ｉｇ構造の二重抗体分子よりも強いＴ細胞活性化能力を示している。
以上より、本実施例は安全性が良く、機能活性が突出し、分子安定性が良いＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体分子を構築した。
参考文献：
１． Ｂｅｒｔｒａｍ ＥＭ， Ｌａｕ Ｐ， Ｗａｔｔｓ ＴＨ． Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ４－１ＢＢ ｖｅｒｓｕｓ ＣＤ２８－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ：４－１ＢＢ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒｓ ｌａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２；１６８： ３７７７－８５．
２． Ｋａｗａｌｅｋａｒ ＯＵ， Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ＲＳ， Ｆｒａｉｅｔｔａ ＪＡ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ Ｉｍｐａｃｔｓ Ｍｅｍｏｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１６；４４： ３８０－９０．
３． Ｙｅ Ｚ， Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ Ｉ， Ｈａｙｄｅｎ－Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ Ｍ， Ｄａｈｌｉｎ Ａ， Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ ＪＡ， Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ＫＥ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ４－１ＢＢ． Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００２；８： ３４３－８．
４． Ｚｈａｎｇ Ｈ， Ｋｎｕｔｓｏｎ ＫＬ， Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ＫＥ， Ｄｉｓｉｓ ＭＬ， Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ Ｉ． Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＣＤ１３７ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｉｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａ ＣＤ１３７ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＣＤ１３７－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｆｕｓｉｏｎ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２００６；５： １４９－５５．
５ Ｙａｎｇ Ｙ， Ｙａｎｇ Ｓ， Ｙｅ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎｔｉ－ＣＤ１３７ ｓｃＦｖ ｉｎｄｕｃｅ ａ ｔｕｍｏｒ－ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００７；６７： ２３３９－４４．
６． Ｍａｒｔｉｎｅｔ Ｏ， Ｄｉｖｉｎｏ ＣＭ， Ｚａｎｇ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖｅｒｓｕｓ ｌｏｃａｌ ４－ １ＢＢ ｌｉｇａｎｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ２００２；９： ７８６－９２。

Claims (24)

  1. 重鎖可変領域を含み；
    前記重鎖可変領域がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１５またはその変異体１、または配列番号１６に示す配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号６０またはその変異体２、または配列番号５０またはその変異体４に示す配列を含み、前記ＨＣＤＲ３が配列番号１０３またはその変異体３、配列番号３３３またはその変異体５、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１６、配列番号３２６、配列番号３３１、配列番号３３４または配列番号９６に示す配列を含み；
    その中で：
    前記変異体１の突然変異がＴ３Ｉ、Ｓ６Ｎ／Ｇ／Ｒ及びＹ７Ｆにおける１つまたは複数を含み；好ましく、前記変異体１の配列は好ましく配列表における配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３００または配列番号２４に示し；
    前記変異体２の突然変異がＳ１Ｇ／Ｎ／Ｄ、Ｇ２Ｓ／Ａ、Ｓ３Ｄ、Ｇ５Ｄ／Ｎ／Ｆ／Ｓ／Ｖ及びＳ６Ｔ／Ｎ／Ｄにおける１つまたは複数を含み；前記変異体２の配列は好ましく配列表における配列番号５７－５９、配列番号６１、配列番号４９、配列番号３０８－３１７及び配列番号６３－７１におけるいずれの配列に示し；
    前記変異体３の突然変異がＧ２Ｒ／Ｄ／Ａ／Ｋ、Ｓ３Ａ／Ｔ、Ｓ４Ｇ／Ｎ／Ａ／Ｔ／Ｈ、Ｅ５Ｔ／Ｖ／Ｍ／Ｇ、Ｔ６Ａ、Ｄ７Ｇ／Ｓ、Ｈ９Ｙ／Ｓ／Ｎ、Ｙ１０Ｈ、Ｙ１１Ｆ、Ｎ１２Ｇ／Ｄ及びＶ１３Ｉ／Ｍ／Ｔにおける１つまたは複数を含み；前記変異体３のアミノ酸配列は好ましく配列表における配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０４－１０６、配列番号１０８、配列番号１０９及び配列番号１１２－１１５におけるいずれの配列に示し；
    前記変異体４の突然変異がＮ１ＩまたはＮ１Ｑを含み；前記変異体４のアミノ酸配列は好ましく配列表における配列番号５３または５４に示し；
    前記変異体５の突然変異がＥ４Ａ／Ｐおよび／またはＮ１３Ｙを含み；前記変異体５のアミノ酸配列は好ましく配列表における配列番号３２７－３３０に示し；
    前記変異体１、変異体２、変異体３、変異体５及び変異体４は少なくとも突然変異前の配列の機能を含む、４－１ＢＢ結合タンパク質。
  2. 前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、それぞれ配列表における配列番号１６、配列番号５０および配列番号９６に示す配列、またはそれぞれ配列番号１６、配列番号５３および配列番号９６に示す配列、またはそれぞれ配列番号１６、配列番号５４および配列番号９６に示す配列、またはそれぞれ配列番号１９、配列番号５７および配列番号１０１に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号５８および配列番号１０２に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号５９および配列番号１０３に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号６０および配列番号１０４に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６１および配列番号１０５に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６０および配列番号１０６に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号６３および配列番号１０８に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号６０および配列番号１０８に示す配列、またはそれぞれ配列番号２２、配列番号６４および配列番号１０９に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６０および配列番号１１０に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６５および配列番号１１１に示す配列、またはそれぞれ配列番号２２、配列番号６６および配列番号１１２に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号４９および配列番号１１３に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号６０および配列番号１０３に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６３および配列番号１０４に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６０および配列番号１１４に示す配列、またはそれぞれ配列番号２３、配列番号６７および配列番号１０５に示す配列、またはそれぞれ配列番号２４、配列番号６８および配列番号１０３に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号６０および配列番号１０５に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号６９および配列番号１１５に示す配列、またはそれぞれ配列番号１５、配列番号７０および配列番号１１６に示す配列、またはそれぞれ配列番号２０、配列番号７１および配列番号１１５に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３０８および配列番号３２６に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３０９および配列番号３２７に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１０および配列番号３２８に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３０８および配列番号３２９に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１１および配列番号３３０に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１２および配列番号３３１に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３０８および配列番号３３２に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１３および配列番号３３０に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１４および配列番号３２９に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１５および配列番号３３１に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１４および配列番号３２７に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１６および配列番号３３１に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３０８および配列番号３３３に示す配列、またはそれぞれ配列番号３００、配列番号３１７および配列番号３３４に示す配列を含み；
    好ましく、前記重鎖可変領域のＦＲをコードする遺伝子が胚系Ｖ遺伝子ＩＧＨＶ４－３４、ＩＧＨＶ３－２３、ＩＧＨＶ３－１１またはＩＧＨＶ３－７４に由来し；
    より一層好ましく、前記重鎖可変領域が配列表における配列番号１６８、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７５－１８０、配列番号１８２－１９６、配列番号３３７－３５２及び配列番号１９８におけるいずれに示す配列を含む、請求項１に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質。
  3. 前記４－１ＢＢ結合タンパク質はさらに軽鎖可変領域を含有し、前記軽鎖可変領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１は配列番号１３３に示す配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１４５に示す配列を含み、前記ＬＣＤＲ３は配列番号１５８に示す配列を含み；
    好ましく、前記軽鎖可変領域のＦＲをコードする遺伝子が胚系Ｖ遺伝子ＩＧＫＶ３－１５に由来し；その中で：ＬＦＷＲ１は好ましく配列番号１２６または配列番号１２８に示すアミノ酸配列を含み、ＬＦＷＲ２は好ましく配列番号１４０に示すアミノ酸配列を含み、ＬＦＷＲ３は好ましく配列番号１５１に示すアミノ酸配列を含み、ＬＦＷＲ４は好ましく配列番号１６４に示すアミノ酸配列を含み；
    好ましく、前記軽鎖可変領域は配列表における配列番号２０１に示す配列またはその変異体を含み、前記変異体が配列番号２０１に示す配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の突然変異が発生することに基づき；突然変異の後に得られた軽鎖可変領域の配列は好ましく配列番号２０４に示し；
    より一層好ましく、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６８に示し、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０１に示し；または、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７１に示し、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０４に示し；または、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７２に示し、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０４に示す、請求項１または２に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質。
  4. 前記４－１ＢＢ結合タンパク質はさらに重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含み；好ましく、前記重鎖定常領域がｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４またはその変異体から選択され、前記軽鎖定常領域がκ鎖またはλ鎖またはその変異体から選択され；その中で：
    前記ｈＩｇＧ１の変異体の突然変異は好ましくＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｅ３４５ＲおよびＰ３２９Ｇにおける１つまたは複数であり、より好ましくＥ３４５Ｒ、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＥ３４５Ｒの組み合わせ、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇの組み合わせであり；前記ｈＩｇＧ４の変異体の突然変異は好ましくＳ２２８Ｐである、請求項１－３のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質。
  5. 前記４－１ＢＢ結合タンパク質は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖は配列表における配列番号２０９、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１６－２２２、配列番号２２４－２３８、配列番号３５３－３６８及び配列番号２４０におけるいずれに示す配列を含み；および／または、前記軽鎖は配列表における配列番号２４６または配列番号２４３に示す配列を含み；
    好ましく、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号２０９に示し、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２４３に示し；または、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号２１２に示し、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２４６に示し；または、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号２１３に示し、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２４６に示し；または、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号２１６に示し、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２４６に示す、請求項４に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質。
  6. 全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、重鎖抗体、単一ドメイン抗体または単一領域抗体の形態、または前記抗体から得られたモノクローナル抗体またはマルチクローナル抗体であり；
    好ましく、前記全長抗体の重鎖は配列番号２０９に示す配列を含み、且つ軽鎖は配列番号２４３に示す配列を含み；または配列番号２１２に示す配列を含み、且つ軽鎖は配列番号２４６に示す配列を含み、または配列番号２１３に示す配列を含み、且つ軽鎖は配列番号２４６に示す配列を含み、または配列番号２１６に示す配列を含み、且つ軽鎖は配列番号２４６に示す配列を含む、請求項１－５のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質。
  7. 前記二重特異性抗体は、第一タンパク質機能領域および第二タンパク質機能領域を含み、前記第一タンパク質機能領域は請求項１－６のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質であり、前記第二タンパク質機能領域は腫瘍抗原を標的とし；好ましくはＨＥＲ２抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体であり；その中で、前記ＨＥＲ２抗体は好ましくｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂまたはｐｅｒｔｕｚｕｍａｂであり、前記ＰＤ－Ｌ１抗体は好ましくａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂまたはＰＲ０００２６５であり、前記ＰＲ０００２６５の重鎖は配列番号２１１に示し、軽鎖は配列番号２４５に示す、二重特異性抗体。
  8. 前記第一タンパク質機能領域または前記第二タンパク質機能領域はｓｃＦｖ、ＶＨＨ、免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または重鎖可変領域の形態であり；たとえば、前記第一タンパク質機能領域はＦａｂであり、前記第二タンパク質機能領域はＶＨＨであり；または、前記第一タンパク質機能領域はＦａｂであり、前記第二タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり；または、前記第一タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第二タンパク質機能領域は重鎖可変領域である、請求項７に記載の二重特異性抗体。
  9. 前記第一タンパク質機能領域と前記第二タンパク質機能領域との間および／または前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間は結合子によって連結され、前記結合子のアミノ酸配列はＧＳであり、または配列表における配列番号２７３－２９３のいずれに示す、請求項８に記載の二重特異性抗体。
  10. 前記二重特異性抗体はポリペプチド鎖１およびポリペプチド鎖２を含み、好ましくさらにポリペプチド鎖３を含み；
    好ましく：
    前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４４に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２５１－２６５のいずれに示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４５に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２７１に示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４９に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２７２に示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４５に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２７０に示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４５に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２６９に示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４５に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２６８に示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２４５に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号３６９－３８２のいずれに示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２６７に示し、前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２６６に示し、且つ前記ポリペプチド鎖３のアミノ酸配列は配列番号２４６に示し；または前記ポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は配列番号２５０に示し、且つ前記ポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は配列番号２４９に示し、且つ前記ポリペプチド鎖３のアミノ酸配列は配列番号２４６に示す、請求項８または９に記載の二重特異性抗体。
  11. 請求項１－６のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質または請求項７－１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする、単離の核酸。
  12. 請求項１１に記載の単離の核酸を含む、発現ベクター。
  13. 請求項１２に記載の発現ベクターを含み；好ましく、原核細胞または真核細胞である、宿主細胞。
  14. 請求項１３に記載の宿主細胞を培養し、培養物から４－１ＢＢ結合タンパク質を獲得することを含む、４－１ＢＢ結合タンパク質の作製方法。
  15. 請求項１－６のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質または請求項７－１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む、キメラ抗原受容体。
  16. 細胞毒性剤、及び請求項１－６のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質または請求項７－１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含み；好ましく、前記細胞毒性剤はＭＭＡＦまたはＭＭＡＥを含む、抗体薬物複合物。
  17. 請求項１－６のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、請求項７－１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体および／または請求項１６に記載の抗体薬物複合物を含む、薬物組成物。
  18. 請求項１－６のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、請求項７－１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体および請求項１７に記載の薬物組成物の、癌を治療および／または予防する薬物の作製における用途であって、
    前記癌は好ましくＨＥＲ２、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢにおける一種または複数種に関連の癌、例えば乳癌、メラノーマ、肺癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘍または結腸直腸癌である、用途。
  19. 請求項１－６のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、請求項７－１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１５前記キメラ抗原受容体、請求項１６に記載の抗体薬物複合物および／または請求項１７に記載の薬物組成物を含み；
    好ましく、さらに（ｉ）抗体またはその抗原結合フラグメントまたは抗体薬物複合物または薬物組成物を投与するデバイス；および／または（ｉｉ）使用説明を含む、試薬キット。
  20. 薬カセットＡおよび薬カセットＢを含み、その中で：
    前記薬カセットＡは請求項１－６のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、請求項７－１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体、請求項１６に記載の抗体薬物複合物および／または請求項１７に記載の薬物組成物を含み；
    前記薬カセットＢは他の抗腫瘍抗体または前記他の抗腫瘍抗体を含む薬物組成物、および／またはホルモン製剤、標的小分子製剤、プロテアーゼ体阻害剤、イメージング剤、診断剤、化学療法剤、溶腫薬物、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、抑制性分子の阻害剤及びワクチンからなる群における一種または複数種を含む、薬キット。
  21. ４－１ＢＢに媒介される疾患または障害を診断、治療および／または予防する方法であって、
    前記方法は必要な患者に治療有効量の請求項１－６のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、請求項７－１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体、請求項１６に記載の抗体薬物複合物または請求項１７に記載の薬物組成物を投与し、または請求項２０に記載の薬キットを用いて必要な患者を治療する、方法。
  22. 前記疾患または障害は腫瘍であり、好ましく４－１ＢＢ陽性腫瘍であり、より好ましく胃癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫、腎癌、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、頭頸癌、気管支癌、神経膠腫および／または白血病である、請求項２１に記載の方法。
  23. ４－１ＢＢを免疫検出または測定する方法であって、
    請求項１－６のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、請求項７－１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体、請求項１６に記載の抗体薬物複合物または請求項１７に記載の薬物組成物を使用することを含み；好ましく、前記検出は診断および／または治療目的のものではない、方法。
  24. それぞれ必要な患者に請求項１－６のいずれか一項に記載の４－１ＢＢ結合タンパク質、請求項７－１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体、請求項１６に記載の抗体薬物複合物または請求項１７に記載の薬物組成物、および第二治療剤を投与し；前記第二治療剤は、好ましく他の抗腫瘍抗体または前記他の抗腫瘍抗体を含む薬物組成物、および／またはホルモン製剤、標的小分子製剤、プロテアーゼ体阻害剤、イメージング剤、診断剤、化学療法剤、溶腫薬物、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子の活性化剤、抑制性分子の阻害剤及びワクチンからなる群における一種または複数種を含む、併用療法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2023143534A1 (zh) * 2022-01-28 2023-08-03 三优生物医药(上海)有限公司 一种特异性识别4-1bb的抗体、其制备方法及其用途

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
BR112016015140A2 (pt) 2013-12-30 2018-01-23 Epimab Biotherapeutics Inc. imunoglobulina com fabs in-tandem e usos das mesmas
DK3354661T3 (da) * 2015-09-22 2020-07-06 Dingfu Biotarget Co Ltd Fuldstændigt humant antistof mod human CD137 og anvendelse deraf
IL260530B2 (en) * 2016-01-11 2024-01-01 Inhibrx Inc Multispecific and multivalent 41BB-binding fusion proteins, preparations containing them and their uses
CN108473587A (zh) * 2016-01-25 2018-08-31 辉瑞公司 用于治疗癌症的ox40激动剂和4-1bb激动剂单克隆抗体的组合
WO2017182672A1 (en) * 2016-04-22 2017-10-26 Alligator Bioscience Ab Novel bispecific polypeptides against cd137
IL268058B2 (en) * 2017-01-20 2023-09-01 Magenta Therapeutics Inc Compositions and methods for depleting cd137 plus cells
US11459394B2 (en) * 2017-02-24 2022-10-04 Macrogenics, Inc. Bispecific binding molecules that are capable of binding CD137 and tumor antigens, and uses thereof
BR112020001180A2 (pt) * 2017-07-20 2020-09-08 Aptevo Research And Development Llc proteínas de ligação a antígenos que se ligam a 5t4 e 4-1bb e composições e métodos relacionados
CN109651507B (zh) * 2017-10-12 2021-11-26 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 一种激动型4-1bb单克隆抗体
WO2019092452A1 (en) * 2017-11-13 2019-05-16 Crescendo Biologics Limited Molecules that bind to cd137 and psma
CN113286825B (zh) * 2018-11-30 2024-06-18 爱必乐生物公司 抗pd-l1/抗4-1bb双特异性抗体及其用途
CN112646031B (zh) * 2019-10-10 2021-12-07 天境生物科技(上海)有限公司 抗4-1bb纳米抗体及其用途

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